CN102112626A - 用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统 - Google Patents

Abstract

用于靶标检测的多核苷酸-编码捕获剂，特别是模块化的多核苷酸-捕获剂，以及相关的组合物方法和系统。该多核苷酸-捕获剂包括靶标结合组分，支架组分，和由能够以受控方式结合和分离的标准化分子单元形成的编码组分。

Description

用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统

对相关申请的交叉引用

本申请要求文件号为CIT-5127-P，2008年4月9日递交的题目为“用于多重细胞分类和基因及蛋白检测的统一平台”的美国临时申请No.61/123,478的优先权，其以参考方式被全文合并于此。本申请还是文件号为P017-US，2007年8月1日递交的题目为“用于检测和/或分类靶标的方法和系统”的美国申请No.11/888,502的部分延续申请，该美国申请依次要求文件号为CIT-4707，2006年8月2日递交的No.60/834,823，题目为“用于多重细胞分类和基因及蛋白检测的统一平台”的临时申请的优先权，以及要求文件号为CIT-4944，2007年7月16日递交的No.60/959,665，题目为“数字式DEAL：定量和数字式蛋白质检测免疫测定法”的美国临时申请的优先权，它们所公开的内容以参考方式被全文合并于此。本申请还可能涉及文件号P235-US，2008年7月16日递交的No.12/174,598，题目为“用于检测靶分子的微流装置，方法和系统”的美国申请，以及文件号为P262-US，2008年7月16日递交的No.12/174,601，题目为“用于检测靶分子的阵列，基质，装置，方法和系统”的美国申请，这两者所公开内容也以参考方式被全文合并于此。

政府拨款说明

依据国家卫生协会授予的拨款No.CA119347，美国政府在本发明中有某些权利。

技术领域

本文公开的内容涉及在样品(如生物样品)中检测和/或分类一个或多个靶标，特别是生物标记物。更特别地，其涉及用于检测和/或分类靶标的捕获剂和相关方法和系统。

背景技术

在生物分子分析领域，靶标，特别是生物标记物的高灵敏度检测已成为一种挑战，特别是在针对复数个靶标的检测和/或针对某尺寸的或者以低浓度存在于样品中的靶标的检测时。无论是对于病理检查还是基本生物学研究，有若干种方法通常被用于各种类别的生物材料和生物分子的检测。

一些在实验室中最通常用于单一生物靶标检测的技术包括凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，蛋白质印迹，荧光原位杂交(FISH)，荧光活化细胞分类(FACS)，聚合酶链式反应(PCR)，和酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些方法能够在生物样品(比如组织)中检测一个或多个生物标记物，并且还适用于诊断目的。

由申请人研发的连续多核苷酸编码方法提供了超越现有技术的改进，特别是，其允许对靶标进行高灵敏度和选择性多重检测。

发明内容

概述

此处提供的是多核苷酸编码的捕获剂，特别是模块化的捕获剂以及相关的阵列方法和系统，在若干实施方式中，通过可变以及通用的模块化分子工具，其容许大量靶标系列的选择性及灵敏检测。

特别地，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂包括以受控方式结合和脱开的标准化分子单元所形成的靶标结合组分，支架组分以及编码组分。相应地，在此处所述的模块化捕获剂中，不仅相同的支架可以和不同的靶标结合结构相结合，而且相同的支架也可以和复数个靶标结合结构相结合，因此显著地改进该捕获剂可完成的检测，灵敏度以及选择性。

根据第一个方面，描述了被设置为用于和靶标特异性结合的模块化多核苷酸编码捕获剂。该模块化多核苷酸编码捕获剂包括至少一个被设置为与该靶标特异性结合的结合分子，被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，以及被设置为用位置可区分的支架结合区域附着该至少一个结合分子和该编码多核苷酸的支架分子。在该支架分子中，该位置可区分的支架结合区域被布置为，依据该至少一个结合分子以及该编码多核苷酸的结合，可以有至少一个用于和该靶标特异性结合的结合分子，以及用于和该基质多核苷酸特异性结合的该编码多核苷酸。

根据第二个方面，公开了在样品中检测靶标的方法和系统，该方法和系统基于附着于基质的基质多核苷酸和，以及包括附着至少一个结合分子和编码多核苷酸的模块化多核苷酸编码捕获剂的组合使用。在该模块化多核苷酸编码捕获剂中，该至少一个结合分子被设置为与该靶标特异性结合，该编码多核苷酸被设置为与附着于该基质的该基质多核苷酸特异性结合。

在该方法中，该模块化多核苷酸编码捕获剂和/或组成所述模块化多核苷酸编码捕获剂的单元，该样品以及该基质多核苷酸在允许该至少一个结合分子与模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物中的靶标结合以及该编码多核苷酸与基质多核苷酸结合的条件下接触一段时间，由此提供与该基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物。在该方法中，与基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物随后通过检测技术进行检测，本领域技术人员基于对本文公开的内容的理解将可确定这些检测技术。

在该系统中，提供了基质，其具有附着于该基质的基质多核苷酸，以及至少一个被设置为与靶标特异性结合的结合分子，和被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，以及被设置为用位置可区分的支架结合区域附着该至少一个结合分子和该编码多核苷酸的支架分子。在该支架分子中，该位置可区分的支架结合区域被布置为，依据该至少一个结合分子以及该编码多核苷酸的结合，可以有至少一个用于和该靶标特异性结合的结合分子，以及用于和该基质多核苷酸特异性结合的该编码多核苷酸。

根据第三个方面，公开了用于分类复数个靶标中的靶标的方法和系统，该方法和系统基于附着于基质的复数个基质多核苷酸，以及复数个模块化多核苷酸编码捕获剂的组合使用。在一些实施方式中，这些靶标为细胞，且该方法和系统用于分类复数个细胞。

在该方法和系统中，各基质多核苷酸是序列特异性的并相对于其它基质多核苷酸是位置可区分的。在该方法和系统中，各模块化多核苷酸编码捕获剂包括至少一个被设置为与该复数个靶标的互补靶标特异性结合的结合分子，被设置为与该复数个基质多核苷酸的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，以及被设置为用位置可区分的支架结合区域和至少一个结合分子和编码多核苷酸相结合的支架分子。该位置可区分的支架结合区域在该支架分子上被布置为，依据至少一个结合分子以及编码多核苷酸的结合，可以有用于和靶标特异性结合的至少一个结合分子，以及用于和基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸。

在该方法中，该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂和/或组成所述复数个模块化多核苷酸编码捕获剂的单元在允许至少一个结合分子与靶标结合的条件下与样品接触一段时间，由此提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物。在该方法中，该复数个多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物随后在允许该编码多核苷酸与附着于该基质的基质多核苷酸相结合的条件下与复数个基质多核苷酸接触一段时间，由此将结合于该基质的复数个多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物中的复数个靶标分类。

该系统中包含基质，其具有附着于该基质的复数个基质多核苷酸，以及复数个结合分子，各结合分子特异性结合至该复数个靶标中的互补靶标，复数个编码多核苷酸，各编码多核苷酸特异性结合至附着于该基质的复数个基质多核苷酸中的每一个多核苷酸，至少一个被设置为用位置可区分的支架结合区域和该复数个结合分子的每一个结合分子以及该复数个编码多核苷酸的每一个编码多核苷酸相结合的支架分子，该位置可区分的支架结合区域在该支架分子上被布置为依据至少一个结合分子以及编码多核苷酸的结合，可以有用于和靶标特异性结合的至少一个结合分子，以及用于和基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸。

根据第四个方面，描述了支架分子，该支架分子包括被设置为附着于至少一个结合分子的第一支架结合区域，以及被设置为附着编码多核苷酸的第二支架结合区域，其中该至少一个结合分子被设置为与靶标特异性结合，并且该编码多核苷酸被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合。在该支架分子中，第一支架结合区域和第二支架结合区域是位置可区分的，且被布置于该支架分子中，由该至少一个结合分子和第一结合区域结合以及该编码多核苷酸与第二结合区域结合来最小化该至少一个结合分子和该编码多核苷酸之间的相互作用。

根据第五个方面，描述了多核苷酸编码捕获剂。该多核苷酸编码捕获剂由特异性结合至靶标的结合分子，以及附着于该结合分子的编码多核苷酸组成。该编码多核苷酸由特异性结合至基质多核苷酸的序列组成。该基质多核苷酸与一基质相连，并含有能和编码多核苷酸特异性结合的序列。在该多核苷酸编码捕获剂中，该编码多核苷酸包括至少一个限制性内切酶位点，使其可被相应的限制性内切酶裂解。在若干实施方式中，该多核苷酸编码捕获剂可以是在此描述的模块化多核苷酸编码捕获剂。

根据第六个方面，此处公开的每一个方法，系统与阵列的基质均与微流组分存在适用的联合，该微流组分包括用来携带流体的微流特征件。相应地，在此处描述的方法中，编码多核苷酸与基质的接触至少可以在该微流特征件携带的流体中进行。此外，此处公开的每一个系统还可以进一步包括含有该微流特征件的微流组分。

在此描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统中，靶标结合结构从支架结构分离出来，从而相较于现有技术的对应装置提高了使用上的灵活性和通用性。

另外，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统可以将复数个结合分子(特别是蛋白质)与单个多核苷酸编码捕获剂结合，而各个结合分子结合同一靶标。相应地，得到的模块化多核苷酸编码捕获剂的灵敏度和/或选择性可以得到控制，特别是得到改进。

特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列，方法和系统相较于现有技术的某些方法和系统可以有更好的目标探测选择性和灵敏度。

更特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列，方法和系统甚至允许从复杂混合物中检测和/或分类靶标(如仅有低亲和性配体存在的细胞)，以及靶标(如配位体以＜＜0.1％的极低丰度存在的细胞)。

在若干实施方式中，此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列，方法和系统还允许用稳固平台进行靶标探测，其不必包括抗体。

特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列，方法和系统可以产生稳固的模块化阵列，用于高效目标探测和/或分类，鉴于它们的稳定性，其能够显著地优于文献中用表面结合的蛋白质来捕获和检测靶标的方法。

此外，在若干实施方式中，模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统允许该多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物的选择性释放，由此在靶标(尤其是靶细胞)检测和/或分类上可以用于许多生物分析方法。

此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统可与若干检测和/或分类靶标的分析方法结合使用，其包括，但不限于，单参数和多参数分析(比如基因组和蛋白组分析)，及技术人员可确认的其它分析法。特别地，此处描述的该平台的模块化可以对俘获的靶标(特别是俘获的细胞)进行通常在玻璃基质上进行的标准化分析在上，比如免疫组织化学，FISH，和技术人员基于阅读本文公开内容可确认的其它分析方法。

此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统可被用于各种领域，其包括但不限于，分子诊断，分子治疗，基础生物学研究，组织工程，以及生物材料。

以下的附图和实施例内容叙述了本文公开的一个或多个实施方式的细节。根据说明书，实施例和附图，以及权利要求书，其余特征，目的，以及优点将变得显而易见。

附图说明

合并于说明书中并构成说明书一部分的这些附图示范了本文所公开内容的一个或多个实施方式，它们和详细说明及实施例一起用于解释本公开的原理和实施。

图1显示了根据本文所公开实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的示意图。

图2显示了根据本文所公开实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的示意图。

图3显示了根据本文所公开的实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂，方法和系统的示意图。

图4显示了根据本文所公开的实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂，方法和系统的示意图。

图5显示了根据本文所公开的实施方式用模块化多核苷酸编码捕获剂进行的细胞分类试验结果。面板A显示了对于酪氨酸酶TCR特异性的ssDNA-p/MHC四聚物阵列与T细胞接触后的灰阶荧光图像。该图像显示了在基质上的T细胞的检测和细胞分类，其中附着的基质DNA与该ssDNA-p/MHC四聚物互补。面板B显示了用两套ssDNA-p/MHC进行细胞分类，其各自的编码ssDNA的结合是可以相互区分的。箭头指示每一套在接触靶标T细胞之后的结合。

图6显示了根据本文所述的实施方式用模块化多核苷酸编码捕获剂进行细胞分类试验的结果。面板A显示了对于酪氨酸酶TRC特异性的ssDNA-SA-p/MHC四聚物阵列与不同频率的互补基质多核苷酸以及T细胞相接触后的灰阶版荧光图像。面板B显示了面板A中所示数据的量化图表。

图7显示了根据本文所述实施方式的支架(面板A)以及相应的优化支架(面板B)的结构模型。

图8示范了根据本文所述实施方式的优化多核苷酸编码捕获剂的结合容量的试验结果。特别地，面板A显示了在表达，重折叠，以及提纯的各种步骤检测到的SAC蛋白质的变性PAGE凝胶。SAC单体的分子量为～12kda。面板B显示了用于检验ssDNA-SAC轭合物的形成的凝胶移位分析。面板C显示了了用2-(4′-羟基偶氮苯)苯甲酸分子(HABA)确定生物素连接SA的摩尔比率的算式。

图9示范了根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的俘获效率的试验结果。面板A显示了ssDNA编码蛋白质阵列的灰阶明视野图像，其包括链亲和素支架和对于人TCR转换的T细胞(左)以及鼠科TCR转基因的T细胞(右)特异性的p/MHC粘合蛋白。面板A的各子面板显示了该ssDNA-编码蛋白质与互补的基质DNA以及所示特定细胞接触之后的阵列的明视野图像。面板B显示了ssDNA-编码蛋白质的阵列的灰阶明视野图像，其包括优化的链亲和素支架和对于人TCR转换T细胞(左)和鼠科TCR转基因T细胞(右)特异性的p/MHC结合体蛋白质(细胞和上面板一致)。面板B的各子面板显示了该SAC-ssDNA p/MHC与互补的基质DNA和所示特定细胞接触之后的阵列的明视野图像。

图10显示了用常规蛋白质阵列和用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行靶标捕获的比较。面板A显示了包含在多核苷酸编码蛋白质中的p/MHC阵列的灰阶荧光图像，和常规的在各种模式基质上的直接p/MHC蛋白点样策略相比，其进一步包括优化的SA支架。面板B的图表量化显示了面板A中所示数据。各数据点源自于三个代表性的点。

图11显示了用常规蛋白阵列和用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行靶标捕获的比较。面板A显示了包含在ssDNA编码蛋白中的p/MHC蛋白阵列的灰阶版本的荧光图像，其还包括SAC支架。各行表示在不同的栽玻片上进行的不同实验。面板B显示了单用p/MHC蛋白点样的衍生表面的灰阶版本荧光图像。各行表示在不同的栽玻片上进行的不同实验。

图12显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行细胞分类试验的结果。面板A显示了三种不同的基质多核苷酸的阵列(标为A，B和C)用由与多核苷酸A互补的ss-DNA编码的p/MHC四聚物以及用Jurkat^α-Tyr细胞提供的靶标接触后的灰阶荧光图像。面板B显示了不同的基质多核苷酸阵列(标为A，B和C)用与多核苷酸A互补的ss-DNA编码的对于Mart-1-特异性TCR特异性的p/MHC四聚物，与多核苷酸B互补的ss-DNA编码的对于酪氨酸酶-特异性TCR特异性的p/MHC四聚物，以及预先用亲脂性染料染色(分别为绿和红色，在灰阶版本中为浅灰色和深灰色)的Jurkat^α-Mart-1和Jurkat^α-Tyr细胞的混合群体提供的靶标接触后的灰阶荧光图像。面板C显示了对于酪氨酸酶-特异性TCR特异性的多核苷酸编码蛋白的阵列在和Jurkat^α-Tyr在所示的不同的连续稀释下(50％，10％，1％，0.1％)接触后的灰阶荧光图像。面板D显示了面板C所示数据的量化图表。

图13显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行的基因工程细胞检测。面板A显示了用F5MART-1 TCR转染PMBC细胞的实验方法的示意图，以及相关的显示由流细胞计数法测定的转染效率的图表。面板B显示了在微阵列上分类的转染PBMC的灰阶明视野图像，该微阵列含有分别被编码为A和B的同源捕获蛋白(MART-1_26-35/HLA-A2.1)和对照捕获蛋白(CMV pp65_495-503/HLA-A2.1)。面板C显示了重叠的共焦和明视野图像，以检验面板B中所示的细胞捕获为特异性(MART-1细胞以浅灰色显示)。

