DE69721629T2

DE69721629T2 - An Nukleinsäure gebundenes Polypeptid, Verfahren zur Herstellung eines an Nukleinsäure gebundenen Polypeptides und Immunoassay, in dem dieses Polypeptid Verwendung findet

Info

Publication number: DE69721629T2
Application number: DE69721629T
Authority: DE
Inventors: Fuminori Higashiyamto-shi Takemura; Eiichi Hino-shi Ueno; Satoru 1-18-1 Itoh
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2017-05-01
Also published as: EP0805160B1; AU707981B2; AU1997897A; ATE239754T1; EP0805160A1; DE69721629D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Immunassay, der das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid verwendet.
DISKUSSION DES HINTERGRUNDS
Es wurden verschiedene Studien durchgeführt, um die spezifische sterische Struktur eines rekombinanten Proteins, welches durch Gentechnologie, spezifischer durch Genmanipulation, hergestellt wurde, zu erhalten, und ebenfalls, wie man das so hergestellte Protein bei einer Antigen-Antikörper-Reaktion anwendet.
Bei der Herstellung des rekombinanten Proteins, im Besonderen im Verlauf eines Reinigungsschrittes des hergestellten Proteins, wird unvermeidlich eine Denaturierungsoperation durchgeführt. Bei einem derartigen Reinigungsschritt ist es nicht immer möglich, eine natürliche Struktur des Proteins aufrechtzuerhalten, so dass ein derartiges Protein in einem Immunassay-System nicht verwendet werden kann.
Auch weitere Faktoren sind bekannt, die Reaktionen beeinträchtigen, welche für jeden der verschiedenen Assays eigentümlich sind. Es ist bekannt, dass die vorstehend erwähnte Antigen-Antikörper-Reaktion aus diesen oder aus anderen Gründen nicht immer wie gewünscht abläuft, wenn das rekombinante Protein verwendet wird.
Zum Beispiel ist als einer der Immunassays ein Agglutinierungs-Immunassay bekannt. Zum Beispiel wird, wenn ein Antikörper, der einem Antigen entspricht, bei dem Agglutinierungs-Immunassay verwendet wird, das Antigen auf der Oberfläche von Teilchen wie Latex-Teilchen fixiert, und derartige Antigen-fixierte Teilchen lässt man mit dem Antikörper in einer Testprobe reagieren. Ist der Antikörper in der Testprobe vorhanden, so agglutinieren die Antigen-fixierten Teilchen auf Grund der Antigen-Antikörper-Reaktion, so dass sich beispielsweise die Absorption der Testprobe verändert. Deshalb kann der Grad der Agglutinierung durch Messen der Absorption der Testprobe bestimmt werden, und dementsprechend können die Antikörper in der Testprobe aus der gemessenen Absorption der Testprobe quantitativ gemessen werden.
Wird jedoch das rekombinante Protein als das auf der Oberfläche der Teilchen zu fixierende Antigen in dem vorstehend erwähnten Immunassay verwendet, so kommt es gelegentlich vor, dass, obwohl das Protein selbst eine Reaktivität mit dem zu testenden Antikörper hat, und der Antikörper tatsächlich in der Testprobe vorliegt, keine Agglutinierung stattfindet.
Herkömmlicherweise wird das rekombinante Protein in dem Fall, in dem keine Agglutinierung wie vorstehend beschrieben stattfindet, in Form eines fusionierten Proteins modifiziert oder exprimiert, um die Agglutinationsreaktivität des Protein zu verbessern. Es ist jedoch extrem schwierig, das Protein so zu modifizieren, dass man ihm die gewünschten Eigenschaften verleiht und gleichzeitig die Antigenität (z. B. die Reaktivität mit dem Antikörper) erhält.
Des Weiteren ist das rekombinante Protein oft von einem unlöslichen Typ, so dass, wenn das so hergestellte Protein gereinigt wird, es einer Solubilisierungsbehandlung unterzogen werden muss. Das Protein wird jedoch oft im Verlauf der Reinigungsbehandlung denaturiert, wobei es die notwendige Antigenität verliert.
Deshalb wird bevorzugt, dass ein lösliches Protein direkt durch Gentechnologie hergestellt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung kann durch einen Immunassay zum Testen eines Antigens, welches ein Polypeptid umfasst oder einem Antikörper, der einem Antigen entspricht, erreicht werden, wobei das vorstehend erwähnte als Antigen verwendet wird, wobei das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid ein Fusionspolypeptid ist, welches ein Polypeptid mit einem Nucleinsäure-bindenden Motiv ist, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR 2 gezeigt ist, umfasst, und an das die Nucleinsäure gebunden ist.
Das vorstehend erwähnte Nucleinsäure-gebundene Polypeptid, kann durch das Verfahren hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Herstellen eines rekombinanten Polypeptids,
– Binden einer Nucleinsäure an das rekombinante Polypeptid, um ein Nucleinsäure-gebundenes Polypeptid als lösliche Fraktion herzustellen, und
– Reinigen des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids von der löslichen Fraktion.

Bei dem vorstehend erwähnten Verfahren zur Herstellung des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids kann der Schritt des Bindens der Nucleinsäure an das Polypeptid, um das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid herzustellen, die folgenden Schritte umfassen:

– Fusionieren eines Gens, welches das Polypeptid codiert und eines Gens, welches das Nucleinsäure-bindende Motiv codiert, um ein Fusionsgen herzustellen, und
– Exprimieren des Fusionsgens, um das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid durch das Nucleinsäure-bindende Motiv herzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Ein umfassenderes Verständnis der Erfindung und viele der damit einhergehenden Vorteile werden besser erreicht, wenn dieselbige unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden wird und wenn es in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, worin:
1 eine genetische Karte eines Clonierungsvektors pW6A zur Verwendung bei der Exprimierung des HCV-Kernproteins ist, welches in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
2 ein Diagramm ist, das die Ergebnisse des Western Blottings zeigt, welches durchgeführt wurde, um die Reaktivität eines HCV-Kernproteins, welches in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung mit menschlichem positivem HCV-Kernserum gentechnologisch hergestellt wurde, zu zeigen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid, das in dem Immunassay der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, kann durch Binden einer Nucleinsäure an ein Polypeptid bereitgestellt werden, wobei die Eigenschaften des Polypeptids, wie der isoelektrische Punkt, das Molekulargewicht und seine dreidimensionale Struktur, verändert werden können, ohne dass sich die Antigenität davon ändert.
Als das „Polypeptid" zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann jedes Polypeptid verwendet werden, solange das Polypeptid selbst Antigenität zeigt und deshalb ist die Anzahl an Aminosäureresten, die das Polypeptid bilden, sechs oder mehr. Es wird bevorzugt, dass die Anzahl der Aminosäurereste, die das „Polypeptid" zur Verwendung in der vorliegenden Endung, bilden, 8 oder mehr ist.
