CN113512572A - 一种发酵法高效制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵法高效制备β‑葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法，包括以下步骤：剑菌菌种的活化：将剑菌菌种接种到活化培养基上静置恒温培养，取得单菌落；种子活化：从所述活化培养基上刮取单菌落接种到种子培养液中，进行摇瓶培养，至培养液OD600值在0.6‑0.9之间时结束培养，得到种子液；发酵培养：将所述种子液接种到与种子活化步骤中种子培养液相同的培养基中，进行扩大培养发酵，得到发酵液；分离干燥：将所述发酵液加入乙醇，静置，离心后取沉淀物，干燥后得到β‑葡聚糖。本发明还公开了剑菌的筛选和验证方法，通过优化发酵条件的控制，实现利用微生物对蔗糖的高效转化制备β‑葡聚糖，进而实现发酵制备β‑葡聚糖的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种发酵法高效制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法。
背景技术
β-葡聚糖是一类具有多种生物活性的葡萄糖聚合物，经特殊步骤萃取且不含内毒素β-葡聚糖在美国FDA已认定是安全的物质，可添加于一般食品，有报导显示小鼠口服β-葡聚糖一段时间后，血脂血糖都有所下降。此外，葡聚糖还具有清除游离基、抗辐射以及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染，故可广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。
传统上生产β-葡聚糖的方法是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。由于受到原料规模、生产周期的限制，通过以上提取方式生产β-葡聚糖的工艺较复杂，且产量较低，远远不能满足市场需求。
β-葡聚糖不仅在各种生物体内发挥多种生物学活性，而且在各种生物间的相互影响过程中也具有多种功能，是高效的生物反应调节因子(BRM)。然而，β-葡聚糖功效的发挥需要一定的溶解度、空间结构和合适的分子量支撑。很多β-葡聚糖水溶性较低，例如，可得然胶是由土壤杆菌或产碱杆菌产生的一种水不溶的凝胶多糖型葡聚糖；菌姑多糖对肿瘤有抑制作用，但它在水中的溶解度也不高。而非水溶性的葡聚糖进入人体后很难被直接吸收，使其应用范围受到极大的限制。
综上所述，研究开发一种水溶性高的β-葡聚糖，规避原料规模、生产周期等限制因素是食品营养健康领域的迫切需求。
发明内容
针对现有技术存在的问题与不足，本发明首先提供一种发酵法制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法，克服现有技术中β-葡聚糖水溶性低、生产周期长等问题。
首先，本发明提供的一个技术方案是一种发酵法制备β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
A.剑菌菌种的活化：将剑菌菌种接种到活化培养基上静置恒温培养，取得单菌落；
B.种子活化：从所述活化培养基上刮取单菌落接种到种子培养液中，进行摇瓶培养，至培养液OD600值在0.6-0.9之间时结束培养，得到种子液；
C.发酵培养：将所述种子液接种到与所述步骤B中种子培养液相同的培养基中，进行扩大培养发酵，得到发酵液；
D.分离干燥：将所述发酵液加入乙醇，静置，离心后取沉淀物，干燥后得到β-葡聚糖。
在一种实施案例中，所述步骤A中活化培养基中含有酵母粉0.8-1.2g/L，葡萄糖5.0-10g/L或蔗糖8-13.0g/L，土壤30-50g/L，琼脂12-18.0g/L，pH＝5-11。
在一种实施案例中，所述步骤A中恒温培养的条件为：培养温度为25-30℃；培养时间为2-3天。
在一种实施案例中，所述步骤B中种子培养液为蛋白胨8.0-12.0g/L、酵母粉4.0-6.0g/L和氯化钠8.0-12.0g/L的混合水溶液，pH为5-11。
在一种实施案例中，所述步骤C中种子培养液与种子液的体积比为1:300-1:800；发酵条件为：发酵温度为25-30℃，发酵时间为3-5天。
在一种实施案例中，所述步骤D中发酵液与乙醇的体积比为1：(2-4)，静置时间为2-4h，离心速率为6000-8000rpm，干燥温度为45℃。
作为本发明的第二个方面，提供一种制备β-葡聚糖的方法中所使用的剑菌，所述剑菌(Ensifer)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为本发明的第三个方面，提供一种剑菌的筛选方法，包括制备筛选培养基的步骤和摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤以及筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤。
