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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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QUERVERWEIS AUF VERWANDTE
ANMELDUNG
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Diese
Anmeldung ist eine Continuation-In-Part-Anmeldung von U.S. Serial
Number 08/099,991, eingereicht am 30. Juli 1993.
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von biotinylierten
Proteinen in vitro und in rekombinanten Wirtszellen. Die Erfindung
betrifft daher das Gebiet der Molekularbiologie, aber angesichts
der diversen Anwendungen für
rekombinante Proteine betrifft die Erfindung auch die Gebiete der
Chemie, Pharmakologie, Biotechnologie und medizinischen Diagnostik.
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2. Beschreibung des technischen
Hintergrunds
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Die
Fähigkeit,
DNA chemisch zu synthetisieren, ermöglichte die Konstruktion von
Peptiden und Proteinen, die ansonsten nicht in der Natur aufgefunden
werden und in einer Vielzahl von Verfahren nützlich sind, welche ansonsten
sehr schwierig oder gar nicht ausgeführt werden könnten. Ein
veranschaulichendes Beispiel dieser Technologie betrifft die als
Rezeptoren bekannte Klasse von Molekülen. Rezeptorproteine vermitteln wichtige
biologische Funktionen durch Wechselwirkungen mit Liganden. Viele
Jahre lang haben Forscher versucht, Liganden zu isolieren und zu
identifizieren, welche mit Rezeptoren wechselwirken, auf eine Art
und Weise, welche dazu beitragen kann, Humankrankheiten (und andere
Krankheiten) zu lindern. Das Aufkommen der Molekularbiologie hat
die Art und Weise, auf welche diese Forscher Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
untersuchen, revolutioniert. Beispielsweise ermöglichten molekularbiologische Standardtechniken
die Klonierung und Expression auf hohem Niveau von vielen Rezeptoren
in rekombinanten Wirtszellen.
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Die
Patentliteratur, beispielsweise, ist voll von Veröffentlichungen,
welche die rekombinante Expression von Rezeptorproteinen beschreiben.
Siehe beispielsweise die PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer
91/18982 und die US Patente Nr. 5,081,228 und 4,968,607, welche
rekombinante, für
den IL-1 Rezeptor kodierende DNA-Moleküle beschreiben; die US Patente
Nr. 4,816,565, 4,578,335 und 4,845,198, welche rekombinante DNA
und Proteine beschreiben, die den IL-2 Rezeptor betreffen; die PCT-Anmeldung
mit der Veröffentlichungsnummer
91/08214, welche Nukleinsäuren
beschreibt, die mit dem Gen für
den EGF-Rezeptor in Zusammenhang stehen, die PCT-Anmeldung mit der
Veröffentlichungsnummer
91/16431 und US Patent Nr. 4,897,264, welche den Interferon-gamma-Rezeptor
und verwandte Proteine und Nukleinsäuren beschreiben; die europäische (EP)
Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer
0 377 489, welche das C5a-Rezeptorprotein
beschreibt; die PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 90/08822,
welche den EPO-Rezeptor und Nukleinsäuren in Zusammenhang damit
beschreibt; und die PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 92/01715,
welche MHC-Rezeptoren beschreibt.
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Mehrere
der vorstehenden Veröffentlichungen
beschreiben nicht nur, wie man ein besonderes Rezeptorprotein (oder
das für
das Protein kodierende Gen) isolieren kann, sondern beschreiben
auch Varianten des Rezeptors, die auf eine Art und Weise nützlich sein
können,
auf die es der natürliche
oder native Rezeptor nicht ist. Beispielsweise beschreibt die PCT-Anmeldung
mit der Veröffentlichungsnummer
91/16431 lösliche
Versionen des gamma-Interferon-Rezeptors, während die PCT-Anmeldung mit der
Veröffentlichungsnummer 92/01715
beschreibt, wie lösliche
dimere Zelloberflächenproteine
hergestellt werden können.
Diese letztere Technologie beinhaltet die Expression des Rezeptors
mit einem Signal für
eine Lipidverbindung, sobald das Lipid an den Rezeptor gebunden
ist, wird der Rezeptor in der Zellmembran verankert, wo die dimere
Form des Rezeptors zusammengesetzt wird. Siehe auch U.S. Serial
No. 947,339, eingereicht am 18. September 1992, welche beschreibt,
wie HPAP-enthaltende Rezeptoren von der Zelloberfläche abgespalten
werden können, und
wie die verbleibenden Verankerungssequenzen als Erkennungssequenzen
für Antikörper dienen
können, welch
für eine
Immobilisierung des Rezeptors verwendet werden.
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Die
hinsichtlich der Klonierung und Expression von Rezeptoren erreichten
Fortschritte wurden begleitet von Technologiefortschritten, betreffend
Verfahren zum Screening eines Rezeptors auf Verbindungen, welche
mit dem Rezeptor in einer gewünschten
Art und Weise wechselwirken könnten.
Ein derartiger Fortschritt betrifft die Erzeugung großer Anzahlen
von Verbindungen oder potenziellen Liganden in einer Reihe von zufälligen (random)
und halbzufälligen "Peptiddiversität"-Erzeugungssystemen. Diese Systeme umfassen
das "Peptide-auf-Plasmiden"-System, beschrieben in der U.S. Patentanmeldung
Serial No. 963,321, eingereicht am 15. Oktober 1992, die eine Continuation-In-Part-Anmeldung
der U.S. Patentanmeldung Serial No. 778,233, eingereicht am 16.
Oktober 1991, ist; das "Peptide-auf-Phage"-System, beschrieben
in der U.S. Patentanmeldung Serial No. 718,577, eingereicht am 20.
Juni 1991, die eine Continuation-In-Part-Anmeldung von U.S. Serial
No. 541,108, eingereicht am 20. Juni 1990, ist; Cwirla et al., August
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382; Barrett et al.,
1992, Analyt. Biochem. 204: 357-364; und den PCT-Anmeldungen mit
den Veröffentlichungsnummern
91/18980 und 91/19818; die auf Phagen basierten Antikörperdisplaysysteme,
beschrieben in der U.S. Patentanmeldung Serial No. 517,659, eingereicht
am 11. Mai 1990, und in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer
91/17271; die auf Beads (Kügelchen)
basierten Systeme zur Erzeugung und zum Screening von Nukleinsäureliganden,
beschrieben in den PCT-Anmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern 91/19813,
92/05258 und 92/14843, das auf Beads basierte System, beschrieben
in der U.S. Patentanmeldung Serial No. 946,239, eingereicht am 16.
September 1992, die eine Continuation-In-Part-Anmeldung von Serial
No. 762,522, eingereicht am 18. September 1991, ist; und das "immobilisierte Polymersynthese
in sehr großem
Maßstab"-System, beschrieben
in US Patent Nr. 5,143,854; den PCT-Anmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern
90/15070 und 92/10092; der U.S. Patentanmeldung Serial No. 624,120,
eingereicht am 6. Dezember 1990; Fodor et al., 15. Februar 1991,
Science 251: 767-773; Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem.
26: 271-180; und der U.S. Patentanmeldung Serial No.805,727, eingereicht
am 6. Dezember 1991.
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Andere
Entwicklungen stehen in Zusammenhang damit, wie der Rezeptor in
derartigen Screeningverfahren verwendet wird. Ein wichtiger Fortschritt
betrifft die Entwicklung von Reagenzien und Verfahren zur Immobilisierung
eines oder mehrerer Rezeptoren in einer räumlich definierten Anordnung,
wie in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 91/07087
beschrieben. In einer Ausführungsform
dieses Verfahrens wird ein Rezeptor an Avidin gebunden und danach
auf einer Oberfläche
immobilisiert, die Biotingruppen hat. Die Oberfläche wird jedoch zunächst mit
in Käfigen
eingeschlossenen Biotingruppen hergestellt, die Avidin nicht binden
bis die Käfiggruppe
entfernt wird, in dieser Ausführungsform
mittels Bestrahlung. Sobald der avidinylierte Rezeptor an die Biotingruppen
an der Oberfläche
gebunden ist, kann die Oberfläche
zum Screening auf Verbindungen gegen den Rezeptor verwendet werden.
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Biotin
ist ein Coenzym, welches kovalent an verschiedene Enzyme gebunden
ist, die am Transfer von aktivierten Carboxylgruppen beteiligt sind.
Wie das vorstehende Beispiel veranschaulicht, kann eine Biotinmarkierung
von Molekülen,
die normalerweise nicht biotinyliert sind, zur Markierung, dem Nachweis,
der Reinigung und/oder Immobilisierung derartiger Moleküle verwendet
werden. Diese Verfahren beruhen auch auf den Proteinen Avidin und
Streptavidin, die sehr stark und spezifisch an Biotin binden, und
auf anderen Biotin-bindenden Molekülen, von denen manche mit einer
unterschiedlichen Affinität
wie Avidin an Biotin binden. Typischerweise werden die in derartigen
Verfahren verwendeten biotinylierten Moleküle mittels eines in vitro Biotinylierungsverfahrens
hergestellt. Ein in vivo Verfahren zur Biotinylierung von Proteinen,
die mittels rekombinanter DNA-Techniken
hergestellt werden, würde
die Erfordernis beseitigen, diese Proteine nach der Reinigung chemisch
zu biotinylieren, und würde
das Reinigungsverfahren in hohem Maße vereinfachen, aufgrund der
Möglichkeit
das Biotin als einen Affinitätsmarker
zu verwenden (siehe Green, 1975, Adv. Protein Res. 29: 85-133).
