CN105308073B - 双生物素化标签 - Google Patents

Abstract

提供了多生物素化的反应物，其可用于二价复合物，供于多种应用如共定位、标记、固定化和纯化。也提供可构建、纯化和使用双生物素化的反应物的方法。在某些实施方式中，2个双生物素化的反应物结合至单个链霉亲和素四聚体以提供具有相对于双生物素化的反应物的化学计量为1:1的复合物。

Description

双生物素化标签

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年6月14日提交的美国临时申请号61/835,311的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。

关于联邦资助研究的声明

未应用。

背景技术

分子生物学中的一个共同任务是鉴定并定量复杂混合物中蛋白质的存在。例如，为了鉴定感兴趣蛋白质的表达水平，可进行Western印迹，其中在凝胶上运行蛋白质提取物并且用针对感兴趣蛋白质的限定表位的抗体染色。限定表位可以是在天然蛋白质中发现的特定序列或结构，或者可以是在克隆期间导入的标签，例如“FLAG标签”，可购得针对其的抗体。使用对与蛋白质结合的一抗有特异性的过氧化物酶偶联的二抗来生成可检测的信号。这种方法是繁琐的，需要用于从细胞提取物中纯化蛋白质的更合理化的方法。

将光学标记物连接到蛋白质可以是检测和定量的替代策略，然而，这一般需要对蛋白质内残基的化学修饰。通过赖氨酸或半胱氨酸残基连接染料通常改变了活性或降低溶解性，使得带标记的蛋白质难以或不可能被纯化。荧光蛋白质标签具有多种光谱性质，例如Shaner等，(2005)Nature Methods 2(12):905-909所述，其通过引用全文纳入本文用于所有目的，但是这些标签对于单分子实验而言是次优的。

化学合成DNA的能力使得可能构建在自然中未发现的肽和蛋白质并且可用于多种方法，这些方法在其它情况中难以或不可能实施。例如，大量描述受体蛋白质重组表达的公开的专利文献。参见，例如，PCT专利公开号91/18982以及美国专利号5,081,228和4,968,607，其描述了编码IL-1受体的重组DNA分子；美国专利号4,816,565、4,578,335和4,845,198，其描述了与IL-2受体相关的重组DNA和蛋白质；PCT专利公开号91/08214，其描述了与核酸相关的EGF受体；PCT专利公开号91/16431和美国专利号4,897,264，其描述了干扰素γ受体与相关的蛋白质和核酸；欧洲专利局(EPO)公开号377,489，其描述了C5a受体蛋白质；PCT专利公开号90/08822，其描述了EPO受体和相关的核酸；PCT专利公开号92/01715，其描述了MHC受体；和1992年9月18日提交的美国专利申请系列号947,339，其描述了如何从细胞表面上切下含HPAP的受体以及保留的锚定序列如何可用作用于固定受体的抗体的识别序列。各自通过引用纳入本文用于所有目的的这些文献中的几种描述了如何分离特定受体蛋白质(或编码该蛋白质的基因)以及可以自然或天然受体不可使用的方式使用的受体变体。

伴随着相对于受体克隆和表达的进步，已有与筛选针对可能以所需的方式与受体相互作用的化合物的受体的方法相关的技术进步。在多种随机和半随机“肽多样性”生成系统中，一种这类进步与大量化合物或潜在配体的生成相关。这些系统包括“质粒上肽”系统，其描述于美国专利号5,338,665，其是美国专利号5,270,170中的部分继续申请；“噬菌体上肽”系统，其描述于1991年6月20日提交的美国专利申请系列号718,577，其是1990年6月20日提交的系列号541,108的部分继续申请；Cwirla等，1990年8月，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382；Barrett等，1992,Analyt.Biochem.204:357-364；以及PCT专利公开号91/18980和91/19818；基于噬菌体的抗体展示系统，其描述于1990年5月11日提交的美国专利申请系列号517,659，和PCT专利公开号91/17271；用于生成和筛选核酸配体的基于珠的系统，其描述于PCT公开号91/19813、92/05258和92/14843；基于珠的系统，其描述于1992年9月16日提交的美国专利申请系列号946,239，其是1991年9月18日提交的系列号762,522的部分继续申请；和“非常大规模的固定的聚合物合成”系统，其描述于美国专利号5,143,854；PCT专利公开号90/15070和92/10092，1990年12月6日提交的美国专利申请系列号624,120,；Fodor等，1991年2月15日，Science 251:767-773；Dower和Fodor,1991,Ann.Rep.Med.Chem.26:271-180；和1991年12月6日提交的美国专利申请系列号805,727。上述参考文献各自通过引用纳入本文用于所有目的。

其它发展涉及在这类筛选方法中如何使用受体。与用于在空间上限定的阵列中固定一个或多个受体的试剂和方法的发展相关的一个重要进步描述于PCT专利公开号91/07087，其描述了受体与亲和素结合并且随后固定在含生物素基团的表面上。一旦亲和素化受体与表面上的生物素基团结合，该表面可用于筛选针对该受体的化合物。

生物素是与参与活化的羧基转移的几种酶共价连接的辅因子。对通常没有生物素化的分子进行生物素标记可用于标记、检测、纯化和/或固定这类分子。这些方法也依赖于蛋白质亲和素和/或链霉亲和素，其与生物素非常紧密且特异性地结合。一般而言，通过体外生物素化方法制备这类方法中使用的生物素化的分子。替代地，由于使用生物素作为亲和标签的能力，对通过重组DNA技术合成的蛋白质体外生物素化的方法消除了在纯化后化学上生物素化这些蛋白质的需要并且极大地简化了纯化方法(参见Green,1975,Adv.Protein Res.29:85-133，其通过引用纳入本文)。

也可使用生物素-链霉亲和素相互作用来将不同的分子连接在一起以形成有用的复合物。例如，由于链霉亲和素具有4个生物素结合位点，4个生物素标记的分子可连接到单个链霉亲和素分子上。包括通过链霉亲和素分子连接生物素标记的分子的方法的某些具体实施例在本领域中详细描述，例如，在2013年2月14日提交的美国专利申请号13/767,619；美国专利号8,389,676；和美国专利号8,252,910中，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。然而，生成2个分子的强1:1复合物对于一些应用是有用的，并且由于其四价性质，这可能对于链霉亲和素而言是困难的。可能生成许多不同的化学计量，例如，1:3和3:1。之前已经描述了产生具有减少数量的活性位点的链霉亲和素四聚体的方法，例如在Howarth等，(2006)Nature Methods 3(4):267-73中，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。然而，Howarth的方法包括混合2种重组链霉亲和素并且是繁琐的。

发明内容

本发明提供了可用于生物素化分子并将生物素化的分子通过生物素结合试剂如链霉亲和素连接在一起的化合物、试剂、方法和试剂盒。本发明提供了包含双生物素化的试剂以及与生物素结合试剂，例如链霉亲和素结合的这类双生物素化的试剂的组合物。在优选的实施方式中，双生物素标签与链霉亲和素或其它生物素结合试剂结合，使得该双生物素标签结合链霉亲和素四聚体的二聚体上的2个生物素结合位点。

在某些方面中，本发明提供了包含与第一双生物素标签偶联，优选共价偶联的第一反应物。在各种替代的实施方式中，该第一试剂是蛋白质、标记物、固定化标签、纯化标签，条码或固体支持物。在更具体的实施方式中，该蛋白质是酶，例如，聚合酶；该标记物是荧光标记物、自旋标记物、或磁性标记物；并且该固体支持物是珠或平面支持物，例如排列的支持物。该双生物素标签在分支接头上任选地串联取向或设置。在一些优选的实施方式中，双生物素标签中的生物素隔开20-60埃。任选地，该组合物还包含与第一双生物素标签结合的链霉亲和素四聚体，例如，其中第一双生物素标签中的2个生物素部分结合到链霉亲和素四聚体，例如，2个都结合到链霉亲和素四聚体中的2个二聚体之一上。在一些实施方式中，该组合物还包含同时与第一双生物素标签和第二双生物素标签结合的链霉亲和素四聚体。该第二双生物素标签一般与第二反应物共价连接。第二双生物素标签中的2个生物素部分优选都结合到不与第一双生物素标签结合的链霉亲和素四聚体的二聚体。

在一些实施方式中，本发明提供了优选以1:1的化学计量共定位2种反应物的方法。在一些实施方式中，这一实施方式包括(a)将第一反应物连接，优选共价连接至第一双生物素标签；(b)将第二反应物连接，优选共价连接至第二双生物素标签；(c)将第一反应物与四价生物素结合试剂结合，从而产生包含与四价生物素结合试剂结合的第一反应物的第一复合物；和(d)使第二反应物暴露于第一复合物，从而产生包含与第一复合物结合的第二反应物的第二复合物。任选地，该方法还包括在暴露所述第二反应物和/或分离第二复合物之前分离第一复合物。在一些实施方式中，该第一反应物是二价结合对的第一成员，而该第二试剂是二价结合对的第二成员，并且另外，其中第二复合物的产生增加了第一反应物与第二反应物之间的结合。在具体实施方式中，第一反应物是酶而第二反应物是酶的底物，并且第二复合物的产生增加了酶与底物之间的催化。在其它具体实施方式中，第一反应物是固体支持物而第二反应物是感兴趣的分子或分子复合物，并且第二复合物的产生固定感兴趣的分子或分子复合物。在其它实施方式中，第一反应物是检测第二反应物的可检测标记物，并且复合物用作将标记物与第二反应物连接用于后续检测步骤。在替代性实施方式中，第一反应物是固定第二反应物的固定化标签，并且复合物用作将固定化标签与第二反应物连接用于后续固定步骤。在其它实施方式中，第一反应物是纯化第二反应物的纯化标签，并且复合物用作将纯化标签与第二反应物连接用于后续分离步骤。

在其他方面中，本发明提供了包含多生物素化的可检测标记物和四价生物素结合试剂的标记试剂。在优选的实施方式中，该多生物素化的可检测标记物包括双生物素标签。可使用不同类型的可检测标记物，例如，荧光染料、自旋标记物、量子点等。四价生物素结合试剂优选是链霉亲和素四聚体。

