DE69630008T2

DE69630008T2 - Treponema palladium Fusions-Antigen, Nachweis für Anti-treponema palladium Antikörpern mit diesen Fusions-Antigenen

Info

Publication number: DE69630008T2
Application number: DE69630008T
Authority: DE
Inventors: Nobuyuki Mitaka-shi Ise; Takeya Hachioji-shi Hori; Katsuya Iruma-shi Fujimura; Tetsuji Tanimoto; Masahisa Hachioji-shi Okada
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1995-12-25
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: US20010002311A1; CA2193870C; US6794155B2; KR100257574B1; ES2207671T3; DE69630008D1; EP0781846A2; EP0781846B1; US6248331B1; EP0781846A3; CA2193870A1; ATE250128T1; KR970048455A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Treponema pallidum Fusions-Antigen, sowie einen Nachweis für anti-Treponema pallidum Antikörper mit diesem Fusions-Antigen.
Diskussion des Hintergrundes
Syphilis ist eine durch Treponema pallidum verursachte infektiöse Krankheit. Treponema pallidum gehört zur Ordnung der Spirochaetales. Es ist bekannt, dass es verschiedene Treponema pallidum Oberflächenantigene auf der Zelloberfläche gibt (The Journal of Immunology 129, 833–838, 1982; The Journal of Immunology 129, 1287–1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology 21, 82–87, 1985; Journal of Clinical Microbiology 30, 115–122, 1992).
Wenn ein Körper mit Treponema pallidum (nachstehend als Tp bezeichnet) infiziert wird, werden Antikörper im Blut vermittels dieser Oberflächenantigene induziert und im Blut produziert. Damit kann die Diagnose von Syphilis durch das Testen auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein der anti-Tp Antikörper im Blut geführt werden.
Üblicherweise werden Immuntests eingesetzt, die sich die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen den Tp-Antigenen und den anti-Tp-Antikörpern zunutze machen, um das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein der anti-Tp Antikörper im Blut des Patienten nachzuweisen.
Zur Durchführung des Immuntests auf die Tp-Antikörper ist eine große Menge an Tp-Antigenen erforderlich. Große Mengen an Tp können jedoch nicht in vitro gezüchtet werden. Üblicherweise wird daher Tp in die Hoden eines Kaninchens inokuliert und das Tp-Antigen wird aus den Hoden des mit Tp infizierten Kaninchens gewonnen und für die weitere Verwendung aufgereinigt (Acta Pathol. Microbiol. Scand. [B] 83, 157–160, 1975).
Das vorstehend beschriebene Verfahren der Inokulation in Kaninchenhoden weist jedoch die folgenden Nachteile auf: Das Tp-Antigen ist mit Verunreinigungen kontaminiert, da Tp in den Kaninchen in vivo gezüchtet wird. Ferner ist das gezüchtete Tp aufgrund der individuellen Unterschiede bei Kaninchen verschieden und schließlich ist es sehr schwierig, große Mengen an Tp-Antigen mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit zu bekommen.
Auf der Basis der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie ist kürzlich ein Verfahren zur künstlichen Herstellung des Tp-Antigens in großen Mengen durch Klonierung eines das Oberflächenantigen von Tp kodierenden Gens entwickelt worden (Science 216, 522–523, 1982; Infection and Immunity 36, 1238–1241, 1982; Infection and Immunity 41, 709–721, 1983; Infection and Immunity 42, 435–445, 1983; Infection and Immunity 42, 187–196, 1983; Journal of Bacteriology 162, 1227–1237, 1985; Infection and Immunity 54, 500–506, 1986; Infection and Immunity 56, 71–78, 1988; Infection and Immunity 57, 2612–2623, 1989; Infection and Immunity 57, 3708– 3714, 1989; Molecular Microbiology 4, 1371–1379, 1990; Infection and Immunity 58, 1697–1704, 1990; Infection and Immunity 61, 1202–1210, 1993; offengelegte Japanische Patentanmeldung 2-500403, wobei der Gegenstand dieser Veröffentlichungen hiermit per Bezug inkorporiert ist).
Unter Verwendung derartiger rekombinanter DNA-Technologie kann das Tp-Antigen in großen Mengen hergestellt werden, ohne dass es hierzu des Einsatzes lebender Tiere bedarf. Bei einigen Arten an Tp-Oberflächenantigenen wird jedoch fast kein Produkt exprimiert, falls lediglich das Gen eingesetzt wird, welches das nämliche Antigen selbst kodiert.
Daher wurde in der vorstehend genannten Anmeldung ein Verfahren zur Expression des gewünschten Antigens vorgeschlagen, bei dem ein Fusionsgen eingesetzt wird. Dieses wird hergestellt durch Verknüpfung eines Gens wie Thioredoxin aus E. coli (nachfolgend als TRX bezeichnet) oder einer Glutathion S-Transferase aus Schistosoma japonicum (nachfolgend als GST bezeichnet) mit einem Gen für das gewünschte Material, wie in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung 5-507209 und der offengelegten Japanischen Patentanmeldung 1-503441 offenbart.
Es wurde gefunden, dass ein GST15kDa-Antigen, das ein Fusionsgen von GST mit einem 15 kDa Antigen, einem Oberflächenantigen von Tp und ein GST17kDa Antigen, das ein Fusionsgen von GST mit einem 17 kDa Antigen, einem anderen Oberflächenantigen von Tp, im Test auf den anti-Tp-Antikörper, wie in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung 7-63365 beschrieben, eine hohe Sensitivität aufweist.
Da Escherichia coli und Schistosoma japonicum im menschlichen Körper leben können und es viele Leute gibt, die in ihrem Blut auch dann einen Faktor aufweisen, der mit TRX oder GST reagiert, wenn sie nicht mit Tp infiziert sind, zeigt sich ein positiver Nachweis auf eine Infektion mit Tp, was belegt, dass dies einen starken Einfluß auf die Diagnose einer Infektion mit Tp ausübt.
