CN101123869A - 用于真核细胞的生物基因转移系统 - Google Patents

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CN101123869A CNA2005800291468A CN200580029146A CN101123869A CN 101123869 A CN101123869 A CN 101123869A CN A2005800291468 A CNA2005800291468 A CN A2005800291468A CN 200580029146 A CN200580029146 A CN 200580029146A CN 101123869 A CN101123869 A CN 101123869A
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector

Abstract

本发明一般地涉及将核酸分子转移至真核细胞的技术。特别是将与植物细胞发生相互作用的非病原菌种类用于转移核酸序列。用于转化植物的细菌通常含有二元载体，诸如带有Ti质粒vir区的质粒和带有含有所关注的DNA序列的T区的质粒。

Description

用于真核细胞的生物基因转移系统
技术领域
本发明一般地涉及将核酸分子转移至真核细胞的技术并且特别是使用非病原菌将核酸序列转移至真核细胞，例如植物细胞的技术。
背景技术
对于转化技术在作物中的商业化应用来说存在三个必要的过程：(i)将新的DNA导入合适的植物细胞/器官；(ii)成功转化的细胞/植物的生长或繁殖，通常涉及选择或鉴别方法；和(iii)靶细胞/器官/阶段中转基因的表达。
这些过程各自以几种不同质量和效率的选择性技术代表。然而，第一步不仅对植物，而且对任何真核生物和细胞类型的转化均为最关键的。目前存在两类广泛用于产生转基因生物体的DNA导入方法，即物理方法和生物学方法。
导入DNA的物理方法包括粒子轰击、电穿孔和被原生质体直接DNA摄取或将其注入原生质体。这些目前实施形式的方法均存在实质上的缺陷。导入的DNA的结构趋向于复杂并且难以控制，且与导入相关的胁迫或使用这些方法所必需的再生的类型通常为致突变的。此外，围绕这些方法的专利前景展望明显不同，但无一不受到阻碍。
生物转化目前集中在使用天然遗传改造物(genetic engineer)根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将确定的新DNA序列转入植物。根瘤土壤杆菌为常见的土壤细菌，其基因中的某些天然插入植物并且使用植物系统表达细菌用作营养物的化合物形式的那些基因。在该过程中，转入基因中的某些还导致形成常见于接近根和茎接合处的植物瘤，来源于它的名称为冠瘿病。该病侵害大范围的双子叶植物，它们构成了开花植物的主要类群之一。所谓土壤杆菌属(Agrobacterium)去甲型菌株用于植物转化，它们已经丧失了形成瘤和在植物上展示出减少的致病表型的能力。不过，至少存在七种染色体毒力基因和几种其它影响毒力的仍然存在于常用土壤杆菌属菌株中的基因。
尽管存在这一缺陷，但是土壤杆菌属介导的植物转化已经广泛用于转化植物细胞。使用土壤杆菌属的其它缺陷包括宿主范围有限，并且它仅可以感染该范围内有限数量的细胞类型。特别重要的是，鉴于土壤杆菌属可以感染许多双子叶植物，单子叶植物更耐受感染。然而，单子叶植物构成了世界上大部分重要的食物作物(例如稻米、玉米)。单子叶植物仅能够被土壤杆菌属在特定条件下并且使用特定类型的细胞、愈伤组织细胞或其它去分化组织转化(例如美国专利US5,591,616；US6,037,552；US5,187,073；US6,074,877)。但是，众所周知某些单子叶植物和某些双子叶植物，例如大豆和其它豆科植物仍然难以用土壤杆菌属转化。在指定植物物种的变种之间转化率上也存在巨大差异，其中某些对土壤杆菌属的基因转移是完全抗拒的。
尽管土壤杆菌属存在这些缺陷，但是尚未开发出用于转化真核细胞的其它细菌系统。认为其它细菌属不适合于转化植物。实际上，普遍认为土壤杆菌属是具有跨界基因转移能力的唯一细菌属。尽管有些报导据称证明了土壤杆菌属诱导瘤的能力可以被转移至其它相关的属，包括根瘤菌(Klein和Klein，Arch Microbiol.66：220-228，1953；Kern，Arch.Microbiol.52：325-344，1965)，但是结果无法一律再现，也不存在任何基因转移的物证。例如，Hooykaas、Schilperoort及其同仁在70年代中到末期就报导了某些菌种，特别是三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)和豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)能够在导入来自毒性土壤杆菌属的Ti质粒后在植物上形成瘤(Hooykaas等，Gen.Microbiol.98：477-484，1977；Hooykaa s等，Gen.Microbiol.4：66i-666，1984)，而其它种类，特别是苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)(目前称作苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))则不能(van Veen等，Plant-Microbe Interactions 1：231-234，1988)。从那时起，几乎没有进行过额外的工作来验证基因转移发生或进一步检验根瘤菌介导基因转移的能力(如果有的话)。仅近来在来自根结缠感染(mat-infected)的黄瓜和番茄的苍白杆菌属(Ochrobactrium)、根瘤菌属(Rhizobium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的环境分离物中发现了诱导根的Ri质粒(Weller等，Appl.和Environ.Microbiol.70：2779-2785，2004)，这表明这些细菌可以维持发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒。然而，未证实与该病的因果关系，也没有任何将DNA转移至植物的证据。此外，证实中华根瘤菌属的种类为Ti质粒的贮主，但未对该细菌中Ti质粒的功能性进行测试(Teyssier-Cuvelle等Molec.Ecol.8：1273-1284，1999)。因此，研究人员基本上仅使用土壤杆菌属的单一种类根癌土壤杆菌，已知它可成功地转化植物细胞。
发明内容
在本发明的一个方面中，提供了用于转化真核细胞的系统。特别是，一种这样的系统包括转化感受态细菌，它们对植物而言为非致病性的并且含有包括转移所需基因的第一种核酸分子和包括一种或多种能够转移所关注的DNA序列的序列的第二种核酸分子。在各种不同的实施方案中，转移所需的基因为来自土壤杆菌属的Ti质粒的vir基因或vir基因的同源物，诸如来自如RK2或RK4这类质粒的tra基因。在其它实施方案中，能够转移的序列为来自土壤杆菌属的Ti质粒的T-边缘序列。在某些实施方案中，所关注的DNA序列位于两种T-边缘序列之间。在其它实施方案中，能够转移的序列为来自任何移动性细菌质粒的oriT序列。
在另一个方面中，所述的细菌含有：包括Ti质粒，诸如来自土壤杆菌属的去甲型Ti质粒的vir基因区第一种质粒；和包括一种或多种T-边缘或oriT序列和所关注的DNA序列的第二种质粒。在另一个方面中，所述的细菌含有单一质粒，它包括Ti质粒的vir基因区和一种或多种可操作地与所关注的DNA序列连接的T-边缘或oriT序列。
设计将所关注的DNA序列转移至真核细胞的质粒和核酸分子。在一个实施方案中，导入细菌以便诱导所关注的DNA序列转移至真核细胞的质粒可以为含有全部或至少部分vir基因的根癌土壤杆菌的Ti质粒或其衍生物。该质粒一般不含T-DNA区。在一些情况中，vir基因为诱导型的，在另一些情况中，vir基因为组成型表达的。在一个实施方案中，该质粒具有一种或多种virG序列。在另一个实施方案中，辅助质粒具有广宿主范围复制起点，诸如来自RK2质粒的复制起点。在其它实施方案中，辅助载体具有一种或多种oriT序列，诸如来自RP4的oriT。在某些实施方案中，所述的载体具有选择性标记。
第二种核酸分子或质粒可以为T-DNA质粒或T-DNA-样质粒，它具有执行与T-DNA边缘序列相同功能的序列。在某些实施方案中，T-DNA边缘序列的同源物为转移起点(oriT)。当第二种质粒为T-DNA质粒时，它具有至少一种T-DNA边缘序列。
能够转移所关注的DNA序列的序列(例如，T-边缘序列)可操作地与所关注的DNA序列连接，使得所关注的DNA序列被转移至受体真核细胞。此外，核酸分子可以含有编码选择性产物的基因以便能够在细菌中或在真核细胞中选择。
获得并且使用上述核酸分子或质粒，通过接合、电穿孔或其它方式转染与植物或植物细胞发生相互作用的非病原菌。合适的细菌包括，但不限于非致病性根瘤菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、欧文氏菌属(Erwinia)和芽孢杆菌属(Bacillus)。
使含有这些质粒的细菌与适当制备的植物、植物细胞或植物组织接触足以将所关注的DNA序列转移至细胞的时间。在一个实施方案中，选择转化的植物或细胞或组织。当使用植物细胞或组织时，将转化的细胞再生成植物。
本发明的这些和其它方面在参照如下详细描述和附图时将变得显而易见。此外，下文列出了更详细描述某些操作步骤或组合物(例如，质粒等)的各种参考文献，因此将它们完整地引入作为参考。
附图说明
图1A和B表示根瘤菌目中细菌的最新分类等级。
图2展示了典型二元载体的图谱。
图3A-F显示了根瘤菌属的种类NGR234(链霉素抗性菌株ANU240)(SEQ ID NOS：1-3)、苜蓿中华根瘤菌(Si norhizobiummelitoli)1021(SEQIDNOS：4-6)、百脉中间根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099(SEQ ID NOS：7-9)、紫金牛叶杆菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)CAMBIA分离物WB1(SEQ ID NOS：10-11)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110(SEQ ID NOS：12-14)的16S rDNA，atpD和recA基因以及根瘤土壤杆菌EHA105(SEQ IDNOS：15-16)的16S rDNA，atpD基因的部分核苷酸序列。
图4显示了来自根瘤土壤杆菌EHA105(SEQ ID NO：17)的recA基因的部分核苷酸序列。
图5显示了使用分离自EHA101的Ti质粒DNA电穿孔的Ti质粒消除的LBA288细胞转化体的扩增分析结果。使用了下列引物：泳道a，Atu16S(SEQ ID NOS：21-22)；泳道b，attScirc(SEQ ID NOS：23-24)；泳道c，attSpAT(SEQ ID NOS：25-26)；泳道d，AtuvirG(SEQ IDNOS：27-28)；泳道e，nptI(SEQ ID NO：29-30)；泳道f，virB(SEQ IDNOS：31-32)。LBA288，Ti质粒消除的土壤杆菌属菌株；EHA101，Ti质粒DNA的供体菌株；转化体1和2，LBA288的独立转化体。
图6说明了使用包含Ti质粒(virG)的同源序列的自杀载体(pWBE58)将来自RP4的oriT整合于EHA105的Ti质粒中的策略。
图7为对来自分别表示virG区(EHA105 pTi1)和accA区(EHA105pTi2)复制的两种根癌土壤杆菌Ti质粒：：自杀载体整合体的基因组DNA的DNA印迹分析。
图8显示了二元载体pCAMBIA1105.1的载体图谱。GUSPlusTM基因(美国专利US 6391547)；HYG(R)，潮霉素抗性基因；MCS，多克隆位点。
图9显示了二元载体pCAMBI A1105.1R的载体图谱。GUSPlusTM基因(美国专利US 6391547)；HYG(R)，潮霉素抗性基因；MCS，多克隆位点的(注意MCS与pCAMBIA1105.1中的MCS不同)。
图10为表示对来自分别包含根癌土壤杆菌修饰的Ti质粒pTil和pTi3以及二元载体pCAMBIA1105.1R的根瘤菌属种类NGR234的菌株(上图)和苜蓿中华根瘤菌1021的菌株(中图)的DNA的扩增分析结果的电泳凝胶。使用了下列引物；泳道a，Sme16SrDNA(SEQ ID NOS：33-34)；泳道b，NodD1NGR234(SEQ ID NOS：35-36)；泳道c，SmeNodQ+NodQ2(SEQID NOS：37-39)；泳道d，VirB(SEQ ID NOS：31-32)；泳道e，VirBllFW2+M13REV(鉴定pTi1；SEQ ID NOS：40-41)；泳道f，M13FW+MoaAREV2(鉴定pTi3；SEQ ID NOS：42-43)；泳道g，HygR510(SEQID NOS：44-45)；泳道h和h’，1405.1FW+M13FW(SEQ ID NOS：46+42；鉴定二元载体中的特异性MCS；泳道h中的阳性对照为pCAMBIA1105.1R，而泳道h’中的阳性对照为pCAMBIA1105.1)；泳道i，Atu16SrDNA(SEQID NOS：21-22)；泳道j，attScirc(SEQ ID NOS：23-24)；泳道k，attSpAT(SEQ ID NOS：25-26)；泳道M，合并的100bp和1kb DNA梯。
图11A-C提供了分别与各自包含Ti质粒和二元载体的根癌土壤杆菌(A图)、苜蓿中华根瘤菌(B图)和根瘤菌属的种类(C图)一起共培养后对GUS(β-萄糖苷酸酶)活性染色的(箭头指向某些蓝色区)稻米愈伤组织的影像。
图12提供了分别与各自包含Ti质粒和二元载体的根癌土壤杆菌、苜蓿中华根瘤菌和根瘤菌属的种类一起共培养后对GUS活性染色的烟草叶片的影像。
图13显示了在使用包含pTil和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌属的种类NGR234进行花浸渍转化后在含有潮霉素的培养基上发芽的鼠耳芥属(Arabidopsis)幼苗；箭头指向生长的潮霉素抗性幼苗。
图14显示了来自分别与根癌土壤杆菌和苜蓿中华根瘤菌的基因转移感受态菌株共培养后再生的烟草枝条的GUS染色的叶端。
图15提供了使用引物Hyg700(SEQ ID NOS：82-83)(上图)和MCS(SEQ ID NOS：46和79)(下图)对分别与基因转移感受态苜蓿中华根瘤菌(2-1，6，7-1，11-1)和根癌土壤杆菌(1，2，3)共培养后再生的烟草枝条(基因型Wisconsin38)获得的HygR基因扩增数据。
图16提供了与包含pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中华根瘤菌一起共培养后再生的生了根的烟草枝条的照片。
图17A-B提供了具有GUS活性(蓝色)的苜蓿中华根瘤菌介导的遗传转化的稻米愈伤组织和未转化的稻米愈伤组织(白色)(A图)和在根中具有可见的GUS活性(蓝色)的苜蓿中华根瘤菌介导的遗传转化的稻米枝条、在发育枝条的基底部和枝条顶端的愈伤组织(B图)的影像。
图18提供了独立转化的烟草(Tob)、鼠耳芥属(Arab)和稻米植物及其各自的未转化对照物(wt)的DNA印迹数据。本文所示的转基因植物由苜蓿中华根瘤菌介导的转化产生。(*)表示空的泳道。
发明详述
如上所述，本发明提供了用于转化真核细胞，尤其是植物细胞的菌种。用于本发明的菌种为可以与植物发生相互作用并且为非致病性的细菌。通过使用一种核酸分子，诸如来自土壤杆菌属的Ti辅助质粒或其衍生物和第二种核酸分子或质粒转染使这些细菌成为基因转移感受态的，所述的一种核酸分子包括所有或部分vir基因区或功能等效物，并且第二种核酸分子或质粒包括可操作地与能够将所关注的序列转移至真核植物细胞的一种或多种序列连接的所关注的DNA序列。在某些方面中，通过使用包括vir基因或同源物和可操作地与能够转移的序列连接的所关注的DNA序列的单一核酸分子转染使得这些细菌成为基因转移感受态的。
合适的非病原菌的鉴定
用于本发明的细菌为那些可以与植物发生相互作用，而对植物或植物细胞无害的细菌，即它们为非致病性的。非病原菌为那些对植物而言为有利的或有益的细菌。非病原菌为那些不会导致疾病状态的细菌。疾病状态的症状包括受侵害的植物组织的细胞死亡、维管元件的进行性发病和相邻组织坏死、组织浸软(例如软腐病)和异常细胞分裂。(就更多有关植物病原菌的信息而言，参见“Kado，CI，″PlantPathogenic Bacteria”in M.Dworkin等，eds.，The Prokaryotes：An Evolving Electronic Resource for the MicrobiologicalCommunity，2nd  edition，release 3.0，21May 1999，Springer-Verlag，New York，http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/。)使用非病原菌的一些优点包括转化质量提高和易于使用、坏死或褐变最少或没有这些情况和缺乏过敏性坏死反应。此外，本发明的细菌与土壤杆菌属相比较可以有效地与其它植物物种发生相互作用，从而为利用不同的充分演化的细菌-植物相互作用提供了巨大机会并且可以将它们转变成基因转移系统。当打算针对指定的真核生物物种进行转化实验时，特别是如果它就是已知难以使用土壤杆菌属转化的物种，那么这些细菌由此提供了进行选择的有价值的备选方案。
用于本发明的细菌与植物组织发生相互作用。尽管根伴随细菌根瘤菌可能是人所共知的，但是用于本发明的细菌可以与任何植物组织，诸如根、叶、分生组织、生殖器官和茎相伴。它们还可以为植物内生的。这类细菌包括，但不限于中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、苍白杆菌属(Ochrobacter)、欧文氏菌属和芽孢杆菌属的种。
为伴随植物的细菌的众所周知的非致病性种类之一包括根瘤菌，即固定氮的细菌。根瘤菌包括一组革兰氏阴性菌，它们具有在根上，或在某些情况下在豆科植物(例如大豆、豌豆、小扁豆和花生)茎上产生根瘤的能力。目前存在分类的几个属和接近40个种的根瘤菌，将它们中的一些列在图1中。这些属代表了α-蛋白菌的第2亚群中的不同科(Gaunt等，IJSEM 51：2037-2048，2001)。这包括根瘤菌属、中华根瘤菌属、异根瘤菌属(Allorhizobium)、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属、固氮根瘤菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)等属中的种。
分子数据，诸如rDNA基因序列的相似性有助于目前的细菌分类观点。由于在获得更多数据时分类系统的流动性，所以鉴定菌种的最佳方法之一为16S rDNA基因的核酸序列同一性(相似性)；额外基因座的序列已经证实了基于16S rDNA的系统发育(Gaunt等，IJSEM51：2037-2048，2001)。因此，细菌的属和种的名称在分类校订时随时间而改变。例如，通过比较rDNA基因，发现根瘤土壤杆菌是与放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)相同的种并且目前为该名称。“名字表示的是什么？我们取名为玫瑰之物/换句话说就是会发出香气”(William Shakespeare，Romeo and Juliet，act 2，sc.1，1.75-81599)。