在其它方面中，本发明提供了包含多生物素化的反应物的组合物，该反应物包含多个生物素部分，其中所有的生物素部分与单个多价生物素结合试剂结合。在某些实施方式中，多价生物素结合试剂是链霉亲和素四聚体，例如，其所有生物素结合位点都被占据。该四聚体任选地结合第二生物素化的反应物，其不是多生物素化的反应物。优选地，生物素部分共价结合到多生物素化的反应物和第二生物素化的反应物之一或两者。在某些实施方式中，多生物素化的反应物和第二生物素化的反应物各自包含双生物素标签。在具体实施方式中，多价生物素结合试剂是链霉亲和素四聚体，多生物素化的反应物上的第一双生物素标签占据链霉亲和素四聚体的第一二聚体上的2个生物素结合位点，并且第二生物素化的反应物上的第二双生物素标签占据链霉亲和素四聚体的第二二聚体上的2个生物素结合位点。多生物素化的反应物可任选地是具有至少2个生物素化肽的生物素化的融合蛋白，例如，在该生物素化肽位于融合蛋白的N端或C端的情况中。生物素化肽可串联排列，或以分支构型提供。

总之，本发明提供了以优选的化学计量，优选一对一化学计量将反应物连接在一起的组合物和方法。该组合物和方法可用于多种目的，包括，例如，用于研究和诊断应用的潜在广泛商业应用。例如，发现特定应用用于连接标记物和试剂，并将2种反应物定位在一起，例如，以强化所需的相互作用。

附图简要说明

图1显示了包含被双生物素化的反应物封闭的2个结合位点和用于进一步结合的2个结合位点的四聚体复合物。

图2显示了包含与四价链霉亲和素结合的双生物素化的可检测标记物的标记试剂。

图3提供了通过双生物素化2种反应物(反应物1和反应物2)并将2种反应物同时或依次结合到四价复合物来共定位2种反应物的说明性实施方式。

图4提供了一种使用四价复合物以1:1的化学计量将2种反应物连接在一起的方法的说明性示例，其中一种反应物经三生物素化而另一种反应物经单生物素化。

图5提供了本发明的实施方式的说明性示例，其中双生物素化的感兴趣的蛋白质(蛋白质1)结合与体关联(body-linked)标记物结合的链霉亲和素，而非特异性蛋白质仍然没有结合(蛋白质2、3和4)。

图6显示了用于分离不同链霉亲和素四聚体复合物的凝胶分离策略的实施方式。

图7提供了蛋白质1和蛋白质2各自通过双生物素连接与不同链霉亲和素四聚体结合的示例性实施方式，各自分别包含核酸标签，标签1和标签2。

图8提供了从离子交换柱收集的部分的典型色谱图的示例。

图9提供了示例性高通量聚合酶筛选凝胶的图像。

图10提供了双生物素加标签策略的说明性实施方式，其中4个SpyTag与聚合酶融合。

图11提供了形成包含与链霉亲和素分子结合的双生物素化的染料的复合物的方法说明性实施方式，其结合到与蛋白质-SpyTag融合物共价连接的双生物素化的SpyCatcher肽。

发明详述

I.定义

出于理解本发明的密度，定义以下术语。

术语“双生物素”、“双生物素标签”、“双-B标签”和“双生物素部分”可互换使用并一般指代与感兴趣的反应物连接(任选地共价连接)的2个共价连接的生物素。在某些优选的实施方式中，感兴趣的反应物包含被生物素连接酶识别的序列，该酶催化序列与生物素分子之间的共价连接。这一序列一般是指生物素连接酶识别序列。感兴趣的反应物中各生物素连接酶识别序列可与生物素部分共价连接，因此具有多个生物素连接酶识别序列的反应物可与多个生物素共价连接。具有一个或多个生物素连接酶识别序列的反应物区域一般是指反应物的生物素化区域。例如，双生物素可指与融合蛋白反应物内的2个生物素化肽结合的2个生物素。

术语“生物素化肽”是指提供可生物素化序列基序的氨基酸序列。因此，生物素化肽是能够经生物素化的肽。

术语“生物素化序列”是指编码生物素化肽的核酸序列。因此，生物素化序列的转录和翻译生成生物素化肽。

术语“生物素化酶”是指一类称为生物素蛋白连接酶的酶，或生物素化其它蛋白质或肽的酶。

术语“融合蛋白”一般是指由通常不以单个蛋白质结合在一起的2种分离的蛋白质的复合体。可通过重组核酸方法，即，其是包含编码生物素化肽的部分和编码一种或多种异源蛋白质的部分的基因融合的转录和翻译的结果，或通过本领域熟知的化学合成方法制备融合蛋白。

术语“宿主细胞”是指真核或原核细胞或细胞组，其可以或已经被重组DNA载体转化。出于本发明的目的，优选原核宿主细胞。

术语“接头”或“间隔子”是指连接2个分子并通常用于将2个分子放置在优选构型和/或位置的一个分子或一组分子(如单体或聚合物)，例如，使得这2个分子可例如与2个不同的分子，或者单个分子或分子复合物上的2个不同位置具有优选的相互作用。

术语“多生物素标签”一般是指包含多个生物素部分的标签。例如，双生物素标签是仅具有2个生物素部分的多生物素标签。

术语“肽”是指寡聚体，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸(通常是α氨基酸)。或者，“肽”可优选是“多肽”。肽长度超过2个氨基酸单体，但是更通常超过5-10个氨基酸单体，并且甚至可以长度超过20个氨基酸，虽然长度超过20个氨基酸的肽更可能被称为“多肽”。

本领域熟知术语“蛋白质”并且通常是指具有一些生物功能的非常大的多肽，或一组结合的多肽。出于本发明的目的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在很大程度上可相互变换，由于所有三种类型的文库可使用基本上类似的方法进行制备。

本文所用术语“反应物”一般表示感兴趣的分子或分子复合物，例如，反应组分。例如，反应物可以是多组分混合物的组分(例如，反应混合物，缓冲剂等)，无论该组分是否直接或间接参与化学或生化反应。在某些优选的实施方式中，感兴趣的反应物经生物素化以促进进一步的操作和/或分析。反应物可以是任意分子或分子复合物，包括但不限于多肽、蛋白质、酶、核酸(例如，寡核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、核酸衍生物等)、辅因子、小分子(例如，药物)、“非反应性”组分、光学标记物(例如，荧光染料)等。

术语“固体支持物”是指具有刚性或半刚性表面的材料。这类材料将优选采用小珠、粒料、盘、芯片或晶片的形式，虽然可使用其它形式。在一些实施方式中，固体支持物的至少一个表面将会是基本平坦的。在一些实施方式中，固体支持物是包含纳米级缝隙的平坦表面，例如，零级波导，其描述于本领域，参见例如美国专利号7,056,661和7,315,019，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

术语“表面”是指固体基材上任意的一般二维结构并且可具有梯、脊、扭结、阶、纳米级缝隙等而不妨碍成为表面。

术语“合成”是指通过体外化学或酶促合成产生。

II.本发明的方法和试剂

生物素-链霉亲和素连接是迄今为止最强的非共价相互作用之一。4个链霉亲和素单体排列成二聚体的二聚体。如此，多达4个加生物素标签的分子(例如，蛋白质、核酸、小分子等)可通过它们相应的生物素标签与单个链霉亲和素四链结构的相互作用连接在一起。在目标将多个相同的加生物素标签的分子连接在一起用于例如纯化目的的情况下，可接受这种排列。然而，在一些情况中，需要或必需以特定的化学计量将不同的加生物素标签的分子结合至同一链霉亲和素分子。例如，在需要2个各类型的加生物素标签的分子结合单个链霉亲和素分子的情况中，在链霉亲和素存在下将它们简单地合并在一起将会产生不仅有所需的2:2化学计量，也有1:3、3:1、4:0和0:4化学计量的复合物。如果考虑到链霉亲和素的4个结合位点没有全部被占据的情况，简单混合策略也可能生成具有0:0、1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、2:0、0:2、3:0和0:3的化学计量的复合物，主要的化学计量受到试剂浓度和时间的影响。例如，当用过量的链霉亲和素进行结合时，包含与一个链霉亲和素四聚体结合的一个单一生物素化的反应物的复合物可以是主要产物。此外，这4个结合位点使得所需的化学计量实际是1:1的应用变得复杂。本发明的反应热已经发展了利用生物素-链霉亲和素相互作用的有益的高亲和性和紧密结合来产生具有1:1化学计量的复合物的策略。

Becket等(1999,Protein Science 8:921-929)和美国专利号5,723,584、5,874,239、5,932,433、6,265,552和8,389,676(通过引用全文纳入本文用于所有目的)描述了生物素化肽，其是与感兴趣的蛋白质连接以提供生物素标记的位点的肽序列。简言之，将编码生物素化肽的序列(“生物素化序列”)克隆到编码感兴趣的蛋白质的DNA序列中，使得表达产生包含与生物素化肽连接的感兴趣蛋白质的融合蛋白，可通过生物素化酶，例如大肠杆菌BirA来识别生物素化肽。如此，融合蛋白可在体内经生物素化，并且加入生物素还可促进从细胞培养物中纯化融合蛋白。无论在体内或体外经生物素化，短的生物素化肽可用于广泛的目的，包括纯化、固定、标记和检测融合蛋白。一些说明性示例包括：(1)在限定位点处用生物素标记受体，使得标记的受体可以例如结合链霉亲和素以产生四价受体来增加结合试验的灵敏度，如1992年9月16日提交的美国专利申请系列号946,239和美国专利号5,143,854中所述的那些，各自通过引用纳入本文；(2)标记含从任意筛选程序导出的肽的融合蛋白，使得标记的融合蛋白可用于测试肽与受体以单价形式的结合(通过在结合发生后用标记的链霉亲和素探测)或多价形式的结合(通过将融合物与标记的链霉亲和素预结合，然后测试与受体的结合)，或者使得肽可固定在链霉亲和素包被的珠上或微孔中用于用受体探测溶液中的例如蛋白酶；(3)在氚标记的生物素存在下由生长中的生物素营养缺陷型细胞直接标记肽或蛋白质，可以已知的具体活性标记肽以允许对结合活性的定量测量；(4)开发用于通过使变体固定序列文库暴露于BirA、生物素和ATP来在表面上进行酶促反应，使得这些作为底物的肽会经生物素化并可用标记的链霉亲和素检测的技术；和(5)将生物素与酶，如聚合酶特异性接合以将酶结合到表面上，例如用于单分子测序，例如美国专利7,056,661和美国专利申请号12/414191所述，其各自通过引用纳入本文。