Gegenwärtig ist Syphilis durch die Entwicklung der Antibiotika vollständig heilbar. Es ist daher wünschenswert, dass Syphilis auf der Basis einer schnellen und akkuraten Diagnose geheilt werden kann. Um dieses Ziel erreichen zu können, wird dringend ein Test mit hoher Sensitivität und Spezifität auf Tp-Antigene und anti-Tp-Antikörper benötigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erster Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung von Treponema pallidum (Tp) fusionierten Antigenen, bei denen mindestens zwei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind und wobei das fusionierte Antigen frei von einem Heteroantigen mit Ausnahme des Tp-Antigens ist. Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Testverfahrens auf anti-Treponema pallidum-Antikörper, bei dem das vorstehend genannte Treponema pallidum Fusionsantigen eingesetzt wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
Eine vollständigere Wertschätzung der Erfindung und vieler Vorteile davon wird unmittelbar erhalten, wenn diese unter Bezug auf die folgende genaue Beschreibung besser verstanden wird, wobei diese zusammen mit den beigefügten Figuren betrachtet werden sollen und wobei:
1 eine genaues Schaubild eines Expressionsvektors für pW6A ist;
2 in einer Übersicht das Verfahren der Herstellung eines ein 47K Antigen kodierenden Gens darstellt;
3 in einer Übersicht das Verfahren der Herstellung eines ein 15K Antigen und ein 17K Antigen kodierenden Gens darstellt;
4 in einer genauen Übersicht einen Expressionsvektor für ein Antigen aus zwei fusionierten Antigenen darstellt;
5 in einer genauen Übersicht einen Expressionsvektor für ein Antigen aus drei fusionierten Antigenen darstellt;
6 in einer genauen Übersicht einen Expressionsvektor für ein Antigen darstellt, in dem 15K mehrfach fusioniert wurde;
7 Diagramme von Elektophoresen mit aufgereinigten Fusionsantigenen darstellen;
8 ein Diagramm einer Elektrophorese mit einem Fusionsantigen darstellt, in dem 15K mehrfach fusioniert wurde:
9 ein Western Blot Diagramm eines Fusionsantigens darstellt, in dem exprimiertes 15K mehrfach fusioniert wurde;
10 ein Diagramm einer Elektrophorese zur quantitativen Messung eines Fusionsantigens darstellt, in dem 15K mehrfach fusioniert wurde;
11 einen Graph darstellt, der eine Arbeitskurve für die quantitative Messung einer Bande auf einem Eletrophoresegel zeigt, das unter Verwendung von BSA hergestellt wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfinder dieser Erfindung untersuchten die Expression eines fusionierten Tp-Antigens, das mit verschiedenen Klassen an Oberflächenantigenen fusioniert wurde, wobei ein Gen eingesetzt wurde, das das fusionierte Tp-Antigen kodiert. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Expressionshöhe im Vergleich zu der Menge bei üblichen Expressionsverfahren signifikant verbessert wurde. Es wurde weiterhin gefunden, dass bei Verwendung des fusionierten Tp-Antigens im Nachweisverfahren auf den anti-Tp-Antikörper, dieser anti-Tp-Antikörper mit höherer Sensitivität nachgewiesen werden kann, als mit einem individuelle Oberflächenantigene einsetzenden Testsystem. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen überraschenden Beobachtungen.
Auf der Zelloberfläche von Tp Zellen befinden sich Oberflächenantigene mit verschiedenen Molekulargewichten. Man kennt repräsentative Oberflächenantigene mit Molekulargewichten von 15 kDa, 17 kDa, 42 kDa und 47 kDa (The Journal of Immunology 129, 833–838, 1982; The Journal of Immunology 129, 1287–1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology 21, 82–87, 1985; Journal of Clinical Microbiology 30, 115–122, 1992, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichungen hiermit per Bezug inkorporiert ist). Diese Antigene wurden von S. J. Norris et al., (Microbiological Reviews 57, 750–779, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung hiermit per Bezug inkorporiert ist) als TpN15, TpN17, TpN44.5(a) und TpN47 bezeichnet. Nachstehend wird ein Tp-Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa auch als 47K bezeichnet, ein Tp-Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa auch als 17K und ein Tp-Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa auch als 15K.
Die diese Oberflächenantigene kodierenden Gene sind bereits kloniert, so dass die Antigene durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. Darüber hinaus wurden die durch diese Gene kodierten Aminosäuresequenzen bestimmt (Molecular Microbiology 4, 1371–1379, 1990; Infection and Immunity 61, 1202–1210, 1993; Infection and Immunity 10, 1568–1576, 1992; Infection and Immunity 57, 3708–3714, 1989, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichungen hiermit per Bezug inkorporiert ist).
Die für die erfindungsgemäßen Fusionsantigene einsetzbaren Tp-Oberflächenantigene schließen alle auf der Zelloberfläche von Tp vorkommenden Oberflächenantigene ein. Antigene wie 47K, 17K und 15K sind derartige Oberflächenantigene.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäß einsetzbaren Oberflächenantigene in geeigneter Weise und in einem Ausmaß modifiziert werden, dass ihre Antigenität nicht verschlechtert werden kann. Beispielsweise gibt es ein Signalpeptid mit einer Sequenz von von etwa 20 Aminosäuren im N-terminalen Bereich der Tp-Oberflächenantigene, wenn diese Antigene in der Zelle translatiert werden. Beim nativen Antigen wird ein derartiges Signalpeptid jedoch entfernt. Man vermutet, das dies deshalb geschieht, weil das Signalpeptid nach der DNA-Translation der Oberflächenantigene durch eine Signalpeptidase II abgespalten wird (Microbial Pathogenesis 7, 175–188, 1989; Infection and Immunity 60, 1202–1210, 1993; Molecular Microbiology 4, 1371–1379, 1990; Infection and Immunity 60, 1568–1576, 1993).
In den erfindungsgemäßen Fusionsantigenen können als Antigene sowohl Antigene eingesetzt werden, die die Signalpeptide an den N-Termini aufweisen, wie auch solche Antigene, die die Signalpeptide an den N-Termini nicht aufweisen.
Beispielsweise wurde berichtet, dass die Möglichkeit besteht, weitere 9 Aminosäuren an den C-Terminus der 434 Aminosäuren in 47K anzufügen (Infection and Immunity 60, 1568–1576, 1992). In diesem Fall wird eine PCR unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt. Der Sinn-Primer und der Antisinn-Primer sind so ausgestaltet, dass sie die kodierende Sequenz des Signalpeptids nicht enthalten, die die 9 Aminosäuren kodierende Sequenz im Anschluß an den C-Terminus jedoch enthalten.
Die erfindungsgemäßen fusionierten Tp-Antigene stellen Antigene dar, die durch Fusion der diese Oberflächenantigene kodierenden Gene miteinander exprimiert werden. Bei der Fusion der Gene für diese Tp-Oberflächenantigene kann jede Kombination von Tp-Oberflächenantigenen eingesetzt werden. Es gibt keine Beschränkungen für diese Kombinationen, da entweder verschiedene Antigene oder die gleichen Antigene kombiniert werden können.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Fusionsantigene kann übliche DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt werden. Genauer gesagt wird genomische DNA aus dem Tp extrahiert, welcher z. B. im Hoden von Kaninchen gezüchtet wird, und als Matrize verwendet.
Um das DNA-Fragment zu erhalten, das jedes Oberflächenantigen kodiert, wird PCR eingesetzt. Jedes Fragment wird unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche auf der Basis der bekannten DNA-Sequenz hergestellt werden. Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden durch ein rekombinantes PCR-Verfahren (die sogenannte Zusammenfügungs-(„assemble") PCR oder vermittels DNA-Ligase fusioniert.
Der Wirt, wie Escherichia coli, wird unter Verwendung eines Vektors, in den dieses DNA-Fragment eingefügt ist, transformiert und dieses Bakterium wird dann z. B. durch Züchtung propagiert, wodurch die Expression des Fusionsantigens durchgeführt wird. Anschließend wird das gewünschte Fusionsantigen durch Aufreinigung erhalten, wie Aufbrechen des Wirts oder Elektrophorese („Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage 1989).
DNA-Fragmente des zu fusionierenden Tp-Antigens können unter Verwendung von in der multiplen Klonierungsstelle vorhandenen Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstellen wie Nde I, Sac I, EcoR I, Sal I, Xho I, BamH I, Kpn I und Hind III in den Vektor eingefügt werden.
Das DNA-Fragment kann entweder allein in den Vektor eingesetzt werden oder zusammen mit DNA-Fragmenten, die zuvor direkt miteinander verbunden wurden, beispielsweise durch ein rekombinantes PCR-Verfahren (die sogenannte Zusammenfügungs-(„assemble") PCR).
