DE102004010131A1

DE102004010131A1 - Anhydrofructose-Reductase, ihre kodierende Nukleotidsequenz und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102004010131A1
Application number: DE102004010131A
Authority: DE
Inventors: Friedrich Dr. Giffhorn; Annette Kühn
Original assignee: UNIVERSITAET DES SAARLANDES WISSENS- und TECHNOLOGIETRANSFER GmbH; Universitat Des Saarlandes Wissens- und Technologietransfer GmbH; Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Giffhorn Friedrich Profdr 66123 Saarbruec De
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2005-09-15
Also published as: WO2005083066A2; WO2005083066A3

Abstract

Offenbart wird eine Anhydrofructose-Reduktase, welche die Reduktion von Anhydrofructose zu Anhydromannitol zu katalysieren vermag, die die Anhydrofructose-Reduktase kodierende Nukleinsäure, den die Anhydrofructose-Reduktase erkennenden Antikörper, sowie ihre Verwendung in der Diagnostik von krankhaften Blutzuckerstörungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Anhydrofructose-Reduktase, welche die Reduktion von Anhydrofructose zu Anhydromannitol katalysiert, die für die Anhydrofructose-Reduktase kodierende Nukleinsäure, Verfahren zur Isolierung der Anhydrofructose-Reduktase und ihre Verwendung.

1,5-Anhydro-D-Fructose (AF) ist ein neuartiger Zucker, der beim Abbau von alpha-l,4-Glucanen in Stärke oder Glykogen durch Katalyse des Enzyms alpha-1,4-Glucan-Lyase entsteht (WO-A 94/09122). AF kommt in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren vor und wird in einer nachfolgenden enzymatischen Reaktion zu 1,5-Anhydroglucitol reduziert. Diese Reaktionsfolge ist neben dem hydrolytischen und phosphorolytischen Stärke- bzw. Glykogenabbau als dritter glykogenolytischer Abbauweg bekannt. Nachgewiesen wurde der dritte glykogenolytische Weg in Escherichia coli, in Pilzen, in keimenden Samen des Fuchsschwanzes (Amaranthus hypochondriacus) und reifenden Bananen sowie in der Rattenleber und in menschlichen Zelllinien. Aus dem Stand der Technik ist eine aus der Schweineleber isolierte 1,5-Anhydro-D-Fructose-Reduktase bekannt, welche 1,5-Anhydro-D-Fructose zu dem Endprodukt dieses Weges 1,5-Anhydro-D-glucitol reduziert (Sakuma et al., J. Biochem., 1998, Vol. 123, Seiten 189 bis 193). 1,5-Anhydro-D-glucitol wird auch in menschlichen Körperflüssigkeiten nachgewiesen und ist eine Zuckeralkoholkomponente des menschlichen Blutes. Die Plasmakonzentration des 1,5-Anhydro-D-glucitols ist normalerweise konstant, jedoch signifikant reduziert bei Patienten, die an Diabetes mellitus erkrankt sind. Deshalb dient 1,5-Anhydro-D-glucitol auch als klinisch relevanter Marker zur Diagnose von Diabetes-Erkrankungen. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von 1,5-Anhydro-D-glucitol für die Diagnose von Diabetes bekannt (zur Übersicht siehe Buse et al., Diabetes Technology & Therapeutics, 2003, Vol. 5, Seiten 355 bis 363). Da die Vorstufe des 1,5-Anhydro-D-glucitols 1,5-Anhydro-D- Fructose ist, ist ein einfacher und spezifischer Nachweis von 1,5-Anhydro-D-Fructose in biologischen Materialien und Körperflüssigkeiten von Vorteil.

Wie Forschungsergebnisse im Mausmodell indizieren, könnte 1,5-Anhydro-D-Fructose die Glucosetoleranz von Diabetespatienten erhöhen, so dass eine kontrollierte Zugabe von 1,5-Anhydro-D-Fructose zu Lebensmitteln für Diabetiker in Betracht kommt. Darüber hinaus ist 1,5-Anhydro-D-Fructose wegen seiner metabolischen Stabilität und seinen zuckerähnlichen Eigenschaften (wasserbindende und antioxidative Wirkung) potentieller Wirkstoff für Lebensmittel, kosmetische und pharmazeutische Formulierungen, so dass auch in diesen Bereichen ein Bedarf an einer einfachen und selektiven Bestimmung von 1,5-Anhydro-D-Fructose in komplexen Materialien besteht. Die Analytik der 1,5-Anhydro-D-Fructose basiert bisher auf aufwändigen Verfahren mittels NMR-Spektrokopie, GC-Massenspektroskopie und HPLC nach chemischer Derivatisierung der 1,5-Anhydro-D-Fructose und Colorimetrie (siehe z.B. Yu et al., 1998, Carbohydr. Res., Vol. 305, Seiten 73-82; Suzuki et al., 1996, Eur. J. Biochem., Vol. 240, Seiten 23-29.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine isolierte Anhydrofructose-Reduktase, welche die Reduktion von Anhydrofructose zu Anhydromannitol zu katalysieren vermag ermöglicht ein einfaches Verfahren zur Bestimmung von 1,5-Anhydro-D-Fructose.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Anhydrofructose-Reduktase um 1,5-Anhydro-D-Fructose-Reduktase, bei Anhydrofructose um 1,5-Anhydro-D-Fructose und bei Anhydromannitol um 1,5-Anhydro-D-Mannitol.

Der Ausdruck „isoliert" oder „gereinigt" bedeutet innerhalb der vorliegenden Erfindung, dass die Anhydrofructose-Reduktase im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen ist. Die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase kann bis zur vollständigen Homogenität oder niedrigeren Reinheitsgraden aufgereinigt sein. Der Reinheitsgrad richtet sich unter anderem nach der beabsichtigten Verwendung. Als kritische Voraussetzung wird vom Fachmann gesehen, dass die Präparation die gewünschte Funktion der Anhydrofructose-Reduktase erlaubt, selbst wenn beträchtliche Mengen anderer Komponenten in der Präparation vorhanden sind. „Im Wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt Enzympräparationen ein, welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) andere Proteine (d.h. kontaminierende Proteine), vorzugsweise weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10% und insbesondere weniger als 5% andere Proteine aufweisen. Wenn die Anhydrofructose-Reduktase rekombinant hergestellt wird, kann sie auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium sein, d.h. das Kulturmedium beträgt weniger als 20% des Volumens der Enzympräparation. „Im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen" umfasst Enzympräparationen, bei denen das erfindungsgemäße Enzym von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen, die beispielsweise an der Synthese des erfindungsgemäßen Enzyms beteiligt sind, abgetrennt ist. Eingeschlossen sind daher Enzympräparationen, welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) chemische Vorstufen oder andere chemische Substanzen, vorzugsweise weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10% und insbesondere weniger als 5% chemische Vorstufen oder andere chemische Substanzen aufweisen.

Die isolierte Anhydrofructose-Reduktase kann aus Zellen, welche das Enzym natürlicherweise exprimieren, oder aus Zellen, welche zur rekombinanten Produktion des Enzyms befähigt sind, aufgereinigt werden, oder mittels bekannter Proteinsyntheseverfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure, die für die Anhydrofructose-Reduktase kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert werden, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingebracht und das Enzym wird in der Wirtszelle exprimiert. Das Enzym kann anschließend mittels Standardverfahren, die weiter unten genauer beschrieben sind, aus den Zellen isoliert werden.

Unter „Reduktion" wird allgemein im vorliegenden Zusammenhang verstanden, dass der zu reduzierende Stoff unter der Wirkung eines Enzyms Elektronen aufnimmt, z.B. durch Anlagerung von Wasserstoffatomen oder durch chemische Abspaltung von Sauerstoff, so dass die Oxidationszahl des betreffenden Stoffes verringert wird.

Neben der Reduktion von 1,5-Anhydro-D-Fructose zu Anhydromannitol kann die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase beispielsweise auch 2-Keto-D-Glucose (D-Glucoson) zu D-Mannose, 2-Keto-3-Deoxy-D-Glucose zu 3-Deoxy-D-Mannose, 2-Keto-6-Deoxy-D-Glucose (D-Rhamnose) zu 3-Deoxy-D-Mannose sowie weitere so genannte Osone zu manno-konfigurierten Aldosen reduzieren. Bevorzugt entsteht bei der Reduktion von Anhydrofructose mittels der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10%, ganz besonders bevorzugt weniger als 5% 1,5-Anhydro-D-Glucitol.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, einem Fragment oder Derivat davon,
b) einer Aminosäuresequenz enthaltend eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, ein Fragment oder Derivat davon,
c) einer Aminosäuresequenz; die von einer Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, kodiert wird,
d) einer Aminosäuresequenz einer Variante der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, wobei die Variante von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, hybridisiert, und
e) einer Aminosäuresequenz eines Orthologs der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, wobei das Ortholog von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, hybridisiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Fragment oder Derivat", dass sich diese Aminosäuresequenzen von der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu dieser Sequenz aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität über die gesamte Länge von mindestens 70%, vorzugsweise über 80%, besonders bevorzugt über 90% und insbesondere von mindestens 95%. Die Abweichungen zu der SEQ ID NO: 2 können dabei durch Deletion, Addition, Substitution oder Insertion von Aminosäuren entstanden sein.

Zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität zweier Aminosäure- oder auch zweier Nukleinsäuresequenzen werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs gegeneinander abgeglichen (z.B. können für optimalen Abgleich Lücken in einer oder beiden zu vergleichenden Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen eingeführt oder nichthomologe Bereiche vernachlässigt werden). Vorzugsweise werden mindestens 30%, 40%, 50%, 70%, 80% oder 90% oder mehr der Länge der Referenzsequenz zu Vergleichszwecken abgeglichen. Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Positionen werden dann miteinander verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz von der gleichen Aminosäure oder dem gleichen Nukleotid besetzt ist wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, dann sind die beiden Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Sequenzidentität ist somit als Funktion der Anzahl identischer, von beiden Sequenzen geteilter Positionen zu verstehen, unter Einbeziehung der Anzahl und Länge der Lücken, die zum optimalen Abgleich eingeführt wurden. Vergleich von Sequenzen und Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität werden üblicherweise mittels dem Fachmann bekannter und zugänglicher Computer-Algorithmen vorgenommen, z.B. „Needleman&Wunsch"-Algorithmus (siehe http://www.accelrys.com). Die Aminosäuresequenzen und Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können weiterhin als Suchsequenzen („query sequence") zur Suche in Datenbanken nach anderen Familienmitgliedern oder verwandten Sequenzen eingesetzt werden. Ein entsprechender Algorithmus zur Bestimmung der Sequenzidentität ist in den NBLAST- und XBLAST-Programmen von Altschul et al. (J. Mol. Biol., 1990, Vol. 215, Seiten 403-410) verwirklicht (siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Ein „Fragment" umfasst üblicherweise mindestens 8, 10, 12, 14, 16 oder mehr benachbarte Aminosäurereste der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2. Derartige Fragmente können aufgrund ihrer biologischen Aktivität oder aufgrund einer anderen Funktion, z.B. Bindung an ein bestimmtes Substrat oder Wirkung als Immunogen ausgewählt werden. Besonders bedeutende Fragmente sind biologisch aktive Fragmente, Peptide, die etwa 8 oder mehr Aminosäuren lang sind. Solche Fragmente umfassen typischerweise ein Motiv oder eine Domäne der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase, z.B. ein aktives Zentrum oder eine Substratbindungsdomäne oder Fragmente, die immunogene Strukturen enthalten. Vorhergesagte Domänen und funktionelle Regionen lassen sich leicht mittels dem Fachmann zugänglicher Computerprogramme identifizieren (z.B. PROSITE-Analyse).

„Derivat" kann auch bedeuten, dass eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz chemisch modifiziert oder markiert sind. Die chemischen Modifizierungen können beispielsweise bewirken, dass die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase stabilisiert wird oder andere, wünschenswerte, physikalische und biochemische Eigenschaften aufweist. Dem Fachmann geläufige Modifizierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalentes Anfügen von Flavin, kovalentes Anfügen von Nukleotiden oder Nukleotidderivaten, kovalentes Anfügen eines Lipids oder Lipidderivats, kovalentes Anfügen von Phosphotidylinositol, Kreuzvernetzung, Zyklisierung, Disulfidbrückenbildung, Demethylierung, Pyroglutamatbildung, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodinierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Razemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, tRNA-vermitteltes Anfügen von Aminosäuren (z.B. Arginylierung oder Ubiquitinierung). Derartige Modifizierungen sind dem Fachmann bekannt und detailliert in der einschlägigen Literatur beschrieben (z.B. Creighton et al., „Proteins – Structure and Molecular Properties", 2nd Ed., 1993, W.H. Freemann & Company, New York). Vorzugsweise handelt es sich bei „Derivat" um ein Protein oder Peptid, welches in der Lage ist, Anhydrofructose zu reduzieren. Ein entsprechendes Testverfahren ist in Beispiel 18 beschrieben.

Der Begriff „Aminosäuresequenz enthaltend eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2" bedeutet, dass die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 zumindest teilweise Bestandteil der Aminosäuresequenz eines Proteins ist. Somit kann ein Protein neben einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 weitere Aminosäuren aufweisen, die entweder natürlicherweise zur der Anhydrofructose-Reduktase-Sequenz gehören oder die heterologe Sequenzen darstellen. Heterologe Sequenzen können an die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase zur Herstellung so genannter Fusionsproteine (Chimäre) angehängt werden. Die heterologen Sequenzen können sich am amino- oder carboxyterminalen Ende oder an anderer Stelle innerhalb des Anhydrofructose-Reduktase-Anteils befinden. Bei diesen weiteren Aminosäuresequenzen kann es sich um funktionelle Peptide oder Proteine handeln, die die Aktivität der Anhydrofructose-Reduktase nicht beeinflussen, aber die beispielsweise den Nachweis, die Aufreinigung, den Transport oder die Immobilisierung der Anhydrofructose-Reduktase an einem Trägermaterial ermöglichen und/oder erleichtern. Dem Fachmann geläufige Beispiele für solche Fusionspartner umfassen Hämagglutinin, Biotin, c-Myc, FLAG-tag, Digoxygenin, Meerettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Green Fluorescent Protein (GFP) und Derivate davon mit veränderter Fluorezenz (EGFP, EYFP, ECFP), beta-Galactosidase, Luciferasen, β-Glucuronidase oder β-Lactamase zum Nachweis, Histidin-tag oder Glutathion-S-Transferase (GST) zur Aufreinigung oder Immobilisierung, HIV-Tat, Antennapedia, Galparan oder Polyarginin zum Transport bzw. Einschleusen in Zellen. Weiterhin kann in manchen Wirtszellen die heterologe Expression und/oder Sekretion eines Proteins durch das Anbringen einer heterologen Signalsequenz verbessert werden.

Die Herstellung von Fusionsproteinen erfolgt nach gängigen DNA-Manipulationsverfahren. Beispielsweise können DNA-Fragmente, die für unterschiedliche Proteinsequenzen kodieren, in einen gemeinsamen Leserahmen ligiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mittels automatisierter DNA-Synthese hergestellt werden. Darüber hinaus gibt es einige kommerziell erhältliche Expressionsvektoren, die bereits für einen Fusionspartner (z.B. GST) kodieren. Die für das erfindungsgemäße Enzym kodierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor inseriert werden, so dass der Fusionsanteil im Leserahmen mit dem Enzymanteil verbunden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Anhydrofructose-Reduktase eine Aminosäuresequenz auf, die von einer Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, kodiert werden. Die Nukleinsäure wird weiter unten genauer beschrieben.

Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin „Varianten" der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2. Dazu zählen natürlich vorkommende, reife Formen oder Vorstufen der Anhydrofructose-Reduktase, Allel- oder Sequenzvarianten, nicht natürlich vorkommende, rekombinant abstammende Varianten, sowie so genannte Orthologe und Paraloge. Solche Varianten können leicht anhand ihrer Sequenz- und/oder Strukturhomologie zu der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase von anderen Peptiden und Proteinen unterschieden werden. Die Homologie bzw. der Identitätsgrad richtet sich in erster Linie danach, ob es sich um eine funktionelle oder nicht-funtionelle Variante der Anhydrofructose-Reduktase handelt, nach Ausmaß der Divergenz innerhalb der Paralogfamilie sowie nach der evolutionären Distanz innerhalb der Orthologe.

Allelvarianten stellen Peptide oder Proteine mit einer signifikanten Sequenzidentität zur erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase dar, die außerdem vom gleichen Genlocus kodiert werden (z.B. Polymorphismen). Paraloge stellen Peptide oder Proteine mit einer signifikanten Sequenzidentität zur erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase dar, die von einem Gen der gleichen Spezies kodiert werden und z.B. ähnliche Aktivität oder Funktion aufweisen. Orthologe stellen Peptide oder Proteine mit einer signifikanten Sequenzidentität zur erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase dar, die von einem Gen einer anderen Spezies kodiert werden. Bevorzugte Orthologe sind Orthologe von Säugetieren, besonders bevorzugt von Primaten.

Vorzugsweise wird unter Variante, Paralog oder Ortholog ein Peptid oder ein Protein verstanden, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, hybridisiert. Die Nukleinsäure und die Nukleinsäure betreffende Begriffe und Verfahren werden weiter unten näher beschrieben.

Weiterhin ist die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) ein Molekulargewicht von etwa 30000 bis 36000 Dalton, bevorzugt 32000 bis 35000 Dalton, besonders bevorzugt 34850 Dalton aufweist und/oder
b) bei einem pH-Bereich zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0 aktiv ist und/oder
c) bei einer Substratkonzentration von etwa 8,4 × 10^–3 mol/L Anhydrofructose und/oder etwa 2,0 × 10^–4 mol/L NADPH ihre halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit aufweist.

Die Bestimmung des Molekulargewichts kann nach allen dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Hierzu zählen unter anderem analytische, präparative, alkalische, SDS und Immun-Gelelektrophoresen, analytische und präparative isoelektrische Fokussierung, Blotting, FPLC, HPLC, präparative und analytische Gelchromatographie (Size-Exclusion, Ion Exchange, Hydrophobic Interaction, präparative und analytische Ultrazentrifugationstechniken (XL-I), spektroskopische Methoden wie Absorptions-, Differenz-, Fluoreszenz-, CD-Spektroskopie, spektrometrische Verfahren wie Elektronenstoß-Ionisation (EI), chemische Ionisation (CI, bei Atmosphärendruck API), Thermospray, Elektrospray-Ionisation (ESI), Felddesorption (FD), Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), Fast Atom Bombardment (FAB), Cf-252-Plasmadesorption, Laserdesorption, Matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Vorzugsweise erfolgt die Molekulargewichtsbestimmung mittels MALDI. Dem Fachmann ist bekannt, dass je nach Bestimmungsmethode die angegebenen Molekulargewichtswerte variieren können.

d) ihren isoelektrischen Punkt bei etwa pH 4,5 hat, und/oder
e) in Anwesenheit von Glucuronsäure, Pyridin-3-Aldehyd, Acetaldehyd, Formaldehyd oder 2,3-Butandion inaktiv ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet „inaktiv" weniger als 30%, bevorzugt weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10%, ganz besonders bevorzugt weniger als 5% der Anhydrofructose-Reduktase-Aktivität, die bei Abwesenheit von Glucuronsäure, Pyridin-3-Aldehyd, Acetaldehyd, Formaldehyd oder 2,3-Butandion vorliegt. Die Aktivität kann idealerweise nach einem Testverfahren, wie sie in den Beispielen beschrieben sind (insbesondere Beispiel 18) festgestellt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Anhydrofructose-Reduktase um eine bakterielle Anhydrofructose-Reduktase. Vorzugsweise stammt die Anhydrofructose-Reduktase aus der Bakterienfamilie Rhizobiaceae, umfassend die Gattung Allorhizobium, die Gattung Ensifer, die Gattung Rhizobium, bevorzugt Rhizobium leguminasorum (Hinterlegungsnummer DSM 30132), die Gattung Mesorhizoboium, bevorzugt Mesorhizobium loti (DSM 2626), die Gattung Bradyrhizobium, bevorzugt Bradyrhizobium japonicum (DSM 30131), die Gattung Azorhizobium, bevorzugt Azorhizobium caulinodans (DSM 5975) und die Gattung Sinorhizobium, bevorzugt Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium saheli oder Sinorhizobium teranga, besonders bevorzugt Sinorhizobium meliloti oder Sinorhizobium morelense.