本领域已知生物素结合试剂并且可与本文提供的方法和组合物联用。在某些实施方式中，本文提供的策略使用多个生物素标签来将单个反应物连接至单个链霉亲和素分子。链霉亲和素是已经充分研究并克隆的生物素结合试剂。参见，例如，等，(1986)Nucleic Acids Res.14(4):1871-1882；Aslan等，(2007)Journal of Biotechnology 128:213-225；Aslan等，(2005)J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(24):8507-8512；Baugh等，(2010)Biochemistry 49:4568–4570；Gitlin等，(1988)Biochem.J.256:279-282；Hendrickson等，(1989)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 86:2190-2194；Hyster等，(2012)Science 338:500-503；Klumb等，(1998)Biochemistry 37(21):7657-63；Kurzban等，(1991)J.Biol.Chem.266(22):14470-14477；Matsumoto等，(2011)J.Biotechnology 152:37-42；Sano等，(1996)Annals of the New York Academy of Sciences 799(酶工程XIII)第383-390页；Schmidt等，(1994)Journal of Chromatography A 676:337-345；Srisawat等，(2001)RNA 7:632-641；Tahiri-Alaoui等，(2002)Nucleic Acids Res.30(10):e45；Voss等，(1997)Protein Engineering 10(8):975–982；和Wilbur等，(2004)BioconjugateChem.15:1454-1463，其全部通过引用全文纳入本文用于所有目的。虽然本文所述的许多组合物、方法、示例和应用使用或包括链霉亲和素，例如，用于结合生物素化的反应物，应理解也可使用其它生物素结合试剂(例如，核酸或其它分子或分子复合物)，例如，亲和素、去糖基化的亲和素(中性亲和素)、捕集亲和素(traptavidin)，及其变体、突变体、或衍生物。例如，美国专利号7,981,632描述了“strep-标签”肽，其结合链霉亲和素的修饰版本，链肌动蛋白(streptactin)。本发明考虑本文提供的试剂与链肌动蛋白和/或strep-标签联用。例如，在双生物素部分可代替单生物素部分结合链肌动蛋白的情况中，链肌动蛋白可取代链霉亲和素；或者，一个或多个strep-标签肽可连接到随后与链肌动蛋白结合，或在结合够强下与链霉亲和素结合的反应物。可使用常规分子生物学技术、克隆、化学课程等来完成将strep-标签连接至反应物。另外，也已经开发了对链霉亲和素有亲和性的肽和核酸适体并描述于本领域，例如ahiri-Alaoui等，(2002)Nuc.Ac.Res.30(10):e45；和Wilson等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-3755，两者通过引用全文纳入本文用于所有目的。这种链霉亲和素结合适体可连接至反应物以促进以与本文所述的生物素标签类似的方式结合链霉亲和素。例如，单个反应物上的2个连接的适体可以与双生物素标签类似的方式操作并且提供将反应物连接至链霉亲和素分子上的2个结合位点的方式。如此，在本文的各实施方式中对链霉亲和素和生物素的限制仅仅是示例性的并且不排除在本文所述的多个方面中(例如方法、组合物和试剂盒中)使用其它生物素结合反应物或链霉亲和素结合反应物，其代替或与链霉亲和素和/或生物素联用。如此，考虑包括同一复合物中结合伴侣的不同组合的实施方式，例如具有单个生物素结合标签和单个链霉亲和素结合适体的反应物，其中该反应物结合链霉亲和素四聚体，适体结合四聚体的一个二聚体中的一个结合位点，并且生物素结合同一二聚体中的另一个结合位点。

另外，虽然本文的各种示例聚焦于将单个多生物素标签结合到感兴趣的反应物，应理解多个多生物素标签可连接至单个反应物，例如，在需要结合多个单独生物素结合试剂的情况中。例如，在单个反应物包含2个双生物素标签的情况中，各标签可结合不同的链霉亲和素，该链霉亲和素可结合其它加生物素标签的反应物，例如，其它反应物、标记物、固体支持物等。考虑通过结合生物素结合试剂使多生物素化的反应物互相连接的网络，例如，用于重建催化途径(例如，代谢或合成途径)，或用于增强多个不同反应物(例如，大分子复合物中的组分)之间的复合物形成。

在本发明的某些优选的方面中，双生物素标签中的2个生物素(或多生物素标签中的多个生物素)全部结合同一生物素结合试剂，例如，链霉亲和素、捕集亲和素等以提供双生物素标签共价结合的反应物与生物素结合试剂之间的稳定连接。在Ringler和Schulz(2003)Science 302,106-109(通过引用全文纳入本文用于所有目的)所描述的“双生物素接头”中，它们用作2个不同分子之间的连接，这2个分子各自具有生物素结合位点。换而言之，双生物素接头上的2个生物素非共价结合2个不同的分子，从而通过接头连接它们。如此，分子都没有共价连接至双生物素接头。其它称为“生物素化的星型放射枝状聚合物”的多生物素接头描述于Wilbur等，(1998)Bioconjugate Chem.9:813-825和美国专利号7,141,676(通过引用全文纳入本文用于所有目的)用于癌症预先靶向方案。同样，这些枝状聚合物并不包含与感兴趣的反应物的共价连接，而是在体内非共价连接分子。其它双生物素接头描述于Wilbur等，(1997)Bioconjugate Chem.8:819-832(通过引用全文纳入本文用于所有目的)；并且虽然在一些实施方式中，在三生物素化的接头中的2个生物素都结合至同一链霉亲和素分子，第三生物素结合不同的链霉亲和素分子，例如，以形成接头和链霉亲和素四聚体的分子网络。如此，并非多生物素化接头中的所有生物素结合到同一链霉亲和素四聚体。在本发明的某些优选的实施方式中，本发明的双生物素化的反应物不仅是包含2个(或更多个)生物素的接头，而且是具有与反应混合物中的其它组分有特异性相互作用/反应的分子。在本发明的其它优选的实施方式中，多生物素化的反应物上的所有生物素结合同一生物素结合试剂，例如，分子复合物如链霉亲和素二聚体或四聚体。如此，包含本发明的多生物素化的反应物的优选复合物还包含单一生物素结合试剂。

在某些优选的实施方式中，修饰反应物以加入2个生物素化肽，并且2个生物素分子随后结合生物素化肽(例如，使用生物素连接酶)以提供反应物上的双生物素标签。在感兴趣的反应物是蛋白质的情况中，多个，优选串联的编码生物素化肽的序列克隆到编码感兴趣的蛋白质的DNA序列中，使得表达产生包含连接到多生物素化肽的感兴趣的蛋白质的融合蛋白，其随后经生物素化。在优选的实施方式中，在单个“生物素化区域”内，例如在感兴趣的反应物的一个末端处出现的2个生物素化肽优选串联排列。例如，对于感兴趣的蛋白质，生物素化区域优选在该蛋白质的C-末端或N-末端处。在替代性实施方式中，2个分开的生物素化区域可经工程改造到感兴趣的反应物中，其中各自包含单个生物素化肽。例如，一个可位于蛋白质的C-末端，而另一个位于N-末端。感兴趣的反应物内的生物素化区域的位置并不限于末端，并且也可出现在反应物内部。然而，在需要反应物保持给定活性的情况中，生物素化肽的位置，以及生物素部分的最终位置不能干扰这种活性。本领域普通技术人员会确定给定反应物的哪些部分是其活性所必需的，并且哪些部分可经受这种修饰。

优选地，生物素化发生在体内，其提供了可用于从细胞提取物中纯化融合蛋白的生物素标签。在其他实施方式中，其可在裂解和纯化过程期间的一些点上在体外进行。在加生物素标签的蛋白质的生物素化和分离之后，现在与生物素化肽结合的生物素分子(双生物素部分)还可结合链霉亲和素四聚体上的2个相邻位点(例如，在同一二聚体上)。导入链霉亲和素导致蛋白质-生物素-链霉亲和素复合物的组装，该复合物在链霉亲和素四聚体上有2个开放的结合位点，其可结合与其它试剂连接的生物素，该试剂具有至少2个生物素标签，或者结合2个其它生物素化的反应物。替代地，导入的链霉亲和素可能已经结合到其它分子，例如，单生物素或双生物素标记的反应物。在某些优选的实施方式中，链霉亲和素已经结合至具有单、双生物素标签的标记物(例如，荧光染料)。

本发明的特别优选的组合物包含全部4个结合位点都被占据，但以1:1化学计量仅结合2个反应物的单个链霉亲和素分子，其中所述2个反应物各自通过2个生物素标签连接至链霉亲和素分子。例如，加双生物素标签的蛋白质与双生物素标记的链霉亲和素(与具有双生物素标签的标记物(例如，荧光染料分子)结合的链霉亲和素)的结合产生具有相对于2个结合的分子(即蛋白质和标记物)的化学计量为1:1的复合物，这是由于仅一个蛋白质和一个标记物结合链霉亲和素四聚体。随后可使用感兴趣的蛋白质和标记物之间通过链霉亲和素四聚体的连接来在其它分析期间鉴定或检测蛋白质。虽然标记物在该示例中结合链霉亲和素，链霉亲和素可结合希望与感兴趣的蛋白质连接的任意分子，例如，另一种蛋白质、核酸或核苷酸、小分子或药物、金或其它金属颗粒、抗体或抗原、亲和标签、RFID标签、条码(例如，核酸或多肽条码)、或不同类型的标记物(例如，质量标记物、自旋标记物等)。此外，链霉亲和素还可连接至表面，例如，通过双生物素连接，例如用于蛋白质的纯化或其它操作。所考虑的表面包括，但不限于，珠(例如，磁珠)、柱(例如，用于色谱)、微阵列、半固体表面、波导基材、阵列上的纳米孔内(例如，在零级波导的底部)等。