Beispiele für das „Polypeptid" zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Zusammensetzungen eines Polypeptids und einer anderen Komponente oder anderen Komponenten wie Zucker oder Lipiden, nämlich Glycoprotein und Lipoprotein.
Es gibt keine besondere Begrenzung hinsichtlich der Größe der Nucleinsäure, die an das Polypeptid gebunden ist, solange die Nucleinsäure die vorstehend genannten Eigenschaften des Polypeptids, wie isoelektrischen Punkt, Molekulargewicht und dreidimensionale Struktur verändern kann ohne die Antigenität davon zu verändern. Normalerweise beträgt die Anzahl der Basen der Nucleinsäure zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung 100 B bis 10 kB, bevorzugt etwa 1 kB bis 5 kB.
Des Weiteren kann die Nucleinsäure, die an das Polypeptid gebunden werden soll, entweder DNA oder RNA sein.
Die Nucleinsäure kann an jeden Abschnitt des Polypeptids gebunden sein. Zum Beispiel kann die Nucleinsäure an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids gebunden sein, jedoch ist die Bindung nicht auf einen solchen Terminus beschränkt. In der vorliegenden Erfindung kann die Nucleinsäure entweder direkt oder indirekt an das. Polypeptid gebunden sein. Zum Beispiel kann die Nucleinsäure über ein Nucleinsäure-bindendes Motiv, welches ebenfalls ein Polypeptid ist, an das Polypeptid gebunden sein.
In dieser Anmeldung bedeutet der Begriff „Binden" oder „gebunden" hinsichtlich der Bindung der Nucleinsäure an, das Polypeptid alle Arten von chemischen Bindungen zwischen dem Polypeptid und der Nucleinsäure mit Anziehungskraft in dem großen Bereich von relativ schwacher Anziehungskraft zu starker Anziehungskraft, ohne irgendeine besondere Begrenzung bezüglich der Bindungsart, einschließlich der sogenannten Assoziation, kovalenten Bindung, ionischen Bindung, koordinierten Bindung und Wasserstoffbindung.
In der vorliegenden Erfindung kann, wenn das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid gentechnologisch hergestellt wird, das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid in Form eines Polypeptids exprimiert werden, an das die Nucleinsäure gebunden ist, und dabei das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid herstellen. Alternativ kann die Nucleinsäure, nachdem ein rekombinantes Polypeptid exprimiert wird, an das rekombinante Polypeptid gebunden werden und dabei das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid herstellen.
Noch spezifischer wird, wenn ein Polypeptid als Fusionspolypeptid mit einem Nucleinsäure-bindenden Motiv exprimiert wird, von dem bekannt ist, dass es eine Funktion hat, die Nucleinsäure an das Polypeptid zu binden, in der die Funktion des zu exprimierenden Polypeptids eingeschlossen wird, ein Polypeptid mit dem Nucleinsäure-bindenden Motiv exprimiert, und die Nucleinsäure in der Wirtszelle wird gleichzeitig über das Nucleinsäure-bindende Motiv an das rekombinante Polypeptid gebunden, so dass das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid hergestellt werden kann. Dieses Nucleinsäure-gebundene Polypeptid kann anschließend gereinigt werden.
Alternativ kann das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid durch Gewinnen des Polypeptids durch Vermischen des exprimierten Polypeptids mit der Nucleinsäure erhalten werden.
In Zusammenhang mit dem vorstehend erwähnten Nucleinsäure-bindenden Motiv sind verschiedene Nucleinsäure-bindende Motive bekannt. Zum Beispiel wird in J. of Virology, 64, 3319-3330 (1990) von einem Nucleinsäure-bindenden Motiv berichtet, welches in der Hbc-Protein-Aminosäuresequenz des Hepatitis B – Virus (HBV) vorhanden ist, und in Biochem. Biophys. Act, 950, 45-53 (1988) wird von Protamin berichtet, welches ein Nucleinsäure-gebundenes Protein in Mäusen ist. Diese können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Nucleinsäure-bindenden Motivs von HBc werden in der Sequenztabelle, die an diese Beschreibung angehängt ist, in der Sequenz Nr. 1, beziehungsweise der Sequenz Nr. 2, gezeigt; und die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Maus-Protamins werden in der Sequenztabelle, die an diese Beschreibung angehängt ist, in der Sequenz Nr. 17 beziehungsweise der Sequenz Nr. 18 gezeigt.
Wie vorstehend erwähnt kommt es gelegentlich vor, dass, wenn das Protein oder das Polypeptid, das herkömmlicherweise gentechnologisch hergestellt wurde, als das Antigen verwendet wird, das in dem herkömmlichen Agglutinations-Immuntest auf der Oberfläche der Partikel fixiert werden soll, sogar obwohl das Polypeptid selbst eine Reaktivität mit dem Antikörper, welcher getestet werden soll, besitzt und der Antikörper in der Tat in der Testprobe vorhanden ist, keine Agglutination stattfindet.
In der vorliegenden Erfindung wird dieses herkömmliche Problem durch Verwendung des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids vollständig gelöst. Wird nämlich das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid der vorliegenden Erfindung als das Antigen verwendet, welches auf der Oberfläche von Partikeln zur Verwendung im Agglutinations-Immuntest fixiert werden soll, so findet die Agglutination erfolgreich proportional in Übereinstimmung mit der Menge des entsprechenden Antikörpers in der Testprobe statt.
Das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann nicht nur für die vorstehend erwähnte Agglutination, sondern auch für jeglichen herkömmlichen Immuntest wie ELISA (Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) verwendet werden.
Des Weiteren kann das Polypeptid-Antigen in einer Testprobe ebenso getestet werden, indem eine Kompetitionsreaktion mit dem Zusetzen einer bekannten Menge des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids zu der Testprobe durchgeführt wird.
Herkömmlicherweise wird, wenn ein Polypeptid gentechnologisch hergestellt wird, das rekombinante Polypeptid in vielen Fällen als unlösliche Fraktion erhalten.
Deshalb muss, wenn das so erhaltene Polypeptid in der Praxis verwendet wird, das Polypeptid einer Solubilisierungsbehandlung unterzogen werden. Deshalb wird bevorzugt, dass das rekombinante Polypeptid als lösliche Fraktion erhalten wird. Das Polypeptid wird jedoch im Verlauf der Solubilisierungsbehandlung häufig denaturiert, wobei die Antigenität verändert wird.
Beim Verfahren zur Herstellung des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel ein Polypeptid gentechnologisch hergestellt und das so hergestellte Polypeptid wird gleichzeitig verursacht, an eine Nucleinsäure in dem Wirt zu binden, wobei das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid als lösliche Fraktion erhalten wird.
Des Weiteren wird, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, zum Beispiel wenn das zu exprimierende Polypeptid als fusioniertes Polypeptid und ein Nucleinsäure-bindendes Motiv von HBc exprimiert wird, die Nucleinsäure gleichzeitig mit der Expression an das Nucleinsäure-bindende Motiv gebunden, so dass das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid in der löslichen Fraktion erhalten wird.
