KR101190255B1 - 두 가지 제초제에 대하여 저항성을 가지는 항생제 마커프리 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터를 이용한 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체에 관한 것이다.
본 발명의 크리핑 벤트그라스 식물체는 두 가지의 비선택성 제초제에 복합 저항성을 가지므로 잡초 방제효과를 향상시킬 수 있어 크리핑 벤트그라스 생산성을 높이고, 항생제 마커-프리이기 때문에 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않으며, 이의 재배시 상기 두 가지의 비선택성 제초제를 혼합 또는 체계 처리함으로써 잡초방제 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라 글리포제이트 처리 농도에 따라 초장 신장을 억제시킬 수도 있어 예초(풀베기) 작업횟수를 줄일 수 있는 장점을 가진다.

Description

두 가지 제초제에 대하여 저항성을 가지는 항생제 마커프리 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체 {ANTIBIOTICS MARKER FREE CREEPING BENTGRASS HAVING RESISTANCE AGAINST TWO HERBICIDES}
본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터를 이용한 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체에 관한 것이다.
크리핑 벤트그라스는 가축의 조사료로 이용하는 목초류 중의 하나인 동시에 한지형 잔디로서 낮은 예초에 대한 내성이 강하며 높은 질감과 조밀한 밀도 등의 우수한 잔디 특성이 있어 전 세계 골프코스의 퍼팅 그린, 티 또는 페어웨이에서 많이 이용되고 있다. 특히 크리핑 벤트그라스의 'Penncross' 품종은 1955년 상업적으로 이용되기 시작해서 1960년대부터 코스 관리자에게 우수한 품종으로 인식되어 현재 전 세계 골프장 그린에 가장 많이 이용되고 있다.
그러나 상기 크리핑 벤트그라스는 brown patch(Rhizoctonia salani) 및 Pythum blight(Pythum graminicola) 등과 같은 병해에 약하고 제초제로 인한 피해도 쉽게 발생한다는 문제점이 있다 (Chai 등, 2003, Journal of Zhejiang University Sci, 4(3): 346-351).
크리핑 벤트그라스를 골프장 그린용으로 이용할 경우 전 생육기간 동안 잡초와 경쟁하며 자라게 되고 잡초로 인하여 잔디면의 불균일성과 품질저하의 직접적인 요인이 되며 관리에도 어려움이 많다. 또한, 이러한 잡초들을 제거하기 위한 비용은 광활한 면적에 재배되는 크리핑 벤트그라스와 같은 잔디용 작물의 경우 더욱 막대한 비용이 소요된다. 지금까지 잡초방제는 인력에 의한 잡초제거가 주를 이루고 있으나 이러한 방법은 막대한 비용과 시간을 요하는 비효율적인 방법이다. 따라서 가장 효율적인 잡초방제 방법은 제초제에 대해서 저항성을 가지는 벤트그라스 식물체를 개발하여 재배하면서 비선택성 제초제를 이용하는 것이다.
그런데 지금까지의 관행 육종법으로는 제초제 저항성 신품종 개발이 불가능하기 때문에 이의 한계를 극복하기 위한 유일한 대안으로서 분자수준의 생명공학기술을 식물육종에 접목하여 응용하는 것이 필수적이라 하겠다 (정 등, 2000, 한국잡초학회지, 20(3): 159-173). 생명공학 기술을 이용한 분자육종법은 관행적인 육종 방법과 달리 우수한 품종의 형질은 유지하면서 새로운 농업적 특성이 우수한 유용유전자의 도입을 가능하게 하고 관행 육종법에 의한 방법으로 품종을 육성하는 것보다 빠른 시간 내에 품종육성이 가능한 장점을 가지고 있다.