根据待加标签的试剂的结构，双生物素标签可排列成线性或分支取向。在反应物是在融合蛋白的一个末端处具有串联取向的生物素化肽(它们之间含有或不含间隔子)的融合蛋白的情况中，优选线性取向。在向感兴趣的肽的基因中加入生物素化序列的情况，类似于向上述感兴趣的蛋白质加入单个生物素化肽的方法中，这种融合蛋白可在体内表达。可使用常规生化方法来提供分支取向，例如，通过生化合成在分开的分支上各自具有2个生物素化肽的分支接头。这种合成接头结合到感兴趣的反应物，并且优选随后经生物素化以提供分支的双生物素标签。

链霉亲和素是二聚体的二聚体。在与这2个二聚体之一上的2个结合位点(即“相邻生物素”)结合的生物素的羧基部分之间存在约19-20埃的距离。(中性抗生物素蛋白和亲和素中也发现类似的距离)。如此，约19-20埃或更大的双生物素部分的2个生物素之间的距离或“接头长度”能够适应2个生物素与链霉亲和素二聚体上的结合位点的结合。由于完全伸展的生物素化肽的15个氨基酸可跨越超过50埃，融合蛋白中串联重复的生物素化肽提供了超过随后结合的生物素部分之间的足够距离以允许与2个链霉亲和素二聚体之一上的相邻结合位点结合，只要结合的生物素部分之间的多肽的二级和/或三级结构没有将它们之间的实际距离缩短至低于19-20埃。在接头长度太短而无法结合2个生物素的情况中，构建体将有利于链霉亲和素四聚体的菊形连接，其中双生物素的一个生物素将结合一个链霉亲和素复合物而另一个生物素将结合第二链霉亲和素复合物，从而将2个链霉亲和素复合物连接在一起。如此，在优选的实施方式中，反应物的生物素化区域提供了至少20埃，更优选至少25、30、35、40、45、50或60埃的结合的生物素部分之间的距离。同样，在双生物素标签中的生物素隔开太远的情况中，链霉亲和素的菊形连接也有利于将2个生物素结合到同一链霉亲和素二聚体。可在Ringler和Schulz(2003)Science 302,106-109中发现关于链霉亲和素的菊形连接的更多信息，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。如此，在优选的实施方式中，接头长度为约20-70埃，更优选约20-60埃。考虑到感兴趣的反应物的柔性连接部分，接头长度也可随着连接部分的弯曲变化，如本领域技术人员会理解的那样。此外，多肽接头的二级和三级结构将改变2个生物素部分之间的实际距离，因此，本文提供的距离是指将2个生物素部分结合到例如，链霉亲和素复合物上的所需结合位点所跨越的距离，并且不必是接头的例如基于其一级结构的“拉伸”长度。

在其它实施方式中，可用3个生物素给单个反应物加标签，即“三生物素”标签。加三生物素标签的分子结合链霉亲和素分子，留下对单个加单生物素标签的分子开放的单个结合位点。与2个加双生物素标签的策略相似，这一策略也以1:1化学计量提供了结合至单个链霉亲和素分子的分子。然而，结合的生物素之间的跨越必须能够适应从链霉亲和素分子的一侧(占据2个结合位点)到另一侧(第三个位点将被占据)的跨度。链霉亲和素复合物的不同二聚体上的生物素结合位点之间的距离是29.6埃，并且该距离通过四聚体复合物的中心而不是围绕在外侧，如三生物素复合物所要求。为了使三生物素标签占据一个二聚体上的2个生物素结合位点并且达到另一侧的另一个二聚体上的生物素结合位点，接头将需要适应约70埃的距离，并且需要足够的柔性以具有围绕复合物所需的曲率。使用三生物素的一个缺点在于其更可能结合2个链霉亲和素分子而不是单个四聚体上的3个结合位点，这可能产生链霉亲和素分子的菊形连接，但是这发生的可能性取决于链霉亲和素的浓度和三生物素化的反应物。

发明人已经认识到使用多生物素化的试剂来有效改变四价结合伴侣(例如，链霉亲和素、捕集亲和素、亲和素、中性亲和素等)的价数使得其通过将多个生物素部分连接至单个反应物来使四价结合伴侣上多个结合位点在反应物结合时封闭的价值。例如，将这些试剂与链霉亲和素分子结合有效降低了四聚体上未占据的结合位点的数量，以促进生物素化的反应物的同二聚体或异二聚体的构建。在优选的实施方式中，双生物素化的试剂与链霉亲和素的结合封闭了四聚体上的2个结合位点，而2个结合位点仍然未被占据。这种双生物素化的链霉亲和素四聚体随后可用于通过导入也双生物素化的第二反应物来构建具有1:1化学计量的结合至链霉亲和素四聚体的反应物的复合物。多种方案是可能的，并且某些优选的实施方式示于图1-7。双生物素结合试剂的其它用途描述于Wilbur等，(1997,Bioconjug.Chem.8(6):819-832)和国际专利公开号WO 1999/060400，两者通过引用全文纳入本文用于所有目的。

在一个简单的实施方式中，双生物素化的反应物是用于封闭四聚体复合物上的位点中的2个的非反应性组分。这产生了仅具有2个用于其它结合的结合位点的四聚体复合物，如图1所示。与双生物素化的反应物结合的四聚体复合物随后可用作二价结合伴侣以1:1的化学计量将2个单生物素化的反应物连接在一起，这2个反应物可以是相同的反应物以产生同二聚体，或者不同的反应物以产生异二聚体。在后一种情况中，可得到产品混合物(例如，包括同二聚体和异二聚体)并且进行后续纯化步骤以分离所需的组合。图1显示了与非反应性组分连接的分支的双生物素部分，其暴露于四聚体链霉亲和素以产生仅具有2个开放的生物素结合位点的复合物。同时或连续导入2个单生物素化的反应物(反应物1和反应物2)，并且各自结合开放的生物素结合位点之一。反应物1和2可以是不同的反应物，或者可以是相同的反应物，如上所述。当需要共定位反应物1和反应物2以例如增加它们之间的反应动力学时，该方法是特别有益的。例如，生化反应的2种组分的共定位将通过增加这两种组分相互作用的可能性来促进反应，例如，酶与共定位的酶底物可能比与溶液中游离的酶底物更快发生反应。类似地，在需要将2种反应物连接在一起的情况中，将它们共定位将通过增加它们相对于彼此的局部浓度来促进连接。另外，共定位协同作用的反应物，例如在代谢途径或作为辅因子/酶对是有益的，因为这种共定位增加了它们协作功能的功效。(共定位的这些益处等同应用于本文所述的其它具体实施方式，如双生物素化的反应物结合同一链霉亲和素分子的那些，如下文进一步详述)。如本文其它地方所述，也可在本文所述的组合物和方法中使用其它结合伴侣。例如，可用2个strep-标签肽代替图1中的双生物素部分，并且可用链肌动蛋白分子代替链霉亲和素，如美国专利号7,981,632所述。

在另一个实施方式中，非反应性组分可以是可检测标记物(例如，荧光染料)，其经双生物素化并结合至四价链霉亲和素以产生图2所示的标记试剂。双生物素化的感兴趣的反应物与该标记试剂组合以产生复合物，其中感兴趣的反应物以1:1的化学计量连接至可检测标记物。这一策略可用于通过将反应物暴露于具有不同可检测标记物的标记试剂来差异标记任意数量的不同反应物。标记的反应物可经过进一步分析，该分析使用标记物来例如追踪或定量实验系统中的反应物。虽然提供荧光染料作为示例性的可检测标记物，该申请中也可使用其它可检测标记物，例如，质量标记物、自旋标记物、量子点、金属颗粒和本领域已知和/或本文他处所述的其它标记物。

在相关的实施方式中，其它双生物素化的部分可通过结合至四价复合物来连接至感兴趣的反应物。例如，与可检测标记物不同，链霉亲和素可结合至核酸条码、多肽条码或RFID标签以形成识别标签，然后连接至感兴趣的反应物。在另一个应用中，亲和或“纯化”标签经双生物素化的并且结合至链霉亲和素，该链霉亲和素用作亲和试剂，用于捕获与链霉亲和素结合的生物素化的感兴趣的反应物的。在某些优选的实施方式中，亲和标签是固定在磁体附近的磁珠或与表面上的抗原结合的抗体。将亲和标签分别固定于例如磁体或抗原包被的表面允许去除混合物的不与链霉亲和素结合的组分，即不是感兴趣的反应物的那些。其它类型的纯化标签包括，但不限于FLAG标签、反应性部分(例如，巯基或SNAP标签标记物)。在其他实施方式中，包含2个可及的结合位点的这类标记试剂(或亲和标签或识别标签)用于双重目的，例如，用于共定位2个单生物素化的反应物并标记该共定位的对。例如，参考图1，非反应性组分可以是标记物(或其它标签)，其中2个反应物不仅共定位，而且还连接到标记物或标签，例如用于追踪、定量、分离、识别等。在其它实施方式中，非反应性组分可以是固定化标签，例如，直接或间接与固体表面结合的试剂。在这类实施方式中，感兴趣的反应物可在四聚体复合物固定之前或之后结合至复合物。

在本发明的另一个方面，通过在2个反应物上提供双生物素标签并将两者同时或依次结合至四价复合物来提供2个反应物的共定位。图3提供了示例性的说明，其中反应物1结合至链霉亲和素二聚体之一的2个结合位点，而反应物2结合至另一个二聚体上的2个结合位点。该图显示了带有分支的生物素化标签的反应物1和带有线性生物素化标签的反应物2，但是该方法也可在同时带有线性标签或同时带有分支的标签的情况下操作。在反应物之间的直接相互作用是复合物目标的情况中，对将反应物与其组分标签连接的接头的长度进行设计以提供充分的移动以允许该相互作用。例如，在一个反应物是辅因子或底物而另一个反应物是酶的情况中，接头足够长以允许反应物之间的生产性相互作用，例如，以促进酶活性。类似地，在反应物将直接接合在一起，例如，接合标签(反应物1)与感兴趣的分子(反应物2)的情况中，接头足够长以允许反应物在促进接合的构造中互相取向。由于2个反应物使用全部4个结合位点，加生物素或加双生物素标签的标记物也不能结合至链霉亲和素的二聚体上的生物素结合位点，但是标记物或其它标签可通过本领域已知且常规的方法连接至复合物中的其它位点(例如，链霉亲和素四聚体的其它区域)。