图14是根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的检测特异性和灵敏度的示意图表。面板A显示了由流细胞计数法测定的对于EBV BMLF1_259-267特异性的人CD8+T细胞的数量和特异性图表。面板B显示了由流细胞计数法测定的对于CMV pp65_495-503特异性的人CD8+T细胞的数量和特异性图表。

图15显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行内源性初级细胞的检测。面板A显示了含有所示的多核苷酸编码p/MHC捕获蛋白质EBV BMLF1_259-267/HLA-A2.1和CMVpp65_495-503/HLA-A2.1，在与对于图13的EBV-BMLF-1特异性的CD8+T细胞接触后的阵列图像(患者NRA 13)。左侧面板显示了在患者NRA 13细胞接触和捕获后用p/MHC捕获蛋白EBV BMLF1_259-267/HLA-A2.1和CMVpp65_495-503/HLA-A2.1定位(分别对A和B cDNA点)的阵列，该患者NRA13细胞含有对于EBV-BMLF-1特异性而不是对CMV-pp65特异性的CD8+T细胞(在图13中独立地以流细胞计数法检查)。右侧的两个面板是这些细胞用荧光性EBV BMLF1_259-267/HLA-A2.1(蓝色，图中显示为白色箭头)和CMV pp65_495-503/HLA-A2.1p/MHC四聚物(红色，在该图的灰阶版本中显示为黑色箭头)染色后的代表性灰阶荧光图像。面板B显示了所示的对于EBV或者CMV特异性的ss-DNA-SAC-p/MHC在和图13所示的对EBV-BMLF-1特异性的CD8+T细胞(患者NRA 13)及对CMV-pp65特异性的CD8+T细胞(患者NRA 11)的1∶1混合物接触后的阵列图像。左侧面板显示了细胞捕获后T细胞定位于A和B点的即刻明视野图像。右侧两个面板是这些细胞用荧光性EBV(蓝色，在图中显示为白色箭头)和CMV p/MHC四聚物(红色，在该图的灰阶版本中显示为黑色箭头)染色后的阵列的代表性荧光图像。面板C显示了～0.4％，0.2％和0.1％人EBV-特异性T细胞群体混合物以流细胞计数法测定的数量和特异性。面板D显示了对于EBV特异性的模块化多核苷酸编码蛋白阵列在和面板C的混合物接触后的灰阶版本荧光图像。EBV-特异性的T细胞群体用浅灰色箭头标记，非特异性细胞用黑色箭头标记。

图16显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂所捕获的靶标的控制释放。面板A显示了该实验方法的示意图。面板B显示了(i)在p/MHC阵列上捕获的(ii)用BamHI处理后的(iii)用EcoRI处理后的以及(iv)用BamHI和EcoRI处理后的Jurkat^α-MART-1(红色在灰阶版本中显示为深灰色)以及Jurkat^α-Tyr细胞(绿色在灰阶版本中显示为浅灰色)的灰阶版本的荧光图像。

图17显示了荧光标记的ssDNA-p/MHC四聚物可以被用作流细胞计数法的着色试剂并且可以通过DNA杂交来定位抗原-特异性T细胞。在面板A中，Cy3-标记的A′-SAC轭合物被用于产生荧光性酪氨酸酶368-376ssDNA-p/MHC四聚物，以及被用于流细胞计数法检测Jurkat^α-Tyr细胞。在Cy3NACS p/MHC四聚物(下面板)和常规的酪氨酸酶368-376(PE)p/MHC四聚物(上面板)之间可观察到类似的染色形态。在面板B中，在暴露至DNA阵列之前，用酪氨酸酶368-376-A′p/MHC四聚物将Jurkat^{α -Tyr}细胞染色。该Jurkat^α-Tyr细胞通过DNA杂交被定位至点。

图18显示了支链肽的示意图。反应性的伯胺用“星”标注，硫醇的反应性马来酰亚胺基团用虚线框标注。

图19显示了用由优化蛋白支架SAC(左面板)和SAC 3(右面板)制成的编码为链A’的酪氨酸酶368-376/HLA-A2.1四聚物对Jurkat^α-TyrT细胞的检测。

图20显示了用免疫-PCR检测细胞表面受体。面板A显示了用ssDNA编码的荧光性MART-1p/MHC四聚物染色的Jurkat^α-MART-1和Jurkat^α-TyrT细胞的流细胞计数法分析。面板B显示了用ssDNA标记编码的荧光性的抗-EGFR抗体染色的CD胶质瘤细胞和Jurkat T细胞的流细胞计数法分析。底面板显示通过用PCR扩增该编码ssDNA检测该同源细胞受体(α-MART-1TCR，面板C；EGFR，面板D)。

图21显示了用DNA编码的p/MHC四聚物和DNA编码的抗体对捕获抗原-特异性细胞的TCR触发激活的功能性描绘示意图。

图22显示了在玻璃纤维基质上捕获和活化的抗原特异性T细胞的功能概况。面板A包含用三种不同的细胞因子在三个不同的时间点编码的独立点的荧光性图像。面板B显示了一个独立的IFN-γ簇的荧光放大率。

详细说明

本文描述了多核苷酸编码捕获剂，特别是模块化的多核苷酸编码捕获剂和相关的阵列方法及系统，根据在此处所称的NACS方法或者技术，其可以和基质多核苷酸组合用于检测样品中的一个或多个靶标。

词组“多核苷酸编码捕获剂”指可特异性结合靶标的多核苷酸编码分子构造。特别地，多核苷酸编码捕获剂通常包括可特异性结合于，并由此在此被定义为互补于靶标的结合组分，支持该结合组分的结构组分，以及附着于该结构组分的编码多核苷酸，其编码该分子结构。

在“模块化多核苷酸编码捕获剂”中，该多核苷酸编码捕获剂的结合组分，结构组分和编码组分由可以受控方式彼此结合或者分离的标准化分子单元形成。特别地，在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，该结合组分由至少一个结合分子形成，其被设置为与靶标特异性结合，并因此被定义为与靶标互补；该编码组分由编码多核苷酸形成，其被设置为特异性结合附着于基质的基质多核苷酸，并因此被定义为和附着于基质的基质多核苷酸互补；该结构组分由附带至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子形成。特别地，在该模块化多核苷酸编码捕获剂种，该至少一个结合分子特异性结合至靶标，该支架分子和编码多核苷酸根据图1或者图2的示意图彼此相附或者准备彼此相附，以下将对此进一步描述。

本文所用的术语“附着”或者“被附着”指通过键，连接，力或者捆绑的连接或者组合，以将两个或两个以上组分保持在一起，其包括直接或者间接的附着方式，比如第一分子直接与第二分子或者材料结合的实施方式，以及一个或多个中间分子被布置于第一分子和第二分子或者材料之间的实施方式。分子包括但不限于多核苷酸，多肽，特别是蛋白和抗体，多糖，核酸适配子(aptamers)和小分子。

本文所用的术语“多核苷酸”指由两个或两个以上单体组成的有机聚合物，所述单体包括核苷酸，核苷或者其类似物。术语“核苷酸”指由结合了嘌呤或者嘧啶碱基，以及磷酸基并且为核酸的基本结构单元的核糖或者脱氧核糖组成的若干化合物中的任何一种。术语“核苷”指由和脱氧核糖或者核糖相结合，并且特别在核酸中发现的嘌呤或者嘧啶碱基组成的化合物(如鸟嘌呤核苷或者腺嘌呤核苷)。术语“核苷酸类似物”或者“核苷类似物”分别涉及一个或多个的单个原子已被不同的原子或者不同的官能团替换的核苷酸或者核苷。相应地，术语多核苷酸包括任何长度DNA RNA类似物及其片段的核酸。三个或者三个以上核苷酸的多核苷酸也被称为核苷酸低聚物或者低聚核苷酸。

本文所用的术语“多肽”指由两个或两个以上氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长的蛋白和肽，以及其类似物和片段。三个或者三个以上的多肽也被称为蛋白低聚物或者寡肽。本文所用的术语“氨基酸”，“氨基酸单体”，或者“氨基酸残基”指二十种天然存在的氨基酸中任何一种，包括具有非天然侧链的合成氨基酸，并包括D和L旋光异构体。术语“氨基酸类似物”指一个或多个的单个原子已被不同的原子，同位素，或者不同的官能团替换，但其它和天然氨基酸类似物一致的氨基酸。

本文所用的术语“蛋白”指具有特定二级和三级结构的多肽，其可以参与，然而并非限于，和其它生物分子的相互作用，所述其它生物分子包括其它蛋白，比如抗体，DNA，RNA，脂质，代谢物，激素，趋化因子，和小分子。

本文所用的术语“抗体”指受到抗原刺激后特异性结合至该抗原，在生物系统中促进免疫反应后由活化的B细胞生成的蛋白，其通常由四个子单元组成，包括两个重链和两个轻链。术语抗体包括天然和合成抗体，其包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体或者其片段。示范性的抗体包括IgA，IgD，IgG1，IgG2，IgG3，IgM以及类似物。示范性的片段包括Fab Fv，Fab′F(ab′)2以及类似物。单克隆抗体是可特异性结合至，因此也被定义为互补于另一个生物分子的单个特定的空间和极性结构，称为“抗原决定簇”的抗体。多克隆抗体指具有各种结合不同抗原性的抗原决定簇的单克隆抗体的单克隆抗体混合物。抗体可以通过本领域众所周知的技术进行制备，比如免疫宿主并收集血清(多克隆)或者通过制备连续的杂交瘤细胞系并采集分泌性蛋白(单克隆)。

本文所使用的术语“多糖”指由通过糖苷键彼此结合的单糖单元形成的聚合物。多糖包括超大的，通常为支链的巨大分子，包括任何长度的聚合物，从单-或双-糖类聚合物到包括数百或者数千单糖的聚合物，其可以具有约1000Da至约20KDa的分子量。示范性的多糖包括糖原，纤维素，淀粉，和壳多糖。

本文所用的术语“核酸适配子”指可结合特定靶标的低聚核苷酸或者肽分子。特别地，核酸适配子包括已经通过重复的离体选择循环或等效手段，SELEX(指数富集配位体系统进化)进行细胞工程处理，以结合至各种分子靶标，比如小分子，蛋白，核酸，甚至细胞，组织和有机体的核酸物质。核酸适配子可被用于生物工艺学和治疗学，因为它们可提供和抗体竞争的分子识别性能。肽核酸适配子是设计成可与其它蛋白在细胞内部相互作用的蛋白。它们由在两端附着至蛋白支架的可变肽环组成。和抗体的结合亲合力相比，这种双结构限制大大增加了该肽核酸适配子的结合亲合力水平(纳摩尔范围)。

本文所使用的术语“小分子”指不是聚合物并且具有约10Da至2000-3000Da尺寸的有机化合物。小分子包括生物学活性分子和不具有生物学活性的分子。示范性的小分子包括4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-[4-甲基-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]-苯基]-苯甲酰胺

磺基琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯，和琥珀酰亚胺基-6-肼基烟酸酯丙酮腙。

在本文所述的模块化多核苷酸捕获剂中，该至少一个结合分子特异性结合至靶标，且该编码多核苷酸特异性结合至附着于基质的基质多核苷酸。

本文所用的关于一分子结合或者附着于另一分子的词语“特异性的”，“特异性地”，或者“特异性”指该分子和另一分子之间的识别，接触和稳定复合物的形成，以及在每一分子和另一分子与其它分子之间基本上较少，甚至没有识别，接触和稳定复合物的形成。示范性的特异性结合为抗体-抗原相互作用，细胞受体-配位体相互作用，多核苷酸杂化，酶底物相互作用等等。本文所用的关于复合物分子组分的术语“特异性”指组分与该组分所属的特定复合物的独特的联合。本文所用的关于多核苷酸序列的术语“特异性”指具有为互补序列的单个多核苷酸的序列的独特联合。

本文所用的词语“基质多核苷酸”指附着于基质以保持其与互补多核苷酸结合能力的多核苷酸。基质多核苷酸可以是，特别地，包括特异性结合多核苷酸编码蛋白的编码多核苷酸，并因此被定义为与多核苷酸编码蛋白的编码多核苷酸互补的序列。

本文所用的术语“基质”指置于下面的支持体或者底层。示范性的基质包括固体基质，比如玻璃板，微量滴定孔板，磁珠，硅片和技术人员根据对本文公开内容的理解可以确认的其它基质。

在一些实施方式中，附着于支架组分的编码多核苷酸对于该结合组分是特异性的。这些实施方式可被用于进行利用该结合组分-靶标特异性相互作用的分析，以检测蛋白，细胞因子，趋化因子，小分子，DNA，RNA，脂质，等等，只要靶标是已知的，并且需要灵敏检测该靶标。在若干实施方式中，该结合组分和该结构组分由蛋白形成。

本文所用的术语“检测(动词)”或者“检测(名词)”指测定靶标或者信号在空间的有限部分中的存在，出现或者实况，包括但不限于，样品，反应混合物，分子复合物和基质。当提及，关于，或者涉及靶标或者信号的量或者数量时，检测是“定量的”(也称为定量)，其包括但不限于，设计成可测定该靶标或者信号的量或者比例的任何分析。当提及，关于，或者涉及对于另一靶标或者信号的相对丰度的靶标或者信号的性质或者种类的识别时，检测是“定性的”，其不被量化。

本文所用的术语“靶标”指所关心的被分析物。术语“被分析物”指其本身在样品中的存在或者缺乏需要被检测的物质，化合物或者组分。被分析物包括但不限于生物分子，特别是生物标记物。本文所用的术语“生物分子”指与生物环境有关的物质化合物或者组分，其包括但不限于，糖类，氨基酸，肽蛋白，低聚核苷酸，多核苷酸，多肽，有机分子，半抗原，抗原决定簇，生物细胞，生物学细胞的部分，维生素，激素及类似物。术语“生物标记物”指与生物环境的特定状态有关的生物分子，其包括但不限于，细胞周期的阶段，健康和疾病状态。生物标记物的存在，缺乏，减少，正相调节和特定状态相关并且可作为特定状态的征兆。

本文所用的术语“样品”指限定量的事物，其象征更大量的该事物，包括但不限于来自生物环境的液体，标本，培养物，组织，商业的重组蛋白，合成化合物或者其部分。

在若干实施方式中，该模块化多核苷酸编码分子包括至少一个结合分子，支架分子和编码多核苷酸。

本文所用的术语“结合分子”或者“亲合剂”指能够与靶标在适当的条件下特异性结合的分子。特别地，该结合分子或者亲合剂能够与至少一个靶标在适当的条件下特异性结合，其包括例如在溶液中(如从生物体取得或者合成)，在细胞表面上，在人工表面上(如衍生的珠，纳米微粒)或者在其它技术人员可以确认的混合物或者表面中结合至该靶标。结合分子的实例包括任何对于预定靶标体现结合亲合力的分子，包括但不限于蛋白结合剂，比如抗体，凝集素，Fc受体，MHC蛋白A/G，肽核酸适配子等等，非蛋白粘合剂，比如多核苷酸(例如RNA e/o DNA)核酸适配子，肽，小分子，和药物，比如伊马替尼甲磺酸盐环蛇毒素，烟碱样乙酰胆碱受体抑制剂等等。在该模块化多核苷酸编码捕获剂中，该亲合剂被附着于支架，其中可以进行直接或者间接的结合，例如通过中间分子(如生物素分子)，通过任何共价的附着方案(本领域人员易于识别)或者通过非共价的方案，比如静电，Fc蛋白A/G相互作用，生物素等等。

用于本文所述的模块化多核苷酸编码蛋白中的结合分子通常对于要检测的靶标展现出结合亲合力和结合选择性，其可以用本领域已知的技术进行测量，比如表面等离子共振(SPR)，酶联免疫吸附分析(ELISAs)，和技术人员可以确认的其它技术。针对模块化多核苷酸捕获剂的结合分子的选择是技术人员鉴于将被检测的靶标以及试验设计而作出的。例如，当该靶标为细胞时，该结合分子展现对生物分子，特别是存在于特定细胞类型的表面上的生物标记物的结合亲合力和选择性。示范性的表面分子包括但不限于膜蛋白，受体，糖蛋白，离子通道或者主要组织相容性复合体及其他可以由技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的分子。

在测定候选的结合分子所展现的对于靶标的结合亲合力和选择性，并考虑附着至支架(见下文)的结合分子数目的基础上，技术人员还能够为某靶标确定适当的结合分子。

在若干实施方式中，依据适当的支架选择，可以通过控制捕获剂对于靶标的化合价(即由捕获剂与该靶标所形成的化学键数目)调整附着于该支架的结合分子数目，以实现所需的结合亲合力和/或选择性。