Somit kann ein Verfahren zur Herstellung des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, welches die Schritte der Herstellung des rekombinanten Polypeptids, des Bindens der Nucleinsäure an das Polypeptid, um das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid als lösliche Fraktion herzustellen und das Reinigen des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids von der löslichen Fraktion, umfasst. Andere Merkmale dieser Erfindung werden im Verlauf der folgenden Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen ersichtlich, die zur Illustrierung der Erfindung angegeben werden, und nicht dazu gedacht sind, dafür begrenzend zu sein.
Referenzbeispiel 1
[Expression von HCV-Kernprotein (1-120 aa)]
Ein DNA-Fragment zur Codierung des HCV-Kern-Polypeptids mit Sequenz-ID. Nr. 3 in der angehängten Sequenztabelle wurde durch das PCR(Polymerase-Kettenreaktions)-Verfahren amplifiziert, wobei als Matrizenmolekül ein CKSC1150-Plasmid mit einem DNA-Fragment, welches eine HCV-Kernregion umfasste, verwendet wurde, und wurde dann mit einer Restriktions-Endonuclease EcoRI und einer Restriktions-Endonuclease BamHI gespalten.
Eine HCV-Kernregion umfassend ein DNA-Fragment von 370 Bp wurde durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-BamHI-Stelle eines pW6A-Expressionsplasmids, welches in l gezeigt wurde, inseriert, so dass ein pW6AHCV-Plasmid -Kern 120 hergestellt wurde.
Durch Verwenden dieses Plasmids wurde Escherichia coli BL21 (DE3) (erhalten vom Brookhaven National Laboratory) einer Transformation unterzogen, so dass ein Ampicillin resistentes transformiertes Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120 zur Expression des HCV-Kern-Polypeptids 120 erhalten wurde und ein HCV-Kernprotein (1-120aa) wurde exprimiert. Im Folgenden wird das so exprimierte Protein als „120" bezeichnet. Die Nucleotid-Sequen von „120" und die Aminosäuresequenz von „120" werden jeweils in Seqzenz ID. Nr. 3 und in Sequenz ID- Nr. 4 in der an diese Beschreibung angehängten Sequenztabelle gezeigt.
Beispiel 1
[Herstellung eines Plasmids]
Ein DNA-Fragment zur Codierung der HCV-Kern-Polypeptide 150 und 120, welche jeweils mit Sequenz ID Nr. 5 und mit Sequenz ID Nr. 3 in der angehängten Sequenztabelle gezeigt werden, wurde durch das PCR(Polymerase-Kettenreaktions)-Verfahren amplifiziert, wobei als Matrizenmolekül ein CKSC1150-Plasmid mit einem DNA-Fragment, welches eine eingeführte HCV-Kernregion umfasste, verwendet wurde, und wurde dann mit einer Restriktions-Endonuclease EcoRI und einer Restriktions-Endonuclease BamHI gespalten.
Eine HCV-Kernregion umfassend ein DNA-Fragment von 470 Bp und eine HCV-Kernregion umfassend ein DNA-Fragment von 370 Bp wurden durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Diese DNA-Fragmente wurden in eine EcoRI-BamHI-Stelle des pW6A-Expressionsplasmids, das in l gezeigt wurde, inseriert, wodurch ein pW6AHCV-Plasmid mit einem 150-Kern und ein pW6AHCV-Plasmid mit einem 120-Kern hergestellt wurden.
Ein DNA-Fragment zur Codierung eines HBc-Nucleinsäure-bindenden Motivs, welches mit Sequenz ID Nr. 1 in der an diese Beschreibung angehängten Sequenztabelle gezeigt wird, wurde durch das PCR (Polymerase-Kettenreaktions)-Verfahren amplifiziert, wobei als Matrizenmolekül ein pHBV-11-Plasmid (Nucleic Acids Res., 18, 4587 (1990)) verwendet wurde und wurde dann durch die BamHI-Restriktions-Endonuclease gespalten.
Ein DNA-Fragment von 110 Bp umfassend ein Nucleinsäure-bindendes Motiv wurde durch 2% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-BamHI-Stelle sowohl von dem vorstehend erwähnten Plasmid pW6AHCV-Kern 150 und dem Plasmid pW6AHCV-Kern 120 inseriert.
Durch die Verwendung dieser Plasmide wurde Escherichia coli BL21 (DE3) (erhalten vom Brookhaven National Laboratory) einer Transformation unterzogen, so dass eine Ampicillin resistente transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 150NA und eine Ampicillin resistente transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA erhalten wurden.
In dieser Beschreibung sind die Proteine, an die das Nucleinsäure-bindende Motiv gebunden ist, um die vorstehend erwähnte transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 150NA und die vorstehend erwähnte transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA zu exprimieren, als „150NA" beziehungsweise „120NA" bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz von „150NA" und die Aminosäuresequenz von „120NA" werden in Sequenz ID Nr. 9 beziehungsweise in Sequenz ID Nr. 10 in der Sequenztabelle, die an diese Beschreibung angehängt ist, gezeigt; und die. Nucleotidsequenz von „120NA" und die Aminosäuresequenz von „150NA" werden in Sequenz ID Nr. 7 beziehungsweise in Sequenz ID Nr. 8 in der Sequenztabelle, die an diese Beschreibung angehängt ist, gezeigt.
Beispiel 2
[Expression von rekombinantem Protein (150NA und 120NA]
Jedes der transformierten Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 150 und der transformierten Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120, hergestellt in Beispiel 1, wurde über Nacht getrennt in 2 ml eines LB-Kulturmediums, welches 50 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C kultiviert.
Nachdem die optische Dichte (OD) jedes Kulturmediums mit einem Licht von einer Wellenlänge von 600 nm 0,6 bis 0,8 durch Prä-Kultur erreichte, wurde mit dem Zusetzen von 0,5 mM IPTG (Isopropyl-β-D(-)-thiogalaktopyranosid) dazu eine Expressionsinduktion durchgeführt, und die Kultivierung wurde weitere zwei Stunden durchgeführt.
1,5 ml des Escherichia coli Kulturmediums wurden bei 5000 UpM 2 Minuten zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Die so aufgefangenen Escherichia coli wurden in 100 μl einer Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) suspendiert und wurden dann 15 Minuten einem Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen, wobei die Escherichia coli vollständig aufgebrochen wurden, wodurch zwei Testproben, nämlich eine Escherichia coli-Testprobe von Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 150NA und eine Escherichia coli-Testprobe von Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA hergestellt wurden.
8 μl einer dreifach konzentrierten SDS-Polyacrylamid-Pufferlösung (0,15 M Tris-HCl, pH-Wert 6,8, 6% SDS, 24% Glycerin, 6 mM EDTA, 2% 2-Mercaptoethanol, 0,003% Bromphenolblau) wurden getrennt jeder der vorstehenden Testproben zugesetzt. Jedes Gemisch wurde dann ausreichend umgerührt und wurde SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen.
