CN101522895A - 1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法及1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种1，5－脱水葡萄糖醇的测定方法，其特征在于，使用下述蛋白质(a)～(c)：(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。

Description

1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法及1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物
技术领域
本发明涉及1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法及1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物。
本申请要求2006年6月22日在日本提出的日本专利申请2006-172619号的优先权，将其内容援用于此。
背景技术
1，5-脱水葡萄糖醇(以下记为1，5-AG。)是葡萄糖的1位的还原物，微量存在于生物体内。人们发现该1，5-AG作为糖尿病的控制标记(control marker)有用(例如参见非专利文献1、2。)
如非专利文献1所述，1，5-AG是处于血糖值和糖化血红蛋白Alc(HbAlc)中间的标记，认为适合轻度糖尿病患者的自我管理。
[表1]
 
标记 性质
血糖值 短时间内升降紊乱
1，5-AG 表示从检查时的约5～7天前开始的血糖状态
HbAlc 表示从检查时的约2个月前开始的平均血糖值
如非专利文献2所公开，健康人的1，5-AG值是血中仅次于葡萄糖的较多的单糖成分，根据在日本人中实施的临床试验，1，5-AG值的平均值为24.6±7.2(mean±SD)μg/ml。个人的生理变动幅度小，几乎不受日内及日间变动的影响。通常，与女性相比，男性有显示较高值的倾向。判定95％的健康人正常的cut off值约为14.0μg/ml。
目前，作为1，5-AG的测定方法，如非专利文献1所记载，已知有气相色谱法和酶法。酶法可以举出下述方法等：将0.2mL血浆(血清)检体进行除蛋白后，进一步通过微柱除去杂质。然后，使吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase；以下记为PROD。)作用，通过1，5-AG的2位羟基的氧化反应产生过氧化氢，使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)使该过氧化氢显色，在420nm测定吸光度。人们正在开发基于该酶法的血液专用的测定盒。
非专利文献1：川合厚生、赤沼安夫、“1，5-脱水葡萄糖醇”、临床检查vol.33no.8 1989年8月901～907
非专利文献2：“Medical Technology”临时增刊号2002 Vol.30No.13(临时增刊号)糖尿病检查概述从筛查至并发症的检查pp.1498-1499(医齿药出版株式会社)
发明内容
但是，由于现有的利用酶法进行的1，5-AG测定中使用的PROD对葡萄糖的作用性高，所以有为了进行高精度的1，5-AG测定而必须清除大量存在于血中的葡萄糖(血糖)的问题。
通过使用对葡萄糖作用性低的1，5-AG氧化酶(脱氢酶)代替该PROD，使1，5-AG的测定更简便，同时能提高测定精度、缩短测定时间，所以迫切希望提供使用上述酶的1，5-AG的测定方法。
本发明是鉴于上述事实而得到的，目的在于提供一种1，5-AG测定方法及1，5-AG测定试剂组合物，所述测定方法在测定检体中的1，5-AG值时，干扰物质的影响小，与现有方法相比，能更高精度地测定1，5-AG值。
为了达到上述目的，本发明提供以下的方案。
[1]一种1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其特征在于，使用下述蛋白质：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
[2]如[1]所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质来源于属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的菌。
[3]如[1]或[2]所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质来源于中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(保藏号：FERM P-19428)。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为100％时，所述蛋白质对D-葡萄糖的反应性为10％以下。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，测定使所述蛋白质在显色基质的存在下作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇而反应的显色基质的量。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，使所述蛋白质作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇之前，预先除去试样中的D-葡萄糖。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，使所述蛋白质在显色基质和电子载体的存在下作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇。
[9]如[1]～[8]所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，以1，5-脱水葡萄糖醇作为基质进行测定时，以此时的所述蛋白质的酶活性为基本单位，添加所述蛋白质使每1mL试样达到1～500单位。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，使所述蛋白质作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇之前使用电子载体活化所述蛋白质。
[11]一种1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其特征在于，所述组合物含有下述蛋白质：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
[12]如[11]所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质来源于属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的菌。
[13]如[11]或[12]所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质来源于中华根瘤菌97507(Sinorhizobiumsp.97507)(保藏号：FERM P-19428)。
[14]如[11]～[13]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
[15]如[11]～[14]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为100％时，所述蛋白质对D-葡萄糖的反应性为10％以下。
[16]如[11]～[15]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质是使用电子载体活化的蛋白质。
[17]如[16]所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述电子载体为吩嗪硫酸二甲酯(phenazine methosulfate)及1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(1-methoxy-5-methyl phenaziniummethylsulfate)中的至少一种。
[18]如[11]～[17]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物还含有显色基质。
[19]如[18]所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述组合物是还含有电子载体的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，所述显色基质为还原性显色基质。
[20]蛋白质(a)、(b)或(c)：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成的蛋白质，所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上；
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有85％的序列同源性的氨基酸序列形成的蛋白质，所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
[21]一种诊断糖尿病的方法，其中，使用[11]～[19]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物。
[22][10]～[19]中任一项所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物在测定1，5-脱水葡萄糖醇中的应用。
[23]下述蛋白质在测定1，5-脱水葡萄糖醇中的应用，所述蛋白质为：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