在一种实施案例中，所述制备筛选培养基的步骤：
按照酵母粉0.8-1.2g/L，蔗糖8-13.0g/L，土壤30-50g/L，琼脂12-18.0g/L的浓度称取物质，蒸馏水溶解定容，调pH＝5-11，115-121℃灭菌20-30分钟，制成筛选培养基；
在一种实施案例中，所述摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤：
将采集的用于筛选的盐碱土样0.5-1.5g加入到5ml液体培养基中，于28℃摇床中振荡培养2-3天，得到富集产β-葡聚糖的菌种培养物；
在一种实施案例中，所述筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤：
将培养物以总重量的5％接种量涂布于所述筛选培养基上，25-30℃倒置培养2-3天，利用菌落特殊形态，选取具有分泌透明粘液的单菌落转接到5-8ml筛选培养基中扩大培养，25-30℃，150-300rpm震荡培养2-3天得到剑菌菌种。
作为本发明的第三个方面，提供一种上述方法制备的β-葡聚糖。
作为本发明的第四个方面，提供一种上述方法制备的β-葡聚糖在包括普通食品、保健食品、特殊医学用途配方食品及药品在内的领域中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用一种剑菌菌种，通过优化发酵条件的控制，实现利用微生物对蔗糖的高效转化制备高水溶性的β-葡聚糖，进而实现发酵制备β-葡聚糖的工业化生产；通过本发明公开的剑菌及其筛选方法，剑菌菌种的产率高，纯度高，为制备高纯度的β-葡聚糖奠定了基础；本发明所制备的β-葡聚糖为食品级，可在普通食品、保健食品、特殊医学用途配方食品等食品领域中应用，其可以控制血糖上升，清除游离基，抗辐射，抵抗病毒真菌感染，为健康食品提供了新的解决方案。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
序列表为权利发明菌株PCR产物纯化后测序所得的16S rDNA序列。
图1为菌株ZB-1的平板菌落形态。
图2为实施例1-3和对比例1-2不同方式制备β-葡聚糖的含量。
图3为实施例1-3和对比例1-2不同方式制备β-葡聚糖的产率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明实施例中发酵法制备β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
A.剑菌菌种的活化：将剑菌菌种接种到活化培养基上静置恒温培养，取得单菌落；
B.种子活化：从所述活化培养基上刮取单菌落接种到种子培养液中，进行摇瓶培养，至培养液OD600值在0.6-0.9之间时结束培养，得到种子液；
C.发酵培养：将所述种子液接种到与所述步骤B中种子培养液相同的培养基中，进行扩大培养发酵，得到发酵液；
D.分离干燥：将所述发酵液加入乙醇，静置，离心后取沉淀物，干燥后得到β-葡聚糖。
本发明实施例中所使用的剑菌的筛选方法，包括制备筛选培养基的步骤和摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤以及筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤：
其中，制备筛选培养基的步骤如下：
按照酵母粉0.8-1.2g/L，蔗糖8-13.0g/L，土壤30-50g/L，琼脂12-18.0g/L的浓度称取物质，蒸馏水溶解定容，调pH＝5-11，115-121℃灭菌20-30分钟，制成筛选培养基；
摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤如下：
将采集的用于筛选的盐碱土样0.5-1.5g加入到5ml液体培养基中，于28℃摇床中振荡培养2-3天，得到富集产β-葡聚糖的菌种培养物；
筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤如下：：
将培养物以总重量的5％接种量涂布于所述筛选培养基上，25-30℃倒置培养2-3天，利用菌落特殊形态，选取具有分泌透明粘液的单菌落转接到5-8ml筛选培养基中扩大培养，25-30℃，150-300rpm震荡培养2-3天得到剑菌菌种。
本发明实施例中所使用的剑菌的验证方法，包括16S rDNA序列分析的步骤：挑取菌株斜面培养物加至5-10ml液体种子培养基中，25-30℃培养过夜，取2ml菌液，5000-6000rpm离心3-5min，弃上清液，在沉淀中加入200-300ul细胞裂解液，加入10-20ul蛋白酶K，50-56℃水浴1-2h。100℃沸水浴加热10-15min后，10000-12000rpm离心5-10min，取上清液进行PCR反应；引物序列如下：
上游引物：5’-CGGCTCCCTTGTTACGACTT-3’
