DE3525722A1 - Verfahren zur herstellung von reinem hefechromatin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von reinem hefechromatinInfo
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Description
GEYER, HAGEMANN & KEHL.-- : : . ' -
PATENTANWÄLTE - '" * · ^- -.. - -
EUROPEAN PATENT ATTORNEYS O C O C "7 O
Ismaninger Straße 108 · 8000 München 80 · Telefon O 089/980731-34 · Telex 5216136 hage d · Telegramm: hageypatent · Telefax 089/982421 Automat (CCITT Gr. 2i
Briefanschrift: Postfach 860329 ■ 8000 München 86
Dr. Channa SHALITIN and München, den
Technion Research & Development 18. Juli 1985
Foundation Ltd. Dr.H/3/cw u. Z.: Pat 574/1-85Ch
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG REINEN HEFECHROMATINS SOWIE
SEINE VERWENDUNG
Die Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zur Gewinnung von Hefechromatin und seine Verwendung zur Gewinnung
von Antikörpern, wie der Bestimmung von Säugetierkarzinomen. Ganz besonders befaßt sich die Erfindung
mit einer neuen, einfachen und billigen Methode zur Gewinnung von reinem Hefechromatin und seine Verwendung
zur Gewinnung von Antikörpern, die gegenüber Säugetier-ras-gen-Erzeugnissen ganz spezifische Bindeeigenschaften
zeigen.
Chromatin ist als ein Nucleoprotein-Komplex bekannt,
der aus vier Hauptbestandteilen besteht: Histonen, die Proteine niedrigen Molekulargewichts darstellen,
Nichthiston-Proteine, die sich von Histonen unterscheiden,
Desoxyribonukleinsäure (DNS) und Ribonukleinsäure (RNS). Das Erscheinungsbild vom Chromatin variiert in Abhängigkeit
von dem Zustand der Zelle und der Art des Fixierens. Im Zusammenhang mit aus Saccharomyces cerevisae
isoliertem Chromatin wurde von einer Zahl von
Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000
bis 21.000 berichtet. In A. Sommer Molec.gen. Genet. 161, 1978, S. 323-331 wird im Zusammenhang mit der
Suche nach einem Histon-H1-ähnlichen Protein von einem
Protein mit einem Molekulargewicht von 21.000 berichtet, das von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
isoliert wurde. Dieses Protein wird danach "Bändel" genannt und als dem H1-Histon ähnlich angesehen. Des
weiteren wird in dieser Literaturstelle darüber berichtet, daß eine Analyse mittels 15%-iger Polyacrylamid/
Natriumdodezylsulfat-Gel-Elektrophorese gezeigt hat,
daß die Verbindung "Bändel" wenig langsamer als das Histon H3 (Fig. 1) wandert. Um den grundsätzlichen
Mechanismus der eukaryotischen Gen-Expression und -Regulation aufzuklären, wählte Sommer Saccharomyces
cerevisiae als experimentelles Modell mit einem genetischen Auffrischen (gentic make-up) begrenzter Komplexität
als ideales eukaryotisches System. Die Substanz "Bändel" wurde aus dem Hefechromatin mittels einer
5-molaren Natriumchloridlösung extrahiert. Das freigesetzte Protein konnte an Biorex 70 gebunden werden.
Die Elution mit einer 550 mmolaren Natriumchloridlösung führte zu der Entdeckung des"BandeI-Proteins"
Wenn Hefechromatin mittels der Mikrokokkus-Nuklease aufgeschlossen wurde und der Aufschluß auf einem Rohrzucker-Gradienten
fraktioniert wurde, dann wurde festgestellt,
daß der hauptsächliche säure-extrahierbare
Proteinbestandteil im oberen Peak als "BandeI-Protein"
gefunden wurde. Daher folgarte Sommer, daß das "Bande-I-Proteiri1
in "internukleosomalen" Räumen vorliegt. Des weiteren fand Sommer, daß die Chromatin-Präparationen,
die in Abwesenheit des Detergenses ITonidet P40 (NP40) isoliert wurden, beträchtlich herabgesetzte
Mengen an dem "BandeI-Protein"enthielten. Die
Aminosäure-Zusammensetzung der"Bande I" (angegeben in
Tabelle I) erwies sich im wesentlichen ähnlich der des HMG-2 (Gruppe 2 mit hoher Mobilität)-Proteins,
das von Rinderthymuschromatin isoliert wurde.
In F. Caron et al "Proc. Natl. Acad. Sei.", USA 76,
1979, S. 4265-4269 wird über ein Verfahren zum Extrahieren
eines Eiston-ähnlichen Proteins aus Hefemitochondrien berichtet. Danach werden die Zellen aufgebrochen
und die Mitochondrien isoliert. Das Protein wird auf einer Rinderthymus-DNS-Zellulosesäule mit
zwei Strängen gereinigt. Es schließt sich eine Behandlung mit DNasel an. Das Protein wurde mittels einer
2-molaren Natriumchloridlösung eluiert und als HM-Protein bezeichnet. Nach diesem Bericht von Caron
enthalten Hefemitochondrien keine Histone. Sie weisen jedoch reichlich ein DNS-Bindeprotein von 20.000
Dalton auf, das HM genannt wurde. Aufgrund der Analyse der Aminosäurezusammensetzung (sh. Tabelle 1 ),
die in dem vorstehend genannten Bericht angegeben wird, scheint es, daß die Aminosäurezusammensetzung
des HM-Proteins im wesentlichen dem gleich zu sein scheint, das Sommer im Zusammenhang mit dem"Bande I-Protein"
beschrieb. Caron et al vermuteten, daß ihr HM-Protein nicht mit dem"Bande I-Protein"aufgrund der unterschiedlichen
Mobilität des HM-Proteins auf Säure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelen
identisch ist. Die Bindung des HM-Proteins an DNS wurde von Caron et al unter Verwendung
des sogenannten entspannten Simian-Virus 40
(SV 40) DNS geprüft. Ihre Reaktionsmischung enthielt einen Chromatinextrakt aus Krebs-Asciten-Zellen mit
einer "nicking-closing activity". Es wurde des weiteren gefunden, daß die optimalen Bedingungen zur
Einführung von einer "Superhelixstruktur" ("superhelical turns") im entspannten SV40-DNS mittels des
HM-Proteins bei 150 mmolarem Natriumchlorid und bei einem HM-DNS-Verhältnis (Gewicht) von 0,8 :1,2 liegt.