Ein entsprechender Bakterienstamm der Bezeichnung Sinorhizobium morelense S-30.7.5. wurde mit der Nummer DSM 15760 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig gemäß den Vereinbarungen des Budapester Vertrags hinterlegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, ein Fragment oder Derivat davon, kodiert,
b) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz enthaltend ein Aminosäureseqzenz mit der SEQ ID NO:2, ein Fragment oder Derivat davon, und/oder eine Variante und/oder ein Ortholog davon kodiert,
c) einer Nukleotidsequenz, welche die Sequenz mit der SEQ ID NO:1, ein Fragment oder Derivat davon, umfasst,
d) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1 hybridisiert,
e) einer Nukleotidsequenz, bei der im Vergleich zu der Nukleotidsequenz in a), b) oder c) mindestens ein Nukleotid substituiert, deletiert oder insertiert ist, und
f) einer Nukleotidsequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zu der Nukleotidsequenz in a), b), c), d), oder e) verschieden ist.

Der Ausdruck „isolierte" Nukleinsäure bedeutet innerhalb der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäure von anderen Nukleinsäuren, die in der natürlichen Umgebung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure natürlicherweise innerhalb der genomischen DNA des betreffenden Organismus flankieren, d.h. Sequenzen, die sich am 5'- oder am 3'-Ende der Nukleinsäure befinden. Jedoch können gewisse flankierende Sequenzen vorhanden sein, z.B. bis zu etwa 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb oder weniger, insbesondere benachbarte oder innerhalb des selben Gens liegende, aber durch Introns getrennte, Peptid-kodierende Sequenzen. Wichtig ist, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure von weit entfernt liegenden oder unwichtigen flankierenden Sequenzen isoliert ist, so dass sie sich für spezifische Manipulierungen wie z.B. rekombinante Expression, Herstellung von Sonden und Primern und andere Verwendungen eignet. Darüber hinaus bedeutet „isoliert", dass die Nukleinsäure, z.B. ein Transkript/cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium (bei rekombinanter Herstellung) oder chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen (bei chemischer Synthese) sein kann. Jedoch kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit anderen kodierenden oder regulatorischen Sequenzen fusioniert sein und gilt dann immer noch als „isoliert". Beispielhaft kommen für isolierte Nukleinsäuren rekombinante DNA-Moleküle innerhalb eines Vektors, innerhalb heterologer Wirtszellen oder (teilweise) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung oder chemisch hergestellte Moleküle in Frage. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vivo oder in vitro RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen, isolierten DNA-Moleküle.

„Umfassend" bedeutet, dass die Nukleotidsequenz zumindest Teil der Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist. Die Nukleinsäure kann daher entweder nur aus mindestens einer der Nukleotidsequenzen a) bis f) bestehen oder zusätzliche Nukleinsäurereste aufweisen, die entweder natürlicherweise mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure assoziiert sind oder heterologe Sequenzen darstellen. Eine derartige Nukleinsäure kann wenige oder bis zu einigen hundert zusätzliche Nukleotide umfassen. Infolgedessen umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure die für die Anhydrofructose-Reduktase kodierende Sequenz alleine, oder zusätzliche kodierende Sequenzen wie Signalsequenzen, zusätzliche nicht-kodierende Sequenzen wie untranslatierte Regionen, regulatorische Regionen (Promotoren, Enhancer etc.), Spleiß- und Polyadenylierungssequenzen. Außerdem kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Sequenzen fusioniert sein, die beispielsweise für Peptide kodieren, die eine Aufreinigung ermöglichen oder erleichtern.

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in Form von RNA (z.B. mRNA) oder in Form von DNA (z.B. cDNA oder genomische DNA), die kloniert oder chemisch synthetisiert wird, vorliegen. Die Nukleinsäure kann doppel- oder einzelsträngig vorliegen. Eine einezelsträngige Nukleinsäure kann der kodierende Strang (Sinn-Strang) oder der nichtkodierende Strang (Anti-Sinn-Strang) sein.

Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren, die Fragmente oder Derivate der SEQ ID NO:2 kodieren, sowie Nukleinsäuren, die für natürlich und nicht natürlich vorkommende Varianten, Paraloge und Orthologe der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase kodieren. Nicht natürlich vorkommende Varianten lassen sich beispielsweise durch gezielte („site-directed") oder zufällige („random") Mutagenese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure erzeugen.

Hinsichtlich der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1 bedeutet „Fragment oder Derivat", dass sich diese Nukleinsäuresequenzen von der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO:1 an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu dieser Sequenz aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität über die gesamte Länge von mindestens 70%, vorzugsweise über 80%, besonders bevorzugt über 90% und insbesondere von mindestens 95%. Die Abweichungen zu der SEQ ID NO:1 können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination von Nukleotiden entstanden sein. Zur Bestimmung der Sequenzidentität gelten die oben gemachten Angaben und Anleitungen entsprechend.

Ein „Fragment" der Nukleinsäure bedeutet ferner eine zusammenhängende Nukleinsäuresquenz mit mindestens 12 Nukleotiden. Weiterhin kann das Fragment 30, 40, 50, 100, 250 oder 500 oder mehr Nukleotide lang sein. Die Länge des Fragments richtet sich unter anderem nach seiner beabsichtigten Verwendung. Beispielsweise kann das Fragment für Epitop-Regionen der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz kodieren oder als DNA-Sonde oder Primer verwendet werden. Solche Fragmente können durch Synthese einer Oligonukleotidsonde anhand der bekannten Nukleotidsequenz erhalten werden. Eine gegebenenfalls markierte Sonde kann dann zur Durchmusterung einer cDNA oder genomischen DNA-Bibliothek, oder mRNA zum Auffinden von korrespondierenden Nukleinsäuren eingesetzt werden. Eine Sonde/Primer umfasst üblicherweise im Wesentlichen ein gereinigtes Oligonukleotid- oder Oligonukleotid-Paar. Das Oligonukleotid umfasst üblicherweise eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens 12, 20, 25, 40, 50 oder mehr benachbarten Nukleotiden hybridisiert.

Die für Varianten, Paraloge und Orthologe kodierenden Nukleinsäuren können mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, leicht identifiziert werden, da sie unter mäßigen bis stringenten Bedingungen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisieren.

Der Begriff „Hybridisierung" bedeutet innerhalb der Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) beschrieben sind. Besonders bevorzugt bedeutet „Hybridisierung" eine Hybridisierung bei einer Hybridisierungstemperatur von 65 bis 68°C unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers enthaltend 2×SSC; 10 × Denhardt-Lösung (Ficoll-400/PEG/BSA im Mischungsverhältnis 1:1:1); 0,1% SDS, 5mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 μg/m1 Heringssperma-DNA; 50μg/ml tRNA; oder 25M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS und anschließendes Waschen bei einer Waschtemperatur von 65 bis 68°C unter Verwendung eines Waschpuffers enthaltend 0,2 × SSC; 0,1% SDS.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.

Der Ausdruck „Vektor" bezeichnet ein Vehikel, bevorzugt eine Nukleinsäure, welches Nukleinsäuren transportieren kann. Üblicherweise ist die zu transportierende Nukleinsäure mit dem Vektor kovalent verbunden. Die vorliegende Erfindung umfasst Plasmide, einzel- oder doppelsträngige Phagen, einzel- oder doppelsträngige, virale DNA- oder RNA-Vektoren, oder artifizielle Chromosomen (AC) wie BAC (bakteriell), PAC (P1-Phage), YAC (Hefe; „yeast"), HAC (human) oder MAC (Säugetier; „mammalian"). Ein Vektor kann innerhalb der Wirtszelle als extrachromosomales Element repliziert und vervielfältigt werden oder in das Wirtschromosom integrieren und zusammen mit der Wirtszelle vervielfältigt werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst Vektoren zur Vermehrung (Klonierungsvektoren) oder zur Expression (Expressionsvektoren) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. In Expressionsvektoren ist die Nukleinsäure daher vorzugsweise in Sinn-Orientierung funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen oder in vitro in zellfreien Systemen ermöglichen. Zu den hier gemeinten regulatorischen Sequenzen zählen unter anderem transkriptionssteuernde Promotoren (z.B. linker lambda-Phage, lac, TRP, TAC, SV40, CMV, Adenovirus, Retrovirus-LTR, SP6, T3, T7 und ähnliche), Repressorbindungssstellen, Enhancer (z.B. aus SV40, CMV, Adenovirus), Transkriptionsterminationsstellen, Ribosomenbindungsstellen, Start- und Stopcodons oder Polyadenylierungssignale. Die regulatorischen Sequenzen bewirken entweder eine konstitutive Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Wirtszelle oder eine Expression, die mittels Temperaturänderung, Nährstoffzusatz- oder -entzug oder Zusatz/Entzug anderer Substanzen (z.B. Tetracyclin) induziert wird.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann nach bekannten Standardverfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die interessierende DNA-Sequenz mit einem Vektor verbunden, indem die DNA-Sequenz und der Vektor mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend miteinander ligiert werden.

Wie bereits beschrieben; kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Fusionsprotein zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch Vektoren, die bereits für Fusionsanteile kodierende Sequenzen erhalten. Derartige Fusionsanteile können die Expression oder Löslichkeit eines rekombinanten Proteins steigern oder eine Aufreinigung erlauben, z.B. pGEX (GST-Fusion), pMAL (Maltose-E-Bindungsprotein) oder rRITS (Protein-A-Fusion).

Idealerweise wird der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Vermehrung oder Expression in eine Wirtszelle eingebracht. Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirtszelle (Transduktion, Transfektion bzw. Transformation) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen. Phagen- oder viralen Vektore werden im Allgemeinen als verpackte oder verkapselte Viren in die Wirtszelle eingebracht.