Western Blotting wurde auf einem Nitrocellulosefilter durchgeführt, wobei jede der so hergestellten Testproben verwendet wurde. Nachdem unter Verwendung von 1% BSA eine Hemmung durchgeführt wurde, ließ man jede Testprobe mit einem menschlichen HCV-Kern-Antikörperserum reagieren, welches mit einer Phosphorsäure-Pufferlösung (10 mM Phosphorsäure, pH-Wert 7,4, 0,15 M NaCl) 200 Mal verdünnt wurde, reagieren. Des Weiteren ließ man dann einen mit Peroxydase-Enzym markierten anti-menschlichen polyclonalen IgG-Ratten-Antikörper (hergestellt durch Daco Co., Ltd.) damit reagieren. Nach dem Waschen wurden dazu 10 ml einer Substrat färbenden Flüssigkeit (0,01% wässrige Lösung aus Wasserstoffperoxid, 0,6 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol) zugegeben, wobei jede Testprobe gefärbt wurde.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Wie in 2 gezeigt, zeigte sowohl die Escherichia coli-Testprobe aus Escherichia coli-BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 150NA als auch die Escherichia coli-Testprobe aus Escherichia coli-BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA eine positive Reaktion mit dem menschlichen HCV-Kern-Antikörperserum.
Beispiel 3
[Reinigung von löslichem Nucleinsäure-gebundenem 120NA-rekombinantem Protein (120(+))]
Die Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA, hergestellt in Beispiel 1, wurde über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C kultiviert. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann mit Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Züchtung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol, 0,2 M NaCl, 0,3% Octylthioglucosid (im Folgenden als „OTG" bezeichnet) zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei eine lösliche Fraktion, die darin eine Nucleinsäure-gebundene 120NA (im Folgenden als „120NA(+)" bezeichnet) enthielt, gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Zucker zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf vorstehend erwähnte Weise wurde eine Pufferlösung mit einer 30%igen Sucrosekonzentration und eine Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der 50%igen Pufferlösung, zur 30%igen Pufferlösung und zur 20%igen Pufferlösung überschichtet.
Die 120NA(+) enthaltende lösliche Fraktion wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentrifugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer ersten Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugenkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen.
Die 120NA(+) wurde in einem Abschnitt mit einer Sucrosekonzentration von etwa 30 bis 40% gewonnen.
Die 120NA(+) enthaltende Fraktion, die durch die erste Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation gewonnen wurde, wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co. Ltd. ) mit einer Pufferlösung (0,3 M NaCl), 0,1% Myristyl-Sulfobetain (Marke „SB3-14", hergestellt durch Sigma Co., Ltd.) äquilibriert, wobei 120NA(+) mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer Sucrosekonzentration von 20% hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der Pufferlösung mit einer 50%igen Sucrosekonzentration, zur Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration überschichtet.
Die vorstehend erwähnte 120NA(+) mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentrifugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer zweiten Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen, wobei die 120NA(+) konzentriert und gereinigt wurde.
Referenzbeispiel 2
[Reinigung von unlöslichem 120NA]
Die Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA, hergestellt in Beispiel 1, wurde über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C kultiviert. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde dann zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol, 0,2 M NaCl, 0,3% OTG zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Aufbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei eine unlösliche 120NA-Fraktion erhalten wurde. Die so erhaltene unlösliche 120NA-Fraktion wurde durch eine Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH; pH-Wert 11,7) löslich gemacht und wurde dann einer Zentrifugation unterzogen, wobei eine Überstandsfraktion erhalten wurde.
Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde unter Verwendung einer kationischen SFF-Ionenaustauschsäule (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 11,7) äquilibriert war, einer Ionenaustausch-Reinigung mit Natriumchlorid-Elution unterzogen.
Die mit SFF eluierte Fraktion wurde dann unter Verwendung von Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 11,7) äquilibriert war, gereinigt. So wurde ein gereinigtes 120NA in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 22 kDa erhalten.
Beispiel 4
[Bestätigung der Eigenschaffen von 120NA und 120NA(+)]
Das 0D260/280 nm-Verhältnis der 120NA(+), welche in Beispiel 3 gereinigt wurde, wurde gemessen. Das Ergebnis war, dass das 0D260/280 nm-Verhältnis der 120NA(+) etwa 2,0 betrug, was größer war als das 0D260/280 nm-Verhältnis der 120NA. Dies indizierte, dass mindestens das Polypeptid und die Nucleinsäure in der 120NA(+) zusammen existieren.
Des Weiteren wurde das 120NA in der Sucrosedichtegradiente-Ultrazentrifugation meist in der Sucrosekonzentrationsregion von null% aufgefangen, wohingegen das 120NA(+) meist in einer Sucrosekonzentrationsregion von 30-40% aufgefangen wurde. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Tatsache anzeigt, dass sich die Dichte des 120NA(+) von der des 120NA unterscheidet.
Das 120NA(+) wurde Enzymbehandlung unter Verwendung von Dnase oder Rnase unterzogen. Wurde das 120NA(+) Enzymbehandlung unterzogen, so wurde die Nucleinsäure, die in dem 120NA(+) enthalten war in seiner Gesamtheit durch die Rnase zersetzt. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Tatsache anzeigt, dass die konstituierende Nucleinsäure des 120NA(+) RNA ist.
Das 120NA(+) wurde ebenso isoelektrischer Fokussierung unterzogen. Der isoelektrische Punkt des 120NA(+) war in einer großen Bereich von pI 3,5 bis 5,0 vorhanden.
In scharfem Kontrast dazu lag der isoelektrische Punkt des 120NA, welches in Referenzbeispiel 2 gereinigt wurde, bei pI 12,84, mit einer starken positiven Ladung, was sich signifikant von dem isoelektrischen Punkt des 120NA(+) unterschied.
Des Weiteren wurde das 120NA(+), unter Verwendung eines 3% Agarose 3% Polyacrylamidgels auch einer nativen Elektrophorese unterzogen. Von der Tatsache, dass zur Zeit der Ethidiumbromidfärbung des 120NA(+) eine Lumineszenz beobachtet wurde, wurde bestätigt, dass die Nucleinsäure in dem 120NA(+)enthalten war.
Das 120NA(+) wurde des Weiteren Western Blotting und Coomassie-Brilliantblaufärbung unterzogen, wobei dasselbe Gel verwendet wurde, welches auch in der vorstehend erwähnten Ethidiumbromidfärbung verwendet würde. Das Ergebnis war, dass beim Western Blotting die Reaktivität des 120NA(+) mit einem anti-HCV-Kern-Antikörper an derselben Position beobachtet wurde wie die des Abschnitts, die durch die Ethidiumbromidfärbung zum Lumineszieren gebracht wurde; und bei der Coomassie-Brilliantblaufärbung wurde die Gegenwart des Polypeptids bestätigt.
In scharfem Kontrast dazu wurde hinsichtlich dem 120A der Transfer des 120NA in das Gel bei der nativen Elektrophorese nicht bestätigt, auch nicht, wenn Western Blotting und Coomassie-Brilliantblaufärbung durchgeführt wurden.