Wenn DNA-Fragmente unter Verwendung dieser Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstellen in den Vektor eingeführt werden, kann es vorkommen, dass eine kurze Aminosäure zwischen den insertierten DNA-Fragmenten als Linker „gefangen" wird. Dieser Linker kann durch die folgenden Schritte entfernt werden. Die DNA-Fragmente werden durch ein rekombinantes PCR-Verfahren (die sogenannte Zusammenfügungs-(„assemble") PCR) verknüpft und das so erhaltene verknüpfte DNA-Fragment wird in die multiplen Klonierungsstellen des Expressionsvektors eingefügt. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsantigen exprimiert werden, ohne dass der Linker entfernt wurde.
Beispiele des erfindungsgemäßen Treponema pallidum Fusionsantigens ist ein Treponema pallidum Fusionsantigen, in dem mindestens zwei Oberflächenantigene von Treponema pallidum verknüpft sind, ein Treponema pallidum Fusionsantigen, in dem mindestens drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum verknüpft sind und ein Treponema pallidum Fusionsantigen, in dem zwei bis drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum verknüpft sind.
In dem vorstehend genannten erfindungsgemäßen Treponema pallidum Fusionsantigen können die mindestens zwei Oberflächenantigene, die mindestens drei Oberflächenantigene oder die zwei bis drei Oberflächenantigene ein Molekulargewicht von 47 kDa, 17 kDa oder 15 kDa aufweisen.
Spezifische Beispiele für die erfindungsgemäßen Treponema pallidum Fusionsantigene sind Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene fusioniert sind in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, das als 47-17-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa fusioniert sind, das als 47-15-17 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa fusioniert sind, das als 15-17-47 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa fusioniert sind, das als 15-47-17 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa fusioniert sind, das als 17-15-47 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 17-47-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa fusioniert sind, das als 47-17 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 47-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa fusioniert sind, das als 17-47 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 17-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 47 kDa fusioniert sind, das als 15-47 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 17 kDa fusioniert sind, das als 15-17 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 15-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 15-15-15 Fusionsantigen bezeichnet wird; und Treponema pallidum Fusionsantigene, bei denen die Oberflächenantigene in der Reihenfolge (N-terminal nach C-terminal) Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa und Oberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 15 kDa fusioniert sind, das als 15-15-15-15 Fusionsantigen bezeichnet wird.
Üblicherweise wird in einem Testsystem auf anti-Tp-Antikörper ein Gemisch der Tp-Hauptantigene wie 47K, 17K und 15K eingesetzt, so dass die nötigen Antigene getrennt aufgereinigt werden müssen.
In krassem Gegensatz dazu enthält das Fusionsantigen bei Einsatz des erfindungsgemäßen Fusionsantigens eine Vielzahl von Antigenen, so dass das Fusionsantigen als einzelnes Antigen aufgereinigt werden kann und so leicht verfügbar ist.
Darüber hinaus werden die 17K und 15K Antigene kaum bei Verwendung der diese Antigene kodierenden Gene exprimiert. Daher werden diese Antigene mit Proteinen wie TRX oder GST als Fusionsproteine exprimiert. Ein von einem fusionierten Gen exprimiertes Fusionsantigen, das ein von einem Tp-Antigen verschiedenes Heteroantigen enthält, kann jedoch eine unerwartete, nicht spezifische Reaktion hervorrufen, die nicht vom Tp-Antigen stammt.
In krassem Gegensatz dazu ist das erfindungsgemäße Antigen ein Fusionsantigen, in dem lediglich Tp-Antigene fusioniert sind und das frei von Heteroantigen ist, das sich von Tp-Antigen unterscheidet. Es ist somit ein ausgezeichnetes Antigen zum spezifischen Nachweis von anti-Tp-Antikörpern.
Bekanntermaßen wird bereits in einem Antikörpertest zur Diagnose viraler Infektionen ein fusioniertes Antigen als Antigen eingesetzt, an das eine Vielzahl verschiedener Antigene fusioniert ist (Hepatology 14, 381–387, 1991).
Im Gegensatz dazu zeigt das erfindungsgemäße Fusionsantigen im Vergleich mit Fällen, in denen jedes Oberflächenantigen einzeln mit dem anti-Tp-Antikörper reagiert, eine wesentlich höhere Reaktivität mit den anti-Tp-Antikörpern. Damit kann durch Verwendung des fusionierten Antigens in dem Testsytem auf anti-Tp-Antikörper ein anti-Tp-Antikörper Testverfahren bereit gestellt werden, das eine unüblich hohe Testsensitivität aufweist.
Darüber hinaus ist erfindungsgemäß erreicht worden, dass die Hauptoberflächenantigene 17K und 15K in einem überraschend hohen Maße exprimiert werden können, wenn sie in Kombination mit den Tp-Antigenen in fusionierte Antigene überführt werden, obwohl die 17K und 15K Oberflächenantigene kaum exprimiert werden, wenn entweder das das 17K Oberflächenantigen kodierende Gen oder das das 15K Oberflächenantigen kodierende Gen allein eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen fusionierten Antigene können in einem anti-Tp-Antikörpertest eingesetzt werden. Anti-Tp-Antikörpertest bezeichnet einen Test, in dem das vorstehend genannte fusionierte Antigen als Antigen in dem Test auf den anti-Tp-Antikörper eingesetzt wird. Solange der Test auf einer Immunreaktion zwischen dem anti-Tp-Antikörper in der Probe und dem fusionierten Antigen beruht, kann die Reaktion vermittels jeden Verfahrens durchgeführt werden.
Dem Fachmann sind verschiedene Immuntests bekannt. Diese können auf der Basis der Art der Reaktion als ein Agglutinationsverfahren, ein nephelometrisches Verfahren, ein Sandwich-Verfahren, oder ein kompetitives Verfahren klassifiziert werden. Auf der Basis der Art an markiertem Material können die Tests in Enzym-markierte Immuntests, Fluoreszenz-markierte Immuntests, Lumineszenz-markierte Immuntests und Radioimmuntests unterteilt werden.
Von diesen immunologischen Nachweisverfahren ist das Agglutinationsverfahren besonders bevorzugt, das keine besondere Ausstattung erfordert, ferner das ELISA-Verfahren basierend auf Enzym-markierten Immuntests, das zur Bearbeitung vieler Proben geeignet ist und der Lumineszenz-markierte Immuntest, der mit Blick auf eine hohe Sensitivität entwickelt wurde und in hohem Maße automatisiert ist.
Wenn das erfindungsgemäße Fusionsantigen in einem Test auf den anti-Tp-Antikörper eingesetzt wird, beispielsweise in einem Agglutinationstest, wird das erfindungsgemäße Fusionsantigen an einen Träger wie Latexpartikel, Gelatinepartikel oder magnetische Partikel gebunden und deren unspezifische Bindungsstellen blockiert. Das an die Träger gebundene Fusionsantigen wird mit einer zu testenden Probe für einen vorbestimmten Zeitraum umgesetzt, wodurch die Menge an anti-Tp-Antikörper in der Probe gemessen werden kann. Dazu wird ein Nachweis-Index wie die durch die Immunreaktion hervorgerufene Agglutinationstrübung oder ein durch die Immunreaktion gebildetes Agglutinationsabbild eingesetzt.
In einem ELISA-Verfahren wird das erfindungsgemäße fusionierte Antigen an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden und deren nicht-spezifische Bindungsstellen werden abgesättigt.