Zum Selektieren einer Subpopulation von Wirtszellen, welche den erfindungsgemäßen Vektor enthalten, ist es zweckmäßig, wenn der Vektor zusätzlich mit einem so genannten Selektionsmarker versehen ist. Geeignete Selektionsmarker umfassen Gene für Tetracyclin-, Kanamycin- oder Ampicillinresistenz für Bakterien und Gene für Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz für eukaryontische Wirtszellen.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, wobei die Wirtszelle nicht eine Wirtszelle ist, die natürlich vorkommend eine natürlich vorkommende, erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Geeignete Wirtszellen umfassen prokaryontische Zellen (Bakterien), niedere eukaryontische Zellen (z.B. Hefezellen) oder höhere eukaryontische Zellen, z.B. Insektenzellen oder Säugetierzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Bakterienzelle, besonders bevorzugt um die Bakteriengattung Sinorhizobium, insbesondere bevorzugt um Sinorhizobium morelense S-30.7.5 (Hinterlegungsnummer DSM 15760, siehe oben).

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Antikörper, der spezifisch eine erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase erkennt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „spezifisch", dass der Antikörper mit hoher „Affinität" an die erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase, Fragmente und Derivate davon, aber nicht signifikant an nicht-verwandte Proteine und Peptide bindet. Ein Antikörper wird nach wie vor als „spezifisch" betrachtet, wenn er auch an andere Proteine bindet, die nicht wesentlich homolog zur Anhydrofructose-Reduktase sind, sofern solche Proteine zumindest homolog zu einem Fragment oder einer Domäne ist, gegen das/die der erfindungsgemäße Antikörper gerichtet ist. In diesem Fall ist dem Fachmann bekannt, dass die Antikörperbindung trotz eines gewissen Grades an „Kreuzreaktivität" spezifisch ist.

Unter „Affinität" versteht der Fachmann die Bindungsstärke zwischen Antigen und Antikörper, die aus dem Massenwirkungsgesetz abgeleitet werden kann. Sie wird als Assoziations- bzw. Dissoziationskonstante ausgedrückt. Für polyklonale Seren liegen die Dissoziationskonstanten vorzugsweise im Bereich von 10^–8 bis 10^–6 mol/l, jedoch sind im Rahmen der vorliegenden Anmeldung auch geringere Dissoziationskonstanten denkbar (z.B. 10^–10 mol/l).

Die Bestimmung der Assoziationskonstante K_a hat Scatchard für die Reaktion von kleinen Molekülen (Haptenen) mit Antikörpern mit Hilfe von Modellrechnungen beschrieben. In einem Assay werden steigende Mengen an markiertem Hapten einer konstanten Menge Antikörpern [AB] zugesetzt. Nach Gleichgewichtseinstellung werden gebundene Fraktion [B] und ungebundene Fraktion [F] getrennt und der Quotient ([B]/[F]) gegen [B] in einem Diagramm aufgetragen (Scatchard-Plot). Es ergibt sich gemäß der von Scatchard hergeleiteten Gleichung: [B]/[F] = Ka[AB] – Ka[B]eine Gerade mit negativer Steigung, welche K_a darstellt. Der x-Achsenabschnitt gibt die Anzahl der Antigenbindungstellen [AB] wieder, der y-Achsenabschnitt stellt (K·[AB]) dar. Der Meßbereich sollte mindestens von 20 bis 75% der Maximalbindung reichen. Für eine einheitliche Bindungsstelle sind 6 bis 10 Meßwerte ausreichend, für zwei Bindungsstellen sind 15 bis 20 Werte erforderlich. Drei verschiedene Bindungsstellen sind maximal erfaßbar, dazu sind mindestens 30 Meßwerte nötig.

Unter „Spezifität" versteht der Fachmann, wie genau ein Antikörper zwischen dem Antigen bzw. Hapten und chemisch verwandten Verbindungen unterscheiden kann. Ein Antikörper mit hoher Spezifität zeigt nur geringe oder keine Affinität zu Antigenen oder Haptenen, die eine ähnliche Struktur besitzen wie das Antigen, gegen das der Antikörper erzeugt wurde. Ist die Affinität zu strukturähnlichen Antigenen hoch, ist die Spezifität des Antiserums gering. Es werden die Affinitäten bzw. die Assoziationskonstanten zweier chemisch ähnlicher Verbindungen verglichen. Man erhält als Größe die relative Kreuzreaktivität. Man unterscheidet verschiedene Arten der Kreuzreaktivität, die sich daraus ergeben, daß man monovalente und polyvalente Seren differenziert. Monovalente Seren sind spezifisch für ein Epitop, hier handelt es sich meistens um monoklonale Antikörper. Polyvalente Seren sind polyklonale Seren oder Mischungen aus monoklonalen Antikörpern. Diese enthalten Antikörperpopulationen gegen mehrere Epitope eines Antigens. Die Kreuzreaktivität von Antiseren kann durch die Konkurrenzreaktion eines markierten Antigens oder Haptens mit steigenden Konzentrationen eines Kompetitors gemessen werden.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper, humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper, sowie Fragmente solcher Antikörper wie z.B. Fab, F(ab')2, Fv, scFv-Fragmente, Antikörper mit mehreren Bindungsstellen (bi-, tri-, etc. multivalente Antikörper), Antikörper mit mehreren Spezifitäten (bi-, tri-, etc. -spezifische Antikörper).

Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zum Herstellen und/oder Identifizieren von Antikörpern, die gegen ein bestimmtes Zielpeptid gerichtet sind, bekannt. Einige dieser Verfahren sind in „Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press (1989)" beschrieben. Üblicherweise wird ein isoliertes Peptid als Immunogen verwendet und einem nichtmenschlichen Säugertier, z.B. Kaninchen, Ratte oder Maus, verabreicht. Zur Immunisierung des Säugetiers kann das vollständige Protein, ein antigenes Peptidfragment oder ein Fusionsprotein verwendet werden. Geeignete Peptide können anhand der Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase ausgewählt werden. Ein antigenes/immunogenes Peptidfragment umfasst üblicherweise 8 benachbarte Aminosäurereste. Es kann aber auch mindestens 10, 12, 14, 16 oder mehr Aminosäurereste umfassen. Derartige Fragmente können z.B. nach physikalischen Eigenschaften ausgewählt werden, wie Fragmente, die Regionen entsprechen, die an der Oberfläche des Proteins lokalisiert sind, z.B. hydrophile Regionen.

Der Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers wird dadurch erleichtert, dass der Antikörper an eine nachweisbare Substanz gekoppelt wird. Beispiele solcher nachweisbaren Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen, biolumineszierende Substanzen und radioaktive Substanzen. Genauere Beispiele umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase, Luciferase, (Strept-)Avidin/Biotin, FITC, TRITC, Rhodamin, Digoxygenin und andere. Entsprechende Nachweisverfahren des erfindungsgemäßen Antikörpers anhand der genannten nachweisbaren Substanzen sind dem Fachmann bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase, umfassend das Kultivieren von erfindungsgemäßen Wirtszellen und das Isolieren der exprimierten Anhydrofructose-Reduktase aus den Wirtszellen.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Anhydrofructose-Reduktase, umfassend das Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors in mindestens eine Wirtszelle nach einem der oben beschriebenen Verfahren, das Kultivieren der Wirtszellen und das Isolieren der exprimierten, rekombinanten Anhydrofructose-Reduktase aus den Wirtszellen.

Der Ausdruck „Kultivieren" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Wirtszellen in einem geeigneten Nährmedium (siehe Beispiele) unter geeigneten Temperaturbedingungen, bevorzugt bei mindestens 25°C und höchstens 38°C, über einen Zeitraum von mindestens 6, 8, 12, 16, 20, 24 oder mehr Stunden vermehrt werden. Die Wirtszellen können zum besseren Wachstum während des Kultivierens geschüttelt werden. Wenn das interessierende Protein nicht ohnehin in das Kulturmedium sezerniert wird, wie das bei Enzymen im Allgemeinen der Fall ist, kann es aus den Wirtszellen mittels Standardverfahren zum Aufschließen von Zellen isoliert werden. Dazu zählen unter anderem Einfrier-/Auftauverfahren, Ultraschallbehandlung, mechanischer Aufschluss und Verwendung lysierender Substanzen (z.B. Lysozym). Zum Gewinnen und Isolieren des Proteins können weiterhin dem Fachmann bekannte Aufreinigungsverfahren wie z.B. Ammoniumsulfatfällung, Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie, Säureextraktion, Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschromatografie, Hydroxyapatitchromatografie, Lektinchromatografie oder High-Performance-Liquid-Chromatografie eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Nährmedium vorzugsweise 5 bis 50mmol/L, besonders bevorzugt 10 bis 20 mmol/L Anhydrofructose und/oder vorzugsweise 5 bis 50 mmol/L, besonders bevorzugt 10 bis 20 mmol/L Anhydroglucitol.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Anhydrofructose-Reduktase zur Bestimmung von Anhydrofructose in einer Probe.

Wie bereits beschrieben, ist Anhydrofructose für die wirtschaftliche Nutzung in der Nahrungsmittel-, Pharma bis hin zur Kosmetikindustrie von Bedeutung, so dass ein einfaches Bestimmungsverfahren wünschenswert ist. Für die Bestimmung von Anhydrofructose mittels der erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase macht man sich den so genannten „optischen Test" zunutze, der darauf basiert, dass reduzierte Nicotinamid-adenin-dinucleotide (NADH und NADPH) im Gegensatz zu ihren oxidierten Formen Licht der Wellenlänge 340 nm absorbieren. Genau betrachtet zeigen NAD⁺ und NADP⁺ eine starke UV-Absorption bei 260 nm, dem Absorptionsmaximum des Adeninringes. Bei der Reduktion von NAD(P)⁺ zu NAD(P)H⁺ H⁺ erscheint ein neues Maximum bei 340 nm, das durch die Reduktion des Nicotinamidanteils des Moleküls hervorgerufen wird. Im optischen Test wird zur Bestimmung eines Substrats, z.B. Anhydrofructose, oder einer Enzymaktivität eine spezifische, enzymatische Reaktion mit einer Redoxreaktion gekoppelt, bei der NAD⁺ bzw. NADP⁺ reduziert oder NADH bzw.

NADPH oxidiert werden. Der Test ist auf Grund der ausgeprägten Substratspezifität der meisten Enzyme eine sehr spezifische und hochempfindliche Methode. Jede Dehydrogenase-Reaktion, bei der NAD(P)H verbraucht oder gebildet wird, kann deshalb direkt durch Registrierung der Extinktionszu- oder abnahme bei 340 nm verfolgt werden.