생명공학기술을 이용한 제초제 저항성 작물 개발의 경우, 현재 옥수수, 목화, 유채(또는 캐놀라), 벼, 기타 작물을 대상으로 주로 비선택성 제초제(글리포제이트, 글루포시네이트 암모늄)를 중심으로 한 제초제 저항성 작물이 개발되어 실용화되고 있는데 (Duke S.O., 2005, Pest Manag. Sci., 61: 211-2118), 잡초 방제 측면에서 보면 거의 모두가 한 가지의 제초제 저항성 유전자를 가지면서 선택표지(selection marker) 유전자로서 항생제 저항성 유전자가 포함된 것들이다.
이 경우, 안전 및 잡초방제 효율화 측면에서 몇 가지 개선되어야 할 기술적 과제가 존재한다. 첫째는 항생제 마커가 없는 형질전환작물이 개발되어야 한다. 둘째, 자연조건에서의 저항성 잡초 출현을 최대한 낮추어야 한다. 셋째는 잡초방제 경비와 노력을 줄이기 위해 방제기술이 개선되어야 한다. 넷째, 농업 환경에로의 제초제 투입량을 최소화시켜야 한다.
한편, 벤트그라스는 생육력이 왕성하기 때문에 골프장 그린에 심어질 경우 수시로 예초 작업을 하는바, 그에 소요되는 관리비도 상당하다. 따라서 초장신장을 둔화시킬 수 있는 기술이 있다면 예초 작업 횟수를 줄일 수 있기 때문에 관리 측면에서 장점을 가진다. 그동안 이러한 목적으로 사용될 수 있는 기술은 식물생장조절제 중 왜화제(retardant)를 처리하는 것이었으나 왜화제는 잡초방제효과가 없다.
따라서, 본 발명에서는 제초제를 처리하면서 잡초방제는 물론 벤트그라스의 생장을 둔화시켜 예초 작업 횟수를 줄일 수 있는 기술을 개발하고자 크리핑 벤트그라스에 제초제 저항성 유전자인 bar 및 CP4 - EPSPS 유전자가 동시에 도입된 식물체를 개발하고자 한 것으로서 이에 관련한 보고는 전무하다.
한국특허공개 제2003-45387호에는 아그로박테리움을 이용한 한지형 벤트그라스 잔디 육종방법이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 항생제 마커가 없고, 잡초방제 측면에서 상승작용을 가지는 비선택성 제초제 조합을 통해, 보다 저농도로 혼합처리하거나 또는 체계처리하는 것이 가능하도록 해당 두 가지 제초제 저항성 유전자가 도입된 크리핑 벤트그라스 식물체를 개발하여 잡초방제 효율을 높임과 동시에 골프장 그린에서의 잡초관리 및 예초 작업 관리를 보다 효율적으로 하고자 하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 형질전환된, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 크리핑 벤트그라스 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 재배지에 글루포시네이트(glufosinate) 및 글리포제이트(glyphosate)를 혼합 또는 체계 처리하는 단계를 포함하는 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 재배지에 글리포제이트(glyphosate)를 처리함으로써 크리핑 벤트그라스의 초장 생장을 억제시켜 크리핑 벤트그라스의 예초 작업 횟수를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 두 가지 제초제 저항성 유전자 (bar와 CP4 - EPSPS)를 동시에 발현시킨 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체는 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 동시에 고도의 저항성을 나타내기 때문에 두 가지 비선택성 제초제를 동시에 처리할 수 있어서 잡초방제 효과를 향상시킬 수 있어 보다 적은 노동력 투입이 가능하다.
글리포제이트 제초제는 자연계에서 이미 여러 가지 저항성 잡초가 출현된 것으로 알려지고 있는바 (Sandermann H. 2006, Trends in Plant Sci. 11: 324-328), 저항성 잡초발생을 유기하지 않은 것으로 알려진 글루포시네이트 암모늄을 처리함으로서 이들을 용이하게 방제할 수 있다. 또한, 상기 두 가지의 비선택성 제초제를 혼합처리할 경우 상승적인 제초효과가 나타나므로 최종 처리 약량(제초제 투입량)을 낮출 수 있어 (민 등, 2006, 한국잡초학회지 26: 337-345) 농업 생태환경 보호에도 기여한다.