Dementsprechend unterscheiden sich die Eigenschaften von 120NA(+) hinsichtlich des offensichtlichen Molekulargewichts, der Dichte, und der elektrischen Ladung davon vollständig von jenen von 120NA, insbesonders auf Grund der Zunahme des offensichtlichen Molekulargewichts des 120NA(+) auf Grund der Bindung der Nucleinsäure zum Polypeptid im 120NA(+), aber es gibt zwischen den beiden keine Unterschiede beim Western Blotting und bei Agglutinationsreaktionen. Auf Grund dieser Tatsachen wird davon ausgegangen, dass die Antigenität in dem 120NA(+) aufrechterhalten wird.
Referenzbeispiel 3
[Expression von Lysin-fusioniertem 120 (120K10)]
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde pW6AHCV-Kern 120 einer solchen Genmanipulation unterzogen, dass fortlaufend 10 Lysin-Reste mit dem C-Terminus von pW6AHCV-Kern 120 fudionien wurden, wobei pW6AHCV-Kern 120K10 hergestellt wurde. Durch die Verwendung dieses pW6AHCV-Kern 120K10 wurde Escherichia coli BL21 (DE3) einer Transformation unterzogen, wobei ein Ampicillin resistenter transformiener Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern K10 erhalten wurde. Im Folgenden wird das Protein, das durch diesen Ampicillin resistenten transformierten Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern K10 exprimien wird, 120K10 genannt.
Der vorstehend transformiene Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern K10 wurde über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 nM IPTG dazu durchgeführt und die Kultivierung wurde zwei Stunden und 30 Minuten lang fongeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde dann zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol, 0,2 M, NaCl, 0,3% OTG zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugien, wobei getrennt eine lösliche 120K10-Fraktion und eine unlösliche 120K10-Fraktion erhalten wurden.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Zucker zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer 30%igen Sucrosekonzentration und eine Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der 50%igen Pufferlösung, zur 30%igen Pufferlösung und zur 20%igen Pufferlösung überschichtet.
Die vorstehend erwähnte lösliche 120K10-Fraktion wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentrifugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen. Das 120K10 wurde weder in der Pufferlösung mit der 50%igen Sucrosekonzentration, noch in der Pufferlösung mit der 30%igen Sucrosekonzentration noch in der Pufferlösung mit der 20%igen Sucrosekonzentration gewonnen, sondern es wurde auf dem obersten Schichtabschnitt in der Röhre gewonnen.
Die vorstehend erwähnte unlösliche 120K10-Fraktion wurde auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 2, unter Verwendung der kationischen SFF-Ionenaustauschsäule (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.) und durch Durchführen der Gelfiltration gereinigt, wobei ein gereinigtes 120K10 in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 20 kDa gewonnen wurde.
Referenzbeispiel 4
[Test von HCV-positivem Kern-Antigenserum]
Die Reaktivität jedes des HCV-positiven Antikörperserums 1 und des HCV- positiven Antikörperserums 2 mit einem herkömmlich erhältlichen HCV-Antikörpertestmittel (Marke „RIBA HCV 3.0 STRIP IMMUNOBLOT ASSAY" hergestellt durch Chiron Co., Ltd.) wurde unter Verwendung von HCV-Antigen c100 (Aminosäuren Nrn. 1569-1931), Kernantigen c33c (Aminosäuren Nrn. 1192-1457), Kernantigen c22 (Aminosäuren Nrn. 2-120) und NS5 (Aminosäuren Nrn. 2054-2995) getestet. Das Ergebnis war, dass sowohl das HCV-positive Antikörperserum 1 und das HCV- positive Antikörperserum 2 Antikörper in der gesamten Antikörperregion einschließlich der Kern-Antigenregion haben.
Tabelle 1 Reaktivitätstests von positiven Seren
Beispiel 5
Jedes der in den Referenzbeispielen 1, 2, 3 und in Beispiel 3 erhaltenen HCV-Antigenen wurde mit einer Konzentration von 10 mg/ml in einer Pufferlösung (0,15M PBS, pH-Wert 7,1) auf der Oberfläche von Gelatineteilchen (hergestellt durch Fujirebio Co., Ltd_:) fixiert.
Durch die Verwendung von HCV-positivem Serum 1 und HCV-positivem Serum 2 wurde bestätigt, dass Antikörper in der gesamten Antigenregion einschließlich der Antigen-Kernregion in Referenzbeispiel 4 vorhanden waren und eines monoclonalen Antikörpers #2-7, der dadurch erhalten wurde, dass HCV-Kernantigen c22 einer Immunisierung untezogen wurde, wurde die Immunreaktivität jedes der vorstehend erwähnten HCV-Antigenen, die auf der Oberfläche von Gelatineteilchen fixiert waren, untersucht.
25 μl jedes HCV-Antigen fixierten Gelatineteilchens und 25 μl eines der vorstehend erwähnten HCV-positiven Antikörperserums 1 oder des HCV- positiven Antikörperserums 2 oder 25 μl des monoclonalen Antikörpers #2-7 ließ man in einer Microtiterplatte (hergestellt durch Fujirebio Co., Ltd.) 2 Stunden reagieren und Agglutinationsbilder?? davon wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in TABELLE 2 gezeigt. In TABELLE 2 wird die Reaktivität mit einer Verdünnungsrate von 2ⁿ gezeigt, und wenn ein positives Agglutinationsbild sogar dann beobachtet wurde, wenn n im Verdünnungsverhältnis 4 oder mehr war, wurde die Immunreaktivität als „positiv" beurteilt.
Der monoclonale Antikörper #2-7, erhalten durch Immunisierung mit HCV-Kernantigen c22, reagierte mit jedem HCV-Kernantigen, aber das HCV-positive Antikörperserum 1 und das HCV-positive Antikörperserum 2 reagierte in den vorstehend erwähnten Reaktionen nur mit den an 120NA(+)-fixierten Gelatineteilchen.
TABELLE 2 Immunreaktivität von HCV-Kernantigenen
Beispiel 6
[Neu-Arrangement von 120NA(+) aus 120NA]
Durch die Verwendung der transformierten Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern-120NA, hergestellt in Beispiel 1, wurde HCV-Kern-120NA von einer unlöslichen Fraktion davon auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 2 gereinigt. Das Molekulargewicht der gereinigten HCV-Kern-120NA lag bei etwa 22kDa und das OD 260/280 nm-Verhältnis davon war etwa 0,7.
Zu der HCV-Kern-120NA (im Folgenden bezeichnet als 120NA) wurde eine zyklische Plasmid-DNA (4,7 Kbp),abgeleitet von pW6A, 6M Harnstoff und 20% Sucrose zugesetzt, und 120NA wurde gegen eine Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 20% Sucrose) dialysiert, wobei 120NA erneut zu 120NA(+) arrangiert wurde:
Die 120NA(+), die durch die vorstehend erwähnte Dialyse und Neu-Anangement erhalten wurde, wurde unter Verwendung von Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), wobei die 120NA(+) in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von 700 bis 1000 kD gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer 50%igen Sucrosekonzentration wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise hergestellt, dass die Konzentration der Sucrose 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung von dem untersten zum obersten Abschnitt der Röhre von der Pufferlösung mit der 50%igen Sucrosekonzentration zur Pufferlösung mit der 20%igen Sucrosekonzentration überschichtet.