Daraufhin wird die Probe in die mit dem fusionierten Antigen beschichteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben und mit dem Fusionsantigen für eine vorbestimmte Zeit umgesetzt. Die Vertiefungen werden dann gewaschen. Anschließend lässt man ein anti-human Immunglobulin, das mit einem Enzym wie einer Peroxidase markiert ist, mit der Probe reagieren. Die Vertiefungen werden dann gewaschen. Danach wird durch Zugabe eines Substrats für das Markierungsenzym eine enzymatische Reaktion durchgeführt und die Enzymaktivität somit gemessen. Die Menge an anti-Tp-Antikörper in der Probe kann so ermittelt werden.
Die vorstehend genannten Agglutinations- und ELISA-Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Der erfindungsgemäße Test ist jedoch nicht notwendigerweise auf die vorstehend beschriebenen Verfahren eingegrenzt.
Beispiele für im erfindungsgemäßen Test einsetzbare Proben schließen Körperflüssigkeiten und verdünnte Körperflüssigkeiten wie Seren von Menschen oder Tieren ein, die einer Diagnose auf Tp unterworfen werden.
Andere Merkmale der Erfindung werden im Zusammenhang der nachfolgenden Beschreibung der Referenzbeispiele deutlich, sowie der beispielhaften Ausführungsformen, die zur Erläuterung der Erfindung aufgeführt sind, diese jedoch nicht einschränken sollen.
Referenzbeispiel 1
[Herstellung von anti-47K monoklonalem Antikörper, anti-17K monoklonalem Antikörper und anti-15K monoklonalem Antikörper]
Als Oberflächenantigen von Tp wurde 47K unter Verwendung von Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt.
Milzzellen aus einer mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen immunisierten Maus und Maus-Myelomzellen wurden einer Zellfusion unterworfen und so ein Hybridom produziert.
Dieses Hybridom wurde gezüchtet und mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen umgesetzt, wobei im ELISA das vorstehend genannte rekombinante Antigen eingesetzt wurde und im Western Blot das vorstehend genannte native Antigen 47K. Hierdurch wurde auf ein Hybridom gescreent, das sowohl mit dem rekombinanten Antigen und dem nativen Antigen 47K reagiert. Das derart selektionierte Hybridom wurde kloniert und eine Zelllinie davon etabliert.
Der so etablierte Klon wurde in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und Aszitesflüssigkeit daraus erhalten und aufgereinigt. Dadurch wurde ein anti-47K monoklonaler Antikörper (nachstehend als 47KMAk bezeichnet) erhalten.
GST17K, bei dem GST an den N-Terminus von 17K fusioniert war, wurde in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt.
Milzzellen aus einer mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen immunisierten Maus und Maus-Myelomzellen wurden einer Zellfusion unterworfen und so ein Hybridom produziert.
Dieses Hybridom wurde gezüchtet und mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen umgesetzt, wobei im ELISA das vorstehend genannte rekombinante Antigen eingesetzt wurde und im Western Blot das vorstehend genannte native Antigen 17K. Hierdurch wurde auf ein Hybridom gescreent, das sowohl mit dem rekombinanten Antigen und dem nativen Antigen 17K reagiert. Das derart selektionierte Hybridom wurde kloniert und eine Zelllinie davon etabliert.
Der so etablierte Klon wurde in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und Aszitesflüssigkeit daraus erhalten und aufgereinigt. Dadurch wurde ein anti-17K monoklonaler Antikörper (nachstehend als 17KMAk bezeichnet) erhalten.
GST15K, bei dem GST an den N-Terminus von 15K fusioniert war, wurde in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt.
Milzzellen aus einer mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen immunisierten Maus und Maus-Myelomzellen wurden einer Zellfusion unterworfen und so ein Hybridom produziert.
Dieses Hybridom wurde gezüchtet und mit dem vorstehend genannten rekombinanten Antigen umgesetzt, wobei im ELISA das vorstehend genannte rekombinante Antigen eingesetzt wurde und im Western Blot das vorstehend genannte native Antigen 15K. Hierdurch wurde auf ein Hybridom gescreent, das sowohl mit dem rekombinanten Antigen und dem nativen Antigen 15K reagiert. Das derart selektionierte Hybridom wurde kloniert und eine Zelllinie davon etabliert.
Der so etablierte Klon wurde in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und Aszitesflüssigkeit daraus erhalten und aufgereinigt. Dadurch wurde ein anti-15K monoklonaler Antikörper (nachstehend als 15KMAk bezeichnet) erhalten.
Referenzbeispiel 2
[Herstellung des Expressionsvektors pW6A]
Die den tac-Promotor enthaltende und GST kodierende DNA-Sequenz wurde aus dem Vektor pGEX2T (Pharmacia Biotec Co., Ltd) entfernt und die DNA-Sequenz vom T7-Promotor über Gen 10 und multiple Klonierungsstelle bis zum T7-Transkriptionsterminator aus pGEMEX-1 (Promega Co., Ltd) wurde in den wie vorstehend beschrieben verkürzten Vektor pGEX2T eingefügt.
Aus dem so erhaltenen Vektor wurde die DNA-Sequenz von Gen 10 entfernt. Der mittels eines DNA-Synthesegerätes (Marke „Model 381A" von Applied Biosystems Co., Ltd) synthetisierte lac-Operator wurde direkt hinter den T7-Promotor insertiert und die multiple Klonierungsstelle wurde teilweise modifiziert. Der so präparierte Expressionsvektor wurde als „pW6A" bezeichnet. 1 zeigt ein detailliertes Schema von pW6A.
Referenzbeispiel 3
[Präparation von Primern zur Herstellung von Vektoren für die Expression unterschiedlicher fusionierten Antigene]
Die folgenden Primer wurden mit einem DNA-Synthesegerät (Marke „Model 381 A" von Applied Biosystems Co., Ltd) synthetisiert, um sämtliche Expressionsvektoren für die Herstellung aller Fusionsantigene gemäß der nachfolgenden Beispiele 1 bis 16 und gemäß Referenzbeispiel 4 zu präparieren:
Referenzbeispiel 4
[Herstellung von Tp 47K, 17K und 15K Genen]
Treponema pallidum (Stamm „Nicols") wurde einer Subkultur im Hoden von Kaninchen unterworfen und durch Percoll Dichtegradienten Zentrifugation (Sex. Transm. Dis. 11, 275–286, 1984) gereinigt. Genomische DNA wurde mit dem SDS-Proteinase K/Phenol-Chloroform Verfahren extrahiert.
Vermittels des Polymerase Kettenreaktion (PCR) Verfahrens wurde das das 15K kodierende DNA-Fragment amplifiziert. Dabei wurde der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 7 als Sinn Primer eingesetzt, der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 9 als anti-Sinn Primer und die wie vorstehend beschrieben extrahierte genomische DNA als Matrize (Molecular Microbiology 4, 1371–1379, 1990).
Ein 17K kodierendes DNA-Fragment wurde amplifiziert, wobei der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 8 als Sinn Primer eingesetzt wurde und der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 6 als anti-Sinn Primer (Infection and Immunity 61, 1202–1210, 1993).
Darüber hinaus wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das 47K kodiert, wobei der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 1 als Sinn Primer und der in Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 20 als anti-Sinn Primer verwendet wurde (Infection and Immunity 60, 1568–1576, 1992).
In Infection and Immunity 60, 1568–1576, 1992, wird berichtet, es sei möglich, dass 9 Aminosäuren mit dem C-Terminus der 434 Aminosäuren von 47K verknüpft werden. Wie in 2 dargestellt, wurde daher bei der Amplifikation des 47K DNA-Fragments ein 47K kodierendes DNA-Fragment durch Zufügen einer DNA-Sequenz, welche den 9 Aminosäuren entspricht, zu dem eingesetzten anti-Sinn Primer hergestellt.