例如，对于某靶标(例如细胞)低亲合力(例如Kd＞10^-6)的结合分子很可能需要增加附着于该支架的分子数量，以确保包括这种结合分子的模块化多核苷酸编码捕获剂的特异性结合。

相应地，在若干实施方式中，该捕获剂对于某个靶标的结合亲合力是可控制的，并且特别地，可以通过提供相同或者不同的结合分子的多重拷贝提高结合亲合力。特别地，如果相同或者不同的结合分子以适当方式位于该支架上，其可以使该结合分子/支架对于所感兴趣的细胞类型构成比该亲合剂单独可实现的亲和力明显更高的结合亲合力。

特别地，多重配位体捕获剂可以通过将各种结合分子(比如上述的结合分子)结合至相同的支架进行组合。在某些需要探查靶标样品内多重要素的情形下(例如，多重细胞表面标记物，来自相同的抗原递呈细胞的内源性和外源性的肽/MHC，等等)，这可能是有利的。

在若干实施方式中，该结合分子为蛋白，比如抗体，凝集素，Fc受体，MHC，蛋白A/G，和技术人员可以确认的其它蛋白。

特别地，在一些实施方式中，该结合分子为抗体。特别地，在这些实施方式中，该抗体可以被生成为与期望的靶标特异性结合.该靶标可以是在混合物中或者细胞表面上要被检测的生物标记物(参见，例如CD4，CD8，和CD3)。在后者情形下，这些抗体还可以被用作被用于检测和/或分类细胞靶标的模块化多核苷酸编码捕获剂的结合分子(见实施例13)。

在一些实施方式中，该蛋白可以是MHC复合物。本文所用的术语“MHC”或者“p/MHC”指肽主要组织相容性复合体分子(p/MHC)，并且，更特别地指异源三聚体蛋白结合剂，其为发现于T细胞上的对T细胞受体的同源结合剂。特别地，p/MHC合成物是抗原递呈细胞的细胞表面发现的异源-三聚蛋白，并且其包括MHC类别I，MHC类别II和MHC类别III蛋白。MHC类别I蛋白包含肽，α链和β2-微-球蛋白。表达MHC类别I蛋白的APCs向细胞毒T细胞呈递抗原片段，其被表面分子CD8稳定。MHC类别II包括异源二聚体肽-结合蛋白和在溶酶体小泡中调整在MHC类别II蛋白上的抗原载荷的蛋白，如MHC II DM，MHC II DQ，MHC II DR，和MHC II DP。在抗原呈递细胞上，MHC类别II蛋白包含α和β链，并且它们通过结合至T-辅助细胞上的TCR和CD4受体向T-辅助细胞呈递抗原片段。MHC类别III包括其它免疫组分，比如补体组分(例如，C2，C4，B因子)和一些编码细胞因子(例如TNF-α)的组分以及hsp。

典型的MHC的受体/靶标是发现于T细胞上的T细胞受体，其对于在该MHC复合物中存在的各种抗原(例如MART-1，巨细胞病毒，酪氨酸酶等等)可以是特异性的。基于所感兴趣的靶标并考虑MHC候选分子的结合特异性，技术人员可以确定对于特定靶标合适的MHC。

在一些实施方式中，MHC单体提供此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂的结合分子。在这些实施方式中，靶标优选由不被包括于受测细胞内的状态或者形式的分子生物标记物或者其它分子提供。在一些实施方式中，MHC二聚物和三聚物可以通过流细胞计数法被用于检测溶液中的抗原-特异性T细胞。在一些实施方式中，具有高亲合力相互作用的MHC二聚物和三聚物(例如TCR-p/MHC)可期望检测同样在复合环境中的抗原特异性T细胞，如实施例5和图9a所示(左下的面板)，其中表达抗酪氨酸酶抗原的TCR的Jurkat细胞用次优的捕获剂(参见图8的二聚物和三聚物混合)进行分类。在一些实施方式中，MHC四聚物与多核苷酸编码支架联合使用，其可以有利地用于涉及细胞检测和/或分类的应用中。(例如，参见实施例9和10以及附图5，6，9，10，11，12，和13-14，15，16，19，22。)

特别地，在一些实施方式中，抗原-呈递MHC的四聚物提供此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂的结合分子。MHC四聚物对于所感兴趣的T细胞呈现比MHC单体或者二聚物高得多的亲合力的，其即为良好的用于通过流细胞计数法检测抗原-特异性T细胞的试剂。当在此处公开的模块化捕获剂中和支架结合时，和本领域已知的方法相比，MHC四聚物容许增加灵敏度和特异性的靶标检测和/或分类。

在以下包括附图和实施例的公开内容中，每当论述与此处公开的模块化多核苷酸编码分子有关的结合分子的性能和用途时，将经常用MHC作为参考。技术人员将能够使此种说明适用于制造和使用蛋白及其它非MHC的分子。特别地，技术人员将能理解，在使用非p/MHC分子的结合蛋白时，选择的主要决定因素是要被检测的靶标。例如，如果需要检测小分子(例如咖啡因)，且存在对于咖啡因特异性的适配体，则技术人员将选择该适配体作为结合部分并将其用于支架构造。(见实施例13)

本文所用的术语“支架”或者“支架分子”指捕获剂的分子结构，其用于组成对编码多核苷酸(例如ssDNA tags)的亲合剂(例如MHC)。此结构可以源自于蛋白(比如链霉亲和素或者SA)，其它生物聚合物(比如多核苷酸，如RNA和DNA，肽核酸等等)，或者是可以与该亲合剂和该编码多核苷酸在聚合物的不同和分开的部分相结合的其它聚合物。

在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，支架分子被设置为以支架结合区域结合至少一个结合分子和编码多核苷酸。

本文所用的术语“域”指由区别性的结构和功能特征标记的区域。特别地，支架结合域是支架中被设置为结合另一个分子的区域。在本文公开内容的意义上，支架结合域包括用于结合另一个分子的官能团，以及在该支架上被另一个结合于支架的分子占据的支架结合区域。官能团一经确定，相关的支架结合区域可以用适合确定尺寸的技术加以确定，特别是用所选择的要附着的另一个分子的最大直径。在若干实施方式中，对于根据本文公开内容的蛋白，取决于所选取的蛋白，最大直径平均值介于约

和约之间，对于小分子介于约

和约

之间，对于多核苷酸介于约和约

之间。适于确定分子尺寸的技术但不限于，用于可结晶分子的X射线晶体照相法(见例如参考文献39-41)，以及用于不能结晶的分子(比如聚合物)的持续长度的技术(见例如参考文献42-43)。这些用于检测分子尺寸的技术是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。

在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，支架结合域彼此之间是位置可区分的，并因此不重叠。

本文所用的词语“位置可区分的”指分子或者其域，指基于该分子或者域占据的点或者区域可区分的分子或者其域。相应地，位置可区分的支架结合区域是在支架上占据不同点的或者区域的结合域，因此它们是位置可区分的。

特别地，在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，该支架分子包括被设置为附着至少一个结合分子的第一支架结合区域和被设置为附着该编码多核苷酸的第二支架结合区域。

在该模块化多核苷酸编码捕获剂中，可以通过标记位置可区分的官能团和相关支架结合区域对第一支架结合域和第二支架结合域进行选择，其被设置为在附着后使该附着分子呈现于该支架上。

本文所用的涉及具有化学反应性并被包括于结构中的分子或者其部分(例如，官能团或者限制位点)的术语“呈现”指该结构中的分子或者官能团的构造，其中该分子或者其部分保持这种化学反应性的可检测水平。相应地，呈现在支架上的分子或者官能团是包含在该支架中的分子或者其部分，其构造容许在适当的条件下进行或者检测可化学地或生物学地表征所讨论的该分子或者其部分的一个或多个化学反应。

因此，在本文公开内容的模块化多核苷酸编码捕获剂中，结合分子以及编码多核苷酸附着支架后，该结合分子被呈现为用于和靶标结合，该编码多核苷酸被呈现为用于和基质多核苷酸结合。

在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，结合分子和编码多核苷酸在支架上的呈现是通过选择具有适当的第一和第二支架结合域的支架实现的。

可以被包括于第一支架结合区域的用于结合结合分子的官能团依赖于该结合分子的化学性质，并且是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。例如，用于结合结合分子的官能团包括但不限于，BirA联接酶(将生物素基团联接到预定肽序列的酶)，其它酶，比如甲酰甘氨酸-生成酶(位点特异性地将醛基引入例如参考文献44所述的重组蛋白质)。

可以被包括于第二支架结合区域的用于结合多核苷酸的官能团也是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。示范性的呈现于支架上的用于结合多核苷酸的官能团包括官能团，比如硫氢基(例如，在半胱氨酸残基中)，伯胺及其它通过常规结合策略附带衍生DNA的官能团，熟悉技术的读者应能确认。

这些官能团可以是该支架上的内源性基团(例如支架蛋白上的天然赖氨酸残基)，或者通过比如基因克隆的方法(例如蛋白)，合成技术(聚合物，小分子)，及其它方法而被引入。可以依附至该支架的多核苷酸或者结合分子的拷贝数目将和该支架上可用的官能团数目成正比。

该特异性的第一和第二官能团和相关的支架结合域是考虑试验设计而加以选择。通常，该支架经过选择以使得第一和第二支架结合区域的官能团允许用正交的化学过程附着结合分子和编码多核苷酸。如果在进行任何特定的化学过程时，这些在该特定化学过程中参加和/或经历化学反应的官能团不和该正交系中的任何其它化学过程反应，则该组化学过程是正交的。当支架为蛋白时，示范性的正交化学过程包括半胱氨酸-马来酰亚胺结合，胺-NHS结合，和链霉亲和素-生物素结合，在支架为多糖时，具有NaIO4的不同的支架结合区域中的OH官能团受控氧化。

在一些实施方式中，除包含区分的支架结合域以容纳亲合剂和编码DNA之外，该支架还经过选择以和所感兴趣的靶标的环境相适应(例如，如果该靶标是细胞表面标记物，其应当可溶于水性溶液)。

在若干实施方式中，该支架包括高分子支架，其通过多配位体相互作用而形成，用于和特定细胞类型的高亲合力结合，随之可用于这些不同细胞类型的空间导向的多重分类。

特别地，在一些实施方式中，该支架由非天然产生的分子提供，其被表达为具有模块设计特性。在这些实施方式中，该蛋白支架经过设计，以使得多重和受控数目的特异性结合分子和编码多核苷酸的拷贝可以在特异性的支架多核苷酸结合域附着于该支架。

在一些实施方式中，该支架可以被设置为在多重第二支架结合域中可启动或者减弱单股编码多核苷酸(例如DNA低聚物)的附着。在这些实施方式中，第二支架结合域可以经过选择，以允许以编码多核苷酸杂化，用于将该支架空间导向至覆盖有该基质多核苷酸的表面上的特定点。

在模块化多核苷酸编码捕获剂被用于特定细胞类型的空间选择性分类的实施方式中，这样设置的支架可能是有用的。例如，各自包含不同套亲合剂，并以结合可区分的ssDNA低聚物独特标记的多重支架可以被采用，同时将许多细胞类型的混合物分离为单一组分，借鉴本文公开的内容，对于技术人员这是显而易见的。例如，在一些实施方式中，可以用具有生物素化抗体与p/MHC蛋白作为亲合试剂的模块化捕获剂，其各自被编码为结合可区分的ssDNA低聚物。这些抗体可被用于根据细胞表面标记物如CD4，CD8，CD3，等等对细胞进行分类，而p/MHC蛋白将根据由TCRs测定的抗原特异性对细胞进行分类。

在一些实施方式中，支架，特别是支架蛋白的所期望的构造，可以通过用技术人员已知技术修饰的候选支架的修饰实现，比如传统克隆技术或者技术人员可以确认的其它技术。

在一些实施方式中，该支架可以针对特定的捕获剂进行优化。特别地，在特定的捕获剂中，优化的支架具有明确定义的用于和结合分子与编码多核苷酸单独结合的支架结合区域，以使得该结合分子和该编码多核苷酸结合后，在该多核苷酸和该结合分子的组件之间可能的干涉被最小化。对于靶标和基质多核苷酸具有期望的结合亲合力的捕获剂，这通常由最小化一个或多个该结合分子和附着于该支架的编码多核苷酸之间的结构重叠，而保持该捕获剂对于该靶标和该基质多核苷酸所期望的结合亲合力而加以实现。

参照图1和2，其显示了根据本文公开内容的模块化捕获剂的不同构造。特别地，在图1和2的图例中，支架域，结合分子域(蛋白结合域)和多核苷酸域(DNA域)被图解示出。如前所述，本文所用的术语“域”指由区别性的结构和功能特征标记的区域。相应地，涉及该支架分子，该结合分子和该编码多核苷酸的该术语“域”指由在某些温度结合于捕获剂众的该分子(支架分子，结合分子，多核苷酸)的构型变化定义的专门区域。某个分子的域可以用任何适于确定尺寸，特别是分子的三维结构的技术进行测定，其包括X射线晶体照相术，筛析色谱法，质谱法，凝胶电泳及其它技术人员可以确认的技术。

在对于某捕获剂优化的支架中，该支架的结合域经过选择以最小化该支架上的结合分子域和多核苷酸域的重叠，以使该捕获剂具有所期望的结合亲合力。

在若干实施方式中，优化的支架呈现结合分子和编码多核苷酸，其与在该支架上所有可用的位置可区分的支架结合区域上形成的捕获剂所期望的结合亲合力相关。另一方面，在若干实施方式中，在非优化支架中，附着的结合分子和编码多核苷酸的数目不匹配该支架上可用位点的总数目。例如，如果该支架具有4个附着结合蛋白的位点以及3个附着DNA的位点，该非优化的支架将很可能每支架可包含＜4个结合蛋白和＜3个DNA，不管摩尔量如何过剩。此种每支架的结合分子和/或多核苷酸的存在(或者缺乏)是可测量的(见例如图8)。该捕获剂还可以用传统的分析方法测试，如ELISA，流细胞计数法，SPR，等等，以测量该捕获剂的效能。

在特异性的捕获剂中，该支架还可以经过修改，以最佳化该支架作为两个部分(即结合分子和编码多核苷酸)的整合点的功能，而最小化在结合这些部分的支架域之间，可能导致附着的部分功能效能降低的任何可能的相互作用。该被降低的功能效能可以是由于空间位阻(在结合分子和编码多核苷酸的重叠区域之间)，由于所应用的结合化学过程的性质而在该支架上的附着区域的不可逆修饰，等等。实施例4-6和图7-9显示了未优化的支架(天然SA)和优化的支架(半胱氨酸-SA)的T细胞俘获效率的比较。

相应地，通过标记结合结合分子和编码多核苷酸的支架结合区域，以及改变支架分子的剩余部分以布置该支架上的支架结合域，使结合分子和编码多核苷酸之间的相互作用最小化，可以针对那些结合分子和编码多核苷酸优化结合某个结合分子和编码多核苷酸的某支架分子。通过这样的方式，可以衍生出某支架分子的优化变体。

在一些实施方式中，支架是蛋白。特别地，在一些实施方式中，蛋白支架已经包含对于结合分子允许特异性结合的官能团。例如，链霉亲和素由于其对于生物素的天然亲合力使其对于生物素化的p/MHC分子具有特异性，是优良的支架蛋白。另一个实例可以是蛋白A/G。这些蛋白对于抗体的Fc区域具有天然的亲合力，其中后者可以被用作结合蛋白。这比没有固有特异性存在的蛋白支架更加有利，在没有固有特异性存在的情况下，需要引入两个化学正交的处理手段，用于结合结合蛋白和编码多核苷酸。由于大多数的蛋白具有窄范围的尺寸和序列长度(即性能，比如溶解度，可用于修饰的位点数量)，可以预期任何蛋白均可被用作支架分子。特别地，在用于生物结合的条件下稳定的蛋白特别有望适用作为支架。