下游引物：5’-AGAGTTTGATACTGGCTCAG-3’
PCR产物纯化后测序所得菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，经过序列比对结果，表明该菌株为剑菌(Ensifer)。
实施例1～3，所采用的剑菌的筛选和验证方法相同，都是上述方法，具体如下：
实施例1
一种使用上述筛选方法得到的剑菌制备β-葡聚糖的方法，具体步骤如下：
(1)剑菌菌种的活化：首先按照比例配制剑菌的活化培养基，即酵母粉1.2g/L，蔗糖10.0g/L，土壤50g/L，琼脂18.0g/L，加热溶解后调整pH至7.0；恒温培养温度为30℃；将剑菌菌种接种到活化平板培养基上静置恒温培养3天，取得平板单菌落。
(2)种子活化：从菌种活化培养基上刮取单菌落接种到液体种子培养液中进行摇瓶培养，作为种子液。剑菌配制种子液的方法为：比例为蛋白胨12.0g/L、酵母粉6.0g/L和氯化钠12.0g/L蒸馏水溶解定容，并调整pH为7.0，然后121℃高温高压灭菌20分钟，待冷却后将步骤(1)所得的剑菌单菌落轻轻刮下加入；在30℃发酵48h，摇床以300rpm的速度震荡3天，至培养液OD600值在0.8时结束培养，形成种子培养液。
(3)发酵培养，按照步骤(2)培养液配置方法再次配置培养液，配置量按步骤(2)所得种子培养液的多少来确定。种子培养液与新配培养液的体积比为1:800，然后在30℃继续发酵3天。
(4)分离干燥：在步骤(3)所得的发酵液中加入乙醇，发酵液与乙醇的体积比为1：2，静置时间为4h，离心力为8000rpm，将醇沉得到的固体采用低温干燥的方法用45℃低温烘干。得到使用剑菌制取的β-葡聚糖粉末。
实施例2
一种使用所述剑菌制备β-葡聚糖的方法。制备方法同实例1，区别在于活化培养基碳源采用的是葡萄糖。具体步骤如下：
(1)剑菌菌种的活化：首先按照比例配制剑菌的活化培养基，即酵母粉1.2g/L，葡萄糖10.0g/L，土壤50g/L，琼脂18.0g/L，加热溶解后调整pH至7.0；恒温培养温度为30℃；将剑菌菌种接种到活化平板培养基上静置恒温培养3天，取得平板单菌落。
(2)种子活化：从菌种活化培养基上刮取单菌落接种到液体种子培养液中进行摇瓶培养，作为种子液。剑菌配制种子液的方法为：比例为蛋白胨12.0g/L、酵母粉6.0g/L和氯化钠12.0g/L蒸馏水溶解定容，并调整pH为7.0，然后121℃高温高压灭菌20分钟，待冷却后将步骤(1)所得的剑菌单菌落轻轻刮下加入；在30℃发酵48h，摇床以300rpm的速度震荡3天，至培养液OD600值在0.8时结束培养，形成种子培养液。
(3)发酵培养，按照步骤(2)培养液配置方法再次配置培养液，配置量按步骤(2)所得种子培养液的多少来确定。种子培养液与新配培养液的体积比为1:800，然后在30℃继续发酵3天。
(4)分离干燥：在步骤(3)所得的发酵液中加入乙醇，发酵液与乙醇的体积比为1：2，静置时间为4h，离心力为8000rpm，将醇沉得到的固体采用低温干燥的方法用45℃低温烘干。得到使用剑菌制取的β-葡聚糖粉末。
实施例3
一种使用所述剑菌制备β-葡聚糖的方法。制备方法同实例1，区别在于工艺参数不同。具体步骤如下：
(1)剑菌菌种的活化：首先按照比例配制剑菌的活化培养基，即酵母粉1.2g/L，蔗糖13.0g/L，土壤50g/L，琼脂18.0g/L，加热溶解后调整pH至5.0；恒温培养温度为25℃；将剑菌菌种接种到活化平板培养基上静置恒温培养2天，取得平板单菌落。
(2)种子活化：从菌种活化培养基上刮取单菌落接种到液体种子培养液中进行摇瓶培养，作为种子液。剑菌配制种子液的方法为：比例为蛋白胨8.0g/L、酵母粉4.0g/L和氯化钠8.0g/L蒸馏水溶解定容，并调整pH为7.0，然后115℃高温高压灭菌20分钟，待冷却后将步骤(1)所得的剑菌单菌落轻轻刮下加入；在25℃发酵24h，摇床以250rpm的速度震荡2天，至培养液OD600值在0.6时结束培养，形成种子培养液。
(3)发酵培养，按照步骤(2)培养液配置方法再次配置培养液，配置量按步骤(2)所得种子培养液的多少来确定。种子培养液与新配培养液的体积比为1:300，然后在25℃继续发酵5天。
(4)分离干燥：在步骤(3)所得的发酵液中加入乙醇，发酵液与乙醇的体积比为1：4，静置时间为4h，离心力为6000rpm，将醇沉得到的固体采用低温干燥的方法用45℃低温烘干。得到使用剑菌制取的β-葡聚糖粉末。
为更好的解释本发明的显著效果，添加对比例如下：
对比例1
一种从大麦中提取制备β-葡聚糖的方法。具体步骤如下：
(1)取500g大麦磨成粉，过40目筛。然后85℃烘烤1h灭内源酶活。
(2)取步骤(1)得到的粉末250g按重量与体积比1:4加入无水乙醇，加热回流20min，并趁热离心(3500r/min)10min，去除上清。