3 zeigt ein 15K kodierendes DNA-Fragment und ein 17K kodierendes DNA-Fragment.
Beispiel 1
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-17 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 7 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 4. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 7 und 4 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Erhitzungszyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das gewünschte DNA-Fragment 1 erhalten.
(b) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 5 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 6. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 5 und 6 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 17K Gens und von 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei dieselben Erhitzungszyklen wie in Schritt (a) von Beispiel 1 eingesetzt wurden. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das gewünschte DNA-Fragment 2 erhalten.
(c) Mit einem Gemisch aus 1 ng des in Schritt (a) von Beispiel 1 hergestellten DNA-Fragments 1, 1 ng des DNA-Fragments 2, den gemäß Referenzbeispiel 3 präparierten Primern 7 und 6 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, und aus 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 40 Mal wiederholt und so das gewünschte ein 15-17 Fusionsantigen kodierendes DNA-Fragment erhalten.
(d) pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (New England Biolabs Co., Ltd.) und 5 Einheiten BamH I (New England Biolabs Co., Ltd.) gespalten. Das in Schritt (c) von Beispiel 1 hergestellte Gen für das 15-17 Fusionsantigen wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (New England Biolabs Co., Ltd.) und 5 Einheiten BamH I (New England Biolabs Co., Ltd.) gespalten.
(e) pW6A und das das 15-17 Fusionsantigen kodierende Gen, gespalten wie in Schritt (d) von Beispiel 1 dargestellt, wurden 2 Stunden bei 16°C unter Verwendung des Ligationskits Ver. 1 (TaKaRa Co., Ltd.) verknüpft. Nach Abschluß dieser Reaktion wurde Escherichia coli DH5α, eine nach dem Verfahren nach Hanahan kompetent gemachte Zelle, unter Verwendung des vorstehend genannten Reaktionsgemisches transformiert. Die so transformierten Escherichia coli Zellen wurden anschließend auf einer Ampicillin in einer Menge von 50 μg/ml enthaltenden LB Agarplatte ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Aus den so hergestellten Ampicillin-resistenten Escherichia coli Zellkolonien wurde eine Transformante ausgewählt, die einen Expressionsvektor für das 15-17 Fusionsantigen trug, in den das das 15-17 Fusionsantigen kodierende Gen integriert war. Die so ausgewählte Transformante wurde danach bei 37°C über Nacht unter Schütteln in einem Ampicillin enthaltenden LB Kultur Flüssigmedium kultiviert. Der gewünschte Transformantenklon wurde geerntet und der gewünschte Vektor daraus mit dem Alkali-SDS Verfahren aufgereinigt.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 2
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-47 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 7 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 17. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 7 und 17 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das gewünschte DNA-Fragment 3 erhalten.
(b) DNA-Fragment 3, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (New England Biolabs Co., Ltd.) und 5 Einheiten Sal I (Toyobo Co., Ltd.) gespalten. pW6A, hergestellt in Referenzbeispiel 2, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (New England Biolabs Co., Ltd.) und 5 Einheiten Sal I (Toyobo Co., Ltd.) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 3 in pW6A, hergestellt in Referenzbeispiel 2, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 eingefügt.
(c) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 12 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 10. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 12 und 10 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 47K Gens und von 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das gewünschte DNA-Fragment 4 erhalten.
(d) pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 3, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, jeweils wie vorstehend angegeben, gespalten. DNA-Fragment 4, hergestellt in Schritt (c) von Beispiel 2, wurde ebenfalls wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 4 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 3, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 15-47 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 3
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 17-47 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 8 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 15. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 8 und 15 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 17K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 5 erhalten.
(b) DNA-Fragment 5, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 3 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I, wie vorstehend angegeben und 5 Einheiten Xho I (Toyobo Co., Ltd.) gespalten. pW6A, hergestellt in Referenzbeispiel 2, wurde ebenfalls wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I und 5 Einheiten Xho I gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 5 in pW6A unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 eingefügt.
(c) DNA-Fragment 4, hergestellt in Schritt (c) von Beispiel 2, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 3 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Xho I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 4 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 17-47 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 4
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 17-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 11 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 9. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 11 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 6 erhalten.
(b) DNA-Fragment 6, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 4 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I und 5 Einheiten BamH I (wie oben angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 3 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Xho I und 5 Einheiten BamH I, jeweils wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 6 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 17-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 5
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 47-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 1 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 21. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 1 und 21 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 47K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das gewünschte DNA-Fragment 7 erhalten.
(b) DNA-Fragment 7, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 5 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, hergestellt in Referenzbeispiel 2, wurde ebenfalls wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie oben beschrieben) und 5 Einheiten Sal I (wie oben angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 7 in pW6A unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt.
(c) DNA-Fragment 6, hergestellt in Schritt (a) von Beispiel 4, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 5 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 6 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 47-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 6
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 47-17 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 14 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 6. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 14 und 6 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 17K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 8 erhalten.
(b) DNA-Fragment 8, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 6 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 5 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 8 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 47-17 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 7
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 47-15-17 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 11 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 6. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 11 und 6 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Beispiel 1 hergestellten Expressionsvektors für das 15-17 Fusionsantigen und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 9 erhalten.
(b) DNA-Fragment 9, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 7 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 5 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 9 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 7, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 47-15-17 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Beispiel 8
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 17-47-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 12 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 2. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 7 und 17 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 47K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 10 erhalten.
(b) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 3 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 9. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 3 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Erhitzungszyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 11 erhalten.
(c) Mit einem Gemisch von 1 ng des in Schritt (a) von Beispiel 8 hergestellten DNA-Fragmentes 10, 1 ng des in Schritt (b) von Beispiel 8 hergestellten DNA-Fragmentes 11, der vorstehend genannten Primer 12 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so ein Gen erhalten, das das 47-15 Fusionsgen kodiert.
(d) Das das 47-15 Fusionsgen kodierende Gen, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 8 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 3 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Xho I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das das 47-15 Fusionsantigen kodierende Gen in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 5, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 17-47-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Beispiel 9
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 17-15-47 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 8 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 17. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 8 und 17 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Beispiel 4 hergestellten Expressionsvektors für das 17-15 Fusionsantigen und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 12 erhalten.
(b) DNA-Fragment 12, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 9 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 12 in pW6A, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt.
(c) DNA-Fragment 4, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 12, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 9 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 4 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 12, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 17-15-47 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Beispiel 10
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-47-17 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 12 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 13. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 12 und 13 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 47K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 13 erhalten.
(b) DNA-Fragment 13, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 10 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Xho I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Xho I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 13 in pW6A, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt.
(c) DNA-Fragment 8, präpariert wie in Beispiel 6 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 13, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 10 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Xho I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 8 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 13, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 13-8 erhalten.
(d) DNA-Fragment 3, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 13-8, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 10 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I und 5 Einheiten Sal I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 3 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 13-8, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für ein 15-47-17 Fusionsantigen erhalten.

Beispiel 11
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-17-47 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 7 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 16. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 7 und 16 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Beispiel 1 hergestellten Expressionsvektors für das 15-17 Fusionsantigen und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 14 erhalten.
(b) DNA-Fragment 14, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 11 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 14 in pW6A, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt.