在若干实施方式中，支架蛋白由链霉亲和素(SA或者SA)形成。链霉亲和素是来自链霉菌属avidinii的四聚物蛋白，其具有序列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS(SEQ ID NO：1)。SA具有出众的亲合力以及四个独特的结合位点，其对于天然的配位体生物素(Kd～10-15mol/L)四面体式布置。链霉亲和素对于生物素的摩尔结合量是4∶1生物素：SA。而SA无需和结合分子特异性结合(例如通过生物素相互作用)，用其它结合方法将结合单元结合至SA的实施方式没有利用SA对于生物素的4倍化合价和强相互作用。特别地，在若干SA为支架的实施方式中，着眼于该蛋白的N末端部分上的生物素的结合孔位置，C末端部分被选择作为编码多核苷酸附着位点。

相应地，在若干支架蛋白是链霉亲和素的实施方式中，结合分子(例如MHC分子)可以是生物素化的，以实现具有蛋白-配位体对SA的四聚物组件。在一些实施方式中，结合分子还可以通过共价键(比如酰胺结合)结合至SA，并因此不必通过生物素-SA相互作用结合。技术人员将能够根据选择的试验设计确定最适当的结合。在本文公开内容的若干实施方式中，SA作为标准支架被用于将p/MHC单体组装入四聚物中。

在支架是SA的实施方式中，可以使用修饰的SA，以及从其中衍生的分子(特别是SA-藻胆色素蛋白(PE或APC)结合物)。在一些实施方式中，可以使用的支架为用于荧光性p/MHC四聚物制备的SA重组体突变株。在一些这类实施方式中，可以使用SA变体，例如在从生物素结合孔去除的位点中，在羧基末端[参考文献25，26，27]结合半胱氨酸残基的变体。在这些实施方式中，半胱氨酸-反应性马来酰亚胺衍生物的结合可以只限于C末端，因为在天然的SA中不存在半胱氨酸残基。

更特别地，在一些实施方式中，可以使用名为链霉亲和素-半胱氨酸(SAC)的优化链霉亲和素，其在c末端包含若干外源性的氨基酸。这些残基包括半胱氨酸氨基酸，衍生DNA(或者任何其它马来酰亚胺衍生分子)可以由其结合。该SAC支架具有序列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCP(SEQ ID NO：2)。

在本文公开的内容中，经常以SA和SAC支架作为参照。技术人员将能够将说明内容用于非SA和和SAC的支架和优化支架，也可以参考实施例部分提供的教导。特别地，其它支架蛋白包括但不限于蛋白A/G，支链肽，小分子，如NHSester PEG-马来酰胺及其优化变体。

采用以下方法可以衍生给定预定靶标和预选结合分子的其它支架和优化支架。(a)选择第一结合化学过程，以将预选的结合分子附着于支架，以及选择第二结合化学过程，以将多核苷酸附着于支架(例如NHS-胺和硫醇-马来酰亚胺化学过程)。(b)考虑形成的捕获剂的化合价和极性(例如支链肽增加化合价的应用，甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸延伸物在结合蛋白之间产生间距的应用)，选择候选的支架结构。(c)用候选的支架结构进行多核苷酸以及结合分子的结合，由此提供候选捕获剂。(d)实验性地以及任选地测试候选的捕获剂和预定靶标的特异性结合。(e)如有必要或者需要，重复一些或者全部步骤，以增加该捕获剂对于该预定靶标的结合亲合力和/或特异性。如果期望优化，可以执行选择候选支架的步骤，或者该步骤可以包括修饰该支架以减少，特别是最小化预选的结合分子和多核苷酸之间重叠的步骤。

本文所用的术语“编码多核苷酸”指附着于此处描述的模块化捕获剂的支架，并且和附着于基质的基质多核苷酸互补的多核苷酸。在若干实施方式中，编码对于第一靶标特异性的模块化捕获剂的编码多核苷酸和编码对于第二靶标特异性的捕获剂的编码多核苷酸是结合可区分的，特别是在第一靶标与第二靶标不同时。

本文所用关于分子的词语“结合可区分的”指基于其和特定分子特异性结合，并由此被定义为与特定分子互补的能力而可区分的分子。相应地，如果第一分子可特异性结合第三分子并由此被定义为与第三分子互补，并且第二分子可特异性结合第四分子并由此被定义为和第四分子互补，而第四分子不同于第三分子，则第一分子和第二分子是结合可区分的。相应地，如果第一编码多核苷酸可特异性结合(并由此被定义为互补)于第一基质多核苷酸，并且第二编码多核苷酸可特异性结合(并由此被定义为互补)于第二基质多核苷酸，而第一基质多核苷酸不同于第二基质多核苷酸，则第一和第二编码多核苷酸是结合可区分的。

在此处描述的阵列基质，方法和系统的若干实施方式中，各基质多核苷酸和编码多核苷酸之间是结合可区分的。在此处公开的方法和系统的一些实施方式中，基质的各基质多核苷酸彼此之间是序列特异性的以及位置可区分的。

如上所述，本文所用的关于分子词语“位置可区分的”指根据分子占据的点或者区域，该分子是可区分的。相应地，位置可区分的基质多核苷酸是在基质上占据不同的点或者区域并且由此为位置可区分的基质多核苷酸。

在若干实施方式中，编码多核苷酸可以包括一个或多个限制性内切酶的限制位点。词语“限制位点”指可以由限制性内切酶识别的特定核苷酸序列。词语“限制性内切酶”指可在已知为限制性位点的特异性识别核苷酸序列处切割双股或者单股DNA的任何酶。此处描述的可以被包括于编码多核苷酸中的示范性的限制位点包括6个碱基限制位点，比如对于EcoRI BamHI，NdeI及其它可以由技术人员确认的酶的位点。其它示范性的限制位点包括但不限于AvaI，BglII，DraI，EcoRV和参考文献45中公布的进一步的限制位点，其以参考方式被全文合并于此。

在若干实施方式中，支架本身在结合可区分的捕获剂之间是可互换的，并且单种支架可被用于构造不同的模块化捕获剂。另外该支架可以经受改善和优化。在若干实施方式中，该支架和至少一个结合分子亦为结合可区分的。

在一些实施方式中，支架可以被设置为提供极性捕获剂，没有图1(上面板)的示意图所示的径向对称，图1(底面板)和图2(右上面板)的示意图所示的对称捕获剂，或者图2(左上面板)的示意图所示的准极性捕获剂。

特别地，极性捕获剂是结合分子域，支架域和编码多核苷酸的重叠被最小化的捕获剂。准极性捕获剂是少数结合分子域和编码多核苷酸域在彼此之间以及和该支架域重叠的分子。在对称捕获剂中，所有的结合分子和编码多核苷酸域在一定程度上重叠。在每一种极性捕获剂，准极性捕获剂和对称捕获剂中，该支架可以被优化，以最小化该一个或多个结合分子域，支架分子域和一个或多个多核苷酸域之间的特定捕获剂中的重叠。对于极性捕获剂，这种最小化被最大化。

相应地，在若干实施方式中，充分组合的极性多核苷酸编码捕获剂有望具备相对于非极性捕获剂更高的能力，因为在极性捕获剂中该结合分子可自由地与所感兴趣的靶标相互作用，并且该编码多核苷酸可自由地与该基质上的cDNA相互作用。申请人已经通过流细胞计数法证明此种“反面(about-face)”构造的近似物导致更高的细胞表面标记物染色(参见图2，下面板)。

特别地，申请人生产了SAC-DNA构造，使每SAC附着1DNA链(经荧光标记)。这个部分是准极性的，因为该MHC捕获蛋白(结合域)沿支架径向分布，而该DNA域是单一的(因此和该构造的其余部分相比是极性的)(见下文)。与径向对称的构造直接对比，此构造结合细胞表面受体更好(平均强度178对比153)(参见图2下面板)。

在若干实施方式中，通过用将结合结构库和单一的支架配对，可以将具有相关编码多核苷酸的单个支架重复用于产生结合结构库。这些实施方式被示范于实施例5，8，9和10，以及图5，6，9，12A，B，13B，15AB，16，19，22中，其中相同的支架(SAC-A′)被用作NACS捕获剂，其具有对MART-1，OVA，Pmel，酪氨酸酶，和CMV的特异性。在这些实施方式中该系统的模块化和互换能力。

在一些实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂，特别是此处描述的模块化的多核苷酸编码捕获剂包括用于将结合分子连接到支架的可变长度的连结物。本文所用的术语“连结物”指包含在模块化多核苷酸编码捕获剂中用于结合或者连接支架与结合分子的分子。该连结物可以源自于可以与包括其的捕获剂的支架和结合分子反应任何化学分子。示范性的连接物包括但不限于肽(例如10肽)，核酸，聚合物(聚乙二醇)，和碳链。连结物的长度可以由常规化学方法控制，对于具有技术专长的读者这应当是显而易见的。该连结物可以用常规的生物结合策略进行附着，这对于熟习技术的读者而言也应当是显而易见的。

在这些实施方式中，对于和所感兴趣靶标的适当相互作用而言，包含连结物有望增加结合蛋白的自由度。当该靶标被固定/限制在适当空间定向对于高亲合力相互作用为决定性的特定域(例如靶细胞表面蛋白被限制于细胞膜)中时，这有望增加该相互作用。

在一些实施方式中，该连结物还可以作为介于所包括的结合分子和编码多核苷酸之间的间隔团，以使得该结合分子域和多核苷酸域彼此不会干涉。示范性的连接物包括尺寸在50Da和5000Da之间的分子。

在以下进一步讨论的一些实施方式中，连结物可以是条件性的连结物，其由于受控的刺激改变其构造。

在一些实施方式中，可以通过将多重结合单元结合至单个支架增加捕获剂对于靶标的亲合力。该捕获剂的化合价的提升增加了该组合复合物的亲合力，因为每一个相邻单元均参与结合进程，所以净效果是该靶标与多核苷酸编码捕获剂的总体联合增加，如实施例5和图7，8和9所示。这对于结合分子(如MHC)特别相关，其特征是作为单体对于靶细胞的亲合力弱，但是以多体形式被束在一起时增加亲合力。

在结合分子由低亲合力结合蛋白形成的实施方式中，捕获剂对于靶标被增加的化合价可能需要有效结合至靶标。可以开发与分子构象的修饰有关的亲合力变化，以即时控制多核苷酸编码分子对相应的互补靶标的相互作用。例如，一些依据对互补配位体(该受体对其特异性的分子)的结合控制细胞活动的细胞表面受体功能。当配位体不再与该受体结合时，该活动可以被逆转或者恢复。因此，通过开发结合分子对支架的分离和多价特性，有可能可以用条件性连接物来控制结合。条件性连接物响应外源性的外部刺激经历一些构象变化而导致化合价减少，因此该捕获剂的结合亲合力以及相应的该多核苷酸编码捕获剂无法保持与该靶标继续结合。条件性连接物的实例为含有紫外线不稳定碱的肽或者核酸，紫外线不稳定碱在暴露于紫外线灯时断开。这种实施例在实践中将用p/MHC蛋白通过紫外线不稳定的肽连接物结合至SAC-DNA支架。该捕获剂将在结合于T细胞受体后激活靶细胞。该多核苷酸编码p/MHC捕获剂即可在暴露于紫外线灯所期望的时间后被去除。

在若干实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂包括彼此结合可区分的多重结合分子。在这些实施方式中，多配位体编码捕获剂可被用于同时应答多重目标。当这些靶标被组合于域中，如被组合于细胞表面上时，这可能是最有利的，因为亲合力的增加(如上面所指出)可以等同地作用于此系统，其中该复合物的亲合力可能大于独立的结合蛋白各自的亲合力。多配位体编码捕获剂的实施例可以包括p/MHC复合物，其中各蛋白可以由不同肽序列组成。其它组合也是可能的，如Ab Ab，Ab肽，Ab适配体，肽适配体，和技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它分子。

此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂可以着眼于根据技术人员可以确认的方法的特异性的捕获和试验设计通过结合这些单元加以制造。例如，在结合分子特异性地结合支架的实施方式中，编码多核苷酸(例如DNA)可以在组装该结合分子(例如MHC)之前先结合至支架(例如SAC)。在其它的结合分子不是特异性结合至支架的实施方式中，结合单元需要以共价形式被附着。这既可以发生在多核苷酸附着于支架前，也可以发生在之后。将此处描述的模块化捕获剂与其它支架和结合分子进行组装的其它方法对于熟习技术的读者将是易于确认的。不管试剂以何种次序组合，这些方法将适于组装此处公开的捕获剂，只要该结合蛋白单元的特异性需要由该多核苷酸序列独特编码。

在一些支架是链霉亲和素的实施方式中，模块化多核苷酸编码蛋白可以通过酶促混合生物素化的MHC分子和链霉亲和素(SA)的商业制剂进行制备，通常比例为4∶1，该链霉亲和素通常连接荧光染料分子。技术人员将可确认在此步骤上致力于改进MHC四聚物对于流细胞计数法的细胞分类的变化。

例如，在一些实施方式中，结合蛋白的附着可以通过蛋白-配位体相互作用(链霉亲和素生物素)，蛋白-蛋白相互作用(Fc域和蛋白A/G)，或者生物结合策略(胺结合，氢硫基结合等等)。在一些结合分子是MHC的实施方式中，MHC可以在C末端被生物素化。在一些支架是SAC的实施方式中，SAC在该C末端以DNA修饰。在一些实施方式中，整个单元通过将联合生物素-MHC和SAC-DNA进行组装，其中SAC通过生物素特异性结合至4个MHC蛋白分子。

此处公开的模块化多核苷酸编码捕获剂的编码多核苷酸与支架蛋白的结合可以用普通的生物结合方法形成，比如化学交联，其包括依赖于蛋白中可被结合的伯胺(通常发现于赖氨酸残基)存在的技术。特别地，多核苷酸编码蛋白可以通过共价结合策略生成，比如PCT申请WO2008/016680中所述的策略，其以参考方式被全文合并于此。特别地，化学结合被用于产生支架蛋白和多核苷酸之间的共价键，其包括NHS-胺结合，硫醇-硫醇结合，硫醇-马来酰亚胺结合，酰肼-醛结合等等。这些生物结合策略对于本领域技术人员应当是显而易见的。

要和特定多核苷酸编码捕获剂结合的编码多核苷酸的数目可以变化。特别地，附着于该蛋白组分的多核苷酸的数目可以被调整，以最小化尺寸，并由此最小化该待定部分的空间位阻，而仍然保持结合特异性。该优化可以通过PCT申请WO 2008/016680中所示方法进行，其以参考方式被全文合并于此。(见图3和实施例3)在这些实施方式中，捕获剂的优化可以化学方式进行(即不同化学计量的反应性小分子与捕获剂(例如抗体))。

在一些实施方式中，要附着于各蛋白的编码多核苷酸的数目可以是1至6，甚至大于6的任何一个数字。在一些实施方式中，比如细胞分类，每支架附着1到4个编码多核苷酸，其提供进一步的优点在于，可以最小化标记的空间效应，并因此允许为了与互补基质多核苷酸的高亲合力杂化用复数个编码多核苷酸标记多核苷酸编码捕获剂。

形成该待定部分的多核苷酸的长度还可以被控制，以优化多核苷酸编码捕获剂与基质的结合。特别地，该编码多核苷酸的长度可以为了正交化目的而被优化。在这些实施方式中，编码区域包含20mer识别序列。这些是根据PCT申请WO 2008/016680示范的方法以计算机产生的，其以参考方式被全文合并于此。特别地，包含实施例中提及的限制位点的这些序列是通过将6个碱基切割位点附加至原本根据PCT申请WO 2008/016680示范的方法产生的序列而产生的，其以参考方式被全文合并于此。

该基质多核苷酸可以通过本领域已知的技术生产。例如，首先多核苷酸可以被化学合成。这些核苷酸即可以是根据Pat Brown在斯坦福[参考文献46]所列范例定点标示。然后技术人员可以根据对本文公开内容的理解将这样生成的基质多核苷酸附着于基质。特别地，适合于生产基质多核苷酸的多核苷酸在聚赖氨酸基质上包括至少75mers长度。

在一些实施方式中，编码多核苷酸和/或基质多核苷酸被正交化，以最小化编码多核苷酸和基质多核苷酸的非特异性结合。相应地，正交化的多核苷酸包括序列为计算机生成以最小化残缺碱基对，亚稳状态和/或其它二级结构的多核苷酸，以最小化多核苷酸之间的非特异性相互作用和通常与相关序列的随机生成有关的在多核苷酸中的非线性二次干扰。