(3)将步骤(2)得到的渣按1:6的重量体积比溶解在水中，90℃加耐高温α-淀粉酶1.5ml，30min处理将淀粉糊化，然后待温度降至60℃后，加高效糖化酶，调整pH为4.0，处理2h；待温度降至32℃，加胰蛋白酶(酶添加量为0.05％)，调整pH为8.0，处理2h。这一过程是为了去除大麦中本身含有的脂质，淀粉，蛋白。然后90℃保温10min，灭酶活。
(4)对步骤(3)得到的酶解液进行离心(8000r/min，10min)分离，得到富含β-葡聚糖、氨基酸、寡肽、单糖、低聚糖的上清液。
(5)对步骤(4)得到的上清用截留分子量为10000的膜，压力0.21MPa，30℃浓缩。然后加等体积无水乙醇对截留下来的固相，多次洗涤，洗涤条件为(8000r/min，10min)。
(6)弃除步骤5得到的上清，低温45摄氏度干燥固相，得到β-葡聚糖粉末。
对比例2
一种使用酿酒酵母制备β-葡聚糖的方法。具体步骤如下：
(1)酿酒酵母经去离子水多次洗涤后配制成质量分数为15％的菌悬液，然后加入质量分数为3％的NaCl，调整pH为5.0，在55℃恒温水浴振荡器中诱导自溶24h，然后升温至85℃，20min灭酶活。
(2)待步骤(1)所得菌悬液冷却至室温后，用去离子水离心洗涤多次，然后用0.02mol/L，pH为7.5的磷酸盐缓冲液再次配制成质量分数湿重为20％的菌悬液，95℃恒温水浴震荡130r/min，热水浸提4h，冷却至室温后用去离子水离心多次洗涤，沉淀保存在4℃。
(3)利用高压微射流对步骤(2)热水浸提后的酵母细胞液进行均质处理，处理条件为：质量浓度湿重20％，压力105MPa，循环次数为6次。
(4)选用甘露聚糖酶和酵母抽屉没对酵母细胞壁中的蛋白成分进行破坏，料液比为1:4，酶添加量为0.5％和0.5％，温度为55℃，pH值为7.0，时间为50min。
(5)在经过步骤(4)复合酶解后，再次对酶解液进行高压微射流进行均质处理。条件为：质量浓度湿重20％，压力210MPa，循环次数为3次。
(6)微射流处理后的样品离心后于恒温鼓风干燥箱中65℃烘干,即得酵母β-葡聚糖产品。
实施例及对比例的结果表征及对比：
1.不同制备方法所得样品中β-葡聚糖含量的测定
采用刚果红法分别测定实施例1-3及对比例1-2中β-葡聚糖的含量，方法为首先绘制β-葡聚糖的标准曲线，并在曲线上求出吸光度为1时，相当量的β-葡聚糖的微克数(即为K值)。分别取待测样品未进行干燥的液体各2ml，分别加入4ml的刚果红，准确计时在20℃的水浴中反应10min，以2ml蒸馏水代替样品做空白调零，测反应液的吸光度A。则样品中β-葡聚糖的含量(mg/L)＝(K/2)×吸光度A×稀释倍数n。
结果见表1：
表1不同方式制备β-葡聚糖的含量
结合表1及图2可以看出，相较于对比例1的化学提取法，实施例1-3和对比例2微生物发酵法制备β-葡聚糖，β-葡聚糖的含量都有明显的提升；而相较于对比例2使用酿酒酵母的微生物发酵法制备β-葡聚糖，实施例1-3所采取的一种剑菌制备β-葡聚糖的方法对于β-葡聚糖的纯度又有明显的提高，充分说明了剑菌比酿酒酵母更有益于β-葡聚糖的转化。
2.不同制备方法所得样品中β-葡聚糖的产率
不同方法制备β-葡聚糖的产率(％)＝所得β-葡聚糖(g)/底物的质量(g)×100结果见表2：
表2不同方式制备β-葡聚糖的产率
结合表2及图3可以看出，与上述的β-葡聚糖的含量的情况有些许不同，相较于对比例1的化学提取法，对比例2使用酿酒酵母的微生物发酵法制备β-葡聚糖，β-葡聚糖的产率仅有少许提升，效果并不显著。而实施例1-3使用剑菌进行的微生物发酵法制备β-葡聚糖，β-葡聚糖的产率则都有明显的提升，提升效果高达化学法的5-6倍。充分说明，实施例所采取的一种剑菌制备β-葡聚糖的方法对于β-葡聚糖的产率有很大幅度的提升，这对于生产应用具有十分重要的促进意义。
综上所述，本发明使用从盐碱土壤中筛选获得的高产β-葡聚糖菌株，通过优化发酵条件的控制，实现使用微生物对蔗糖的高效转化制备β-葡聚糖。有望实现发酵制备β-葡聚糖的工业化生产，避免或降低传统β-葡聚糖提取制备方式高度依赖原料、生产周期长且复杂的缺点，同时拓展了蔗糖资源的高价值加工利用。基于当前食品、医药、养殖等领域对β-葡聚糖的市场需求，本发明具有良好的应用前景。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
序列表
<110> 苏州朗邦营养科技有限公司
<120> 一种发酵法高效制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法
<141> 2021-04-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1321
<212> DNA
<213> 剑菌(Ensifer)
<400> 1
tacgagcggc agacgggtga gtaacgcgtg ggaatctacc cttttctacg gaataacgca 60