또한, 한 가지 비선택성 제초제만 사용할 수 있도록 제작된 벤트그라스를 재배할 경우, 해당 제초제를 계속적으로 사용하게 되어 저항성 잡초의 조기출현이 우려되는데 본 발명의 벤트그라스는 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 체계 처리할 수 있기 때문에 저항성 잡초 출현을 최소화시킬 수 있다.
그리고 글리포제이트 처리 농도에 따라 형질전환 크리핑 벤트그라스의 초장 신장을 억제시킬 수도 있어 잡초방제는 물론 예초(풀베기) 작업횟수를 줄일 수 있는 장점을 가진다.
도 1은 본 발명에 사용된 제초제 저항성 유전자 식물 형질전환용 벡터 p35S-EPSPS-B의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 방법에 준하여 진행했을 때의 캘러스로부터의 신초 형성 및 신장, 뿌리 유도, 토양순화 후 포트에서 자라는 모습을 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 의하여 획득한 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체에서 제초제 저항성 유전자(CP4 - EPSPS 및 bar)의 존재를 보여주는 PCR 분석의 결과이다. A는 CP4 - EPSPS 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이고, B는 bar 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이다.
도 4는 본 발명에 의하여 획득한 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체에서 제초제 저항성 유전자(CP4 - EPSPS)의 도입을 보여주는 서던 분석(Southern hybridization)의 결과로 CP4 - EPSPS 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이다.
도 5는 본 발명에 의하여 획득한 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체에서 제초제 저항성 유전자(CP4 - EPSPS 및 bar)의 안정적인 발현을 보여주는 노던 분석(Northern hybridization) 결과이다. CP4 - EPSPS와 bar 유전자를 각각 탐침으로 하여 분석한 것이다.
도 6은 효소면역반응(ELISA)을 통한 CP4 - EPSPS 유전자의 발현을 확인한 그림이다. 형질전환체 모두에서 대조구 보다 높은 수치를 보여 CP4 - EPSPS 유전자의 발현이 양호함을 나타낸다.
도 7은 형질전환 크리핑 벤트그라스의 글루포시네이트와 글리포제이트 제초제의 단용 및 혼합 처리에 대한 전식물체 수준에서의 저항성 발현을 나타내는 사진이다. A, 비형질전환체와 형질전환체의 제초제 처리 전 정상 생육사진. B, 바이엘 크롭사의 바스타 (유효성분: 18% 글루포시네이트 암모늄) 제초제를 1%(v/v)로 희석하여 경엽 처리한 후 10일째 모습. C, 글리포제이트 처리에 따른 제초제 저항성 검증으로 글리포제이트를 1000 ㎍/mL 수준으로 희석하여 경엽 처리한 후 10일째의 모습. D, 글루포시네이트와 글리포제이트를 각각 0.5% + 500 ㎍/㎖ 수준으로 혼용으로 경엽 처리한 후 10일째의 모습으로서 비형질전환체는 모두 죽었지만 형질전환체는 무처리와 가깝게 생육하고 있다.
도 8은 형질전환 크리핑 벤트그라스의 글리포제이트 제초제의 처리에 대한 전식물체 수준에서의 초장 신장 정도를 나타낸 그림이다. 비형질전환체는 약 10 ㎍/mL 이상에서 모두 고사되었지만, 형질전환체(계통 1, 8, 14)는 3,000 ㎍/mL에서도 죽지 않고 초장 신장이 억제되었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 벤트그라스 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 보다 구체적으로,
제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS (CP4 5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase) 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계;
상기 형질전환된 아그로박테리움과 크리핑 벤트그라스(creeping bentgrass) 배발생 캘러스를 공동배양하는 단계;
상기 공동배양된 크리핑 벤트그라스 배발생 캘러스로부터 형질전환된 신초를 선발하여 신장시키고 뿌리를 유기하는 단계; 및
상기 형질전환이 확인된 크리핑 벤트그라스 식물체를 대상으로 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트의 두 가지 제초제에 대한 저항성을 검정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계를 포함한다. 본 발명의 제초제 저항성 bar 유전자는 당업계에 통상적으로 이용되는 유전자를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 pCAMBIA3300(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) 벡터에 포함된 bar 유전자를 이용할 수 있다. CP4 - EPSPS 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 형질전환에 사용된 크리핑 벤트그라스(Agrostis palustri) 품종은 펜크로스이나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터, 벼 유래 Clp 프로모터일 수 있다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.