Das vorstehend gewonnene 120NA8+) wurde in der Ultrazentrifuge oben auf die überschichteten Pufferlösungen überschichtet und wurde dann 12 Stunden lang bei 10°C einer Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g, unter Verwendung der Beckman Ultraschallzentrifuge unterzogen. Das neu-arrangierte 120NA8+) wurde in einem Abschnitt der Pufferlösung gewonnen, welcher eine Sucrosekonzentration von etwa 40% bis 50% enthielt.
Das OD 260/280-Verhältnis der 120NA vor dem Neu-Arrangement war etwa 0,7, und wenn die 120NA zu dem 120NA8+) neu-arrangiert war, wurde das OD 260/280-Verhältnis davon von etwa 0,7 auf 1,7 verändert.
Des Weiteren besitzen das vorstehend erwähnte neu-arrangierte 120NA(+) und das lösliche 120NA(+), hergestellt in Beispiel 3, nach der Gelfiltration davon beinahe dasselbe Molekulargewicht davon und haben nach der Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation davon auch beinahe dasselbe spezifische Gewicht davon. Demnach wird in Betracht gezogen, dass diese Tatsachen anzeigen, dass das vorstehend erwähnte Neu-Arrangement vom 120NA zum 120NA(+) erfolgreich durchgeführt wurde.
Beispiel 7
[Konstruktion von transformiertem Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern-
120NA120 zur Expression von mit 120-fusioniertem 120NA (120NA120)] Ein DNA-Fragment zur Codierung eine HCV-Kern-Polypeptids, gezeigt mit Sequenz ID.Nr. 3 in der angehänten Sequenztabelle, wurde unter Verwendung eines Plasmids CKSC1150 als Matrizenmolekül mit einem DNA-Fragment, umfassend eine HCV-Kernregion, welche eingeführt wurde, durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease NheI und einer Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten.
Ein DNA-Fragment von 370 Bp, welches eine HCV-Kernregion umfasste, wurde durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine NheI-EcoRI-Stelle des in 1 gezeigten Expressionsplasmids pW6A inseriert, wobei ein Plasmid-pW6AHCV-Kern 120 (NheI/EcoRI) hergestellt wurde.
Ein DNA-Fragment zur Codierung des HCV-Kern-Polypeptids, gezeigt mit Sequenz ID. Nr. 3 in der angehängten Sequenztabelle, wurde unter Verwendung eines Plasmids CKSC1150 als Matrizenmolekül mit einem DNA-Fragment, umfassend eine HCV-Kernregion, welche eingeführt wurde, durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease EcoRI und einer Restriktionsendonuclease BamHI gespalten.
Ein DNA-Fragment von 370 Bp, welches eine HCV-Kernregion umfasste, wurde durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-BamHI-Stelle des Plasmid-pW6AHCV-Kerns 120 (NheI/EcoRI) inseriert, wobei ein Plasmid-pW6AHCV-Kern 120-120 hergestellt wurde.
Ein DNA-Fragment zur Codierung eines HBc-Nucleinsäure-bindenden Motivs mit Sequenz ID. Nr. 1 in der angehängten Sequenztabelle, wurde unter Verwendung eines Plasmids pHBV-11 als Matrizenmolekül, durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten.
Ein DNA-Fragment von 110 Bp, welches das Nucleinsäure-bindende Motiv umfasste wurde durch 2% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-Stelle des vorstehend erwähnten Plasmid-pW6AHCV-Kerns 120-120 inseriert.
Durch die Verwendung dieses Plasmids wurde Escherichia coli BL21 (DE3) einer Transformation unterzogen, so dass ein Ampicillin-resistentes transformiertes Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA120 zur Expression von 120-fusioniertem 120NA (im Folgenden als 120NA120 bezeichnet) erhalten wurde.
Beispiel 8
[Reinigung von unlöslichem 120NA120]
Auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 3 wurde das in Beispiel 7 hergestellte transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA120 über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde dann zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol, 0,2 M NaCl, 0,3% OTG zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei ein exprimiertes 120NA120 als lösliche Fraktion sowie eine unlösliche Fraktion erhalten wurde. Die unslösliche 120NA120-Fraktion wurde durch eine Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 11,0) löslich gemacht und wurde dann einer Zentrifugation unterzogen, wobei eine Überstandsfraktion erhalten wurde.
Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde unter Verwendung einer kationischen SFF-Ionenaustauschsäule (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff-Glycin-NaOH, pH-Wert 11,0) äquilibriert war, einer Ionenaustausch-Reinigung mit Natriumchlorid-Elution unterzogen. 120NA120 wurde in einer Natriumchlorid-Elutionsfraktion von etwa 0,5 M gewonnen.
Die mit SFF eluierte Fraktion wurde dann unter Verwendung von Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff-0,5M NaOH, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,6) äquilibriert war, gereinigt. So wurde ein gereinigtes 120NA120 in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kDa erhalten.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des 120NA120 sind geweils mit Sequenz ID. Nr. 11 und Sequenz ID. Nr. 12 in der angehängten Sequenztabelle gezeigt.
Beispiel 9
[Reinigung von löslichem Nucleinsäure-gebundenem 120NA120(+)]
Auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 3 wurde das in Beispiel 7 hergestellte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6AHCV-Kern 120NA120 über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden, Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol, 0,2 M NaCl, 0,3% OTG) zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei ein lösliches Nucleinsäure-gebundenes 120NA120 (im Folgenden als „120NA120(+)") gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer 30%igen Sucrosekonzentration und eine Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentnfugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der 50%igen Pufferlösung, zur 30%igen Pufferlösung und zur 20%igen Pufferlösung überschichtet.
Die 120NA120(+) enthaltende lösliche Fraktion wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentnfugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer ersten Sucrosedichtegradienten-Ultrazentnfugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen.
Die 120NA120(+) wurde in einem Abschnitt mit einer Sucrosekonzentration von etwa 30 bis 40% gewonnen.
Die 120NA120(+) enthaltende Fraktion, die durch die erste Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation gewonnen wurde, wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co. Ltd.) gereinigt; die mit einer Pufferlösung (0,3 M NaCl, 0,3% OTG, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 10,0) äquilibriert war, wobei 120NA120(+) mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer Sucrosekonzentration von 20% hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentnfugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der Pufferlösung mit einer 50%igen Sucrosekonzentration, zur Pufferlösung mit der 20%igen Sucrosekonzentration überschichtet.
Das vorstehend erwähnte 120NA120(+) mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentnfugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer zweiten Sucrosedichtegradienten- Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen, wobei das 120NA120(+) konzentriert und gereinigt wurde.