In einer jüngeren Arbeit wird von S.Weber und I. Isenberg
in Biochemistry, Bd. 19, 1980,^S. 2236-2240 ein als HMGa bezeichnetes Protein beschrieben, daß aus
Saccharomyces cerevisiae isoliert wurde. Dieses Pro-
— ο —
tein soll eine Gruppeneigenschaft hoher Mobilität besitzen. Es wurde aus Chromatin durch Extraktion mit
einer 0,25-molaren Salzsäurelösung gewonnen. Nach diesem Bericht kann das Protein HMGa nicht entsprechend
den üblichen Extraktionskriterien definiert werden. Gestützt auf die Mobilität in Natriumdodezylsulfat
und in Essigsäure-Harnstoff-Gelen und aufgrund seiner Aminosäurezusammensetzung folgerten die Autoren, daß
das "Bande I-Proteiri1 von Sommer tatsächlich mit dem
HMGa-Protein identisch ist.
Bei einem kürzlich erschienen Bericht von Ulrich Certa et al in Nucleic Acids Res., Bd. 12, 1984, S. 7975-7985
wird ein anderes Verfahren zur Reinigung von "Histon-Hi-ähnlichen"
Proteinen (20 Kd) beschrieben. Nach diesem Verfahren wird das 20 Kd-Protein, wie von
Sommer beschrieben, aus herkömmlicher Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
hergestellt, wobei die Umkehrhochleistungs-DC verwendet wurde. Hierbei wurde das
Protein hohen Konzentrationen von Acetonitril unter nicht-physiologischer Bedingung ausgesetzt.
Aufgrund einer sorgfältigen Analyse der obengenannten und von Saccharomyces cerevisiae isolierten Proteine
wurde erfindungsgemäß gefunden, daß alle obengenannten Proteine auf Essigsäure-Harnstoff-Gelen die gleiche Itobilität
haben (alle bewegen sich ein wenig langsamer als das Rinderthymushiston
H1) . Es wurde gefunden, daß gereinigtes Chromatin (frei von Ribosomen) von Saccharomyces cerevisiae
(Bäckerhefe) ein Ausgangsmaterial für das p20-Polypeptid sein kann. Es wurde des weiteren gefunden, daß
das derartig erhaltene p20-Polypeptid ein "Superhelixsystem ("superhelical turns") in entspannte
pMB9-DNS (sh. Fig. 2) einführen kann, wie es vorher durch Caron et al beim aus Hefemitochondrien isolierten
HM-Protein beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde gefunden, daß das p20-Polypeptid zur Gewinnung von
Antikörpern geeignet ist, die die Fähigkeit besitzen(
-9-ras-onkogene Produkte nachzuweisen.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Gewinnung von reinem Hefechromatin, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß
(a) die Hefezellen in einer Lösung eines Puffers aufgebrochen werden und die Aufschlämmung zentrifugiert
wird,
(b) die ausgefällten Kügelchen des Chromatins mittels
Rohrzucker gereinigt und mit einer 2-Mercaptoethanol und Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltenden
Pufferlösung gewaschen werden,
(c) die bei der Maßnahme (b) erhaltene Ausfällung enzymatisch aufgeschlossen und löslich gemacht wird,
(d) die überstehende Lösung der aufgeschlossenen Masse der Maßnahme (c) in einer Pufferlösung einem
linearen Rohrzuckergradienten von 5 bis 30 % auferlegt wird und
(e) von den Fraktionendes Rohrzuckergradienten das p20-Polypeptid mittels einer 0,15-bis 5-molaren Natriumchlorid-Pufferlösung extrahiert wird.
(e) von den Fraktionendes Rohrzuckergradienten das p20-Polypeptid mittels einer 0,15-bis 5-molaren Natriumchlorid-Pufferlösung extrahiert wird.
Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäß gewonnene
isolierte p20-Polypeptid von hoher Reinheit ist, was sich in der Auflösung mittels Gelelektrophorese
in Natriumdodecylsulfat zeigt, gefolgt durch das Einfärben mit Coomassie brilliant blue R-250, erläutert
in Fig. 1 A, oder mit einem Silbereinfärbungsverfahren,
erläutert in Fig. 1 B. Es ist anzunehmen, daß der Hauptbande mehr als 90 % des gesamten
Materials zuzuschreiben sind. Das isolierte p20-Polypeptid war auch entsprechend der Elektrophorese
in einem Essigsäure-Harnstoff-Gel rein (sh. Fig. 3). Die Aminosäurezusammensetzung des p20-Polypeptids
wird in der Tabelle 1 wiedergegeben, um einen Vergleich mit den eingangs erwähnten Proteinen
zu ziehen. Aus der obigen Tabelle kann gefolgert werden, daß in deren Zusammensetzung keine signifikan-
ten Unterschiede vorliegen. Vielmehr sind alle charakterisiert durch einen hohen Gehalt an Asparagin-
und Glutaminsäure (21,8 bis 27,0 Mol-%) und durch ein Verhältnis Lysin/Arginin im Bereich von 2,31 bis
3,1.
