DE19630390A1 - Proteine, insbesondere Membranproteine von Helicobacter pylori, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

Proteine, insbesondere Membranproteine von Helicobacter pylori, ihre Herstellung und Verwendung

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, insbesondere Membranproteine oder mit der Membran fest assoziierte Proteine von Helicobacter pylori (H. pylori) enthaltend eine der Peptidsequenzen ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 gemäß Tabelle 1a-1c, oder Teile mit einer Mindestlänge von fünf Aminosäuren davon, und deren Herstellung und Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Vakzine, oder Diagnostikum.

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, mikroaerophiles und spiralförmiges Bakterium, das die Mukosa des menschlichen Magens besiedelt. Das Bakterium ist die Ursache der chronischen aktiven Gastritis sowie der peptischen Ulkuskrankheit, insbesondere des Ulcus duodeni, und spielt eine Rolle bei der Entstehung von Magenkarzinomen; somit ist Helicobacter pylori ein wichtiger humanpathogener Erreger.

Die Schraubenform und Motilität durch vier bis sechs Flagellen ermöglicht dem Bakterium eine Durchwanderung des Magenschleims, um die nahezu pH-neutrale Grenzschicht zwischen Schleim und Mukosa zu erreichen. Ammoniumionen, die bei der enzymatischen Spaltung von Harnstoff durch bakterielle Urease entstehen, schützen den Erreger vor der aggressiven Magensäure. Das Bakterium adhäriert an den Endothelzellen des Magens unter Verwendung spezifischer Adhäsine.

Folge der chronischen Schleimhautbesiedelung kann eine entzündliche granulozytäre, später monozytäre Infiltration des Epithels sein, die über Entzündungsmediatoren wiederum zur Gewebedestruktion beiträgt. Die Infektion stimuliert sowohl eine lokale als auch eine systemische humorale Immunantwort, ohne dabei eine wirksame Elimination des Erregers bewirken zu können. Eine Impfung ist der klassische Weg, um Infektionskrankheiten zu verhindern. Daher ist es wichtig, diese Möglichkeit auf die Kontrolle einer H. pylori Infektion hin zu überprüfen.

Die Entwicklung eines Impfstoffes beinhaltet die Identifikation von Faktoren, die für die Virulenz ausschlaggebend sind, bzw. von Strukturen, die für das menschliche Immunsystem zur Eliminierung eines Erregers zugänglich sind. Solche Antigene sind in der äußeren Membran des Bakteriums zu vermuten. So sind in der äußeren Membran Adhäsine von 19.600 Da (P. Doig et al., 1992, J. of Bacteriology 174, 2539-2547) 20.000 Da (D. G. Evans et al., 1993, J. of Bacteriology 175, 674-683) und 63.000 Da (C. Lingwood et al., 1993, Infection and Immunity 61, 2474-2478) lokalisiert, die Kandidaten für eine experimentelle Vakzine sind, mit dem Ziel Antikörper zu induzieren, die die bakterielle Adhäsion an der mukosalen Oberfläche verhindern.