根据本发明，能提供一种1，5-AG测定方法及1，5-AG测定试剂组合物，所述1，5-AG测定方法在测定检体中的1，5-AG值时，干扰物质的影响小，与现有方法相比，能更高精度地测定1，5-AG值。
进而，根据本发明的1，5-AG测定方法及1，5-AG测定试剂组合物，能适用血浆、血清、脑脊髓液、尿等临床检体，能迅速且简便地定量、检测检体中的1，5-AG。另外，也能进行小规模测定，在临床检查中广泛使用的全自动生化检查分析装置等中也能实现高精度且高灵敏度的1，5-AG的检测、定量。
附图说明
[图1]表示实施例1中用于制备山梨糖脱氢酶的质粒pUCNNT2的构筑顺序的前半工序的简图。
[图2]表示图1的构筑顺序的后半工序的简图。
[图3]表示实施例1中制备的山梨糖脱氢酶的最佳pH的测定结果图。
[图4]表示实施例1中制备的山梨糖脱氢酶的pH稳定性的测定结果图。
[图5]表示实施例1中制备的山梨糖脱氢酶的最佳温度的测定结果图。
[图6]表示实施例1中制备的山梨糖脱氢酶的温度稳定性的测定结果图。
[图7]表示实施例1中制作的校正曲线的图。
[图8]表示实施例2中用于制备山梨糖脱氢酶的质粒pUCpTrcAGD1的构筑顺序的工序的简图。
[图9]表示实施例2中制作的校正曲线的图。
[图10]表示实施例3中使用实施例2中制备的山梨糖脱氢酶的临床检体的测定结果图。
具体实施方式
本发明的1，5-AG的测定方法的特征在于，使用下述蛋白质：(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
以下，将上述蛋白质表述成山梨糖脱氢酶。
用于本发明的测定方法的山梨糖脱氢酶优选具有以下的理化学性质。
(1)最佳pH：约8.0。其中，在6.3-9.1的范围显示50％以上的活性。
(2)pH稳定性：在40℃下处理15分钟后，在pH5.9～8.6之间稳定。
(3)最佳温度：在pH7.0缓冲液中，最佳温度为60℃左右。
(4)温度稳定性：即使在pH7.0缓冲液中、在45℃下处理10分钟后也具有77％以上的残留活性，在约45℃以下稳定。
(5)基质特异性及Km值：作为基质，较强作用于1，5-AG及L-山梨糖，对D-半乳糖、D-葡萄糖等糖几乎没有作用或作用较弱。对1，5-AG的Km值为82.5mM左右，对L-山梨糖的Km值为65.6mM左右。
(6)分子量及亚单位分子量：总分子量为约150kDa及约672kDa左右，亚单位分子量为约59.6kDa左右。
(7)抑制剂特异性：被重金属离子(Mn2+、Hg2+、Cu2+)较强抑制。
(8)作用于L-山梨糖，生成L-山梨酮。
(9)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶。
用于本发明的测定方法的山梨糖脱氢酶只要具有本说明书中记载的特征即可，对其来源、制法等没有特别限定，可以为天然蛋白质、用基因工程方法由重组DNA表达的蛋白质或化学合成蛋白质中的任一种。特别是用于本发明的测定方法的山梨糖脱氢酶优选来源于属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的菌，更优选来源于中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(保藏号：FERM P-19428)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti(优选为Strain 1021))，最优选来源于中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(保藏号：FERM P-19428)。
此处，所谓“来源于”，表示上述菌具有的山梨糖脱氢酶基因编码的蛋白质，是由该菌体直接提取的蛋白质、利用基因工程方法表达的蛋白质、化学合成的蛋白质等，对其制备方法没有特别限定。
以下说明使用基因工程方法的制备用于本发明测定方法的山梨糖脱氢酶的方法之一例。
(DNA的提取)
将中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(FERM P-19428)的菌体用超声波处理或溶菌酶处理破坏细胞壁后，用苯酚等提取DNA，用盐析及乙醇沉淀等回收DNA。
(PCR)
以如上所述提取的来源于中华根瘤菌97507(Sinorhizobiumsp.97507)(FERM P-19428)的DNA为模板，另外使用以山梨糖脱氢酶基因的碱基序列为基础制作的多个引物，进行PCR，扩增山梨糖脱氢酶基因。所得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳等纯化，从琼脂糖凝胶中提取山梨糖脱氢酶基因DNA。
(重组载体的制作)
用于制作重组载体的表达载体从下述物质中适当选择：表达的蛋白质以原本的形态生产得到的表达载体；或以在其N末端或C末端添加了组氨酸标签的形态生产得到的表达载体；或以在N末端或C末端融合麦芽糖结合蛋白质或GST肽的形态生产得到的表达载体等。重组载体可以如下制作：将表达载体和上述PCR得到的山梨糖脱氢酶基因DNA用例如NcoI、HindIII等相同的限制酶切断后，将酶基因DNA连接在载体上，由此制作重组载体。
需要说明的是，表达载体可以使用市售品，但较优选使用将该市售的质粒载体的特定部位进行置换稳定化得到的表达载体。
另外，如上所述，用于本发明的测定方法的山梨糖脱氢酶的特征在于，使用下述蛋白质：(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％(60％～100％)的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质，关于该同源性，优选为65％以上(65％～100％)，较优选为75％以上(75％～100％)，更优选为85％以上(85％～100％)。
只要考虑上述氨基酸序列的同源性且制备的重组型山梨糖脱氢酶实现本发明的目的，就可以通过使用Kunkel法等公知的碱基置换技术的部位特异性突变对插入在上述表达载体中的山梨糖脱氢酶基因编码区域进行氨基酸的置换、添加、缺失等操作，还可以通过使用易错PCR(error-prone PCR)法等公知的碱基置换技术的随机变异进行氨基酸的置换、添加、缺失等操作。进而也设想对于从多种细菌等中分离的山梨糖脱氢酶基因，通过DNA改组(shuffling)等公知技术制备具有更优异的性状的山梨糖脱氢酶。
需要说明的是，本发明中所说的用语“同源性”，是指2个以上基因序列相对于彼此的同一性程度。因此，某二个基因的同源性越高，上述序列的同一性或类似性越高。可以通过序列的直接比较，或为核酸时通过在严格条件下的杂交法研究2种基因是否具有同源性。
(转化体的制作)
可以使用目前公知的方法将掺入了所述山梨糖脱氢酶基因的重组载体导入(转化(移入))宿主细胞中。例如，为细菌(E.coli、Bacillus subtilis等)时，例如可以用Cohen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、第69卷、第2110页、1972年)、原生质体法(Mol.Gen.Genet.、第168卷、第111页、1979年)或感受态法(Journalof Molecular Biology(J.Mol.Biol.)、第56卷、第209页、1971年)进行转化；为酵母(Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris等)时，例如可以通过Hinnen等的方法(Proc.Natl.Acad.USA.、第75卷、第1927页、1978年)或锂法(J.Bacteriol.、第153卷、第163页、1983年)进行转化；为动物细胞时，例如可以用Graham的方法(Virology、第52卷、第456页、1973年)进行转化；为昆虫细胞时，例如可以用Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.、第3卷、第2156～第2165页、1983年)进行转化。需要说明的是，转化无需通过上述重组载体来表达，例如可以使用将用于本发明的山梨糖脱氢酶基因直接插入宿主细胞的染色体DNA中，使其表达的方法。本发明中，考虑到处理容易且能在较短时间内制备大量重组蛋白质，优选以细菌和酵母作为宿主，较优选以属于埃希菌(Escherichia)属的微生物作为宿主。
(山梨糖脱氢酶的表达、采集)
用于本发明的测定方法的山梨糖脱氢酶可以将如上所述调制得到的含有表达载体的转化细胞培养在营养培养基中，采集表达的山梨糖脱氢酶而获得。营养培养基优选含有宿主细胞(转化体)生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，例如可以举出葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖、甲醇等。作为无机氮源或有机氮源，例如可以举出铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、胨、酪蛋白、肉浸汁、大豆渣、马铃薯提取液等。另外，也可以根据希望含有其他营养素(例如无机盐(例如氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。可以通过本领域所知的方法来进行培养。培养条件、例如温度、培养基的pH及培养时间可以适当选择，使其能产生大量上述山梨糖脱氢酶。
如上所述，表达上述山梨糖脱氢酶的微生物等宿主细胞(转化体)可以通过离心分离等操作从培养液中回收。将回收的宿主细胞悬浮在各种适当的缓冲液中后，进行超声处理等机械处理、溶菌处理等酶处理，可以进一步根据目的组合各种亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等公知的纯化技术，纯化上述山梨糖脱氢酶。
另外，如上所述，用于本发明的山梨糖脱氢酶以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶，但基于上述通常的条件制备山梨糖脱氢酶时，即使不从外部添加FAD，也能调制结合有该辅酶的状态的山梨糖脱氢酶。
因此，在上述制备工序中，无需在本发明的1，5-AG测定方法及1，5-AG试剂组合物中人为地添加FAD。
(山梨糖脱氢酶的活化法)