图4提供了另一种使用四价复合物以1:1的化学计量将2种反应物连接在一起的方法的说明性示例，其中一种反应物经三生物素化而另一种反应物经单生物素化。由于在链霉亲和素四聚体上只有4个结合位点，只有一个各类型的生物素化的试剂可结合至单个四聚体。哪种试剂具有三生物素标签而哪种具有单生物素标签取决于实施者的需要以及各自强且稳定结合的要求。例如，在试剂之一存在下发生后续反应的情况中，可选择该试剂是加单生物素标签的试剂使得在反应期间解离之后试剂的另一分子容易用于结合开放的结合位点。在优选的实施方式中，三生物素化的试剂首先结合至链霉亲和素。这种顺序确保仅一个单生物素化的试剂结合，因为在三生物素化的试剂结合之后只有一个可及的结合位点。如上述实施方式，反应物可以是可经受这种生物素化的任意反应物，如核酸、蛋白质、药物、糖、辅因子、可检测标记物、亲和标签、识别标签、固定试剂等。

高度带负电或带正电的蛋白质(也称为“超带电”蛋白质；参见例如Thompson等，2012,Methods Enzymol.503:293-319，其通过引用全文纳入本文用于所有目的)在折叠、没有聚集、和被细胞摄取(在带正电的蛋白质的情况中)上有优异性质。在某些方面中，本发明提供了“超带电”大分子复合物，其具有许多与超带电蛋白质类似的有用性质。在某些优选的实施方式中，高度带电的部分经双生物素化并且结合至链霉亲和素四聚体以留下2个开放的结合位点。实施者希望连接到高度带电部分的感兴趣的反应物，例如，蛋白质、核酸、小分子、标记物或任意其它试剂也经双生物素化并结合至2个开放的结合位点。这种构造提供了高度带电部分与感兴趣的反应物之间1:1的化学计量。在替代的实施方式中，高度带电部分和/或反应物上的生物素数量可变化。替代地或另外，多个单生物素化的反应物和/或高度带电部分可结合至复合物。例如，高度带电的部分可经双生物素化，而2个结合的反应物各自仅具有单个生物素标签，反之亦然。在某些优选的实施方式中，高度带电部分是高度带负电的部分，如聚磷酸酯链。例如，考虑到与链霉亲和素连接的双生物素，高度带负电的聚磷酸酯基团是非常稳定的。

如上所述，虽然所述内容主要关于与生物素化的试剂结合的链霉亲和素四聚体，普通实施者会清楚可用中性抗生物素蛋白、中性亲和素以及本文所提及和本领域已知的对生物素有高亲和性的其它多价分子来代替链霉亲和素。参见，例如，Takakura等，(2009)FEBS Journal 276:1383-1397，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。替代地，其它高亲和性结合伴侣(例如，链肌动蛋白和strep-标签肽)可取代链霉亲和素-生物素组合。此外，在复合物打算将可检测标记物连接至单个生物素化的反应物的情况中，生物素化的反应物可包括4个生物素标签，其占据链霉亲和素(或其它多价生物素结合伴侣)的全部4个结合位点，其中标记物在不同位置连接至链霉亲和素，例如通过表面赖氨酸，使得连接并不干扰单个四生物素化的反应物的结合。

本文所述的方法和组合物也可用于在复杂混合物中识别和定量感兴趣的蛋白质。如上所述，首先用编码生物素化肽的串联序列来克隆感兴趣的蛋白质。含有编码该蛋白质和生物素化肽的序列的细胞生长并裂解。裂解物暴露于生物素和生物素化酶以在生物素化肽处添加生物素部分，并且随后与包含连接至可检测标记物的链霉亲和素的复合物孵育。可检测标记物可经单生物素化并且结合至链霉亲和素四聚体上的一个生物素结合位点，或者可以不封闭任意生物素结合位点的方式连接至链霉亲和素(例如，“体标记的(body-labeled)”)。图5提供了该方法的说明性示例，其显示双生物素化的感兴趣的蛋白质(蛋白1)如何结合与体关联标记物结合的链霉亲和素(即连接至链霉亲和素四聚体上非生物素结合位点的部分)，而非特异性蛋白质仍然没有结合(蛋白2、3和4)。然后裂解物在SDS(十二烷基硫酸钠)或其它合适的去污剂存在下，在90℃下孵育20分钟，并随后经电泳。只有具有串联的结合的生物素(即，结合至四聚体中链霉亲和素二聚体之一上的2个生物素结合位点的双生物素)链霉亲和素四聚体保持四聚体。没有双生物素结合的那些链霉亲和素四聚体通过严苛处理大多数瓦解成单体。虽然存在以下关于通过生物素热稳定化链霉亲和素的文献，这种发现还是令人惊讶的结果，因为普通技术人员不会预期一个双生物素标签与链霉亲和素四聚体的一个二聚体的结合在如此极端的条件下稳定化整个四聚体。例如，Holmberg等报告了生物素-链霉亲和素相互作用可在温度超过70℃的非离子型水性溶液中被破坏(Electrophoresis 2005,26:501-510)，并且Xia等显示了实验，其中取决于计算方法，溶液中大约一半的链霉亲和素四聚体在70℃下在仅仅约9±1至11±2分钟之后解折叠(Biochemistry(2012)51:100-107)，这两篇通过引用全文纳入本文用于所有目的。单个双生物素化的反应物在SDS存在下，可于90℃出乎意料地稳定链霉亲和素四聚体20分钟，在本文的实施例中提供了揭示这种意外的结果的实验具体细节。剩余的链霉亲和素四聚体的浓度与裂解物中感兴趣的蛋白质的量呈正比并且可通过标准扫描技术定量，该技术检测在对应于四聚体链霉亲和素的条带中存在的标记物的量。即，存在的标记物的量与存在的四聚体的量呈正比，其与裂解物中存在的感兴趣的蛋白质的量呈正比。胶上其它条带中存在的标记物代表与在SDS高热孵育期间瓦解的链霉亲和素结合的标记物。任选地，为了确保体标记的四聚体与双生物素化的蛋白质(其可结合2个二聚体)之间1:1的化学计量，在暴露于细胞裂解物之前，可例如使用单生物素化的非反应性组分来封闭链霉亲和素二聚体之一上的1个或2个生物素结合位点。替代地，在胶分析期间，具有2个结合的蛋白质的复合物会在分开的条带中迁移，并且会计算在迁移较慢的条带中蛋白质的量以计算各条带的2个蛋白质。在使用单生物素化的标记物的实施方式中，标记物本身可用于封闭双生物素化的蛋白质与2个二聚体之一的结合，使另一个二聚体可用于结合。任选地，非反应性单生物素化的组分可结合至标记物结合的二聚体的第二结合位点。更优选地，使用纯化方法，例如，基于质量的方法以确保标记的链霉亲和素在结合感兴趣的蛋白质之前仅结合一个单生物素化的标记物。另外，在2种标记物的存在可检测地改变了复合物迁移的情况中，不需要额外的纯化步骤，因为分析对应于双标记的复合物的条带中感兴趣的蛋白质的量以考虑到单个蛋白质对应于该条带的2种标记物。

在替代的实施方式中，与链霉亲和素结合的可检测标记物通过双生物素标签在2个结合位点处结合。这种模式提供了感兴趣的蛋白质和染料之间更明显的1:1化学计量，其改善了对四聚体条带中存在的蛋白质的量的计算，因为对于感兴趣的蛋白质而言只有2个结合位点可及确保了只有一个蛋白质会结合到链霉亲和素四聚体。这种策略需要稍复杂的胶分离步骤，因为双生物素化的标记物会在高热去污剂孵育期间将四聚体保持在一起，无论是否结合感兴趣的蛋白质。图6说明了合适的胶分离策略的一个实施方式，其显示了2种链霉亲和素四聚体复合物：一种仅结合双生物素化的染料，而另一种结合双生物素化的染料和双生物素化的感兴趣的蛋白质(蛋白质1)。也显示了非特异性“污染”蛋白质(蛋白质2)。电泳之后，胶会显示对应于这2种染料标记的复合物的2个条带。如果包含感兴趣的蛋白质的复合物在胶上迁移至不同位置处，实施者可易于区分应分析哪个条带以测量该蛋白质的量。然而，如果这2种复合物一起迁移或互相非常靠近，在凝胶电泳之前可进行额外的结合步骤以更好地分开这2种复合物的迁移。在某些优选的实施方式中，向混合物中加入第三双生物素化的非反应组分(NRC)。由于只有缺少感兴趣蛋白质的复合物具有可及的任意结合位点，这种第三双生物素化的NRC将仅结合该复合物。NRC导致缺少蛋白质1的复合物的迁移明显不同于包含蛋白质1的复合物，例如，更慢或更快。结果，电泳将提供这2种复合物的分开，并且可对包含感兴趣的蛋白质的复合物进行定量以确定其在混合物中的量。在替代的实施方式中，彻底改变缺少感兴趣的蛋白质的复合物的迁移不同，NRC也可以是猝灭来自标记物的信号的猝灭部分，使得缺少感兴趣的蛋白质的复合物对后续检测和分析而言“不可见”。猝灭分子是熟知的并且易于在本发明所涉及的领域中得到。

除了化学计量的优点以外，使用加多生物素标签的分子的另一个益处在于与链霉亲和素的结合比加单生物素标签的分子更紧密且更稳定，即，稳定性超过2倍。如此，在需要2种反应物与链霉亲和素的高稳定性结合的情况中，优选使用加双生物素标签的分子。替代地，增加的稳定性对分子中的第一个更重要而基于单生物素的稳定性对第二个分子足够的情况中，优选在第一分子上使用三生物素标签(如本文他处所述)且在第二分子上使用单生物素标签。不希望受到理论的限制，稳定性增加的一个可能原因是双生物素标签与链霉亲和素四聚体结合的亲合力。在蛋白质中，亲合力是多种键相互作用的组合强度。亲合力是键亲和性的组合协同强度而不是键的总和。如此，单个生物素部分与链霉亲和素上的生物素结合位点的解离之后迅速再结合，这是因为释放的生物素紧邻，其通过仍然结合的生物素部分有效拴在链霉亲和素分子上。如此，大多数时间中，结合至少一个生物素，并且如果没有结合，则非常接近且可能迅速重新结合。只要2个生物素不同时解离，就能保持双生物素与链霉亲和素的结合。