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In
vivo wird Biotin an Proteine hinzugefügt durch die Bildung einer
Amidbindung zwischen der Biotin-Carboxylgruppe und der epsilon-Aminogruppe
von spezifischen Lysinresten in einer Reaktion, die ATP benötigt. In
normalen E. coli ist nur ein Protein biotinyliert, die Biotincarboxylcarrierprotein
(BCCP) -Untereinheit von Acetyl-CoA-Carboxylase.
Diese Reaktion wird katalysiert durch die Biotin-Proteinligase (BirA),
das Produkt des birA-Gens (siehe Cronan, 1989, Cell 58: 427-429,
durch Bezugnahme hierin aufgenommen).
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Murtif
et al. beschreiben die rekombinante Expression einer 1,3 S Biotinenthaltenden
Untereinheit mit einer Länge
von 123 Aminosäuren,
wie sie in der Natur vorkommt. Sie offenbaren auch die nachfolgende
Biotinylierung der Untereinheit unter Verwendung von Biotinholoenzymsynthetase
aus E. coli und stellen fest, dass Biotinholoenzymsynthetasen für die Hinzufügung von
Biotin zu allen Biotinenzymen verantwortlich sind. Sie erwähnen auch,
dass in bekannten Fällen
das Biocytin(Bct) innerhalb der Aminosäuresequenz Ala-Met-Bct-Met
lokalisiert ist, und in einem Abstand von 35 Aminosäuren vom
COOH-Terminus des Polypeptids. Sie stellen jedoch klar, dass es
unbekannt ist ob diese Merkmale der Primärsequenz an der Erkennung durch
die Synthetase beteiligt sind, oder ob sie einen allgemeinen Wirkungsmechanismus
von Biotinenzymen widerspiegeln (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
82, Seiten 5617-5621, September 1985, Vicki L. Murtif, Chris R.
Bahler and David Samols).
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Andere
haben ein Mittel vorgeschlagen, durch das eine Markierung mit Biotin
in vivo bewirkt werden kann, durch die Hinzufügung einer Domäne von mindestens
75 Aminosäuren
zu rekombinanten Proteinen (siehe Cronan, 1990, J. Biol. Chem. 265:
10327-10333). Siehe auch Cress et al., 1993, Promega Notes 42: 2-7.
Die Hinzufügung
dieser 75 Aminosäure-Domäne zu mehreren
unterschiedlichen Proteinen führt
zu der Biotinylierung der Fusionsproteine durch BirA an einem spezifischen
Lysin der hinzugefügten
Domäne.
Die Hinzufügung
kleiner Fragmente der Domäne
mit 75 Resten führt
nicht zu einer Biotinylierung, was nahe legt, dass eine ziemlich
komplexe Erkennungsdomäne
erforderlich ist. Veränderungen
in der Sequenz von biotinylierten Proteinen bis hin zu 33 Resten
weg von dem modifizierten Lysin stoppen die Biotinylierung (siehe
Murtif and Samols, 1987, J. Biol. Chem. 262: 11813-11816). Veränderungen
in der Nähe
des Lysins beeinträchtigen ebenfalls
die Biotinylierung (siehe Shenoy et al., FASEB J. 2: 2505-2511, und Shenoy
et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 18407-18412). Unglücklicherweise
kann jedoch die Hinzufügung
einer derart großen
Proteindomäne
die biochemischen Eigenschaften eines biotinylierten Proteins negativ
beeinflussen. Kleinere Domänen, welche
eine Biotinylierung spezifizieren, wären sehr günstig, da derartige Domänen eine
minimale Strukturwirkung auf eine große Vielzahl von möglichen
Fusionspartnern hätten.
Die Domäne
mit 75 Resten führt
auch nicht zu einer vollständigen
Biotinylierung der Domäne,
und verbesserte Domänen
könnten
effizienter sein. Die vorliegende Erfindung stellt derartige verbesserte
Biotinylierungsdomänen
bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt nützliche
Verbindungen, Reagenzien, Verfahren und Kits für die Biotinylierung von Proteinen
bereit. Gemäß einem
ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Biotinylieren
eines Proteins bereit, wobei das Verfahren umfasst: (a) Konstruieren
eines rekombinanten DNA-Expressionsvektors,
der für
ein Fusionsprotein kodiert, welches das Protein und ein Biotinylierungspeptid mit
einer Länge
von weniger als 50 Aminosäuren
umfasst, (b) Transformieren einer rekombinanten Wirtszelle, welche
ein Biotinylierungsenzym synthetisieren kann, mit dem Vektor, und
(c) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen Biotin
vorhanden ist, und so, dass das Fusionsprotein und das Biotinylierungsenzym exprimiert
werden, was zu der Biotinylierung des Fusionsproteins führt. Wenn
die Wirtszelle nicht natürlicherweise
Biotin produziert, kann man Biotin zu dem Medium zugeben. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle E. coli, und ist das Biotinylierungsenzym BirA.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann somit ein Biotinylierungspeptid der vorliegenden Erfindung
zu einem beliebigen in E. coli expimierten Protein hinzugefügt werden,
mit einer ausreichenden Verweilzeit im Cytoplasma um zu ermöglichen,
dass BirA wirkt. Wenn hohe Expressionsniveaus an biotinyliertem
Protein gewünscht
sind, kann man das BirA-Protein auf einfache Weise gleichzeitig überexprimieren
(siehe Buoncristiani et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 1013-1016).
In ähnlicher
Weise können
Wirtszellen, denen eine endogene Biotin-Proteinligase (als ein Biotinylierungsenzym
bezeichnet) fehlt, mit einem Vektor transformiert werden, der für Expression
des birA-Gens kodiert, um sie mit der Fähigkeit zu versehen, rekombinante
Proteine zu biotinylieren, bzw. ihre Fähigkeit zu verstärken. In
Fällen,
bei denen die endogene Biotin-Proteinligase von anderen, von E.
coli verschiedenen Zelltypen aufgrund der Konservierung der Erkennungsdomänen die neuen
Biotinylierungssequenzen erkennen, ist keine derartige rekombinante
Expression eines Biotinylierungsenzyms erforderlich. Man kann die
Biotinylierungsreaktion auch in vitro durchführen, unter Verwendung eines Biotinylierungsenzyms
wie etwa gereinigter BirA (siehe Buoncristiani, a.a.O.), Biotin,
und Biotinylierungssequenzpeptid-markierten Proteinen, wobei die
Proteine entweder in rekombinanten Wirtszellen oder durch in vitro
Translation produziert werden können.
Man kann auch Biotinanaloga verwenden, wie etwa 2-Iminobiotin, das
eine niedrigere Affinität
für Avidin
hat als Biotin, und so in manchen Anwendungen anstelle von Biotin
in dem Verfahren bevorzugt sein kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien bereit, welche in dem
erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
sind, umfassend Peptide, Proteine, Oligonukleotide und rekombinante
DNA-Expressionsvektoren. Somit stellt die vorliegende Erfindung
biotinylierte Peptide mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren, typischerweise
einer Länge
von 10 bis 20 oder mehr Aminosäuren
bereit, und Oligonukleotide, die kodierende Sequenzen für derartige
Peptide umfassen. Zusätzlich
stellt die Erfindung rekombinante biotinylierte Proteine bereit,
und Expressionsvektoren, welche für diese Proteine kodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist
das erfindungsgemäße Biotinylierungspeptid
13 Aminosäuren
lang, und ist definiert durch LX1X2IX3X4X5X6KX7X8X9X10 (SEQ.
ID NO:1), worin X1 eine beliebige Aminosäure ist,
X2 eine von großen hydrophoben Aminosäuren (wie
etwa L, V, I, W, F, Y) verschiedene Aminosäure ist, X3 gleich
F oder L ist, X4 gleich E oder D ist, X5 gleich A, G, S oder T ist, X6 gleich
Q oder M ist, X7 gleich I, M oder V ist,
X8 gleich E, L, V, Y oder I ist, X9 gleich W, Y, V, F, L oder I ist, und X10 bevorzugt gleich R oder N ist, aber eine
beliebige Aminosäure sein
kann, außer
eine saure Aminosäure
wie etwa D oder E.
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Zusammenfassend
stellt diese Erfindung ein einfaches und effizientes Mittel bereit
um rekombinante Proteine zu biotinylieren, wobei sie eien rasche
Reinigung, Immobilisierung, Markierung und einen raschen Nachweis
dieser Proteine bereitstellt. Das Verfahren ist nützlich für eine Reihe
von Zwecken und ist in breitem Umfang kommerziell nützlich für Anwendungen
in Forschung und Diagnose.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORM
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I. Definitionen
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Zum
Verständnis
der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe definiert.