(c) DNA-Fragment 4, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 14, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 11 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I und 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 4 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 14, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 15-17-47 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Beispiel 12
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 47-17-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 1 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 18. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 1 und 18 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 47K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 15 erhalten.
(b) DNA-Fragment 15, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 12 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sac I (wie vorstehend angegeben; Toyobo Co., Ltd.) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sac I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 15 in pW6A, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt.
(c) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 19 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 28. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 19 und 28 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 17K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 16 erhalten.
(d) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 29 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 9. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 29 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 17 erhalten.
(e) DNA-Fragment 16, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 12 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sac I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten EcoR I (Toyobo Co., Ltd.) gespalten. DNA-Fragment 17, präpariert wie in Schritt (d) von Beispiel 12 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten EcoR I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 12 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sac I und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurden die DNA-Fragmente 16 und 17 gleichzeitig in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für das 47-17-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Beispiel 13
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 7 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 9. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 7 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Erhitzungszyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 18 erhalten.
(b) DNA-Fragment 18, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 13 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A, präpariert wie in Referenzbeispiel 2 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Nde I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 18 in pW6A, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für ein 15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Beispiel 14
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 11 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 9. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 11 und 9 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 19 erhalten.
(b) DNA-Fragment 19, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 14 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Der Expressionsvektor für das 15-47-17 Fusionsantigen, präpariert wie in Beispiel 10 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 19 in den Expressionsvektor für das 15-47-17 Fusionsantigen, aus dem das DNA-Fragment 47-17 eliminiert worden war, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für ein 15-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Beispiel 15
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-15-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 11 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 22. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 11 und 22 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 20 erhalten.
(b) DNA-Fragment 20, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 15 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und mit 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Der Expressionsvektor für das 15-47-17 Fusionsantigen, präpariert wie in Beispiel 10 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Sal I (wie vorstehend angegeben) und mit 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 20 in den Expressionsvektor für das 15-47-17 Fusionsantigen, aus dem das DNA-Fragment 47-17 eliminiert worden war, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde pW6A generiert, in den ein DNA-Fragment 15-15 insertiert worden ist.
(c) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 23 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Beispiel 3 hergestellte Primer 24. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 23 und 24 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase (TaKaRa Co. Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 21 erhalten.
(d) DNA-Fragment 21, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 15 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben, Toyobo Co., Ltd.) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 15 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben, Toyobo Co., Ltd.) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 21 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für ein 15-15-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Beispiel 16
[Herstellung eines Expressionsvektors für das 15-15-15-15 Fusionsantigen]

(a) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 23 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Referenzbeispiel 3 hergestellte Primer 25. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 23 und 25 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase (TaKaRa Co., Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 22 erhalten.
(b) DNA-Fragment 22, präpariert wie in Schritt (a) von Beispiel 16 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten BamH I (wie vorstehend angegeben) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 15 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten BamH I, wie vorstehend angegeben, gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 22 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde pW6A mit einem DNA-Fragment 15-15-15 erhalten.
(c) Als Sinn Primer wurde der gemäß Referenzbeispiel 3 präparierte Primer 26 ausgewählt und als anti-Sinn Primer der gemäß Referenzbeispiel 3 hergestellte Primer 27. Mit einem Gemisch der vorstehend genannten Primer 26 und 27 bei einer jeweiligen Endkonzentration von 1 μM, von 0,1 ng des gemäß Referenzbeispiel 4 hergestellten 15K Gens und von 2,5 Einheiten der vorstehend genannten Taq-Polymerase (TaKaRa Co. Ltd.) wurde eine PCR durchgeführt, wobei ein Erhitzungszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten eingesetzt wurde. Dieser Zyklus wurde 30 Mal wiederholt und so das DNA-Fragment 23 erhalten.
(d) DNA-Fragment 23, präpariert wie in Schritt (c) von Beispiel 16 angegeben, wurde 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Hind III (wie vorstehend angegeben, Toyobo Co., Ltd.) gespalten. pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15-15, präpariert wie in Schritt (b) von Beispiel 16 angegeben, wurde ebenfalls 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Kpn I (wie vorstehend angegeben) und anschließend 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten Hind III, wie vorstehend angegeben, (Toyobo Co., Ltd.) gespalten. Nach diesen Reaktionen wurde das DNA-Fragment 23 in pW6A mit dem insertierten DNA-Fragment 15-15-15, unter denselben Bedingungen wie in Schritt (e) von Beispiel 1 angegeben, eingefügt. Hierdurch wurde ein Expressionsvektor für ein 15-15-15-15 Fusionsantigen erhalten.

Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Beispiel 17
[Expression aller Fusionsantigene]
Escherichia coli BL 21 (DE3), eine gemäß dem Verfahren nach Hanahan kompetent gemachte Zelle, wurde unter Verwendung von jedem der vorstehend genannten und in den Beispielen 1 bis 12 erhaltenen Expressionsvektoren transformiert.
Die jeweiligen Transformantenkulturen wurden anschließend auf eine 50 μg/ml Ampicillin enthaltende LB Agarplatte ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Aus dem so erhaltenen Gemisch Ampicillin-resistenter Escherichia coli Zellen wurden Transformanten ausgewählt, die jeweils einen Expressionsvektor für insgesamt alle Fusionsantigene aufwiesen, in die jeweiligen fusionierten Antigene integriert waren. Jede der so ausgewählten Transformanten wurde anschließend in 4 ml 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB Flüssigmedium inokuliert und bei 37°C über Nacht unter Schütteln angezogen.
Die so erhaltene Kultur wurde weiter in 1 l 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB Flüssigmedium inokuliert und bei 37°C 3 Stunden unter Schütteln gezüchtet.
Dem angezogenem Escherichia coli wurde IPTG (Isopropyl-β-D(–)-thiogalaktopyranosid) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben.
Die Anzucht wurde anschließend bei 37°C über Nacht unter Schütteln weitergeführt. Hierdurch wurde die Expression von jedem Fusionsantigen durchgeführt.
Beispiel 18
[Aufreinigung der Fusionsantigene]
Das 47-17-15 Fusionsantigen, das 47-15-17 Fusionsantigen, das 15-17-47 Fusionsantigen und das 15-17 Fusionsantigen wurden aufgereinigt.
Die Fusionsantigene des Typs drei fusionierte Antigene, nämlich das 47-17-15 Fusionsantigen, das 47-15-17 Fusionsantigen und das 15-17-47 Fusionsantigen wurden durch die Schritte des Mischens unter Verwendung von Ultraschall und Zentrifugation sämtlicher Antigen exprimierender Escherichia coli, in Lösung Bringen des Restes unter Verwendung von Harnstoff und Durchführung einer Gelfiltrationschromatographie mit dem Antigen unter Verwendung von Superdex-200 (Pharmacia Biotec Co., Ltd), Ionenaustauscher Chromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose (Pharmacia Biotec Co., Ltd), und Absorptionschromatographie vermittels keramischem Hydroxyapatit (Asahi Optical Co., Ltd.) aufgereinigt.