Das Verfahren zur erfindungsgemäßen Herstellung von p20-Polypeptid ist sehr einfach im technischen Maßstab
durchzuführen, ohne daß eine komplizierte oder spezielle Ausrüstung erforderlich wäre. Darüber hinaus
ist das Ausgangsmaterial, nämlich Bäckerhefe, preisgünstig in großen Mengen erhältlich. Der im Rahmen
der Erfindung verwendete Begriff "Hefe" ist weitestgehend zu verstehen und umfaßt jeden beliebigen Stamm
von Saccharomyces, Schizosaccharomyces (wie Saccharomyces
cerevisiae und Schizosaccharomyces poitibe und umfaßt des weiteren partiell aufgebrochene Zellen,
isolierte Kerne oder Mitochondrien.
der ersten Maßnahme (a) wird die Bäckerhefe mit
einer Lösung des Puffers A gewaschen, der Tris-HCl (pH = 7,5) , EDTA, Magnesiumsulfat und Natriumbisulfit
enthält. Sie wird dann in einem frischen Puffer A, der auch Phenylmethylsulfonylfluorid enthält, erneut
suspendiert. Die Zellen werden durch mehrmaliges Schütteln mit Glaskügelchen aufgebrochen. Vorzugsweise
sind diese Glaskügelchen mit Sigmacote beschichtet. Die abgegossene überstehende Lösung wird gekühlt.
Ein neuer Teil des Phenylmethylsulfonylfluo-
OQ rids wird hinzugegeben und eingerührt. Die viskose
obere Schicht der Kügelchen wird erneut in einer Lösung suspendiert, die, wie oben, den Puffer A sowie
Phenylmethylsulfonylfluorid enthält und erneut rotiert. Bei der Maßnahme (b) werden die Chromatin-
Q5 pellets erneut in einem kalten Puffer suspendiert,
der Rohrzucker, ein Detergens, wie NP40, Phenylmethylsulfonylf luorid und 2-Mercaptoethanol, enthält.
Es wurde festgestellt, daß die Gegenwart des letzteren Bestandteils absolut wesentlich für die Unterstützung
der Reinigung des Chromatins ist. Die Konzentration des Rohrzuckers kann in einem weiten Bereich
ausgewählt werden, vorzugsweise ist sie 0,3-bis 1,7-und ganz besonders bevorzugt 1,4-bis 1 , frmolar.
Das erneut in dem vorgenannten Puffer suspendierte Chromatin wurde rotiert. Die erhaltenen Pellets
werden in dem gleichen Puffer dispergiert und des weiteren durch Zentrifugieren mittels einer Rohrzuckerlösung
in einem Puffer gereinigt, der den Puffer A + Phenylmethylsulfonylfluorid und 2-Mercaptoethanol
enthielt. Die erhaltene Aufschlämmung wird erneut bei 4° C rotiert. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung
der Erfindung wird das Zentrifugieren mindestens zweimal durchgeführt, wobei beim ersten
Zentrifugieren ein niedriger g-Wert und bei dem zweiten Zentrifugieren ein höherer g-Wert gewählt wird.
Es wurde festgestellt, daß dieses Vorgehen das Ausmaß
der Reinigung begünstigt. Bei der Maßnahme (c) wird die nach der Maßnahme (b) erhaltene Ausfällung
enzymatisch aufgeschlossen bzw. aufgelöst, wie mittels DNasel oder der Mikrokokkus-Nuklease. Nach der Inkubation,
wie sie im Stand der Technik bekannt ist, wird die Suspension zentrifugiert und separiert.
Bei der Maßnahme (d) wird die überstehende Lösung, gemischt mit einem Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltenden
Puffer, einem linearen Rohrzuckergradienten von 5 bis 30 % (Gewicht) in einer Tris-HCl (pH 7,5),
EDTA, Phenylmethylsulfonylfluorid, Natriumbisulfit und 2-Mercaptoethanol enthaltenden Pufferlösung unterworfen.
Die Gradienten wurden bei 4° C bei 153 000 g betrieben. Die Fraktionen wurden über Nacht gegen
Essigsäure (0,1-molar) dialysiert, lyophilisiert und auf Natriumdodecylsulfat-15 %-Polyacrylamid-Gelen
analysiert. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt,
die ein 15 %-Polyacrylamid-Natriumdodecylsulfat-Gel
von Proteinen erläutert, wobei die Proteine mittels der Mikrokokkus-Nuklease aus Hefechromatin freigesetzt
und auf linearen Rohrzuckergradienten (5 - 20 %) fraktioniert wurden. In der Figur werden die folgenden
Ausdrücke herangezogen:M = Molekulargewicht-Standardangaben: Rinderserumalbumin (68 kd), Ovalbumin
(43 kd), Carboanhydrase (29 kd), Chymotrypsinogen (25 kd), Lysozym (14 kd), Ribonuklease (12,6 kd)/
Weg H Gewebehistone, die nach dem Verfahren von Sommer
säure-extrahiert wurden; Wege 1-7: Gradientenfraktionen Nr. 1 bis 7, wobei die Fraktion Nr. 1 die Spitze
des Gradienten und B die untere Fraktion ist.