本发明的山梨糖脱氢酶在电子载体的存在下进行培养时被活化。因此，可以在本发明的测定方法及制备1，5-AG测定试剂组合物之前，预先进行该活化处理。特别是适用的试样为血液等临床检体时，考虑到能高灵敏度地检测1，5-AG，优选将上述山梨糖脱氢酶预先进行活化处理。
作为用于活化的电子载体，有吩嗪硫酸二甲酯(PMS)或1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(1m-PMS)等。使用1m-PMS时，在上述调制完的山梨糖脱氢酶中添加1m-PMS至最终浓度为0.01～50mM、较优选为0.01～10mM，在pH5～9、温度4～45℃下培养30分钟～1天。活化处理后，在调制测定试剂后1m-PMS过量的情况下，可以通过透析或超滤等除去过量的1m-PMS，用于本发明的测定方法及制备1，5-AG测定试剂组合物。
通过上述处理，可以将用于本发明的山梨糖脱氢酶活化，但如下所述，以1，5-AG作为基质进行测定时的酶活性在活化处理前和处理后优选活化2倍以上(2～20倍)、更优选4倍以上(4～10倍)。
(测定方法)
本发明的1，5-AG的测定方法可以正确测定血液或脑脊髓液等检体中的1，5-AG量。如上所述，由于血液中的1，5-AG值作为糖尿病的控制标记有用，所以本发明的测定方法对于诊断糖尿病有用。
本发明的1，5-AG的测定方法例如可以用以下的方法实施。在预计含有1，5-AG的体液试样(检体)中添加本发明的山梨糖脱氢酶，使每1mL试样中以1，5-AG为基质测定时的酶活性作为基本单位，达到1～500单位，进而，在为通过本发明的山梨糖脱氢酶直接反应的显色基质的情况下，仅添加将该显色基质；在为通过本发明的山梨糖脱氢酶不直接反应但在电子载体的存在下被还原显色的显色基质、或为虽然通过本发明的山梨糖脱氢酶稍微显色但在电子载体存在时强烈还原显色的显色基质的情况下，除添加上述显色基质之外，还添加电子载体，优选在4～50℃、特别优选25～40℃下培养优选1分钟～3小时、更优选1～30分钟、特别优选1～10分钟，同时测定吸光度的变化，从预先制作的校正曲线中测定检体中的1，5-AG浓度。
需要说明的是，本发明中，所谓“显色基质”包括上述通过脱氢酶直接反应的显色基质；在电子载体存在下发生还原显色的显色基质；及在电子载体存在时强烈还原显色的显色基质，进而，所谓“还原性显色基质”包括在电子载体的存在下还原显色的显色基质；及电子载体存在时强烈还原显色的显色基质。
用于本发明的1，5-AG测定方法的山梨糖脱氢酶需要至少使用在实用范围内与1，5-AG反应的山梨糖脱氢酶。山梨糖是不存在于生物体中的糖，对山梨糖的反应性没有特别问题。但是，对1，5-AG的反应性也取决于被供给的检体试样，以对山梨糖的反应性为100％时优选使用反应性为10％以上(10～200％)、更优选为50％以上(50～200％)的山梨糖脱氢酶。进而，用于本发明的1，5-AG测定方法的山梨糖脱氢酶使用对D-葡萄糖几乎不发生作用或作用较弱的山梨糖脱氢酶。由于D-葡萄糖大量存在于检体中，所以选择对1，5-AG的反应性为100％时，对D-葡萄糖的反应性为10％以下(0.001～10％)、更优选为5％以下(0.001～5％)的山梨糖脱氢酶，由此能大幅降低检体的前处理、特别是除去D-葡萄糖等糖类的处理的必要性及严密性，能简化测定、缩短测定时间、提高测定精度及削减成本等。
需要说明的是，上述“反应性”如下评价，相对于用于反应的酶量大量过剩的基质使山梨糖、1，5-AG、D-葡萄糖作用，用催化与基质的反应的酶的最大反应速度评价反应性。对山梨糖的情况给出了具体例，如下述山梨糖的[酶活性测定方法]所述。
如上所述，用于本发明的1，5-AG测定方法的山梨糖脱氢酶对1，5-AG的特异性高，但有时略受D-葡萄糖的影响。例如用于测定D-葡萄糖的浓度为1，5-AG的数千倍的糖尿病患者的检体时，有时无法忽视D-葡萄糖的影响。在上述检体中，为了完全避免D-葡萄糖的影响，需要在检体中加入D-葡萄糖除去剂或清除剂，预先清除D-葡萄糖的影响后测定1，5-AG。
作为除去D-葡萄糖等糖类的方法，例如有特公平5-41235号公报的使用离子交换树脂的方法。另外，作为清除D-葡萄糖的方法，例如可以利用特开平1-320998号公报、特公平7-71514号公报、特开平6-237795号公报、特开平3-27299号公报、特开平6-245796号公报、特公平7-102154号公报等所示的使用葡萄糖6位磷酸化酶(己糖激酶或葡糖激酶)，将D-葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的方法。优选利用能安装在生化检查用的广泛使用的自动测定机中的后者的D-葡萄糖清除法。作为此处所用的葡萄糖6位磷酸化酶，优选使用对D-葡萄糖特异性高的葡糖激酶。葡糖激酶的使用量因检体中的葡萄糖的量而不同，为1～20U/mL。另外，葡萄糖磷酸化所需的三磷酸腺苷(ATP)的量因检体中的葡萄糖的量而不同，为0.5～20mM。进而，为了促进D-葡萄糖的磷酸化，加入2～50mM氯化镁。
进而，在需要高度清除D-葡萄糖的情况下，例如使用用上述葡糖激酶的D-葡萄糖的6位磷酸化体系时，进一步组合酶循环体系、例如使用丙酮酸激酶的ATP循环体系等，从而可以实现完全清除D-葡萄糖。
作为通过本发明的山梨糖脱氢酶直接反应的显色基质，例如有2，6-二氯苯酚吲哚酚(DCIP)之类电子受体。
另外，也能适用下述方法：以铁氰化钾的铁氰化合物作为电子受体，在用山梨糖脱氢酶进行氧化还原反应后，检测电子受体本身的呈色变化或添加硫酸铁-dupanol试剂(ferric sulfate-dupanol reagent)，作为Procyanblue使其显色，但考虑到简便性及检测灵敏度，优选使用能与DCIP等直接反应以高灵敏度进行测定的显色基质。
作为本发明的在电子载体存在下还原显色的显色基质、或电子载体存在时强烈还原显色的显色基质，有四唑鎓或其盐类。作为具体例，可以举出硝基四唑蓝(NTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓·1钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓·1钠盐(WST-3)、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓·1钠盐(WST-8)等。该显色基质的使用浓度优选为0.05～4mM、特别优选为0.1～2mM的范围。
另外，作为用于使本发明的四唑鎓或其盐显色的电子载体，有吩嗪硫酸二甲酯(PMS)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(1m-PMS)等。使用1m-PMS时，其使用浓度优选为0.01～50mM、特别优选为0.01～10mM的范围。
作为能用于上述测定方法的缓冲液，为pH6～10的磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液、GOOD’S缓冲液、硼酸缓冲液等通常使用的缓冲液即可，可以任意适用。
(测定试剂组合物)
本发明的1，5-AG测定试剂组合物含有上述山梨糖脱氢酶作为必须成分，在糖尿病的诊断中有用，但可以根据目标检体试样、使用的显色剂、测定形态等适当改变该试剂形态。
例如，本发明的1，5-AG测定试剂组合物如上所述用于测定D-葡萄糖浓度高的糖尿病患者的检体时，可以与除去D-葡萄糖等糖类的试剂(糖类除去剂)组合。作为糖类的除去剂，能适用上述公知技术，优选组合硼酸结合树脂、阴离子交换树脂及阳离子交换树脂得到的除去剂或组合强碱性的阴离子交换树脂和阳离子交换树脂得到的除去剂。用强碱性阴离子交换树脂或硼酸处理检体时，不除去1，5-AG而选择性地除去糖类，能得到含有1，5-AG的试样。另外，通过使用不对1，5-AG起作用而对其他糖类起作用的酶，能除去1，5-AG以外的糖类。作为上述酶，例如可以举出上述己糖激酶或葡糖激酶，可以通过使用上述酶将葡萄糖磷酸化，除去葡萄糖。除此之外，还有使用葡萄糖氧化酶除去检体中的D-葡萄糖的方法等。需要说明的是，用葡萄糖氧化酶由D-葡萄糖得到的反应产物为D-葡萄糖酸-1，5-内酯。
本发明的1，5-AG测定试剂组合物可以混合全部作为单一试剂使用，存在相互干扰的成分时，可以适当分割各成分使其为合适的组成。另外，上述组合物可以调制成溶液状或粉末状试剂，也可以使滤纸或膜等适当的支撑体含有上述组合物调制成试验纸或分析用膜。需要说明的是，也可以添加高氯酸等除蛋白剂或含有一定量1，5-AG的标准试剂。优选调制成本组合物中的酶、山梨糖脱氢酶的量，以1，5-AG作为基质进行测定时的酶活性为基本单位，每1种试样的反应液中的最终浓度为0.1～50单位/mL左右。用于定量1，5-AG的检体例如可以举出血浆、血清、脑脊髓液、尿等。
作为本发明的1，5-AG测定试剂组合物的用途，作为最通常的用途，设想为生化检查用的大型的广泛使用的自动测定机，除此之外，认为还有将其小型化的专用仪器或面向私人诊所的医生的便携化仪器。
调制上述自动测定器用的1，5-AG测定试剂组合物时，例如在检体中添加D-葡萄糖清除剂、还原性显色剂、还原性显色剂为四唑鎓时四唑鎓和电子载体、山梨糖脱氢酶时，只需先添加D-葡萄糖清除剂，其他成分可以全部同时添加，即可以将上述成分集中调制成一个试剂。另外，例如，D-葡萄糖清除剂、四唑鎓、电子载体、山梨糖脱氢酶中存在相互干扰的成分时，只需分离上述成分调制各个试剂，就可以避免干扰。
下面给出实施例更详细说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
实施例
(实施例1)
[使用菌株的鉴定]
用于试验的菌株为从苜蓿的根瘤中分离的菌株，上述菌株的细菌学性质如下所述。
1.形态学性质
在酵母提取液-甘露醇培养基中培育的本菌株的形态性质如下所述。细胞的形态为杆菌，大小为0.5～0.9×1.2～3.0μm。不形成孢子，革兰氏染色性为阴性。
2.在各培养基中的培育状态
在酵母提取液-甘露醇培养基中培育的本菌株的培育状态如下所述。菌落呈奶油色，形状为圆形，凸状隆起，有粘性。在30℃下培养3天后的菌落直径为2～4mm。另外，有鞭毛，具有运动性。
3.生理学性质
本菌株是好氧性的，培育的最佳温度为25～30℃，培育的最佳pH为6～8。另外，各种糖类的利用性如表2所述，产生氧化酶及过氧化氢酶。
[表2]
 