Das Fusionsantigen des Typs zwei fusionierte Antigene, nämlich das 15-17 Fusionsantigen wurde durch die Schritte des Mischens unter Verwendung von Ultraschall und Zentrifugation des Antigen exprimierenden Escherichia coli, Zusammenfügen des Überstandes, Zuführen von Harnstoff und Durchführung einer Ionenaustausch Chromatographie mit dem Antigen unter Verwendung von Q-Sepharose (Pharmacia Biotec Co., Ltd), einer Absorptionschromatographie vermittels keramischem Hydroxyapatit (Asahi Optical Co., Ltd.) und anschließend einer Ionenaustausch Chromatographie unter Verwendung von SP-Sepharose (Pharmacia Biotec Co., Ltd) aufgereinigt.
Es wurden 7 mg des 47-17-15 Fusionsantigens, 10 mg des 47-15-17 Fusionsantigens, 20 mg des 15-17-47 Fusionsantigens und 10 mg des 15-17 Fusionsantigens mit einem Reinheitsgrad von 95% oder höher aus einem Liter des jeweiligen Kulturmediums gewonnen.
Nach der Reinigung wurde mit jedem Fusionsantigen eine SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen mit nachfolgender Coomassie-Färbung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
Es wurde erwartet, dass die Antigene des Typs drei fusionierte Antigene ein Molekulargewicht von 75K aufwiesen und dass das 15-17 Fusionsantigen ein Molekulargewicht von 29K aufwies und zwar angesichts der jeweiligen Aminosäuresequenzen. Durch die elektrophoretischen Analysen wurde bestätigt, dass diese Erwartung richtig war.
Vermittels Western Blotting unter Verwendung von 47KMAk, 17KMAk und 15KMAk, hergestellt wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, wurde bestätigt, dass diese monoklonalen Antikörper mit den entsprechenden Antigenen innerhalb jedes der Fusionsantigene reagieren.
Beispiel 19
[Präparation einer Platte, an die fusioniertes Antigen gebunden ist]
Jedes der in Beispiel 18 aufgereinigten Fusionsantigene wurde mit 10 mM PBS verdünnt, in einer Menge von 0,66 pMol/Vertiefung in die Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Becton Dickinson Co., Ltd) überführt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Hierdurch wurde das Fusionsantigen an die Vertiefungen gebunden. Nach diesem Bindungsprozeß wurde jede Vertiefung, an die Fusionsantigen gebunden hatte, mit 10 mM PBS, die 1% Magermilch enthielt, bei 37°C für 2 Stunden blockiert.
Referenzbeispiel 5
[Präparation einer Platte, an die ein einzelnes Antigen gebunden ist]
Rekombinantes, einzelnes 47K Antigen, das in Escherichia coli exprimiert und daraus aufgereinigt wurde, ein 17K Antigen mit einem Signalpeptid an seinem N- Terminus (nachfolgend als S17K Antigen bezeichnet) und GST15K Antigen wurden jeweils in einer Menge von 0,66 pMol/Vertiefung an Vertiefungen gebunden.
Darüber hinaus wurde ein Gemisch aus dem vorstehend genannten rekombinanten, einzelnen 47K Antigen, S17K Antigen und GST15K Antigen in einer Menge von 0,66 pMol/Vertiefung an Vertiefungen gebunden.
Nach diesem Bindungsprozeß wurden die Vertiefungen mit 10 mM PBS, die 1% Magermilch enthielt, bei 37°C für 2 Stunden blockiert.
Beispiel 20
[Tests auf Reaktivität zwischen Fusionsantigenen und monoklonalen Antikörpern]
Der 47KMAk, der 17KMAk, der 15KMAk, jeweils alleine, und ein Gemisch davon wurden mit 10 mM PBS, die 1% Magermilch enthielt, und 0,05% Tween 20 (Marke) (nachfolgend als Magermilch enthaltende PBST bezeichnet) derart verdünnt, dass die Endkonzentration jedes monoklonalen Antikörpers 10 μm/ml betrug.
Jeder der wie vorstehend verdünnten monoklonalen Antikörper sowie das vorstehend genannte Gemisch wurde in einer Menge von 50 μl in die gewaschenen Vertiefungen der Platten mit daran gebundenem Antigen gegeben, die gemäß Beispiel 19 und Referenzbeispiel 5 präpariert worden waren und anschließend bei Raumtemperatur eine Stunde und dreißig Minuten inkubiert.
Nachdem sämtliche Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden 50 μl eines mit Peroxidase markierten anti-Maus Ig (DAKO Co., Ltd.), verdünnt zu 1/1000 mit Magermilch enthaltender PBST, in jede Vertiefung gegeben und das Gemisch wurde für eine Stunde und dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nachdem alle Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden 50 μl eines Lösungsgemisches aus einer Wasserstoffperoxid Lösung und ABTS [2,2'-Azino-6-bis(3-ethylthiazolin)sulfonsäure] zugegeben und ABTS für 3 Minuten gefärbt. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Absorption bei 405 nm mittels eines Spektrophotometers gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Wie in Tabelle 1 dargestellt, zeigen die fusionierten Antigene eine höhere Aktivität als jedes der einzelnen Antigene 47K, S17K und GST15K.
Tabelle 1
Beispiel 21
[Vergleichstest betreffend Reaktivitäten zwischen fusionierten Antigenen und einzelnen Antigenen]
Jeweils 50 μl eines Tp positiven Serums (käuflich erworben von der Firma Boston Biomedica Inc.), das 1/1000 mit Magermilch enthaltender PBST verdünnt worden war und eines Tp negativen Serums wurden in die Vertiefungen der gewaschenen Platten gegeben, an die Antigen gebunden war und die wie in Beispiel 19 und Referenzbeispiel 5 beschrieben, hergestellt worden waren.
Jedes der vorstehend genannten Seren wurde bei Raumtemperatur eine Stunde und 30 Minuten inkubiert.
Nachdem sämtliche Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden 50 μl eines Peroxidase-markierten anti-human IgG (BIO SOURCE Co., Ltd.), 1/1000 verdünnt in Magermilch enthaltender PBST, in jede Vertiefung gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde und 30 Minuten inkubiert.
Nachdem die Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden 50 μl eines Lösungsgemisches aus einer Wasserstoffperoxid Lösung und ABTS zugegeben und ABTS für 3 Minuten gefärbt. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Absorption bei 405 nm mittels eines Spektrophotometers gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigen die fusionierten Antigene eine höhere Reaktivität mit dem positiven Serum als die einzelnen Antigene und das Gemisch davon und zeigen in keinem Fall eine Reaktion mit dem negativen Serum.
Tabelle 2
Beispiel 22
[Reaktivitätstests zwischen fusionierten Antigenen und positivem Serum]
24 Beispiele von Tp positiven Seren (gekauft von Boston Biomedica Inc.) und ein Beispiel eines Tp negativen Serums wurden auf die gleiche Weise getestet, wie in Beispiel 21 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Färbungsdauer auf 30 Minuten ausgedehnt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Reaktivitäten der fusionierten Antigene mit den 24 Beispielen an positiven Seren waren bedeutend höher als die der fusionierten Antigene mit dem negativen Serum.
Tabelle 3
Beispiel 23
[Expression von 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K]
Escherichia coli BL21 (DE3) wurde jeweils mit den 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K Expressionsvektoren transformiert, die wie in den Beispielen 13 bis 16 dargestellt, erhalten worden waren.
Die jeweiligen Transformantenkulturen wurden anschließend auf einer 50 μg/ml Ampicillin enthaltenden LB Agarplatte ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Aus dem so erhaltenen Gemisch Ampicillin-resistenter Escherichia coli Zellen wurden Transformanten ausgewählt, die jeweils einen Expressionsvektor für insgesamt alle Fusionsantigene aufwiesen, in die jeweiligen fusionierten Antigene integriert waren.