Aus der Fig. 4 ist ableitbar, daß das p20-Polypeptid zwei aufgespaltene Banden (Weg 2) zeigt. Die obere
Bande des Dubletts in den Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen
hat ein scheinbares Molekulargewicht von 20.500. Im Gegensatz dazu wandert das durch Säureextraktion
isolierte Polypeptid als einzelne Bande (Fig.4,Weg H) . Schließlich wurde bei der Maßnahme (e)
das p20-Polypeptid von den Sukrosegradientenfraktionen mittels einer Natriumchloridlösung extrahiert, ge-.iriischt
mit e inem Puffer Tris-HCl (pH = 8), EDTA, DTE (Dithioerythrit)
und zwei Protease-Inhibitoren, wie PhenylmethylsulfonyIfluorid und Natriumbisulfid.
Dies ist die bedeutendste aufgefundene Maßnahme gemäß der Erfindung, die absolut erforderlich ist, um das
richtige reine p20-Polypeptid zu gewinnen. Es wurde gefunden, daß die Konzentration des Natriumchlorids
zur Gewinnung der optimalen Polypeptidfraktion ziemlich entscheidend ist und 0,15-bis 5-molar und
ganz besonders 0,35-bis 2,0-molar ist. Unter Wahl von Konzentrationen des Natriumchlorids unterhalb
0,15 Mol wird lediglich eine sehr kleine Menge Polypeptid erhalten. Zusätzliches p20-Polypeptid konnte
aus den Rohrzuckergradientenfraktionen mittels einer
zweiten Extraktion mit einer Natriumchloridlösung erhalten werden. In diesem Falle wird der Extrakt
mit unerwünschten Bestandteilen kontaminiert. Wenngleich bei der Erläuterung der vorliegenden Erfindung
auf die Verwendung von Natriumchlorid als Extraktionsmittel abgestellt wurde, so können selbstverständlich
auch andere geeignete Alkalichloride, wie Kaliumchlorid oder eine Mischung aus Natriumchlorid
und Kaliumchlorid/ebenfalls herangezogen werden.
In der folgenden Tabelle 1 werden die Aminosäurezusammensetzungen
des erfindungsgemäß gewonnenen p20-Polypeptide gezeigt. Zu Vergleichszwecken werden
ähnliche Proteine angegeben. Wie es aus der Tabelle 1 ersichtlich ist, sind die Aminosäurezusammensetzungen
grob gesehen gleich, jedoch sind geringe Unterschiede insbesondere in dem Gehalt an Asparaginsäure,
Threonin, Serin und Glycin festzustellen.
Tabelle I
Aminosäure-Analyse (Mol-%) von p20-Polypeptid und ähnlichen
Aminosäure-Analyse (Mol-%) von p20-Polypeptid und ähnlichen
| Asparaginsäure | früher | beschriebenen | Proteinen | HMd | 20 kde | |
| 5 | Threonin | ona ρ 20 |
Bande Ib | HMGaC | 9.4 | 10.8 |
| Serin | 11.2 | 10.0 | 8.5 | 3.8 | 4.4 | |
| Glutamins äure | 5.4 | 2.9 | 8.4 | 8.3 | 9.6 | |
| Prolin | 8.4 | 7.1 | 7.5 | 12.4 | 16.2 | |
| 10 | Glycin | 13.9 | 15.5 | 15.6 | 4.0 | 5.3 |
| Alanin Valin |
4.8 | 5.9 | 5.9 | 13.3 | 7.7 | |
| 1/2 Cystein | 12.4 | 7.7 | 3.6 | 7.5 3.4 |
6.8 3.2 |
|
| 15 | Methionin | 7.9 3.2 |
7.4 3.2 |
8.8 2.3 |
1.7 | - |
| Isoleucin | Spur | Spur | - | 0,8 | Spur | |
| Leucin | 1.0 | <1 | - | 4.6 | 5.0 | |
| 20 | Thyrosin | 4,6 | 5.0 | 6.5 | 7.5 | 5.9 |
| Phenylalanin | 6.7 | 7.3 | 7.5 | 4.0 | 3.9 | |
| Lysin | 2.1 | 4.2 | 4.4 | 4.0 | 2.8 | |
| Histidin | 2.7 | 3.0 | 2.8 | 11.8 | 11.7 | |
| 25 | Arginin | 9.8 | 14.7 | 15.9 | 1.8 | 1.9 |
| Lys in/Arginin | 2.5 | 1.3 | 1.3 | 5.1 | 4.9 | |
| 3.7 | 4.7 | 5.5 | 2.31 | 2.38 | ||
| 2.65 | 3.1 | 2.89 | ||||
Asparaginsäure + ?c c
Glutaminsäure
Lysin + Arginin 13.5 19.4
24.1 21.8 27.0 21.4 16.9 16.6
Erfindung 35 bSommer (1978)
CWeber & Isenberg (1980) dCaron et al. (1979)
eCerta et al. (1984)
Für die bereits angesprochenen Figuren 1, 2 und 3 sollen folgende Beschreibungen gegeben werden:
Fig. 1: NaDodSO. - Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
von p20-Polypeptid
7,5 μΙ-Proben von salζ-extrahiertem p20-Polypeptid
von der Rohrzuckergradientenfraktion Nr. 2 wurden in Gegenwart von NaDodSO. auf
einem Polyacrylamidgel (15 %) einer Elektrophorese
unterzogenι
CaI coomassie-eingefärbt, [BjJ silber-einge-
färbt;
M-Standards waren die Phosphorylase b (96 kd),
Rinderserumalbumin (68kd), Actin (45 kd),
Carboanhydrase (29 kd), Troponin C (18 kd),
Parvalbumin (10,5 kd);
M'-Molekulargewichts-Standard: Rinderserumalbumin (68kd), Ovalbumin (43kd), Carboanhydrase
(29kd), Chymotrypsinogen (25kd),
Lysozym (14kd), Ribonuklease (12,6kd).