Da Anhydrofructose in Anwesenheit des Elektronendonators NADPH zu Anhydromannitol reduziert, während NADPH dabei gleichzeitig zu NADP oxidiert wird, kann eine Extinktionsabnahme bei 340nm beobachtet werden. Die umgesetzte Molmenge an NADPH ist direkt proportional zur ursprünglich vorhandenen Molmenge an Anhydrofructose.

Im Folgenden wird beispielhaft, ohne darauf beschränkt zu sein, die Bestimmung von Anhydrofructose beschrieben. Günstig ist es, wenn die Bestimmung von Anhydrofructose bei konstanter Messtemperatur, die bevorzugt zwischen 20° und 40°C, besonders bevorzugt zwischen 25° und 30°C liegt, durchgeführt wird. Die Anhydrofructoseenthaltende Probe wird mit einer Lösung versetzt, die ein Puffersystem mit einem pH-Bereich zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise ein Bis-Tris-Puffer, pH 6,5, NADPH sowie gegebenenfalls weiterer Zusatzstoffe wie Stabilisierungsmittel aufweist. Durch Zugabe von Anhydrofructose-Reduktase wird die enzymatische Reaktion gestartet. Aus der Extinktion vor Zusatz des Enzyms und nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wird die Extinktionsdifferenz gemessen, aus der die Anfangskonzentration an Anhydrofructose in der Probe ermittelt werden kann. Um die Absorption der eingesetzten Reagenzien berücksichtigen zu können, wird parallel zur eigentlichen Probe eine Leerwertmessung durchgeführt, wobei anstelle der Probe dem Testansatz eine entsprechende Menge an Wasser zugesetzt wird.

Idealerweise werden die für die Bestimmung erforderlichen Substanzen in folgenden Konzentrationen eingesetzt:
0,01 bis 1,0 mol/L Puffer, pH 6,0-8,0
0,1 bis 1,0 mmol/L NADPH
0,01 bis 10 Einheiten (U)/ml erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Testansatz:
0,02 bis 0,2 mol/L Bis-Tris-Puffer, pH 6,5
0,2 bis 0,4 mmol/L NADPH
0,01 bis 1,0 Einheiten (U) erfindungsgemäße Anhydrofructose-Reduktase

Um den linearen Messbereich nicht zu überschreiten, sollte die Konzentration an Anhydrofructose in der Testlösung den Wert von 0,2 mmol/L nicht übersteigen. Sind in einer Probe höhere Konzentration zu erwarten, kann der vorteilhafte Konzentrationsbereich durch Verdünnung der Probe eingestellt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der „Probe" um jede Art von Probe handeln, bei der eine Bestimmung des Anhydrofructose-Gehalts wünschenswert und/oder erforderlich ist. Hierzu zählen natürlich vorkommende, biologische Proben wie auch chemisch hergestellte oder auf andere Art hergestellte Proben. Bei der Probe kann es sich um eine Nahrungsmittelprobe, ein pharmazeutisches Präparat, ein kosmetisches Präparat oder um ein von einem tierischen oder pflanzlichen Organismus entnommene, isolierte Probe, z.B. Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten, handeln. Die Entnahme und Isolierung von Gewebeproben und Körperflüssigkeiten sind dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine dem menschlichen Körper entnommene Körperflüssigkeit. Zu den Körperflüssigkeiten zählen Blut, Blutserum, Blutplasma, Lymphe, cerebrospinaler Liquor, Speichel und Urin, besonders bevorzugt Blut.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Hyperglykämie in einem Patienten, umfassend die Bestimmung von Anhydrofructose mittels einer erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase in einer aus dem Patienten isolierten Probe, wobei eine im Vergleich zu einer geeigneten Referenz veränderten, bevorzugt niedrigere Menge an Anhydrofructose indikativ für das Vorliegen von Hyperglykämie in dem Patienten ist. Die Menge an Anhydrofructose kann bei Vorliegen von Hyperglykämie 2x, 4x, 10x, 50x, 100x oder mehr verändert, bevorzugt erniedrigt sein

Unter „Hyperglykämie" (oder Glucosämie) wird im Allgemeinen eine krankhafte Erhöhung des Blutzuckers, insbesondere Glucose, (Überzuckerung) verstanden, die z.B. bei Diabetes mellitus, bei Hyperadrenalismus u. -pituitarismus, oder als paraneoplastisches Symptom, bei Behandlung mit Glucocorticosteroiden auftritt. Hyperglykämie liegt dann vor, wenn vor der Nahrungsaufnahme Werte über 120 mg/dl (über 6,6 mmol/l) Glucose oder zwei Stunden nach der Nahrungsaufnahme Werte über 160 mg/dl (über 8,8 mmol/l) Glucose erreicht werden. Dem gemäß handelt es sich bei einer „geeigneten Referenz" um die isolierte Probe einer Person, bei der keine Hyperglykämie vorliegt. Wie bereits erwähnt ist bei einem Diabetiker aufgrund des hohen Glucosespiegels die Menge an Anhydroglucitol erniedrigt. Insofern wäre auch denkbar, dass die Menge an Anhydrofructose, eine Vorstufe des Anhydroglucitols, in Abhängigkeit von der Glucosemenge variiert.

In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose einer Krankheit, bei der eine im Vergleich zu einer gesunden Referenzprobe veränderte Menge Anhydrofructose vorliegt. Die Menge an Anhydrofructose kann bei Vorliegen der Krankheit 2x, 4x, 10x, 50x, 100x oder mehr verändert, insbesondere erniedrigt, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Krankheit um Diabetes mellitus.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach auch ein Diagnosemittel zur Diagnose einer Krankheit, insbesondere Diabetes mellitus, bei der eine im Vergleich zu einer gesunden Referenzprobe veränderte Menge Anhydrofructose vorliegt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anhydrofructose-Reduktase zur biokatalytischen Synthese manno-konfigurierter Zucker, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,5-Anhydro-D-Mannitol, D-Mannose und D-Rhamnose.

Eine biokatalytische Synthese manno-konfigurierter Zucker in großem Maßstab, insbesondere von Anhydromannitol, kann besonders dann wünschenswert sein, wenn große Mengen solcher Zucker benötigt werden. D-Mannose beispielsweise lagert sich aufgrund seiner chemischen Struktur an die äußere Wand von Bakterien, z.B. Escherichia coli, an. Dadurch sind diese Bakterien nicht mehr in der Lage, sich an die Innenseite der Harnblase oder des Harnleiters anzuheften, was üblicherweise zu Harnwegsinfekten und Blasenerkrankungen führt, sondern werden mit dem Harn ausgeschieden. Die erfindungsgemäße Verwendung der Anhydrofructose-Reduktase stellt somit eine Substanz bereit, die zur Herstellung eines Medikaments gegen bakteriell verursachte Harnwegsinfekte und Blasenerkrankungen verwendet werden kann.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

1

Die 1 zeigt Anzucht und Wachstumskurve von Sinorhizobium morelense (geschlossene Dreiecke: Optische Dichte der Bakterien bei 600nm, linke Ordinate; geschlossene Quadrate: pH-Wert während des Wachstums; offene Kreise: Konzentration an 1,5-Anhydrofructose in mM, rechte Ordinate)

2

Die 2 zeigt die Wachstumskurve der Anhydrofructose-Reduktase-exprimierenden Bakterien BL21(DE3) (geschlossene Dreiecke: Optische Dichte der Bakterien bei 600nm, linke Ordinate; geschlossene Quadrate: pH-Wert während des Wachstums; geschlossene Kreise: Aktivität der rek. Anhydrofructose-Reduktase in Units/Liter)

3

Die 3 zeigt die quantitative Substratbestimmung über den optischen Test von 1,5-Anhydrofructose bei verschiedenen Mengen von 1,5-Anhydrofructose-Reduktase (angegeben in μmol).

4

Die 4 zeigt die Biokonversion von 1,5-Anhydrofructose (geschlossene Kreise) zu 1,5-Anhydromannitol (geschlossene Quadrate).

5

Die 5 zeigt die Biokonversion von D-Glucoson (geschlossene Kreise) zu D-Mannoson (geschlossene Quadrate).

6

Die 6 zeigt die Biokonversion von D-Alloson (geschlossene Kreise) zu D-Altrose (geschlossene Quadrate).

7

Die 7 zeigt die Biokonversion von 3-Keto-1,5-Anhydrofructose (geschlossene Kreise) zu 1-Desoxy-3-Keto-D-Mannose (geschlossene Quadrate).

8

Die 8 zeigt die präparative Produktgewinnung (Bsp. 18.3) von 1,5-Anhydromannitol (geschlossene Quadrate) aus 1,5-Anhydrofructose (geschlossene Kreise).

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein:
Beispiel 1: Die von der nativen Anhydrofructose-Reduktase katalysierten Reaktionen
Von der nativen Anhydrofructose-Reduktase werden folgende Reaktionen katalysiert: (a) 1,5-anhydro-D-fructose + NADPH+H⁺ = 1,5-anhydro-D-mannitol + NADP⁺
(b) 2-Keto-D-glucose + NADPH+H⁺ = D-Mannose + NADP⁺
(c) 2-Keto-D-Allose NADPH+H⁺ = D-Altrose + NADP⁺ (siehe Figur 6)
Beispiel 2: Biochemische Charakteristika der nativen Anhydrofructose-Reduktase

1.) Reaktionstyp: Bei der von der Anhydrofructose-Reduktase katalysierten Reaktion handelt es sich um eine Oxidoreduktion.
2.) Isolierung und Identifizierung des Anhydrofructose-Reduktase-produzierenden Organismus: 2.a.) Screening nach einer 1,5-Anhydrofructose-reduzierende Dehydrogenase – Entnahme von Bodenproben von 20 verschiedenen Standorten – Selektion der Mikroorganismen durch Wachstum auf 1,5-Anhydrofructose und 1,5-AG (10 mM-1,5-Anhydrofructose/AG-Mineral-Vitaminmedium; Medium s. „Materialien"): 40 bakterielle Bodenisolate mit 1,5-Anhydrofructose-Dehydrogenase-Aktivität – Auswahl des Isolates mit höchste Spezifischer Aktivität für 1,5-Anhydrofructose 2.b.) Identifizierung der Anhydrofructose-Reduktase – Isolierung der genomischen DNA von S. morelense S-30.7.5. nach Altenbuchner, Cullum (84) – Amplifizierung der 16S-rDNA (siehe SEQ ID NO:3) – Klonierung in pCRII-TOPO^®-Vektor – Sequenzierung des 1436 bp-Inserts
3.) Molekulargewicht: 35.1 kDa (bestimmt anhand MALDI)
4.) Untereinheiten: Bei der Anhydrofructose-Reduktase handelt es sich um ein Monomer (bestimmt anhand Gelfiltration)
5.) Cofaktor: NADPH/NADP⁺, Keine Aktivität mit NADH/NAD⁺
6.) pH-Optimum: pH 6.5 in 100 nM Bistris-Puffer