细菌可以获自土壤样品、植物组织、种质库、菌株保藏所和商品来源等处。用于培养不同细菌的条件为众所周知的。可以检测细菌的抗生素敏感性以便找到允许在防止其它细菌生长的选择性条件下生长的合适的抗生素。通过将测试细菌平板接种在含有不同浓度的抗生素的固体培养基上并且对菌落进行计数来确定抗生素抗性和敏感性。或者，可以通过每隔一段时间测定培养基中细菌的数量来确定在有不同抗生素存在和不同浓度下的生长率。易于通过在允许固体培养基上平板接种并且对菌落进行计数或通过分光光度吸收度测定来确定细菌数量和生长曲线。
通过分子技术可以便利地确定本发明细菌的种。本领域中普遍使用的方法是将获自该细菌的rDNA序列与根据已知细菌属或种确定的rDNA序列进行比较，不过，代替rDNA序列或除了rDNA序列外还可以使用其它基因序列。正如实施例中证实的，通过将16S rDNA、recA和atpD核苷酸序列与序列数据库比较来鉴定方案中使用的细菌；所有这些基因序列已经预先用于细菌中的系统发育研究(Gaunt等，IJSEM51：2-37-2048，2001)。一般通过对基因组DNA的扩增片段进行测序获得序列。用于扩增这些基因和许多其它基因的共有引物可以在文献中找到(例如(Tan等，Appl.Environm.Microbiol. 8：1273-1284，2001)；(Gaunt等，IJSEM 51：2037-2048，2001))或可以基于对来自相关种的序列进行序列比对进行设计。鉴定基于序列之间的匹配，如果至少为90％，至少为95％或至少为99％，那么是最佳的。
为便于快速证实可用于本发明的菌株或多种菌株，还可以通过使用种-特异性或属-特异性引物序列鉴定菌种。它们可以包括特异性扩增至少部分16S rDNA区、其它染色体区和质粒携带的序列的引物。对广泛收集的细菌菌株(例如那些用于实验室的菌株)测试引物，并且仅那些扩增来自预计的种，而非来自其它种的正确产物的引物用于随后的鉴定评价。
在本发明的一个方面中，用于基因转移的细菌应能够获得和维持质粒。在某些实施方案中，该质粒为功能性的Ti质粒或至少部分Ti质粒。作为控制由土壤杆菌属导致的植物中的冠瘿病的研究的组成部分，Teyssier-Cuvelle等(Molec.Ecol.8：1273-1284，1999)研究了可以通过接合从土壤杆菌属细胞获得和维持Ti质粒的细菌的土壤微生物区系。通过扩增rDNA基因并且与rDNA基因序列数据库比较来确定转接合细菌的分类。作者鉴定了两种新的用于实施例中的菌种，它们与中华根瘤菌属和根瘤菌属极为接近。可以修饰由本发明细菌获得和维持的Ti质粒以便增加其在某些种中的摄取或稳定性或这两者。例如，可以通过下列方式修饰Ti质粒：插入在这些菌种中识别的复制起点或使得所述质粒变为可移动的转移起点(oriT)，或除去某些基因或使其突变，所述基因对基因转移而言并非必需的或者其中所说的除去或突变可以改善Ti质粒的稳定性或其移动至其它细菌。
细菌还应能够诱导或组成型表达参与所关注的DNA序列转移的基因。这些基因为由vir操纵子编码的毒力基因或该毒力基因的同源物，诸如tra基因。当使用vir基因时，一般通过由受伤的植物细胞天然释放的酚类化合物或化合物，例如乙酰丁香酮的作用进行诱导，将所述化合物添加到细菌在外植体感染前生长的培养基中。证实vir基因、tra基因或其它同源物得到表达的任何方式都可以用于建立功能性。典型方式包括使用特异性抗体对蛋白质进行的蛋白质印迹分析、对与任何基因的启动子连接的报道基因(例如使用vir启动子-lacZ融合体)表达的分析或与报道基因，诸如绿色荧光蛋白融合的蛋白质(例如virD4或virE2)的细胞定位的显微镜观察。或者，可以在乙酰丁香酮诱导细菌培养物后，使形成的单链转移中间体，诸如T-DNA分子直接在诸如含有未消化基因组DNA的DNA印迹上显现。
发现可维持第一种核酸分子，诸如去甲型Ti质粒的细菌应能够表达将所关注的DNA序列转移至植物细胞中所涉及的基因。在一个实施方案中，将所关注的DNA序列装配在T-DNA质粒上，在其上，这些基因位于一个或两个T-DNA边缘的侧翼。T-DNA边缘为virD2蛋白切割T-DNA质粒的位点，导致形成松弛小体(T-复合物)，然后通过virB跨膜复合物被转移至植物细胞。
在另一个实施方案中，将所关注的DNA序列装配在不具有T-DNA边缘，而是含有执行T-DNA边缘相同功能的一种或两种序列的质粒上，即所述质粒含有用于切割和切除含有所关注的DNA序列的单链DNA区的位点(Waters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1456-1460，1991；Ward等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9350-9354，1991)。这些切割位点可以由质粒，诸如RSF1010或CloDF13的转移起点(oriT)区组成，已经证实这两种质粒被virB跨膜复合物转运(Buchanan-Wollastan等，1987；Escudero等，2003)。就T-DNA边缘而言，可以存在一个或多个oriT区。如果存在两个oriT区，那么一个oriT区一般位于所关注的DNA序列的任一侧。使用非-T-DNA移动性载体将所关注的DNA序列从土壤杆菌属细胞转移至植物和酵母细胞的操作步骤已经描述在WO2001/064925A1(Escudero等，Mol.Microbiol 47：891-901，2003)中。该载体来源于有限宿主范围的质粒CloDF13，它含有来自CloDF13的oriT和mobB和mobC基因以及含有GUS基因的植物表达盒，并且通过募集土壤杆菌属的毒力器而被移动至植物细胞。经证实转化的植物组织表达GUS活性。
在另一个实施方案中，用于本发明的细菌能够维持由并非完整Ti质粒的广宿主范围质粒上的virB操纵子编码的土壤杆菌属Ti质粒转移基因和可能的其它vir基因。此外，它们能够维持含有待转移至植物细胞的所关注的基因的第二种移动性质粒，例如WO 2001/064925中使用的CloDF13的衍生物。
此外，本发明的细菌以一种或另一种方式附着于植物组织或接触细胞，以便将所关注的DNA转移至植物细胞。就未知附着于或与植物细胞发生相互作用的菌株而言，可以通过许多方法评价附着或接触的验证。例如，可以使用荧光蛋白标记细菌并且与植物组织一起孵育；然后可以通过荧光显微镜检查来观察附着情况。或者，还可以评价T-DNA转移或整合中所涉及的细菌蛋白(例如virD2、virE2、virF)的转移或T-DNA整合中所涉及的植物基因(例如RAT5)的诱导。
核酸分子，包括质粒的制备
使用上述和本文所述的核酸分子转染细菌。在本章节中，从质粒方面描述核酸分子的制备。就含有并非质粒的核酸分子(例如整合入细菌基因组的)的细菌而言，一般将质粒用作起始材料。
在本发明的一个方面中，使用两种质粒载体。所述的载体为：(i)广宿主范围的小复制子，它通常具有允许在广泛细菌，包括大肠杆菌(E.coli)和本发明的细菌中维持的质粒的复制起点(oriV)；和(ii)第二种质粒，当它为Ti质粒时，被认为是″去甲型″，因为其位于T-DNA中诱导肿瘤的基因已经被除去(美国专利US4,940,838、5,149,645和5,464,753)。
第一种质粒含有可操作地与左和右T-DNA边缘(或至少右T-边缘)连接的所关注的DNA序列。当使用两种边缘序列时，所关注的DNA序列位于所述边缘序列之间。当仅使用一种边缘序列时，所关注的DNA序列位于与待转入靶真核细胞的位置足够近和该位置上。为了表达所关注的序列，这些序列处于启动子控制下。典型质粒的示意图如图2中所示。在某些实施方案中，该质粒具有能够形成松弛小体的序列(US2003/0087439A1)。典型移动性质粒来源于RSF1010(Scholz等，基因75(2)，271-288，1989，GenBank  登录号M28829)和CloDF13(Escudero等，Mol Microbiol.47：891-901，2003；GenBank登录号NC002119)。
第二种质粒一般为广宿主范围质粒，并且包括Ti质粒vir基因的至少一部分或同源基因，诸如tra基因。尽管一般使用完整的vir基因或tra基因区(或其它功能性同源物)，但是这些基因中的一种或多种可以被缺失或被另一种同源物置换，只要剩余的基因足以导致所关注的DNA序列的转移。载体还可以含有用于在细菌中维持的oriV和选择标记。当将核酸分子整合入细菌染色体或其它自我复制的细菌DNA分子时，oriV并非必不可少的。
一般而言，含有所关注的DNA的载体也含有用于鉴定转化体的选择或筛选标记。所述的标记可以在适当条件下提供生长优势。某些众所周知的选择标记为药物抗性基因，诸如新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、除草剂抗性基因等。诸如在正选择中，可以选择性地使用其它选择系统，包括编码对其它毒性化合物的抗性的基因；编码细胞生长所需产物的基因。这些“正选择”系统的实例是大量的(例如，参见美国专利US 5,994,629)。或者，可以使用允许基于视觉表型，例如β-葡糖醛酸糖苷酶或绿色荧光蛋白(GFP)表达选择转化细胞的筛选标记。选择标记一般还具有基因转录所必需的可操作连接的调节元件，例如组成型或诱导型启动子和终止序列，包括聚腺苷酸化信号序列。任选包括提高转录效率的元件。
适用于本发明的典型小复制子载体基于pCAMBIA1305.2。已经描述了其它载体(美国专利US 4,536,475；5,733,744；4,940,838；5,464,763；5,501,967；5,731,179)或可以基于本文提供的指导原则构建它们。pCAMBIA1305.2质粒含有用于整合入植物宿主染色体的左和右边缘序列，并且还含有细菌复制起点和选择标记。这些边缘序列位于两种基因的侧翼。一种为由双CaMV 35S启动子驱动并且使用胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点的潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸转移酶或HYG)。第二种为来自多种生物体的任一种，诸如大肠杆菌、葡萄球菌属(Staphyloccocus)、海栖热袍菌(Thermatoga maritima)等的在CaMV 35S启动子和胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(报道基因)。如果合适，CaMV 35S启动子被不同启动子置换。另外插入上述表达单位的一种或插入该表达单位以代替GUS或HYG基因弹夹。
含有将来自在土壤杆菌属的DNA转移至植物细胞所必需的基因的Ti质粒还可以在其它属的细菌中复制。特别是，Ti质粒可以在根瘤菌中复制，并且是稳定的(即不易于从细菌中消除)。在本发明的情况下使用的典型根瘤菌包括豌豆根瘤菌三叶草变种(Rhizobiumleguminosarum bv.Trifolii)(上文的豌豆根瘤菌)、根瘤菌属的种类NGR234、百脉中间根瘤菌、紫金牛叶杆菌和苜蓿中华根瘤菌(上文的苜蓿根瘤菌)，它们均能够支持和表达Ti质粒的基因。在一个实施方案中，通过插入另一种复制起点，一般为广宿主范围复制起点，诸如RK2复制起点来修饰Ti质粒，以便使Ti质粒在某些细菌中更为稳定。因此，当适当修饰和改造时，这些细菌可以用于将核酸序列转入真核细胞，尤其是转入植物细胞。
包含在本发明细菌中的辅助Ti质粒缺乏完整的T-DNA区，但含有vir区。为了有助于构建既具有小复制子质粒(或移动性质粒)，又具有Ti质粒的细菌菌株，Ti质粒可以含有选择标记、相容性复制起点和多个virG序列。尽管选择标记在这两种质粒上可以相同，但是更典型的是这些标记不同，以便有利于证实这两种质粒的存在。辅助质粒或小复制子或移动性载体可以任选含有至少一种额外的virG基因和任选含有修饰的virG基因。可以通过多种方法中的任一种将额外的virG基因插入Ti质粒，所述的方法包括使用转座子和同源重组(Kalogeraki和Winans，基因188：69-75，1997)。可以通过任何方法诱导同源重组，包括使用携带Ti质粒(例如virG基因)的克隆片段的自杀质粒或例如通过不相容性促使与Ti质粒重组的稳定复制子。此外，在含有virG的片段上可以包括编码抗生素抗性的基因。Ti质粒的其它序列可以类似地(完全或部分)被复制或被除去，包括对本申请的目的而言趋向于不重要的大区域。可以任选包括转移起点，诸如RK2/RP4的oriT(Stabb和Ruby，Enzymol.358：413-426，2002)。这种类型的转移起点允许借助于RK2/RP4或类似载体，包括衍生物的转移功能使Ti质粒移动至其它细菌，例如根瘤菌。
典型的辅助质粒为pTiBo542。还对这种高毒力的质粒进行了完整测序(P.Oger，数据未公布)。已经广泛使用了去甲型衍生物pEHA101和pEHA105(Hood等，J.Bacteriol.168：1291-1301，1986；Hood等，Transgenic Research 2：208-218，1993)。其它辅助质粒包括LBA4404、pGA系列、pCG系列中的那些等(参见Hellens和Mullineaux，“土壤杆菌属二元Ti载体指南”-Trends Plant Sci.5：446-451，2000).
例如，在美国专利US 4,693,976、5,731,179和EP 116718B2中充分描述了共整合载体的构建。
细菌的转染
一般而言，通过接合或通过直接转移法将质粒转入本发明的细菌。通过将来自高度转化-感受态土壤杆菌属的适当去甲型Ti‘辅助’质粒(例如来自EHA105的pEHA105)和修饰的基因转移T-DNA载体(例如pCAMBIA1305.1)(或移动性质粒)转移至本发明的细菌，产生转化感受态细菌。这些细菌可以用于转化植物和植物细胞。
可以通过生物学方法，诸如接合或通过物理方法，诸如电穿孔或PEG(聚乙二醇)介导的方法从含有Ti质粒的土壤杆菌属(或其它根瘤菌)转移第一种质粒，例如Ti质粒。当将来自根瘤土壤杆菌的质粒转移至选择的细菌(例如根瘤菌)菌株时，如果土壤杆菌属具有染色体负选择标记，诸如辅源营养或抗生素敏感性，那么可辅助该操作步骤。可以通过缺失质粒上的accR和/或traM基因获得Ti质粒的组成型接合能力(Teyssier-Cuvelle等，Molec.Ecol.8：1273-1284，1999)。否则，可以通过使用在冠瘿病中天然产生的特异性冠瘿氨基酸或使用可以(暂时)与Ti质粒形成共整合物的自我转移R质粒(例如R772或RP4)进行接合的诱导。如果已经通过插入外源性oriT，例如RP4/RK2的oriT改造了Ti质粒，那么可以借助于在质粒或其染色体上含有相容性转移功能的细菌菌株，例如大肠杆菌进行一种细菌与另一种细菌的接合。该过程可以在供体、受体和辅助菌株之间的三亲接合中或在含有转移基因的供体与受体之间的双亲接合中完成。将细菌转入选择培养基并且将推定的转接合子进行充分的平板接种以便分离单细胞克隆。在转接合后，可以对土壤杆菌属进行选择。如果土壤杆菌属对受体细菌耐受的抗生素敏感，无论是天然抗性的还是作为具有小复制子质粒结果抗性的，那么该抗生素可以用于选择受体细菌菌株。类似地，如果使用辅助菌株，那么可以通过使用受体细菌耐受的相同或不同抗生素对其进行选择。还可以通过例如由转座子载体介导的整合提供抗生素抗性的外源基因，使这些辅助菌株成为抗生素抗性的。类似地，可以通过选择Ti质粒排除尚未接纳Ti质粒的细菌。一般而言，这种选择也将是抗生素选择，但依赖于Ti质粒中的选择标记。
可以通过任何合适的方法验证Ti质粒的存在，不过，为方便起见，通常使用vir基因或任何其它Ti质粒序列的扩增。可以在使用多种试验中的任一种，应用乙酰丁香酮诱导后，检查新宿主中Vir基因的表达，所述的试验诸如RNA印迹分析、RT-PCR、实时扩增、微阵列上的杂交、蛋白质印迹、对来自与vir基因的启动子连接的报道基因的基因表达的分析等。
还可以在不使用土壤杆菌属作为供体菌株的情况下将Ti质粒转移至其它细菌。例如，已经通过一种或另一种方式获得了Ti质粒的根瘤菌菌株可以作为其它细菌受体菌株的Ti质粒的供体。在某些情况下，这可避免干扰存在于许多细菌(即使并非所有细菌)中的限制性内切核酸酶系统。
代替接合，可以将Ti质粒电穿孔入受体细菌。已经描述了Ti质粒的分离和对其它土壤杆菌属菌株，例如对Ti质粒消除的菌株LBA288的电穿孔(Mozo等，Plant Mol.Biol.16：617-918，1990)。类似地，可以对其它菌种进行电穿孔。
为了转移小质粒或一般为小质粒的移动性二元载体，便利地使用电穿孔。二元载体应与Ti质粒相容，并且对两者进行选择。可以通过扩增或通过从细菌中再分离质粒并且通过限制性消化分析质粒DNA来证实二元载体的存在。
真核细胞的转化
可以在本发明的情况下转化真核细胞。此外，可以使用单独的细胞或细胞聚集物，诸如器官或组织或器官或组织的一部分。一般而言，在转化前培养待转化的细胞或组织，或可以在原位转化细胞或组织。在某些实施方案中，在有添加剂存在下培养细胞或组织以便使它们更易受转化。在其它实施方案中，从生物体中切下细胞或组织并且在没有预先培养的情况下进行转化。
作为待转化的细胞或组织来源的合适的真核生物包括植物、真菌和酵母。可以使用土壤杆菌属转化酵母细胞并且因此在本发明的情况下可以将这些酵母细胞用于测定和用于优化条件。使用酵母的优点在于酵母的快速生长和它在实验室条件下生长的能力。易于根据转化体改变的表型检测它们，例如在缺乏必需生长成分的培养基上生长，而未转化的细胞不能在该培养基上生长。然后通过对生长在选择培养基上的菌落的数量进行计数来量化转化率。通过土壤杆菌属进行酵母细胞转化不依赖于对植物转化而言必需的附着基因的表达，并且通过使用自主复制DNA单元(微型染色体)可以避免对基因整合(如果需要)的需求。附着的解偶联和来自全部基因转移过程中的DNA整合可以简化通过其它细菌进行的转化的优化。例如，在将Ti/T-DNA质粒转移至这些细菌后，可以通过遗传互补，使用转移至含pTi的细菌的根癌土壤杆菌基因组文库优化该系统。然后将该细菌文库用于转化酵母细胞并且选择最有效转化的细菌克隆。
或者，当对根瘤土壤杆菌和某些菌种已经完全测序并且可以比较时，在对用土壤杆菌属转化而言重要的后者细菌中缺失的基因可以从土壤杆菌属基因组中单独挑选出来并且通过任何方式插入细菌基因组或在质粒上表达。类似地，可以将这些细菌用于在各种试验条件，诸如温度、pH、营养添加剂等下转化酵母细胞。可以快速确定最佳条件且然后在植物细胞或其它真核细胞的转化中测试。
简言之，在典型的转化方案中，通过对含有Ti质粒和二元载体的细菌培养物与叶片、原生质体、分生组织或愈伤组织共培养转化植物细胞，以便产生转化的植物(Bevan，Nucl.Acids.Res.12：8711，1984；U.S.Patent No.5,591,616)。在共培养几天后，例如，通过洗涤并且用抗生素处理除去细菌，并且将植物细胞转移至一般含有抑制或杀伤细菌生长的抗生素(例如头孢噻肟)和诸如描述在美国专利US5,994,629中的任选选择剂的培养后的培养基平板。将植物细胞进一步孵育几天。此时可以测试转基因的表达。在选择培养基中进一步孵育几周后，将愈伤组织或植物细胞转移至再生培养基并且置于光照下。将幼苗转移至生根培养基并且将所得植物转入温室。
植物细胞转化的备选方法包括将完整的花浸入细菌混悬液，使该植物进一步生长至种子形成，采集种子并且使它们在有仅允许转化幼苗生长的选择剂存在下发芽。或者，用仅转化植物耐受的除草剂处理发芽的种子。
重要的是要注意用于本发明的菌种可以以特异性方式与许多植物发生天然相互作用。这些细菌-植物相互作用与土壤杆菌属天然与植物发生相互作用的方式极为不同。因此，通过土壤杆菌属可转化的组织和细胞在使用其它细菌的情况下可以是不同。尤其适于转化的某些植物细胞类型包括分生组织、花粉和花粉管、种子胚、花、胚珠和叶。尤其适于转化的植物包括玉米、稻米、小麦、大豆、苜蓿和其它豆科植物、马铃薯、番茄等。