Weg I: isoliertes p20-Polypeptid; Weg H: Hefe-Histone,
s'äure-extrahiert gemäß dem Verfahren von Sommer.
Fig. 2: Spezifität der p2Q-DNS-Wechselwirkungen
Gereinigtes p20-Polypeptid wurde mit stark gewundenen ("supercoiled") [A] oder entspannten
(relaxed)£B] DNS-Matrizen in Gegenwart oder
Abwesenheit von GTP oder ATP inkubiert. [A3
Weg 1, nicht-behandelte pMB9 DNS, 0,5 μg
pMB9 DNS, inkubiert bei 37° C mit ansteigenden Konzentrationen von p20-Polypeptid (0,5 1,5
^g) in Abwesenheit von 1 mM GTP (Wege 2-4)
und in Gegenwart von 1 mM GTP (Wege 5 - 7).
CBl Wege 1 bis 7, 0,5 μg enzymatisch ent
spanntes DNS, inkubiert bei 37° C mit Topoisomerase I ("topoisomerase") (vom Rinderthymus,
BRL) für 60 Minuten. Wege 2 und 3:
0,5 μg vom entspannten pMB9 DNS wurden mit
0,5 ng vom p20-Polypeptid 60 Minuten lang bei 37° C in Abwesenheit von 1 niM GTP (Weg 2) oder
in Gegenwart von 1 mM GTP (Weg 3) inkubiert. Weg 4: 0,5 ng entspannten pMB9 DNS wurden mit
0,5 μg p20-Polypeptid während 60 Minuten bei
37° C in Gegenwart von 1 mM ATP (Weg 6) oder 1 mM UTP (Weg 7) inkubiert; nicht-behandeltes
pMB9 DNS (Weg 8).
Fig. 3: Säure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
5 ml-Proben vom salz-extrahierten p20-PoIypeptid
von der Rohrzuckergradientenfraktion Nr. 2 wurden an einem 15 %-Polyacrylamid-
Säure-Harnstoff-Mikroplatten-Gel (90 χ 70 χ
0,8 mm) einer Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese wurde bei 220 Volt 2 Stunden
lang bei 4° C durchgeführt. Weg A: 5 μg isoliertes
Protein der Bande I; Weg B: Hefehisto-
ne, hergestellt nach dem Verfahren von Sommer;
Weg C: 5 [ig Rinderthymushistone (Boehringer) .
Das Gel wurde mit dem Farbstoff Coomassie eingefärbt.
Bei einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wurde gefunden, daß das Polypeptid Antikörper erzeugen kann,
die gegenüber den Säugetier-ras-gen-ErZeugnissen spezifische
Bindeeigenschaften zeigen. Die Antikörper konnten zur Immunfeststellung bei der Methode
"Western blots", bei der Immunofluoreszenz und bei der Immunoausfällung genutzt werden. Es wurde des
weiteren gefunden, daß zur Gewinnung spezifischer bzw. spezieller Antikörper die zur Immunisierung von Tieren
herangezogenen Polypeptide ein Molekulargewicht von 16.000 bis 21.000 aufweisen können (wenn Schizosaccharomyces
pombe zur Herstellung des Polypeptids herangezogen wurde, lag das Molekulargewicht in dem Bereich von
29-000 bis 31-000 Dalton). Die anhand von Saccharomyces cerevisiae
erhaltenen Polypeptide haben im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung folgende
Hauptmerkmale:
Asparaginsäure + Glutaminsäure 21,8 - 27,0 Mol.-%;
Lysin + Arginin 13,5 - 21,4 Mol.-% und ein Verhältnis Lysin/Arginin von 2,31 -3,1.
Derzeit sind drei aktive Human-ras-gene identifiziert
worden:
TT Τζ
ras' in menschlichen Blasenkarzinomzellen, ras in der
menschlichen Lunge und in den Kolonkarzinomzellen und ras in einer Linie einer menschlichen Neuroblastomzelle.
Alle Mitglieder dieser ras-gen-Familie verschlüsseln damit eng in Beziehung stehende Proteine
(etwa 21.000 Dalton),die mit p21 bezeichnet werden. Das Niveau der p21-Expression ist in vielen verschiedenen
menschlichen TumorZellenlinien ähnlich, was unabhängig davon gilt, ob die Zellinie ein aktiviertes
ras-Gen enthält, das durch Transfektion (Der und Cooper, Cell 32, 1983, S. 201 - 208) feststellbar ist.
Menschliche Zellular-Kirsten-ras 1-und -ras 2-gene
wurden anhand ihrer Chromosomen 6 bzw. 12 lokalisiert.
Menschliche Zellular-Harvey-ras 1- und ras 2-gene wurden
durch die Chromosomen 11 bzw. X lokalisiert. Das menschliche N-ras-gen wurde anhand des Chromosoms
Nr. 1 lokalisiert (vgl. Sakaguchi et al., Mol. and Cell Biol., 4, 1984, S. 989 - 993). Die Beziehung
zwischen dem c-Ki-ras und c-Ha-ras zu den Chromosomen 3 und 12 ist beim menschlichen Krebs beobachtet worden
(vgl. Mitelman und Levan, Hereditas 95, 1981: S. 79 139, Gahrton et al., Nature 297, 1982, S. 513 - 514).