Jede der so ausgewählten Transformanten wurde anschließend in 2 ml 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB Flüssigmedium inokuliert und bei 37°C über Nacht unter Schütteln angezogen.
40 μl der so erhaltenen Kultur wurde in 2 ml 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB Flüssigmedium inokuliert und weiter bei 37°C 2 Stunden unter Schütteln gezüchtet.
Dem angezogenen Escherichia coli wurde IPTG (Isopropyl-β-D(–)-thiogalaktopyranosid) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben.
Die Anzucht wurde anschließend bei 37°C über Nacht unter Schütteln weitergeführt. Hierdurch wurde jedes Fusionsantigen exprimiert.
Von den 2 ml der so erhaltenen Kultur wurden 1,5 ml in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mittels einer Mikrozentrifuge (Marke „himac CT 15D", Hitachi Ltd.) 30 Sekunden bei 15.000 UpM zentrifugiert. Hierdurch wurde ein Zellpellet der gewünschten Escherichia coli Transformante gesammelt.
Jedes Zellpellet wurde in 150 μl TE Puffer (10 mM Tris-Salzsäure Puffer, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) und 150 μl 2 × Probenpuffer (1 M Tris-Salzsäure Puffer, pH 6,8, 20% (Gew./Vol.) SDS, 10 Vol.-% β-ME) resuspendiert und 5 Minuten gekocht. Danach wurde jede Probe 10 Minuten lang Ultraschall behandelt.
Zu 13 μl der so erhaltenen Probe wurden 2 μl an 50%igem Glycerin zugegeben und das Ganze vermischt. Mit 10 μl des Gemischs wurde dann eine Elektrophorese auf einem 15% SDS-Polyacrylamid Gel unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt (Laemmli, U.K., 1970: Nature 227, 680) und anschließend eine Färbung mit Coomassie Blau R.
Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
Durch die Expression über Nacht wurde das Vorhandensein der 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K Banden bestätigt.
Darüber hinaus wurde jedes über Nacht exprimierte Antigen einer SDS-PAGE, wie vorstehend beschrieben, auf einem 10–15%-igen Polyacrylamid Gradientengel zugeführt. Anschließend wurde ein Western Blot mit dem in Referenzbeispiel 1 hergestellten 15KMAk durchgeführt.
Das Ergebnis ist in 9 dargestellt und das Vorhandensein der 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K Banden bestätigt.
Beispiel 24
[Vergleich der exprimierten Mengen an 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K]
Mit einer Elekrophoreseprobe, die wie in Beispiel 23 dargestellt präpariert wurde und mit Molekulargewicht Standards, die eine bekannte Konzentration an BSA enthielten (Marke „Low Molecular Weight Calibration Kit", Pharmacia LKB) wurde eine Elektrophorese auf einem 15%igem SDS-Polyacrylamid Gel unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt und anschließend eine Färbung mit Coomassie Blau R. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
Die Mengen der exprimierten Antigene wurden mittels eines Densitometers (Marke „Densitograph AE-6900", Atto Co., Ltd.) anhand der gefärbten Banden berechnet.
Aus dem mit Coomassie Blau R gefärbten Gel in 10 wurde die Dichte der BSA-Banden bekannter Konzentration mittels des Densitometers gemessen und so eine Eichkurve wie in 11 dargestellt erhalten. Darüber hinaus wurden die Dichten der 15K, 15K-15K, 15K-15K-15K und 15K-15K-15K-15K entsprechenden Banden in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, mit dem Densitometer vermessen und die jeweiligen exprimierten Mengen wurden unter Verwendung der in 11 dargestellten Eichkurve berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Bei 15K wurden keine Banden beobachtet. Im Gegensatz dazu betrug die exprimierte Menge an 15K-15K-15K 1 μg pro Spur (entsprechend 23 mg pro Liter Kultur) und war damit die größte aller getesteten Proben. Durch mehrfache Fusion von 15K wurde so die exprimierte Menge des Produktes signifikant erhöht.

Claims

An Treponema pallidum fusioniertes Antigen, in welchem mindestens zwei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind, wobei das fusionierte Antigen frei von einem Heteroantigen mit Ausnahme des Tp-Antigens ist.
An Treponema pallidum fusioniertes Antigen nach Anspruch 1, wobei mindestens drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind.
An Treponema pallidum fusioniertes Antigen nach Anspruch 1 oder 2, in welchem zwei bis drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind.
An Treponema pallidum fusioniertes Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oberflächenantigene ein Molekulargewicht haben, das ausgewählt ist aus 47 kDa (47K), 17 kDa (17K) und 15 kDa (15K).
An Treponema pallidum fusioniertes Antigen nach Anspruch 4, wobei die Oberflächenantigene in der Reihenfolge von der N-terminalen zur C-terminalen Sequenz ausgewählt sind aus dem 47K-17K-15K-fusionierten Antigen, dem 47K-15K-17K-fusionierten Antigen, dem 15K-17K-47K-fusionierten Antigen, dem 15K-47K-17K-fusionierten Antigen, dem 17K-15K-47K-fusionierten Antigen, dem 17K-47K-15K-fusionierten Antigen, dem 47K-17K-fusionierten Antigen, dem 47K-15K-fusionierten Antigen, dem 17K-47K-fusionierten Antigen, dem 17K-15K-fusionierten Antigen, dem 15K-47K-fusionierten Antigen, dem 15K-17K-fusionierten Antigen, dem 15K-15K-fusionierten Antigen, dem 15K-15K-15K-fusionierten Antigen und dem 15K-15K-15K-15K-fusionierten Antigen.
In-vitro-Testverfahren für anti-Treponema pallidum-Antikörper, welches die Verwendung eines an Treponema pallidum fusionierten Antigens umfasst, in welchem mindestens zwei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind, wobei das fusionierte Antigen frei von Heteroantigenen mit Ausnahme von Tp-Antigenen ist.
Testverfahren nach Anspruch 6, welches die Verwendung eines an Treponema pallidum fusionierten Antigens umfasst, in welchem mindestens drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind.
Testverfahren nach Anspruch 6 oder 7, welches die Verwendung eines an Treponema pallidum fusionierten Antigens umfasst, in welches zwei bis drei Oberflächenantigene von Treponema pallidum fusioniert sind.
Testverfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Oberflächenantigene ein Molekulargewicht haben, das ausgewählt ist aus 47 kDa (47K), 17 kDa (17K) und 15 kDa (15K).
Testverfahren nach Anspruch 9, wobei die Oberflächenantigene in der Reihenfolge von der N-terminalen zur C-terminalen Sequenz ausgewählt sind aus dem 47K-17K-15K-fusionierten Antigen, dem 47K-15K-17K-fusionierten Antigen, dem 15K-17K-47K-fusionierten Antigen, dem 15K-47K-17K-fusionierten Antigen, dem 17K-15K-47K-fusionierten Antigen, dem 17K-47K-15K-fusionierten Antigen, dem 47K-17K-fusionierten Antigen, dem 47K-15K-fusionierten Antigen, dem 17K-47K-fusionierten Antigen, dem 17K-15K-fusionierten Antigen, dem 15K-47K-fusionierten Antigen, dem 15K-17K-fusionierten Antigen, dem 15K-15K-fusionierten Antigen, dem 15K-15K-15K-fusionierten Antigen und dem 15K-15K-15K-15K-fusionierten Antigen.