本文所用的术语“正交化”指由计算生成一组多核苷酸的进程，其中残缺碱基对，亚稳状态及其它二级结构被最小化，以使得多核苷酸只结合互补链而不结合其它。用于此公开内容的示范性的正交化技术包括根据Dirks等人所列范例[参考文献47]进行的正交化，其以参考方式被全文合并于此。

特别地，在一些实施方式中，编码多核苷酸和相应的互补基质多核苷酸为正交化的多核苷酸，比如多核苷酸A，B，和C，其被详细描述于实施例6和图5，6，9-13，15，17，19，22，以及多核苷酸AEcoRI，BBamHI，其被描述于实施例7和图16。

其它正交化的多核苷酸可以通过一些方法和步骤进一步加以确定，比如根据技术人员基于对本文公开内容的理解显而易见的方法的计算正交化(即电脑化的正交化)。

此处描述的用MHC作为结合分子的模块化多核苷酸编码捕获剂可以使用[参考文献33]中广泛描述的步骤进行制造，其以参考方式被全文合并于此。依据这种步骤，可以首先合成通过受控刺激可修饰的牺牲肽，来产生p/MHC蛋白分子的库。例如，在若干实施方式中，此牺牲肽包含非天然氨基酸，其含有硝基-苯基侧链。此官能团是紫外线不稳定的；因此在紫外线存在下，该牺牲肽被断裂为两个较小的肽。因此可以产生呈递该牺牲肽的p/MHC复合物，将全部复合物暴露于紫外线，而在包含摩尔过量交换肽的溶液中实行后者。接触紫外线后，该牺牲肽将被断裂为两部分，并将为全长的交换肽置换，MHC因其将具有更高的亲合力。通过使用肽库，将可以在一个紫外线交换步骤中产生巨大的p/MHC库。

此处公开的方法和系统可以被用于进行靶标的检测分析，包括单参数分析，和多参数分析，其全部可以作为多重分析被进行。

本文所用的术语“单参数分析”指为测定一个靶标的存在，缺乏，或者数量所进行的分析。术语“多参数分析”指为了测定复数个靶标的存在，缺乏，或者数量所进行的分析。术语“多重的”或者“多重化的”分析指在单个反应室中进行多重分析反应的分析，例如多重被分析物的同时分析，和/或以单一的分隔及检测形式进行的分析。

在一些实施方式中，此处公开的方法和系统可以有利地被用于进行诊断分析，其中要被检测的一个或多个靶标是与预定疾病有关的预定生物标记物。在从通常不均质的组织样品的不同区域各自测量不同类别的生物材料和生物分子，因此会引入不可避免且难以测定的干扰源的诊断方法中，这些实施方式特别有利。

在一些此处公开的方法和系统的实施方式中，多核苷酸编码捕获剂和基质多核苷酸被用于组合物中，如图3，4，21所示。

在图3，4，21所示的实施方式中，此处公开的多核苷酸编码捕获剂形成蛋白阵列，其可以接触样品以检测该样品中的靶标。图3，4，21的实施方式对于检测和/或分类蛋白靶标特别有利。

在其它特别适于检测和/或分类细胞靶标的实施方式中，一些或者全部模块化多核苷酸编码捕获剂在用互补的基质多核苷酸接触模块化的多核苷酸编码抗体之前接触样品。在这些其它实施方式中，该抗体和一个或多个相应的靶标可以在不存在基质的情况下结合，例如在液相中，其中两个分子均具有完全的定向自由度并且该靶标对该亲合剂的结合部位的接入不会被该基质削弱。另外，与现有技术的相应方法和系统相比，所进行的分析的灵敏度和特异性，以及结合至该基质的模块化多核苷酸编码的靶标复合物的探测能力可以被改进。显示以上一些优点的示范性的实施方式被示意于实施例12和图17中。

在一些实施方式中，多重细胞类型可以在阵列上通过使用蛋白结合剂库进行分类，在该库中它们结合的支架用不同的多核苷酸进行编码，以使得各个不同的蛋白结合体的特异性由不同的DNA序列编码。此方法的在实践中实施例示意于实施例8-11和图5b，12b，15b，16中。

在此处公开的方法和系统的一些实施方式中，结合至基质的模块化多核苷酸编码靶标复合物最后从该基质被检测。

在一些实施方式中，通过提供标记分子进行复合物的检测，其包括可以特异性结合要检测的模块化多核苷酸编码蛋白靶标复合物(例如抗体，适配子，肽等等)的任何分子，以及提供标记信号的标记，附着于该分子的标记化合物。将该标记分子与该多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物接触，则技术人员依据对本文公开内容，特别是实施例部分的理解，即可检测来自该基质上结合于多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物的标记化合物的标记信号。

在如下更详细叙述的一个或多个靶标和/或复数个靶标被检测的实施方式中，标记分子可以由复数个标记分子形成。各标记分子包括特异性结合一个或多个靶标/复数个靶标中一个靶标的分子，以及附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号，各标记分子之间是检测可区分的。

本文所用的关于标记分子的词语“检测可区分的”指基于附着于该分子的标记化合物提供的标记信号可区分的分子。可以被用于提供检测可区分的标记分子的示范性标记化合物包括但不限于放射性同位素，荧光发生团，化学发光染料，发色团，酶，酶基质，酶协同因子，酶抑制剂，染料，金属离子，纳米微粒，金属溶胶，配位体(比如生物素，抗生物素蛋白，链霉亲和素或者半抗原)以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它化合物。

在一些实施方式中，将复数个标记分子和复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物在允许该复数个多核苷酸编码捕获剂靶标复合物与该复数个标记分子结合的条件下接触一段时间。然后在该基质上从结合于该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物的复数个标记分子检测标记信号。

在一些实施方式中，检测方法可以通过荧光读数方法进行，其中被标记的抗体是用荧光发色团进行标记，其包括但不限于小分子染料，蛋白发色团，量子点，和金纳米微粒。特别地，在一些此处公开的任何方法和系统的实施方式中，可以在金纳米微粒标记的第二检测系统中进行检测，其中普通的照相显影溶液可以放大金纳米微粒，进一步内容如下所述。而且，如果读数来自金颗粒的暗视野散射，则启动单个分子数字式蛋白组学方法。技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它技术将不作详细讨论。

本文所用的作为复合物或者分子的组分的术语“标记”和“标记分子”指能检测的分子，其包括但不限于放射性同位素，荧光发生团，化学发光染料，发色团，酶，酶底物，酶协同因子，酶抑制剂，染料，金属离子，纳米微粒，金属溶胶，配位体(比如生物素，抗生物素蛋白，链霉亲和素或者半抗原)等等。术语“荧光发生团”指在可检测的图像中能够显现荧光的物质或者其一部分。因此本文所用的词语“标记信号”指容许该标记检测的标记发射出的信号，其包括但不限于放射能，荧光，化学发光，酶促反应产物中化合物的产生等等。特别地，金纳米微粒可被用于三明治形式的检测分析，其中检测复合物被连接至金纳米微粒。这在小分子类蛋白，肽等等的检测最为相关，因为检测细胞可以简单采用传统的显微技术进行。

在一些实施方式中，检测一种特定靶标。在这些实施方式中，可以在将该多核苷酸编码捕获剂与基质接触之前或者之后将模块化多核苷酸编码捕获剂与该靶标接触。特别地，形成该模块化捕获剂的单元可以在单一的反应混合物中被接触。然而，此种方法将要求支架和结合分子之间，以及支架和编码多核苷酸之间具有特异性(其通常已经为特异性)。

模块化多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在模块化多核苷酸编码蛋白与基质接触之前进行的实施方式特别适合于细胞分类或者检测。此方法被示范于实施例12和图17中。

模块化多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在模块化多核苷酸编码蛋白与基质接触之后进行的实施方式特别适合于高灵敏度的蛋白分类或者检测。

此处公开的多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在多核苷酸编码捕获剂与基质接触之后进行的方法和系统的实施方式被示范于实施例3，7，8，9，10，11和图5-6，9-13，15-16，19，22中。在这些实施方式中，结合于靶标的多核苷酸编码蛋白和非结合于该靶标的多核苷酸编码蛋白之间对于相同的特定基质的竞争可以被去除，并且分析的灵敏度因此被增加。进一步地，在这些实施方式中，基质上的多核苷酸的浓度可以被优化，以使得高浓度的多核苷酸编码捕获剂可以结合至该基质，根据调节各结合的热力学平衡法则，这将接着使正确组装的复合物的浓度更高，随之增加总体检测灵敏度。

可以用图5a，6，9-11，12Ac，13b，15ad，17b，19，22和实施例1，7-10中示范的方法和系统进行的单参数分析包括但不限于，用于血清中单一标记物检测，生物样品中单一蛋白检测，根据表面标记物的细胞分类，以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它分析中的任何分析方法。

特别地，可以在样品CD8细胞，CD4细胞或者抗原特异性T-细胞(即在T细胞受体(TCRs)上彼此区别的细胞，这给予它们抗原特异性)中进行单参数分析检测。

在一些实施方式中，根据实施例3，8，10和11，以及图3-6，12b，15b，16，22所示的策略，进行了复数个靶标的检测。

在一些实施方式中，可以生产由复数个结合可区分的并且位置可区分的模块化多核苷酸编码捕获剂组成的蛋白阵列。这些实施方式特别有利于不同蛋白-靶标的高灵敏度分类和/或检测。

在其它实施方式中，复数个模块化多核苷酸编码捕获剂在接触基质多核苷酸之前和样品接触，以检测相关靶标。在这些实施方式中，此处公开的方法和系统可被用于进行多重的多参数分析，其中由于和结合蛋白与靶标在无基质时的结合有关的改进的灵敏度和选择性，并虑及被减少的生物淤积和蛋白变性，许多生物标记物可以有效地被定量和/或定性检测。

可以用实施例3，8-11和图3-6，12b，15b，16，22所示方法和系统进行的多参数分析包括但不限于任何蛋白组分析，组织分析，血清诊断，生物标记物，血清描绘(serum profiling)，多参数细胞分类，单细胞研究，和本领域技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它分析方法。

在一些这类实施方式中，可以进行多参数分析，以多重检测方式在样品CD8细胞，CD4细胞和抗原特异性T细胞中进行检测。

复数个靶标由不同类型的细胞组成的方法和系统的实施方式相比于现有技术的相应的方法和系统(比如细胞与印在基础基质上的表面标记物-特异性抗体相互作用的淘选[参考文献48])特别有利。特别地，相对于现有技术方法和系统，由于捕获抗体的淘洗和三级结构通过吸收/共价附着于普通衍生基质而有害地和不可逆地被损坏，基质上的细胞捕获效率可以被改进。和实施例7和图10和11所示的NACS比较，这导致较低反应性的表面。

在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂被用于细胞分类方法。

用实施例1-11和图3-13，15-17，19，21，22所示的方法和系统可实施的分类靶标的分析方法包括需要检测混合物中的特定靶标(包括但不限于细胞靶标，蛋白-靶标或者基因靶标)的任何分析方法，这是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。

特别地，此处描述的方法和系统允许从细胞类型复合混合物中至少1∶1000稀度进行特定细胞类型的多重分类。即使在细胞特异性亲合剂呈现相对弱的结合亲合力时，这种稀少细胞的分类也被证实。

在一些实施方式中，用于编码捕获剂的多核苷酸(“例如DNA低聚物”)被设计成包括不同的限制性内切酶位点，其可以被互补的限制性核酸内切酶裂开(此处也称可释放的多核苷酸捕获剂)。

特别地，这些限制位点被包括，以使得不同的限制性内切酶识别结合可区分捕获剂上不同的DNA序列。因此通过使用复数个不同限制性内切酶，不同群体的捕获剂的粘着，以及由此而来的不同群体的靶标，特别是细胞，可以通过添加对用于分类该细胞类型的序列特异性的互补限制性内切酶而被独立地控制。释放的细胞可以通过细胞富集培养在体内扩张，或者可以用本文公开内容所述的单参数或者多参数分析方法进行基因组或者蛋白生物学分析(例如PCR，蛋白质印迹等等)。

采用多核苷酸编码捕获剂的任何捕获靶标的控制释放将允许用其它常规的生物分析技术进一步分析该靶标，如PCR，质谱，蛋白质印迹等等，以及技术人员可以确认的其它技术。

相应地，在一些实施方式中，此处描述的可释放的多核苷酸编码捕获剂可被用于相关的方法，其中提供靶标，特别是复数个靶标，该多核苷酸编码捕获剂和靶标以及附着有基质多核苷酸的基质在允许多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物形成于基质上的条件下接触一段时间。然后将针对可释放的多核苷酸编码捕获剂的限制位点的限制性内切酶和可释放的多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物接触，以允许该互补限制位点裂开，由此允许包括该与限制性内切酶互补限制位点的可释放的多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物的选择性释放。在一些实施方式中，用此处描述的方法进行的释放可以被选择性控制，以通过受控方式(例如在不同的时间)释放不同的可释放多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物。

在一些实施方式中，可释放的多核苷酸-编码捕获剂是此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂。特别地，在一些实施方式中，根据此方法的可释放的模块化多核苷酸编码捕获剂进一步包括连结物分子，以允许此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂的控制释放，由此允许缺少该捕获剂时对靶标的其它分析。

在若干实施方式中，在阵列中捕获的靶标，特别是在阵列上捕获的细胞也将接受进一步的分析。特别地，可以使用免疫-PCR以描绘细胞表面受体。此外或者另外，可以采用一组多核苷酸编码捕获剂，比如以参考方式被全文合并于此的WO 2008/016680所述的捕获剂进行这种分析，其可以根据实施例16和图20-22所示方法进行。特别地，在图20-22的实施例中，抗靶标表面生物标记物的抗体被独特的DNA序列标记。然后这些多核苷酸编码抗体被用于染色在该阵列上被捕获的细胞。该编码抗体上的DNA标记即可被分析，且这些靶标细胞生物标记物的存在或者缺乏将和该细胞生物标记物相关的DNA标记的存在或者缺乏相关联。这些DNA标记可以用常规方法检测，如PCR，测序，微阵列，以及技术人员可以确认的其它技术。

相应地，在一些实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂和模块化多核苷酸编码捕获剂可被组合用于检测，特别是分析靶标的方法中，其中至少一个模块化多核苷酸编码捕获剂和多核苷酸编码捕获剂和靶标和/或附着在基质上的基质多核苷酸接触，以形成模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物和/或多核苷酸编码捕获剂靶标复合物。其它多核苷酸-编码捕获剂和/或模块化多核苷酸编码捕获剂可以进一步和这些复合物接触，以允许和该靶标和/或该靶标上呈现的其它靶标结合，以形成其它多核苷酸-编码捕获剂复合物。因此可以检测其它多核苷酸-编码捕获剂和/或模块化多核苷酸编码捕获剂与其它靶标的复合物。基于使用可释放的多核苷酸捕获剂和/或含有连结物，特别是条件性连结物的多核苷酸-编码捕获剂，其它变体对于技术人员将是显而易见的。

在其它实施方式中，此处公开的任何方法和系统的基质可以和微流组分有关，因此允许基于分析的微流操作。基于分析的微流具有各种优点，比如减少样品和试剂体积，缩短分析时间[参考文献49]。例如，在某些操作条件下，表面结合分析动力学主要通过被分析物(蛋白)浓度和被分析物/抗原结合亲合力被测定，而不是通过扩散测定[参考文献50]。

本文所用的术语“微流”指具有微流特征的组分或者系统，如通常以微米或者亚微米尺度制造的通道和/或腔室。例如，代表性的通道或者腔室至少具有一个横截面的尺寸在约0.1微米至约1500微米范围内，更具有代表性地为约0.2微米至约1000微米，更具有代表性为约0.4微米至约500微米。个别的微流特征通常容纳非常小量的流体，例如约10纳升至约5毫升，更具有代表性地为约100纳升至约2毫升，更具有代表性地为约200纳升至约500微升，或者更具有代表性地为约500纳升至约200微升。

微流组分可以被包括于集成器件中。在此应用时，“集成器件”指具有两个(或以上)彼此物理式或者操作式联合的器件。这些组分可以(全部或者部分)被彼此分离地制造并在它们的(完全或者部分)制造后被联合，或者该集成器件可以被制造为将不同组分包括于该集成器件中。集成的微流阵列装置包括被联合至微流组分的阵列组件，其中该微流组分和该阵列组件彼此成可操作的联合，以使得该阵列组件的阵列基质和该微流组分的微流特征呈流体连通。微流组分是包括微流特征，并且适合于和阵列组件成可操作联合的组分。阵列组件是包括基质，并且适合于和微流组分成可操作联合的组分。