转化系统的使用
本文所述的生物转化系统可以用于将一种或多种所关注的DNA序列(转基因)导入真核细胞且尤其是导入植物细胞。尽管通常为基因序列，但是所关注的序列实际上可以为任何核酸序列，无论它是否产生蛋白质、RNA、反义分子或调节序列等。导入植物的转基因可以编码影响能育性，包括雄性不育性、雌性生殖力和无融合生殖的蛋白质；植物保护基因，包括提供对疾病、细菌、真菌、线虫、除草剂、病毒和昆虫的抗性的蛋白质；影响发育过程或提供新表型的基因和蛋白质，诸如控制分生组织发育、花期、细胞分裂或衰老(例如，端粒末端转移酶)、毒性(例如，白喉毒素、肥皂草毒蛋白)，影响膜透性(例如，葡糖苷酸通透酶(美国专利US5,432,081))、转录激活物或阻抑物，改变营养质量，生产疫苗等的基因和蛋白质。昆虫和疾病抗性基因为众所周知的。这些基因中的某些存在于植物基因组中并且已经进行了遗传鉴定。在细菌中发现了这些基因中的另一些并且用于提供抗性。特别是众所周知的昆虫抗性基因为编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的晶体蛋白的基因。该晶体蛋白对各种昆虫，诸如鳞翅目(lepidopterans)、双翅目(Diptera)、半翅目(Hemiptera)和鞘翅目(Coleoptera)都具有活性。已经克隆了这些基因中的许多。例如，参见GenBank；美国专利US 5,317,096；5,254,799；5,460,963；5,308,760，5,466,597，5,2187,091，5,382,429，5,164,180，5,206,166，5,407,825，4,918,066。在本发明的情况下对核盘菌属(Sclerotinia)、包囊线虫、烟草花叶病毒、亚麻锈病和冠锈病、稻瘟病、白粉病、黄萎病、薯虫、蚜虫以及其它感染的其它抗性基因是有用的。用于其它转基因，诸如控制雄性能育性的核苷酸序列可在美国专利US 5,478,369和其中的参考文献以及Mariani等，Nature347：737，1990中找到。
用于转化植物的其它转基因包括制备用于人或动物的可食用疫苗的序列(例如美国专利：US 6136320，US 6395964)，改变脂肪酸含量的序列，改变食物作物的氨基酸组成的序列(例如美国专利US6,664,445)，导入合成维生素，诸如维生素A和维生素E途径中的酶的序列，提高铁浓度的序列，控制果实催熟的序列，减少例如小麦和坚果的变应性的序列，吸收和贮存毒性和有害物质以便有助于清除被污染的土壤的序列，改变木材的纤维含量的序列，提高耐盐性和耐旱性等的序列。
在诱导后，可以在选择的组织中或在发育的某些阶段以组成型方式产生所关注的DNA序列的产物。进行这类表达的调节元件为本领域众所周知的。调节元件的许多实例可以在CAMBIA IP Resource文件“用于调节基因表达的启动子”1.0版，2003年10月中找到。
提供下列实施例是为了解释，而决非起限制作用。
具体实施方式
实施例1
可以转移DNA的菌种的鉴定
测试趋异细菌以便鉴定能够转化DNA的菌种。菌株获自公共种质库或分离自土壤、其它自然环境或任何植物组织。通过扩增和测序信息基因，包括rDNA基因atpD和recA来鉴定菌种(Gaunt等，IJSEM51：2037-2048，2001)。将扩增产物的DNA序列与具体细菌的公知序列进行比较。此时，存在的具有预计大小的扩增产物可以用于鉴定。
如上所述，合适的菌种以一种或另一种方式与植物发生天然相互作用。它们包括与植物伴生的植物内生细菌，诸如根瘤菌，已知它们可用于固定氮并且能够为植物所利用。还包括可以附着于植物并且具有有益的或中性的与植物相互作用的细菌，即附生菌。
测试了下列菌种：根瘤菌属的种类NGR234(链霉素抗性菌株ANU240)，苜蓿中华根瘤菌菌株1021、百脉中间根瘤菌MAFF 303099、紫金牛叶杆菌、大豆慢生根瘤菌USDA110、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)(保藏号WAC 1664)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(保藏号WAC 1650)。所有菌株均获自公共种质库(WAC，Plant Research Division Culture Collection，Western AustralianDepartment of Agriculture Baron-May Court，South Perth，WA 6151Australia)，但除外紫金牛叶杆菌菌株，其为自发实验室分离物。
通过对16S rDNA基因以及分别编码膜ATP合酶的β-亚单位和DNA重组和修复系统的一部分的atpD和recA基因进行扩增和测序来鉴定菌种(Gaunt等，IJSEM 51：2037-2048，2001)。用于扩增和测序部分16SrDNA基因的引物序列为SEQ ID NOS：47-50，用于atpD基因的引物序列为SEQ ID NOS：51-52，且用于recA基因的引物序列为SEQ IDNOS：53-54。荻自对为测定的菌株产生的扩增产物测序的核苷酸序列如图3A-F和图4中所示。这些序列在与基因序列数据库，例如GenBank比较时揭示出分别与根瘤菌属的种类NGR234、苜蓿中华根瘤菌菌株1021、百脉中间根瘤菌MAFF 303099、紫金牛叶杆菌和大豆慢生根瘤菌USDA110的最高相似性。
通过扩增染色体上和基因组巨大质粒部分上的信息基因靶并且通过凝胶电泳在有或没有预期的扩增产物存在下评分进行额外的菌株鉴定。这类扩增可以快速证实操作步骤过程中的菌株基因型并且证实根瘤菌中的质粒，诸如一种或多种巨大质粒，通常称作共生质粒(pSym)或土壤杆菌属中的Ti质粒和巨大质粒，称作pAT质粒的获得、丧失或维持。
本文使用的基因型分型引物由扩增至少部分染色体编码的16SrDNA基因和其它细菌基因的菌株-或种-特异性引物组成。为了设计合适的引物序列，从GenBank中检索靶向基因的核苷酸序列并且进行序列比对。理想的情况是，进行比对的序列包括来自尽可能多的菌种的基因，并且还包括根瘤土壤杆菌的基因。从序列比对中选择特异性扩增来自仅一个菌种或其亚群的序列的引物序列。选择种特异性引物对，以便在通过凝胶电泳分离时，扩增的产物具有不同的大小，从而使得易于在单一或多元反应过程中对它们进行评分。
靶向于快速基因型分型的染色体基因包括，但不限于16S rDNA基因和存在于环状染色体上的根瘤土壤杆菌的attS基因。用于鉴定存在于细菌中的巨大质粒的特异性引物包括那些靶向根瘤菌属的种类NGR234中的单一pSym质粒上的NodD1基因，分别存在于苜蓿中华根瘤菌的pSymA和pSymB质粒上的NodQ和NodQ2基因和存在于两个百脉中间根瘤菌巨大质粒pMLa和pMLb上的两个repA基因座的引物。按照这类方式设计所有这些质粒引物，以便它们选择性扩增且由此仅鉴定特定的巨大质粒。其它引物使用土壤杆菌属Ti质粒上的virG和virB基因的扩增部分和存在于在大部分(即使不是全部)土壤杆菌属菌株中发现的pAT巨大质粒上的attS基因拷贝。选择产生不同大小扩增产物的所有引物，以便易于评价凝胶上的PCR产物。选自来自不同细菌的相关基因的序列比对的引物序列如表1中所示。
用于扩增的模板为通过下列步骤获得的煮熟的菌落：使用移液管尖端从平板上的菌落中吸取一些细胞，将它们重新悬浮于含有100μL无菌水的试管中，煮沸3分钟并且在室温下冷却粗DNA制品。然后将4μL该制品用于20μL扩增反应。或者，可以通过任何公知方法分离纯化的或更大量富集的DNA。对不同菌种和菌株严格测试所有引物并且使用相同扩增程序利用这些引物，所述的扩增程序由在94℃下初始变性1分钟，然后94℃下30秒、58℃下30秒和72℃下1分钟的35个循环以及在72℃下最终延伸2分钟组成。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增反应的产物并且通过与已知大小的DNA条带的梯进行比较来确定其大小。证实测定的菌株获得的产物大小是否符合对该菌株预计的大小。
一般而言，使细菌菌株生长在选择培养基上。为了找到用于本实施例中测试的菌株的合适的选择生长条件，将细胞混悬液完全涂布到含有几种不同抗生素之一(25、50、100和/或200mg/L)或利福平(100mg/L)的酵母甘露糖醇(YM)琼脂培养基上并且孵育长达7天。每个平板铺展至少104个细胞。在孵育后，记下菌落数量(条件是＜10)或对细菌(+)相对生长估计值进行评分。
大豆慢生根瘤菌USDA110对艮他霉素(25mg/L)、利福平(100mg/L)具有耐药性并且对链霉素(200mg/L)具有中度耐药性。百脉中间根瘤菌MAFF 303099对所有测试的抗生素都敏感。苜蓿中华根瘤菌1021和根瘤菌属的种类NGR234(菌株ANU240)对链霉素(200mg/L)具有耐药性并且对艮他霉素(25mg/L)和利福平(100mg/L)具有轻度耐药性。紫金牛叶杆菌菌株对卡那霉素(50mg/L)、氨苄西林(100mg/L)、氯霉素(100mg/L)和链霉素(200mg/L)具有耐药性。还对细菌菌株测试了在LB琼脂平板上的生长。所有测试的细菌均可以在LB培养基上生长，不过，生长速度和菌落形态有所不同。类似地，可以测试其它培养基，例如合成基本培养基，并且可以检验其它抗生素或生长培养基成分，诸如不同的糖类或维生素。优先地且为了避免培养任何污染微生物，使细菌生长在为使用的特定菌株选择的条件下。因此，使根瘤菌属的种类和苜蓿中华根瘤菌生长在YM+strep200上，使紫金牛叶杆菌生长在YM+Km50上，使大豆慢生根瘤菌生长在YM+Rif100上并且使百脉中间根瘤菌生长在普通的YM平板上。
为了找到用于消除植物转化实验后的细菌的合适条件，使细菌菌株生长在含有不同浓度头孢噻肟、特美汀和拉氧头孢的平板上，这三种常用的抗生素用于对土壤杆菌属进行反选择。结果表明使用低浓度的头孢噻肟(50mg/L)完全抑制了除苜蓿中华根瘤菌外所有测试菌株的生长；使用200mg/L的拉氧头孢或使用头孢噻肟与特美汀(两者均为100mg/L)的组合可以抑制苜蓿中华根瘤菌的生长。
将已知浓度的土壤杆菌属加入到如根据连续稀释后的菌落计数确定的也为已知浓度的根瘤菌培养物(根瘤菌属的种类、苜蓿中华根瘤菌或百脉中间根瘤菌)中。将1ml含有109cfu/mL根瘤菌种与106-100cfu土壤杆菌属的混合物铺展在LB培养基上并且在28℃下培养2-3天。土壤杆菌属以快于根瘤菌种的速率生长。培养2天后，易于在根瘤菌生长薄膜中检测单个土壤杆菌属菌落(例如在含有根瘤菌菌苔的单个平板上，可以观察到10个土壤杆菌属的菌落)。
使用根瘤菌种的转化实验可以通过在LB培养基上培养1mL孵育培养基(一般含有109cfu的根瘤菌)利用这种差别生长速率，以便监测土壤杆菌属污染。此外，在典型转化实验中，用无菌液体洗涤共培养平板，然后在LB上培养以便监测土壤杆菌属污染。
  表1
种/菌株 基因组位置 基因 引物 序列5′-3′   长度(NTS)   产物大小(BP)   SEQ IDNo.
  根癌土壤杆菌   染色体(环状+线性)   16S rRNA   Atu16SFW2   23   320   22
  Atu16SREV   CGGGGCTTCTTCTCCGACT   19   21
环状染色体 AttS   attScircFW   CAGGCTCAAACCGCATTTCC   20 436   23
  attScircREV   GTAAGTCCAGCCTCTTTCTCA   21   24
Ti质粒   VirG   AtuvirGFW   CGCTAAGCCGTTTAGTACGA   20   520   27
  AtuvirGREV   CCCCTCACCAAATATTGAGTGTAG   24   28
  virB操作子下游   VirBFW   TGACCTTGGCCAGGGAATTG   20 947   31
  VirBREV   TCCTGTCATTGGCGTCAGTT   20   32
  NptI(仅在EHA101中)   NptIFW   CAGGTGCGACAATCTATCGA   20   633   29
  NptIREV   AGCCGTTTCTGTAATGAAGG   20   30
AT质粒 AttS   attSpATFW   GTGCTTCGGATCGACGAAAC   20 631   25
  attSpATREV   GGAGAATGGGAGTGACCTGA   20   26
  根瘤菌属的种类NGR234(ANU240)   共生质粒   NodD1   NGRNodD1FW   GCCAGAAATGTTCATGTCGCACA   23   350   35
  NGRNodD1REV   AATGGGTTGCGGAAGTTCGGT   21   36
  苜蓿中华根瘤菌1021 染色体 16S rRNA(1)   Sme16SFW   TGTGCTAATACCGTATGAGC   20 820   33
  Sme16SREV   CAGCCGAACTGAAGGATACG   20   34
pSymA NodQ   SmeNodQFW   GACAGGATCCTCCACGCTCA   20 420   37
  SmeNodQREV   CGCCAGGTCGTTCGGTTGG   18   38
pSymB NodQ2   SmeNodQFW   GACAGGATCCTCCACGCTCA   20 360   37
  SmeNodQ2REV   GCTCATAGGGCGAGGATACA   20   39
  百脉中间根瘤菌MAFF303099   染色体   16S rRNA   Mlo16SW   CCCATCTCTACGGAACAACT   20   500   55
  Mlo16SREV   ACTCACCTCTTCCGGACTCG   20   56
pMLa RepC   MlopMLaRepCFW   GACGGCCGAGCCAAGGACGA   200
MlopMLRepCREV CACATGGCAAGCCTCCTCA   2019   5857
pMLb RepC   MlopMLbRepCFW   GATGCTGGAAAGCTTCACAAGT   22 320   59
  MlopMLRepCREV   CACATGGCAAGCCTCCTCA   19   58
(1)这些引物还扩增NGR234菌株ANU240中的16S rRNA基因。
  紫金牛叶杆菌菌株WB1   染色体   16SrRNA   Pmy16SFW   CTGGTAGTCTTGAGTTCGAG   20 400   60
  Pmy16SREV   CCAGCCTAACTGAAGGAAAC   20   61
DNA促旋酶B   PmyGyrBFW   CTGGCTGCGTCTCAAGATTC   20 544   62
  PmyGyrBREV   CCTTTGCCTTCTTCGCCTGC   20   63
  大豆慢生根瘤菌USDA110   染色体   16S rRNA   Bja16SFW   GGGCGTAGCAATACGTCA   18 600   64
  Bja16SREV   CTTCGCCACTGGTGTTCTTG   20   65
(1)这些引物还扩增NGR234菌株ANU240中的16S rRNA基因。
实施例2
可以用作Ti质粒供体的土壤杆菌属菌株的鉴定、Ti质粒的分离和通过电穿孔转移至其它细菌
用作Ti质粒来源的土壤杆菌属菌株为高毒力菌株EHA105，它含有Ti质粒pEHA105，即去甲型pTiBo542衍生物(Hood等，TransgenicResearch 2：208-218，1993)。为了确认该菌株，为16S rDNA基因(SEQID NOS：22-23)和环状染色体(SEQ ID NOS：23-24)或pAT巨大质粒(SEQIDNOS：25-26)上的attS基因设计土壤杆菌属特异性基因型分型引物。还设计了用于扩增Ti质粒上的序列，即virG(SEQ ID NOS：27-28)和virB基因(SEQ ID NOS：31-32)的引物。测试这些引物对土壤杆菌属DNA的特异性和有效扩增。还在由所有为基因转移测定的其它菌种制备的DNA模板上测试了这些引物。结果证实了土壤杆菌属DNA的特异性扩增，但无可检测的从其它细菌模板的扩增。
这些或其它引物组可以用于证实在植物转化过程中使用的细菌培养物、混悬液或任何其它制品中不存在土壤杆菌属细胞。为了确定可在另一菌种培养物中检测到的土壤杆菌属细胞的最低数量。可以进行如下实验。在29℃下使土壤杆菌属的近亲，豌豆根瘤菌三叶草变种(菌株ANU843)的培养物在TY(胰蛋白胨-酵母提取物)培养基中生长至O.D.600为1.0，相当于108-109个细胞/mL。在29℃下使根癌土壤杆菌EHA101生长在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中并且以10倍的等级进行稀释。通过将等分部分平板接种到LB琼脂平板上并且对细胞数量进行计数来确定稀释液各自中的细胞数量。根据这些计算，确定每ml中的细胞数量并且制备在10μL体积中含有20、200、2000和20.000个细胞的连续稀释液。然后准备含有10μL的10-倍稀释的相当于2×105个细胞的根瘤菌培养物和80μL无菌水的4支试管；加入来自各土壤杆菌属稀释液的10μL，使得试管各自分别含有2、20、200和2000个土壤杆菌属细胞。通过在100μL水的总体积中添加2000个土壤杆菌属细胞准备第5支试管，它不含根瘤菌细胞。将全部试管均保持在沸水浴中3分钟以便裂解细胞并且释放DNA。
使用来自来自试管1-5的10μL模板DNA在20μl总体积中进行扩增。扩增混合物含有两组引物(双扩增)，一组对豌豆根瘤菌16S rDNA基因(SEQ ID NOS：18-19)具有特异性，且一组对根癌土壤杆菌16SrDNA基因(SEQ ID NOS：20-21)具有特异性，它们分别扩增豌豆根瘤菌和根癌土壤杆菌中的部分16S rDNA基因并且在凝胶电泳时产生不同大小的产物(分别约700和410bp)。使用在1分钟过程中94℃下的初始变性温度，然后是94℃下30秒、58℃下30秒、72℃下1分钟和在72℃下2分钟过程中的最终延伸的40个循环进行扩增反应。通过电泳分离反应产物并且通过溴化乙锭染色使其显现。
为了分离用于对其它细菌进行电穿孔的Ti质粒，使2mL EHA 101培养物在LB+卡那霉素(50mg/L)中生长至OD600为1.0。EHA101与EHA105极为相似，但含有可对该菌株提供卡那霉素抗性的NptI基因(Hood等，J.Bacteriol.168：1291-1301，1986)。通过适合于分离大质粒的改进的碱性裂解法分离质粒DNA。将培养物以20x稀释入新鲜培养基并且使其再生长2-3小时。通过离心收集细胞(2500xg，10分钟)并且重新悬浮于2mL TE(10mM Tris，pH 8和1mM EDTA)缓冲液中，再次沉淀并且重新悬浮于40μLTE中。将0.6mL新鲜制备的裂解缓冲液(4％在TE中的SDS，pH 12.4)加入到1.5mL Eppendorf管中并且将细菌细胞用移液管吸移入该裂解溶液且谨慎混合。将该混悬液在37℃下孵育2分钟，然后通过添加30μL 2.0M Tris-HCl pH 7.0并且缓慢倒置试管进行中和，直到注意到粘度改变。然后通过添加240μL5M NaCl并且将试管在冰上孵育1-4小时沉淀染色体DNA。在以16000xg离心10分钟后，将上清液倾入新试管并且加入550μL异丙醇以便沉淀质粒DNA。将试管放置在-20℃下30分钟，然后以16000x g离心3分钟。除去上清液并且在室温下干燥沉淀。将沉淀重新悬浮于10μLTE，在4℃下孵育过夜。