Die Messung erfolgt in 1 ml-Küvettenansatz: Messung bei 365 nm, in Anwesenheit von 100 μmol jeweiliger Puffer, 0,28 μmol NADPH, 30 μmol 1,5-Anhydrofructose, 50 mU bzw. 100 mU 1,5-AF-R
Beispiel 3: 16S-rDNA-Sequenz von 1,5-anhydro-D-fructose-Reduktase aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5.: 1436 by (SEQ ID NO:3)
Die Sequenz wurde einem Datenbankvergleich unterzogen und zwar mittels des NCBI/BLAST-Programms (The National Center for Biotechnology Information) Tabelle 1: Datenbankvergleich
Sinorhizobium morelense S-30.7.5. wurde hinterlegt als Patentstamm bei DSMZ, Braunschweig:
DSM-No. 15760
Beispiel 4: Charakterisierung von Sinorhizobium morelense S-30.7.5.
Tabelle 2: Eigenschaften von Sinorhizobium morelense S-30.7.5.
Beispiel 5: Enzyminduktion: Vergleich der Aktivitäten im Rohextrakt
Tabelle 3: Enzymaktivitäten in Abhängigkeit vom Substrat
10 mM 1,5-Anhydrofructose und 1,5-AG in MV-Medium; NB-Komplex-Medium (s. Materialien)
Beispiel 6: Anzucht von Sinorhizobium morelense/Wachstumskurve (siehe 1)
Die Zellen von Sinorhizobium morelense werden 36 Std. auf einem Kulturmedium angezogen, das die folgenden Bestandteile enthält:
2,0 g Anhydrofructose oder Anhydroglucitol
1,0 g KH₂PO₄
0,4 g MgSO₄ × 7H₂O
0,4 g NaCl
1,0 g NH₄Cl
0,05 g CaCl₂ × 2H₂O
10 ml Spurenelementlösung SL 4; u.a. nach Pfennig und Lippert (1966) Arch. Microbiol. 55, Seite 245
10 ml Vitaminlösung; u.a. nach Balch in „Methods for General and Molecular Bacteriology" (Hrsg. G.Philipp, Seite 60, American Society for Microbiology, 1994) ad 1 Liter H₂O,
pH 6,8 eingestellt mit NaOH.
Die Kultivierung erfolgt in anaerober Schüttelkultur. Jeweils 150ml der in der vorstehenden Weise gewonnenen Zellsuspension werden in 1L-Erlenmeyerkolben bei 30° auf dem Schütteltisch bei 150 Upm unter Zusatz de o.g. genannten Kulturmediums inkubiert. In 1 ist der Verlauf des Anhydrofructose-Abbaus und die Absorptions der Zellsuspension bei 600 nm dargestellt. Die Kultivierung im Schüttelkolben lässt sich ohne weiteres auf Fermenteransätze übertragen. Ein 2-Liter-Fermenter (Braun-Biostat-B) wird mit Kulturmedium gefüllt, das 2 g/L Anhydrofructose oder 2 g/L Anhydroglucitol enthält. Während der Kultivierung wird die Temperatur bei 30°C und der pH des Kukturmediums bei 6,7 konstant gehalten. Die Belüftungsrate beträgt 5 Liter Luft/min und die Rührerdrehzahl 500Upm. Der Fermenter wird mit 10% einer Vorkultur beimpft. Die Ausbeuten betragen 500-1000 Units/Liter.
Genaues Vorgehen (in Stichpunkten):

Vorkultur I: 10 ml 10 mM-1,5 Anhydrofructose-MV-Medium; 8 h, 148 Rpm, 28°C, Schüttelkolben
Vorkultur II: 100 ml 10 mM-1,5 Anhydrofructose-MV-Medium; 12 h, 148 Rpm, 28°C, Schüttelkolben
Hauptkultur: 1500 ml 10 mM-1,5 Anhydrofructose-MV-Medium; 2 L-Fermenter, beimpft mit VK II, OD₆₀₀ 0,8 und pH 6,4
Fermentationsbedingungen: 28°C 400 UpM 0,4 vvm
Probenahme: stündlich OD₆₀₀ pH-Wert 1,5-Anhydrofructose-Konzentration (HPLC, H-Biorad)

In einem Berechnungszeitraum zwischen t = 5-13 h betrug die
Wachstumskonstante μ = 0,17
und die Generationszeit t_d = 4,1 h
Beispiel 7: Enzym-Aufreinigung
Die mit der Kultivierung erhaltene Zellmasse wird in einer 20 mmol/Liter Bis-Tris-Pufferlösung (pH 7) (3 ml Puffer pro g feuchte Zellmasse) suspendiert und mit Ultraschall (4 × 30 s bei 20 Microns) aufgeschlossen. Zelttrümmer werden anschließend durch Zentrifugation (40 min bei 5000 g) abgetrennt. Der erhaltene Zellextrakt wird mit 0,1 mg/ml DNase versetzt. Der so behandelte Rohextrakt wird dann mit chromatografischen Verfahren aufgereinigt. Die Tabelle 4 zeigt die verschiedenen Reinigungsschritte, Ausbeuten und spezifische Aktivität der Anhydrofructose-Reduktase.
Genaues Vorgehen (in Stichpunkten):

– Anzucht in 2L-Fermenter, 1.5 L 10 mM-1,5-Anhydrofructose-Mineral-Vitaminmedium (s. Materialien); bei 28°C, für 36 h
– Ausbeute von 3.5 g nassen Zellen

Tabelle 4:
Beispiel 8: Substratspektrum Reduktionsreaktion
Mit dem gereinigten Enzym wird die Substratspezifität der Anhydrofructose-Reduktase in bekannter Weise bestimmt. Hierzu wird beispielsweise zu einer NADPH-enthaltenden Bis-Tris Pufferlösung (pH 6,5) die Enzymlösung gegeben (0,2 Units/ml Testansatz) und die Reaktion durch Zugabe der in Tabelle 5 aufgeführten Substrate in einer Konzentration von 30 mmol/Liter gestartet.
Tabelle 5: Spezifische Aktivität der Anhydrofructose-Reduktase in Anwesenheit verschiedener Substrate
Tabelle 5
Die Messung erfolgte folgendermaßen:
1 ml-Küvettenansatz: Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 0,28 μmol NADPH, 70 mU 1,5-AF-R, 30 μmol Substrat
Die Bestimmung der Anhydrofructose-Reduktase aus Sinorhizobium meliloti mit der Hinterlegungsnummer DSM 1981 erfolgte entsprechend. Die Anhydrofructose-Reduktase wurde im Extrakt in Gegenwart von 1,5-Anhydro-D-Fructose mit einer spezifischen Aktivirät von 0,4 U/mg Protein bestimmt.
Beispiel 9: Substratspektrum Oxidationsreaktion

→ entspricht ca. 1% der 1,5-Anhydrofructose-Reduktions-Aktivität

Tabelle 6: Spezifische Aktivität (Oxidation) der Anhydrofructose-Reduktase in Anwesenheit verschiedener Substrate
Tabelle 6:
Die Messung erfolgte folgendermaßen:
1 ml-Küvettenansatz: Messung bei 365 nm
100 μmol Tris (pH 9), 1,8 μmol NADP⁺, 5 U 1,5-AF-R, 100 μmol Substrat
Beispiel 10: Bestimmung der Substratkonzentration, bei der die Anhydrofructose-Reduktase ihre halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit aufweist (= KM-Werte für Reduktionsreaktion)

8.3 mM	1,5-anhydro-D-fructose
11.0 mM	D-Glucoson
0.2 mM	NADPH

Die Messung wurde wie folgt durchgeführt:
Küvettenansatz KM (1,5-Anhydrofructose): Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 0,28 μmol NADPH, 50 bzw. 100 mU 1,5-AF-R
Küvettenansatz KM (D-Glucoson): Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 0,28 μmol NADPH, 50 bzw. 100 mU 1,5-AF-R
Küvettenansatz KM (NADPH): Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 30 μmol 1,5-Anhydrofructose, 50 bzw. 100 mU 1,5-AF-R
Beispiel 11: Aktivitätsvergleich der Anhydrofructose-Reduktase-Aktivitäten verschiedener Sinorhizobien
Vergleich der 1,5-AF-R-Aktivitäten verschiedener Sinorhizobien, gemessen in Rohextrakten (1,5-Anhydrofructose-MV-Medium, s. Materialien) Tabelle 7: Aktivitätsvergleich
Materialien

Minimalmedium für Sinorhizobium morelense S-30.7.5.