D-阿拉伯糖 +
纤维二糖 +
果糖 +
D-半乳糖 +
葡萄糖 +
乳糖 +
D-甘露糖 +
甘露醇 +
D-核糖 +
木糖 +
纤维素 -
山梨糖 -
卫矛醇 -
岩藻糖 -
基于上述分离来源·性质，根据“Bergey’s Manual of DETERMINATIVE BACTERIOLOGY(第9版)”检索本菌株所属的属，判明该菌株为属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属的微生物，将本菌株命名为中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)株。该中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)株由本申请人于2003年7月10日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，在专利生物保藏中心于2003年7月11日通知的保藏证明中获得FERM P-19428的保藏号。以下，将该中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(FERM P-19428)记为保藏菌株。
需要说明的是，本申请人于2007年6月22日向独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(国际保藏局)申请将上述中华根瘤菌97507(Sinorhizobium sp.97507)(保藏号：FERM P-19428)移交国际保藏，该局在当日收到申请。在受理书中给予受理号FERMABP-10843。
[山梨糖脱氢酶的克隆]
从上述保藏菌株中提取染色体DNA，根据以下的顺序进行山梨糖脱氢酶的克隆。
1.染色体DNA的提取
将上述保藏菌株的菌体进行溶菌酶处理，破坏细菌的细胞壁后，用苯酚提取DNA，进行盐析，提取染色体DNA，回收。
2.PCR
在下述条件下进行PCR，获得含有约1.6kbp的山梨糖脱氢酶基因的PCR产物。
模板：1.中提取的来源于保藏菌株的DNA
引物：序列号3及序列号4表示的DNA
(以Sinorhizobium meliloti strain 1021 Genome Project(网页http：//sequence.toulouse.inra.fr/meliloti.html)公开的碱基序列SMa1414(推定L-山梨糖脱氢酶)为基础合成引物1、2。)
聚合酶：TaKaRa LA Taq(Takara-bio公司制)
反应条件：
a.在94℃下变性1分钟(1个周期)
b.在94℃下变性30秒
c.在57℃下退火1分钟
d.在72℃下进行延伸反应2分钟
e.在72℃下进行延伸反应5分钟(1个周期)
需要说明的是，b～d的反应进行30个周期。
3.从凝胶提取纯化
将由2.获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，使用QIAEXII GelExtraction Kit(Qiagen公司制)，从琼脂糖凝胶中提取山梨糖脱氢酶基因DNA。
4.限制酶处理
将在3.中从琼脂糖凝胶提取纯化的山梨糖脱氢酶基因DNA及质粒pUCNNT2用限制酶NcoI、HindIII进行限制酶处理。将限制酶处理后的山梨糖脱氢酶基因DNA及质粒pUCNNT2用琼脂糖凝胶电泳纯化，使用QIAEXII Gel Extraction Kit(Qiagen公司制)，从琼脂糖凝胶中提取山梨糖脱氢酶基因DNA及质粒pUCNNT2。
需要说明的是，上述质粒pUCNNT2是在市售的质粒pUC19(Takara-bio公司制)中添加了NcoI接头(linker)和来自助于质粒稳定化的pKK223-3(Pharmacia Biotech公司制)的rrnB核糖体终止子(ribosomal terminator)的质粒，特别适合表达用于本发明的山梨糖脱氢酶。图1及图2为构筑用于本实施例的质粒pUCNNT2的流程图。如图1、图2所述，上述质粒pUCNNT2经以下工序1～5进行构筑。
工序1：制作在市售的质粒pUC19(Takara-bio公司制)中添加NdeI接头得到的pUCNde。
工序2：用PCR扩增pKK223-3(Pharmacia Biotech公司制)的EcoRI-SspI区域。此时，添加NdeI接头(PCR product NdeI-SspI片断)。
需要说明的是，图1中所示的PCR product NdeI-SspI片断中的rrnBT1T2助于质粒稳定化。
工序3：制作将pUCNde的NdeI-SspI区域与上述PCR product NdeI-SspI片断置换得到的质粒pUCNNT。
工序4：用PCR扩增所述pUCNNT的Cfr10I-BamHI区域。此时，将NdeI接头转化为NcoI接头。
工序5：将上述扩增片断与pUCNNT的Cfr10I-BamHI置换，制作质粒pUCNNT2。
5.连接
使用DNA Ligation Kit Ver2.1(Takara-bio公司制)使经4.限制酶处理后的山梨糖脱氢酶基因DNA及质粒pUCNNT2连接，构筑质粒pUCNNT2_AGD1。
6.转染
使用5.中构筑的质粒pUCNNT2_AGD1，转化E.coliJM109感受态细胞(Competent Cell)(Takara-bio公司制)，在含有氨苄青霉素钠的LB板中播种，在37℃下培养一夜。确认用直接PCR在20个生长在含有氨苄青霉素钠的LB板中的菌落中是否导入含有山梨糖脱氢酶基因的质粒。将确认了山梨糖脱氢酶基因扩增的7株播种在含有氨苄青霉素钠的LB板中，进行纯化。
7.确认活性
(1)将7株纯化的基因重组体大肠杆菌在下述条件下进行液体培养。
培养基：
LB培养基10mL
Bacto Tryptone(Bectone，Dickinson and Co.制)1.00％(w/v)
Bacto Yeast Extract(Bectone，Dickinson and Co.制)0.50％(w/v)
氯化钠(Nacalai Tesque公司制)1.00％(w/v)
氨苄青霉素钠(和光纯药公司制)0.005％(w/v)
培养容器：试验管(直径2.5×长度20cm)
培养条件：37℃、15小时、121rpm
(2)采集10mL培养液分量的菌体(1000×g、10分钟、室温)。
(3)除去上清液，用1mL破碎缓冲液(crushing buffer)(50mMKPB(pH7.5)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.01％(w/v)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD))悬浮菌体。
(4)用探头式超声波破碎装置将菌体破碎(冰浴、5分钟)。
(5)将菌体破碎液进行离心分离(13000×g4℃5分钟)，回收上清液(无细胞提取液)，将其用作活性测定用样品。
(6)基于下述[酶活性测定方法]进行活性表达的确认，将山梨糖脱氢酶活性最强的株作为E.coliJM109/pUCNNT2_AGD1。需要说明的是，每份培养基的山梨糖脱氢酶活性为0.080U/mL培养基。
另外，针对从E.coliJM109/pUCNNT2_AGD1的培养菌体中提取的质粒pUCNNT2_AGD1，确认碱基序列时，确认插入了编码山梨糖脱氢酶的DNA片断。其碱基序列用序列号1表示，氨基酸序列用序列号2表示。
需要说明的是，将本实施例中确定的碱基序列与公开在上述Sinorhizobium meliloti strain1021的基因组测序计划(genome project)中的山梨糖脱氢酶推定编码区域(Locus tag：SMa1414)相比较。结果，第160个碱基在SMa1414中为腺嘌呤(A)，而本实施例的第160个碱基为胞嘧啶(C)。通过该碱基的置换，第54个氨基酸在SMa1414(ACCES SION No.：NP_436019)中为甲硫氨酸(Met)，而本实施例中为亮氨酸(Leu)。
[山梨糖脱氢酶的制备]
培养上述制作的具有山梨糖脱氢酶基因的基因重组体(E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1)，从所得的菌体中分离·纯化山梨糖脱氢酶。
需要说明的是，该基因重组体E.coliJM109/pUCNNT2_AGD1由本申请人于2006年3月28日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，在2006年3月28日专利生物保藏中心通知的保藏证明中得到保藏号为FERM P-20854。
1.培养
菌株：基因重组体E.coliJM109/pUCNNT2_AGD1
1.1 种培养
在容量为2.0L的坂口烧瓶中加入1.0L LB培养基，进行高温灭菌器灭菌(121℃、20分钟)，进而在使用前添加用过滤器灭菌得到的氨苄青霉素钠至终浓度为0.005％(w/v)。在该LB培养基中用铂圈种植基因重组体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1，在37℃下振荡培养(120rpm)。将培养开始13小时后的培养液作为本培养时的菌种。
LB培养基组成：
Bacto Tryptone(Bectone，Dickinson and Co.制)1.00％(w/v)
Bacto Yeast Extract(Bectone，Dickinson and Co.制)0.50％(w/v)
氯化钠(Nacalai Tesque公司制)1.00％(w/v)
氨苄青霉素钠(和光纯药公司制)0.005％(w/v)
1.2 本培养
在容量为30L的培养装置中加入21L GYC培养基，进行高温灭菌器灭菌(121℃、20分钟)，进而在使用前添加用过滤器灭菌得到的氨苄青霉素钠(和光纯药公司制)及异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(Sigma Aldrich Japan公司制)，使终浓度分别为0.005、0.024％(w/v)。
GYC培养基组成：(用15N的NaOH调节至pH7.0)
丙三醇(阪本药品工业公司制)4.0％(w/v)
酵母提取液(味之素公司制)2.0％(w/v)
玉米浆(Sanei糖化公司制)4.5％(w/v)