在某些方面中，提供方法用于产生主要包含仅结合单个双生物素化的反应物且具有2个游离生物素结合位点的链霉亲和素的制剂。在优选的实施方式中，通过使用离子交换柱纯化方法来从包含2种双生物素化的反应物的复合物中分离包含单一双生物素化的反应物的链霉亲和素复合物。例如，在双生物素化的反应物是带负电的染料分子的情况中，染料上的电荷促进了在离子交换柱上的制备，因为结合2个染料的复合物将会具有明显更多的与它们结合的负电荷。使用含乙腈的缓冲剂的线性梯度来洗脱复合物，并且收集并浓缩包含单个双生物素化的反应物的链霉亲和素复合物的部分。在本文的实施例部分中提供了详细的方案。可储存不含所需复合物的部分并且直接(如在没有结合的双生物素化的反应物的链霉亲和素复合物的情况中)或在剥离任何剩余的双生物素化的反应物之后在未来的制备中再利用。

在本发明的另一个方面中，提供了用包含双生物素化的标记物的四聚体复合物来标记反应物的试剂盒。本发明还包括可用于通过所需化学计量(优选1:1的化学计量)的四聚体复合物连接2种单独的反应物的试剂盒，这2种反应物可以是相同或不同的。在某些实施方式中，这类试剂盒包含链霉亲和素(或其它四聚体，生物素结合复合物)和双生物素化的标记物，如质量标记物、自旋标记物或荧光染料。替代地，这类试剂盒包括已经与四聚体复合物结合的双生物素化的标记物。试剂盒的其它组分可包括适于将生物素化序列克隆到感兴趣的蛋白质的基因中的宿主细胞，并且优选从感兴趣的蛋白质中得到表达；和与固体支持物偶联的四聚体复合物；生物素化酶如纯化的BirA。还任选包括方法各方面的说明书，例如使用这些试剂盒分析和纯化表达的蛋白质、纯化包含单个双生物素化的标记物的四聚体复合物、和分析细胞裂解物中感兴趣的蛋白质的量的说明书。优选地，宿主细胞可表达生物素化酶。任选地，试剂盒中可提供在转化到宿主细胞时导致生物素化酶的产生或过量产生的多核苷酸，或者试剂盒所提供的宿主细胞已经修饰以产生或过量产生生物素化酶。然而，对于一些应用，宿主细胞中没有生物素化酶是有优势的。例如，试剂盒使用者偏好在体外生物素化表达的融合蛋白。

III.应用

已经在上述的实施方式中描述了方法和组合物的各种应用。例如，包含双生物素化的标记物(例如，荧光染料)的四聚体复合物是双生物素化的感兴趣的反应物的非常有效的标记试剂。该方法教导了如何从双重标记的复合物中纯化标记物-四聚体复合物。纯化的复合物高效地结合至双生物素化的感兴趣的反应物，并且所得的复合物有效地将标记物连接至高度稳定的复合物中的反应物。

同样如上所述，共定位2个反应物(2个相同的反应物或2个不同的反应物)也是本发明的高度有益的应用。本文提供的组合物可提供不同蛋白质，如协同作用的酶的共定位。这可发挥功能以提供与常规融合蛋白性质类似的“假融合蛋白”，但其可以快得多的速度组装而不需要将2种蛋白质克隆在一起。这种酶的示例包括，但不限于聚合酶和核酸修饰酶(例如，修复酶、拓扑异构酶、甲基转移酶等)。有益地共定位的其它反应物是参与相同代谢途径，例如合成生化途径的那些。另外，一些反应得益于具有较高浓度的具有保护性功能的组分，例如，在降低激发光照下对反应组分的破坏的那些。在其他实施方式中，共定位反应物以增强它们之间的反应动力学，例如，作用于酶底物的酶，并且这可提供酶促途径的巩固和/或加速。结合相互作用也得益于结合伴侣，例如抗体-抗原对、受体-配体对等的共定位。也可使用本文所述的方法和组合物通过确保与与之相互作用的蛋白质的活性位点的共定位来强化用于门选生物分子反应的刺激相应聚合物的活性，例如，Shimoboji等，(2001)Bioconjugate Chem.12:314-319所述，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

该组合物也可用于通过使用双生物素化的寡核苷酸(例如，探针或引物)富集特定感兴趣序列的核酸混合物来“钓出”混合物中的特定序列。设计寡核苷酸以与核酸混合物中感兴趣的序列互补。优选地，核酸混合物在暴露于双生物素化的寡核苷酸之前片段化。在特别优选的实施方式中，片段化是专门为了确保所需核酸中的连续序列与寡核苷酸互补。在一些实施方式中，片段化提供了与靠近或位于5’端的寡核苷酸的部分互补的3’端。在促进退火的条件下将片段化的核酸混合物暴露于双生物素化的寡核苷酸之后，使用聚合酶来延伸寡核苷酸，从而加强寡核苷酸(现已延伸)和感兴趣的样品核酸之间的相互作用。将延伸的寡核苷酸/样品核酸固定能允许去除混合物中的其它核酸，从而分离感兴趣的序列并提供富集这些序列的混合物。在去除非特异性序列之后，还可进一步分析剩余的核酸。例如，可从双生物素部分中移去延伸的寡核苷酸和样品核酸之间的双链体并经过测序反应、扩增和/或克隆。替代地，延伸的寡核苷酸或所选的样品核酸中只有一个经过进一步分析，例如单链测序、扩增等。在相关的实施方式中，也使用其它类型的亲和对。例如，在某些实施方式中，寡核苷酸包含2个链霉亲和素结合适体而不是双生物素部分，如本文他处所述。与双生物素部分类似，任选地在寡核苷酸延伸之后，使用2个适体来固定并分离感兴趣的样品核酸。

在某些方面中，本发明提供了使用具有核酸标签或“条码”的链霉亲和素分子检测2个生物素化的(优选双生物素化的)蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的方法。在优选的实施方式中，第一双生物素化的蛋白质与第一标签标记的链霉亲和素分子结合，而第二双生物素化的蛋白质与第二标签标记的链霉亲和素分子结合。现在连接至加标签的链霉亲和素分子的这2个蛋白质在促进它们之间的相互作用，例如共价或非共价结合、催化相互作用或导致它们永久或暂时共定位的其它相互作用的反应混合物中合并。反应混合物也包括连接酶并在蛋白质结合到链霉亲和素时促进2个标签的游离末端的连接。图7提供了说明性实施方式，其中蛋白质1和蛋白质2各自通过双生物素连接结合至不同的链霉亲和素。结合至蛋白质1的链霉亲和素包含核酸标签，标签1；而结合至蛋白质2的链霉亲和素包含核酸标签，标签2。这些蛋白质之间的相互作用导致标签的定位，其在末端连接在一起。随后在切割位点(各自用星号表示)处切割标签将它们从双生物素标签上释放，并且连接的标签可经进一步处理，例如通过扩增、环化、测序、基于凝胶的分析等。

连接事件的检测用作2种蛋白质相互作用的代替物。例如，在各标签在远离发生连接的标签末端的远末端处有不同的引物结合位点的情况中，连接在一起的标签是指数扩增的模板，例如，通过PCR；没有连接的标签不可进行指数扩增，因为它们仅有一个引物位点。产物扩增可通过基于凝胶的方法来检测，或者可经过核酸测序反应。优选确定实际序列而不是仅扩增产物的尺寸，因为这使得实施者将多个不同的蛋白质与多个不同的标签组合，并且使用扩增的产物的序列来识别多个蛋白质中哪些互相结合。在一些实施方式中，核酸标签是单链的并且通过使用与标签的末端互补的“夹板(splint)”寡核苷酸来促进连接，其中寡核苷酸与标签的结合将标签的末端引至高效连接的位置上。在其它实施方式中，核酸标签是双链的并且通过标签的互补突出端来促进连接。在某些实施方式中，例如，通过内切核酸酶消化来从蛋白质上释放连接的标签，并在进一步分析之前环化。对于通过连接2个单链标签形成的单链构建体，以多种方式完成环化，例如，通过连接切割端，例如，使用上述的夹板寡核苷酸；或通过合成互补链并将茎环适体接合到产生的双链末端。类似地，对于通过连接2个双链标签形成的双链构建体，通过内切核酸酶反应形成的双链末端可直接连接在一起以形成双链环构建体，或者可连接至茎环适体以形成单链环构建体。不同蛋白质上的标签的差异也可超过它们的规范碱基序列。例如，在一些实施方式中，标签包含随后可在测序反应期间检测到的修饰的碱基。测序反应期间检测修饰的碱基的方法是本领域已知的，并且描述于国际专利申请公开号WO2012065043，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

本发明的双生物素化的化合物也在医药科学中发现应用，通过提供链霉亲和素和感兴趣的试剂之间非常稳定的连接，其中该试剂待保留在肾脏中持续数天，例如以治疗肾脏疾病。在身体中，链霉亲和素在肾脏中积累并观察到在小鼠、大鼠和兔的肾脏中保留3-4天。积累可包括15-20％剂量的注射的链霉亲和素，并且远大于其它测试组织中的任何积累。(参见，例如，Schechter等，(1995)Kidney International 47:1327-1335，其通过引用全文纳入本文用于所有目的)。如此，可使用链霉亲和素来递送对肾脏有特异性的试剂，并且这类试剂可包括药物、化疗剂、放射性同位素等。在某些方面中，本发明提供了通过双生物素连接与链霉亲和素连接的这类配体，其提供了更好地控制向肾脏递送的试剂的剂量的益处。此外，其提供了通过将2种试剂各自的一个连接至待导入的各链霉亲和素分子来确保向肾脏递送1:1化学剂量的2种不同试剂，并且双生物素连接的更高稳定性确保了2种试剂在通过链霉亲和素分子运送到肾脏时保持结合。