1,5-Anhydrofructose/1,5-AG	1.62 g/1.64 g
KH₂PO₄	1.0 g
NH₄Cl	0.5 g
MgSO₄·7 H₂O	0.4 g
NaCl	0.4 g
CaCl2·2 H2O	0.05 g
SL4-Lösung	1 ml
Vitaminlösung	1 ml
H2O dest.	ad 1000 ml, pH 6.8

Spurenelementlösung SL4 (Pfennig und Lippert, 1966, 10fach)

EDTA 5.0 g

FeSO₄·7 H₂O 2.0 g

ZnSO₄·7 H₂O 0.1 g

MnCl₂·4 H₂O 0.03 g

H₃BO₃	0.3 g
CoCl₂·6 H₂O	0.2 g
CuCl₂·2 H₂O	0.01 g
NiCl₂·6 H₂O	0.02 g
Na₂MoO₄·2 H₂O	0.03 g
H₂O dest.	ad 1000 ml

Vitaminlösung (Schlegel, 1985, 10fach)

Biotin 2 mg

Nicotinsäure 20 mg

Thiamin 10 mg

4-Aminobenzoesäure 10 mg

Pantothenat 5 mg

Pyridoxamin 50 mg

Cyanocobalamin 20 mg

H₂O dest. ad 100 ml
NB-Medium No. 4, Fluka

Meat peptone 5 g

Meat extract 3 g

H₂O dest. ad 1000 ml
Beispiel 12: N-terminale Sequenzierung, Datenbankvergleich und Primer-Ableitung
Die Anhydrofructose-Reduktase wurde zu spezifischer Aktivität von 490 U/mg aufgereinigt, einer Western Blot-Analyse unterzogen und N-terminal ansequenziert: 25 Aminosäuren (Aminosäure 1-25 der SEQ ID NO:2)
Der Datenbank-Abgleich (Alignment) erfolgte mittels obiger 25 AS-Sequenz.
Tabelle 8: Datenbank-Vergleich
Die Ableitung von PCR-primern Oxred_Mel.l-35-f and Oxred_Mel.979-r erfolgte ausgehend von Gensequenz des putativen Oxidoreductaseproteins aus Sinorhizobium meliloti; ORF SMc04400 (database NP_387411.1, gene position 3605092-3606093) mit einer Länge von 1002 bp, kodierend für 35 kD-Protein (Primer-Sequenzen, s. Tabelle 11)
Beispiel 13: Klonierung der Anhydrofructose-Reduktase
Die Klonierung der Anhydrofructose-Reduktase erfolgte wie im Folgenden stichpunktartig beschrieben:

– Isolierung der genomischen DNA von S. morelense S-30.7.5. nach Altenbuchner und Cullum, 1984, Mol Gen Genet.; Vol. 195, S. 134-8
– Amplifikation mittels Proofstart^TM PCR, in Volumen von 50 μl: 10 mM Tris/HCl (pH 9.2), 1.5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.3 mM dNTP mix, 10 mM Oxred_Mel.1-35-f 10 mM Oxred_Mel.979-r, 1 μg genomische DNA and 5 U Proofstart^TM Polymerase (Primer-Sequenz, s. Tabelle 11)
– 1 %iges TBE-Gel: Kontrolle des 1.0 kb-PCR-Produkts
– Taq-Polymerase-Reaktion, TOPO^®-Klonierung in pCRII^®-TOPO-Vektor (sog. Plasmid pPS18, s. Tabelle 1) und Transformation in chemisch kompetent E. coli TOPO^®-Zellen (sog. E. coli [pPS18], s. Tabelle 10)
– Sequenzierung des 1.0 kb-PCR-Produkts: Sequenz siehe Beispiel 14)

Beispiel 14: Nucleotid- und Aminosäuresequenz der Anhydrofructose-Reduktase
(a) Nucleotidsequenz von 1,5-anhydro-D-fructose-Reduktase aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5.: 1002 by (SEQ ID NO:1)
(b) Abgeleitete Proteinsequenz von 1,5-anhydro-D-fructose-Reduktase aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5.: 334 AS (SEQ ID NO:2)
Das anhand der Sequenz berechnete Molekulargewicht beträgt 35010 Da.
Tabelle 9: Datenbankvergleich mit abgeleiteter AS-Sequenz: NCBU BLAST
Beispiel 15: Klonierung in Expressionsvektor pET24a(+), Expression in E.coli und Aufreinigung mittels Histidin-Tag
(a) Die Klonierung in den Expressionsvektor pET24a(+) erfolgte wie im Folgenden stichpunktartig beschrieben:

– PCR-Mutagenese von pPS18-Insert mittels Proofstart^TM PCR, in Volumen von 50 μl: 10 mM Tris/HCl (pH 9.2), 1.5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.3 mM dNTP mix, 10 mM_Oxred Mor.NDE-f 10 mM_Oxred Mor.Bam-r, 1 μg genomische DNA and 5 U Proofstart^TM Polymerase (Primer-Sequenz, s. Tabelle 11)
– 1% iges TBE-Gel: Kontrolle des 1.0 kb-PCR-Produkts
– Restriktionsverdau des 1.0 kb-PCR-Produkts mittels NdeI und BamHI
– Ligation des 1.0 kb-PCR-Produkts mit NdeI BamHI-geschnittenen pET24a(+)-Vektor (sog. Plamid pA6Chl, s. Tabelle 10)
– Sequenzierung des 1.0 kb-PCR-Produkts: Sequenz siehe Beispiel 14)
– Transformation in E. coli BL21 (DE3)-Zellen (sog. E. coli BL21/DE3) [pA6Ch1], s. Tabelle 10)

(b) Die Aufreinigung mittels Histidin-tag erfolgte wie im Folgenden stichpunktartig beschrieben:

– PCR-Mutagenese von pPS 18-Insert mittels Proofstart^TM PCR, in Volumen von 50 μl: 10 mM Tris/HCl (pH 9.2), 1.5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.3 mM dNTP mix, 10 mM Oxred_Mor.NDE-f 10 mM Oxred_Mor.His-r, 1 μg genomische DNA and 5 U Proofstart^TM Polymerase (Primer-Sequenz, s. Tabelle 11)
– 1%iges TBE-Gel: Kontrolle des 1.0 kb-PCR-Produkts
– Restriktionsverdau des 1.0 kb-PCR-Produkts mittels NdeI und BamHI
– Ligation des 1.0 kb-PCR-Produkts mit NdeI/BamHI-geschnittenen pET24a(+)-Vektor (sog. Plamid pA6Ch1, s. Tabelle 10)
– Sequenzierung des 1.0 kb-PCR-Produkts: Sequenz siehe Beispiel 14)
– Transformation in E. coli BL21 (DE3)-Zellen (sog. E. coli BL21/DE3 [AFR-HIS], s. Tabelle 10)

Tabelle 10
Tabelle 11: verwendete PCR-Primer
Beispiel 16: Biochemische Charakterisierung der rekombinanten 1,5-Anhydrofructose-Reduktase
1.) Die von der rekombinanten 1,5-Anhydrofructose-Reduktase katalysierten Reaktionen:
(a) 1,5-anhydro-D-fructose + NADPH+H⁺ = 1,5-anhydro-D-mannitol + NADP⁺
(b) 2-Keto-D-glucose + NADPH+H⁺= D-Mannose + NADP⁺
(c) 2-Keto-D-Allose + NADPH+H⁺= D-Altrose + NADP⁺
2.) Reaktionstyp: Oxidoreduktion
4.) Wachstumskurve der Anhydrofructose-Reduktase-exprimierenden Bakterien BL21(DE3) (siehe 2)
Die Kultivierung der Anhydrofructose-Reduktase-exprimierenden Bakterien BL21(DE3) (siehe Beispiel 15), erfolgte wie im Folgenden stichpunktartig beschrieben:

Vorkultur: 2 × 50 ml Komplex-Kanamycin (25 μg/ml)-Medium, s. Anhang; 12 h, 240 Rpm, 37°C, Schüttelkolben
Hauptkultur: 1500 ml Komplex-Kanamycin (25 μg/ml)-Medium, s. Anhang; 2 L-Fermenter, beimpft mit VK, nach 1 h Induktion IPTG (0.1 mM)
Fermentationsbedingungen: 37°C 200 UpM 3 L/min
Probenahme: stündlich OD₆₀₀ pH-Wert 1,5-AF-R-Aktivität

In einem Zeitraum zwischen t = 2-5 h wurden folgende Werte ermittelt:
Wachstumskonstante μ= 0.41
Generationszeit t_d = 1.7 h
5.) Cofaktor: NADPH/NADP⁺, kein NADH/NAD⁺
6.) Aufreinigung
Die Kultivierung der Anhydrofructose-Reduktase-exprimierenden Bakterien BL21(DE3) erfolgte in Schüttelkultur, 0.25 L Komplex-Kanamycin (25 μg/ml)-Medium
(s. Materialien),
37°C, 24 h, nach 1 h Induktion mittels IPTG (0.1 mM)
Ausbeute von 4 g nassen Zellen,
Aufreinigung in 4 Aliquots, Tabelle entspr. 1 Aliquot
Der Rohextrakt wird dann mit chromatografischen Verfahren aufgereinigt. Die Tabelle 12 zeigt die verschiedenen Reinigungsschritte, Ausbeuten und spezifische Aktivität der rekombinanten Anhydrofructose-Reduktase Tabelle 12:
7.) pH-Optimum: pH 6.5 in 100 mM Bistris-Puffer
Die Messung erfolgte bei:

– 1 ml-Küvettenansatz : Messung bei 365 nm
– 100 μmol jeweiliger Puffer, 0,28 μmol NADPH, 30 μmol 1,5-Anhydrofructose, 50 mU bzw. 100 mU 1,5-AF-R

Das Substratspektrum für die Reduktionsreaktion/Oxidationsreaktion entspricht der nativen 1,5-AF-R aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5.
8.) KM-Werte (Substratkonzentrationen bei der die rekombinante Anhydrofructose-Reduktase halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit aufweist.
6.4 mM 1,5-anhydro-D-fructose

0.2 mM NADPH
Die Bestimmung wurde wie folgt durchgeführt:
1 ml-Küvettenansatz KM (1,5-Anhydrofructose): Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 0,28 μmol NADPH, 50 bzw. 100 mU 1,5-AF-R
1 ml-Küvettenansatz KM (NADPH): Messung bei 365 nm
100 μmol BT (pH 6,5), 30 μmol 1,5-Anhydrofructose, 50 bzw. 100 mU 1,5-AF-R
9.) Molekulargewicht: 35.1 kDa (bestimmt anhand MALDI)
10.) Untereinheiten: Monomer (bestimmt anhand Gelfiltration)
Beispiel 17: His-Tag-AFR, Aufreinigung
Die Kultivierung der Anhydrofructose-Reduktase-exprimierenden Bakterien erfolgte in Schüttelkultur, in 0.25 L Komplex-Kanamycin (25 μg/ml)-Medium, unter folgenden Bedingungen:
37°C, 24 h, nach 1 h Induktion mittels IPTG (0.1 mM)
Ausbeute von 4 g nassen Zellen,
Aufreinigung in 4 Aliquots, Tabelle entspr. 1 Aliquot
Der Bakterienextrakt wird anschließend mit chromatografischen Verfahren aufgereinigt. Die Tabelle 13 zeigt die verschiedenen Reinigungsschritte, Ausbeuten und spezifische Aktivität der Anhydrofructose-Reduktase.
Tabelle 13
Materialien
Komplex-Medium