Außerdem verfügt die äußere Membran über Porine der Molekulargewichte 30.000 Da (M. A. Tufano et al., 1994, Infection and Immunity 62, 1392-1399), 48.000 Da, 49.000 Da, 50.000 Da, 67.000 Da (M. M. Exner et al., 1995, Infection and Immunity 63, 1567-1572) und 31.000 Da (P. Doig et al., 1995, J. of Bacteriology 177, 5447-5452), sowie über eisen­ regulierte äußere Membranproteine der Molekulargewichte 77.000 Da, 50.000 Da und 48.000 Da (D. J. Worst et al., 1995, Infection and Immunity 63, 4161-4165), erythrocyten-bindende Antigene der Molekulargewichte 59.000 Da und 25.000 Da (J. Huang et al., 1992, J. of Gen. Microbiol. 138, 1503-1513) und Bindungsproteine für Laminin, Kollagen I und IV, Fibronektin und Vitronektin (I. Kondo et al., 1993, European J. Gastroenterol. Hepatol. 5, 63-67). Weiterhin sind Proteine der Molekulargewichte 19.000 Da (E. B. Drouet et al., 1991, J. of clinical Microbiology 29, 1620-1624), 50.000 Da (M. M. Exner et al., 1995, Infection and Immunity 63, 1567-1572) und 30.000 Da (J. Bölin et al., 1995, J. of Clincal Microbiology 33, 381-384) sowie ein 20.000 Da Lipoprotein (M. Kostrzynska et al., 1994, J. of Bacteriology 176, 5938-5948) und stammspezifische, oberflächenlokalisierte Antigene von 51.000 Da, 60.000 Da und 80.000 Da (P. Doig and T. J. Trust, 1994, Infection and Immunity 62, 4526-4533) beschrieben. Die Gene für die Proteine der Molekulargewichte 20.000 Da (HpaA) (Evans et al.) und 20.000 Da (lpp20) (M. Kostrzynska et al.) sind inzwischen isoliert worden. N-terminale Proteinsequenzdaten sind für die Adhäsine der Molekulargewichte 19.600 Da (P. Doig et al., 1992) und 63.000 Da (C. Lingwood et al.), für die Porine der Molekulargewichte 48.000 Da, 49.000 Da, 50.000 Da, 67.000 Da (M. M. Exner et al.), 30.000 Da (M. A. Tufano, 1994) und 31.000 Da (P. Doig et al., 1995) und für das 50.000 Da Protein (M. M. Exner et al., 1995) bekannt.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt nun die Isolierung und Bestimmung von insgesamt 19 Proteinen, insbesondere Membranproteine oder mit der Membran fest assoziierte Proteine, vor allem integrale Membranproteine, im Molekulargewichtsbereich von 17 kD bis ca. 250 kD (Tabelle 1a-1c). Unter dem Begriff Membranprotein werden im allgemeinen integrale und periphere Membranproteine und Transmembranproteine verstanden. Integrale Membranproteine sind Proteine, die teilweise oder ganz in die Cytoplasmamembran eingefügt sind. Periphere Membranproteine haften im Gegensatz hierzu nur an der Membranoberfläche. Transmembranproteine gehen vollständig durch die Membran hindurch (siehe z. B. B. Alberts et al. (eds), Membrane Proteins in "Molecular Biology of the Cell", 2nd ed. Garland Publishing, Inc., New York & London, 284-287, 1989). In sieben Fällen (SEQ ID NO: 2 und 3, 5 und 6, 7 und 8, 10 und 11, 13 und 14, 15 und 16, 17 und 18) wurden dabei aus einer Bande zwei Sequenzen ermittelt und in weiteren fünf Fällen (SEQ ID NO: 1, 4, 9, 12, 19) konnte aus einer Bande nur eine Sequenz ermittelt werden. Von den 19 ermittelten Sequenzen waren acht N-terminale Sequenzen bereits in früheren Arbeiten beschrieben, so die Sequenzen für Urease A und Urease B (B. E. Dunn et al., 1990, J. Biolog. Chem. 265, 9464-9469), für das Exoenzym S ähnliche Protein (C. Lingwood et al.), für das 50 kD Membranprotein und für die Porine Hop B und Hop C (M. M. Exner et al.). Von diesen Antigenen konnten bisher nur die Gene für Urease A und B isoliert werden (A. Labigne et al., 1991, J. Bacteriol. 173, 1920-1931). Bereits beschriebene N- terminale Sequenzen der Membranproteine der Molekulargewichte 19.600 Da (P Doig et al., 1992), 48.000 Da, 67.000 Da (M. M. Exner et al., 1995) und 31.000 Da (P. Doig et al., 1995) konnten unter den erfindungsgemäß beschriebenen 19 Sequenzen nicht gefunden werden. Somit kann auch das Protein, das durch die SEQ ID NO: 14 beschrieben ist, nicht dem Protein mit dem Molekulargewicht von 31.000 (P. Doig et al., 1995) zugeordnet werden. Die übrigen dreizehn aminoterminalen Proteinsequenzen sind nicht beschrieben. Es ist davon auszugehen, daß diese bisher noch nicht identifizierten Proteinen von Helicobacter pylori zugeordnet werden können.