Somit lassen bisher die karyotypischen Abweichungen die Bösartigkeit der Zellen noch nicht feststellen.
Menschliche Neoplasie konnte durch histologische überprüfung
oder durch ein DNS-vermitteltes Transfektions-Assay mit Mäuse-NIH 3T3-Fibroblasten festgestellt
werden. Foki von transformierten Zellen werden nach 21 Tagen markiert,und lediglich 10 % des Harntrakttumors
führtenbei diesem Test zu den Foki. (Fujita et al., Nature 309, 1984, S. 464 - 466).
TT
Die Nukleotid-Sequenz-Analyse des ras -transformierenden Gens von menschlichen Blasenkarzinomzellen
zeigte, daß die Transformationsaktivität dieses Gens eine Folge einer Punktmutation ist, die die Aminosäure
12 des p21 vom Glycin ins Valin überführt (Tabine et al., Nature 300, 1982, S. 143 - 149;
Reddy et al·.. Nature 300, 1982, S. 149 - 152; Capon
et al., Nature 302, 1983, S. 33,37; Reddy, Science 220, 1983, S. 1061 - 1063) .
Das geänderte p21-Protein zeigt eine unnormale elektrophoretische
Mobilität auf SDS-Polyacrylamid-Gelen (SDS = Natriumdocecylsulfat). Des weiteren zeigten
Proteine, die durch ras -Gene verschlüsse^ und in vier menschiichen Lungen und KolonkarZinorriZellen^nien
aktiviert waren, eine unnormale elektrophoretische Mobilität (Der und Cooper, Cell 32, 1983, S. 201 - 208).
Es schien des weiteren, daß die unterschiediichen Mutationen das gieiche ras -Gen in unterschiediichen
individuellen Neoplasmen aktivieren konnten(Der und Cooper, Ceil· 32, 1983, S. 201 - 208). Das in einer
anderen Lungenkarzinomzeilenlinie aktivierte ras'-Gen
verschiüsselte die normale Aminosäure in der Stellung 12. Aber sie ist am Codon 61 mutiert, um Leucin mehr
als Glutamin zu verschiüsseln (Yuasa et al., Nature 303, 1983, S. 775 - 779). Ein rasN -Gen, das in einer menschiichen
NeurobiasiZellenMnie aktiviert ist, wird ebenfalls
am Codon 61 verändert bzw. einer Mutation unterzogen, verschlüsselt jedoch eher Lysin als Glutamin
(Taparowsky et al., Cell 34, 1983, S. 581 - 586). Diese Ergebnisse zeigen zusammengenommen, daß ras-Gene in
den menschlichen Neoplasmen gewöhniich durch struktu-Mutationen aktiviert werden. Diese Mutationen
scheinen insoweit am Codon 12 oder 61 aufzutreten, wobei unterschiedliche Aminosäuresubstitutionen zu
einer ras-gen-Aktivierung in verschiedenen Tumoren führen.
Der Wechsel in der Stellung 12 im menschlichen Ha-ras führt zu einem Verlust von einer Restriktionsseite
für den Aufschluß von Hpall-MSpI, womit eine Möglichkeit
zur molekularen Diagnose von Läsionen in dieser Position geschaffen wird (Feinberg et al, Science 220,
1983, S. 1175 - 1177). Die Änderung in der Position 61 schließt eine BstNI-Erkennungsstelle aus. Die Bestimmung
von menschlichen Krebszellen durch molekulare Diagnose von Restriktionsstellen ist mühsam. Ein leichter
Weg der Diagnose steht durch die elektrophoretische Abtrennung der Proteine, die von Krebszellenextrakten
auf SDS-Polyacrylamid-Gelen stammen, ("Western blots")
und durch Einfärben spezifischer Antikörper zur Verfügung. Karzinomzellen, die ras-Proteine mit identischer
elektrophoretischer Mobilität gegenüber normalen menschlichen Zellen ausdrücken, können das Protein bei
einem Niveau vom 3~bis 5-fachen höher als der primären
Fibroblasten oder epithelialen Kulturen ausdrücken (Der und Cooper, Cell 32, 1983, S. 201 - 208).
Um die Anti-p20-Antikörper zu erhalten, wurden Kaninchen
mit 40 μg-Portionen des salz-extrahierten p20-Polypeptids
immunisiert, wobei das Polypeptid in dem vollständigen Freund's Adjuvans (Difco) emulgiert,
mit 5 mg Tuberkelbazilluszellen ergänzt und intradermal· an mehreren Stellen injiziert wurde. Den Kaninchen
wurden Boosterinjektionen mit 40 μg Protein 5 Wochen nach der ersten Injektion gegeben. Sie wurden
ein- bis zwei Wochen später bluten gelassen. 35
Um die Spezifität der Kaninchen-Anti-p20-Antikörper einzustellen, wurde ein immunologisches Einfärben der
Proteine, die aus Hefechromatin durch Rohrzuckergradienten
- und durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
("Western blots") isoliert wurden, durchgeführt, wie es die Fig. 5 A zeigt. Das p20 reagierte
spezifisch mit den polyklonalen Anti-p20-Antikörpern. Keine Reaktion wurde erzielt, wenn Nicht-Immun-Antiseren
verwendet wurden. Die Fig. 5 A, linke Seite, demonstriert die Rohrzuckergradientenfraktion Nr. 2,
aufgefangen am oberen Teil des Gradienten (Weg 1) und
die Hefehistone, die entsprechend dem Verfahren nach Sommer (Weg 2) (coomassie-eingefärbt) erhalten wurden.