该微流系统还可以为模块化的形式。“模块化的”表示系统或装置具有多个一起应用的标准化组分，其中一类组分的多个不同实施例之一可以被另一个同类组分代替，以改变该系统或装置的功能或者性能；在这种系统或装置中，每一个标准化组分即为“模块”。

在此处公开的方法和系统的微流实施方式中，在极小的样本体积和非常紧缩的基础/生物淤积中进行大面板蛋白生物标记物的测量是可能的。

在此处公开的方法和系统的微流实施方式中，还可以提升分析的灵敏度。

另外，此处公开的微流方法和系统允许进行(i)单步骤分析(其中多核苷酸编码捕获剂一个或多个靶标和标记抗体在单一步骤中接触)和(ii)减少时间内的多步骤分析(其中基质被连续地暴露于模块化多核苷酸编码捕获剂，一个或多个靶标，然后是第二抗体)，和现有技术的相应微流方法和系统以及其它用于分子检测的非微流方法和系统相比，其样品尺寸减少，灵敏度更高。

其它与此处公开的微流方法和系统有关的优点包括，可以在微流环境中进行任何涉及基质支持抗体的分析，而用现有技术不可能有微流芯片组件可以继续存在。

与此处公开的方法和系统有关的进一步的优点为：可以用低成本试剂进行灵敏的测量，比如用玻璃，塑料；以及可以将基质与其它组分组合应用与样品预处理和提纯。

此处公开的方法和系统允许多重的多参数检测，分类，和所感兴趣的生物标记物以及相关的诊断分析。此处公开的用于诊断分析的方法和系统的应用示范描述于实施例9-10和图13-15，21-22中，以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的任何其它分析方法。

特别地，在图13-15的示范性的诊断分析中，用来自人PBMCs的NACS导向检测抗原特异性T细胞群体。这些T细胞的检测对于诊断目的很重要，因为它们参与抗癌和病毒病原体的免疫反应。治疗学分析的实施例作为替代提供于图13中。在此人PBMCs用对于癌症有关抗原特异性的TCR进行转染。这些T细胞在随后注入患者之前在NACS阵列上被检测。

此处公开的系统可以为阵列或者部分试剂盒的形式。阵列有时候被称为“微阵列”，其包括可寻址区域的任一种一维，二维或者三维空间布置，该可寻址区域带有和该区域有关的特定分子。通常该特征尺寸是微米。实施例3-11，图3-6，9-13，15-17，19，21-22提供了示范性的微阵列。

在部分试剂盒中，该模块化多核苷酸编码捕获剂和/或任何有关的组分独立地和基质一起被包含于该试剂盒中。特别地，该模块化多核苷酸编码捕获剂可以被包括于一种或多种组合物中，并且每一种模块化多核苷酸编码捕获剂均可以和适宜的媒介载体或者助剂一起被包含于组合物中。

提供于该系统的基质可以具有附着其上的基质多核苷酸。在一些实施方式中，该基质多核苷酸可以进一步被提供为该试剂盒的其它组分。其它组分可以包括标记了的多核苷酸，标记了的抗体，标签，微流芯片，参照标准，和技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它组分。特别地，该试剂盒的组分可以被提供为具有适宜的说明及其它必要的试剂，以实行此处公开的方法。该试剂盒通常将在单独的容器中包含所述组合物。用于实施该分析方法的说明，例如书面或者声音的在纸上或者电子载体(比如磁带或者CD-ROMs)上的说明，将通常被包含于该试剂盒中。根据使用的特定方法，该试剂盒还可以包含其它封装的试剂和材料(即洗涤缓冲剂及类似物)。

本领域技术人员依据对本文公开内容的理解可以确定关于所述组合物的适宜的载体或者助剂的识别的更详细资料，通常是该试剂盒的制造和包装。

具体实施方式

此处公开的方法和系统被进一步示范于下列实施例中，其用于示例而不是限制。实施例1：多核苷酸编码SAC支架蛋白的生产

SaC的表达根据在先出版的规程[参考文献36]进行。简而言之，克隆入pET-3a质粒的链霉亲和素-半胱氨酸(SaC)基因是来自TakeshiSano博士(Harvard Medical School)的慷慨礼物。克隆选择和整夜开始培养后，包含该质粒的BI21(DE3)-pLysE通过在LB媒介中振动在37℃下生长，并对于pET-3a-SaC选择抗生素氨苄西林(50ltg/ml)，对于pLysE选择氯霉素(25ltg/ml)。当A600达到0.6时发生细胞诱导，在该处加入b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.4mM的最终浓度。接着在37℃保持诱导细胞4小时。然后在1600g离心培养物10分钟，并用100mM NaCl，1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH 8.0洗涤。然后用溶胞缓冲液溶化细胞(2mM EDTA，30mM Tris-HCl，0.1％Triton X-100，pH 8.0)。

为了减少该溶液的粘性，该溶胞产物随后用去氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(各10ltg/ml，J2mM MgS04)在室温下处理20分钟。然后通过在39,000g离心15分钟将不可溶的包含体与该溶胞产物分离，之后用溶胞缓冲液再次洗涤沉淀物。将该沉淀物溶解于6M胍-HCl，pH 1.5至原始培养体积。为了去除细胞生物素，将100ml的溶解沉淀物溶液在1L的pH 1.5的6M胍-HCl中进行渗析。然后将渗析液转移至pH 6.0的0.2M醋酸钠，以去除胍并重折叠SaC。这里关键之处是去掉搅拌棒缓慢进行渗析。然后在3000g旋转渗析液10分钟，以去除沉淀析出物，并将其过滤通过0.2！-Lmtllter(次微粒)。最后以的50mM碳酸氢盐，500mM NaCl，pH 11对重折叠的SaC进行渗析。

如下对SaC进行提纯。将重折叠的SaC和结合缓冲液(50mM碳酸氢钠，500mM NaCl，10mM b-Me，pH 11)1∶1混合。用10毫升结合缓冲液洗涤装有1.5毫升亚氨基生物素琼胶糖树脂(Pierce)的重力柱。然后将该重折叠混合物添加至该柱，收集流出部分并再次添加至该柱，以最大化SaC回收。用20毫升结合缓冲液洗涤该柱后，用pH4的洗脱缓冲液(50mM乙酸钠，10mM～-Me)洗出SaC。以OD280监视，收集包含SaC的部分，缓冲液更换为包含10mM～-Me的PBS，并用10K mwco过滤器(Millipore)浓缩至1毫克/毫升的最终浓度。

如下进行SaC低聚核苷酸结合。在使用之前，用脱盐柱(Pierce)将原料SaC缓冲液更换为含有5mM TCEP的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)。TCEP是含还原剂的nonthiol，其在结合期间保持SaC的还原形式。将MHPH(3-N-马来酰亚胺基-6-肼吡啶盐酸盐，Solulink)的DMF溶液在300∶1摩尔过量下加入SaC。同时将SFB的DMF溶液(琥珀酰亚胺基4-甲酰苯甲酸酯，Solulink)以40∶1摩尔过量添加至5′胺化低聚物(IDT)。

该混合物在室温下反应3-4小时。用脱盐旋转柱(Pierce)去除过量MHPH和SFB，缓冲液更换为柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH 6.0)。然后将该SFB标记的低聚物以20∶1摩尔过量和该衍生的SaC结合，并在转移至4℃培育整夜之前在室温下使其反应2-3小时。用Pharmacia Superdex 200凝胶过滤柱以0.5毫升/分钟等浓度PBS流去除未反应的低聚物。用10K mwco浓度过滤器(Millipore)浓缩包含该SaC-低聚物轭合物的部分。用非还原的8％Tris-HCI SDS-PAGE检验SaC-低聚物构造的合成。实施例2：制造微阵列

DNA微阵列是通过标准方法用系统生物学研究所(ISB--西雅图，WA)的微阵列设备印在胺涂覆玻片上。代表性的点尺寸是600f.lm(SMPXB 15针，Arrayit)。全部DNA链为购买的集成DNA工艺，并且全部补体均为5′胺化。全部六个3D-mers的序列及其相应的标识给出于下表1和下表2中。表1.序列标识

名称 序列	SEQ ID NO
		A    5′-AAA AAA AAA AAT CCT GGA GCT AAG TCC GTA	3

B    5′-AAA AAA AAA AGC CTC ATT GAA TCA TGC CTA	4
		C    5′-AAA AAA AAA AGC ACT CGT CTA CTA TCG CTA	5

表2.补体

名称 序列	SEQ ID NO
		A’5′-NHz-AAA AAA AAA ATA CGG ACT TAG CTC CAG GAT	6

表2.补体

名称 序列	SEQ ID NO
		B’5′-NHz-AAA AAA AAA ATA GGC ATG ATT CAA TGA GGC′	7
C’5′-NHz-AAA AAA AAA ATA GCG ATA GTA GAC GAG TGC	8

实施例3：使用NACS的检测和分类方法以及系统

如图3和图4所示，用组织于ssDNA-低聚物标记的SaC支架上的抗原呈递MHC分子对抗原特异性的CD8+T细胞进行细胞分类。特别地，图3和4所示的分析针对细胞分类，其可以在玻璃基质上分类并通过常规的显微技术检测不同的细胞类型。该模块化的DNA-SaC-MHC构造首先与该阵列杂交，然后将包含所感兴趣的靶标T细胞的复合物细胞样品施加于该阵列上并加以分类。

根据第一系列的试验，表达了蛋白SaC，并且根据实施例1示范的步骤(参见图3)用硫醇结合将ssDNA低聚物结合至半胱氨酸残基。

通过将摩尔过量的p/MHC单体和SaC-低聚物结合，并在37℃培育20分钟，使生物素化的抗原呈递MHC在生物素/SaC结合位点结合至SaC。(见图3)

然后将该SaC/MHC/ssDNA和含有所感兴趣的CD8+细胞的溶液组合，然后根据实施例2所示的步骤(见图3)，将全部SaC/MHC/ssDNA/CD8+组件定位至用互补ssDNA的低聚物预定位的表面上。

根据第二系列的试验，制备了用于抗原特异性细胞多重分类的自组装ssDNA-p/MHC四聚物阵列。(图4)。通过在暴露于过量的生物素化p/MHC单体之前将ssDNA位点特异性结合至SAC，生成ssDNA-标记的p/MHC四聚物(图4)。通过将选择特异性和杂化的ssDNA-p/MHC四聚物联合于互补印刷ssDNA微阵列，形成p/MHC四聚物阵列(图4)。通过结合至表面限定的四聚物对表达同源TCR的T细胞进行检测。

为了进行两个系列的试验，两个经遗传学基因工程处理以表达对于黑色素瘤抗原特异性的TCRs的细胞系，酪氨酸酶-TCR转基因Jurkats和Mart-I-TCR转基因Jurkats被一起用于相应的HLA-A2限定的I类主要组织相容性复合体(MHC)单体和酪氨酸酶369-377(YMDGTMSQV-SEQ ID NO：9)和MartI 26-35(ELAGIGILTV-SEQ ID NO：10)肽。

在分类试验之前，用溶于PBS的1毫克/毫升PEG-NHS酯(Sunbio)在室温下阻滞这些微阵列玻片2小时，以防止非特异性的细胞吸收。然后将这些玻片在0.5 x PBS中浸泡5次，以去除过量PEG，随后立刻在dH20中浸泡5次，以去除盐。用氮气枪吹干这些玻片。这些玻片可以在干燥器中存储多达2周而不降低其效能。

通过先将摩尔过量的p/MHC单体结合至SaC-低聚物并在37℃培育20分钟，进行固态分类。在四聚反应后，将增添10％FBS的200ul的DMEM添加于溶液将其吸取到该DNA微阵列之上。

在37℃将该四聚物定位至互补的点1小时。然后用FBS的3％PBS溶液冲洗该玻片。冲洗后，将100III的新鲜DMEM中的106T细胞加到该阵列上的玻片。然后将该玻片转移至37℃培育箱20-30分钟，使这些细胞与该plMHC阵列。培育后，用含有3％FBS的PBS溶液轻划该玻片，以驱散未结合细胞并通过明视野和荧光显微术观测。通过用0.5μg的组装NACS四聚物结合10⁶细胞进行类似的液相捕获，使该捕获剂结合液相中的细胞。在37℃培育20分钟后，在500g旋转这些细胞5分钟，并且吸取移除过量四聚物。将这些细胞再悬浮于100/μL DMEM，10％FBS中，并将其直径施加于预阻滞的微阵列。在37℃进一步培育玻片20分钟。随后的洗涤和成象步骤和固态分类一致。

图5示意了执行上述步骤以获得单参数和多重细胞分类的结果。特别地，图5的结果显示了NACS对于单参数(图5A)和抗原特异性CD8+T细胞的多重(图5B)分类的用途。从图5的细节技术人员将了解DNA杂交的特异性，以及空间定位的p/MHC蛋白的功能，其允许以最小的点间噪声进行靶标分类，特别是细胞分类。

为了评价上述步骤所进行的检测/分类的灵敏度，进一步进行了一系列实验，其中执行了上述步骤，以用ssDNA-SA-p/MHC四聚物阵列在10％，1％，和0.1％的水平对搀入其它细胞的混合物中的抗原特异性的CD8+T细胞进行检测和分类。

图6所示的结果显示了NACS在其它细胞的混合物中用于检测和/或分类抗原特异性细胞的用途。特别地，图6A的显微图说明了细胞分类的效率，其中在每一个子面板的左上角，用百分比标出靶标T细胞群体，而图6B的柱状图显示了此试验的定量表示。较短的条代表和该分类实验的目标相比有不同抗原特异性的CD8+T细胞，其因此表示本背景信号水平。实施例4：优化的支架

图7A显示了链霉亲和素的结构，图7B显示了优化的链霉亲和素SAC的结构。

这是优化的链霉亲和素-半胱氨酸蛋白构造的晶体结构。链霉亲和素由四个等同的子单元(以各种灰度显示)组成。对应蛋白的生物素结合域被显示于图中，其中结合了生物素配位体(白色)。半胱氨酸残基在羧基端显示为红“球”。这是衍生DNA的附着点。注意此两个区域间隔约20-30埃的距离。在该晶体结构中存在第三组成部分，由lys121(灰色)显示。这也可以替代半胱氨酸残基的附着作为衍生DNA的附着点(通过胺-NHS结合)。此附着位点的问题是它太短，接近该生物素孔(即域会重叠，7埃)，因此这表示的是未优化的支架。ssDNA的直径为约10埃，dsDNA为约20埃。因此如果该DNA被附着于该赖氨酸残基，其将和该生物素结合区域物理重叠(10埃＞7埃)，阻止和生物素化结合蛋白(例如生物素化的p/MHC)的特异性相互作用。

支架设计中的合成方法容许对优化的支架的各种参数进行精确控制。例如，在肽被作为支架的情形下，若干涉及支架优化的参数可以被控制，其包括分离结合蛋白和编码多核苷酸附着区域的连结物长度，极性，和化合价。实施例5：优化和非优化的ssDNA编码p/MHC四聚物

申请人表达了SAC，用5′-马来酰亚胺ssDNA结合该蛋白，并用迁移率变动分析检验轭合物的形成。

特别地，如下进行ssDNA-SAC轭合物的生产。根据在先出版的规程由pET 3a质粒进行SAC的表达[参考文献36]。在结合之前，用zeba脱盐柱(Pierce)将原料SAC的缓冲液更换为包含5mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)的PBS。将MHPH(3-N-马来酰亚胺基-6-肼吡啶盐酸盐，Solulink)的DMF溶液在300∶1摩尔过量下添加至SAC。同时，将SFB的DMF溶液(琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸甲酯，Solulink)以40∶1摩尔过量添加至5′胺化的低聚物。在室温(RT)下反应该混合物3-4小时，随后用zeba柱将缓冲更换为柠檬酸盐(50mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH 6.0)。该SFB标记的低聚物以20∶1摩尔过量和该衍生的SAC合并，并在室温下培育整夜。用Pharmacia Superdex 200凝胶过滤柱在0.5毫升/分钟的等浓度PBS流下去除未反应的低聚物。用10K mwco浓度过滤器(Millipore)浓缩含SAC-低聚物的部分。同时，将ssDNA结合于天然的SA用于直接比较。