Es war daher überraschend, daß eine Vielzahl weiterer, neuer Proteine aus H. pylori in einer sarkosyl®-unlöslichen Fraktion nachgewiesen werden konnte. Die Proteine sind höchstwahrscheinlich integrale Proteine der äußeren Membran oder mit der Membran fest assoziierte Proteine. Sie eignen sich daher besonders als Kandidaten für die Entwicklung einer Vakzine oder eines Diagnostikums.

Die Erfindung betrifft daher Proteine, insbesondere Membranproteine oder mit der Membran fest assoziierte Proteine, vor allem integrale Membranproteine, insbesondere sarkosyl®-unlösliche integrale Membranproteine von H. pylori, welche eine der Peptidsequenzen ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18 oder 19 gemäß Tabelle 1a-1c enthält, oder Teile mit einer Mindestlänge von fünf, vorzugsweise sechs Aminosäuren davon, wobei diese Peptidsequenzen vorzugsweise N-terminale Sequenzen der genannten Proteine darstellen. Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Peptide, die wenigstens zehn aufeinanderfolgende Aminosäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16 und 19 aufweisen. Weiterhin sind solche genannten Teile insbesondere bevorzugt, die eine ununterbrochene Abfolge eindeutig bestimmter Aminosäuren enthalten.

In einer besonderen Ausführungsform hat das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 1 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 250 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 110 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 3 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 100 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 6 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 60 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 10 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 42 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 11 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 42 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 12 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 32 bis ca. 36 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 14 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 30 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 15 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 28 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 16 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 28 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 17 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 25 kD, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 18 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 25 kD, und das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 19 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 17 kD.

Bei dem Isolieren der Proteine geht man beispielsweise von dem allgemein erhältlichen H. pylori Stamm Nr. ATCC 43504 aus, wobei insbesondere folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden können:

  • (a) Isolieren der Proteine mittels differentieller Solubilisierung, insbesondere mit Sarkosyl® (einem N- Lauroylsarcosin) nach der Methode von Blaser et al. (1983, Infect. Immun. 42, 276-284).
  • (b) Trennen der nach Schritt (a) isolierten Proteine mittels gelelektrophoretischer Methoden, vorzugsweise mittels SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese, wobei insbesondere Polyacrylamidgele mit unterschiedlichem Polyacrylamidgehalt, insbesondere mit ca. 8, 10 oder 16% Polyacrylamid verwendet werden, und
  • c) Isolieren der nach Schritt (b) getrennten Proteine mittels bekannter Verfahren, beispielsweise durch Elution oder Isolierung an einer Membran.

Für die Isolierung und Charakterisierung der Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung wurden zunächst die Proteine nach der Methode von Blaser et al. (supra) gewonnen. Die in einer Kugelmühle aufgeschlossenen Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 5.000 g von intakten Bakterien befreit, anschließend wurde der Überstand bei 100.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in Sarkosyl® gelöst und die in Sarkosyl® unlösliche Fraktion, die insbesondere die integralen Membranproteine enthält, abzentrifugiert. Das Pellet wurde in destilliertem Wasser resuspendiert und durch SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Es stellte sich dabei heraus, daß die SDS-PAGE im Gegensatz zur HPLC eine sehr effektive Methode war, um sarkosylunlösliche Proteine abzutrennen. Die Gele wurden dabei mit Methionin vorbehandelt, um eine Oxidation der Methioninreste zu verhindern. Es folgte ein Proteintransfer aus dem SDS-Gel auf eine PVDF-Membran (Immobilon P®, Fa. Millipore), wobei zur Vervollständigung des Proteintransfers der sehr unlöslichen Proteine dem Kathodenpuffer 0,005% SDS zugesetzt wurde. Für die Sequenzanalyse wurden die Proteinbanden von jeweils vier Spuren aus der PVDF-Membran ausgeschnitten und der Aminosäure-Abbau nach Edman zur Bestimmung der Aminosäuresequenz im Flüssigphasen-Sequenzer 477A (Applied Biosystems) durchgeführt. Eine weitere Auftrennung der Proteine, die in einer Bande laufen, ist beispielsweise mittels der isoelektrischen Fokusierung oder der zweidimensionalen Gelelektrophorese möglich, jedoch für die eindeutige Sequenzanalyse nicht nötig, da aufgrund der unterschiedlichen Proteingehalte der in einer Bande laufenden Proteine die Sequenzen eindeutig zugeordnet werden können.