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Aminosäurereste
in Peptiden werden abgekürzt
wie folgt: Phenylalanin ist Phe oder F, Leucin ist Leu oder L, Isoleucin
ist Ile oder I, Methionin ist Met oder M, Valin ist Val oder V,
Serin ist Ser oder S, Prolin ist Pro oder P, Threonin ist Thr oder
T, Alanin ist Ala oder A, Tyrosin ist Tyr oder Y, Histidin ist His
oder H, Glutamin ist Gln oder Q, Asparagin ist Asn oder N, Lysin
ist Lys oder K, Asparaginsäure
ist Asp oder D, Glutaminsäure
ist Glu oder E, Cystein ist Cys oder C, Tryptophan ist Trp oder
W, Arginin ist Arg oder R, und Glycin ist Gly oder G.
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Der
Begriff "Antikörper" bezeichnet Antikörper und
Antikörperfragmente,
welche die Fähigkeit
beibehalten, an das Epitop zu binden, an welches der intakte Antikörper bindet,
unabhängig
davon, ob der Antikörper
oder das Fragment durch Hybridomzelllinien, durch Immunisierung
um eine polyklonale Antikörperreaktion hervorzurufen,
oder durch rekombinante Wirtszellen produziert wird, die mit einem
rekombinanten DNA-Expressionsvektor transformiert worden sind, welcher
für den
Antikörper
oder das Antikörperfragment
kodiert.
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Der
Begriff "Antigen" ist definiert als
ein Molekül,
welches die Bildung eines Antikörpers
induziert oder spezifisch an die Antigenbindungsstelle eines Antikörpers binden
kann.
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Der
Begriff "wirksame
Menge" bezeichnet
eine Menge, welche ausreichend ist um ein gewünschtes Ergebnis zu induzieren.
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Der
Begriff "Epitop" bezeichnet denjenigen
Teil eines Antigens, der mit einem Antikörper wechselwirkt.
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Der
Begriff "Wirtszelle" bezeichnet eine
eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder Gruppe von Zellen,
die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert werden kann
oder worden ist. Für
Zwecke der vorliegenden Erfindung sind prokaryontische Wirtszellen
bevorzugt.
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Der
Begriff "Ligand" bezeichnet ein Molekül, das von
einem besonderen Rezeptor erkannt wird. Das von dem Rezeptor gebundene
oder mit ihm reagierende Mittel wird als "Ligand" bezeichnet, ein Begriff, der von der
Definition primär
auf sein Rezeptorgegenstück
bedeutsam ist. Der Begriff "Ligand" impliziert keine
besondere Molekülgröße oder
ein anderes Struktur- oder Zusammensetzungsmerkmal, sondern dass
die fragliche Substanz an den Rezeptor binden oder anderweitig mit
ihm wechselwirken kann. Ein Ligand kann entweder als der natürliche Ligand
dienen, an den der Rezeptor bindet, oder als ein funktionelles Analogon,
welches als ein Agonist oder Antagonist wirken kann. Beispiele von
Liganden, welche mit der vorliegenden Erfindung untersucht werden
können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Peptide und Proteine wie etwa Agonisten und Antagonisten von
Zellmembranrezeptoren, Toxine und Gifte, Epitope wie etwa virale
Epitope, Antikörper, Hormone,
Enzymsubstrate und Proteine.
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Der
Begriff "Linker" oder "Abstandhalter" bezeichnet ein Molekül oder eine
Gruppe von Molekülen
(wie etwa ein Monomer oder Polymer), das zwei Moleküle miteinander
verbindet und oftmals dazu dient, die zwei Moleküle räumlich in eine bevorzugte Konfiguration
zu bringen, z.B. so dass ein Ligand mit minimaler sterischer Hinderung
an einen Rezeptor binden kann.
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Der
Begriff "Monomer" bezeichnet jedes
Element des Satzes von Molekülen,
die miteinander verknüpft werden
können
um ein Oligomer oder Polymer zu bilden. Der Satz an Monomeren, welcher
in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst, ist aber nicht
darauf beschränkt,
für das
Beispiel der Peptidsynthese den Satz von L-Aminosäuren, D-Aminosäuren oder
synthetischen Aminosäuren.
Wie hierin verwendet bezeichnet "Monomer" jedes Element eines
Basissatzes für
die Synthese eines Oligomers. Beispielsweise bilden Dimere von L-Aminosäuren einen
Basissatz von 400 "Monomeren" für die Synthese
von Polypeptiden. In der Synthese eines Polymers können bei
nacheinander folgenden Schritten unterschiedliche Basissätze von
Monomeren verwendet werden. Der Begriff "Monomer" bezeichnet auch eine chemische Untereinheit,
die mit einer anderen Untereinheit kombiniert werden kann um eine
Verbindung zu bilden, welche größer ist
als jede Untereinheit alleine.
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Der
Begriff "Oligomer" oder "Polymer" bezeichnet die Verbindungen,
welche durch chemisches oder enzymatisches Aneinanderfügen von
zwei oder mehr Monomeren gebildet werden. Derartige Monomere umfassen
beispielsweise sowohl lineare als auch zyklische und verzweigte
Polymere von Nukleinsäuren
und Peptiden, wobei die Peptide sowohl alpha-, beta- als auch omega-Aminosäuren aufweisen
können.
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Der
Begriff "Oligonukleotid" bezeichnet ein einzelsträngiges DNA-
oder RNA-Molekül, oder
Analoga von beiden. Geeignete Oligonukleotide können hergestellt werden durch
das Phosphoramidit-Verfahren, beschrieben von Beaucage et al., 1981,
Tetr. Lett. 22: 1859-1862, oder durch das Triester-Verfahren, gemäß Matteucci
et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, oder durch andere Verfahren,
wie etwa unter Verwendung kommerziell erhältlicher, automatisierter Oligonukleotidsynthesizer.
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Der
Begriff "operativ
verknüpft" bezeichnet die Platzierung
einer Nukleinsäure
in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäure. Beispielsweise
ist ein Promotor mit einer kodierenden Sequenz "operativ verknüpft", wenn der Promotor die Transkription
der kodierenden Sequenz hervorruft. Im Allgemeinen bedeutet "operativ verknüpft", dass die miteinander
zu verknüpfenden
DNA-Sequenzen aneinander grenzen, und wo es notwendig ist zwei für Peptid
oder Protein kodierende Regionen miteinander zu verbinden, miteinander im
Leseraster.
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Der
Begriff "Peptid" bezeichnet ein Oligomer,
bei dem die Monomere Aminosäuren
(üblicherweise
alpha-Aminosäuren)
sind, durch Amidbindungen miteinander verbunden. Alternativ kann
ein Peptid als ein "Polypeptid" bezeichnet werden.
Peptide haben eine Länge
von mehr als zwei Aminosäuremonomeren,
aber gewöhnlich
eine Länge
von mehr als 5 bis 10 Aminosäuremonomeren,
und können
sogar eine Länge
von mehr als 20 Aminosäuren
aufweisen, obwohl Peptide mit einer Länge von mehr als 20 Aminosäuren eher
als "Polypeptide" bezeichnet werden.
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Der
Begriff "Protein" ist in der Technik
gut bekannt und bezeichnet üblicherweise
ein sehr großes
Polypeptid oder einen Satz von assoziierten Polypeptiden, der irgendeine
biologische Funktion hat. Für
Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe "Peptid", "Polypeptid" und "Protein" im Großen und
Ganzen untereinander austauschbar, da Bibliotheken aller drei Typen
unter Verwendung von im Wesentlichen ähnlicher Methodik hergestellt
werden können.
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Der
Begriff "Randompeptid" bezeichnet ein Oligomer,
das aus zwei oder mehr Aminosäuremonomeren zusammengesetzt
ist und durch ein Mittel konstruiert wurde, mit dem man die spezifische
Sequenz irgendeines besonderen Oligomers nicht vollständig vorab
auswählt.
Der Begriff "Randompeptidbibliothek" bezeichnet nicht
nur einen Satz von rekombinanten DNA-Vektoren, der für einen
Satz von Randompeptiden kodiert, sondern auch den Satz der von diesen
Vektoren kodierten Randompeptiden sowie die Fusionsproteine, welche diese
Randompeptide enthalten. Der Begriff "Proteinbibliothek" hat eine ähnliche Bedeutung wie "Randompeptidbibliothek", aber die verschiedenen
Elemente der Bibliothek unterscheiden sich hinsichtlich der Aminosäuresequenz
des interessierenden Proteins oder der dafür kodierenden Sequenz, so dass
die Bibliothek als eine Sammlung verwandter, aber unterschiedlicher
Versionen des gleichen Proteins dient.
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Der
Begriff "Rezeptor" bezeichnet ein Molekül, das eine
Affinität
für einen
gegebenen Liganden hat. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische
Moleküle
sein. Rezeptoren können
verwendet werden in ihrem unveränderten
natürlichen
oder isolierten Zustand, in einer rekombinanten oder modifizierten Form,
oder als Aggregate mit anderen Spezies. Beispiele von Rezeptoren,
die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Antikörper,
Zellmembranrezeptoren, monoklonale Antikörper, Antiseren, die mit spezifischen
antigenen Determinanten (wie etwa auf Viren, Zellen oder anderem
Material) reaktiv sind, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Lektine, Polysaccharide,
Zellen, Zellmembranen, Viren und Organellen. Rezeptoren werden in
der Technik manchmal als "Antiliganden" bezeichnet. Wie
der Begriff "Rezeptor" hierin verwendet
wird, ist keine abweichende Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn
ein Rezeptor und Ligand durch molekulare Erkennung miteinander kombiniert
haben, wobei ein Komplex gebildet wird.