在上述培养基中种植1L上述1.1中准备的菌种，在下述条件下培养15小时。需要说明的是，培养中用15N的NaOH将pH控制为7.0。
培养温度：37℃
通气量：1v/v/m
旋转数：350rpm
培养开始15小时后，使用离心分离机，回收955.06g菌体。
2.纯化
经以下的各精制工序从由上述培养得到的菌体分离·纯化山梨糖脱氢酶。测定主要的精制工序中的山梨糖脱氢酶的总活性、比活性、回收率、比活性倍数(fold)。结果示于表3。
需要说明的是，基于下述[酶活性测定方法]测定山梨糖脱氢酶活性。
[表3]
 
纯化工序 总活性(U) 比活性(U/mg) 回收率(％) fold
CFE 3.318 0.24 100 1.00
硫酸铵透析 2.894 0.918 87.2 3.82
强阴离子交换色谱法(TOYOPEARL Super0.650M) 619 0.777 18.7 3.23
脱盐浓缩 798 105 24.0 4.35
2.1 无细胞提取液(CFE)的调制
使用上述1.2的本培养中得到的955.06g菌体中的200g，进行纯化。在菌体200g中加入1L破碎缓冲液(50mM KPB(pH7.5)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mM FAD)，制作菌体悬浮液。在该菌体悬浮液中添加作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM，用探头式超声波破碎装置破碎。将菌体破碎液进行离心分离(13000×g、4℃、15分钟)，回收上清液。将该上清液作为CFE。
2.2 硫酸铵分离
在冰浴下，在上述2.1回收的1095mL CFE中加入硫酸铵至终浓度40％(w/v)。此时，用氨水调节至pH为7.5。硫酸铵溶解后，在4℃下静置一夜。
2.3 透析
通过离心分离(13,000×g、4℃、15分钟)回收硫酸铵沉淀。将回收的硫酸铵沉淀放入透析管(无缝纤维素管(seamless cellulosetube)小尺寸18和光纯药公司制)中，使用透析缓冲液(5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mMFAD)，进行透析。
2.4 离心分离
由于在透析管内产生了不溶物，所以通过离心分离(13000×g、4℃、15分钟)除去该不溶物，回收上清液。
2.5 强阴离子交换色谱法(TOYOPEARL SuperQ650M)
在350mL用平衡化缓冲液(5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mM FAD)平衡化的强阴离子交换树脂TOYOPEARL SuperQ650M(东曹公司制)(柱大小：
Figure A200780023052D0027164958QIETU
6.2cm×高度27cm)中装入上述2.3中回收的上清液。装入结束后，用树脂床体积的5倍量的洗涤缓冲液(5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mM FAD)洗涤后，使用树脂床体积的2.5倍量的2种洗脱缓冲液(1:5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mM FAD、2:5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.001mMFAD、1M NaCl)，使目标蛋白梯度洗脱，回收活性成分。
2.6 脱盐浓缩
使用超滤装置VIVACELL250(Vivascience公司制、截留分子量1万)，进行在上述2.5的强阴离子交换色谱法(TOYOPEARLSuperQ650M)中回收的活性成分的脱盐浓缩，将最终溶解酶的缓冲液置换为50mM KPB(pH7.5)、0.25％(w/v)BL-9EX(日光化学公司制)、0.01mM FAD，得到山梨糖脱氢酶。
[酶活性测定方法]
将1mL0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0mL1.0M L-山梨糖、0.14mL 3mM 2，6-二氯苯酚吲哚酚(DCIP)、0.2mL 3mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯、0.61mL水添加在3mL石英池中，安装在带有恒温池支架的分光光度计中，在37℃下培养10分钟后，添加0.05mL酶溶液，然后，在37℃下测定DCIP在600nm的吸光度变化(ΔABS600/min)。以DCIP在pH7.0的摩尔吸光系数为16.3mM-1，以1分钟内还原1μmol DCIP的酶量为1单位(unit)，根据下式求出酶活性浓度。
酶活性浓度(units/mL)＝
(-ΔABS600/min×3.0×稀释倍率)/(16.3×1.0×0.05)
光路长：1.0cm
[山梨糖脱氢酶的性质试验]
适当改变上述[酶活性测定方法]的测定条件，对于上述2.6中得到的山梨糖脱氢酶的最佳pH、pH稳定性、最佳温度、温度稳定性、基质特异性、Km值、总分子量、亚单位分子量、抑制剂、酶反应产物的鉴定，如下所述进行试验，调查本酶的性质。
(1)最佳pH：
将上述[酶活性测定方法]中的缓冲液替换为乙酸·乙酸钠缓冲液(pH3.71～5.36)、柠檬酸·磷酸钠缓冲液(pH5.55～5.95)、磷酸钾缓冲液(pH6.25～7.35)、Tris·盐酸缓冲液(pH7.52～8.34)、甘氨酸·氢氧化钠缓冲液(pH8.68～9.11)(各缓冲液的终浓度均为33.3mM)，测定纯化酶的酶活性浓度。需要说明的是，计算酶活性浓度时，使用预先求出的各pH的DCIP的摩尔吸光系数。该结果示于图3。如图3所示，该山梨糖脱氢酶的最佳pH为8.0。
(2)pH稳定性：
将山梨糖脱氢酶分别溶解在50mM浓度的缓冲液、即乙酸·乙酸钠缓冲液(pH4.14～5.91)、柠檬酸·磷酸钠缓冲液(pH5.91～6.30)、磷酸钾缓冲液(pH6.59～7.47)、Tris·盐酸缓冲液(pH7.53～8.39)、甘氨酸·氢氧化钠缓冲液(pH8.61～10.30)中，通过上述[酶活性测定方法]测定在40℃下保持15分钟后的酶活性。其结果示于图4。如图4所示，该山梨糖脱氢酶在pH5.9～8.6的区域稳定。
(3)最佳温度：
将山梨糖脱氢酶溶解在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，使上述[酶活性测定方法]的温度在35℃～70℃的范围变化，测定酶活性。将该结果示于图5。如图5所示，该山梨糖脱氢酶的最佳温度在60℃左右。
(4)温度稳定性：
将山梨糖脱氢酶溶解在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.25％BL-9EX(日光化学公司制)、0.01mM FAD中，在30℃～70℃的各温度下保持10分钟后，通过上述[酶活性测定方法]测定，求出酶活性的残留率。该结果示于图6。如图6所示，该山梨糖脱氢酶在45℃下也保持77％的酶活性，在约45℃以下稳定。
(5)基质特异性及Km值：
作为上述[酶活性测定方法]的活性测定用反应液的基质，使用1，5-AG、L-山梨糖及表4中所示的其他各基质(终浓度均为333mM、乳糖为167mM)时，根据[酶活性测定方法]测定此时的活性，求出相对反应性。结果以L-山梨糖的活性值为基准，以相对于各个基质的相对值表示。
[表4]
基质特异性
 
基质 相对活性(％)
1)L-(-)-山梨糖2)1，5-脱水葡萄糖醇3)烯丙基醇4)D-(-)-山梨糖5)2-甲基-1-丙醇6)D-(+)-半乳糖7)1-丁醇8)D-(+)-葡萄糖9)木糖醇10)1-丙醇11)乳糖12)2-丙醇13)2，3-丁二醇14)D-(+)-甘露糖15)乙醇16)丙三醇17)麦芽糖18)D-(-)-果糖       10079.13.802.962.061.691.291.220.890.750.710.390.260.150000   
由表4的结果可知，该山梨糖脱氢酶较强作用于1，5-AG和L-山梨糖，较弱作用于烯丙基醇、D-山梨糖、2-甲基-1-丙醇、D-半乳糖、1-丁醇、D-葡萄糖。另外，几乎不作用于木糖醇、1-丙醇、乳糖、2-丙醇、2，3-丁二醇、D-甘露糖、乙醇、丙三醇、麦芽糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、蔗糖、D-海藻糖、D-棉子糖、肌醇、meso-赤藓醇、2-丁醇、2-戊醇、丙二醇、甲醇。
另外，该山梨糖脱氢酶的Km值对1，5-AG为82.5mM，对L-山梨糖为65.6mM。
(6)总分子量及亚单位分子量：
流动相使用含有0.2M NaCl的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，用TSKgel BioAssist G4SWXL柱(直径0.78cm×长度30cm、东曹公司制)在流速0.5mL/分钟的条件下分析该山梨糖脱氢酶的总分子量。通过与分子量标记(Oriental酵母公司制)、分子量标记(AmershamBiosciences公司制)及IgM(Sigma公司制)比较，推定该山梨糖脱氢酶以总分子量约150kDa和约672kDa的形态存在。
使用10％聚丙烯酰胺凝胶，根据Laemmli等的方法，将该山梨糖脱氢酶施加在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中。泳动后用考马斯亮蓝染色，将移动度与分子量标记(Amersham Biosciences公司制)的移动度进行比较，结果推定本发明的山梨糖脱氢酶的亚单位分子量为约59.6kDa。
(7)抑制剂：
在上述[酶活性测定方法]的活性测定用反应液中分别加入表5中所述各种添加物，至终浓度为1mM，测定山梨糖脱氢酶的活性。除不加入添加物之外根据[酶活性测定方法]制成对照。对照的活性值为100(％)，添加1)～39)的各种抑制剂时得到的活性值作为相对活性(％)而求出，结果记载在表5中。
[表5]
 
抑制剂 终浓度(mM) 相对活性(％)
对照不添加抑制剂 0 100
1)NaN3 1.0 115
2)AlCl3 1.0 109
3)8-羟基喹啉 0.3 106
4)EDTA·2Na 1.0 102
5)苯甲酸 1.0 101