Die in dem Sequenzprotokoll mit Xaa gekennzeichneten Aminosäuren sind wie folgt zu erklären:
Die nicht bestimmbaren Aminosäuren können von Störungen durch Verunreinigungen im 1. Sequenzierungsschritt, eine nicht analysierbare Aminosäure wie Cys oder Trp, eine modifizierbare Aminosäure, die im Elutionsprogramm fehlt, oder eine grundsätzlich wegen geringer Sequenzausbeuten schlecht bestimmbare Aminosäure wie Ser oder Thr verursacht sein. Verschiedene Banden können auch zwei Proteine sehr ähnlicher Molekulargewichte in unterschiedlichen Mengen enthalten. Daraus resultieren dann zwei Sequenzen, die wegen der unterschiedlichen Häufigkeit der einzelnen Aminosäuren dann auch eindeutig zuzuordnen sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf die durch die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18 oder 19 gekennzeichneten Peptide gemäß Tabelle 1a-1c, oder Teile mit einer Mindestlänge von 5 Aminosäuren, insbesondere von sechs Aminosäuren davon, die sich beispielsweise durch allgemein bekannte chemische Peptidsynthesen herstellen lassen (Barani, G. & Merrifield R. B. in "The peptides, analysis, synthesis and biology" (Gross E. ed.), Vol. 2, Academic press 1980, Johannes Meyenhofer Verlag; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. "The practice of peptide synthesis", Springer Verlag 1984). Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Peptide, die wenigstens zehn aufeinanderfolgende Aminosäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16 und 19 aufweisen. Weiterhin sind solche genannten Teile insbesondere bevorzugt, die eine ununterbrochene Abfolge eindeutig bestimmter Aminosäuren enthalten wie das die Sequenzen aus den SEQ ID NO: 12, 14 und 15 aufzeigen.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Antikörper, die ebenso nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden können (siehe z. B. B. A. Diamond et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349) und gegen ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide gerichtet sind.

Dem Fachmann sind auch aus J. Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) Verfahren bekannt wie man Polynukleotide, die für die erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide kodieren, herstellt. Insbesondere sind anhand des genetischen Kodes dem Fachmann die Nukleotidsequenzen bekannt, die für die Peptide gemäß dem Sequenzprotokoll kodieren. Insbesondere sind die Nukleotidsequenzen bevorzugt, die nach den Regeln der Häufigkeit in der Verwendung der verschiedenen Codons bei Helicobacter pylori am häufigsten vorkommen. Diese können beispielsweise durch chemische Polynukleotidsynthese hergestellt werden ( siehe z. B. E. Uhlmann & A. Peyman (1990) chemical Reviews, 543-584, Vol 90, No. 4).