Die molekularen Größen werden in Dalton χ 103 angegeben.
Rechts: elektrophoretische Transfer-Immunoflecken der identischen Wege wie bei dem mit Coomassie eingefärbten
Gel, wodurch eine Immunreaktion der p20-Polypeptide gezeigt wird. Nach der Inkubation mit dem
Antikörper wurde das Nitrozellulosepapier mit Meerrettich-Peroxidase-Protein
A-Konjugat (Sigma) inkubiert. Das Nitrozellulosepapier wurde gewaschen. Anschließend
wurde eine Farbentwicklung mit Wasserstoffperoxid und mit 3,4,3',4'-Tetraaminobiphenylhydrochlorid
durchgeführt.
Die spezifische Bestimmung der Säugetier-p21-ras-Proteine
durch Anti-p20-Antikörper wird anhand der Fig. 5B demonstriert: 50 μg von 3T3 NIH-Mäusezellen, transformiert
durch den Ha-Mäusesarkom-Virus und abgebaut bzw. aufgelöst durch 1 % Triton X-100, 0,15 mol NaCl,
50 mmol Tris-HCl (pH = 7,4), 1 % Trasylol (Infusionslösung
mit Aprotinin , einem bas. Polypeptid aus Rinderlungen, das Proteinasen,wie Kallikrein, Trypsin
und Plasmin hemmt), 1 % Na-Desoxycholat und 0,1 % SDS enthielt, wurde mittels Elektrophorese an SDS-PoIyacrylamid-Gelen
analysiert. "Western blots" wurden mit Nicht-Immun-Serum (WegA)und mit dem Anti-p20-Antikörper
(Weg B) inkubiert. Nach der Inkubation mit dem Antikörper wurde das Nitrozellulosepapier mit einem
125
I-markierten Protein A inkubiert. Das Nitrozellulosepapier
wurde gewaschen und 48 Stunden lang einem XAR-5-FiIm ausgesetzt.
Das erfindungsgemäß erhaltene p20-Erzeugnis konnte in
entspanntes pMB9 DNS, wie in Fig. 2 gezeigt, eine Superhelixstruktur einführen (superhelical turns). Wenn
jedoch die Isolationsverfahrensweise, die von Certa et al. beschrieben wird, herangezogen wird, die das
Hochleistungs-DC-Verfahren mit Acetonitril nutzt, konnte das derartig erhaltene Polypeptid in entspanntes
pMB9 DNS keine Superhelixstruktur einführen. Dies steht im Gegensatz zu der Fig. 2B (Weg 3), womit die
Erfindung erläutert wird.
Anhand der vorstehenden Beschreibung der Erfindung ist es dem Fachmann ohne weiteres klar, daß diese vielfältigen
Modifikationen unterzogen werden kann , ohne sich von deren Wesen zu lösen.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines Beispiels noch näher erläutert werden:
Die Isolierung des Hefechromatins erfolgt wie folgt:
Eine Menge von 15 g im Handel erhältlicher Bäckerhefe wurde dreimal mit 100 ml einer Pufferlösung A
gewaschen. Diese Pufferlösung A enthielt 24mM Tr is-HCl (pH = 7,5), 10 mM MgSO4, 0,4 mM EDTA und 40 mM
NaHSO.,. Die Aufschlämmung wurde in einem endgültigen
Volumen von 36 ml des Puffers A erneut suspendiert, der ebenfalls ein mM Phenylmethylsulfonylfluorid
in 0,4 g/ml enthielt. Die Zellen wurden durch achtmaliges Schütteln während einer Minute bei 4° C mit einem
gleichen Volumen von Glaskügelchen (0,5 mm, vorbehandelt mit 0,01 normaler HCl während 60 Minuten, mit Wasser
solange gespühlt, bis sich die Neutralität einstellte, getrocknet und mit Sigmacote beschichtet) aufgebrochen.
Die abgegossene überstehende Lösung wurde gekühlt. Es wurden 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid hinzugegeben.
Die Mischung wurde 20 Minuten bei 10.000 U/min bei 40C rotiert. Die viskose obere Schicht der Kügelchen wurde
in 10 ml Puffer A + 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid erneut suspendiert und erneut rotiert. Die Chromatidenkügelchen
wurden in 20 ml kaltem Puffer A, der 0,3 M Rohrzucker, 0,5 % NP40 (als grenzflächenaktives
Mittel), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, erneut suspendiert. Die
Mischung wurde bei 13.000 U/min bei einer Temperatur von 40C 15 Minuten lang rotiert. Die erhaltenen Kügelchen
wurden in dem gleichen Puffer dispergiert und des weiteren durch Zentrifugieren durch eine Lösung
von 1,5 M Rohrzucker im Puffer A, der einimM Phenylmethylsulfonylchlorid
und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, gereinigt. Die mittels Rohrzucker gereinigten Chromatinkügelchen
wurden einmal im Puffer A + 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen.
Die Mischung wurde wiederum 15 Minuten lang bei 13.000 U/min bei 40C rotiert.