터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있다.
본 발명의 발현벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium)과 함께 크리핑 벤트그라스 식물체에 도입될 것이므로, 아그로박테리움에서 복제, 발현 및 선별이 가능하도록 구성된 어떠한 벡터라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에서는, 식물체 선발인자로 bar 유전자를 포함하는 플라스미드 pCAMBIA 3300(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)에 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 제초제 저항성 유전자 CP4 - EPSPS를 삽입하여 제조된 식물 형질전환용 발현 벡터를 사용한다. 바람직하게는 상기 재조합 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터일 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테 리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 균주라도 사용이 가능하다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 큰 것으로 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 더욱 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 C58C1 (A.tumefaciens EHA C58C1)를 이용한다.
본 발명의 벡터로 형질전환된 상기 아그로박테리움 농축액을 배발생 캘러스와 공동배양한 후 먼저 신초를 유기 신장시키고, 이어 뿌리 발생 및 신장을 유도시키는 배양법을 통해 형질전환체를 얻는다. 형질전환체를 선발하기 위해 신초를 유기 신장시키는 배양단계에서는 통상의 배양 배지, 예를 들어, MS 고체배지 (Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15:473-497, 1962)에 포스피노트리신을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환체를 선발할 수 있다. 이때, 포스피노트리신은 배지에 0.1 내지 15 mg/L, 바람직하게는 5 내지 10 mg/L의 양으로 첨가할 수 있다.
이어서, 얻어진 형질전환체를 대상으로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 서던 혼성 반응 (Southern hybridization) 및 노던 혼성 반응(Northern hybridization) 등을 실시하여 유전자의 도입 및 안정적 발현 여부를 확인할 수 있다. 얻어진 형질전환 식물의 제초제 저항성 여부는 전식물체에 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트의 단독처리 또는 혼합처리를 통해서 제초제 저항성 여부를 최종 확인할 수 있다.
본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 형질전환된, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체를 제공한다. 상기 크리핑 벤트그라스 식물체는 크리핑 벤트그라스 식물체의 줄기, 뿌리, 잎뿐만 아니라 꽃가루(화분)까지 포함하는 개념이다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체의 꽃가루와 형질전환되지 않은 크리핑 벤트그라스 식물체를 교배하여 새로운 크리핑 벤트그라스 식물체를 육종하는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체는 글루포시네이트 암모늄 저항성 bar 유전자와 제초제 글리포제이트 저항성 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 형질전환되어 상기 유전자들을 모두 발현하므로 비선택적 제초제인 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 복합 저항성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 크리핑 벤트그라스 식물체는 항생제 표지 유전자를 포함하지 않으므로, 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 형질전환에 사용된 크리핑 벤트그라스(Agrostis palustris) 품종은 펜크로스이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 재배지에 글루포시네이트(glufosinate) 및 글리포제이트(glyphosate)를 혼합 또는 체계 처리하여 잡초를 보다 효율적으로 방제하는 방법을 제공한다. 상기 체계 처리는 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 처리하는 것을 의미한다.