Beispielsweise können nach diesen Regeln hergestellte Oligodesoxynukleotide zum Screenen von Genbanken von Helicobacter pylori nach bekannten Methoden (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) eingesetzt werden. Weiterhin können, basierend auf den Sequenzdaten, Peptide synthetisiert werden, die zur Gewinnung von Antiseren eingesetzt werden. Mit Hilfe dieser Antiseren können dann Expressionsgenbanken durchsucht werden. Die aus diesen unterschiedlichen Screeningmethoden resultierenden Klone können dann durch Isolierung und Sequenzierung der insertierten DNA-Fragmente zur Identifizierung von DNA- Sequenzabschnitten, die für die N-terminal ansequenzierten Proteinabschnitte der Proteine kodieren, eingesetzt werden. Falls die insertierten DNA-Fragmente nicht das vollständige Gen, das für ein bestimmtes Protein kodiert, enthalten, können diese DNA-Fragmente zur Isolierung der kompletten Gene durch Absuchen weiterer DNA-Genbanken verwendet werden. Die auf diese Art und Weise vollständig isolierten Gene können anschließend nach dem Stand der Technik in Verschiedenen allgemein bekannten Systemen zur Gewinnung des entsprechenden Proteins exprimiert werden.

Die erfindungsgemäßen Proteine, Peptide, Antikörper, Polynukleotide und deren Expressionsprodukte können nun nach dem Fachmann bekannten Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere einer Vakzine, oder eines Diagnostikums verwendet werden.

Für die Herstellung von Impfstoffen sind diejenigen Bereiche aus den Proteinen besonders geeignet, die einerseits bei möglichst allen H. pylori Stämmen vorkommen und andererseits die Bildung von schützenden Antikörpern bewirken. Vor allem sind die Bereiche bevorzugt, die in das Cytoplasma ragen.

Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, insbesondere Vakzinen, und Diagnostika enthaltend ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine und/oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Antikörper oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide oder ein oder mehrere Expressionsprodukte der erfindungsgemäßen Polynukleotide.

Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der Polynukleotide eine DNA-Vakzine oder ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR-Diagnostik) oder anhand der Antikörper ein Immunotest, beispielsweise ein Westernblot-Test oder ein Enzymimmunotest (ELISA) hergestellt werden. Ferner können die erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide bzw. deren immunogene Teile, insbesondere wenn sie eine ununterbrochene Abfolge eindeutig bestimmter Aminosäuren enthalten, mit einer Mindestlänge von fünf Aminosäuren, vorzugsweise sechs Aminosäuren und vor allem bei den erfindungsgemäßen Peptiden mit der SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16 und 19 wenigstens zehn aufeinanderfolgende Aminosäuren als Antigene für die Immunisierung von Säugetieren verwendet werden. Die durch die Immunisierung gebildeten Antikörper bzw. mittels gentechnischer Methoden hergestellten Antikörper (siehe z. B. Winter G. & Milstein C. (1991) Nature, 293-299, Vol. 349) können unter anderem die Adhäsion der Bakterien an die mukosale Oberfläche verhindern, Makrophagen zur Eliminierung der Bakterien anlocken und das Komplementsystem zur Lyse der Bakterien aktivieren.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung im Detail erläutern.

Beispiel 1 Kultivierung von Helicobacter pylori

Der H. pylori Stamm ATCC 43504 wurde unter mikroaerophilen Bedingungen (BBL Topf/Campy Pak Plus: Becton & Dickinson) auf Columbia Agar Platten mit 5% Pferdeblut passagiert (Inkubation 48 h, 37°C). Zur Beimpfung eines 500 ml Schikane- Kolbens (100 ml Columbia broth, 7% FKS) wurden drei Platten abgeschwemmt; während der Inkubation (BBL Topf/Campy Pak Plus; 48 h, 37°C, 90 hpm) stieg die OD₅₉₀ von 0,3 auf 2,0. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 10.000 Upm geerntet und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