图8显示了结果，其表明在结合ssDNA后，表达C-末端半胱氨酸残基的链霉亲和素的基因工程变体和天然的链霉亲和素相比具有优异的生物素结合力。特别地，图8的结果显示SAC单体的分子量是～12kDa(图8A)，差一条DNA链，表示SAC-低聚物轭合物的单一链可被溶解，并且，和未改性的SAC相比，由于核酸的电荷/质量密度差异，较低级的SAC-低聚物轭合物(每蛋白1-2低聚物)跑得“更轻”(图8B)。相当于每SAC 3-4 DNA链的较高级SAC-低聚物轭合物是有利的(favored)(图8B)。

为了测试生物素结合力，用2-(4′-羟基偶氮苯)苯甲酸(HABA)，具有依据生物素是否结合于SA具有不同光密度系数的生物素分子模拟物探测SAC-低聚物轭合物[参考文献28]。在该分析中，生物素：SA摩尔比率明显低于4的联合体将显示生物素结合力减少。来源于天然SA的轭合物大于预期值以下的一个完整单元(2.86对4.0)，而用SAC形成的轭合物保持接近最佳(3.7)结合力(图8C)。

特别地，如图8所示，和4∶1比率的未改性SAC相比，每摩尔SA结合～2.9摩尔生物素的天然SA-低聚物轭合物显著减少。SAC-低聚物轭合物保持接近优化的结合力(3.7∶1)。

然后在4个不同的单克隆T细胞群体中(2个人TCR-转导细胞系和2个鼠TCR-转基因脾细胞的细胞悬浮液)测试这些轭合物。与用天然SA制备的p/MHC四聚物的相比，ssDNA-标记的SAC结构具有明显更高的细胞俘获效率(图9)。特别地，图9A显示了用天然链霉亲和素进行的细胞捕获试验结果，其中图9A中各子面板显示了采用不同细胞类型的分离实验结果。在图9B中，我们用相同的细胞测试细胞俘获效率，但是采用优化的SAC支架。技术人员应当理解，当图9A的细胞俘获效率实验极大改变时，图9B的细胞俘获效率实验在所有细胞类型间是一致的。以后的NACS四聚物SA结构全部用SAC变体制备。

该DNA编码域在附着于未优化的支架(SA)时减少生物素结合力(结合蛋白域)，导致标记并减少的T细胞俘获效率。优化的支架(SAC)最小化两个不同形态之间的相互作用，导致更高效率的T细胞分类。

此实施例中所示的结果进一步显示了该结合分子通过增加单个捕获剂中所含结合分子数目而增加的亲合力。p/MHC蛋白作为每一个别单体的特征在于弱亲合力(解离常数＝Kd～10^-5，[参考文献2])。然而当四个p/MHC蛋白约束在一起形成p/MHC四聚物时，该复合物的亲合力大为增加(Kd～10^-9，参考文献1)。这种由于多化合价增加的亲合力应当同样延及蛋白结合剂，核酸适配子，肽，小分子家族。化合价在捕获剂复合物的亲合力上的效果可清楚地见于图8-9。其中以～3p/MHC蛋白形成的捕获剂具有足以捕获T细胞群体子集的亲合力而完全形成的四聚物(4p/MHC)能够捕获并结合全部4个T细胞群体。

技术人员将理解，此系列实验所示的原理可被用于解释其它优化的支架，因为捕获剂的化合价可以用相同的推理思路进行计算。特别地，技术人员将理解，在特异性结合分子上独立使用多化合价支架总是比单体需要得多。实施例6：用包括限制位点的多核苷酸制造微阵列

全部DNA链均购买自IDT。DNA微阵列是用系统生物学研究所(ISB--西雅图，WA)的微阵列设备印在胺涂覆的玻片(GAPS II，Corning)上，含A，B和C点交替行的一式三份的12 x 12阵列，或者带SMPXB 15针的A_EcoRI和B_BamHI(Arrayit)。所有链的序列记录在下表3中。表3.用于p/MHC四聚物空间编码的正交DNA序列

表3.用于p/MHC四聚物空间编码的正交DNA序列

表3中要被结合至SAC的全部序列(A′，B′，C′，A_EcoRI′，和B_BamHI′)被设计为具有聚A连结物，其后为20mer杂化区域。该异-双功能马来酰亚胺衍生MHPH的附着需要5′胺。印在玻璃基质上的序列(A，B，C，A_EcoRI，和B_BamHI)被设计为具有被聚A分隔的两个杂化区域。其被设计为促进对胺玻璃基质的静电吸附。

序列AEcoRI和BBamH被设计为包括限制位点，其可以释放，特别是选择性释放靶标(比如根据以下实施例11释放)。实施例7：通过DNA定位和直接点样进行p/MHC阵列的生产，和常规 蛋白阵列作比较。

申请人直接将在实施例6所提供的阵列上进行的NACS和常规的在各种模型基质上直接点样的策略进行了比较。选择基质以表示通常用于定位蛋白(共价，静电，疏水性，和亲水性吸附)的表面化学谱。将荧光性的MART-1 SA-PE四聚物(装载到HLA-A2.1 MHC分子上的黑素瘤肽抗原决定簇MART-1_26-35)的连续稀释液根据厂商说明点样到基质上。

根据以下步骤制备T细胞。使用来自对酪氨酸酶_368-376特异性的TCR的α和β链。该TCR^Tyro的α和β链被克隆入慢病毒载体，其中两个转基因由[参考文献37]所述的2A自裂解序列连接。使用来自这种慢病毒载体的浓缩上清液感染Jurkat细胞，以产生Jurkat^α-Tyro细胞。使用表达F5MART-1 TCR的MSGV1-F5AfT2AB逆转录病毒载体。特别地，使用该MSGV1-F5AfT2AB逆转录病毒上清液感染Jurkat细胞以产生Jurkat^α-MART-1细胞系。为了产生表达F5 MART-1 TCR的初级人T淋巴细胞培养物，用50ng/ml的OKT3(抗人CD3鼠源性单克隆抗体，Ortho-Biotech，Bridgewater，NJ)和300U/ml的IL-2(adesleukin，Novartis，Emeryville，CA)将白细胞除去法获得的PBMCs活化48小时。MSGV1-F5AfT2AB逆转录病毒上清液被施加于纤维连接蛋白(retronectin)覆盖的孔(Takara Bio Inc.，日本)。

然后将在RPMI及添加以300IU的IL-2的5％人AB血清中的活化PBMC添加至这些孔中，并在37℃，5％CO₂下培育过夜。下一天将PBMC转移至第二组预涂敷的纤维连接蛋白逆转录病毒载体组织培养板，并在37℃，5％CO₂下培育过夜。随后洗涤细胞并将其在上述的培养介质中再悬浮。将来自患者NRA 11和NRA 13(UCLA IRB#03-12-023)的凝固白细胞除去部分解冻并在补充有10％人AB血清和1％青霉素，链霉素，和两性霉素的RPMI(Omega Scientific)中，之后用AutoMACS设备根据制造商的说明富集CD8+。分离后，将这些细胞保持于含30U IL2/毫升的RPMI-humanAB中。

然后将Jurkat^α-MART-1T细胞(用F5 MART-1 TCR转染[参考文献29]的对肽抗原表位MART-1_26-35特异性的人T白血病细胞系Jurkat)用如实施例3所示的方法施加于实施例6的阵列和另一个蛋白阵列。图10显示了该集中和量化阵列的代表性图像。

特别地，和用同样浓度的p/MHC四聚物固定化的NACS阵列相比，图10A(集中图)和图10B(量化图)显示在大多数研究的表面上很少或者没有T细胞捕获(静电的，亲水性的)或者明显干扰(疏水性的)。特别地，图10A显示了当细胞结合对于使用SAC的优化支架相容和一致时，仅在一个表面(共价的)观察到细胞结合，但是细胞捕获变化剧烈。图10B显示了图10A的量化结果。技术人员从图10的细节将理解，为了实现相当的细胞捕获密度，常规阵列需要比SAC支架多＞5倍的蛋白材料(见图10B的量化结果)。

在进一步的系列实验中，测试了用NACS进行的T细胞结合的坚固性，将其与直接点样进行的T细胞结合作比较。特别地，p/MHC四聚物被点样到被形成用于捕获T细胞的衍生表面(环氧官能团)上(与00164中没有结合细胞的其它表面相比)。根据制造商的说明将p/MHC四聚物点样，并直接和用相同量的定位p/MHC蛋白组装的NACS阵列比较。

图11中所示结果为该SAC细胞捕获平台的相容性和坚固性(图11A)，以及相应的常规方法的不一致性，其由大的点间细胞捕获非均匀性证明(图11B)。

特别地，在直接点样的表面(共价的)上观察到T细胞结合，但是细胞捕获变化剧烈，其可由所示的点内和点间非均匀性以及交叉试验方法确定的变化量证明(见图11B)。

相反，当和点样的阵列直接比较时，NACS进行T细胞定位的相容性和坚固性由图11的图像证明，其受制于点间，点内，以及实验间非均匀性(见图11B)。

此外，为了实现相等的T细胞捕获密度，NACS p/MHC阵列需要的材料比共价定位少)5倍。(p/MHC单体半数最大值≡K_1/2对于NACS为1.1ng，对于共价定位为5.7ng)。

NACS p/MHC阵列的操作和再现性有显著改进，其体现了将基于阵列的T细胞检测方案扩展用于广泛用途的整合步骤。这可能有几方面原因。第一，和需要符合表面的吸附蛋白相比，表面束缚的ssDNA-p/MHC四聚物可以在表面/溶液界面享有更大的定向自由度。此效应可以增加功能蛋白的密度，并因此减少阵列生产的材料需要量。第二，在生产和随后存储蛋白阵列期间，环境的水合作用状态对于阵列再现性是一个重要因素[参考文献9，12，17]。采用NACS可以最小化此种效应，因为DNA芯片可以被印刷并干燥存储，用于延长时间期限，并且ssDNA-标记的p/MHC四聚物阵列在实验之前可在溶液中自组合。实施例8：NACS检测特异性和检测灵敏度

为了评价p/MHC阵列组件和T细胞分类的特异性，用互补链(A)与两个其它不同序列(标示为B和C)一起根据实施例6所示步骤印刷DNA微阵列。

将NACS ssDNA-p/MHC四聚物(负载具有垂体DNA序列A′的黑色素瘤抗原肽抗原决定簇酪氨酸酶_368-376的人HLA-A*0201 MHC分子)杂交至该DNA微阵列进行制备。

然后根据实施例3所示步骤将Jurkat^α-Tyr细胞的均质种群(用对于酪氨酸酶_368-376特异性的TCR转染的Jurkat细胞)[参考文献30]杂交至该阵列。

图12所示结果显示了Jurkat^α-TyrT细胞定位至含杂交同源p/MHC的互补点(A)，而不是用非互补序列B和C(图12A)。由三个点(～600μm)算出的平均结合力为～1486±62Jurkat^α-TyrT细胞。

为了说明NACS的多重性能，将分别编码DNA序列A和B的MART-1和酪氨酸酶ssDNA-p/MHC四聚物进行合并及组装为三元DNA微阵列(A，B，和C链)。将用亲脂性染料预先染色的Jurkat^α-MART-1和Jurkat^α-Tyr细胞(绿色和红色在该灰阶版本中分别显示为浅灰色和深灰色)的1∶1混合群体施加于该阵列，并装入交互柱(图12B)。观察最小交叉反应性。点A和B的平均密度是小于均一分类的二的因子(661±19T细胞)(图12B)。为了测定检出限，将Jurkatα-Tyr细胞以10％，1％和0.1％的浓度加入到野生型Jurkat细胞中并分类(图12C)。对各混合物的每点每类别T细胞捕获密度进行计算和平均(图12D)。

粘合至该阵列的非特异性w.t.Jurkat细胞的数目在所有稀释物中是恒量，而每点捕获的Jurkat^α-TyrT细胞数目与Jurkat^α-Tyr细胞的组合比例线性递减，检出限为1000个细胞中～1-该检出限和每点可以捕获的细胞总数极为相关。因此，由于落在盲区上的抗原特异性T细胞不能取样以及和它们的同源p/MHC四聚物结合，此种方法的灵敏度受到严格的凡何限制。通过增加捕获区域的尺寸(即增加点直径和/或合并冗余点)或者减少惰性区域(即增加印刷密度)可以改进灵敏度。

此外，和缓搅拌或者微流整合在细胞分类期间可能潜在地使全部T细胞群体取样全部的蛋白阵列。该阵列的几何布置决定可以被同时应答的抗原特征数目。在这种情况，600μm点被印在12乘12栅格(～1平方英寸)中，其能够识别来自10⁶个T细胞的144个不同抗原特征(覆盖1平方英寸区域通常需要的细胞数)。实施例9：TCR基因工程改造的初级人T细胞的NACS分类和检测

外周血单核细胞(PBMCs)的TCR基因工程是在黑素瘤及其它肿瘤患者体内迅速产生大量肿瘤抗原特异性T细胞用于继承转移细胞治疗的新兴临床方法[参考文献31，32]。在此方法中，从患者收集T细胞，并用对靶标癌症抗原特异性的TCR进行转染，然后进行自体同源注入。论证检测TCR基因工程初级人淋巴细胞的可行性对于NACS的临床应用有重要意义。

相应地，在第一系列实验中，通过白细胞除去法从患者获取含CD8+细胞的人PBMCs，用含F5MART-1TCR的反向病毒载体扩张和转染。

图13A所示的结果显示流细胞计数法测定的转染效率大于90％。

随后将这些细胞在NACS阵列上用MART-1(阳性对照)和巨细胞病毒(CMV pp65_495-503/HLA-a2.1，阴性对照)p/MHC四聚物进行分类。

特别地，根据在先公开的规程(38)自己制备负载有酪氨酸酶_369-377(YMDGTMSQV)(SEQ ID NO：10)和MART-126-35(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO：11)的HLA-A*0201限定的MHC类别I单体。A2.1-限定的EBV BMLF1_259-267(GLCTLVAML)(SEQ ID NO：21)，CMV pp65_495-503(NLVPMVATV)(SEQ ID NO：22)，鼠H-2Kb/-OVA_257-264(SIINFEKL)(SEQ ID NO：23)，和鼠H-2Db/-gp100_25-33(KVPRNQDWL)(SEQ ID NO：24)，以及所有荧光性HLA-A*0201四聚物购买自Beckman Coulter。亲脂性细胞膜染色染料DiO，DiD，和DiL购买自Invitrogen。

在实验之前，用1毫克/毫升PEG-NHS酯(Sunbio)的PBS溶液在室温下阻滞微阵列玻片2小时，以防止非特异性细胞结合。将四倍摩尔过量的p/MHC单体与ssDNA-SAC在37℃混合20分钟。在37℃下于200μl介质中将ssDNA-p/MHC四聚物混合于DNA阵列1小时，并用3％的FBS的PBS溶液冲洗。在该阵列上于37℃培育T细胞(10⁶/100μl介质)30分钟。用3％的FBS的PBS溶液冲洗该阵列，并通过明视野(Nikon Eclipse TE 2000)和/或共焦显微术(Nikon E 800)观测细胞捕获。T细胞捕获后，通过用200μl含荧光性p/MHC四聚物与荧光性cDNA(Cy5-A′和/或Cy3-B′)的介质培育该阵列，完成p/MHC四聚物染色。在成像之前，用3％的FBS的PBS溶液冲洗该阵列。对于选择性T细胞释放实验，用三个等同的阵列固定细胞。在RPMI介质中37℃下用EcoRI，BamHI，或者DNase处理1-2小时。DNase购买自Sigma，其余全部酶来自NEbiolabs。

为了进行p/MHC对比研究，从Arrayit(Sunnyvale，CA)购买SuperEpoxy和SuperProtein(分别表示共价和疏水性的表面)。从Corning购买Amine GAPS II玻片(静电性)。从XanTec(德国)购买聚羧酸酯水凝胶(亲水性)。根据制造商的说明为每一个玻片印刷荧光性MART-1四聚物。用ImageJ(NIH)量化细胞分类图像并用Origin(OriginLab，MA)安装至HillFunction(NACS n＝2，R2＝0.95，共价n＝2.1，R2＝0.97)。