本发明的双生物素化的化合物的另一个应用包括向器官内的目标位置递送各种试剂，例如，用于成像/治疗诊断的可检测标记物、小分子治疗剂、靶向肿瘤的细胞毒性试剂等。先前已经使用单生物素化的化合物进行这些类型的应用，例如，参见美国专利公开号20110014151和20130052130，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。使用双生物素标签代替之前使用的单生物素的策略将增加这些递送试剂的稳定性，从而改善这些应用的各个方面，包括增加向靶位置递送的试剂的总量和减少在非靶位置中从复合物中解离潜在危险的载荷(例如，细胞毒素)的量。

本文所述的方法和组合物也可用于探索细胞信号传导系统。例如，可在单分子复合物水平上通过将各分子中的一个连接至链霉亲和素分子从而使它们在一起并促进它们之间的相互作用来研究2种分子组分之间的信号传导。类似地，也可以这种方式探索天然中没有相互作用的2种细胞组分之间的相互作用。此外，可使用链霉亲和素聚合物来共定位甚至更多的细胞组分，在单个反应位点处在单个链霉亲和素支架上产生包含多个不同组分的信号网络。此外，可通过改变它们在支架内的位置来测试这些组分之间的空间关系。将这类化合物导入细胞中使得能够在体内测试细胞功能、生长、分裂、死亡等的形态。这也提供可处于特定目的对细胞进行工程改造的机会，其中导入的信号传导途径向细胞或待导入细胞的生物体提供益处。这类工程改造的细胞可以是治疗性细胞，或者可以是处于生物技术目的工程改造的细胞，例如，生产燃料、清除污染、生产商业上有价值的分子(例如，药物、抗体等)。参见，例如，Wei等，(2012)Nature 488:384-388；和Sattely等，(2008)NaturalProduct Reports,25:757-793，两者通过引用全文纳入本文用于所有目的。

本文的方法和组合物也可用于富集感兴趣基因座的核酸混合物。在某些优选的实施方式中，包含双生物素标签的寡核苷酸与感兴趣的基因座内的核苷酸序列互补。寡核苷酸与感兴趣的基因座的特异性杂交以及寡核苷酸通过双生物素标签的固定允许去除核酸混合物中的其它基因座，从而针对感兴趣基因座富集混合物。在混合物包含双链片段，例如基因组DNA的情况中，核酸一般在暴露于双生物素化的寡核苷酸之前变性。优选地，选择双生物素标签的位置以确保在结合至感兴趣的基因座之后寡核苷酸的3’末端可用作引物。这使得在去除非特异性核酸之前延伸引物，从而向感兴趣的基因座提供更强的连接。另一种益处是产生例如通过内切核酸酶消化来从双生物素标签中去除，并且可经进一步分析的双链分子。在某些实施方式中，双链分子的末端用适体加帽，例如，具有引物结合位点的适体和/或茎环适体，以允许分子的扩增和/或测序。双生物素标签可固定到包含生物素结合试剂，例如链霉亲和素和本文所述的其它试剂的任意固体表面，并且这种表面包括珠、阵列、柱等。

本文所述的双生物素标签可用于改善在Ringler和Schulz(2003)Science302,106-109所述的表面上的链霉亲和素晶体的二维有序阵列的组装。使用双生物素化的链霉亲和素使得这类阵列对例如热等更稳健。此外，相比相邻的分子凭借与生物素连接的2个臂而放置的情况，接合至链霉亲和素四聚体中的2个点将提供更好的控制。可通过利用由双生物素连接提供的替代性化学计量来实现其它优势。

双生物素连接也适用于镧系-链霉亲和素标记方法，该方法用于通过金属螯合的医学成像的应用，描述于Aime等，(2006)Coordination Chemistry Reviews,250(11–12),2006,1562-1579，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。它们也可用于改善Howarth和Ting的用于通过在细胞表面提供双生物素连接来对或细胞中的蛋白质进行成像的方法，这种连接可以比他们所述的单生物素标签更高的稳定性结合链霉亲和素的二聚体。此外，在链霉亲和素另外偶联至感兴趣的双生物素连接的感兴趣的生物物理探针(例如，荧光团或量子点)的情况中，与单生物素标记的探针相比，改善了该方法的另一个方面。参见，例如，Nature Protocols(2008)3(3):534-545，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

此外，本文所述的双生物素连接有益于Chivers等，(2010)Nat.Methods 7(5):391-393中所述的方法，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。该文章的作者鉴定了一种突变链霉亲和素，捕集亲和素，其显示出慢约10倍的解离速率、增加的机械强度和改善的热稳定性。它们还证明了动力蛋白FtsK可从DNA上剥离蛋白质，从生物素化的DNA上快速置换链霉亲和素；捕集亲和素抗拒置换并因此表明由FtsK移位生成的力。双生物素连接的更高稳定性将进一步稳定化DNA(或其它反应物)与捕集亲和素(以及链霉亲和素)的结合。例如，双生物素连接将增加对动力蛋白沿着生物素化的DNA分子运行所带来的置换的抗拒。

在其它方面中，本文提供的双生物素连接可与由Howarth实验室开发并在以下文献中描述的SpyTag/SpyCatcher系统联用，例如，Zakeri等，(2012)“Peptide tag forminga rapid covalent bond to a protein,through engineering a bacterial adhesin(通过对细菌粘附素的工程改造，肽标签形成与蛋白质的快速共价结合)”PNAS 109(12):E690-7；Schoene等，(2014)Angew.Chem.Int.Ed.53:1-5；Zhang等，(2013)J.Am.Chem.Soc.135:13988-13997；和Fierer等，(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA E1176-E1181，其各自通过引用全文纳入本文用于所有目的。简而言之，细菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)具有纤连蛋白结合蛋白FbaB，其含有在赖氨酸残基和天冬氨酸残基之间的自发性异肽键的结构域。Howarth实验室分割该结构域并且使用片段来对2个肽“SpyTag”和“SpyCatcher”进行工程改造。这些单独的肽仍然能够高效形成共价酰胺键，并且用于在包含SpyTag肽和SpyCatcher肽的麦芽糖结合蛋白融合物之间产生分子间键合。

在本发明的某些实施方式中，以新的多重策略使用SpyTag/SpyCatcher系统将反应物偶联至多个双生物素标签。一般机制是将多个SpyTag偶联至单个反应物，并且然后将该反应物-(SpyTag)_n暴露于SpyCatcher，其各自偶联至双生物素标签。这样，反应物提供了多个双生物素标签用于结合至例如亲和素或链霉亲和素。链霉亲和素可在SpyTag和SpyCatcher之间的共价键形成之前或之后结合至双生物素标签。例如，在优选的实施方式中，反应物是与多个SpyTag融合的蛋白质。该蛋白质可以是酶促或非酶促的，并且在优选的实施方式中，是包含聚合酶和多个SpyTag的融合蛋白。工程改造融合蛋白的方法是本领域常规的并且是普通实施者所熟知的，例如，Horton等，(1989)Gene 77(1):61-8，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。虽然一般由实施者基于构建体的目标应用来确定与反应物融合的SpyTag的数量，该数量的范围一般会是2-10个SpyTag，优选3-8个SpyTag，并且在某些优选的实施方式中是至少4个SpyTag。例如，图10提供了双生物素加标签策略的说明性实施方式，其中4个SpyTag与聚合酶融合以提供具有4个双生物素标签的最终复合物(在SpyTag和双生物素化的SpyCatcher之间形成共价酰胺键之后)。

所得的-(SpyTag)_n-(SpyCatcher+双生物素标签)_n复合物可用于各种应用。例如，在复合物中的各双生物素标签结合至链霉亲和素四聚体的情况中，复合物可固定在表面上，该表面包含与四聚体的开放结合位点结合的部分，例如表面上的生物素或双生物素部分。如本文他处所述，考虑的表面包括但不限于珠、微阵列、柱、半固体表面、波导基材、纳米孔内(例如，零级波导)等。在其他实施方式中，多个链霉亲和素四聚体结合至辅助蛋白质，其在紧邻反应物时有益。例如，在反应物是酶的情况中，辅助蛋白质可用于向酶提供底物，或可进一步处理催化活性产物。在具体实施方式中，反应物是聚合酶并且辅助蛋白质是有助于从聚合酶前的单链模板中除去二级结构的单链结合蛋白质。在替代的实施方式中，反应物是聚合酶并且辅助蛋白质是解旋酶，其有助于解开聚合酶前的双链模板。多个链霉亲和素可结合辅助蛋白质在辅助蛋白质以多聚体发挥功能的情况中是特别有益的，如在单链DNA结合蛋白质的情况中。

在其它实施方式中，多个链霉亲和素分子提供了标签，例如亲和标签、可检测标签(例如，染料)等的结合位点。具体地，申请人提供了使用SpyTag/SpyCatcher系统来提供多价标记而排除靶蛋白质的交联的方法。例如，在亲和标签结合至链霉亲和素分子，例如优选通过双生物素部分的情况中，该复合物可以比仅具有单个亲和标签的复合物更高效地纯化。在其他实施方式中，多个可检测标签通过链霉亲和素分子与复合物结合。例如，双生物素化的荧光染料可结合至各链霉亲和素分子。在一些实施方式中，染料全部都是相同的染料，从而增加了在用合适的激发波长照射后来自复合物的总发射。替代地，可选择染料使得它们中的2个或更多个之间出现能量转移，例如，在荧光共振能量转移(FRET)的情况中。如此，复合物中的一个或多个染料可以是相同的染料，并且一个或多个染料可以是不同的染料。可以各种方式组装该复合物。在一些实施方式中，双生物素化的染料在链霉亲和素结合至双生物素化的SpyCatcher肽之前结合至链霉亲和素，并且所得的复合物随后结合至待SpyTag的蛋白质，如图11所示。在其它实施方式中，双生物素化的SpyCatcher肽首先结合至蛋白质-SpyTag融合物，并且在共价键合形成之后，链霉亲和素结合至双生物素。另一种双生物素化的部分(例如，标签)在链霉亲和素结合至双生物素化的SpyCatcher肽之前或之后结合至链霉亲和素。虽然本发明主要涉及SpyTag肽，但是也可使用与SpyTag相关的蛋白质，并且文献中已经公开了这类蛋白质。参见，例如，Takakura等，(2009)FEBS Journal 276(5):1383-97，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