Beispiel 2 Gewinnung von äußeren Membranproteinen von Helicobacter pylori

Die Herstellung der Fraktion äußerer Membranproteine, wobei die inneren und äußeren Membranproteine mittels differentieller Solubilisierung durch Sarkosyl® (Ciba-Geigy AG) getrennt werden, erfolgte nach der Methode von Blaser et al. Dabei werden die Bakterienkulturen in der spätlogarithmischen Wachstumsphase geerntet, in 10 mM Trispuffer (pH 7,4) gewaschen und mit Glasperlen im Homogenisator (IMA) bei 4°C und 4.000 rpm 15 Min. aufgeschlossen. Danach werden die Glaskugeln durch Filtration abgetrennt und die Bakteriensuspension für 20 Min. bei 5.000 g abzentrifugiert, um intakte Zellen zu entfernen. Aus dem Überstand werden die Zellwände durch 60-minütige Zentrifugation bei 100.000 g bei 4°C pelletiert. Das resultierende Pellet wird mit 1% Sarkosyl®-Lösung in 7 mM EDTA resuspendiert und 20 Min. bei 37°C inkubiert. Die sarkosyl®-unlösliche Fraktion, welche die integralen Membranproteine enthält, wird durch 60-minütige Zentrifugation bei 50.000 g bei 4°C pelletiert, in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 3 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Blotting

Die Gelherstellung und die Elektrophorese wurden in der Protean II xi slab Cell-Apparatur der Fa. BioRad durchgeführt. Die eingesetzten Chemikalien und das Polyacrylamid-Monomer (als 30%ige Lösung mit 0,8% Bisacrylamid) wurden von der Fa. Oxford GlycoSystems bezogen. Neben einem 10%igen Standardgel kamen speziell für die Trennung im hoch- bzw. niedermolekularen Bereich noch Gele mit einem Polyacrylamid-Gehalt von 8% bzw. 16% zum Einsatz. Die Gelstärke betrug 1 mm.

Zur Eliminierung unerwünschter oxidierender Eigenschaften des zur Gelherstellung verwendeten Ammoniumpersulfats wurden sämtliche Geltaschen mit einer 50 pM/Mikroliter L-Methionin enthaltenden Lösung gefüllt und über Nacht stehen gelassen. Nach dem Absaugen am nächsten Tag und dem erneuten Einfüllen von jeweils 10 Mikroliter dieser Lösung in jede der Taschen erfolgt eine Vorelektrophorese. Diese Vorbehandlung verhindert eine Oxidation der Methioninreste des Proteins und ermöglicht dadurch ggf. eine Proteinspaltung mit BrCN (Spaltstelle Met). Das Ausgangsmaterial der Membranproteinfraktion wird in 1,5% SDS, 2,5% Mercaptoethanol, 5% Glyzerin und Bromphenolblau in 63 mMol/l Tris-Puffer, pH 6,8 gelöst und durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt.

Der Proteintransfer aus dem SDS-Gel auf die PVDF-Membran (Immobilon P® Fa. Millipore) erfolgt in der Trans Blot SD- Apparatur der Fa. Bio Rad, München, unter modifizierten Bedingungen.

Zur Vervollständigung des Proteintransfers werden dem Kathodenpuffer 0,005% SDS zugesetzt und somit einer zu schnellen SDS-Verarmung im Gel entgegengewirkt. Als optimal erweist sich hierbei die Verwendung von sechs mit diesem Puffer getränkten Filterpapieren auf der Kathodenseite.

Anschließend wurde der Blot mit Amidoschwarz nach der Vorschrift von R. Westermeier (Elektrophorese Praktikum VCH Verlag Weinheim 1990, ISBN 3-527-28172-X) gefärbt.

Beispiel 4 N-terminaler Edman-Abbau

Der Aminosäure-Abbau nach Edman und die Bestimmung der PTH Aminosäuren erfolgte im Flüssigphasen-Sequenzer 477A mit online HPLC-Analysator 120A (Fa. Applied Biosystems).

Für die Analysen wurden die entsprechenden Banden von jeweils vier Spuren auf der PVDF-Blot-Membran ausgeschnitten und nach einem von der Fa. ABI vorgegebenen Waschschritt sequenziert.

Die Anzahl der Sequenzschritte betrug 5-25 (abhängig von der Menge an sequenzierbarer Substanz).

Die PTH-Aminosäuren von Cys und Trp sind bei den gewählten Bedingungen nicht nachweisbar.