Beispiel 10
[Neu-Anangement von 120NA120 zu 120NA120(+)]
Das OD 260/280 nm-Verhältnis des 120NA120, welches in Beispiel, 9 gereinigt wurde, lag bei etwa 0,7.
Zu dem gereinigten 120NA120 wurde eine gereinigte DNA (etwa 1,3-0,7 kBp) (hergestellt durch Sigma Co., Ltd.) zugesetzt, welche aus Kälberthymus gewonnen wurde und einer ausreichenden Spaltung durch eine Restriktionsendonuclease Hae3 unterzogen wurde. Des Weiteren wurden dazu 6 M Harnstoff, 20% Sucrose und 1,0 M NaCl zugesetzt.
Dieses Gemisch wurde bei 4°C gegen einen Puffer (50 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl) dialysiert, wobei das 120NA120 zu einem löslichen 120NA120(+) neu arrangiert wurde.
Das lösliche 120NA120(+) wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co. Ltd.) gereinigt, wobei ein gereinigtes 120NA120(+) in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde. Das OD 260/280 nm-Verhältnis des so gewonnenen neu-arrangierten 120NA120(+) lag bei etwa 1,8.
Beispiel 11
[Konstruktion von transformiertem Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6A47C2NA zur Expression von Nucleinsäure-bindendem TP47 (TP47C2NA)]
Ein DNA-Fragment, welches ein Antigen von 47 kDa codierte und welches von TP (Treponema pallidum) abgeleitet war, gezeigt mit Sequenz ID.Nr. 13 in der angehängten Sequenztabelle, wurde unter Verwendung eines Plasmids pW6A47C2 als Matrizenmolekül mit einem DNA-Fragment, umfassend ein Antigen von 47 kDa, welches eingeführt wurde,, durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease EcoRI und einer Restriktionsendonuclease BamHI gespalten.
Ein DNA-Fragment, welches ein TP-Antigen von 47 kDa umfasste, wurde durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-BamHI-Stelle des in 1 gezeigten Expressionsplasmids pW6A inseriert, wobei ein Plasmid-pW6A47C2 (EcoRI/BamHI) hergestellt wurde.
Ein DNA-Fragment zur Codierung eines HBc-Nucleinsäure-bindenden Motivs mit Sequenz ID: Nr. 1 in der angehängten Sequenztabelle; wurde unter Verwendung eines Plasmids pHBV-11 als Matrizenmolekül, durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease HamHI und einer Restriktionsendonuclease HindIII gespalten.
Ein DNA-Fragment von 110 Bp, welches ein HBc-Nucleinsäure-bindendes Motiv enthielt, wurde dann durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine BamHI-HindII-Stelle des vorstehenden Plasmids pW6A47C2 (EcoRI/BamHI) inseriert.
Durch die Verwendung dieses Plasmids wurde Escherichia coli BL21(DE3) einer Transformation unterzogen, so dass ein Ampicillin resistentes transformiertes Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6A47C2NA zur Exprimierung eines Nucleinsäure-bindenden TP47 (im Folgenden als TP47C2NA bezeichnet) erhalten wurde.
Beispiel 12
[Reinigung von unlöslichem TP47C2NA]
Auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 2 wurde das in Beispiel 11 hergestellte transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6ATP47C2NA über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde dann zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherischia toll wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei ein exprimiertes TP47C2NA als lösliche Fraktion sowie eine unlösliche Fraktion erhalten wurden. Die unslösliche TP47C2NA-Fraktion wurde durch eine Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) löslich gemacht und wurde dann einer Zentrifugation unterzogen, wobei eine Überstandsfraktion erhalten wurde.
Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde unter Verwendung einer kationischen SFF-Ionenaustauschsäule (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff, Natriumacetat, pH-Wert 6,0) äquilibriert war, einer Ionenaustausch-Reinigung mit Natriumchlorid-Elution unterzogen. TP47C2NA wude in einer Natriumchlorid-Elutionsfraktion von etwa 0,5M gewonnen.
Die mit SFF eluierte Fraktion wurde dann unter Verwendung von Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff-0,5M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,6) äquilibriert war, gereinigt: So wurde ein gereinigtes TP47C2NA in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 100 kDa erhalten.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des TP47C2NA sind jeweils mit Sequenz ID. Nr. 15 und Sequenz ID. Nr. 16 in der angehängten Sequenztabelle gezeigt.
Beispiel 13
[Reinigung von löslichem Nucleinsäure-gebundenem TP47C2NA (+)]
Auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 3 wurde das in Beispiel 11 hergestellte Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6A TP47C2NA über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann mit dem Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fortgeführt.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0; 20% Ethanol, 0,3 % OTG) zugesetzt und das Gemisch wurde eisgekühlt und Aufbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei ein lösliches Nucleinsäure-gebundenes TP47C2NA (im Folgenden als „TP47C2NA(+)") gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug. Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer 30%igen Sucrosekonzentration und eine Pufferlösung mit einer 20%igen Sucrosekonzentration hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der 50%igen Pufferlösung, zur 30%igen Pufferlösung und zur 20%igen Pufferlösung überschichtet.
Die TP47C2NA(+) enthaltende lösliche Fraktion wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentrifugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer ersten Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen.
Die TP47C2NA(+) wurde in einem Abschnitt mit einer Sucrosekonzentration von etwa 30 bis 40% gewonnen.
Die TP47C2NA(+) enthaltende Fraktion, die durch die erste Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation gewonnen wurde, wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co. Ltd.) gereinigt, die mit einer Pufferlösung (0,3 M NaCl, 0,3% OTG, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 10,0) äquilibriert war, wobei TP47C2NA(+) in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde.
Eine Pufferlösung mit einer Konzentration von 50% Sucrose wurde durch Zusetzen von Sucrose zu einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) auf eine solche Weise durchgeführt, dass die Sucrose-Konzentration in der Pufferlösung 50% betrug.
Auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt wurde eine Pufferlösung mit einer Sucrosekonzentration von 20% hergestellt.
Diese Pufferlösungen wurden in einer Ultrazentrifugenröhre in Richtung vom untersten bis zum obersten Abschnitt der Röhre von der Pufferlösung mit der 50%igen Sucrosekonzentration, zur Pufferlösung mit der 20%igen Sucrosekonzentration überschichtet.
Das vorstehend erwähnte TP47C2NA(+) mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa wurde oben auf die überschichteten Pufferlösungen in der Ultrazentrifugenröhre überschichtet und wurde dann bei 10°C 12 Stunden einer zweiten Sucrosedichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Zentrifugalkraft von 100.000 g unter Verwendung einer Beckmann-Ultraschall-Zentrifuge unterzogen, wobei das TP47C2NA(+) konzentriert und gereinigt wurde.
Beispiel 14
[Neu-Arrangement von TP47C2NA zu TP47C2NA(+)]
Das OD 260/280 nm-Verhältnis des TP47C2NA, welches in Beispiel 12 gereinigt wurde, lag bei etwa 0,6.