본 발명의 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체는 비선택성 제초제인 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 복합 저항성을 가지므로 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트를 상기 식물체의 재배지에 처리함으로써 잡초에 대해 상승된 방제효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 두 가지 비선택성 제초제에 저항성을 가지는 크리핑 벤트그라스 식물체를 재배하면 잡초방제를 위해 선택할 수 있는 약제가 하나에서 두 가지로 확대되기 때문에 잡초방제 체계(혼합처리 및 체계처리)를 보다 원활하게 세울 수 있고, 서로 다른 특성의 제초제를 사용하게 됨에 따라 잡초방제효과를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 보다 적은 노동력 투입으로 크리핑 벤트그라스 식물체의 생산성을 높이는 효과를 가진다.
또한, 한 가지 비선택성 제초제만 사용할 수 있도록 제작된 크리핑 벤트그라스 식물체를 재배할 경우, 제초제를 계속적으로 사용함으로 인해 저항성 잡초의 조기 출현 문제가 발생될 수 있는데 본 발명의 크리핑 벤트그라스 식물체는 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 처리할 수 있기 때문에 저항성 잡초 조기 출현 문제를 막거나 최소화시킬 수 있다. 아울러 글리포제이트 제초제는 자연계에서 이미 몇몇 저항성 잡초가 발생된 것으로 보고되고 있는 바 (Sandermann H. 2006, Trends in Plant Sci., 11: 324-328), 저항성 잡초 발생이 보고되지 않은 글루포시네이트를 처리함으로서 이들을 용이하게 방제할 수 있다 (Duke et al., 2005, Outlooks on Pest Management - October: 208-211).
아울러, 본 발명의 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체 재배지의 잡초를 방제하기 위해 글루포시네이트 및 글리포제이트 제초제를 혼합처리할 경우, 상기 제초제들이 상승효과를 나타내므로 최종 처리 약량(제초제 투입량)을 낮출 수 있어 환경부담을 감소시키는 효과를 가진다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 크리핑 벤트그라스 식물체의 재배지에 글리포제이트를 약 10 ㎍/mL 이상, 바람직하게는 10~3,000 ㎍/mL 처리하여 잡초를 방제함은 물론 크리핑 벤트그라스의 초장 신장을 억제하여 풀베기 작업 횟수를 줄이기 위한 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 제초제 저항성 형질전환 크리핑 벤트그라스 생산
식물재료
형질전환을 위한 재료로는 크리핑 벤트그라스(Penncross 품종)의 성숙종자로부터 유도된 배발생 캘러스를 사용하였다. 캘러스 유도를 위해 성숙종자의 종피를 제거한 다음 70% 에탄올에서 1분간 살균한 후, 5% 차아염소산소다(sodium hypochlorite) 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균한 종자를 MS 배지를 기본으로 하는 캘러스 유도배지(2.5 mg/L 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 0.5 mg/L BA(6-benzyladenine), 500 mg/L L-프롤린, 100 mg/L 마이오 이노시톨, 30 g/L 수크로스, 3 g/L 젤라이트)에 치상하여 6주간 배양하여 형성된 캘러스를 동일한 배지에서 1회 계대배양하여 발생 캘러스를 아그로박테리움 감염에 이용하였다.
발현벡터 및 아그로박테리움을 이용한 크리핑 벤트그라스의 형질전환
제초제 저항성 형질전환 크리핑 벤트그라스를 개발하기 위한 발현벡터는 CaMV 35S 프로모터 하류에 제초제 글리포제이트 저항성 유전자인 CP4 - EPSPS 유전자와 글루포시네이트 저항성 유전자인 bar를 선발 표지로 가지고 있는 pCAMBIA3300 발현벡터를 제작하여 p35S-EPSPS-B로 명명하였다(도 1).