gggaaacttg tgctaatacc gtatgagccc ttcgggggaa agatttatcg ggaaaggatg 120
agcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc 180
tggtctgaga ggatgatcag ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 240
gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg 300
atgaaggccc tagggttgta aagctctttc accggtgaag ataatgacgg taaccggaga 360
agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt 420
cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggacattta agtcaggggt gaaatcccgg 480
ggctcaaccc cggaactgcc tttgatactg ggtgtctaga gtccagaaga ggtgagtgga 540
attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc 600
tcactggtct ggtactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 660
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg ttagccgtcg ggcagtttac tgttcggtgg 720
cgcagctaac gcattaaaca ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag 780
gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag 840
aaccttacca gcccttgaca tcccggtcgc gggaacgaga gatcgtttcc ttcagttcgg 900
ctggaccgga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 960
agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt agttgccagc atttagttgg gcactctaag 1020
gggactgccg gtgataagcc gagaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt 1080
acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg tggtgacagt gggcagcgag accgcgaggt 1140
cgagctaatc tccaaaagcc atctcagttc ggattgcact ctgcaactcg ggtgcatgaa 1200
gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1260
acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg ttctacccga aggtagtgcg ctaaccgcaa 1320
g 1321
Claims (10)
1.一种发酵法制备β-葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.剑菌(Ensifer)菌种的活化：将剑菌菌种接种到活化培养基上静置恒温培养，取得单菌落；
B.种子活化：从所述活化培养基上刮取单菌落接种到种子培养液中，进行摇瓶培养，至培养液OD600值在0.6-0.9之间时结束培养，得到种子液；
C.发酵培养：将所述种子液接种到与所述步骤B中种子培养液相同的培养基中，进行扩大培养发酵，得到发酵液；
D.分离干燥：将所述发酵液加入乙醇，静置，离心后取沉淀物，干燥后得到β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的发酵法制备β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤A中活化培养基中含有酵母粉0.8-1.2g/L，葡萄糖5.0-10g/L或蔗糖8-13.0g/L，土壤30-50g/L，琼脂12-18.0g/L，pH＝5-11；
所述步骤A中恒温培养的条件为：培养温度为25-30℃；培养时间为2-3天。