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Die
Begriffe "rekombinanter
DNA-Klonierungsvektor" und "rekombinanter DNA-Expressionsvektor" bezeichnen ein DNA-
oder RNA-Molekül,
das für
eine nützliche
Funktion kodiert und entweder verwendet werden kann um eine Wirtszelle
zu transformieren oder in ein zellfreies Translationssystem eingebracht
werden kann, um ein Protein zu produzieren, das von dem Vektor kodiert
ist. Für
Zwecke der vorliegenden Erfindung dient ein Klonierungsvektor typischerweise
primär
als ein Intermediat bei der Konstruktion eines Expressionsvektors;
der letztere Vektor wird zur Transformation oder Transfektion einer
Wirtszelle verwendet (oder wird in ein zellfreies Transkriptions-
und Translationssystem eingebracht), so dass die transformierte
Wirtszelle (oder das zellfreie Transkriptions- und Translationssystem)
ein Protein oder ein anderes Produkt produziert, das von dem Vektor
kodiert ist. Derartige Vektoren sind typischerweise "Plasmide", welche für Zwecke
der vorliegenden Erfindung Vektoren sind, die in einer Wirtszelle
extrachromosomal gehalten werden können, aber auch Vektoren sein
können,
die in das Genom einer Wirtszelle integrieren. Der Fachmann mag "Klonierungsvektoren", wie hierin definiert,
als "Vektoren" bezeichnen, und "Expressionsvektoren", wie hierin definiert,
als "Plasmide".
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Der
Begriff "fester
Träger" bezeichnet ein Material
mit einer steifen oder halbsteifen Oberfläche. Derartige Materialien
nehmen bevorzugt die Gestalt von kleinen Beads, Pellets, Scheiben,
Chips oder Wafern an, obwohl andere Formen verwendet werden können. In
manchen Ausführungsformen
wird mindestens eine Oberfläche
des festen Trägers
im Wesentlichen eben sein.
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Der
Begriff "Oberfläche" bezeichnet jede
im Allgemeinen zweidimensionale Struktur auf einem festen Substrat
und kann Stufen, Erhebungen, Knicke, Terrassen und dergleichen aufweisen,
und bleibt dabei immer noch eine Oberfläche.
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Der
Begriff "synthetisch" bezeichnet eine
Produktion durch in vitro chemische oder enzymatische Synthese.
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II. Verfahren und Reagenzien
der Erfindung
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Das
System zur Erzeugung und zum Screening von Randompeptiden, welches
als das "Peptide-auf-Plasmiden"-System bekannt ist,
wurde verwendet um die kleinen effizienten Peptidbiotinylierungssequenzen
der vorliegenden Erfindung zu entdecken. Die Bibliothek war derart
konstruiert, so dass sie Peptide der Form:
X10 IVXAMKMX10 (SEC ID NO: 2) exprimiert, wobei X einen
Randomrest darstellt, die anderen Buchstaben Ein-Buchstaben-Abkürzungen
von Aminosäuren
sind, und die Unterstreichung eine geringe Degeneriertheit im Kodon
für die
spezifizierten Aminosäuren
anzeigt, wie nachstehend beschrieben. Diese Sequenz wurde auf Basis
der bekannten Sequenzen von mehreren biotinylierten Proteinen (siehe
Samols et al., J. Biol. Chem. 263: 6461-6464, durch Bezugnahme hierin
aufgenommen), wie in Tabelle 1 gezeigt, ausgewählt. Wie durch die Punkte angedeutet,
sind die nachstehenden Sequenzen nur Teile der großen Sequenzen,
von denen vor der vorliegenden Erfindung angenommen wurde, dass
sie für
eine Biotinylierung erforderlich sind.
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Der
Lysinrest, der biotinyliert wird, ist in der Sequenz "AMKM" (SEC ID NO: 13)
enthalten, welche den meisten Proteinen in Tabelle 1 gemeinsam ist,
welche sind: die 1.3S Untereinheit der Transcarboxylase aus Propionibacterium
shermanü (TC
1.3S), die Oxaloacetatdecarboxylase aus Klebsiella (OADC), Acetyl-CoA-Carboxylase aus Huhn
(cACC), die Acetyl-CoA-Carboxylase aus E. coli (EcBCCP), die Pyruvatcarboxylase
aus Hefe (yPC), die Pyruvatcarboxylase aus Mensch (hPC), die Pyruvatcarboxylase
aus Schaf (sPC), die Pyruvatcarboxylase aus Ratte (aPC), die Propionyl-CoA-Carboxylase
aus Mensch (hPCC), und das Biotinylpeptid aus Tomate (tbp). Die
Sequenzen dieser Proteine haben mehrere konservierte Reste und/oder
Regionen mit ähnlichen
Eigenschaften (z.B. verzweigtkettige Aminosäuren oder amidierte Säuren) gemeinsam.
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Trotz
dieser Lehre, dass eine große
Region für
eine Biotinylierung erforderlich ist, wurde die Peptide-auf-Plasmiden-Bibliothek,
welche verwendet wurde um die Biotinylierungspeptide der vorliegenden
Erfindung zu entdecken, derart konstruiert, so dass sie Randompeptide
mit einer Länge
von nur 27 Aminosäuren darstellt,
enthaltend nur einen festgesetzten Kodon (für K) und 5 konservierte Kodons
(für die
unterstrichenen vorstehenden Aminosäuren).
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Konservierte
Kodons wurden hergestellt, indem der Oligonukleotidsynthesizer derart
programmiert wurde, dass er für
jedes Nukleotid eines konservierten Kodons 91 des korrekten Nukleotids
und 3% von jedem der drei anderen Nukleotide hinzufügte. Durch
dieses Verfahren wurde eine sehr große Bibliothek von Randompeptiden
hergestellt und zur Transformation von E. coli Wirtszellen verwendet.
Die Peptide, welche von jedem Klon dieser Bibliotheken kodiert wurden,
wurden mit dem Carboxyterminus des sequenzspezifischen DNA-Bindeproteins
lac-Repressor (Lacl) fusioniert. Jeder Partikel der Bibliothek besteht
aus einem Lacl-Peptid-Fusionsprotein,
gebunden an die lac-Operatorstellen (lacO) auf dem gleichen Plasmid,
das für
es kodierte. Expression dieser Bibliotheken im Cytoplasma gestattet
es den Zellen für
Kompartmentalisierung zu sorgen, so dass jedes Fusionsprotein an
das entsprechende Plasmid gebunden ist.
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Da
die Partikel der Peptide-auf-Plasmiden-Bibliothek im Cytoplasma
vorliegen, ist das BirA-Enzym in E. coli Wirtszellen für die Randompeptidregion
zugänglich.
Alle Randompeptide, die produktiv mit BirA wechselwirken (vermutlich
ein kleiner Teil der Gesamtheit), werden biotinyliert. Nach Zelllyse
wurden die biotinylierten Bibliothekspartikel durch Bindung an immobilisiertes
Streptavidin isoliert. Der Hintergrund an Peptidsequenzen, die ohne
eine Biotinylierung an Streptavidin binden (siehe Devlin et al.,
1990, Science 249: 404-406, durch Bezugnahme hierin aufgenommen)
wurde eliminiert durch Zugabe von freiem Biotin-Kompetitor nachdem
die Bibliothekspartikel an das immobilisierte Streptavidin binden
lassen wurden. Die Affinität
dieser Hintergrundpeptide für
Streptavidin ist niedriger als die Affinität für Biotin, und auf diese Weise
werden Hintergrundpeptide von dem freien Biotin verdrängt. Die
gewünschten
biotinylierten Peptide wurden durch Biotin nicht verdrängt, da
die Peptide zuerst binden lassen wurden, eine Affinität ähnlich der
von Biotin aufweisen, und multivalent mit dem immobilisierten Streptavidin
wechselwirken.
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Somit
umfasste das Protokoll das Lysieren der transformierten Zellen,
das Entfernen von zellulärem Material
durch Zentrifugation, und das Sammeln des Rohlysats, aus dem Plasmide,
welche für
Biotinylierungspeptide kodieren, durch Affinitätsanreicherung an Streptavidin
isoliert wurden, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei mit den Plasmiden
begonnen wurde, die am Ende des vorhergehenden Zyklus gesammelt
worden waren, mit den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen.
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Diese
Ergebnisse zeigten an, dass die Bibliothek Elemente enthielt, die
Biotinylierungspeptide darstellten und daher angereichert und identifiziert
werden konnten. Mehrere der Isolate aus der vierten Streptavidinbindungsrunde
wurden getestet um zu bestimmen, ob die dargestellten Peptide eine
Biotinylierung lenkten. Die Sequenzen der Randompeptide in den positiven
Klonen sind in Tabelle 3 gezeigt, in Reihenfolge der Stärke ihrer
Reaktion in einem ELISA geordnet. Die Sequenzen zeigen nicht nur
Reste mit einer Tendenz, der durch die bekannten biotinylierten
Proteine definierten Konsensussequenz näher zu kommen, sondern auch Reste,
die sich von der bekannten Konsensussequenz unterscheiden. Die Peptide
haben keine Sequenzmotive (wie etwa HPQ), welche mit einer schwachen
Bindung an Streptavidin assoziiert wurden (Devlin et al., a.a.O.).