발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105에 형질전환 후, 단일 군체를 선발하여 100 mg/L 카나마이신(Km)이 첨가된 YEP 액체배지에서 28℃, 2일간 배양한 후 2,500 g에서 10분간 원심분리하여 회수한 후 접종배지(1/2 MS 배지, 60 g/L 수크로스, 36 g/L 글루코스, 20 g/L 만니톨, 100 uM 아세토시링원(AS))에 OD600=0.6이 되도록 현탁한 다음 캘러스의 감염에 이용하였다. 성숙종자로부터 유도된 캘러스를 현탁된 아그로박테리움이 있는 접종 배지에 1시간 침지시켜 감염시킨 다음 여분의 아그로박테리움을 멸균된 여과지 위에서 제거하였다. 감염시킨 캘러스를 공동배양배지(MS 배지, 2 mg/L 2,4-D, 100 uM AS, 500 mg/L L-프롤린, 30 g/L 수크로스, 2 g/L 젤라이트)에 계대한 후 25℃에서 5일간 암 상태로 공동배양 하였다.
형질전환체의 선발과 재분화
공동배양한 캘러스는 500 mg/L 세포탁심이 첨가된 공동배양배지로 세정하여 아그로박테리움을 제균한 후 선발배지 (MS 배지, 250 mg/L 세포탁심, 10 mg/L PPT(phosphinothricin), 0.01 mg/L 2,4-D, 1 mg/L BA, 500 mg/L L-프롤린, 30 g/L 수크로스, 3 g/L 젤라이트)에서 3주간 배양하여 포스피노트리신(PPT) 내성을 보이는 캘러스만을 선발하여 다시 10 mg/L PPT이 첨가된 선발 배지에 옮겨 6주간 배양하여 생존하는 캘러스로부터 식물체를 재분화 시켰다. 재분화된 식물체는 10 mg/L PPT가 첨가된 1/2 MS 배지가 들어있는 배양 병에 옮겨준 후 4주간 배양하여 정상적으로 뿌리가 발육되고 생존하는 개체만을 선발하여 포트로 이식하여 온실에서 재배하였다. 이상의 과정을 거쳐 선발된 식물체의 사진을 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 크리핑 벤트그라스에서의 글루포시네이트 및 글리포제이트 저항성 식물체의 유전자 도입 확인
제초제 저항성 유전자의 도입을 확인하기 위하여 형질전환 크리핑 벤트그라스 식물체의 신선한 잎 조직으로부터 CTAB를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. PCR 분석은 bar와 CP4 - EPSPS 유전자 각각의 특이적인 프라이머 (bar 유전자: 서열번호 2인 정방향 프라이머 5'-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3'와 서열번호 3인 역방향 프라이머 5'-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3', CP4 - EPSPS 유전자: 서열번호 4인 정방향 프라이머 5'-ACGATTTCGACAGCACCTTC-3'와 서열번호 5인 역방향 프라이머 5'-GTGACAGGGTTTTCCGACAC-3')를 이용하여 분석을 실시하였다. 그 결과 443bp의 bar 유전자의 밴드 크기를 확인할 수 있었고(도 3의 밴드 B), 928bp의 EPSPS 유전자의 밴드 크기를 확인하였다(도 3의 밴드 A). 따라서 발현벡터의 T-DNA 영역이 형질전환 식물체의 genome으로 도입되었음을 확인할 수 있었다(도 3).
이를 더욱 확인하기 위하여 크리핑 벤트그라스의 genomic DNA(20㎍)을 HindⅢ 제한효소로 처리하여 서던 분석을 한 결과, 모든 형질전환 식물체에서 하나의 카피 수를 확인할 수 있었다(도 4).
한편 크리핑 벤트그라스에 도입된 제초제 저항성 유전자가 전사(transcription) 되는지를 확인하기 위하여 RNA를 분리하여 노던 블럿 분석을 실시하였다. 그 결과, 비형질전환 식물체에서는 도입 유전자의 발현을 확인할 수 없었으나, 형질전환 식물체에서는 개체간 발현 양의 차이는 있으나 도입한 유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 관찰하였다 (도 5).
이러한 결과들은 형질전환 식물체내에 CP4 - EPSPS, bar 유전자가 정상적으로 도입되었으며 CaMV35S 프로모터에 의해 항상적으로 발현되고 있음을 의미한다.