Sequenzprotokoll

Claims (21)

1. Protein von Helicobacter pylori (H. pylori) enthaltend eine der Peptidsequenzen ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 gemäß Tabelle 1a-1c, oder Teile mit einer Mindestlänge von fünf Aminosäuren davon.
2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidsequenzen N-terminale Sequenzen sind.
3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 1 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 250 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 110 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 3 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 100 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 6 gemäß Tabelle 1a ein Molekulargewicht von ca. 60 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 10 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 42 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 11 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 42 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 12 gemäß Tabelle 1b ein Molekulargewicht von ca. 32 bis ca. 36 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 14 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 30 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 15 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 28 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 16 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 28 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 17 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 25 kD hat, das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 18 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 25 kD hat, und das Protein enthaltend eine Peptidsequenz mit der SEQ ID NO: 19 gemäß Tabelle 1c ein Molekulargewicht von ca. 17 kD hat.
4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Membranprotein oder ein mit der Membran fest assoziiertes Protein ist.
5. Protein nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein integrales, insbesondere ein sarkosyl-unlösliches integrales Membranprotein ist.
6. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, erhältlich gemäß den folgenden Verfahrensschritten:
  • (a) Isolieren der Proteine mittels differentieller Solubilisierung;
  • (b) Trennen der nach Schritt (a) isolierten Proteine mittels gelelektrophoretischer Methoden; und
  • (c) Isolieren der nach Schritt (b) getrennten Proteine.
7. Protein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mittels differentieller Solubilisierung mit Sarkosyl® erhältlich ist.
8. Protein nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es mittels Trennung durch eine oder mehrere SDS- Polyacrylamid Gelelektrophoresen erhältlich ist.
9. Protein nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es mittels mehrerer SDS-Polyacrylamid Gelelektrophoresen mit unterschiedlichem Polyacrylamidgehalt erhältlich ist.
10. Protein nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyacrylamidgehalt ungefähr 8, 10 oder 16% beträgt.
11. Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18 oder 19 gemäß Tabelle 1a-1c, oder Teile mit einer Mindestlänge von 5 Aminosäuren davon.
12. Antikörper gegen ein oder mehrere Proteine gemäß einem der Ansprüche 1-10 und/oder gegen ein oder mehrere Peptide gemäß Anspruch 11.
13. Polynukleotid kodierend für ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1-10 oder ein Peptid gemäß Anspruch 11.
14. Verfahren zur Herstellung der Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:
  • (a) Isolieren der Proteine mittels differentieller Solubilisierung;
  • (b) Trennen der nach Schritt (a) isolierten Proteine mittels gelelektrophoretischer Methoden; und
  • (c) Isolieren der nach Schritt (b) getrennten Proteine.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine gemäß Schritt (a) mit Sarkosyl® isoliert werden.
16. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Peptidsynthese durchgeführt wird.
17. Verfahren zur Herstellung der Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bzw. der Peptide gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polynukleotid gemäß Anspruch 13 zur Expression gebracht wird.
18. Verwendung eines oder mehrerer Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, eines oder mehrerer Peptide gemäß Anspruch 11, eines oder mehrerer Antikörper gemäß Anspruch 12 oder eines oder mehrerer Polynukleotide gemäß Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Diagnostikums.
19. Arzneimittel enthaltend ein oder mehrere Proteine gemäß einem der Ansprüche 1-10 und/oder ein oder mehrere Peptide gemäß Anspruch 11 oder ein oder mehrere Antikörper gemäß Anspruch 12 oder ein oder mehrere Polynukleotide gemäß Anspruch 13 oder deren Expressionsprodukte.
20. Arzneimittel nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet daß das Arzneimittel als Vakzine verwendet wird.
21. Diagnostikum enthaltend ein oder mehrere Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, ein oder mehrere Peptide gemäß Anspruch 11, ein oder mehrere Antikörper gemäß Anspruch 12 oder ein oder mehrere Polynukleotide gemäß Anspruch 13 oder deren Expressionsprodukte.
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