通过电穿孔将Ti质粒转入其它细菌。在此我们显示了将pTi转移至为Ti质粒消除的土壤杆菌属菌株LBA288。按照用于根癌土壤杆菌的标准操作步骤，由成指数生长的细胞制备电感受态细胞。将40μl融化的感受态细胞加入到含有10μl重新悬浮的EHA101质粒DNA的试管中，缓慢混合并且转移至冷却的微量吸收池(Bio-Rad，0.1cm电极距离)。通过Bio-Rad的基因脉冲器和脉冲控制器以13kV/cm的场强施加5分钟的单一电脉冲。较低的场强因其较大的能力而一般在电穿孔过程中使用，以便增加Ti质粒转移的效率。在电脉冲后即刻加入600μl SOC并且将细胞混悬液转移至1.5mL Eppendorf管且孵育1小时。然后将100μL等分部分铺展到含有利福平(50mg/L)(就LBA288而言)和卡那霉素(50mg/L)(就Ti质粒而言)的LB琼脂平板上。在28℃下孵育2天后，在平板上观察到菌落。对大量菌落进行扩增以便检验来自EHA101的Ti质粒的存在。图5显示了使用用于染色体、pAT质粒和Ti质粒的引物对两种独立转化体以及供体和受体菌株的分析结果。结果揭示出LBA288菌株已经获得了EHA101的Ti质粒。同样，可以使用适合于每个种的特定的电穿孔条件将Ti质粒电穿孔入其它菌种。通过植物转化实验证实Ti质粒的功能性。
实施例3
移动性Ti质粒的构建
尽管Ti质粒一般为自我接合质粒，但是其在实验室条件下的移动因不存在活化它们的接合器所必需的特定成分和条件而是不方便的。在本实施例中，通过插入RP4/RK2辅助质粒的转移起点(oriT)使得来自EHA105的去甲型Ti质粒成为传递性的。还将抗生素抗性标记插入Ti质粒，以便能够选择转接合子。然后可以通过由RP4/RK2质粒提供的转移功能使所得修饰的Ti质粒移动并且进行选择。
使用插入Ti质粒中的载体，通过同源重组将RP4oriT插入Ti质粒中。可以使用几种类型的载体，诸如自杀载体或广宿主范围载体。自杀载体含有并非在土壤杆菌属中为功能性的复制起点和一种或多种抗生素选择标记。对这些标记进行选择促使自杀载体重组至基因组，例如重组至Ti质粒。其它合适的载体含有在土壤杆菌属(例如RK2)中稳定的广宿主范围复制起点。通过使用与广宿主范围载体不相容的质粒转化菌株并且选择这两种质粒而促使后者插入Ti质粒中。通过将Ti质粒区克隆入自杀或广宿主范围载体增强同源重组，由此能够使该区与Ti质粒上的相同序列重组。
在本实施例中，使用来源于Topo载体PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的自杀载体。扩增将作为同源重组的靶起作用的Ti质粒的序列并且将T/A克隆入该Topo载体。所述的靶序列包括位于分别来自virB11和virC2基因的部分序列侧翼的完整virG基因(引物序列VirBllFW和VirC2REV；SEQ ID NOS：66-67))。通过使用引物moaAFW和moaAREV(SEQ ID NOS：68-69)对来自moaA基因的部分序列并且使用引物accAFW和accAREV(SEQ ID NOS：70-71)对来自accA基因的部分序列分别进行T/A克隆构建两种其它的自杀载体。这三种基因位于沿Ti质粒序列的不同位置上，并且与自杀载体的重组由此在三个不同区(在单独的Ti质粒中)中导致对Ti质粒的修饰。通过测序证实所得的自杀载体构建体。然后使用引物oriTFW和oriTREV(SEQ ID NOS：72-73)由质粒pSUP202，即RP4载体的衍生物扩增RP4 oriT序列。将oriT产物克隆入三种自杀载体的Xba I位点，转移至大肠杆菌Top10感受态细胞并且通过测序证实该质粒载体。自杀质粒之一pWBE58的载体图谱与用于同源重组至EHA105的Ti质粒的策略如图6中所示。然后将自杀载体电穿孔入根瘤土壤杆菌EHA105。在补充了卡那霉素(50mg/L)和羧苄西林(100mg/L)的LB平板上选择含有载体整合体的推定转化体(这两种选择标记均存在于自杀载体上)。在3天内获得通过在virG、accA或moaA基因座上的同源重组已经将自杀载体整合入Ti质粒的候选菌落并且通过扩增对这些菌落中存在的修饰的Ti质粒进行测定。
用于验证将完整自杀质粒整合入Ti质粒的引物如下：用于pTi::pWBE58整合体，目前称作pTi1的virB11FW2(SEQ ID NO：40)和M13REV(SEQ ID NO：41)；用于pTi::pWBE60整合体，目前称作pTi2的accAFW2(SEQ ID NO：74)和M13REV(SEQ ID NO：41)；和用于pTi::pWBE62整合体，目前称作pTi3的M13FW(SEQ ID NO：42)和moaAREV2(SEQ IDNO：75)。在每种情况中，M13引物退火至自杀载体序列，而第二种引物退火至在各自的自杀载体中克隆的区外部的序列。使用在1分钟过程中94℃下的初始变性，然后是94℃下30秒、58℃下30秒、72℃下2分钟和在72℃下2分钟的最终延伸的35个循环进行扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的产物。结果(图7)显示了对每种载体整合而言，存在预计的扩增产物，分别为：对于pTi1，1496bp产物；对于pTi2，2080bp；和对于pTi3，1627bp。对含有未修饰Ti质粒的野生型EHA105菌株而言未获得扩增产物。
通过DNA印迹分析获得自杀载体整合入Ti质粒中的进一步证据。基因组DNA分离自野生型EHA105菌株、Ti质粒-消除的土壤杆菌属菌株LBA288和含有修饰的Ti质粒pTi1和pTi2的EHA105菌株。用限制性内切核酸酶XbaI消化基因组DNA并且通过凝胶电泳运行过夜进行分离。XbaI切割自杀载体两次，在oriT序列的每侧一次。在修饰的Ti质粒序列中，这应导致分别对重复virG和accA区内部的DNA进行切割，从而产生各自含有virG或accA片段的两种片段。然后将消化的基因组DNA印迹到膜上，固定并且与DNA探针杂交。在单独的泳道中，加载XbaI-消化的自杀载体DNA。通过下列步骤制备DNA探针：对相应于通过使用M13引物(SEQ ID NOS：41-42)和accAFW+accAREV引物(SEQ ID NOS：70-71)分别对从相应自杀载体扩增的virG基因和accA基因的扩增产物进行DIG标记(HighPrime DIG标记试剂盒，Roche diagnostics，Mannheim，Germany)。在对杂交和洗涤的膜进行曝光后的胶片显影揭示出在野生型菌株中存在单个条带而在pTi1和pTi2菌株中存在两个条带。不具有Ti质粒的LBA288菌株未显示出任一探针的条带，从而表明探针与Ti质粒区结合。结果证实完整的自杀载体已经通过单交换事件整合入Ti质粒的同源区，由此使在载体(分别为virG和accA)中克隆的区重复。这一结果如图7中所示。在pTi1中，这一过程导致完整virG基因的重复，而在pTi2中，插入了AccA基因的第二截短的拷贝，。在土壤杆菌属中，已经证实含有重复virG基因或增强的virG活性的菌株增加了基因转移的感应性。
实施例4
Ti质粒转移至大肠杆菌和其它细菌以及Ti质粒在大肠杆菌中的操作
在本实施例中，将Ti质粒转移至大肠杆菌细胞并且在大肠杆菌中维持和修饰。(Hille等，J.Bacteriol.154：693-701，1983)证实了野生型章鱼氨酸Ti质粒与广宿主范围质粒R722之间自发的稳定共整合可以在大肠杆菌中得以维持。通过电穿孔或接合将RK2复制起点和转移起点插入和转移至大肠杆菌来修饰去甲型Ti质粒EHA105。
未修饰的Ti质粒在某些菌种中不稳定。因此，在本发明的一个实施方案中，通过插入广宿主范围复制起点修饰Ti质粒，由此使得它更为稳定并且能在其它菌种，包括，但不限于大肠杆菌中复制。然后使修饰的Ti质粒与非-土壤杆菌属种类接合，例如与大豆慢生根瘤菌或巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)接合。可以将在某个种中稳定维持的任何复制起点或稳定蛋白基因用于稳定Ti质粒。
首先通过插入在大肠杆菌中具有活性的复制起点修饰Ti质粒。通过用来自Topo载体PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的卡那霉素抗性基因置换四环素抗性基因(tetA和tetR)修饰广宿主范围质粒pRK404，即RK2的较小衍生物(Scott等，质粒50：74-79，2003；GenBank登记号AY204475)。用BseRI消化pRK404，并且用T4DNA聚合酶使大片段变为平端并且与含有kanR和来自PCR2.1的F1 ori的EcoRV/XmnI片段连接。所得10.5kb载体为卡那霉素抗性的并且称作pRK404km。为了有利于与Ti质粒的同源重组，将Ti质粒的序列克隆入pRK404km载体。使用引物virB11FW和virC2REV(就virG而言；SEQ ID NOS：66-67)以及引物moaAFW和moaAREV(就moaA而言；SEQ ID NOS：68-69)扩增完整virG基因和含有侧翼DNA的moaA基因的一部分，所述引物均携带限制位点。用HindIII(virG)或BamHI(moaA)消化扩增产物并且与类似地消化的pRK404km质粒连接。将连接反应电穿孔入大肠杆菌和在卡那霉素(50mg/L)上生长且在有X-gal和IPTG存在下仍为白色的转化体，并且分析其中预计质粒的存在。然后将所得载体电穿孔入野生型EHA105感受态细胞并且在卡那霉素(50mg/L)上选择转化体。或者，使pRK404km/virG或pRK404km/moaA质粒与EHA105在三亲接合中借助于另一种大肠杆菌菌株提供的RP4-4或在双亲接合中使用大肠杆菌菌株S17-1(具有在其染色体中整合的RP4转移功能)接合，其中已经对大肠杆菌菌株S17-1电穿孔了pRK404km/virG或pRK404km/moaA质粒。
所得EHA105转化体很可能携带pRK-衍生的质粒载体作为单独的质粒。为了促使这些载体整合入Ti质粒，用与前述载体不相容的另一种incP质粒转化菌株，并且针对初始pRK载体上的KanR基因和第二种incP载体上的选择标记选择转接合子/整合体。
通过与携带RP4-4(为卡那霉素敏感性的RP4的衍生物)的大肠杆菌菌株接合转化EHA转化体并且在含有卡那霉素(50mg/L)和羧苄西林(100mg/L)的M9蔗糖(对大肠杆菌反选择)平板上选择。在所得转接合子中，某些菌落具有在Ti质粒virG或moaA序列区中整合的pRK-载体，并且额外携带RP4-4载体。然后将这些菌落用于与大肠杆菌的接合实验，其中在37℃下在含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上选择大肠杆菌转接合子。所得大肠杆菌菌落可能已经获得了RP4-4质粒加上Ti质粒。将许多菌落在新鲜平板上铺板几次，并且通过在含有羧苄西林(100mg/L)的LB上影印铺板检查RP4-4质粒的自发丧失。通过使用用于Ti质粒标记virG、virB和moaA的引物(分别为SEQ ID NOS：27-28；31-32；和68-69)扩增证实这些大肠杆菌菌株中存在Ti质粒。
可以通过用于在革兰氏阴性菌中的遗传操作的常用工具，包括转座子诱变和λ重组酶支持的同源重组操作大肠杆菌中的Ti质粒。可以使大的部分从对将基因转移至植物而言非必需的区中的Ti质粒中缺失。可以插入序列以便增加Ti质粒的稳定性、维持性或基因转移能力。然后通过电穿孔或接合方法将修饰的Ti质粒转回至合适的细菌菌株并且用于转化植物或其它真核生物。
实施例5
用于通过根癌土壤杆菌和非-土壤杆菌属细菌进行植物转化的“标记的”二元载体的构建
在本实施例中，将二元载体系统用于将基因转移至植物。将所关注的DNA序列转移至植物的细菌载体因此含有不含T-DNA的去甲型Ti质粒和在T-DNA边缘之间含有所关注的基因的载体。在此使用的载体来源于pCAMBIA系列载体，即来自pCAMBIA1305.1(GenBank登录号：AF354045)。通过用来自pPZP200的壮观霉素/链霉素抗性标记(SpecR)置换卡那霉素抗性标记nptI来修饰载体(Hajdukiewicz等，PlantMolec.Biol.25：989-994，1994)。用引物SpecFWNsiI(SEQ ID NO.76)和SpecREVSacII(SEQ IDNO.77)从pPZP200扩增SpecR基因，用NsiI和SacII消化并且与来自pCAMBIA1305.1 NsiI/SacII消化物的两种大片段连接，从而排除了含有KanR基因的988bp片段。在检查连接的片段的正确取向后，所得的载体具有置换了KanR基因的SpecR基因并且被称作pCAMBIA1105.1。这种载体的图谱如图8中所示。它含有pCAMBIA1305.1的全部特征，包括在左和右T-DNA边缘内的潮霉素抗性弹夹和GusPlus(美国专利US 6,391,547)报道基因弹夹。GusPlus基因含有内含子，从而防止它在细菌中被表达。在细菌混悬液的X-GlcA染色后，未检测到蓝色斑点。类似地，通过使用SpecfwSacII和SpecrevSacII(SEQ ID NOS：78+77)从pPZP200扩增SpecR基因并且连接至pCAMBIA1305.1的唯一SacII位点来构建pCAMBIA1405.1。这种载体pCAMBIA1405.1具有组合的Kan和Spec抗性并且含有与其亲代载体和pCAMBIA1105.1完全相同的T-DNA区。
为了验证基因转移已经通过非-土壤杆菌属种类的辅助和不是通过污染土壤杆菌属细胞而发生，将与用作转化过程中的阳性对照的转移至土壤杆菌属菌株的载体相比稍有不同的二元载体转移至本发明的细菌。为了标记这种二元载体和使该标记序列被整合至靶植物种的基因组，修饰T-DNA区的一小部分，例如将稍有不同的多克隆位点用于两种载体中或在边缘序列内的任何区中造成小的缺失或插入。将在此称作“标记的二元载体”(MBV)的一种二元载体仅转移至非-土壤杆菌属菌株，并且决不导入任何的土壤杆菌属菌株。将另一种二元载体(BV)仅导入土壤杆菌属菌株。通过横跨标记序列扩增并且测定产物的DNA序列可以对转化的植物组织分析整合入基因组的T-DNA序列的类型。由此可以通过扩增或可选地或另外通过测序来检验任何的T-DNA整合。因此，可以将T-DNA的起点确定为来源于靶细菌菌株或土壤杆菌属。
在本实施例中，通过用与Topo载体PCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)稍有不同的位点置换其多克隆位点来标记pCAMBIA1105.1载体。将来自Topo载体的多克隆位点作为PvuII片段切掉并且连接至PvuII-消化的pCAMBIA1105.1。通过横跨多克隆位点序列扩增并且通过对完整多克隆位点进行序列分析来分析所得载体。标记的载体称作pCAMBIA1105.1R(图9)并且将其仅电穿孔入本发明的细菌。类似地，将原始载体pCAMBIA1105.1或相关载体pCAMBIA1305.1和1405.1仅电穿孔入土壤杆菌属，并且将所得菌株用作基因转移的阳性对照。通过用引物1405.1(SEQ ID NO.46)和P35S5’rev(SEQ ID NO.79)扩增MCS证实与原始载体相比在标记的二元载体中不同的MCS序列，从而产生1105.1/1305.1/1405.1系列载体的491bp产物和标记的二元载体pCAMBIA1105.1R的572bp产物。这一结果如图15中所示。
实施例6
可以转移DNA的细菌菌株的构建
在本实施例中，为DNA转移而通过掺入土壤杆菌属Ti质粒和T-DNA二元载体来改造细菌菌株。首先通过接合将Ti质粒从土壤杆菌属转移至本发明的细菌菌株。pTi辅助质粒具有强毒力功能，例如来自EHA105的pEHA105，并且带有阳性选择标记。在一个实施方案中，通过RP4/RK2质粒接合器的辅助实现Ti质粒的移动。这些IncP质粒或其衍生物能够使携带RP4/RK2的转移起点(oriT)的质粒移动(参见实施例3)。如果本发明的细菌菌株不具有有用的选择标记，那么首先通过转座子介导的诱变或通过任何的重组手段将选择标记插入其基因组。
将携带pTi1的EHA105和携带pTi3的EHA105(两种pTis均携带对卡那霉素和羧苄西林的抗性；参见实施例3)用作供体菌株。将携带RP4-4(RP4的卡那霉素敏感性衍生物)的大肠杆菌或携带pRK2073(壮观霉素抗性RP4衍生物，它在土壤杆菌属或本发明菌株中无活性的有限宿主范围复制子上含有RP4转移功能)的大肠杆菌用作辅助菌株，将根瘤菌属的种类NGR234(链霉素抗性菌株ANU240)和苜蓿中华根瘤菌菌株1021(链霉素抗性)用作受体菌株。
通过在三亲接合中合并含有Ti质粒的供体土壤杆菌属、根瘤菌受体菌株和辅助RP4/RK2(衍生物)菌株的活跃生长的培养物引起接合。将细菌混合物转移至置于非选择性YM生长培养基上的硝化纤维素滤膜上并且在29℃下孵育几小时或过夜。然后重新悬浮滤膜上的细胞并且在有利于转接合子，即含有Ti质粒的根瘤菌生长的选择平板(含有链霉素(100mg/L)、卡那霉素(50mg/L)和羧苄西林(50mg/L)的YM)上铺板。将候选转接合子作为单细胞菌落充分铺板并且通过扩增检查其中pTi(例如vir基因)的存在且证实为根瘤菌菌株。对各菌种中的一个菌株的扩增分析结果如图10中所示。另外，对转接合子分析存在的RP4-衍生的辅助质粒(使用引物RP4FW和REV；SEQ ID NOS：80-81)。为进一步应用选择缺乏该质粒的菌株。
然后用pCAMBIA1105.1R(参见实施例4)，通过电穿孔转化含有Ti质粒的根瘤菌菌株。在含有卡那霉素(50mg/L)(用于选择pTi)和链霉素(100mg/L)(用于选择二元载体)的YM培养基上选择推定的转化体。3-5天后观察候选菌落，将其在新平板上铺板并且通过扩增对存在的二元载体(hygR的引物，SEQ ID NOS：44-45；和多克隆位点，SEQ IDNOS：46+79)、Ti质粒(virG，virB和moaA引物，SEQ ID NOS：27-28；31-32；68-69)和用于菌株证实的基因型分型标记(Sme16S，SEQ IDNOS：33-34；和NodD1，SEQ ID NOS：35-36；或NodQ，SEQ ID NOS：37-38，分别就根瘤菌属和苜蓿中华根瘤菌而言)进行分析。
作为在这些菌株中二元载体维持的进一步证据，由在28℃下在选择或不选择(卡那霉素(50mg/L)+壮观霉素(100mg/L))的情况下生长2天的培养物制备质粒DNA。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳分离一般用一种或多种限制酶消化的质粒DNA。在所有提取中均可检测到二元载体。
在另一个实验中，使Ti质粒pTi1在三亲接合中从含有pTi1和RP4-4的土壤杆菌属菌株EHA105移动至大豆慢生根瘤菌菌株USDAll0，随后在含有Rif100(就大豆慢生根瘤菌而言)和卡那霉素(50mg/L)和羧苄西林(100mg/L)(就pTi1而言)的YM上选择。获得了含有pTi1的大豆慢生根瘤菌的菌落。然后用pCAMBIA1105.1R电穿孔该菌株。
还在双亲接合过夜中使用含有pTi1和RP4-4的根瘤菌属的种类NGR234菌株使pTi1移动至百脉中间根瘤菌MAFF303099。首先通过转座子插入单拷贝的庆大霉素抗性基因(通过DNA印迹证实)改造百脉中间根瘤菌菌株；在含有Gm30(就百脉中间根瘤菌而言)和卡那霉素(50mg/L)(就pTi1而言)的YM上进行转接合子选择。获得含有pTi1的几打百脉中间根瘤菌转接合子。它们中的大部分还获得了RP4-4；因此在80个转接合子菌落上通过扩增进行筛选，并且鉴定了不含RP4-4的3个菌落。然后用pCAMBIA1105.1R电穿孔这些菌株之一。
然后转化植物组织。通过测定GUS活性验证成功的转化。作为阳性对照，用相关载体pCAMBIA1105.1或pCAMBIA1405.1转化土壤杆菌属供体菌株并且用于转化植物组织。