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Die
Sequenzen der biotinylierten Klone aus der ersten Bibliothek, gezeigt
in Tabelle 3, sind an dem vermutlich modifizierten K-Rest ausgerichtet.
Mehrere Klone waren in dem erhaltenen Satz von 20 Sequenzen mehr
als einmal vorhanden, so dass nur 15 unabhängige Sequenzen gezeigt sind.
An manchen Positionen in den Sequenzen ist ein klarer Konsensus
nicht offensichtlich. An anderen Resten stellen sich jedoch klare Trends
heraus. Beispielsweise war Position –4 (relativ zu dem K-Rest)
entworfen worden um für
V zu kodieren, in Übereinstimmung
mit diesem Rest des Biotincarboxyl-Carrierproteins aus E. coli (ein
Kodon GTT, synthetisiert mit jeder Base zu 97% wie angegeben, jeweils
3% von den anderen Basen). Trotz dieser sehr geringfügigen Mutagenese
hatte jede Sequenz eine Mutation, welche die kodierte Aminosäure zu entweder
L oder F änderte.
L ist der Rest, der an dieser Position in den meisten der natürlich biotinylierten
Sequenzen aus von E. coli verschiedenen Organismen gefunden wird,
aber F war in den untersuchten Sequenzen nicht vorhanden. Der Rest –3, in der
Bibliothek durch einen Randomkodon (NNK) kodiert, war in 9 der 15
Sequenzen negativ geladen (E oder D). Wiederum ist diese Konsensussequenz ähnlich zu
der, welche in natürlich
vorkommenden Sequenzen aufgefunden wird (E oder S). Die Position
+3 definiert jedoch einen neuen Konsensus, der in den natürlichen
Sequenzen nicht aufgefunden wird. 15 der 15 Peptide hatten einen
hydrophoben Rest (W, Y, V, F oder L) an +3, anstelle des normalerweise
aufgefundenen T aus den Enzymsequenzen.
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Die
vielleicht bemerkenswerteste Sequenz aus der ersten Bibliothek war
SMWETLNAQKTVLL (SEQ ID NO: 24), welche aus der Deletion einer einzigen
Base während
der Synthese oder Klonierung des Bibliotheksoligonukleotids entstand.
Diese Sequenz stimmt nur an drei Resten mit der Enzymkonsensussequenz überein,
entspricht aber dem Muster der anderen Bibliotheksklone an den Positionen
+2 und +3. Diese Ergebnisse zeigen, dass die evolutionären Zwänge auf
die Enzymsequenz aus einer Kombination von Faktoren resultieren,
von denen die Fähigkeit,
biotinyliert zu werden, nur einer ist.
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Um
die Konsensussequenz für
eine Biotinylierung klarer zu definieren, wurden drei zusätzliche
Bibliotheken gescreent (siehe die Tabellen 4, 5 und 6, nachstehend).
Zwei basierten auf dem Muster der aus der ersten Bibliothek isolierten
Klone und die andere bestand einfach aus einem K-Rest, der an beiden
Seiten von 10 Randomresten flankiert war. Nach vier Runden Panning
wurde ein Restriktionsfragment, das die Randomregion enthielt, aus
dem Pool von angereicherten Klonen in einen MBP (Maltose-bindendes
Protein) Expressionsvektor (siehe U.S. Patentanmeldung Serial No.
876,288, eingereicht am 29. April 1992) subkloniert. Diese Populationen
von Plasmiden wurden danach gescreent unter Verwendung einer Kolonie-Lifttechnik,
umfassend einen Nachweis mit einem Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat.
Die Biotinylierung von mehreren dieser Klone wurde mittels Markierung
mit 3H-Biotin bestätigt.
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Die
zweite Bibliothek wurde mit einer für ein Randompeptid kodierenden
Sequenz konstruiert, definiert durch XXXIFEAMKMXXXXX (SEQ ID NO: 29), wobei
X ein NNK-Kodon ist, unterstrichene einzelne Reste Kodons für die gezeigte
Aminosäure
sind, aber mit einem 70/10/10/10 Mutagenesegemisch (70% der Base,
welche an einer bestimmten Position im Kodon für die Aminosäure kodiert
und jeweils 10% der drei anderen Basen), und der Kodon für K festgelegt
ist. Die aus dieser Bibliothek isolierten und sequenzierten biotinylierten Sequenzen
sind in Tabelle 4 gezeigt.
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Die
dritte Bibliothek wurde mit einer für ein Randompeptid kodierenden
Sequenz konstruiert, definiert durch XXXXXXIFEAMKMXXXXX
(SEQ ID NO: 49), wobei X ein NNK-Kodon ist, unterstrichene einzelne
Reste Kodons für
die gezeigte Aminosäure
sind, aber mit einem 70/10/10/10 Mutagenesegemisch (70% der Base, welche
an einer bestimmten Position im Kodon für die Aminosäure kodiert
und jeweils 10% der drei anderen Basen), und der Kodon für K festgelegt
ist. Die aus dieser Bibliothek isolierten und sequenzierten biotinylierten Sequenzen
sind in Tabelle 5 gezeigt.
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Die
vierte Bibliothek wurde mit einer für ein Randompeptid kodierenden
Sequenz konstruiert, definiert durch XXXXXXXXXXKXXXXXXXXXX (SEQ
ID NO: 69), wobei X ein NNK-Kodon ist und der Kodon für K festgelegt
ist. Die aus dieser Bibliothek isolierten und sequenzierten biotinylierten
Sequenzen sind in Tabelle 6 gezeigt.
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Die
Biotinylierungspeptide aus diesen Bibliotheken dienen dazu, die
neue Konsensussequenz für
die Biotinylierungspeptide der vorliegenden Erfindung weiter zu
definieren. Mehrere Merkmale sind bemerkenswert. Eine starke Präferenz für L an Position –8 ist klar,
insbesondere in der zweiten Bibliothek, die eine kürzere Randomsequenzregion
links des modifizierten K hatte als alle anderen Bibliotheken. Die
anderen Sätze
an Sequenzen haben diese Präferenz
an –8
gemeinsam, aber zu einem geringeren Ausmaß als die zweite Bibliothek.
Das L an dieser Position kann wichtiger sein, wenn weniger Aminosäuren vorhanden
sind, welche die Biotinylierungsdomäne an das Carrierprotein verbinden.
In den natürlich
vorkommenden Sequenzen gibt es an dieser Position keinen Konsensus.
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An
anderen Positionen werden viele Reste aufgefunden und es ist nur
ein allgemeiner Trend offensichtlich. Beispielsweise werden an Position –6 viele
Reste aufgefunden, aber keine großen hydrophoben Reste (L, V,
I, W, F oder Y), eine Tendenz, die sich von derjenigen der natürlich vorkommenden
Enzyme unterscheidet (L ist am häufigsten).
Die Position +4 enthält
ein breites Spektrum an Resten, aber mit einer klaren Präferenz für basische
Aminosäuren
(18 von 56 sind R, H oder K) gegenüber sauren Resten (kein D oder
E).
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An
Position –2
ist eine Präferenz
für eine
kleine Größe klar,
da nur A, G, S oder T aufgefunden werden. Position –1 zeigte
eine Tendenz zu M in allen Bibliotheken außer der vierten Bibliothek.
In den Bibliotheken mit dieser Tendenz wird M am häufigsten
aufgefunden, aber Q ist häufig
vorhanden. Bemerkenswerterweise erfordert die Mutation von einem
M-Kodon (ATG) zu einem Q-Kodon (CAA/G) zwei Basenaustausche. In
den Klonen, die diese Tendenz an dieser Position nicht zeigten,
haben 4 von 4 Klonen Q, was darauf hindeutet, dass Q in der Tat
der bevorzugte Rest sein könnte.
Die hydrophoben Reste M, I und V werden in nahezu allen Sequenzen
an Position +1 aufgefunden. Position +2 ist oftmals der natürliche Konsensus
E, tendiert jedoch auch dazu, die hydrophoben Reste L, V, Y und
I zu enthalten.
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Um
die allgemeine Nützlichkeit
der Biotinylierungssequenzen zu untersuchen und ihre möglichen
Anwendungen zu erweitern wurde eine Bibliothek derart hergestellt,
so dass die Biotinylierungspeptide in einem Fusionsprotein am N-Terminus
von cytoplasmatischem MBP exprimiert werden würden. Diese Bibliothek hatte eine
ausgesprochene Tendenz zugunsten von Sequenzen, welche mit der Konsensussequenz
der Erfindung passen, mit einem Randompeptid, definiert durch M
AXX
LXX
I(F/L)(E/D)AQK
(M/I)EW(H/R)XXXGGS (SEQ ID NO:
73), worin die unterstrichenen Reste festgelegt sind, die unterstrichenen
Reste 97/1/1/1 mutagenisierte Kodons für die gezeigten Reste sind,
und X ein NNK-Kodon ist. Die Sequenzen von positiven Klonen aus
dieser Bibliothek, durch Lifting von Kolonien identifiziert, sind
in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle
7
- Q*
- = supE supprimierter
Amber-Kodon
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Die
Biotinylierung von mehreren dieser Klone wurde mittels Markierung
mit 3H-Biotin bestätigt. Die Fähigkeit, funktionelle Biotinylierungssequenzen
frei an jedem Ende eines Proteins zu exprimieren deutet darauf hin,
dass es nicht erforderlich ist, dass ein bestimmtes Ende des Peptids
frei ist um mit der Biotinholoenzymsynthetase wechselzuwirken.