6)富马酸 1.0 99
7)LiCl 1.0 98
8)H2O2 1.0 98
9)ZnCl2 1.0 98
10)meso-酒石酸 1.0 94
11)KCN 1.0 94
12)MgCl2 1.0 93
13)CaCl2 1.0 92
14)尿素 1.0 92
15)CdCl2 1.0 91
16)氨基胍硫酸盐 1.0 91
17)D-环丝氨酸 1.0 90
18)FeCl3 1.0 89
19)1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠 1.0 89
20)N-乙基马来酰亚胺 1.0 88
21)2，2’-联二吡啶 1.0 88
22)SnCl2 0.5 86
23)CoCl2 1.0 86
24)柠檬酸 1.0 86
25)DL-酒石酸 1.0 86
26)NaCl 1.0 85
27)DL-苹果酸 1.0 85
28)碘乙酸 1.0 83
29)PbCl2 1.0 83
30)马来酸 1.0 82
31)NiCl2 1.0 80
32)BaCl2 1.0 80
33)1，10-菲绕啉 1.0 77
34)2-(对)硝基苯甲酸 1.0 75
35)吖啶黄 1.0 66
36)Triton X-100 1.0 39
37)MnCl2 1.0 11
38)HgCl2 1.0 0
39)CuCl2 1.0 0
由表5的结果可知，该山梨糖脱氢酶被重金属离子(Mn2+，Hg2+，Cu2+)较强抑制。另外，吖啶黄中相对活性为66％。
(8)酶反应产物的鉴定：
添加上述2.6中得到的山梨糖脱氢酶3.87U，调节成300mM L-山梨糖、50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、60mM1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯、498U/mL过氧化氢酶(和光纯药公司制)，边搅拌得到的酶反应溶液1.5mL，边在室温下反应2小时。将用离心超滤器Microcon YM-10(Amicon公司制、截留分子量1万)除去酶得到的酶反应溶液用高效液相色谱法进行分析。结果，与保留时间的标准品相比较，鉴定酶反应产物为L-山梨酮。此处，作为标准品使用的L-山梨酮是预先化学合成的。
需要说明的是，高效液相色谱法的分析条件如下所述。
柱：High Performance Carbohydrate Column(Waters公司制)
检测：RI
洗脱液：乙腈:蒸馏水＝6:4(含有50mM磷酸钾缓冲液(pH6.0))
流速：1.0mL/min
柱温度：35℃
进样量：10μL
[校正曲线制作]
将上述[酶活性测定方法]的基质从L-山梨糖改变为1，5-AG，使其终浓度在1.5～40.6mM的范围变化，测定吸光度变化，绘出1，5-AG浓度和吸光度变化(ΔABS600/min)的关系，制作图7所示的校正曲线。如图7所示，可知该山梨糖脱氢酶能定量终浓度1.5～40.6mM的1，5-AG。
[辅酶]
对山梨糖脱氢酶实施酸处理，将通过酸处理从山梨糖脱氢酶的蛋白中游离的黄素化合物用高效液相色谱法进行分析。从山梨糖脱氢酶游离的黄素化合物由于保留时间与FAD的标准品一致，所以可知该山梨糖脱氢酶的辅酶为FAD。
(实施例2)
接下来，给出通过使用置换型高表达质粒(以下为pUCpTrcAGD1。)制备重组山梨糖脱氢酶及将该山梨糖脱氢酶活化，高灵敏度地检测1，5-AG的例子。
需要说明的是，pUCpTrcAGD1中，如下所述，在紧邻该山梨糖脱氢酶基因的起始密码子后方添加编码谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)的密码子，基于此不同于上述pUCNNT2_AGD1。
以下，按图8简略给出的顺序，详细说明质粒pTrcAGD1的构筑方法。
[1]质粒pTrcAGD1的构筑
1.PCR(图8中、工序1)
在下述条件下进行PCR，获得含有约1.6kbp的置换型山梨糖脱氢酶基因的PCR产物。
模板：pUCNNT2_AGD1
引物：序列号7及8表示的DNA
聚合酶：Takara LA Taq(Takara-bio公司制)
需要说明的是，序列号7表示的引物含有限制酶NcoI位点及上述谷氨酸(gaa)、苯丙氨酸(ttc)的添加序列，序列号8表示的引物含有限制酶BamHI位点。各引物的位置关系示于图8的工序1。
反应条件：
a、在94℃下变性2分钟(1个周期)
b、在94℃下变性40秒
c、在58℃下退火30秒
d、在72℃下进行延伸反应2分钟
e、72℃下进行延伸反应5分钟(1个周期)
需要说明的是，b～d的反应进行35个周期。
2.PCR产物的纯化(图8中、工序1)
对1.中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认增幅，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司制)，纯化含有山梨糖脱氢酶基因的约1.6kbp的DNA。
3.限制酶处理(图8中、工序1)
将2.中纯化的含有山梨糖脱氢酶基因的约1.6kbp的DNA用限制酶NcoI、BamHI进行限制酶处理。对经限制酶处理的含有山梨糖脱氢酶基因的约1.6kbp的DNA进行琼脂糖凝胶电泳而纯化，使用QIAquickGel Extraction Kit(Qiagen公司制)，从琼脂糖凝胶中提取含有山梨糖脱氢酶基因的约1.6kbp的DNA。
质粒pTrc99A(Amersham Biosciences公司制)用限制酶NcoI、BamHI进行限制酶处理后，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司制)进行纯化。
4.连接(图8中、工序2)
将3.中进行限制酶处理的含有山梨糖脱氢酶基因的约1.6kbp的DNA及pTrc99A使用Ligation high(东洋纺公司制)连接，构筑质粒pTrcAGD1。pTrcAGD1的质粒模式图示于图8的工序2。
5.转染
使用4.中构筑得到的质粒pTrcAGD1，转化E.coli JM109感受态细胞(Takara-bio公司制)，播种在含有氨苄青霉素钠的LB板中，在37℃下培养一夜。将生长的菌落在下述条件下培养。
培养基：LB培养基10ml
培养容器：试验管(直径2.5×长度20cm)
培养条件：30℃、20小时、210rpm
使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从培养液中提取质粒，将该质粒用限制酶NcoI或BamHI处理，对该处理后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳确认是否导入山梨糖脱氢酶基因。
需要说明的是，置换型山梨糖脱氢酶基因如序列号5所示，其氨基酸序列如序列号6所示。
[2]质粒pUCpTrcAGD1的构筑
1.PCR(图8中、工序3)
在下述条件下进行PCR，获得含有约2.2kbp的trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的PCR产物。
模板：pTrcAGD1
引物：序列号9及10表示的DNA
聚合酶：Takara Ex Taq(Takara-bio公司制)
需要说明的是，序列号9及序列号10表示的引物分别含有Bg1II位点作为连接序列。
反应条件：
a、在96℃下变性5分钟(1个周期)
b、在96℃下变性40秒
c、在58℃下退火40秒
d、在72℃进行延伸反应2分钟
e、在72℃下进行延伸反应5分钟(1个周期)
需要说明的是，b～d的反应进行25个周期。
2.从凝胶提取纯化(图8中、工序3)
将1.中获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，使用QIAquickGel Extraction Kit(Qiagen公司制)，从琼脂糖凝胶中提取含有trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的约2.2kbp的DNA。
3.限制酶处理(图8中、工序3、4)
将2.中从琼脂糖凝胶中提取纯化的含有trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的约2.2kbp的DNA用限制酶Bg1II进行限制酶处理。经限制酶处理后的含有trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的约2.2kbp的DNA通过琼脂糖凝胶电泳纯化，使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen公司制)，从琼脂糖凝胶中提取含有trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的约2.2kbp的DNA。
将质粒pUC19用限制酶BamHI进行限制酶处理后，进行脱磷酸化处理。
4.连接(图8中、工序4)
使用Ligation high(东洋纺公司制)连接3.中经限制酶处理后的含有trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的约2.2kbp的DNA及pUC19，构筑质粒pUCpTrcAGD1。关于pUCpTrcAGD1的质粒模式图，示于图8的工序4。
5.转染
使用4.中构筑的质粒pUCpTrcAGD1，转化E.coliJM109感受态细胞(Takara-bio公司制)，播种在含有氨苄青霉素钠的LB板中，在37℃下培养一夜。生长的菌落在下述条件培养。
培养基：LB培养基10ml
培养容器：试验管(直径2.5×长度20cm)
培养条件：30℃、20小时、200rpm
使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从培养液中提取质粒，将该质粒用限制酶EcoRI或PstI处理，将经该处理的质粒通过琼脂糖凝胶电泳确认是否导入trc启动子及山梨糖脱氢酶基因。
将确认导入了trc启动子及山梨糖脱氢酶基因的上述E.coli克隆之一(以下为E.coliJM109/pUCpTrcAGD1。)供给至以下所示的“置换型山梨糖脱氢酶的制备”。