Glucose	2.5 g
Trypton	17.0 g
Soja Pepton	3.0 g
NaCl	5.0 g
H₂O dest.	ad 1000 ml, pH 7

Beispiel 18: Anwendungen für die Anhydrofructose-Reduktase
1.) Quantitative Substratbestimmung (3)
1,5-anhydro-D-fructose + NADPH+H⁺ = 1,5-anhydro-D-mannitol + NADP⁺
Die Substratbestimmung wurde wie im Folgenden stichpunktartig beschrieben durchgeführt:

– 1 ml-Küvettenansatz: Messung bei 340 nm
– 100 μmol Bis-Tris-Puffer (pH 6,5), 0,14 μmol NADPH, 9 bzw. 13 U 1,5-Anhydrofructose-DH,
– 0,075 μmol, 0,04 μmol, 0,01 μmol, 0,008 μmol 1,5-Anhydrofructose-Reduktase

In einer idealen Messung hat man eine Anhydrofructose-enthaltende Probe sowie – statt dessen – als Leerwert Wasser. Nach Mischen der Substanzen wir die Ausgangsextinktion E1 bei der Wellenlänge von 340nm oder 365nm (Quecksilberlampe) gegen Luft gemessen. Zum Starten der enzymatischen Reaktion werden die Testlösungen mit Anhydrofructose-Reduktase versetzt, gemischt und bis Reaktionsstillstand inkubiert. Danach wird der Extinktionswert E2 gemessen. Aus der Differenz Delta-E = E1 – E2 wird mittels Lambert-Beer'sches Gesetz die Ausgangskonzentration an Anhydrofructose-Reduktase ermittelt. Zur Bestimmung in reifen Bananen werden 2g einer reifen Banane mit 1ml 100mM Bis-Tris-Puffer, pH 6,5, versetzt und im Homogenisator aufgeschlossen. Die Suspension wird 20min bei 10000g zentrifugiert und der resultierende, als Probe zu verwendende Überstand vorsichtig mit einer Pipette entnommen. Der Test wird durch die im Blut vorhandenen Kohlenhydrate (physiol. Konzentrationen: 6 mM Glucose; 0,3 mM D-Galactose; 1 mM Fructose; 1,5 mM D-Glucose-6-Phosphat) nicht beeinträchtigt.
2.) Biokonversionen
(a) 1,5-anhydro-D-fructose + NADPH+H⁺ = 1,5-anhydro-D-mannitol + NADP⁺ (siehe Figur 4)
Die Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

– 5 ml-Umsatz:
– 500 μmol BT (pH 6,5), 115 μmol NADPH, 17 U 1,5-AF-R, 100 μmol 1,5-Anhydrofructose
– 28°C, 142 UpM

(b) 2-Keto-D-glucose + NADPH+H⁺= D-Mannose + NADP⁺ (siehe Figur 5)
Die Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 ml-Umsatz:
500 μmol BT (pH 6,5), 115 μmol NADPH, 61 U 1,5-AF-R, 100 μmol D-Glucoson
28°C, 142 UpM
(c) D-Xy1oson + NADPH+H⁺= D-Lyxose* + D-Xylose + NADP⁺
Die Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 ml-Umsatz:
100 μmol BT (pH 6,5), 115 μmol NADPH, 61 U 1,5-AF-R, 100 μmol D-Xyloson
28°C, 142 UpM
*NMR-Analyse noch offen
(d) 3-Keto-1,5-Anhydrofructose + NADPH+H⁺ = 1-Desoxy-3-Keto-D-Mannose* + NADP⁺ (siehe Figur 7)
*NMR-Analyse noch offen
Die Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 ml-Umsatz:
100 μmol BT (pH 6,5), 115 μmol NADPH, 61 U 1,5-AF-R, 100 μmol 3-Keto-1,5-Anhydrofructose
28°C, 142 UpM
(e) D-Galactoson + NADPH+H⁺ = D-Talose + D-Galactose + NADP⁺
(f) 6-Desoxy-D-Glucoson + NADPH+H⁺= 6-Desoxy-D-Glucose + 6-Desoxy-D-Mannose + NADP⁺
3.) Präparative Produktgewinnung

Bsp.:

1,5-anhydro-D-fructose + NADPH+H⁺ = 1,5-anhydro-D-mannitol + NADP⁺ (siehe Figur 8)
Die Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
10 ml-Umsatz:
1 mmol BT (pH 6,5), 0.3 μmol NADPH, 12 μmol NADP⁺, 30 U 1,5-AF-R, 30 Units Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6P-DH), 660 μmol 1,5-Anhydrofructose, 660 μmol Glucose-6-Phosphat (G-6P)
28°C, 142 UpM

Claims

Isolierte Anhydrofructose-Reduktase, welche die Reduktion von Anhydrofructose zu Anhydromannitol zu katalysieren vermag.
Anhydrofructose-Reduktase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anhydrofructose-Reduktase eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, einem Fragment oder Derivat davon, b) einer Aminosäuresequenz enthaltend eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, ein Fragment oder Derivat davon, c) einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, kodiert wird, d) einer Aminosäuresequenz einer Variante der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, wobei die Variante von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, hybridisiert, und e) einer Aminosäuresequenz eines Orthologs der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2, wobei das Ortholog von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1, einem Fragment oder Derivat davon, hybridisiert.
Anhydrofructose-Reduktase gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anhydrofructose-Reduktase a) ein Molekulargewicht von etwa 30000 bis 36000 Dalton, bevorzugt 32000 bis 35000 Dalton, besonders bevorzugt 34850 Dalton aufweist und/oder b) bei einem pH-Bereich zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0 aktiv ist und/oder c) bei einer Substratkonzentration von etwa 8,4 × 10^–3 mol/L Anhydrofructose und/oder etwa 2,0 × 10^–4 mol/L NADPH ihre halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit aufweist.
Anhydrofructose-Reduktase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anhydrofructose-Reduktase, d) ihren isoelektrischen Punkt bei etwa pH 4,5 hat, und/oder e) in Anwesenheit von Glucuronsäure, Pyridin-3-Aldehyd, Acetaldehyd, Formaldehyd oder 2,3-Butandion inaktiv ist.
Anhydrofructose-Reduktase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Anhydrofructose-Reduktase aus Bakterien stammt.
Anhydrofructose-Reduktase gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien die Gattungen Allorhizobium, Ensifer, Rhizobium, Mesorhizoboium, Bradyrhizobium, Azorhizobium und/oder Sinorhizobium, bevorzugt Sinorhizobium meliloti oder Sinorhizobium morelense, umfassen.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 kodiert, b) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz enthaltend eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:2 und/oder eine Variante und/oder ein Ortholog davon kodiert, c) einer Nukleotidsequenz, welche die Sequenz mit der SEQ ID NO:1, ein Fragment oder Derivat davon, umfasst, d) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang der Nukleinsäure mit der SEQ ID NO:1 hybridisiert, e) einer Nukleotidsequenz, bei der im Vergleich zu der Nukleotidsequenz in a), b) oder c) mindestens ein Nukleotid substituiert, deletiert oder insertiert ist, und f) einer Nukleotidsequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zu der Nukleotidsequenz in a), b), c), d), oder e) verschieden ist.
Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7.
Vektor gemäß Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure in Sinn-Orientierung mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen ermöglichen.
Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder einen Vektor nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Wirtszelle nicht eine Wirtszelle ist, die natürlich vorkommend eine natürlich vorkommende Nukleinsäure nach Anspruch 7 enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienzelle zur Gattung Sinorhizobium, Allorhizobium, Ensifer, Rhizobium, Mesorhizoboium, Bradyrhizobium oder Azorhizobium gehört.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienzelle zum Stamm Sinorhizobium morelense S-30.7.5. mit der Hinterlegungsnummer DSM 15760 gehört.
Antikörper, der spezifisch eine Anhydrofructose-Reduktase nach einem der Ansprüche 1-6 erkennt.
Verfahren zum Herstellen einer Anhydrofructose-Reduktase nach mindestens einem der Ansprüche 1-6, umfassend das Kultivieren von Wirtszellen nach einem der Ansprüche 10-13 und das Isolieren der exprimierten Anhydrofructose-Reduktase aus den Wirtszellen.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Anhydrofructose-Reduktase, umfassend das Einbringen eines Vektors nach Anspruch 8 oder 9 in mindestens eine Wirtszelle, das Kultivieren der Wirtszellen und das Isolieren der exprimierten, rekombinanten Anhydrofructose-Reduktase aus den Wirtszellen.
Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren der Wirtszellen mittels Nährmedium enthaltend Anhydrofructose und/oder Anhydroglucitol erfolgt.
Verwendung einer Anhydrofructose-Reduktase nach mindestens einem der Ansprüche 1-6 zur Bestimmung von Anhydrofructose in einer Probe.
Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine dem menschlichen Körper entnommene Körperflüssigkeit ist.
Verwendung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut ist.
Verfahren zum Nachweis von Hyperglykämie in einem Patienten, umfassend die Bestimmung von Anhydrofructose mittels einer Anhydrofructose-Reduktase nach einem der Ansprüche 1-6 in einer aus dem Patienten isolierten Probe, wobei eine im Vergleich zu einer geeigneten Referenz veränderten, bevorzugt niedrigere, Menge an Anhydrofructose Indikativ für das Vorliegen von Hyperglykämie in dem Patienten ist.
Verwendung einer Anhydrofructose-Reduktase nach einem der Ansprüche 1-6 zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose einer Krankheit, bei der eine im Vergleich zu einer gesunden Referenzprobe veränderte Menge Anhydrofructose vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit Diabetes mellitus ist.
Diagnosemittel zur Diagnose einer Krankheit, bei der eine im Vergleich zu einer gesunden Referenzprobe veränderte Menge Anhydrofructose vorliegt, wobei das Diagnosemittel eine Anhydrofructose-Reduktase nach einem der Ansprüche 1-6 enthält.
Diagnosemittel gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit Diabetes mellitus ist.
Verwendung einer Anhydrofructose-Reduktase nach einem der Ansprüche 1-6 zur biokatalytischen Synthese manno-konfigurierter Zuckerderivate.
Verwendung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die mannokonfigurierten Zucker ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 1,5-Anhydro-D-Mannitol, D-Mannose und D-Rhamnose.