在另一个实验中，基因转移感受态苜蓿中华根瘤菌菌株已经保留了苜蓿结瘤的能力。使苜蓿种子发芽，使之接触苜蓿中华根瘤菌并且在含有生长培养基的大培养皿中生长4周。给在植物根上形成的瘤接种野生型菌株和改造的苜蓿中华根瘤菌菌株，表明存在的Ti质粒和二元载体不会减少结瘤。
实施例7
根瘤菌属介导的稻米的转化
在本实施例中，用均包含pTi3和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌属的种类NGR234和苜蓿中华根瘤菌1021(对于这些菌株的构建参见实施例4和5)转化稻米愈伤组织。对照菌株包括包含pCAMBIA1405.1载体的土壤杆菌属菌株EHA105。在菌株EHA105中的vir辅助Ti质粒(Hood等，Transgenic Res.2：208-218，1993)来源于succinamopine类超毒力Ti质粒pTiBo542。
如下制备转化组织。使表面灭菌的稻米种子在26℃下的暗处在含有生长素(2，4-D)的2N6培养基上生长4周以形成愈伤组织。然后将盾片衍生的愈伤组织再分成4-8mm直径的片并且置于含有2N6培养基的平板上且在26℃下的暗处孵育4-10天。将这些盾片衍生的愈伤组织用于转化。
将根瘤菌菌株在含有合适的抗生素(卡那霉素(40mg/L)和壮观霉素(80mg/L)的YM培养基上划线并且在29℃下孵育3天。此时，细胞在平板上形成菌苔。将土壤杆菌属菌株在含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(100mg/L)的AB培养基上划线并且在29℃下生长2天。保持谨慎以使根瘤菌培养物不被土壤杆菌属污染。
从平板中采集细菌并且重新悬浮于含有100μM乙酰丁香酮(AS)的AAM或minA培养基中。将土壤杆菌属的细菌混悬液的O.D.600调节至1.0并且将根瘤菌的细菌混悬液的O.D.600调节至1.5(选择相当于中-指数生长期的数字)。将混悬液保持在室温下2-3小时。然后将20mL细菌混悬液转入培养皿或其它合适的无菌容器。将4-7天的去分化的愈伤组织加入到细菌混悬液中，涡旋并且保持30分钟。然后将愈伤组织干印迹在无菌Whatman No.1滤纸上并且转移至2N6-AS平板上。将愈伤组织在26℃下的暗处共培养3-7天。可以改变混悬液和用于根瘤菌菌株的共培养培养基以便提供对发生基因转移的足够或改善的支持。例如，通过将生物素添加到培养基中改善苜蓿中华根瘤菌的生长。类似地，当细菌在含有100μMAS和5μM/l生物素的RMOP培养基(用于烟草，参见实施例9)上生长时，生长得以改善且转化增加。
7天后，用含有250mg/L头孢噻肟的水洗涤与细菌一起共培养的愈伤组织以便除去细菌；将愈伤组织转至含有补充了250mg/L头孢噻肟的25mL水的平板上，涡旋并且孵育20分钟。在这一段时间中，大部分细菌从愈伤组织中释放。将愈伤组织干印迹在无菌Whatman No.1滤纸上且然后转至含有250mg/L的头孢噻肟(杀灭保持附着于愈伤组织状态的细菌)和50mg/L潮霉素(选择转基因愈伤组织)的2N6-CH平板。
将愈伤组织在26℃下的暗处孵育约4周，在此期间，每隔2周将它们在新鲜选择培养基上传代培养一次。小的转基因潮霉素抗性愈伤组织在潮霉素上选择4周后开始增殖。将增殖的愈伤组织转移到2N 6-TCH上并且使它们进一步生长约2周，此时，将它们转移至再生培养基(RGH6)上并且使它们进一步在暗处生长1周。
然后将愈伤组织转至光亮处并且使它们生长4-6周。在5-10天后，愈伤组织开始变成绿色，并且在2-3周后，枝条开始分化。将这些枝条转移至生根培养基(二分之一强度的MSH)上，并且在根形成时，将植物转移至温室。
通过用X-GlcA(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D葡糖苷酸)染色少数洗涤的愈伤组织来测试瞬时GUS表达。图11显示了在与土壤杆菌属、中华根瘤菌属或根瘤菌属的种类的菌株一起共培养5天后测定的愈伤组织的GUS活性。在与根瘤菌一起共培养后在愈伤组织上观察到了蓝色染色区，不过，与在与土壤杆菌属一起共培养后观察到的相比，染色频率较低。
图17显示了在与含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中华根瘤菌一起共培养后获得的GUS染色的稻米小植物。在根中，在枝条的基底部和在叶尖端中观察到了GUS活性。扩增分析揭示出存在pCAMBIA1105.1R-特异性MCS，从而证实了在该植物中整合的T-DNA来源于苜蓿中华根瘤菌菌株。
检验润湿剂对转化的影响。润湿剂包括各种洗涤剂(例如，Triton)和其它试剂，诸如Silwet L77。还检验了Silwet L77对苜蓿中华根瘤菌介导的稻米转化的作用。将稻米愈伤组织与苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R在含有0.005％-0.1％(w/v)的Silwet L77的培养基中共培养。在22℃下共培养7天后，使用X-GlcA测定愈伤组织的GUS活性。
下表显示了添加0.01％或0.02％浓度的Silwet L77提高了稻米愈伤组织的转化率。
表2
  Silwet L77(％)   测定的愈伤组织数量  具有GUS活性的愈伤组织数量(％)
  0   172   2(1.7％)
  0.005   162   1(0.6％)
  0.01   152   3(2.0％)
  0.02   144   5(3.5％)
  0.05   168   1(0.6％)
  0.1   171   0
实施例8
用于根瘤菌介导的稻米转化的选择性条件
在本实施例中，测试了用于转化的各种选择性条件。这些条件中的一些包括愈伤组织发育的天数、温度、共培养基、排除或填充剂的使用，诸如硫酸葡聚糖、果聚糖、微晶纤维素、PEG和PVP，并且检验了涉及转化率的稻米组织的龄期。
在25℃下将稻米种子在添加了乙酰丁香酮(100μM)的愈伤组织诱导培养基(2N6，pH 5.8)上培养7天。在愈伤组织诱导7天后，将约60μL苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R置于发育的愈伤组织之上；然后在25℃下将愈伤组织和细菌一起共培养7天且随后使用X-GlcA测定其GUS活性。就这一特定实验而言，在YM培养基(具有合适的抗生素选择)上将苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R培养2天，且然后将其重新悬浮于AAMAS培养基中至O.D.(600nm)约为1.0，并且进一步在室温22-26℃下培养2-3小时。在91个测定的愈伤组织中，一个具有GUS活性。这一结果提示仅具有7天去分化的愈伤组织可以被苜蓿中华根瘤菌转化，并且愈伤组织与细菌培养物的标准40分钟孵育可能不一定必要。
联合测试转化前愈伤组织发育的天数、愈伤组织发育的孵育温度和用于转化的共培养基的类型。在本实验中，在22或25℃下将稻米种子在愈伤组织发育培养基(2N6，pH5.8)上培养5、6或7天；使用两种不同的共培养基-2N6AS(标准共培养基，pH5.2)或2N6+AS(含有100μM乙酰丁香酮的标准愈伤组织发育培养基，pH5.8)；用于愈伤组织与苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R共培养的共培养条件为在22或25℃下共培养8天。共培养后，测定愈伤组织的GUS活性。
来自典型实验的结果如下表中所示。
表3
  种子平板培养的天数   温度   共培养基(pH)   测定的愈伤组织数量   具有GUS活性的愈伤组织数量(％)
  5   22   2N6AS(5.2)   77   0
  5   22   2N6+AS(5.8)   真菌污染   未对愈伤组织评分
  6   22   2N6AS(5.2)   76   0
  6   22   2N6+AS(5.8)   80   3(3.8％)
  7   22   2N6AS(5.2)   80   1(1.3％)
  7   22   2N6+AS(5.8)   74   3(4.1％)
  7   25   2N6AS(5.2)   68   0
  7   25   2N6+AS(5.8)   70   5(7.1％)
这些结果表明随同在2N6培养基上仅6天去分化，稻米愈伤组织对中华根瘤菌属介导的转化而言是感受态的。此外，中华根瘤菌属介导的转化在22或25℃下去分化6或7天后发生。还可以使用5.2或5.8的pH的培养基实现转化，表明pH范围是可接受的。
检验不同组织，例如种子、发芽幼苗、愈伤组织的被转化的能力。就下表中的数据而言，使用稻米种子、为愈伤组织发育培养7天的种子和来自培养的种子的新近收获的愈伤组织。如表中所示用苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R处理这些组织且然后在8天共培养后测定其GUS活性。如本文其它部分中所述通过培养并且重新悬浮于AAMAS中至O.D.600约为1.0来制备苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R。将稻米组织在苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R混悬液中孵育40分钟，或就稻米种子而言，与置于稻米种子之上的约60μL细菌培养物一起孵育。
表4
  植物组织   处理   处理的组织数量   GUS活性  ％GUS活性
  表面灭菌的种子   孵育培养基悬滴   65  在种皮、愈伤组织或根中未观察到GUS活性。与对照相比愈伤组织发育较少。在种子周围有可见的Sme生长。   0
  1周龄发芽的幼苗   40分钟孵育   48  6个幼苗在愈伤组织中具有GUS活性。在种皮或根中未观察到GUS活性。在幼苗周围几乎没有Sme生长。   12.5％
  收获自4周龄发芽幼苗的愈伤组织   40分钟孵育   118  3个愈伤组织具有GUS活性。在愈伤组织周围没有可见的Sme生长。   2.5％
如上表中所示，这些结果提示嫩盾片衍生的愈伤组织(来自1周龄幼苗)与使用更老龄的愈伤组织(4周龄)相比会提高苜蓿中华根瘤菌介导的转化率。
在下列实验中，检验了聚乙二醇(PEG)(MW 3350和8000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW 360,000)对转化率的作用。
使用中华根瘤菌属在有PEG(MW 3350)存在下转化稻米愈伤组织。在YM培养基(具有合适的抗生素选择)上将苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R培养3-4天，然后重新悬浮于AAMAS培养基中且在室温22-26℃下培养2-3小时。恰在孵育愈伤组织前，将重新悬浮的苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMBIA1105.1R与含有PEG的AAMAS培养基混合至最终O.D.600约为1.0且PEG浓度在0-20％(w/v)范围内。将稻米愈伤组织孵育40-50分钟，导液并且在无菌滤纸上干燥20-30分钟且然后在22℃下在2N6AS培养基(pH5.2)上共培养7天。在共培养后，使用X-GlcA测定愈伤组织的GUS活性(0.5mg/mlX-GlcA，5分钟真空渗入并且在37℃下过夜孵育)。
表5
  重复次数   ％PEG(mw 3350)   测定的愈伤组织数量  具有GUS活性的愈伤组织数量   具有GUS活性的愈伤组织％
  2   20   247   12   4.9
  3   10   392   20   5.1
  3   5   428   23   5.3
  1   1   176   4   2.3
  1   0.5   162   6   3.7
  1   0.1   159   0   0
  5   0   770   10   1.3
上表中的这些结果表明添加0.5-20％PEG(mw3350)可以将苜蓿中华根瘤菌介导的稻米愈伤组织转化提高2-4倍。
检验了PEG(MW 8000)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮MW 360,000)对中华根瘤菌属介导的稻米愈伤组织转化的进一步作用。转化方案如上所述，但不同的是将PEG(MW 8000)或PVP(MW 360,000)而不是PEG(MW 3350)加入到孵育培养基中。将稻米愈伤组织与苜蓿中华根瘤菌(pTi3)pCAMB IA1105.1R在有0-20％(w/v)PEG或0-10％PVP(w/v)存在下一起孵育且然后在22℃下在2N6AS培养基上共培养7天。共培养后，使用X-GlcA测定愈伤组织的GUS活性。
表6
  孵育培养基   测定的愈伤组织数量  具有GUS活性的愈伤组织数量  具有GUS活性的愈伤组织％
  Sme 3R+20％PEG   97   0   0
  Sme 3R+10％PEG   97   4   4.1
  Sme 3R+5％PEG   106   1   0.9
  Sme 3R+1％PEG   126   6   4.8
  Sme 3R+10％PVP   102   6   5.8
  Sme 3R+5％PVP   142   2   1.4
  Sme 3R+1％PVP   111   4   3.6
  Sme 3R+0.5％PVP   109   0   0
  Sme 3R   129   3   2.3
上表中的这些结果表明向孵育培养基中添加PEG(MW 8000)或PVP(MW 360,000)提高了苜蓿中华根瘤菌介导的稻米愈伤组织转化的转化率。
实施例9
根瘤菌介导的烟草的转化
在本实施例中，用含有Ti质粒和二元载体的根瘤菌转化烟草叶片。用于本实验的外植体组织为在来自4-5周龄组织培养生长的生根植物的上面展开的烟草叶上穿孔的1cm2叶片。用于本实施例中的细菌为根瘤菌属的种类NGR234(ANU240)和苜蓿中华根瘤菌1021，它们均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R(参见实施例3-5)。作为基因转移的阳性对照，使用含有pTi1和pCAMBIA1405.1的土壤杆菌属EHA105菌株。
在含有卡那霉素(40mg/L)和壮观霉素(80mg/L)的YM平板上充分铺展细菌(根瘤菌)，或者在含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(100mg/L)的AB平板上充分铺展细菌(土壤杆菌属)。将平板在28℃下孵育2-3天。
从平板上刮下细菌并且重新悬浮于20mL minA液体中直到OD600为1.0-1.5。从上面的烟草叶上切下叶片，转移至含有细菌混悬液的培养皿中，并且孵育5分钟。任选地，将叶片在Whatman 1号滤纸上吸干。将叶片置于胶凝的共培养基上，例如RMOP。或者，将叶片倒置放置在胶凝培养基上。将平板在19-28℃下的暗处孵育2天(土壤杆菌属)或5-7天(根瘤菌)。
将叶片转移至选择平板(RMOP-TCH)上并且在28℃下和每天以16小时目光的光亮中孵育2-3周。每2周将叶片传代培养一次。当枝条出现时，将小植物转移至MST-TCH平板上以便小植物再生。当根出现时，将小植物转移至温室中的土壤。
在共培养后即刻通过在X-GlcA中染色叶片过夜监测基因转移效率(Jefferson，Plant Mol Biol.Rep 5：387-405，1987)。表5显示了使用根瘤菌菌株和作为对照的土壤杆菌属菌株的典型烟草转化实验的结果。图12显示了使用这些细菌转化的几个烟草叶的影像。
表7
  菌种   Ti  质粒   二元载体   测定的叶片数量   蓝色斑点总数   每个叶片上蓝色斑点的平均数
  根瘤菌属的种类   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10   2   0.2
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10   59   6
  根癌土壤杆菌   pTil   pCAMBIA1405.1   10   ～3000   ～300
表6显示了使用含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中华根瘤菌的几个转化实验的结果。嫩烟草叶的使用显著增加了基因转移(每个叶片的蓝色斑点比稍老龄叶的蓝色斑点多15倍)；就土壤杆菌属介导的转化而言，对两种叶类型而言，基因转移看起来差不多相似。
表8
  菌种   Ti质粒   二元载体   测定的叶片数量   每个叶片上蓝色斑点的平均数
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10   5.9
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10   6.3
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R(老叶材料)   10   2.2
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R(嫩叶材料)   10   30.6
为了确定用于烟草叶处理的根瘤菌培养物不含任何污染的土壤杆菌属细胞，在与非土壤杆菌的生长相比有利于土壤杆菌属菌落生长的培养基上将用于叶处理的细菌混悬液充分铺板。将烟草叶片在不同比例(参见下表)的苜蓿中华根瘤菌和根瘤土壤杆菌EHA105(pCAMBIA1305.2)的混合物中孵育，共培养3天且然后测定叶片的GUS活性。通过在合适的培养基上将连续稀释液铺板并且对菌落计数以便确定每ml培养物的cfu而分别确定这两种细菌培养物的浓度。因为苜蓿中华根瘤菌不含二元载体，所以叶片的任何转化均必须为用EHA 105转化的结果。这些结果表明在3天共培养后，在109cfu/ml中华根瘤菌属中小至10cfu的土壤杆菌属可以以极低频率导致烟草的转化。在20μL苜蓿中华根瘤菌混悬液中甚至存在1000个包含pCAMBIA1305.1的土壤杆菌属细胞也仅在添加后(add-back)实验中产生几个蓝色斑点，其中所述的苜蓿中华根瘤菌混悬液含有pTi3，但不含二元载体(Sme pTi3)，其结果如下表中所示。
表9
  处理  Sme pTi3细胞总数   EHA105细胞总数   叶片数   GUS活性
  1   1010   0   10   无GUS活性
  2   1010   102   10   1个蓝色斑点
  3   1010   103   10   3个蓝色斑点(三个叶片的每片上有1个斑点)
  4   1010   105   10   423个蓝色斑点(42个斑点/片)
  5   0   1010   9   每片上有300-400个蓝色斑点
表10
  苜蓿中华根瘤菌数量(cfu/ml)   EHA105(pC1305.2)数量(cfu/ml)   测定的烟草叶片数量  GUS转化灶总数  每片中GUS转化灶平均数
  109   0   10   0   0
  109   104   10   423   42
  109   102   10   3   0.3
  109   101   10   1   0.1
  0   109   9   3000+   300+