本文所述的方法和组合物的其它应用包括在用生物素结合试剂如链霉亲和素、亲和素、捕集亲和素等包被的表面上的单细胞成像中的应用。这类单细胞试验的成像描述于Zareh等，(2011)Microscropy Research and Technique 74:682—687，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。使用双生物素化的反应物增加了与包被的表面结合的稳定性，从而促进在溶液中检测反应物。

根据本文的教导，所述方法和组合物在本文所述的应用和本领域的其它应用中的益处将对于普通技术人员而言是清楚的。例如，双生物素标签也可用于构建二维链霉亲和素阵列，其中链霉亲和素的晶体结合到空气-水界面处的生物素化的脂质单层，例如Farah等，(2001)Langmuir 17:5731-5735所述，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。使用双生物素化的脂质单层将会通过限制将链霉亲和素连接至脂质单层的共价键的数量来对这类二维蛋白质阵列的形成进行额外控制。它们也在细胞表面展示应用中通过增加细胞表面上的链霉亲和素复合物的稳定性和寿命提供了类似的优点，例如Furukawa等，(2006)Biotechnol.Prog.22:994-997所述，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

本领域技术人员从上述描述中认识到本发明向在各种应用中使用双生物素化的标签提供了许多优点和比现有技术方法更多的应用。双生物素相互作用的高结合亲和性也向标记、定位、检测、固定和纯化方法提供优点。如上述公开所理解，本发明具有广泛的应用。因此，会理解以说明的方式提供了上述的描述和以下的实施例，并不旨在限制或局限。

本申请公开的各种实施方式和可对本发明进行的修改对本领域技术人员而言应该是显而易见的，包括但不限于本发明的多个方面的组合，而不偏离本发明的范围和精神。因此，本发明的范围不应参照以上的说明决定，而应参照所附权利要求及其等同方案的全部范围决定。除非上下文中明显或明确表示，本文提供的任何浓度值一般以混合值或百分比的形式给出，而没有关于在加入混合物的特定组分时或之后的任何转化。出于说明和公开可与本发明关联使用的试剂、方法和概念的目的引用本文所有的出版物。本文并不旨在理解为承认这些参考文献相对于本文所述的发明是现有技术。在本发明中，参考多个专利、专利申请和公开。除非另外说明，各自出于所有目的通过引用纳入。

IV.实施例

纯化

在某些方面中，提供了从双重双生物素化的链霉亲和素(即，与2个双生物素化的分子结合使得所有4个结合位点被双生物素占据并且没有结合位点是开放的)和所有结合位点都未被占据的链霉亲和素中纯化双生物素化的链霉亲和素(即，与单个双生物素化的分子结合的链霉亲和素，使得2个结合位点被双生物素占据而2个结合位点开放)的方法。在某些优选的实施方式中，离子交换色谱提供了分离通过双生物素化的分子与链霉亲和素混合形成的不同复合物的方式。例如，该方法在分离包含带电基团，例如带负电的染料分子的链霉亲和素复合物时是特别有效的。

如下进行对结合至链霉亲和素的单个双生物素染料部分的典型离子交换纯化(例如，图2所示的标记试剂)。1ml等份的10mg/ml溶液(10％甘油，50mM KOAc，5mM Tris pH7.4)的重组链霉亲和素融化并置于5ml管中。向4ml的缓冲液A(5mM Tris HCl pH 7.4，20％乙腈)中加入双生物素染料至18.75μM的终浓度。在250μl等份中，通过反复移液向浓缩的链霉亲和素中加入稀释的染料以混合，每次加入使用新的移液管直至2种溶液完全合并(向浓缩的酶中加入稀释的染料有利于形成单个染料结合的物质)。然后将所得的5ml溶液加载到装载了MonoQ_10/100_GL离子交换柱的10 FPLC的5ml进样环中。使用20个柱体积的从5％缓冲液A到50％缓冲液B(5mM Tris HCl pH 7.4,20％乙腈，2M NaCl)的线性梯度来纯化样品。收集2ml部分同时监测254、280和542nm处的波长。一般的色谱如图8所示。收集含有连接到单个双生物素染料的链霉亲和素复合物的部分并使用4ml超旋浓缩器(30K)浓缩，将样品在5mM Tris HCl pH 7.4的溶液中稀释至4ml并随后再浓缩以交换缓冲液。

链霉亲和素四聚体稳定化

证明结合至链霉亲和素四聚体的单个双生物素标签能稳定化四聚体，即使是在高温下持续长时间然后在去污剂存在下进行电泳的极端条件下。在一次实验中，27μl的上样缓冲剂加入包含结合至链霉亲和素四聚体的生物素化的聚合酶的3μl蛋白质样品中。混合物在90℃下加热持续20分钟，并且将10μl的各所得混合物加载到SDS-PAGE凝胶上，并且按照标准方案用Ruby染色。图9提供了一块示例性高通量聚合酶筛选凝胶的图像。编号为1-11的泳道各自含有不同的聚合酶。大多数连接至单个生物素标签，但是命名为3和6的2个具有双生物素标签。凝胶的右侧鉴定了各条带。最低的条带仅含有在严苛处理期间从四聚体解离的链霉亲和素单体。中间条带是也从链霉亲和素四聚体解离的聚合酶。保持完整的2种复合物显示为凝胶上跑得最高的2个条带。各“超迁移的”条带包含与双生物素化的聚合酶之一结合的链霉亲和素。超迁移的条带仅显示于双生物素化的聚合酶-链霉亲和素复合物的事实表明双生物素策略的优异稳定性。在所有其它情况中，链霉亲和素四聚体和单生物素化的聚合酶变性并分离。

在单链霉亲和素复合物中单生物素连接与双生物素连接的比较

使用复合物来证明与链霉亲和素的双生物素连接相比单生物素连接更高的稳定性，该复合物包含链霉亲和素分子，其四聚体中有一个二聚体与双生物素化的荧光染料结合，并且另一个二聚体结合2个单独的包含多核苷酸聚磷酸酯(也称为“碱基簇”)的单生物素化的化合物。这类碱基簇，以及包含链霉亲和素、染料和碱基簇的复合物的示例详细描述于2013年2月14日提交的美国专利申请号13/767,619，并且其通过引用全文纳入本文用于所有目的。浓度为57μM的复合物与5mM Tris，pH 7.4中10x过量的游离生物素孵育。游离生物素用于在与染料或碱基簇连接的生物素部分解离时占据链霉亲和素复合物上的空生物素结合位点。时程运行900分钟并且对5、10、20、40、220和900分钟处取的30μl时间点进行快速冷冻。在时程运行完之后，将时间点在5mM Tris，pH 7.4中稀释到500μl。然后向analytica MonoQ^TM阴离子交换柱(1mM)中注射样品并按照生产商的说明书(瑞典乌普萨拉的GE医疗保健公司(GE Healthcare，Uppsala，Sweden))使用缓冲液A(5mM Tris，pH 7.4；20％乙腈(CAN))和缓冲液B(5mM Tris，pH 7.4；2M NaCl；20％ACN)进行分析。结果显示，单生物素化的碱基簇之一易于解离，半衰期为2小时，而双生物素化的染料在该时程中并没有从复合物中明显解离。有趣的是，第二碱基簇也没有明显解离，并且虽然不希望受到理论限制，这种发现表明2个单生物素化的碱基簇与链霉亲和素复合物的结合存在一些负协同，可能是由于基于电荷和/或位阻的干扰。

Claims (16)

1.一种组合物，其包含：在N-末端或C-末端有两个串联生物素连接酶识别序列的蛋白质，所述生物素连接酶识别序列各自具有与之共价连接的生物素部分，所述的两个生物素连接酶识别序列和两个生物素部分一起形成第一双生物素标签；固体支持物，所述固体支持物与第二双生物素标签共价偶联，所述第二双 生物素标签指与所述固体支持物连接的两个共价连接的生物素；和四价生物素结合试剂，所述两个双生物素标签结合所述四价生物素结合试剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质是聚合酶。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述固体支持物是珠。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述固体支持物是阵列。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一双生物素标签中的两个生物素部分分隔20-60埃。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述四价生物素结合剂是亲和素。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述四价生物素结合剂是链霉亲和素、去糖基化的亲和素、捕集亲和素或抗生物素蛋白。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述四价生物素结合试剂是链霉亲和素四聚体。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述链霉亲和素四聚体包含第一链霉亲和素二聚体和第二链霉亲和素二聚体，所述第一链霉亲和素二聚体结合至所述第一双生物素标签的两个生物素部分，所述第二链霉亲和素二聚体结合至所述第二双生物素标签的两个生物素部分。

10.一种共定位蛋白质与固体支持物的方法，所述方法包括：

a)提供在N-末端或C-末端有两个串联生物素连接酶识别序列的蛋白质，所述生物素连接酶识别序列各自具有与之共价连接的生物素部分，所述的两个生物素连接酶识别序列和两个生物素部分一起形成第一双生物素标签；

b)将固体支持物共价连接至第二双生物素标签，所述第二双 生物素标签指与所述固体支持物连接的两个共价连接的生物素；

c)将所述蛋白质结合至四价生物素结合试剂，从而产生包含与所述四价生物素结合试剂结合的所述蛋白质的第一复合物；并且

d)将载有所述第二双生物素标签的所述固体支持物暴露于所述第一复合物，从而产生包含与所述第一复合物结合的所述固体支持物的第二复合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述暴露固体支持物之前分离所述第一复合物。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离所述第二复合物。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述四价生物素结合剂是亲和素。

14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述四价生物素结合剂是链霉亲和素、去糖基化的亲和素、捕集亲和素、抗生物素蛋白。

15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述四价生物素结合试剂是链霉亲和素四聚体。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素四聚体包含第一链霉亲和素二聚体和第二链霉亲和素二聚体，所述第一链霉亲和素二聚体与所述第一双生物素标签的两个生物素部分结合，所述第二链霉亲和素二聚体与所述第二双生物素标签的两个生物素部分结合。