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Wie
vorstehend diskutiert, können
die kurzen Biotinylierungspeptide der Erfindung in vivo oder in
vitro biotinyliert werden, und sie können für ein breites Spektrum von
Anwendungen verwendet werden, umfassend Reinigung, Immobilisierung, Markierung
und Nachweis von Proteinen. Ein paar veranschaulichende Beispiele umfassen:
(1) die Markierung von Rezeptoren mit Biotin an einer definierten
Stelle, so dass der markierte Rezeptor beispielsweise an Streptavidin
gebunden werden könnte,
um einen tetravalenten Rezeptor zu erzeugen um die Sensitivität von Bindeassays
zu erhöhen,
wie etwa die in US Patent Nr. 5,143,854 und U.S. Patentanmeldung
Serial No. 946,239, eingereicht am 16. September 1992, beschriebenen;
(2) die Markierung von Fusionsproteinen, die Peptid-Leads aus irgendeinem
Screeningprogramm enthalten, so dass die markierten Fusionsproteine
verwendet werden können
um auf eine Bindung des Peptids an Rezeptoren in einem monovalenten
Format (durch Sondieren mit markiertem Streptavidin, nachdem die
Bindung stattgefunden hat) oder in einem multivalenten Format (durch
zuvoriges Binden der Fusionen an markiertes Streptavidin und nachfolgendes
Testen der Bindung an Rezeptoren) zu testen, oder so, dass Peptide
auf Streptavidinbeschichteten Beads oder in Vertiefungen von Mikrotiterplatten
immobilisiert werden, zum Sondieren mit Rezeptoren, wie etwa Protease-Enzymen,
in Lösung;
(3) die Markierung von Peptiden oder Proteinen direkt durch Anziehen
von Zellen in der Gegenwart von Tritium-markiertem Biotin -- mit
einem Biotinauxotroph, die Peptide könnten bei einer bekannten spezifischen
Aktivität
markiert werden um quantitative Messungen von Bindeaktivität zu ermöglichen;
und (4) die Entwicklung von Technologie zur Durchführung von
enzymatischen Reaktionen auf Oberflächen, durch Behandeln von Bibliotheken
von varianten immobilisierten Sequenzen mit BirA, Biotin und ATP,
so dass diejenigen Peptide, die Substrate waren, biotinyliert werden
würden
und mit markiertem Streptavidin nachgewiesen werden könnten.
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Diese
Erfindung umfasst auch Kits, welche zur Produktion von Proteinen,
die Biotinylierungspeptide enthalten, nützlich sind. Derartige Kits
umfassen beispielsweise ein rekombinantes Expressionspolynukleotid, welches
verwendet werden kann um die erfindungsgemäßen Peptide fusioniert an eine
kodierende Sequenz nach Wahl zu produzieren, und Anleitungen hinsichtlich
der Verwendung der Polynukleotide. DNA-Expressionspolynukleotide
können
derart ausgelegt sein, so dass sie episornal replizieren oder in
das Chromosom der für
die Expression ausgewählten
Wirtszelle integrieren. Die DNA-Polynukleotide des Kits enthalten
häufig
eine Mehrfachklonierungsstelle, welche mit der für die erfindungsgemäßen Peptide
kodierenden Sequenz verbunden ist, so dass eine beliebige kodierende Sequenz
im korrekten Translationsleseraster für eine Expression insertiert
werden kann. Diese Kits können
verwendet werden um die erfindungsgemäßen Peptide fusioniert an der
Aminoterminus, den Carboxyterminus oder innerhalb der ausgewählten kodierenden
Sequenz zu produzieren. Innerhalb dieser Fusionsproteine können die
erfindungsgemäßen Peptide
durch zusätzliche
Abstandhaltersequenzen von den kodierenden Sequenzen getrennt sein.
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Eine
Expression von kodierenden Sequenzen erfolgt bevorzugt unter Kontrolle
eines induzierbaren Promotors, wovon ein paar Beispiele der lac-
oder tac-Promotor in E. coli, der gal4-Promotor in S. cerevisiae, der
glaA-Promotor in Aspergillus niger oder der Metallothioneinpromotor
aus Maus in vielen Säugerzellen
sind. Alternativ können
für bestimmte
Anwendungen konstitutive Promotoren erwünscht sein, wie etwa der SV40 early
Promotor in Säugerzellen.
Für manche
Anwendungen, wie etwa in vitro Translation in Kaninchen-Retikulozyten,
wird es erforderlich sein, RNA in vitro unter Verwendung einer RNA-Polymerase,
wie etwa der aus dem Bakteriophagen SP6, synthetisieren zu können. In
diesem Fall können
Signale für
die Initiation der Transkription sowohl von SP6-RNA-Polymerase als
auch einer alternativen RNA-Polymerase
operativ mit der gleichen Expressionssequenz verknüpft sein.
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Neben
einem Promotor für
die Initiation der Expressionssequenzen werden die Polynukleotide
des Kits bevorzugt auch Sequenzen für die Termination der Transkription
enthalten, wie etwa den T7-Terminator in E. coli oder den SV40-Terminator in Säugerzellen.
Wenn die Proteine in Säugerzellen
exprimiert werden, ist zusätzlich
ein Polyadenylierungssignal wünschenswert,
wie etwa die SV40-Polyadenylierungssequenz.
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Natürlich können auch
zusätzliche
Sequenzen in den Polynukleotiden dieser Kits eingebaut sein, welche
den produzierten Proteinen zusätzliche
Eigenschaften vermitteln. Beispielsweise kann eine Signalsequenz,
welche verursacht, dass die exprimierten Proteine aus der Zelle
sezerniert werden, in die Polynukleotide eingebaut sein. Sequenzen,
welche dazu dienen, exprimierte Proteine an die Membran zu binden,
wie etwa eine für
eine hydrophobe membranüberspannende
Domäne
kodierende Sequenz oder eine kodierte Sequenz, welche eine Bindung
eines Glycosyl-Phosphatidylinositol-Membranankers an das Protein
signalisiert, können
als ein Bestandteil des Expressionspolynukleotids eingebaut sein.
Die Polynukleotide können
auch für eine
Sequenz kodieren, welche von einer Protease wie etwa Faktor Xa erkannt
wird, benachbart zu der für
die erfindungsgemäßen Biotinylierungspeptide
kodierenden Sequenz. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese und
viele andere Kombinationen zusätzlicher
Sequenzen vorteilhaft sein können.
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Andere
Bestandteile der Kits können
Wirtszellen umfassen, welche geeignet sind um Expression von dem
Polynukleotid zu erhalten, Avidin oder Streptavidin, gekoppelt an
einen festen Träger,
Avidin oder Streptavidin, gekoppelt an einen nachweisbaren Marker
wie etwa das Enzym Meerrettich-Peroxidase, ein Biotinylierungsenzym
wie etwa gereinigte BirA, und Anleitungen für die Analyse und Reinigung
der unter Verwendung dieser Kits exprimierten Proteine. Die Wirtszellen
exprimieren bevorzugt ein Biotinylierungsenzym. Gegebenenfalls können Polynukleotide,
die nach Transformation in Wirtszellen eine Überproduktion der Biotinylierungsenzyme
hervorrufen, in den Kits bereitgestellt sein, oder die in den Kits
bereitgestellten Wirtszellen können
bereits modifiziert sein, so dass sie Biotinylierungsenzyme überproduzieren.
Für manche
Anwendungen kann es jedoch die Abwesenheit von Biotinylierungsenzym
in der Wirtszelle vorteilhaft sein. Beispielsweise kann der Anwender
des Kits bevorzugen, die exprimierten Fusionsproteine in vitro zu
biotinylieren.
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Der
Fachmann erkennt aus der vorstehenden Beschreibung, dass die vorliegende
Erfindung viele Vorteile und mehr Anwendungen bereitstellt als Verfahren
aus dem bekannten Stand der Technik zur Biotinylierung von Proteinen.