需要说明的是，对从该E.coliJM109/pUCpTrcAGD1中提取的质粒，确定山梨糖脱氢酶基因部位的碱基序列。该碱基序列如序列号5所示，氨基酸序列如序列号6所示。
确认碱基序列，结果，pUCpTrcAGD1中，紧邻插入的山梨糖脱氢酶基因的起始密码子之后，符合读框地顺次添加有gaa(谷氨酸)、ttc(苯丙氨酸)。
另外，对于上述质粒pUCNNT2_AGD1的山梨糖脱氢酶的编码区域中的第51个碱基胞嘧啶(C)、第108个碱基鸟嘌呤(G)及第168个碱基鸟嘌呤(G)，确认在pUCpTrcAGD1中与上述碱基相当的碱基分别依次被置换为胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)及腺嘌呤(A)。但是，除添加上述二个氨基酸之外，上述碱基置换并未导致其编码的山梨糖脱氢酶的氨基酸序列发生置换等变异。
[3]置换型山梨糖脱氢酶的制备
1.培养
菌株：基因重组体E.coliJM109/pUCpTrcAGD1
1.1 种培养
在容量为500mL的三角烧瓶中加入100mL LB培养基，用高温灭菌器灭菌，进一步在使用前加入用过滤器灭菌的氨苄青霉素钠至终浓度为0.01％(w/v)。在该LB培养基中用铂圈种植基因重组体E.coliJM109/pUCpTrcAGD1，在25℃下振荡培养(120rpm)。将培养开始21小时后的培养液作为本培养时的菌种。
1.2 本培养
在容量为500mL的三角烧瓶中加入100mL LB培养基，用高压灭菌器灭菌，进一步在使用前添加经过滤器灭菌后的氨苄青霉素钠至终浓度为0.01％(w/v)，调制40个烧瓶培养基。在各个培养基中分别种植2mL上述1.1中准备的菌种，在25℃下振荡培养(120rpm)3小时，在得到的培养液中添加经过滤器灭菌后的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至0.0024％(w/v)，进一步在25℃下振荡培养21小时。培养结束后，使用离心分离机回收菌体。
2.纯化
经以下的各纯化工序从上述培养得到的菌体中分离·纯化置换型山梨糖脱氢酶。其结果示于表6。
需要说明的是，山梨糖脱氢酶活性基于实施例1中记载的[酶活性测定方法]测定。
[表6]
 
纯化工序 总活性(U) 比活性(U/mg) 回收率(％) fold
CFE 883 0.19 100 1.00
硫酸铵盐析 517 0.24 58.6 1.26
弱阴离子交换色谱法(DEAE FF)       502 0.91 56.9 4.79
脱盐浓缩 322 0.94 36.5 4.95
2.1 无细胞提取液(CFE)的调制
在上述1.2的本培养中回收的菌体中加入360mL pH7.5的50mM磷酸钠缓冲液，制作菌体悬浮液。将该菌体悬浮液分成4份，分别使用超声波破碎装置(KUBOTA公司制INSONATOR201M)在输出180W下破碎30分钟。合并上述菌体破碎液，进行离心分离(11,000×g、4℃、30分钟)，回收355mL CFE。
2.2 硫酸铵分离
在冰浴下，在上述2.1中回收的CFE中加入BL-9EX至终浓度0.25％(v/v)，搅拌30分钟，溶解。进而，边一点点地溶解51.12g硫酸铵边加入至饱和浓度为25％。硫酸铵溶解后，进一步搅拌30分钟。将该溶解液进行离心分离(11,000×g、4℃、30分钟)，回收370mL上清液。然后，在冰浴下，在该上清液中边一点点地溶解34.41g硫酸铵边加入至饱和浓度为40％。硫酸铵溶解后，进一步搅拌30分钟后，在4℃下搅拌一夜。
2.3 透析
通过离心分离(11,000×g、4℃、30分钟)，回收硫酸铵沉淀。将回收的硫酸铵沉淀溶解在10mL pH7.5的50mM磷酸钠缓冲液中，放入透析管，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，20％丙三醇)进行透析。
2.4 离心分离
由于在透析管内产生不溶物，所以通过离心分离(27,000×g、4℃、15分钟)将其除去，回收21mL上清液。
2.5 弱阴离子交换色谱法(DEAE Sepharose Fast Flow)
在320mL用平衡化缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，20％丙三醇)平衡化的弱阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow(GEHealthcare BIO-SCIENCES公司制)(柱大小：f2.6cm×高度60cm)中装入上述2.4中回收的上清液。装入结束后，用树脂床体积的3倍量的洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，20％丙三醇)洗涤后，使用树脂床体积的5倍量的洗脱缓冲液(1:20mM Tris-HCl，pH7.5，20％丙三醇、2:20mM Tris-HCl，pH7.5，20％丙三醇，1M NaCl)，使目标蛋白梯度洗脱，回收262mL活性成分。
2.6 脱盐浓缩
使用超滤装置模型8200(Amicon公司制、超滤膜截留分子量10万)，将所述2.5的活性成分浓缩为21.5mL。将该浓缩液放入透析管，使用透析缓冲液(50mM HEPES，pH7.5)进行透析，进行缓冲液的置换。进而，使用离心浓缩器VIVASPIN20(Vivascience公司制、截留分子量10万)通过离心分离(2,700×g、4℃、3小时)浓缩至2.7mL，得到置换型山梨糖脱氢酶322U。
[4]置换型山梨糖脱氢酶的活化
用以下的方法将上述[3](“置换型山梨糖脱氢酶的制备”)中制备的山梨糖脱氢酶(以下简称为置换型酶)用1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(1m-PMS)处理，活化置换型酶。
在0.115mL上述[3]制备的浓度为119U/mL的置换型酶的溶液中加入1.765mL50mM HEPES缓冲液(pH7.5)和0.12mL20mM的1m-PMS水溶液，搅拌后，在冰箱中保存1夜进行活化。活化结束后，在离心浓缩器VIVASPIN20(Vivascience公司制、截留分子量5万)中添加全部量的该活化酶液，用10mL 50mM的HEPES缓冲液(pH7.5)稀释后放置在离心分离机中，以4,500rpm离心分离45分钟，浓缩至约0.3mL。进而，在该浓缩液中加入10mL 50mM的HEPES缓冲液(pH7.5)稀释后，再次离心分离，进行浓缩，除去1m-PMS。进一步重复2次相同的操作，几乎完全除去1m-PMS。最后，在该浓缩液中加入50mM的HEPES缓冲液(pH7.5)，使总液量为4mL，调整活化的置换型酶的浓度为3.4U/mL。
[5]活化效果的确认
使用经1m-PMS活化的酶和未处理的酶，分别配制实施例3(临床的1，5-AG的测定法)的R2试剂。使用上述R试剂，测定0和50μg/mL的1，5-AG标准液，比较各自的显色强度。50μg/mL的1，5-AG标准液导致的吸光度增加在活化前的酶的情况下为0.064，而在活化处理后的酶的情况下约为4倍达到0.248，可知酶被活化约4倍。
(实施例3)
[1]临床的1，5-AG的测定法
考虑到满足临床检查中广泛使用的全自动生化检查分析装置，组合了最小标尺的测定法。
预先调制以下组成的测定试剂、R1-1试剂(葡萄糖清除剂)、R1-2试剂(1m-PMS水溶液)、R2试剂(1，5-AG检测剂)。
在试验管中加入9μL作为样品的1，5-AG标准液或临床检体、200μL R1-1试剂，搅拌，在37℃的恒温水槽中反应5分钟。反应后，进一步加入10μL R1-2试剂和100μL R2试剂，搅拌，立即将该反应液转移入分光光度计用的池中，安装在被加热至37℃的池支架上，测定5分钟在450nm处吸光度的变化。
需要说明的是，用于本实施例的临床检体是由健康者和糖尿病患者采集的血清。
·试剂组成
R1-1试剂(葡萄糖清除剂)
氯化钾            49.6mM
氯化钠            100mM
EDTA·2钠         0.1mM
磷酸烯醇丙酮酸    8.01mM
ATP               0.99mM
氯化镁            7.38mM
丙酮酸激酶(东洋纺制)  5U/mL
葡糖激酶(Unitika制)   4U/mL
WST-1                 0.95mM
HEPES缓冲液           50mM(pH7.5)
R1-2试剂(1m-PMS水溶液)
1m-PMS                0.4mM
R2试剂(1，5-AG检测剂)
置换型酶              3.4U/mL
HEPES缓冲液           50mM(pH7.5)
[2]校正曲线的制作
使用以血清为基础的基质，调制0、5、12.5、25、50μg/mL的1，5-AG的标准液。用上述临床的1，5-AG的测定法测定该标准液，制作图9的校正曲线。需要说明的是，对于各标准液，吸光度增加的值示于表7。
[表7]
 
1，5-AG(μg/mL) 0 5 12.5 25 50
吸光度增加 0.128 0.146 0.175 0.224 0.320
[3]临床检体的测定
根据上述临床的1，5-AG的测定法(本法)测定从健康者和糖尿病患者得到的20个血清检体，与用已经建立的1，5-AG测定试剂盒、“Lana1，5AG Auto Liquid”测定的结果进行比较。其结果示于表8、图10。
[表8]
 
检体编号 Auto试剂(μg/mL) 本法(μg/mL)
No.73 1.1 3.1
No.1 4.5 6.5
No.5 6.5 9.1
No.9 7.8 14.3
S-5 9.7 13.5
No.42 10.4 11.2
S-4 12.4 16.1
No.11 14.7 16.1
S-1 15.1 18.5
S-3 15.5 20.8
No.14 17.1 23.7
No.15 20.8 19.5
No.23 21.7 30.7
No.25 23.6 26.6
S-2 26.4 35.7
S-6 29.4 36.2
No.29 30.1 34.1
S-7 31.8 30.7
S-8 33.6 35.2
No.33 36.2 38.5
如图10的图所示，确认两者的测定值之间有良好的相关关系，即，相关式：y(本法)＝1.0124x(Lana1，5AG Auto Liquid)+3.3199、相关系数(r)：0.964。