作为土壤杆菌属不存在于烟草转化实验中的进一步证据，在除去外植体后通过向平板中添加2mL LB培养基并且在28℃下振摇1小时从平板上洗掉在共培养平板上生长的细菌团。然后在有利于土壤杆菌属生长的平板上将100μL该混悬液铺板。在2天期限内未观察到在这些平板上生长的菌落。此外，使100μl在共培养前后的细菌混悬液旋转沉降，重新悬浮于无菌水中并且用于使用土壤杆菌属特异性attScirc引物(SEQ ID NOS：23-24)和作为阳性对照的Sme16S引物(SEQID NOS：33-34)的扩增分析。结果还提示土壤杆菌属DNA不存在于样品中。
在含有潮霉素的再生培养基上培养与苜蓿中华根瘤菌pTi3pCAMBIA1105.1R和与土壤杆菌属pTi1 pCAMBIA1405.1共培养的叶片。使枝条发育并且使小植物再生。图16显示了与基因转移称职的苜蓿中华根瘤菌菌株共培养后再生的烟草植物照片。测定来自许多独立植物的叶尖端的GUS活性。结果如图14中所示，其揭示出在测定的三个叶尖端中各自具有强GUS活性，而未转化的烟草叶尖端无GUS活性。表8显示了使用苜蓿中华根瘤菌pTi3 pCAMBIA1105.1R和根癌土壤杆菌pTi1 pCAMBIA1405.1进行两次独立转化实验后再生的生根植物的数量。由在含有选择(50mg/L潮霉素)的培养基上培养的枝条形成根是该枝条被遗传转化的良好指征。数据为根形成的低估值，因为在早期时间点采集数据并且这些枝条的中的某些仍然可以形成根。如下表中所示，就每个叶片中回收的推定转化的枝条的数量而言，苜蓿中华根瘤菌介导的转化低于土壤杆菌属介导的转化5-9倍。
表11
  菌种   实验   共培养叶片的数量   采集的枝条的数量   形成根的枝条的数量*   转化的枝条的数量/叶片
  苜蓿中华根瘤菌   1   20   9   2(22％)   2/20(10％)
  苜蓿中华根瘤菌   2   34   24   6(25％)   6/34(18％)
  根癌土壤杆菌   3   10   48   9(19％)   9/10(90％)
植物从叶片再生并且通过扩增T-DNA标记进行分析。基因组DNA分离自叶片并且用于扩增潮霉素基因(SEQ ID NOS：82-83)和MCS序列(SEQ ID N0：46和79)。结果如图15中所示并且概括在表9中。所有4种与苜蓿中华根瘤菌共培养的植物和所有3种与根癌土壤杆菌共培养的植物表现出存在潮霉素带且由此证实被转化。此外，所有4种苜蓿中华根瘤菌转化的植物展示出572bp扩增产物，与在pCAMBIA1105.1R中相应的序列一致；相反，土壤杆菌属转化的植物展示出相当于pCAMBIA1405.1中MCS序列的491bp产物。该结果证实在苜蓿中华根瘤菌转化的植物中存在来源于根瘤菌特异性标记的pCAMBA1105.1R载体，而非来源于pCAMBIA1405.1的T-DNA区，它具有较小的MCS并且仅电穿孔入土壤杆菌属菌株。
表12
  植物序号   共培养细菌   二元载体   GUS活性   HygR   MC位点(491或572bp)
  2-1   苜蓿中华根瘤菌   pCAMBIA1105.1R   有   +   +(572)
  6   苜蓿中华根瘤菌   pCAMBIA1105.1R   有   +   +(572)
  7-1   苜蓿中华根瘤菌   pCAMBIA1105.1R   无   +   +(572)
  11-1   苜蓿中华根瘤菌   pCAMBIA1105.1R   有   +   +(572)
  1   根癌土壤杆菌   pCAMBIA1405.1   有   +   +(491)
  2   根癌土壤杆菌   pCAMBIA1405.1   有   +   +(491)
  3   根癌土壤杆菌   pCAMBIA1405.1   有   +   +(491)
  非-转基因Wisconsin 38   无   -   -
  质粒pCAMBIA1405.1   +   +(491)
  质粒pCAMBIA1105.1R   +   +(572)
  无DNA对照   -   -
类似地，在与含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的根瘤菌属的种类NGR234共培养后获得5种烟草植物。所有这些植物均在其叶中表达GUS并且展示出MCS和HygR基因的预计的扩增带，从而证实它们是因根瘤菌介导的转化所致。
图18显示了来自烟草、鼠耳芥属和稻米植物转化体的限制基因组DNA的杂交模式。就该实验而言，用EcoRI限制酶消化约等于3×106基因组拷贝的适量的基因组DNA(稻米，3μg；烟草，27μg；和鼠耳芥属，0.75μg)，在1％琼脂糖凝胶上分离并且使用NaOH转移至HybondN+膜(Sambrook等，1989 Molecularcloning：a laboratory manual.Cold Spring Harbor，NY. Cold Spring Harbor Press)。使用备用标记珠(Pharmacia，Uppsala Sweden)，用α-32P-dCTP标记DNA探针并且通过NICK柱(Pharmacia)纯化。在65℃下通过在SDS-PreHyb缓冲液(7％(w/v)SDS，1％(w/v)BSA，0.5M NaHPO，pH7.2，1mM EDTA)中旋转预杂交膜。在约4小时后，将标记的探针加入到所述缓冲液中并且持续孵育16小时。在65℃下使用2X SSC+0.1％SDS将膜洗涤两次，每次10分钟，然后使用0.2X SSC+0.1％SDS洗涤两次，每次10分钟。用塑料薄膜包裹膜，此后在-80℃下在感光快性照相胶片上曝光。使用标准显影操作步骤使曝光的胶片显影。正如图18中所示，杂交模式对每种转化体而言是不同的，证实每种植物是独立转化的结果。T-DNA拷贝数获自7种鼠耳芥属植物，57种烟草植物和一种稻米植物，它们均使用苜蓿中华根瘤菌或根瘤菌属种类转化。
将烟草叶片与如实施例6中构建的百脉中间根瘤菌共培养。在5天共培养后，4个区域对在总计10个叶片上的GUS表达而言染色呈阳性；分别在7或9天共培养后，在10个叶片各自上分别观察到了55和25个表达GUS的转化灶。
实施例10
RP4存在对基因转移的作用
在T-DNA切除和转移后基因转移至植物与细菌接合具有许多相似性(例如Pans egrau等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：11538-11542，1993；Hamilton等，J. Bacteriol. 154：693-701，2000；Bravo-Angel等，J. Bacteriol.181：5758-5765，1999)。而且，可以将某些移动性质粒，诸如RSF1010和CloDF13通过Ti质粒的virB系统转移至植物细胞(Fullner，J. Bacteriol. 180：430-434，1998；Escudero等，Mol.Microbiol. 47：891-901，2003)，并且已经通过土壤杆菌属介导的转化，使用含有pClo载体，而不含T-DNA边缘序列的GUS获得了转化的植物(Escudero等，Mol.Microbiol.47：891-901，2003)。此外，在野生型土壤杆菌属菌株中存在RSF1010通过一种过程抑制其毒力，在该过程中，该质粒的转化形式与virD2-T链复合物和/或virE2竞争共同的输出位点(Stahl等，J.Bacteriol.180：3933-3939，1998)。在此我们证实在基因转移感受态细菌中存在RP4-4，即广宿主范围IncP质粒RP4的卡那霉素敏感性衍生物干扰其基因转移至植物的能力。
将烟草叶片和稻米愈伤组织与含有Ti质粒和二元载体并且具有或没有RP4-4质粒的细菌菌株共培养。通过将来自含有RP4-4的大肠杆菌的质粒进行接合转移并且在羧苄西林(100mg/L)上选择转接合子制备含有RP4-4的菌株。或者，可以在细菌群体中选择含有RP4-4的菌株，其中使用大肠杆菌RP4-4菌株作为辅助菌株，在使来自EHA105的修饰Ti质粒与任何根瘤菌菌株接合后获得所述的细菌群体。通过在有用于一部分RP4质粒的引物(SEQ ID NOS：80-81)存在下，使用防止非特异性结合的62℃的退火温度进行扩增来证实在菌株中存在或不存在RP4-4。在本实施例中，评价含有pCAMBIA1405.1具有和没有RP4-4的土壤杆菌属菌株EHA105的基因转移能力。将结果概括在表10中。在没有RP4-4存在下，在测定的10个烟草叶片上检测到了约3000个表达GUS的GUS转化灶。相反，对10个叶片而言，含有RP4-4质粒的菌株仅产生73个GUS转化灶，这一结果仅为缺乏RP4-4的菌株的基因转移效率的2.4％。在稻米愈伤组织转化中，结果甚至更为显著：在与含有RP4-4的土壤杆菌属菌株共培养后在93个愈伤组织中未观察到GUS活性，而在受到使用缺乏RP4-4的菌株转化的30个愈伤组织中有27个表现出GUS活性。这一结果表明RP4-4质粒的存在阻碍了基因转移，可能的原因在于接合过程中的某一部分干扰了T-DNA或vir蛋白转移至植物细胞。
在使用包含Ti质粒和二元载体的苜蓿中华根瘤菌和根瘤菌属的种类NGR234菌株的类似实验中，上述结果得到证实(参见表10)。与含有RP4-4的苜蓿中华根瘤菌菌株共培养的烟草叶片在10个测试的叶片中未产生表达GUS的斑点，而对老叶和嫩叶材料而言，不含RP4-4的类似菌株各自在10个叶片上分别产生了22和306个GUS转化灶。就不含RP4-4的根瘤菌属种类的菌株而言，观察到2个GUS转化灶，而对含有RP4-4的相同种的菌株而言未获得转化灶。再则，结果提示了IncP质粒对这些菌株的转化能力的显著性负面作用。
表13
  烟草
  菌种   Ti质粒   二元载体(pCAMBIA)   测定的叶片的数量(#植物，效率+)   GUS转化灶总数
  苜蓿中华根瘤菌   pTi1+RP4-4   pCAMBIA1105.1R   10   0
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10(老龄)   22
  苜蓿中华根瘤菌   pTi3   pCAMBIA1105.1R   10(嫩)   306
  根瘤菌属的种类NGR234   pTi1+RP4-4   pCAMBIA1105.1R   10   0
  根瘤菌属的种类NGR234根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌苜蓿中华根瘤菌苜蓿中华根瘤菌苜蓿中华根瘤菌   pTi3wtwt+RP4-4wt1wt+RP4-4pTiWB1pTiWB1pTiWB1+RP4-4   pCAMBIA1105.1RpCAMBIA1405.1pCAMBIA1405.1pCAMBIA1405.1pCAMBIA1405.1PCAMBIA1105.1RPCAMBIA1105.1RPCAMBIA1105.1R   1010(14；140％)10(7；70％)10(9；90％)10(2；20％)10(5；45％)19(3；27％)10(0；＜9％)   2～300073610186646830
+，植物数量/片
表14
  稻米
  菌种   Ti质粒   二元载体(pCAMBIA)   测定的愈伤组织数量  具有GUS活性的愈伤组织数量
  根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌   wt1wt+RP4-4wt1wt+RP4-4   pCambia1405.1pCambia1405.1pCambia1405.1pCambia1405.1   3093165148   27(90％)072(44％)0
wt，野生型Ti质粒，pTiEHA105
实施例11
根瘤菌属介导的鼠耳芥属花组织的转化
使用常用的花浸入法，通过含有Ti质粒和二元载体的根瘤菌属转化鼠耳芥属(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。将盆栽的鼠耳芥属植物的未成熟的花茎浸入细菌混悬液，使其开花并且开始形成种子，且收获种子并且使其在对转化体生长选择性的培养基上发芽。用于本实施例的细菌为根瘤菌属的种类NGR234(ANU240)和苜蓿中华根瘤菌1021，它们均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R(参见实施例3-5)。作为基因转移的阳性对照，使用含有pTi3和pCAMBIA1405.1的土壤杆菌属EHA105。
在含有卡那霉素(40mg/L)和壮观霉素(80mg/L)的YM平板(根瘤菌属)或含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(100mg/L)的mi nA平板(土壤杆菌属)上将细菌充分铺板。将平板在28℃下孵育2-3天。将来自平板的细菌重新悬浮于渗入培养基(1x MS盐，5％蔗糖，50mMMES-KOH pH 5.7，0.1％ Silwet L-77)中至O.D.600nm为1.0。
将鼠耳芥属种子种植到土壤中并且在20℃下生长室内孵育几周(例如4周)，直到它们开始开花。将花序浸入细菌混悬液；或者将细菌混悬液喷在植物上。将植物保持在箱内1天且此后在20℃无遮盖下生长直至产生种子(约3-4周)。收获种子，然后在旋转器上用70％(v/v)乙醇，随后用20％(v/v)Triton X-100进行表面灭菌20分钟。将种子在无菌蒸馏水中充分洗涤，然后使其在含有1x MS盐、3％蔗糖、0.05％MES-KOH pH5.7、0.8％Phytagel和30mg/L潮霉素的平板上发芽。
将推定的转化体置于土壤中并且转入温室。在此阶段，测定叶的GUS活性以便测定T-DNA的存在。图13显示了使用根瘤菌属种类的菌株的转化实验结果。在本实验中，300粒种子中有1粒为潮霉素抗性的。结果表明根瘤菌属的种类NGR234可以通过花浸入转化转化鼠耳芥属种系。在类似的实验中，含有pTi3和pCAMBIA1105.1R的苜蓿中华根瘤菌菌株产生3株潮霉素抗性鼠耳芥属幼苗，它们表达GUS并且具有如通过扩增揭示并通过DNA印迹分析证实的整合的pCAMBIA1105.1R特异性MCS和HygR标记。
如上所述进一步进行鼠耳芥属的花浸入转化，但不同的是使用改良的渗入培养基。通过改变pH、蔗糖浓度和Silwet浓度来改变渗入培养基。通过阳性GUS染色并且如本文所述使用mcs-特异性引物扩增来证实所得转化体。
使用的不同类型的培养基包括：(i)低蔗糖培养基(1X MS盐，1％蔗糖，50mM MES-KOH pH5.7，0.1％ Silwet L-77)；(ii)低S ilwet培养基(1X MS盐，5％蔗糖，50mM MES-KOH pH5.7，0.02％ SilwetL-77)；(iii)pH7培养基(1X MS salts，5％蔗糖，50mM MES-KOH pH7，0.1％Silwet L-77)；和组合培养基(1X MS盐，1％蔗糖，50mM MES-KOHpH7，0.02％ Silwet L-77)。
下表中列出的结果提示通过使用组合培养基获得由苜蓿中华根瘤菌改善的转化频率，在组合培养基中使Silwet和蔗糖浓度降低且使pH增加。此外，当使用pH7培养基时，也提高了由根瘤菌属的种类改善的转化频率。
表15
  渗入培养基   苜蓿中华根瘤菌   根瘤菌属的种类
  转化体/种子   转化频率   转化体/种子   转化频率
  标准品(5％蔗糖，0.1％Silwet，pH5.7)   1/6790   0.015％   0/5450   ＜0.02％
  低Silwet(0.02％)   0/2230   ＜0.04％   0/4160   ＜0.02％
  低蔗糖(1％)   0/4750   ＜0.02％   0/3490   ＜0.03％
  pH  7   0/5230   ＜0.02％   2/5370   0.04％
  组合   2/4080   0.05％   0/2000   ＜0.05％
实施例12
根瘤菌介导的完整植物的转化
已经大量研发了植物转化方案用于土壤杆菌属介导的转化。使用本发明的以不同方式与植物和植物组织发生相互作用的细菌，改进了用于转化的方案和组织，以便适应细菌-植物相互作用的具体特征。在本实施例中，将含有pTi和二元载体的根瘤菌种类用于菜豆(Phaseolus sativa)的完整植物转化。用于本实施例的细菌为根瘤菌属的种类NGR234(ANU240)和苜蓿中华根瘤菌1021菌株，它们均含有pTi3和pCAMBIA1105.1R。将在含有卡那霉素(40mg/L)和壮观霉素(80mg/L)的液体TY培养中生长至600nm处的OD为1.5的细胞沉淀，重新悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的AAM培养基中并且用于植物共培养。
给菜豆表面灭菌并且使其在培养皿中的湿滤纸上发芽。将幼苗在细菌混悬液中孵育30分钟，吸干并且转移至湿滤纸上。5天共培养后，通过用X-GlcA处理测定幼苗的GUS活性。在幼苗上的GUS转化灶表明存在已经获得并且表达含GusPlus的T-DNA的细胞。
实施例13
转化载体插入位点的分析
可以使用多种众所周知的方法中的任一种测定位于T-DNA插入位点侧翼的植物DNA序列。就本实施例而言，使用称作限制性消化/连接物连接的技术建立侧翼序列(Cottage等，2001.Plant Mol.BiolRep.19，321-327)。简言之，使用限制酶，诸如DraI或不在T-DNA内切割的另一种酶将植物DNA消化完全。在限制的热失活后，通过用氯仿提取将其取出。通过乙醇沉淀收集DNA。
在退火条件下将寡核苷酸ADAPL和ADSPS和ADSPS一起孵育，与消化的基因组DNA混合并且与基因组DNA连接。
使用寡核苷酸API以及对位于邻近左侧(HYGR1，HYGR2)或右侧(GPFW1，GPFW2，GPFW3，NOSpolyAfw)T-DNA边缘的T-DNA序列具有特异性的引物进行连接物连接的基因组DNA扩增，所述的寡核苷酸API在其5’端上具有EcoRI识别序列且然后是与ADAPL相同的序列。下列参数用于扩增：最初为94℃下的2分钟变性，随后是94℃下30秒、60℃下30s、68℃下4分钟的30个循环和68℃下10分钟的1个循环。将扩增反应体系稀释100倍，此后使用嵌套衔接引物NAP1和对接近左或右侧T-DNA边缘的T-DNA序列具有特异性的嵌套引物进行第二轮扩增。使扩增产物在琼脂糖凝胶上运行。从凝胶上纯化条带并且对其进行DNA序列反应和分析。
表16
  寡核苷酸   序列   SEQ ID No.
ADAPL   CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGC AGGT 84
  ADSPS   P-ACCTGCCC-H2N*   85
  API   GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC   86
  NAP1   TATAGGGCTC GAGCGGC   87
  HYGR1   GGCTGTGTAG AAGTACTCGC CGATAGT   88
  HYGR2   TTCGATGATG CAGCTTGGGC GC   89
  GPFW1   CTTCGATGGC GGTGATCTCG   90
  GPFW2   CGATGAGTTT GAGAACTTCG TGGGT   91
  GPFW3   GACCAACATT CCAGATTTCG GCTA   92
  NOSpolyAfw   GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT   93
*P＝PO4，磷酸化5’端；H2N＝胺基
获得了用于转化的烟草、稻米和鼠耳芥属植物的位于左和右侧T-DNA边缘插入位点序列侧翼的植物序列并且将它们列在下表中。
表17
  植物   插入位点上的序列  SEQ  IDNo.