Die erfindungsgemäßen Biotinylierungspeptide
sind klein aber spezifisch, ermöglichen
es, ein Protein an einer definierten Stelle zu markieren, an jedem
Ende des zu markierenden Proteins oder innerhalb davon. Die Erfindung
stellt ein verbessertes Immobilisierungsverfahren bereit, welches
es ermöglicht,
die Verwendung von Antikörpern
und die damit verbundenen Probleme zu vermeiden. Die hohe Bindeaffinität der Avidin-Biotin-Wechselwirkung
stellt Vorteile bereit für
die Markierung, Lokalisierung, den Nachweis, die Immobilisierung,
und auch für
Reinigungsverfahren. Beispielsweise könnte man die Biotinylierungspeptide
der Erfindung zur Reinigung von BirA oder anderen Biotinylierungsenzymen
verwenden.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
als das Substrat in einem Assay zum Screening auf die Gegenwart
von neuen Biotinylierungsenzymen dienen. Die Biotinylierungsreaktion
kann in vivo stattfinden (wo nur wenige andere Proteine natürlicherweise
biotinyliert werden) oder in vitro, mit leicht zugänglichen
Materialien. Wie aus der vorstehenden Offenbarung erkannt werden
kann, hat die vorliegende Erfindung ein breites Spektrum an Anwendungen.
Demgemäß werden
die nachfolgenden Beispiele lediglich zur Veranschaulichung angegeben,
und nicht als eine Einschränkung.
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Beispiel 1
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Konstruktion
einer Bibliothek
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Die
Peptide-auf-Plasmiden-Bibliotheken wurden im Vektor pJS142 hergestellt,
einem Derivat von Plasmid pMC5, beschrieben in der U.S. Patentanmeldung
Serial No. 963,321, eingereicht am 15. Oktober 1992. Dieser Vektor
ist derart ausgelegt, so dass die Randomregion einer Bibliothek
mit lacl verbunden ist, durch einen Abstandhalter, welcher für die Sequenz
VVHGEQVGGEASGGG (SEQ ID NO: 90) kodiert. Die erste Bibliothek wurde
hergestellt durch Annealing der phosphorylierten Oligonukleotide
ON-1396 (GAGGTGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKatcgttNNKgctatgAAAat gNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAACTAAGTAAAGC
(SEC ID NO: 91), worin kleine Buchstaben Basen darstellen, die mit
Gemischen von 91% der Base und 3% jeder der anderen Basen synthetisiert wurden,
bezeichnet als eine "91/3/3/3
Mutagenese", N ein äquimolares
Gemisch aller 4 Basen bedeutet und K ein äquimolares Gemisch von G und
T bedeutet), ON-829 (ACCACCTCCGG) (SEC ID NO: 92), und ON-830 (TTACTTAGTTA)
(SEC) ID NO: 93), jeweils in einer Konzentration von 1 μM in 0,1
M NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, indem während 10 min auf 70°C erwärmt wurde
und die Reaktion über
mehrere Stunden auf unter 15°C
abkühlen
gelassen wurde. Die annealten Oligonukleotide (5,2 pMol) wurden
an 10 μg
(2,6 pMol) Sfil-verdauten pJS142 ligiert, in 0,5 ml 20 mM Tris pH
7,4, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM ATP,
50 μg/ml
BSA, 2 mM DTT, enthaltend 800 Kohäsivende-Einheiten an T4 DNA-Ligase
(New England Biolabs), über
Nacht bei 14°C.
Die Ligierungen wurden danach 10 min auf 65°C erwärmt. Die einzelsträngige Lücke wurde
aufgefüllt
durch Zugabe von 26 Einheiten SequenaseTM 2.0
(United States Biochemical) in der Gegenwart von 0,2 mM dNTP. Die DNA
wurde mit Phenol/CHCl3 extrahiert, mit Isopropanol
präzipitiert,
und zur Transformation von ARI 280 (lon-11 sulA1 hsdR17 Δ(ompT-fepC) ΔclpA319::kan Δlacl lacZU118
recA::cat) verwendet, wobei eine Bibliothek von 5 × 108 unabhängigen
Transformanten erhalten wurde, welche amplifiziert und aufbewahrt
wurde, wie in der U.S. Patentanmeldung Serial No. 963,321, eingereicht
am 15 Oktober 1992, und in Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 1865-1869 beschrieben, außer dass die Zellen in 35 mM
HEPES pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 50 mM KCl (HEK Puffer) aufbewahrt wurden.
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Die
zweite (5 × 109 Transformanten), dritte (5 × 109 Transformanten), und vierte (2,2 × 109 Transformanten) Bibliothek wurden konstruiert
wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von ON-1544 (GAGGTGGTNNKNNKNNKatctttgaagctatgAAAatg
NNKNNKNNKNNKNNKTAACTAAGTAAAGC (SEQ ID NO: 94), worin kleine Buchstaben
eine 70/10/10/10 Mutagenese darstellen), ON-1545 (GAGGTGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKatctttgaagctatgAAAatgNNKNNKNNKNNK
NNKTAACTAAGTAAAGC (SEQ ID NO: 95), worin kleine Buchstaben eine
70/10/10/10 Mutagenese darstellen), bzw. ON-828 (GAGGTGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKAAANNKNNKNNKNNK
NNKNNKNNKNNKNNKNNKTAACTAAGTAAAGC) (SEQ ID NO: 96), anstelle von
ON-1396. Die vierte Bibliothek wurde mit 30 μg des Vektors pJS141 hergestellt,
der sich von pJS142 nur dadurch unterscheidet, dass die kodierende
Sequenz von lacl derart verändert
ist, so dass sie für
S, A bzw. S kodiert anstelle der C-Kodons, welche normalerweise
an den Positionen 107, 140 und 182 aufgefunden werden. Die Bibliothek
wurde amplifiziert durch Transformation des Stammes ARI 246 (lon-11
sulA1 hsdR17 Δ(ompT-fepC) ΔclpA319::kan
lacl42::Tn10 lacZU118).
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Die
fünfte
Bibliothek wurde im Vektor pBAD/MBP-N konstruiert, einem Derivat
von pBAD18, siehe U.S. Patenanmeldung Serial No. 965,677, eingereicht
am 22. Oktober 1992, der einen Polylinker und die kodierende Sequenz
für die
Aminosäuren
27-393 von MBP stromabwärts
des Arabinose-induzierbaren araB-Promotors platziert. Diese Bibliothek
wurde hergestellt durch Ligierung von annealten ON-1699 (CTAGCTAACTAATGGAGGATACATAAATGgctNNKNNKctgNNKNVKattttNgaNgctc
arAAAatNgaatggcryNNKNNKNNKGGTGGTAGCC (SEQ ID NO: 97), worin kleine
Buchstaben eine 97/1/1/1 Mutagenese darstellen; V = A, C oder G;
r = g oder a; y = c, t), ON-1700 (TCCTCCATTAGTTAG)(SEQ ID NO: 98),
und ON-1701 (TCGAGGCTACCACC)(SEQ ID NO: 99) an Nhel-Xhol-verdauten
pBAD/MBP-N, wie vorstehend beschrieben. Die Bibliothek wurde zur
Transformation von XL1-Blue (F' proAB
laclq lacZΔM15
Tn10(tetR)//recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 relA1 lac, Stratagene)
verwendet und durch Kolonielifting wie nachstehend beschrieben gescreent.
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Beispiel 2
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Panning
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Etwa
2 ml aufgetaute Zellen in HEK wurden zu 6 ml 25 mM HEPES pH 7,5,
0,07 mM EDTA, 8,3% Glyzerin, 1,25 mg/ml BSA, 0,83 mM DTT und 0,2
mM PMSF zugegeben. Die Zellen wurden 2 bis 4 min auf Eis lysiert
durch die Zugabe von 0,15 ml 10 mg/ml Lysozym (Boehringer Mannheim),
und danach wurden 2 ml 20% Lactose und 0,25 ml 2 M KCl zugegeben.
Der Überstand
aus einer 15-minütigen
27.000 × G
Zentrifugation wurde zugegeben zu 0,1 ml Streptavidin-Agarose-Beads
(Pierce) in 1 ml HEK, 0,2 M Lactose (HEKL), 4,5% BSA, 0,9 mg/ml
Hering-DNA, und 1 Stunde bei 4°C
sanft gemischt. Die Beads wurden zentrifugiert und viermal mit HEKL-Puffer,
1% BSA und 0,1 mg/ml Hering-DNA bei 4°C gewaschen (in späteren Runden
enthielten diese Waschlösungen
manchmal 10 μM
Biotin), und danach 30 min bei 4°C
im gleichen Puffer plus 10 μM
Biotin inkubiert. Die Beads wurden fünfmal mit HEKL-Puffer, 1% BSA,
zweimal mit HEKL-Puffer, und einmal oder zweimal mit HEK-Puffer
gewaschen, bei 4°C.
Die gebundenen Plasmide wurden 30 min bei Raumtemperatur mit 35
mM HEPES pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 200 mM KCl, 1 mM IPTG, 10 μg/ml selbst-annealtem
ON-413 (GAATTCAATTGTGAGCGCTCACAATTGAATTC)(SEQ ID NO: 100) eluiert,
mit Isopropanol präzipitiert,
und danach für
eine Amplifikation zur Elektrotransformation von entweder ARI 280
oder ARI 298 (lon-11 sulA1 hsdR17 Δ(ompT-fepC) ΔclpA319::kan Δlacl lacZU118
recA::cat cytR) verwendet.