3.根据权利要求1所述的发酵法制备β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤B中种子培养液为蛋白胨8.0-12.0g/L、酵母粉4.0-6.0g/L和氯化钠8.0-12.0g/L的混合水溶液，pH为5-11。
4.根据权利要求1所述的发酵法制备β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤C中种子培养液与种子液的体积比为1:300-1:800；发酵条件为：发酵温度为25-30℃，发酵时间为3-5天。
5.根据权利要求1所述的发酵法制备β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤D中发酵液与乙醇的体积比为1：(2-4)，静置时间为2-4h，离心速率为6000-8000rpm，干燥温度为45℃。
6.一种根据权利要求1～5任一项所述的制备β-葡聚糖的方法中所使用的剑菌，其特征在于，所述剑菌(Ensifer)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.根据权利要求6所述的剑菌的筛选方法，其特征在于，包括制备筛选培养基的步骤和摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤以及筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，
所述制备筛选培养基的步骤：
按照酵母粉0.8-1.2g/L，蔗糖8-13.0g/L，土壤30-50g/L，琼脂12-18.0g/L的浓度称取物质，蒸馏水溶解定容，调pH＝5-11，115-121℃灭菌20-30分钟，制成筛选培养基；所述摇瓶培养富集产β-葡聚糖菌种的步骤：
将采集的用于筛选的盐碱土样0.5-1.5g加入到5ml液体培养基中，于28℃摇床中振荡培养2-3天，得到富集产β-葡聚糖的菌种培养物；
所述筛选具有分泌透明粘液的单菌落扩大培养的步骤：
将培养物以总重量的5％接种量涂布于所述筛选培养基上，25-30℃倒置培养2-3天，利用菌落特殊形态，选取具有分泌透明粘液的单菌落转接到5-8ml筛选培养基中扩大培养，25-30℃，150-300rpm震荡培养2-3天得到剑菌菌种。
9.根据权利要求1～5任一所述方法制备的β-葡聚糖。
10.根据权利要求9所述的β-葡聚糖在包括普通食品、保健食品、特殊医学用途配方食品及药品在内的领域中的应用。
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| CN202110402921.0A CN113512572A (zh) | 2021-04-15 | 2021-04-15 | 一种发酵法高效制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110402921.0A CN113512572A (zh) | 2021-04-15 | 2021-04-15 | 一种发酵法高效制备β-葡聚糖的方法、剑菌及其筛选方法 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083066A2 (de) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Universität des Saarlandes | Anhydrofructose-reductase, ihre kodierende nukleotidsequenz und deren verwendung |
| CN101123869A (zh) * | 2004-06-28 | 2008-02-13 | 卡姆比亚公司 | 用于真核细胞的生物基因转移系统 |
| CN105849261A (zh) * | 2013-12-26 | 2016-08-10 | 株式会社三养社 | 剑菌属菌株和使用其生产阿洛酮糖的方法 |
| WO2018127486A1 (en) * | 2017-01-03 | 2018-07-12 | Novozymes A/S | Enzymatic dehusking of pulses |
-
2021
- 2021-04-15 CN CN202110402921.0A patent/CN113512572A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083066A2 (de) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Universität des Saarlandes | Anhydrofructose-reductase, ihre kodierende nukleotidsequenz und deren verwendung |
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