产业上的可利用性
根据本发明的1，5-AG的测定方法及1，5-AG测定试剂组合物，能高精度地定量糖尿病的控制标记1，5-AG，通过适用血浆、血清、脑脊髓液、尿等临床检体，能迅速且简便地诊断糖尿病。
由此，本发明具有极高的产业上的可利用性。
序列表
<110>池田食研株式会社
     日本化药株式会社
<120>1，5—脱水葡萄糖醇的测定方法及1，5—脱水葡萄糖醇测定试剂组合物
<150>JP 2006-172619
<151>2006-06-22
<160>10
<210>1
<211>1596
<212>DNA
<213>中华根瘤菌97507
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1596)
<400>1
Figure A200780023052D00431
Figure A200780023052D00451
<210>2
<211>531
<212>PRT
<213>中华根瘤菌97507
<400>2
Figure A200780023052D00452
Figure A200780023052D00461
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：石丸 惠美；真田 浩一；小村 启悟.
<400>3
Figure A200780023052D0047165632QIETU
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：石丸 惠美；真田 浩一；小村 启悟.
<400>4
<210>5
<211>1602
<212>DNA
<213>中华根瘤菌97507
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1602)
<400>5
Figure A200780023052D00471
Figure A200780023052D00481
Figure A200780023052D00491
<210>6
<211>533
<212>PRT
<213>中华根瘤菌97507
<400>6
Figure A200780023052D00492
Figure A200780023052D00501
Figure A200780023052D00511
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：吉冈 秀树；塚本 周平；增田 稔.
<400>7
Figure A200780023052D00512
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：吉冈 秀树；塚本 周平；增田 稔.
<400>8
Figure A200780023052D00513
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：吉冈 秀树；塚本 周平；增田 稔.
<400>9
Figure A200780023052D00514
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：吉冈 秀树；塚本 周平；增田 稔.
<400>10
Figure A200780023052D00515

Claims (23)

1、一种1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其特征在于，使用下述蛋白质：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
2、如权利要求1所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质来源于属于中华根瘤菌属的菌。
3、如权利要求1所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，所述蛋白质来源于中华根瘤菌97507 FERM P-19428。
4、如权利要求1所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，以所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
5、如权利要求4所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，以所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为100％时，所述蛋白质对D-葡萄糖的反应性为10％以下。
6、如权利要求1所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，测定使所述蛋白质在显色基质的存在下作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇而反应的显色基质的量。
7、如权利要求6所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，在使所述蛋白质作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇之前，预先除去试样中的D-葡萄糖。
8、如权利要求7所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，使所述蛋白质在显色基质和电子载体的存在下作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇。
9、如权利要求8所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，以1，5-脱水葡萄糖醇作为基质进行测定时，以此时所述蛋白质的酶活性为基本单位，添加所述蛋白质使每1mL所述试样达到1～500单位。
10、如权利要求8所述的1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其中，使所述蛋白质作用于试样中的1，5-脱水葡萄糖醇之前使用电子载体活化所述蛋白质。
11、一种1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其特征在于，所述组合物含有下述蛋白质：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
12、如权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质来源于属于中华根瘤菌属的菌。
13、如权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质来源于中华根瘤菌97507 FERM P-19428。
14、如权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，以所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
15、如权利要求14所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，以所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为100％时，所述蛋白质对D-葡萄糖的反应性为10％以下。
16、如权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述蛋白质是使用电子载体活化的蛋白质。
17、如权利要求16所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述电子载体为吩嗪硫酸二甲酯及1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯中的至少一种。
18、如权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物中还含有显色基质。
19、如权利要求18所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，其中，所述组合物是还含有电子载体的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物，所述显色基质为还原性显色基质。
20、一种蛋白质，是下述的(a)、(b)或(c)：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成的蛋白质，以所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上；
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有85％的序列同源性的氨基酸序列形成的蛋白质，以所述蛋白质对山梨糖的反应性为100％时，所述蛋白质对1，5-脱水葡萄糖醇的反应性为10％以上。
21、一种诊断糖尿病的方法，使用权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物诊断糖尿病。
22、权利要求11所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂组合物在1，5-脱水葡萄糖醇的测定中的应用。
23、下述蛋白质在1，5-脱水葡萄糖醇的测定中的应用，所述蛋白质为：
(a)由序列号2表示的氨基酸序列形成的蛋白质；
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、置换及/或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质；或
(c)由相对于序列号2表示的氨基酸序列至少具有60％的序列同源性的氨基酸序列形成、具有山梨糖脱氢酶活性的蛋白质。
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