  T-DNA-RB-基因组侧翼DNA
  烟草3-5   tatcagtgttTGAAGCCACTTTGCTTCTTCGTTTTTTTC   94
  tatcagtgttTGAAGAATCTAGGTATTTCAATTTGGTTG   95
  烟草15   tatcagt ttTGATAGTACGTGATTTAGCTCGGGATTTA   96
  烟草16-2   tatcagtgttTGACCCGATCAGCACCAAGTGCGGAACAT   97
稻米001   tatcagtgttTG GTGTGAGAGGAGACGAGGCGAGAGTGOSJNBa 0081F16 98
鼠耳芥属5   tatcagtgttTGAATGTTAATTTAATTATAAAACATGTAT23G18 99
鼠耳芥属6   tatcagtgttTGACCGGATCGATGGATGCAAAATTGTGAF16B3 100
  T-DNA-LB-基因组侧翼DNA
  烟草3-5   acattaaaaa#AAGTGATCATTAGACTTTCACACCCA   101
  鼠耳芥属4   gtgttattaa*CTACTTCGAGAATCCCCAATGTTACC PP2C   102
鼠耳芥属5   gcgtcaatttGTTTACAATGTTTTACAAGTTTTAATCTCT23G18 103
鼠耳芥属7   gcgtcaatttGTTTACAACATTCATATAAACATAGATTT22E19 104
*，与pCAMBIA1105.1R匹配的#序列终止于#38bp或*LB序列前16bp
位于鼠耳芥属植物#4中单一T-DNA插入物侧翼的序列表现出与拟南芥(A.thaliana)染色体I上的蛋白磷酸酶2C基因完全匹配。此外，用于鼠耳芥属植物#5的T-DNA插入位点的序列在左和右侧边缘表现出与鼠耳芥属染色体I(BAC克隆T23G18和T6D22)中位点的匹配，但在插入位点上存在20bp缺失。用于鼠耳芥属植物#6的T-DNA插入位点位于染色体III(鼠耳芥属BAC F16B3)上。
对稻米植物中单一T-DNA整合位点的分析表明T-DNA被整合入稻米染色体ll(BAC克隆OSJNBa0081F16；图X)。烟草的结果表明T-DNA已经整合入独立的基因座(图X)。此外，单拷贝的插入频率极高。
实施例14
苜蓿中华根瘤菌介导的转基因植物子代中GUS活性或潮霉素抗性的分离
通过以上实施例中教导的方案，使用中华根瘤菌属转化稻米、烟草和鼠耳芥属。在幼苗阶段中检验下一代的GUS活性。给稻米种子表面灭菌并且使其在含有潮霉素的培养基上进行体外发芽。使烟草和鼠耳芥属种子在土壤中发芽。DNA印迹分析表明所有转基因亲代植物均具有单拷贝的T-DNA插入片段且因此GUS活性和潮霉素应按3∶1分离。
表18
  种   植物序号  具有GUS活性的幼苗数量  没有GUS活性的幼苗数量  χ2(概率)
  烟草   Sm01-2   22   6   0.190(0.663)
  Sm02-2   0   27   9.00(0.003)
  Sm05-2   26   13   1.44(0.229)
  鼠耳芥属   3   15   3   0.667(0.414)
  稻米   Sme001   13*   8*   1.92(0.166)
*使稻米幼苗在含有潮霉素的培养基上发芽，并且在该培养基上，13粒种子发芽，而8粒种子未发芽。所有13粒发芽的种子均具有GUS活性，而对未发芽的种子没有测定出GUS活性。
基于卡方检验，在观察到的与预计的幼苗数量之间无显著性差异，表明GUS活性(或潮霉素抗性)，但不包括烟草植物Sm02-2。因此，这些结果证实功能性gus和hygR基因以预计的3∶1比例的遗传性。
从上文中可以理解，尽管本文为解释目的描述了本发明的具体实施方案，但是可以在不脱离本发明实质和范围的情况下进行各种变型。因此，本发明并不限于它们，而由所附的权利要求限定。
序列表
SEQ ID 名称                           序列5’-3’
NO.
116S rDNA根瘤菌属的种类NGR234        参见图3
2a tpD根瘤菌属的种类NGR234           参见图3
3recA根瘤菌属的种类NGR234            参见图3
416S rDNA苜蓿中华根瘤菌1021          参见图3
5 atpD苜蓿中华根瘤菌1021             参见图3
6 recA 苜蓿中华根瘤菌1021            参见图3
7 16S  rDNA  百脉中间根瘤菌          参见图3
MAFF 303099
8 atpD 百脉中间根瘤菌MAFF303099      参见图3
9 recA 百脉中间根瘤菌MAFF303099      参见图3
10 16S rDNA 紫金牛叶杆菌             参见图3
11 atpD 紫金牛叶杆菌                 参见图3
12 16S rDNA 大豆慢生根瘤菌USDA110    参见图3
13 atpD 大豆慢生根瘤菌USDA110        参见图3
14 recA 大豆慢生根瘤菌USDA110        参见图3
15 16S rDNA根癌土壤杆菌EHA105        参见图3
16 atpD 根癌土壤杆菌EHA105           参见图3
17 recA 根癌土壤杆菌EHA105           参见图3
18  Rle16Sfw                         CACGTAGGCGGATCGATC
19 Rle16Srev                         TTAGCTCACACTCGCGTGCT
20 Atu16Sfw                          GGCTTAACACATGCAAGTCGAAC
21 Atu16Srev                         CGGGGCTTCTTCTCCGACT
22 Atu16Sfw2                         GAATAGCTCTGGGAAACTGGAAT
23 AttScircfw                        CAGGCTCAAACCGCATTTCC
24 AttScircrev                       GTAAGTCCAGCCTCTTTCTCA
25 AttSpATfw                         GTGCTTCGGATCGACGAAAC
26 AttSpATrev                        GGAGAATGGGAGTGACCTGA
27 AtuvirGfw                         CGCTAAGCCGTTTAGTACGA
28 AtuvirGrev                        CCCCTCACCAAATATTGAGTGTAG
29 NptIfw                            CAGGTGCGACAATCTATCGA
30 NptIrev                           AGCCGTTTCTGTAATGAAGG
31 VirBfw                            TGACCTTGGCCAGGGAATTG
32 VirBrev                           TCCTGTCATTGGCGTCAGTT
33 Sme16Sfw                          TGTGCTAATACCGTATGAGC
34 Sme16Srev                         CAGCCGAACTGAAGGATACG
35 NodD1NGR234fw                     GCCAGAAATGTTCATGTCGCACA
36         NodD1NGR234rev    AATGGGTTGCGGAAGTTCGGT
37         SmeNodQfw         GACAGGATCCTCCACGCTCA
38         SmeNodQrev        CGCCAGGTCGTTCGGTTGG
39         SmeNodQ2rev       GCTCATAGGGCGAGGATACA
40         VirB11FW2         ACGGCGCGAATCCAATCCAA
41         M13REV            CAGGAAACAGCTATGAC
42         M13FW             GTAAAACGACGGCCAG
43         MoaArev2          TAAGCGTCCCATCGAGATCG
44         HygRfw            GCATCTCCCGCCGTGCACAG
45H        ygRrev            GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG
46         1405.1fw          CTGGCACGACAGGTTTC
47         16Sfw63           CAGGCTTAACACATGCAAGTC
48         16Srev801         ACCAGGGTATCTAATCCTGT
49         16Sfw714          GAACACCAGTGGCGAAGGC
50         16Srev1492        CGGCTACCTTGTTACGACTT
51         atpDfw294         ATCGGCGAGCCGGTCGACGA
52         AtpDrev771        GCCGACACTTCCGAACCNGCCTG
53         recAfw63          ATCGAGCGGTCGTTCGGCAAGGG
54         RecArev504        TTGCGCAGCGCCTGGCTCAT
55         Mlo16Sfw          CCCATCTCTACGGAACAACT
56         Mlo16Srev         ACTCACCTCTTCCGGACTCG
57         MlopMLaRepCfw     GACGGCCGAGCCAAGGACGA
58         MlopMLRepCrev     CACATGGCAAGCCTCCTCA
59         MlopM1brepCfw     GATGCTGGAAAGCTTCACAAGT
60         Pmy16Sfw          CTGGTAGTCTTGAGTTCGAG
61         Pmy16Srev         CCAGCCTAACTGAAGGAAAC
62         PmyGyrBfw         CTGGCTGCGTCTCAAGATTC
63         PmyGyrBrev        CCTTTGCCTTCTTCGCCTGC
64         Bja16Sfw          GGGCGTAGCAATACGTCA
65         Bja16Srev         CTTCGCCACTGGTGTTCTTG
66         VirB11fw          ATAAGCTTCTCTACGGCGATCGATGTCA
67         VirC2rev          ATCTGCAGTGCTCGAGGTCGCTCGAAGT
68         MoaAfw            ATGGATCCGGTCTTGAAAGCTTGGCTCA
69         MoaArev           ATGGATCCTGCCGTGGTCTCGTGTTCTGG
70         AccAfw            ATGGATCCGAGCAGGGAGAGGACAACCA
71         AccArev           ATGGATCCTCGGGTCCTGAAAGATCATC
72         OriTfw            GGATCCTCTAGACTGGAAGGCAGTACACCT
                             TGATAG
73         OriTrev           GGATCCTCTAGATTCCTGCATTTGCCTGTT
                      TCCAG
74      AccAfw2       AGCTGCGGAAGAAGCTCGT
75      MoaArev2      TAAGCGTCCCATCGAGATCG
76      SpecfwNsiI    ATGCATGATATATCTCCCAATTTGTG
77      SpecrevSacII  CCGCGGATGACAGAGCGTTGCTGCCTGTGA
                      TCAATT
78      SpecfwSacII   CCGCGGCATGATATATCTCCCAATTT
79P     35S5’rev     TACGGCGAGTTCTGTTAGGT
80      RP4fw         AGCTGGCTGACGAACCTGCG
81      RP4rev        GGCGTCCTTGGAACGATGCT
82      Hyg700fw      ACTCACCGCGACGTCTGTC
83      Hyg700rev     GCGCGTCTGCTGCTCCAT
84      ADAPL         CTAATACGAC TCACTATAGG
                      GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT
85      ADSPS         P-ACCTGCCC-H2N*
86      API           GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC
87      NAPI          TATAGGGCTC GAGCGGC
88      HYBR1         GGCTGTGTAG AAGTACTCGC CGATAGT
89      HYGR2         TTCGATGATG CAGCTTGGGC GC
90      GPFW1         CTTCGATGGC GGTGATCTCG
91      GPFW2         CGATGAGTTT GAGAACTTCG TGGGT
92      GPFW3         GACCAACATT CCAGATTTCG GCTA
93      NOSpolyAfw    GGGTTTTTAT GATTAGAGTC
                      CCGCAATTAT
94      烟草3-5       tatcagtgt tTGAAGCCACTTTGCTTCTTC
                      GTTTTTTTC
95                    tatcagtgt tTGAAGAATCTAGGTATTTCA
                      ATTTGGTTG
96      烟草15        tatcagt
                      ttTGATAGTACGTGATTTAGCTCGGGATTT
                      A
97      烟草16-2      tatcagtgttTGACCCGATCAGCACCAAGT
                      GCGGAACAT
98      稻米001       tatcagtgttTG
                      GTGTGAGAGGAGACGAGGCGAGAGTG
                      OSJNBa0081F16
99      鼠耳芥属5     TATCAGTGTTTGAATGTTAATTTAATTATA
                      AAACATGTA T23G18
100     鼠耳芥属6     TATCAGTGTTTGACCGGATCGATGGATGCA
                     AAATTGTGA F16B3
101      烟草3-5L    acattaaaaa#
                     AAGTGATCATTAGACTTTCACACCCA
102      鼠耳芥属4   gtgttattaa*
                     CTACTTCGAGAATCCCCAATGTTACC
                     PP2C
103      鼠耳芥属5L  GCGTCAATTTGTTTACAATGTTTTACAAGT
                     TTTAATCTC T23G18
104      鼠耳芥属7G  CGTCAATTTGTTTACAACATTCATATAAA
                     CATAGATT T22E19
序列表
<110>CAMBIA
<120>用于真核细胞的生物基因转移系统
<130>CAMBIA 414PC
<150>60/583,426
<151>2004-06-28
<150>10/954147
<151>2004-09-28
<150>10/953392
<151>2004-09-28
<160>104
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1408
<212>DNA
<213>根瘤菌属的种类NGR234(菌株ANU240)
<400>1
cttaacacat gcaagtcgag cgccccgcaa ggggagcggc agacgggtga gtaacgcgtg     60
ggaatctacc cttttctacg gaataacgca gggaaacttg tgctaatacc gtatgagccc    120
ttcgggggaa agatttatcg ggaaaggatg agcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg    180
taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag ccacattggg    240
actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg    300
caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggccc tagggttgta aagctctttc    360
accggtgaag ataatgacgg taaccggaga agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc    420
cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg    480
cggacattta agtcaggggt gaaatcccgg ggctcaaccc cggaactgcc tttgatactg    540
ggtgtctaga gtccggaaga ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat     600
attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc tcactggtcc ggtactgacg ctgaggtgcg     660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg     720
ttagccgtcg ggcagtttac tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca ttccgcctgg     780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga     840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca tcccggtcgc     900
ggatacgaga gatcgtatcc ttcagttcgg ctggaccgga gacaggtgct gcatggctgt     960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt    1020
agttgccagc atttggttgg gcactctaag gggactgccg gtgataagcc gagaggaagg    1080
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg    1140
tggtgacagt gggcagcgag accgcgaggt cgagctaatc tccaaaagcc atctcagttc    1200
ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca    1260
tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg    1320
ttctacccga aggtagtgcg ctaaccgcaa ggaggcagct aaccacggta gggtcagcga    1380
ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccg                                       1408
<210>2
<211>487
<212>DNA
<213>根瘤菌属的种类NGR234(ANU240菌株)
<400>2
cgacgaagcc ggcccggtcg agacctcgtc gcgccgcgcc atccaccagg cacgcgccgg     60
cctatgtcga gcagtcgacg gaagcgcaga tcctcgtcac cggcatcaag gtcgtcgacc    120
tgctggcgcc ttacgcaaag ggcggcaaga tcggcctctt cggcggcgca ggcgtcggca    180
agaccgttct gatcatggaa ctgatcaaca acgtcgcaaa ggcccacggc ggctactcgg    240
ttttcgcggg cgtcggtgaa cgcacgcgcg aaggcaacga cctctaccac gaaatgatcg    300
aatccggcgt gaacaagcac ggcggcggcg aaggctccaa ggcagccctg gtttacggcc    360
agatgaacga accgccgggc gcccgcgccc gcgtcgcact caccggtctg acgatcgccg    420
agcatttccg tgacgaaggt caggacgttc tcttcttcgt cgacaacatc ttccgcttca    480
cccaggc                                                              487
<210>3
<211>474
<212>DNA
<213>根瘤菌属NGR234(ANU240)
<400>3
tcggcaaggg atcgatcatg aagctcggct cgaaggacag cgtaatcgag atcgaaactg     60
tttcgaccgg ctcgctcggc ctcgatatcg cgctcggcat cggcggtctg ccgaaagggc    120
gcatcattga aatctatggt ccggaaagct cgggcaagac gacgctggcg ctgcaaacca    180
ttgccgaagc gcaaaaaaag ggcggcatct gcggtttcgt cgacgccgaa catgcgctcg    240
atccggttta tgcgcgcaaa ctgggcgtcg acctcgaaaa cctgctgatc tcgcagcccg    300
ataccggtga acaggcgctc gaaatcaccg acacgctggt tcgctccggt gcaatcgacg    360
tgctcgtcgt cgactcggtt gcagcgctcg tgccgcgcgc cgaaatcgaa ggcgagatgg    420
gcgacagcct gccgggcatg caggcccgcc tgatgagcca ggcgctgcgc aaat          474
<210>4
<211>1395
<212>DNA
<213>苜蓿中华根瘤菌1021
<400>4
ggcttaacac atgcaagtcg agcgccccgc aaggggagcg gcagacgggt gagtaacgcg     60
tgggaatcta cccttttcta cggaataacg cagggaaact tgtgctaata ccgtatgagc     120
ccttcggggg aaagatttat cgggaaagga tgagcccgcg ttggattagc tagttggtgg     180
ggtaaaggcc taccaaggcg acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg     240
ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg     300
cgcaagcctg atccagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cctagggttg taaagctctt     360
tcaccggtga agataatgac ggtaaccgga gaagaagccc cggctaactt cgtgccagca     420
gccgcggtaa tacgaagggg gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta     480
ggcggattgt taagtgaggg gtgaaatccc agggctcaac cctggaactg cctttcatac     540
tggcaatcta gagtccagaa gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag     600
atattcggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggt ctggaactga cgctgaggtg     660
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa     720
tgttagccgt cgggcagttt actgttcggt ggcgcagcta acgcattaaa cattccgcct     780
ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg     840
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagcccttga catcccgatc     900
gcggatacga gagatcgtat ccttcagttc ggctggatcg gagacaggtg ctgcatggct     960
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgccc    1020
ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggggactgc cggtgataag ccgagaggaa    1080
ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggctg ggctacacac gtgctacaat    1140
ggtggtgaca gtgggcagcg agaccgcgag gtcgagctaa tctccaaaag ccatctcagt    1200
tcggattgca ctctgcaact cgagtgcatg aagttggaat cgctagtaat cgcagatcag    1260
catgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt    1320
ggttctaccc gaaggtagtg cgctaaccgc aaggaggcag ctaaccacgg tagggtcagc    1380
gactggggtg aagtc                                                    1395
<210>5
211>362
<212>DNA
<213>苜蓿中华根瘤菌1021
<400>5
gctccctatg cgaagggcgg caagatcggc ctcttcggcg gcgcgggcgt cggcaagacc     60
gtgctgatca tggaactgat caacaacgtc gccaaggcgc acggcggtta ctccgtcttc    120
gcaggcgtcg gtgaacggac ccgcgaaggc aacgacctct atcacgaaat gatcgagtcc    180
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ttccgtgacg aaggccagga cgttctcttc ttcgtcgaca acatcttccg cttcacccag    360
gc                                                                   362
<210>6
<211>462
<212>DNA
<213>苜蓿中华根瘤菌1021
<400>6
gttcggcaag ggatcgatca tgaagctcgg agcgaaggac agcgtagttg agatcgaaac     60
cgtctccacc ggttcgctcg gcctcgatat cgcgctcggc atcggcggcc tgccgaaggg    120
ccgtatcatc gagatctatg gtccggaaag ctcgggcaag acgacgctgg cgctgcagac    180
cattgccgag gcacagaaga agggcggcat ctgcggcttc gtcgatgccg agcatgcact    240
cgatccggtc tatgcacgaa agctcggggt cgatctcgaa aatctcctga tttcgcagcc    300
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gggcgacagt ctgccgggca tgcaggcgcg cctcatgagc ca                       462
<210>7
<211>1349
<212>DNA
<213>百脉中间根瘤菌MAFF303099
<400>7
cgggtgagta acgcgtggga atctacccat ctctacggaa caactccggg aaactggagc      60
taataccgta tacgtccttt tggagaaaga tttatcggag atggatgagc ccgcgttgga     120
ttagctagtt ggtggggtaa tggcctacca aggcgacgat ccatagctgg tctgagagga     180
tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga     240
atattggaca atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag     300
ggttgtaaag ctctttcaac ggtgaagata atgacggtaa ccgtagaaga agccccggct     360
aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg aattactggg     420
cgtaaagcgc acgtaggcgg atacttaagt caggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg     480
aactgccttt gatactgggt atctcgagtc cggaagaggt gagtggaatt ccgagtgtag     540
aggtgaaatt cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggtccggt     600
actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggagtccacg     660
ccgtaaacga tggaagctag ccgttggcaa gtttacttgt cggtggcgca gctaacgcat     720
taagcttccc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc     780
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc     840
ttgacatccc ggtcgcggtt tccagagatg gataccttca gttcggctgg accggtgaca     900
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag     960
cgcaaccctc gcccttagtt gccagcattc agttgggcac tctaagggga ctgccggtga    1020
taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac    1080
acacgtgcta caatggtggt gacagtgggc agcgagaccg cgaggtcgag ctaatctcca   1140
aaagccatct cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag   1200
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc   1260
acaccatggg agttggtttt acccgaaggc gctgtgctaa ccgcaaggag gcaggcgacc   1320
acggtagggt cagcgactgg ggtgaagtc                                     1349
<210>8
<211>510
<212>DNA
<213>百脉中间根瘤菌MAFF303099
<400>8
ttatcggcga gccggtcgac gaagagggcc cggtcgatgc gatcgagatg cgctccatcc     60
accagccggc tccgacctat gtcgagcagt cgacggaagc gcagatcctg atcaccggca    120
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<210>9
<211>438
<212>DNA
<213>百脉中间根瘤菌MAFF 303099
<400>9
ggcgaacgag caggtcgtcg agatcgaaac cgttgccgac cggctcgctc ggcctcgaca    60
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gactgatgag ccaggcgc                                                  438
<210>10
<211>1368
<212>DNA
<213>紫金牛叶杆菌Cambia分离物
<400>10
cttaacacat gcaagtcgag cgccccgcaa ggggagcggc agacgggtga gtaacgcgtg     60
ggaatctacc catctctacg gaataacgca tggaaacgtg tgctaatacc gtatacgtcc    120
ttcgggagaa agatttatcg gagatggatg agcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg    180
taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg    240
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg    300
caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggccc tagggttgta aagctctttc    360
accggtgaag ataatgacgg taaccggaga agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc    420
cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggatttact gggcgtaaag cgcacgtagg    480
cggactatta agtcaggggt gaaatcccgg ggctcaaccc cggaactgcc tttgatactg    540
gtagtcttga gttcgagaga ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat    600
attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc tcactggctc gatactgacg ctgaggtgcg    660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa actatgagag     720
ctagccgtcg ggcagtatac tgttcggtgg cgcagcaaac gcattaagct ctccgcctgg     780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga     840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca tcccgatcgc     900
ggttaccaga gatggtttcc ttcagttagg ctggatcggt gacaggtgct gcatggctgt     960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt    1020
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tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg    1140