Die gewaschenen und mittels Rohrzucker gereinigten Chromatinkügelchen wurden zweimal in 10 mM Tris (pH =
7,5) in Gegenwart von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen erneut
in 1,2 ml Aufschlußpuffer suspendiert, der 10 mM Tris (pH = 7,5), 1 mM CaCl- und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
enthielt. Eine Menge von 30 μg Mikrokokkos-Nuklease
(500 E, Worthington) wurde zu der Mischung gegeben. Sie wurde 10 Minuten lang bei 37°C
in einem Eppendorf-Rohr unter gelindem Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 120 μΐ
0,1 M EDTA bei dem pH-Wert von 7,5 gestoppt und auf Eis gekühlt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei
12.000 U/min (bei 4° C) zentrifugiert. Eine Menge von
0,2 ml der klaren überstehenden Lösung + 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
wurde per linearem Rohrzuckergradienten (5 - 20 %) in 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5),
1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Natriumbisulfit und 10 mM 2-Mercaptoethanol behandelt,
vorgeformt in beschichteten Pollyalomar-Rohren. Die Gradienten wurden 18 Stunden lang bei 30.000 U/min
(bei 4° C) in einem SW 41-Rotor (153.000 g) betrieben. 1 ml-Fraktionen wurden am oberen Teil gesammelt,
wobei eine sterile Spritze verwendet wurde. Die Fraktionen wurden über Nacht gegen 0,1 M Essigsäure
dialysiert, lyophilisiert und auf SDS-Polyacrylamid-Gelen
analysiert.
Die lyophilisierten Rohrzuckergradientenfraktionen, die das p20-Polypeptid enthielten, wurden erneut in
50 μΐ eines Puffers suspendiert, der eine Lösung folgenden
Gehaltes darstellte:0,35 M NaCl, 1OmM Tris-HCl,
(pH 8,0) , 1 mM EDTA und zwei Proteaseinhibitoren (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Natriumbisulf
it) . Nach 30 Minuten wurde die Mischung bei 12.000 U/min 10 Minuten lang auf Eis rotiert. Es wurde
eine Menge von 25 μ^ p20-Polypeptid erhalten, bezogen
auf die Aminosäureanalyse.
- zu-
- Leerseite
Claims (17)
1. Verfahren zur Herstellung von reinem Hefechroma- _-
tin, dadurch gekennzeichnet , daß '
(a) die Hefezellen in einer Lösung eines Puffers auf- K
gebrochen werden und die Aufschlämmung zentrifugiert
wird,
(b) die ausgefällten Kügelchen des Chromatins mittels
Rohrzucker gereinigt und mit einer 2-Mercaptoethanol und Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltenden Pufferlösung
gewaschen werden,
(c) die bei der Maßnahme (b) erhaltene Ausfällung enzymatisch aufgeschlossen und löslich gemacht wird,
(d) die überstehende Lösung der aufgeschlossenen Masse der Maßnahme (c) in einer Pufferlösung einem linearen
Rohrzuckergradienten von 5 bis 30 % auferlegt wird und
(e) von der Fraktion des Rohrzuckergradienten das p20-Polypeptid mittels einer 0,15-bis 5-molaren Natriumchlorid-Pufferlösung
extrahiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Hefe irgendeinen Stamm von Saccharomyces oder Schizo-
saccharomyces, partiell aufgebrochene Zellen, isolierte
Kerne und Mitochondrien enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einer Lösung eines Phenylmethylsulfonylfluorid
in der Gegenwart von GTäskügelchen enthaltenden Puffers A aufgebrochen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Glaskügelchen mit Sigmacote beschichtet sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß bei der Maßnahme (b) die Konzentration des Rohrzuckers zwischen 0,3 molar und 1,7 molar gewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß eine 1,4-bis 1,6-molare Konzentration gewählt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung des Reinheitsgrades
des Chromatins bei der Maßnahme (b) nach der Reinigung mittels Rohrzucker zwei Zentrifugierungsstufen
durchgeführt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Zentrifugierungsstufe bei einem höheren
g-Wert als die erste durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatische Aufschluß
mittels eines Enzyms in Form von DNase I und/oder der Mikrokokkus-Nuklease durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des p20-Polypeptids
bei der Maßnahme (e) mittels einer 0,3 5-bis 2,0-molaren Natriumchloridlösung durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Maßnahme (e) die
Extraktionslösung ebenfalls eine Pufferlösung enthält, wobei diese Pufferlösung Tris-HC^ EDTA, DTT oder DTE
und Protease-Inhibitoren enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß der Protease-Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid und/oder Natriumbisulfit ist.
13. Verfahren zur Gewinnung von Anti-p20-antikörpern, die gegenüber Säugetier-ras-gen-ErZeugnissen spezifische
Bindeeigenschaften zeigen, dadurch gekennzeichnet, daß Tiere mit Teilen eines Natriumchlorid-extrahierten
p20-Polypeptids,das in dem vollständigen Freund's Adjuvans emulgiert und intradermal injiziert wird,
immunisiert werden, wobei diese Tiere Booster-Injektionen mit Protein enthalten und danach ausbluten.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-p20-Antikörper dadurch hergestellt werden,
daß Tiere mit einem p16-p21-Polypeptid in3iziert werden,
das als Hauptkennzeichen bezüglich der Aminosäurezusammensetzung
die folgenden Paare Asparagin- und Glutaminsäuren in dem Bereich von 21,8 bis 25,5 Mol-%,
Lysin und Arginin in dem Bereich von 13,5 bis 21,4 Mol-% und ein Verhältnis von Lysin zu Arginin in dem Bereich
von 2,31 bis 3,1 aufweist.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet,
daß das Freund1 s Adjuvans mit Tuberkelbazilluszellen ergänzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das p20-Polypeptid spezifisch
mit den polyklonalen Anti-p20-Antikörpern umgesetzt wird.
-A-
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß die p2O-Antikörper spezifisch mit Säugetier-p21-ras-gen-ErZeugnissen umgesetzt
werden.
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