Zu dem gereinigten TP47C2NA wurde eine gereinigte DNA (etwa 1,3-0,7 kBp) (hergestellt durch Sigma Co., Ltd.) zugesetzt, welche aus Kälberthymus gewonnen wurde und einer ausreichenden Spaltung durch eine Restriktionsendonuclease Hae3 unterzogen wurde. Des Weiteren wurden dazu 6 M Harnstoff, 20% Sucrose und 1,0 M NaCl zugesetzt.
Dieses Gemisch wurde bei 4°C gegen einen Puffer (50 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl) dialysiert, wobei das TP47C2NA zu einem löslichen TP47C2NA(+) neu arrangiert wurde. Das lösliche TP47C2NA(+) wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co. Ltd.) gereinigt, wobei ein gereinigtes TP47C2NA(+) in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde. Das OD 260/280 nm-Verhältnis des so gewonnenen neu-arrangierten TP47C2NA(+) lag bei etwa 1,8.
Beispiel 15
[Konstruktion von transformiertem Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6ACV-Kern120pro1 zur Expression von Maus-Protamin 1 fusioniertem 120 (120pro1)]
Ein DNA-Fragment zur Codierung eines Maus-Protamins 1 mit Sequenz ID.Nr. 17 in der angehängten Sequenztabelle, wurde isoliert und unter Verwendung einer Maus-Protamin 1-cDNA als Matrizenmolekül durch das PCR-Verfahren amplifiziert, und wurde dann mit einer Restriktionsendonuclease EcoRI und einer Restriktionsendonuclease BamHI gespalten.
Ein DNA-Fragment, welches eine Maus Protamin 1-Region von 160 Bp umfasste; wurde durch 1% Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Dieses DNA-Fragment wurde in eine EcoRI-BamHI-Stelle des in 1 hergestellten Plasmids pW6AHCV-Kern120 (NheI/EcoRI) inseriert.
Durch die Verwendung dieses Plasmids wurde Escherichia coli BL21(DE3) einer Transformation unterzogen, so dass ein Ampicillin resistentes transformiertes Escherichia coli BL21 (DE3)/pW6ACV-Kern-120pro1 zur Exprimierung eines Maus Protamin 1-fusionierten 120 (im Folgenden, als 120pro 1 bezeichnet) erhalten wurde.
Beispiel 16
[Reinigung von 120pro1]
Auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 2 wurde das in Beispiel 15 hergestellte transformierte Escherichia coli BL21 (DE3)/ pW6ACV-Kern-120pro1 über Nacht in einem LB-Kulturmedium bei 37°C gezüchtet. Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums wurde durch Präkultur auf etwa 0,7 bei Messung mit Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm eingestellt. Eine Expressionsinduktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM IPTG dazu durchgeführt und danach wurde die Kultivierung zwei Stunden und 30 Minuten lang fongefühn.
Das Escherichia coli-Kulturmedium wurde dann zentrifugiert, wobei die Escherichia coli aufgefangen wurden. Zu den so aufgefangenen Escherichia coli wurden 150 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20% Ethanol) zugesetzt und das Gemisch. wurde eisgekühlt und Ausbrechen durch Ultraschall unterzogen.
Dieses Gemisch wurde dann zentrifugiert, wobei ein exprimiertes 120pro als lösliche Fraktion sowie eine unlösliche Fraktion erhalten wurde. Die unslösliche 120pro1-Fraktion wurde durch eine Pufferlösung (6M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH, pH-Wert 11,0) löslich gemacht und wurde dann einer Zentrifugation unterzogen, wobei eine Überstandsfraktion erhalten wurde.
Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde unter Verwendung einer kationischen SFF-Ionenaustauschsäule (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff-Glycin-NaOH, pH-Wert 11,0) äquilibrien war,, einer Ionenaustausch-Reinigung mit Natriumchlorid-Elution unterzogen. 120pro1 wurde in einer Natriumchlorid-Elutionsfraktion von etwa 0,5M gewonnen.
Die mit SFF eluierte Fraktion wurde dann unter Verwendung von Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.), welche mit einer Pufferlösung (6M Harnstoff-0,5M NaOH, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,6) äquilibrien war, gereinigt. So wurde ein gereinigtes 120pro1 in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 22 kDa erhalten.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des 120pro1 sind jeweils mit Sequenz ID. Nr. 19 und Sequenz ID. Nr. 20 in der angehängten Sequenztabelle gezeigt.
Beispiel 17
[Neu-Anangement von 120pro1 zu 120pro1(+)]
Das OD 260/280 nm-Verhältnis des 120pro1, welches in Beispiel 16 gereinigt wurde, lag bei etwa 0,7.
Zu dem gereinigten 120pro1 wurde eine gereinigte DNA (etwa 1,3-0,7 kBp) (hergestellt durch Sigma-Co., Ltd.) zugesetzt, welche aus Kälberthymus gewonnen wurde und einer ausreichenden Spaltung durch eine Restriktionsendonuclease Hae3 unterzogen wurde. Des Weiteren wurden dazu 6 M Harnstoff, 20% Sucrose und 1,0 M NaCl zugesetzt.
Dieses Gemisch wurde bei 4°C gegen einen Puffer (50 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl) dialysiert, wobei das 120pro1 zu einem löslichen 120pro1(+) neu arrangiert wurde.
Das lösliche 120pro1(+) wurde durch Superdex 200 (Gelfiltrationssäule) (hergestellt durch Pharmacia Co., Ltd.) gereinigt, wobei ein gereinigtes 120pro1(+) in einem Abschnitt mit einem Molekulargewicht von etwa 700 bis 1000 kDa gewonnen wurde. Das OD 260/280 nm-Verhältnis des so gewonnenen neu-arrangierten 120pro1(+) lag bei etwa 1,7.
Somit stellt die vorliegende Erfindung das Nucleinsäure-gebundene Polypeptid mit verschiedenen Eigenschaften des veränderten Polypeptids zur Verfügung, ohne dessen Antigenität zu verändern. Die Verwendung des Nucleinsäure-gebundenen Polypeptids der vorliegenden Erfindung macht es möglich, Immunassays durchzuführen, welche herkömmlicherweise unmöglich waren.
Des Weiteren wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zu Gewinnung eines genetischen Produkts in einer löslichen Fraktion zur Verfügung gestellt, welche herkömmlicherweise in einer unlöslichen Fraktion gewonnen wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immuntest zum Testen eines Antigens oder eines Antikörpers gegen das Antigen, wobei das Antigen ein Polypeptid umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein an Nucleinsäure gebundenes Polypeptid umfasst, wobei das an Nucleinsäure gebundene Polypeptid ein Fusionspolypeptid ist, umfassend ein Polypeptid mit einem Nucleinsäure bindenden Motiv, das die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz einschließt, woran die Nucleinsäure gebunden ist.
Immuntest nach Anspruch 1, wobei der Immuntest ein Agglutinationstest ist, und das an Nucleinsäure gebundene Polypeptid auf der Oberfläche von Partikeln fixiert ist.