-
Beispiel 3
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Subklonierung
in MBP-Vektor
-
Aus
dem Panning gewonnene Plasmide wurden mit BspEl und Scal verdaut,
und ein Fragment, das die für
Peptid kodierende Sequenz enthielt, wurde in mit Agel, Scal verdautes
Plasmid pELM3, ein Derivat von pMALc2, subkloniert, das von New
England Biolabs erhältlich
ist, ausgelegt um kodierende Sequenzen aus pJS142 aufzunehmen. Das
transferierte Fragment kodiert für
GGG-Peptid und ist mit der für
MBP kodierenden Region über
eine für
N10LGIEGRT kodierende Sequenz verbunden.
Das MBP wird aufgrund des Fehlens einer Signalsequenz im Cytoplasma
zurück
gehalten.
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Beispiel 4
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Markierung mit 3H-Biotin
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Zellen
wurden über
Nacht bei 37°C
in Minimalmedium E (Davies, 1980, Advanced Bacterial Genetics (CSH
Press)) mit 0,4% Glyzerin, 0,1% Vitamin-Assay-Casaminosäuren (Difco), 1 μg/ml Thiamin
und 50 μg/ml Ampicillin
angezogen. Die Kulturen wurden im gleichen Medium 1/10 verdünnt, mehrere
Stunden angezogen, und danach zu einem gleichen Volumen Medium,
enthaltend 2 μCi/ml 3H-Biotin (Amersham) und 0,6 mM IPTG (für pELM3-Klone)
oder 0,4% L-Arabinose anstelle von Glyzerin (für pBAD/MBP-N-Klone) zugegeben.
Das Wachstum wurde mehrere weitere Stunden fortgesetzt, und danach
wurden die Zellen geerntet und mit SDS-Proteingelpuffer lysiert. Die Proben
wurden auf einem Acrylamidgel mit einem Gradienten von 4-20% gefahren,
und unter Verwendung von Amplify (Amersham) und Röntgenfilm
fluorographiert.
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Beispiel 5
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Kolonielifts
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Kolonielifts
wurden doppelt ausgeführt,
im Wesentlichen wie beschrieben (Sambrook, 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (CSH Press)) außer dass die induzierenden
Platten 10 μM
Biotin und 0,3 mM IPTG (für
pELM3-Klone) oder 0,2% L-Arabinose (für pBAD/MBP-N-Klone) enthielten.
Das Blockierreagenz war 5% BSA, und die Sonde war 1/5000 verdünntes Streptavidin-alkalische
Phosphatase-Konjugat
(Gibco BRL).
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Beispiel 6
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Überexpression von BirA
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Das
birA-Gen wurde unter der Kontrolle von induzierbaren Promotoren
auf zwei verschiedenen Plasmiden kloniert. Das birA-Gen wurde in
einer Polymerasekettenreaktion (PCR) von dem Plasmid pBA22 (siehe Barken
and Campbell, 1981, J. Mol. Biol. 146: 469-492) amplifiziert, unter
Verwendung der Primen ON-1589 (SEC ID NO: 101)(5' TAC AGT GCT AGC TAA CTA ATG GAG GAT
ACA TAA ATG AAG GAT AAC ACC GTG CCA CTG 3') und ON-1590 (SEQ ID NO: 102)(5' GTA TCA GAG CTC
TTA TTT TTC TGC ACT ACG CAG GGA 3'). Das Fragment wurde mit Sacl und Nhel
verdaut und in mit Sacl, Nhel verdautes Plasmid pJS100 kloniert, wodurch
birA unter die Kontrolle des araBAD-Promotors gestellt wurde. Das
resultierende Plasmid, bezeichnet als pJS170, enthält einen
von pBR322 abgeleiteten Replikationsursprung, ein Ampicillinresistenzgen,
und das araC-Gen, das für
einen Regulator des araBAD-Promotors kodiert. Induktion der Expression
von birA aus diesem Plasmid in LB + 0,2% Arabinose ermöglicht die
Expression großer
Mengen an BirA-Protein.
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Das
birA-Genfragment wurde auch in mit Sacl, Spel verdautes Plasmid
plQCAT-LC9 kloniert. Dies stellt birA unter die Kontrolle des tac-Promotors,
der mit IPTG induzierbar ist. Dieses Plasmid, bezeichnet als pJS169,
enthält
auch einen p15A-Replikationsursprung,
ein Chloramphenicolresistenzgen, und das laclQ-Allel des lacl-Gens,
welches für
einen Repressor der Promotoren lac oder tac kodiert. Der p15A-Replikationsursprung
ermöglicht
die Replikation dieses Plasmids in der gleichen Zelle wie von pBR322
abgeleitete Plasmide. Somit kann BirA in der gleichen Zelle, die
das Biotinylierungszielprotein exprimiert, überexprimiert werden. Zellen,
die pJS169 enthalten und in LB + 0,3 mM IPTG angezogen werden, überexprimieren
BirA in einem geringeren Ausmaß als
Zellen, die pJS170 enthalten und mit 0,2% Arabinose induziert werden.
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Beispiel 7
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Verstärkte Biotinylierung in einem
E. coli Stamm, der BirA überproduziert
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Die
Effizienz der Biotinylierung des MBP-Peptid-Fusionsproteins wurde
unter zwei Wachstumsbedingungen unter Verwendung eines Bandenverschiebungsassays
bestimmt. Dieser Assay wurde durchgeführt, indem deglykosiliertes
Avidin (UltraAvidin, Leinco Technologies) mit einem Zellrohlysat
aus einem E. coli Stamm, der das MBP-Peptid-Fusionsprotein überexprimierte,
gemischt wurde. Das Gemisch wurde einer Elektrophorese auf einem
nicht-denaturierenden 4-20% Acrylamidgel unterzogen und mit dem
Lysat ohne Avidin verglichen. Ein Vergleich der beiden Bahnen ermöglichte
die Quantifizierung der Biotinylierungseffizienz durch Beobachten
der durch das zugegebene Avidin verursachten Bandenverschiebung.
Fusionsproteine, die in einem Stamm exprimiert worden waren, der
pJS169 enthielt (unter Induktion von birA mit 0,3 mM IPTG), in LB-Medium,
enthaftend 10 μM
Biotin, waren stärker
biotinyliert als diejenigen, welche in Abwesenheit von extra BirA
und zugegebenem Biotin exprimiert worden waren.
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Beispiel 8
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Biotinylierung
von rekombinanten Proteinen in vitro
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1. Überexpression
und Reinigung von BirA
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BirA
kann entweder gemäß veröffentlichten
Verfahren (siehe Buoncristiani and Otsuka, 1988, J. Biol. Chem.
163(2): 1013-1016) oder gemäß dem nachfolgenden
Verfahren gereinigt werden.
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Eine
Einzelkolonie des E. coli Stamms BL21, transformiert mit pJS169,
wurde über
Nacht in 50 ml LB + Ampicillin angezogen. Diese Kultur wurde 1:100
in 1 Liter LB + Ampicillin angeimpft und bei 37°C unter Schütteln bis zu OD600 =
0,5 angezogen. Nach Induktion mit 0,4 mM IPTG wurden die Zellen
weitere 4 Stunden angezogen, mittels Zentrifugation geerntet, in
20 mM Tris-HCl pH 7,4 + 5 mM DTT (TD5) erneut suspendiert, und durch
Beschallen lysiert. Zellmaterial wurde mittels Zentrifugation entfernt,
und der Überstand
mit TD5-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt.
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Roher Überstand
wurde auf eine 10 ml Blue Sepharose FF-Säule (Pharmacia) aufgetragen
und mit TD (20 mM Tris-HCl pH 7,4) durchgewaschen bis die A280 des
Säulendurchflusses
etwa 0 war. Diese Säule wurde
mit 100 ml eines Gradienten von 0-1,5 M NaCl in TD eluiert, und
2 ml Fraktionen wurden gesammelt. BirAenthaltende Fraktionen wurden
gepoolt und gegen TD dialysiert bis die NaCl-Konzentration etwa 15 mM betrug.
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Das
Dialysat wurde unter Verwendung von Amicon YM30 konzentriert und
danach auf eine 5 ml S Sepharose FF-Säule (Pharmacia) aufgetragen
und mit TD1 (20 mM Tris-HCl pH 7,4 + 1 mM DTT) durchgewaschen. Protein
wurde mit 50 ml eines Gradienten von 0-350 mM NaCl in TD1 eluiert.
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BirA-enthaltende
Fraktionen wurden gepoolt, an eine Biotin-Sepharose-Säule gebunden,
mit TD1/150 mM NaCl gewaschen, und mit TD1/150 mM NaCl + 2 mM Biotin
eluiert. BirA-enthaltende Fraktionen wurden über YM30 gegen TD1/150 mM NaCl
auf ein Endvolumen von 10 ml dialysiert.
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2. Biotinylierung in vitro
unter Verwendung von gereinigtem BirA-Enzym
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Proteine,
die an eines der erfindungsgemäßen Peptide
fusioniert waren, wurden in vitro bei 37°C biotinyliert, in einem Puffer,
enthaltend: RPMI-Medium 1640 (Gibco-BRL), ergänzt mit 5 mM ATP, 5 mM MgCl2 und 10 μM
Biotin.
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Obwohl
die vorstehende Erfindung mittels Erläuterungen und Beispielen aus
Gründen
der Klarheit und Verständlichkeit
in gewisser Ausführlichkeit
beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass bestimmte Veränderungen
und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden
können.
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