또한, 단백질 수준에서 CP4 - EPSPS 유전자의 효소면역반응(ELISA) 검정을 알아보기 위해 Agdia PSP 74000/0096 PathoScreen Kit을 사용하여 ELISA-DAS 방법(Clark and Adams 1977, Journal of General Virology 34: 475-483)으로 조사하였다.
그 결과, 형질전환된 크리핑 벤트그라스의 식물체는 분석 키트에 포함되어 있는 음성 대조구인 비형질전환 대두의 흡광도(0.156)의 약 13배의 흡광도 (2.017~2.157)를 나타내었고, 양성 대조구인 글리포제이트 저항성 대두의 흡광도 (1.084) 보다는 높은 흡광도를 보여 형질전환 크리핑 벤트그라스에서 CP4 - EPSPS 유전자가 많이 발현하고 있음을 알 수 있었다(도 6).
실시예 3: 형질전환 크리핑 벤트그라스에서의 글루포시네이트 및 글리포제이트 저항성 식물체의 제초제 저항성 확인
전식물체 수준에서 제초제 내성을 조사하기 위하여 온실에서 8주 동안 생육시킨 비형질전환 식물체와 형질전환 식물체(1, 2, 3번 식물체)의 경엽 부위에 바이엘크롭사의 바스타 제초제(18% 글루포시네이트 암모늄)를 1%(v/v), 또는 글리포제이트(95%, 두체파)를 1000 ㎍/mL 각각 20ml을 살포하고 10일 후에 식물체 잎에 나타나는 피해 정도를 비교 조사하였다.
그 결과, 글루포시네이트를 처리한 후 광 조건에서 3일째부터 비형질전환 식물체는 잎 손상이 관찰되었다. 그리고 7일째에는 식물체가 완전히 고사되는 것을 확인하였다. 그리고 글리포제이트를 처리한 결과에서도 비슷한 양상을 나타내었다 (도 7).
한편, 전식물체에 글루포시네이트와 글리포제이트를 0.5% + 500 ㎍/㎖ 수준으로 혼용하여 경엽처리한 다음 저항성 여부를 조사하였다.
그 결과 비형질전환체는 90% 이상 고사했으나 형질전환체는 정상적으로 생육하였다. 따라서 형질전환 크리핑 벤트그라스는 상기 두 가지 제초제에 대해서 복합저항성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 형질전환 크리핑 벤트그라스에서의 글리포제이트 처리에 따른 초장 신장의 억제
전식물체 수준에서 글리포제이트 처리에 따른 형질전환 크리핑 벤트그라스의 초장 신장 억제 정도를 조사하기 위하여 온실에서 수개월 재배되고 있는 비형질전환 식물체와 형질전환 식물체(계통 1, 8, 14 식물체)를 포트에 이식, 3주간 활착시킨 후 지상부 4.0cm를 남기고 절단한 다음 경엽 부위에 글리포제이트(95%, 두체파)를 1 ㎍/mL부터 3,000 ㎍/mL까지 5 가지 농도를 64 cm2 원형 포트당 각각 2.5ml을 살포하고 24일 후에 식물체 고사 여부 및 초장 신장 정도를 비교 조사하였다.
그 결과, 비형질전환 식물체는 글리포제이트 11 ㎍/mL 이상의 농도 수준에서 모두 고사되었지만 형질전환 식물체는 3,000 ㎍/mL 농도처리에서도 생존하였다. 그런데 형질전환 식물체는 글리포제이트 처리농도가 높을수록 초장의 신장이 억제되는 특징을 보여 1,000 ㎍/mL 처리에서는 글리포제이트 무처리구의 25% 신장을 나타내었다(도 8). 이는 약제처리에 의해 식물체는 죽지 않지만 초장 신장이 현저히 억제된 상태로 있어 풀베기를 자주 하지 않아도 되기 때문에 골프장 등에서의 벤트그라스 경제적 관리에 큰 장점을 부여한다.
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