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ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa    1260
tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg    1320
ttttacccga aggtgctgtg ctaaccgcaa ggaggcaggc aaccacgg                 1368
<210>11
<211>483
<212>DNA
<213>紫金牛叶杆菌Cambia分离物
<400>11
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ggc 483
<210>12
<211>1382
<212>DNA
<213>大豆慢生根瘤菌USDA110
<400>12
tagcaagtcg agcgggcgta gcaatacgtc agcggcagac gggtgagtaa cgcgtgggaa     60
cgtacctttt ggttcggaac aacacaggga aacttgtgct aataccggat aagcccttac    120
ggggaaagat ttatcgccga aagatcggcc cgcgtctgat tagctagttg gtagggtaac    180
ggcctaccaa ggcgacgatc agtagctggt ctgagaggat gatcagccac attgggactg    240
agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggggcaac    300
cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc tcttttgtgc    360
gggaagataa tgacggtacc gcaagaataa gccccggcta acttcgtgcc agcagccgcg    420
gtaatacgaa gggggctagc gttgctcgga atcactgggc gtaaagggtg cgtaggcggg    480
tctttaagtc aggggtgaaa tcctggagct caactccaga actgcctttg atactgaaga    540
tcttgagttc gggagaggtg agtggaactg cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc    600
gcaagaacac cagtggcgaa ggcggctcac tggcccgata ctgacgctga ggcacgaaag    660
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgccag    720
ccgttagtgg gtttactcac tagtggcgca gctaacgctt taagcattcc gcctggggag    780
tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat    840
gtggtttaat tcgacgcaac gcgcagaacc ttaccagccc ttgacatgtc caggaccggt    900
cgcagagatg tgaccttctc ttcggagcct ggaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag    960
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccccgt ccttagttgc   1020
taccatttag ttgagcactc taaggagact gccggtgata agccgcgagg aaggtgggga   1080
tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac acgtgctaca atggcggtga   1140
caatgggatg ctaaggggcg acccttcgca aatctcaaaa agccgtctca gttcggattg   1200
ggctctgcaa ctcgagccca tgaagttgga atcgctagta atcgtggatc agcacgccac   1260
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag ttggctttac   1320
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gt                                                                  1382
<210>13
<211>504
<212>DNA
<213>大豆慢生根瘤菌USDA110
<400>13
cgatcgacga agccggcccg gtcaagtcgg aaggcctgcg cgccatccac caggaagcgc     60
cgacctacac cgaccagtcc accgaagctg aaattctcgt caccggcatc aaggtcgtcg    120
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cgctggtgtt cggccagatg aacgagccgc cgggcgcccg cgcccgcgtc gcgctcaccg    420
gtctgaccat cgcggaagac ttccgcgaca agggccagga cgtgctgttc ttcgtcgaca    480
acatcttccg cttcacccag gccg                                           504
<210>14
<211>438
<212>DNA
<213>大豆慢生根瘤菌USDA110
<400>14
cccggcagcg catcgcccat ctcgccctcg agttcggcct tcggcaccag cgccgcgacc     60
gaatcgacca ccagaacgtc caccgcaccc gagcgcacca gcgtgtcgca gatttccagc    120
gcctgctcgc cggtgtccgg ctgcgaaatc agcagctcgt cgatattgac cccgagcttg    180
cgtgcataga ccgggtcgag cgcgtgctcg gcgtcgatga aggcacagat gccgcccttc    240
ttctgcgctt ccgccaccgt gtgcagcgcc agcgtggtct tgcccgagga ttccggcccg    300
tagatttcca cgacgcgccc cttgggcaga ccgccgatcc ccagtgcaat gtcgagcccg    360
agagaaccgg aggacaccgc ctcgacatcc atcgaccggt cgttcttgcc gagcttcatc    420
accgagccct tgccgaac                                                  438
<210>15
<211>1433
<212>DNA
<213>根癌土壤杆菌EHA105
<400>15
caagtcgaac gccccgcaag gggagtggca gacgggtgag taacgcgtgg gaatctaccc     60
atctctgcgg aatagctctg ggaaactgga attaataccg catacgccct acgggggaaa    120
gatttatcgg ggatggatga gcccgcgttg gattagctag ttggtggggt aaaggcctac    180
caaggcgacg atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacattggga ctgagacacg    240
gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc    300
cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca ccgatgaaga    360
taatgacggt agtcggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac    420
gaagggggct agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggatatttaa    480
gtcaggggtg aaatcccgca gctcaactgc ggaactgcct ttgatactgg gtatcttgag    540
tatggaagag gtaagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa    600
caccagtggc gaaggcggct tactggtcca ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg    660
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgtcgg    720
gcagtatact gttcggtggc gcagctaacg cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc    780
gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt    840
aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag ctcttgacat tcggggtatg ggcattggag    900
acgatgtcct tcagttaggc tggccccaga acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt    960
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccctta gttgccagca   1020
tttagttggg cactctaagg ggactgccgg tgataagccg agaggaaggt ggggatgacg   1080
tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg   1140
ggcagcgaga cagcgatgtc gagctaatct ccaaaagcca tctcagttcg gattgcactc   1200
tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc agatcagcat gctgcggtga   1260
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggt tttacccgaa   1320
ggtagtgcgc taaccgcaag gaggcagcta accacggtag ggtcagcgac tggggtgaag   1380
tcgtaacaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca cctcctttct aag          1433
<210>16
<211>485
<212>DNA
<213>根癌土壤杆菌EHA105
<400>16
gacgaagccg gtccgatcgt aacggccaag aagcgcgcca tccaccagga cgcaccgtct     60
tacgtcgagc agtcgacgga aggccagatc ctcgtcaccg gcatcaaggt cgtcgacctt    120
ctcgctcctt acgccaaggg cggcaagatc ggcctcttcg gcggcgccgg cgtgggcaag    180
acggttctca tcatggaact gatcaacaac gtcgccaagg cgcatggtgg ttactcggta    240
ttcgccggcg tgggtgagcg tacccgcgaa ggcaacgacc tttatcacga aatgatcgag    300
tcgaacgtca acaagctcgg tggcggcgaa ggctccaagg ctgcgctcgt gtacggccag    360
atgaacgaac cgccgggcgc ccgcgctcgc gtcgctctga ccggtctgac gatcgctgaa    420
aacttccgtg atgaaggcca ggacgttctg ttcttcgtgg acaacatctt ccgcttcacg    480
caggc                                                                485
<210>17
<211>400
<212>DNA
<213>根癌土壤杆菌EHA105
<400>17
ggcaagggat cgatcatgaa gctcggttcc aatgaaaatg tggttgaagt ggaaaccgtt     60
tcgacgggct cgctcagcct ggatatcgcg ctcggcatcg gcggcttgcc gaaggggcgt    120
atcattgaga tttacggccc ggaaagctcc ggtaaaacga cgctggcgct gcagacgatc    180
gcggaagccc agaagaaggg cggcatctgc gccttcgtgg acgccgaaca cgcgctcgat    240
ccggtttatg cccgcaagct cggtgtggat ttgcagagcc ttctgatctc gcagcccgat    300
accggcgagc aggcgcttga gatcaccgat acgctggtgc gttcgggcgc tgtggacgtt    360
cttgtcatcg attcggttgc ggccttgacg ccgcgggcgg                          400
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>18
cacgtaggcg gatcgatc                                                  18
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>19
ttagctcaca ctcgcgtgct        20
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>20
ggcttaacac atgcaagtcg aac    23
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>21
cggggcttct tctccgact         19
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>22
gaatagctct gggaaactgg aat    23
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>23
caggctcaaa ccgcatttcc        20
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>24
gtaagtccag cctctttctc a      21<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>25
gtgcttcgga tcgacgaaac    20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>26
ggagaatggg agtgacctga         20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>27
cgctaagccg tttagtacga         20
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>28
cccctcacca aatattgagt gtag    24
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>29
caggtgcgac aatctatcga         20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>30
agccgtttct gtaatgaagg          20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>31
tgaccttggc cagggaattg          20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>32
tcctgtcatt  ggcgtcagtt         20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>33
tgtgctaata ccgtatgagc        20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>34
cagccgaact gaaggatacg        20
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>35
gccagaaatg ttcatgtcgc aca    23
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>36
aatgggttgc ggaagttcgg t      21
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>37
gacaggatcc tccacgctca    20
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>38
cgccaggtcg ttcggttgg     19
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>39
gct cataggg cgaggataca   20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>40
acggcgcgaa tccaatccaa    20
<210>41
<211>17
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>41
caggaaacag ctatgac       17
<210>42
<211>16
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>42
gtaaaacgac ggccag        16
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>43
taagcgtccc atcgagatcg    20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>44
gcatctcccg ccgtgcacag       20
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>45
gatgcctccg ctcgaagtag cg    22
<210>46
<211>17
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>46
ctggcacgac aggtttc          17
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>47
caggcttaac acatgcaagt c     21
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>48
accagggtat ctaatcctgt    20
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>49
gaacaccagt ggcgaaggc     19
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>50
cggctacctt gttacgactt    20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>51
atcggcgagc cggtcgacga    20
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<220>
<221>misc_特征
<222>(18)..(18)
<223>n is a，c，g，or t
<400>52
gccgacactt ccgaaccngc ctg    23
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>53
atcgagcggt cgttcggcaa ggg    23
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>54
ttgcgcagcg cctggctcat        20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>55
cccatctcta cggaacaact    20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>56
actcacctct tccggactcg    20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>57
gacggccgag ccaaggacga    20
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>58
cacatggcaa gcctcctca        19
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>59
gatgctggaa agcttcacaa gt    22
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>60
ctggtagtct tgagttcgag       20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>61
ccagcctaac tgaaggaaac       20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>62
ctggctgcgt ctcaagattc    20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>63
cctttgcctt cttcgcctgc    20
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>64
gggcgtagca atacgtca      18
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>65
cttcgccact ggtgttcttg    20
<210>66
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>66
ataagcttct ctacggcgat cgatgtca    28
<210>67
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>67
atctgcagtg ctcgaggtcg ctcgaagt    28
<210>68
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>68
atggatccgg tcttgaaagc ttggctca    28
<210>69
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>69
atggatcctg ccgtggtctc gtgttctgg            29
<210>70
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>70
atggatccga gcagggagag gacaacca             28
<210>71
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>71
atggatcctc gggtcctgaa agatcatc             28
<210>72
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>72
ggatcctcta gactggaagg cagtacacct tgatag    36
<210>73
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>73
ggatcctcta gattcctgca tttgcctgtt tccag    35
<210>74
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>74
agctgcggaa gaagctcgt                       19
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>75
taagcgtccc atcgagatcg                      20
<210>76
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>76
atgcatgata tatctcccaa tttgtg               26
<210>77
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>77
ccgcggatga cagagcgttg ctgcctgtga tcaatt    36
<210>78
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>78
ccgcggcatg atatatctcc caattt               26
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>79
tacggcgagt tctgttaggt                      20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>80
agctggctga cgaacctgcg    20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>81
ggcgtccttg gaacgatgct    20
<210>82
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>82
actcaccgcg acgtctgtc    19
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成DNA
<400>83
gcgcgtctgc tgctccat    18
<210>84
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>衔接序列
<400>84
ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt   44
<210>85
<211>8
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>衔接序列
<400>85
acctgccc                                            8
<210>86
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>扩增引物
<400>86
ggatcctaat acgactcact atagggc                      27
<210>87
<211>17
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于扩增的嵌套衔接引物
<400>87
tatagggctc gagcggc                                 17
<210>88
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接近左侧T边缘的扩增引物
<400>88
ggctgtgtag aagtactcgc cgatagt    27
<210>89
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接近左侧T边缘的扩增引物
<400>89
ttcgatgatg cagcttgggc gc         22
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接近右侧T边缘的扩增引物
<400>90
cttcgatggc ggtgatctcg            20
<210>91
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>接近右侧T边缘的扩增引物
<400>91
cgatgagttt gagaacttcg tgggt      25
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>扩增引物
<400>92
gaccaacatt ccagatttcg gcta                    24
<210>93
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>扩增引物
<400>93
gggtttttat gattagagtc ccgcaattat              30
<210>94
<211>39
<212>DNA
<213>烟草
<400>94
tatcagtgtt tgaagccact ttgcttcttc gtttttttc    39
<210>95
<211>39
<212>DNA
<213>烟草
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<213>烟草
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<212>DNA
<213>烟草
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<212>DNA
<213>稻
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<212>DNA
<213>拟南芥
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<213>拟南芥
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<213>烟草
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<213>拟南芥
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<213>拟南芥
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Claims (38)

1.将所关注的DNA序列导入植物的方法，包括：使植物或植物组织或植物细胞或原生质体接触非病原菌，该非病原菌含有：
(i)包括用于接合转移所需的基因的第一种核酸分子；和
(ii)包括一种或多种能够转移的与所关注的DNA序列可操作地连接的序列的第二种核酸分子；
其中用于转移所需的基因产物起将所关注的DNA序列转移入植物、植物细胞、植物组织或原生质体的作用。
2.权利要求1所述的方法，其中用于接合转移所需的基因为来自土壤杆菌属的Ti质粒的vir基因。
3.权利要求1所述的方法，其中用于接合转移所需的基因为土壤杆菌属的vir基因的同源物。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的同源物为来自IncP质粒的tra基因。
5.权利要求1所述的方法，其中能够转移的序列为来自土壤杆菌属的Ti质粒的T-边缘序列。
6.权利要求1所述的方法，其中能够转移的序列为移动性质粒的oriT序列。
7.权利要求6所述的方法，其中移动性质粒为IncP质粒RK2、IncP质粒RP4、IncQ质粒RSF1010或IncQ质粒CloDF13。
8.权利要求1所述的方法，其中将第一种核酸分子整合入非病原菌的基因组。
9.权利要求1所述的方法，其中第一种和第二种核酸分子为自我复制质粒。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属，黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
11.将所关注的DNA序列导入植物的方法，包括：使植物或植物组织或植物细胞或原生质体接触非病原菌，该非病原菌含有：
(i)包括Ti质粒的vir基因区的第一种质粒；和
(ii)包括一种或多种与所关注的DNA序列可操作地连接的T-边缘序列的第二种质粒；
其中vir基因产物起将所关注的DNA序列转移入植物、植物细胞、植物组织或原生质体的作用。
12.权利要求11所述的方法，其中第一种质粒为来自土壤杆菌属的去甲型Ti质粒。
13.权利要求11所述的方法，其中第一种质粒或第二种质粒或这两种质粒进一步包括编码选择性产物的序列。
14.权利要求13所述的方法，其中编码第二种质粒的选择性产物的序列可操作地与T-边缘序列连接并且可以在植物中选择所述的产物。
15.权利要求11所述的方法，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
16.将所关注的DNA序列导入植物的方法，包括：使植物或植物组织或植物细胞或原生质体接触含有核酸分子的非病原菌，所述的核酸分子包括Ti质粒的vir基因区和一种或多种可操作地与所关注的DNA序列连接的T-边缘序列。
17.权利要求16所述的方法，其中通过包括T-边缘序列和vir基因区的载体与包括所关注的DNA序列的载体之间的同源重组形成所述的核酸分子。
18.权利要求16所述的方法，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
19.与植物细胞发生相互作用的非病原菌，包含：
(a)包括用于接合转移所需的基因的第一种核酸分子；和
(b)包括一种或多种能够转移的与所关注的DNA序列可操作地连接的序列的第二种核酸分子；
其中用于转移所需的基因产物起将所关注的DNA序列转移入植物、植物细胞、植物组织或原生质体的作用。
20.权利要求19所述的细菌，其中用于接合转移所需的基因为来自土壤杆菌属的Ti质粒的vir基因。
21.权利要求19所述的细菌，其中用于接合转移所需的基因为土壤杆菌属的vir基因的同源物。
22.权利要求19所述的细菌，其中所述的同源物为来自移动性质粒的tra基因，IncP质粒为RK2或RP4质粒。
23.权利要求19所述的细菌，其中能够转移的序列为来自土壤杆菌属的Ti质粒的T-边缘序列。
24.权利要求19所述的细菌，其中能够转移的序列为移动性质粒的oriT序列。
25.权利要求24所述的细菌，其中移动性质粒为RK2、RP4、RSF1010或CloDF13。
26.权利要求19所述的细菌，其中将第一种核酸分子整合入非病原菌的基因组。
27.权利要求19所述的细菌，其中第一种和第二种核酸分子为自我复制质粒。
28.权利要求19所述的细菌，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
29.与植物细胞发生相互作用的非病原菌，该细菌包含：
(a)包括Ti质粒的vir基因的第一种质粒；和
(b)包括一种或多种可操作地与所关注的DNA序列连接的T-边缘序列的第二种质粒；
其中vir基因产物起将所关注的DNA序列转移入植物、植物细胞、植物组织或原生质体的作用。
30.权利要求29所述的细菌，其中第一种质粒为来自土壤杆菌属的去甲型Ti质粒。
31.权利要求29所述的细菌，其中第一种质粒或第二种质粒或这两种质粒进一步包括编码选择性产物的序列。
32.权利要求29所述的细菌，其中编码第二种质粒的选择性产物的序列可操作地与T-边缘序列连接并且可以在植物中选择所述的产物。
33.权利要求29所述的细菌，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
34.与含有核酸分子的植物细胞发生相互作用的非病原菌，该细菌包括Ti质粒的vir基因区和一种或多种可操作地与所关注的DNA序列连接的T-边缘序列。
35.权利要求34所述的细菌，其中通过包括T-边缘序列和vir基因区的载体与包括所关注的DNA序列的载体之间的同源重组形成所述的核酸分子。
36.权利要求34所述的细菌，其中所述的细菌为非病原菌，该非病原菌选自根瘤菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、红球菌属、叶杆菌属、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属、苍白杆菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属组成的组。
37.生产对基因转移而言处于感受态的细菌的方法，包括如下任何次序的步骤：
(a)在所述的细菌中导入包括用于接合转移所需的基因的第一种核酸分子；和
(b)在所述的细菌中导入包括一种或多种能够转移的可操作地与所关注的DNA序列连接的序列的第二种核酸分子；
其中所述的细菌为非致病性的并且与植物细胞发生相互作用。
38.生产对基因转移而言处于感受态的细菌的方法，包括如下任何次序的步骤：
(a)在所述的细菌中导入包括Ti质粒的vir基因区的第一种质粒；和
(b)在所述的细菌中导入包括一种或多种可操作地与所关注的DNA序列连接的T-边缘序列的第二种质粒；
其中所述的细菌为非致病性的并且与植物细胞发生相互作用；且其中所得的细菌含有至少一个第一种质粒和至少一个第二种质粒。
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