该转染的T细胞只被固定化至MART-1区域。在细胞被固定在阵列上后，通过用荧光性MART-1和CMV p/MHC四聚物(分别为红色和蓝色)双重确认被捕获细胞的抗原特异性。

图13B和图13C所示结果显示没有细胞被染色为对于CMV特异性(见图13B中的点状圆)，并且该细胞捕获是特异性的(参见图13C的共焦和明视野图像)。实施例10：内源性初级人T细胞的NACS分类和检测

对从周围血液分离的初级人T细胞进行NACS检测。这是因为，一般而言从周围血液分离的初级人T细胞通常比培养的细胞系更需要，因为抗原特异性T细胞的单一群体存在于大范围的不同血细胞中，并具有不同特征的表达单克隆和多克隆TCRs的T细胞。此外，这些T细胞可能表达内源性水平的TCR。申请人探索了上述实施例中发现的NACS的相同特性是否可以同样用于内源性的初级人T细胞。

在NACS分类之前，对来自患者的冷冻白细胞除去法样品NRA11和NRA13进行CD8+富集。

通过流细胞计数法分析用荧光性EBV和CMV p/MHC四聚物染色的患者体内的EBV特异性和CMV特异性的T细胞NRA 11和NRA 13的数量和特异性。

图14所示结果显示从NRA 13分离的淋巴细胞包含显著性水平的EBV特异性T细胞(4.9％)和极少CMV特异性T细胞。(参见图14A)而从NRA 11分离的淋巴细胞包含高水平的CMV特异性T细胞(9％)和低数目的EBV特异性细胞(0.12％)(参见图14B)。

该测定之后，在单一靶标检测和多重检测实验中用NACS技术分析来自患者的白细胞NRA 11和NRA 13。

对于单靶标检测实验，对来自患者那3的冷冻白细胞进行CD8+富集，并将其施加于按实施例6的方法提供的CMV和Epstein-barr病毒(EBV BMLF1_259-267/HLA-a2.1)p/MHC阵列。

对于多重检测，通过将NRA 13淋巴细胞与来自患者NRA 11的CMV特异性T细胞混合，形成EBV特异性和CMV特异性的CD8+T细胞的1∶1混合物，并将该混合物施加于按实施例6的方法提供的CMV和Epstein-barr病毒(EBV BMLF1_259-267/HLA-a2.1)p/MHC阵列。

图15所示结果显示，在两个实验中，T细胞被选择性并且定量地检测。特别地，在用患者NRA 13的白细胞(leukepheresis)进行的检测中，只有T细胞被捕获于EBV区域(参见图15A)。从NRA 11和NRA 13的1∶1混合物的检测到的T细胞(左面板)被检验为对于EBV和CMV是特异性的。特别地，在NACS细胞分类和荧光性p/MHC四聚物染色后，这些群体针对适当的抗原特异性被互补染色(图15B)。

将来自患者NRA 13的T细胞依次稀释以形成包含EBV特异性T细胞的细胞混合物(以FACS计算～0.4％，0.2％，和0.1％(图14C)。这三种EBV特异性T细胞的混合物在用EBV/HLA-a2.1四聚物编码的阵列上接受检测，如图15D所示。

图15C和15D所示结果显示分离的目标在低达～0.1％的频率下被解析(图15D，暗灰色箭头)。捕获区域(黑色箭头)内未被染色细胞的数目在所有稀释物中为恒量(～1-2细胞/点)，并可以表示基于非特异性相互作用的背景水平。应当注意，我们在T细胞定位后结合荧光性p/MHC四聚物是出于说明的目的，捕获细胞的特异性可以仅由阵列的记录来确定。实施例11：通过用NACS方法固定化的T细胞的限制性核酸内切酶进 行控制和选择性释放

固定在玻璃上的抗原特异性T细胞可即刻用于第二分析，因为许多方法，例如免疫组织化学(IHC)，荧光原位杂交(FISH)和细胞活素分泌分析[参考文献5，7]是以传统方式进行的，或者与定位至基质的细胞相适应。然而，若干其它的相关分析法需要有释放被捕获细胞的方法，比如被设计为评估T细胞表现型或者功能状态类的基因组/mRNA分析，或者简单地为了表现型的富集的进一步的培养。任何理想的释放方案对于给定细胞类型均应当是选择性的。对于NACS，申请人探索了DNA束缚是否可以通过开发限制性核酸内切酶的序列特异性被选择性裂解。

申请人将独特的限制位点集成至用于细胞分类的各DNA序列(见以上实施例6)，并发现抗原特异性T细胞的不同群体的附着事实上可以被独立控制(图16b)。

特别地，实施例6的低聚核苷酸A和B通过引入分别对核酸内切酶EcoRI和BamHI特异性的6bp限制位点而被修饰，由此获得低聚核苷酸A_EcoRI和B_BamHI，该方法被显示于图16A中。

因此用含EcoRI和BamHI限制位点的正交序列印刷DNA微阵列。然后，如实施例7所示制备并用亲脂性染料(分别为红色和绿色)预先染色的Jurkat^α-MART-1和Jurkat^α-Tyr细胞被分类于用DNA序列A_EcoRI和B_BamHI根据实施例6所示方法印刷的阵列上。

图16B所示结果显示了A_EcoRI和B_BamHI的分类，以及用相应的限制性内切酶处理后所选定靶标的正确释放。

特别地，该细胞被首先固定在图16Bi所示的阵列上，其中红色染料被显示为深灰色，绿色染料被显示为浅灰色。

T细胞定位后，用BamHI处理阵列，以裂开该B_BamHI点以及选择性释放结合的Jurkat^α-Tyr细胞(图16Bii)。相反，在分离的但是相同的阵列上，Jurkat^α-MAER-1细胞在用EcoRI处理之后被释放(图16Biii)。用互补的核酸内切酶(EcoRI对状态(ii)或者BamHI对状态(iii))进行第二轮酶催化处理，去除剩余的粘着细胞(图16Biv)。此外，全部被捕获的细胞(i)可以在单步骤中添加DNase而被非选择性地释放(数据未示出)。实施例12：用于对溶液中被捕获的靶标进行NACS检测的方法

细胞的靶标群体可以根据一方法被捕获，其中该编码捕获剂在结合基质以前和靶标接触。

图17显示了根据此方法进行的一系列示范性实验。生物样品中所感兴趣的生物标记物可以和溶液中的多核苷酸编码捕获剂结合。结合后，全部该样品可被施加于用cDNA印刷的基质。在施加于该基质后，该生物样品被定位至DNA杂交介导的空间可区分位置。因此和该多核苷酸编码捕获剂结合的载荷可以用熟习技术的读者可以确认的常规的荧光及其它检验技术进行识别。

在图17的实验中，可将编码多核苷酸捕获剂用于在溶液中结合细胞表面上的生物学靶标。这被示范于面板A中，其中荧光多核苷酸-编码酪氨酸酶/HLA-A2.1 p/MHC四聚物被用于染色Jurkat^α-Tyr细胞，并用流细胞计数法分析。将其直接与荧光酪氨酸酶/HLA-A2.1 p/MHC四聚物进行比较。两种试剂以相等强度对Jurkat^α-Tyro进行染色。用多核苷酸-编码酪氨酸酶/HLA-A2.1 p/MHC四聚物预先染色的Jurkat^α-Tyro细胞在DNA杂交介导的阵列(面板B)上被捕获并检测。请提供关于该图结果的说明。实施例13：含有蛋白质结合分子的其它优化支架捕获剂

其它优化支架可以由A蛋白，G蛋白，和A/G蛋白提供，其为结合所有IgG子类的Fc域，并对IgA，IgE，IgM和IgD有限长度的细菌重组体家族。特别地，这些蛋白可以在DNA通过NHS-酰胺结合化学过程随机附着于蛋白表面上的自由赖氨酸残基的实施方式中作为未优化支架。该结合蛋白是抗所期望的生物标记物的IgG抗体(例如T细胞上可发现的CD3)。可以用ssDNA-蛋白A/G培育摩尔过量的IgG抗体并将其用于分类和捕获所感兴趣的生物学靶标(例如抗-CD3-蛋白A/G-ssDNA轭合物可被用于从细胞的复合混合物选出T细胞)。

图18所示为支链肽的假想图。在此该肽从N末端丙氨酸至C末端酪氨酸残基延伸的长度是9个氨基酸。在4位赖氨酸残基处从其C端有一分支点，其使该支架具有两倍化合价。在N端的反应性马来酰亚胺基团是用于附着两个具有自由硫醇基的结合体蛋白的化学手段，并且该编码多核苷酸可以通过NHS-酰胺结合被附着于紧接该C-末端酪氨酸残基的赖氨酸残基。由于该结合蛋白和该编码多核苷酸的附着位点通过这种支链肽方式被分离，所得捕获剂可以是充分极性和优化的。示范性的结合分子可以是包含半胱氨酸残基的RGD肽(Anaspec，#29897)。要检测的靶标包括表达整联蛋白受体的细胞(ATCC，#CCL-92)。

另外的优化蛋白支架是蛋白SAC3，其由初级氨基酸序列表示：HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCGGSGCGGSGCP(SEQ IDNO：25)

此种其它优化的链霉亲和素支架在c末端包含3个半胱氨酸残基，作为编码多核苷酸的特异性附着位点。通过结合摩尔过量的生物素化p/MHC(酪氨酸酶/HLA-A2.1)和ssDNA-SAC3，所得捕获剂可被用于从复合混合物中靶定T细胞。在图19中，该优化的支架SAC3(右面板)的T细胞的捕获效率(Jurkat^α-Tyro)被直接和该优化的支架SAC进行比较。细胞俘获效率相同。

SA的任何形式的优化方案将维持和生物素4∶1的结合比率。申请人已提供了超过一种优化SA，不同的优化SA对特定靶标作用各异。最终根据结合靶标的能力选择支架。在SA结合之外，支链肽(比如图18所示的肽)可以被用作多聚支架，可以有单体或者二聚或者n聚物的支架，其也取决于实验设计。实施例14：含有蛋白质结合分子的捕获剂

其它结合蛋白和支架也可以被使用。整联蛋白是结合胞外基质蛋白的异源二聚体细胞表面受体，其通常由肽基序精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸组成。包含该RGD基序的生物素结合肽可以从Anaspec(#62347)购买。这些肽结合分子可以用优化的支架(如SAC-A)组合并用于分类包含表达整联蛋白的靶细胞的细胞群体，其包括3T3纤维原细胞(ATCC，#CCL-92)。实施例15：含有连结物的捕获剂

连结物可用于将结合蛋白连接至支架。其可以由肽序列组成。例如，连结物GGGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：26)可以被附着在HLA-a2.1 MHC分子。生物素分子可以用酶BirA联接酶附着于所得连结物。这种生物素化的p/MHC构造可被用于和优化的A-SAC支架连接，以在cDNA印刷基底上分类抗原特异性细胞。

其它连结物可以由肽LCTPSRGSLFTGR(SEQ ID NO：27)组成，其也可以被附着于结合蛋白，如MHC分子的C末端。可以用甲酰甘氨酸生成酶(FGE)将甘氨酸残基变为醛基。包含酰肼的支架(R-NH-NH2)(例如将SANH(琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸酯丙酮腙，Solulink)与支架SA反应)可被用于附着该醛-MHC结合蛋白。

连结物的实例可以是聚-尿嘧啶RNA序列UUUUUUUUUU(SEQ ID NO：28)。此连结物可以在核糖核酸酶A，核糖核酸内切酶存在下开裂，其裂解不成对的(即单链)C和U残基的3′端。实施例16：用NACS描绘细胞捕获的表面标记物的免疫PCR

在阵列上被捕获的T细胞可以被进一步分析。一种分析法是免疫PCR[参考文献51]。用不同DNA标签加以标记的抗体(DEAL轭合物)在此被用于和所感兴趣的靶标结合，在此实施例中，其为表达在细胞表面上的生物标记物。结合后，该抗体上的DNA标记可以用PCR扩增和检测。在已经表明其对于来自溶液的蛋白有效的同时，申请人还表明当生物标记物被限制在细胞表面时，此概念也是可行的。将图20所示(右上面板，通过流细胞计数法确认)的表达EGFR的细胞系(CD细胞)和具有零表达EGFR的细胞系(Jurkat细胞)用α-EGFR-ssDNA DEAL轭合物染色。染色后用PCR和Q-PCR扩增该EGFR抗体的标记(下面板)。在14.6周期(CD细胞)和23.2周期(Jurkat细胞)检测到标记的存在。器对应～400∶1的信号对干扰。

同时，将DNA编码的p/MHC四聚物用于检测T细胞上TCR的存在。将两个细胞系，其一表达对于MART-1抗原特异性的TCR(Jurkat^α-MART1)，和表达对于酪氨酸酶抗原特异性的TCR的另一细胞系(Jurkat^α-Tyr，两个细胞系均通过用荧光p/MHC四聚物染色并用流细胞计数法分析进行验证，图20，左上面板)用DNA编码的MART-1/HLA-a2.1p/MHC四聚物进行染色。通过PCR扩增DNA标记，并用凝胶电泳检测。在15周期内可检测到Jurkat^α-MART-1细胞，而不表达同源TCR的Jurkat^α-Tyr细胞在大约10个周期内显现。因此可以特异性地检测MART-1特异性的TCR的存在。实施例17：用NACS和DEAL轭合物动态功能性描绘T细胞

申请人通过将ELISPOT型夹心式分析法和p/MHC NACS集成，对捕获的“在位点”鼠TCR转基因脾细胞产生的细胞因子进行检测(图21，22)。用DNA链A′，B′，和C′分别编码三种鼠抗细胞因子抗体(IL-2，IFN-γ和TNF-α)。将H-2Kb-OVA257-264ssDNA-p/MHC四聚物编码至所有三条链。将ssDNA-p/MHC四聚物和抗体的轭合物联合并组装至用互补链A，B和C印刷的微阵列。然后将鼠OT1淋巴细胞(来源于大多数脾细胞对于抗原模型OVA257-264为特异性的TCR转基因鼠)接种在该阵列上。在2，5，或者18小时的培育期之后，添加组合的细胞因子检测抗体并且通过共焦显微对玻片成像(图22A)。在时间点5和18检测到炎症细胞因子IFN-γ，暂时增加平均直径的离散散布簇(在5小时处直径～50-100μm)的出现可归因于分子扩散和持续分泌。各信号序列的局部附近地区的测验显示各荧光簇为单一细胞，而相邻细胞显现为非响应(图22B)，其提示各IFN-γ信号序列源自于单一细胞。IFN-γ簇的数目在5小时和18小时之间保持～3的恒量，其指示在这些小时之间活化T细胞数目没有增加。在这些时间点没有检测到显著水平的鼠IL-2和TNF-α。

在前述的实施例中，申请人参照T细胞进行示范，描述了用于产生高效率目标探测和分类的稳固以及模块化的p/MHC阵列的方法。包含更多套DNA序列[参考文献19，24]可以使模块化组件具有更高阶的用于T细胞筛选实验的p/MHC阵列(例如一个DNA序列工作组可被互换地用于产生任何p/MHC阵列组合)。这在TCR肽抗原决定簇发现领域中可以有直接应用，该领域最近在老鼠和人类中利用多色彩流细胞计数法通过高处理量CD8+筛选实验发现了新的抗原肽[参考文献33，34](制备和测试了2,000个不同的p/MHC四聚物)。

NACS阵列预计可将此种实验进行流水线化。虽然生产单一p/MHC单体的某些传统方法为时间和劳动密集型，最近报道使用条件性肽交换技术可以相对简单的迅速形成1000单体p/MHC库[参考文献34-36]。用这些肽交换工艺进行的NACS集成是实际可行的选择。NACS阵列在关键标准(比如再现性和均一性)上优于常规的点样阵列。开发了DNA序列用于细胞分类的通用性，使其对于下游的分析可以用限制性核酸内切酶进行固定T细胞的靶标群体的程式化选择性释放。由于该性能，轻巧和模块化的p/MHC四聚物阵列组件，NACS作为多用途平台，对于多重T细胞检测极具前景。

申请人还论证了NACS平台的许多优点。它显著地优于某些利用p/MHC四聚物和捕获细胞的表面结合的文献方法。由于细胞分类在传统的DNA印刷技术制备的玻璃基质上进行，它可以简单并且廉价地实行。此外，分类的细胞可以被选择性释放，其容许在NACS分类的细胞上展开许多生物分析方法。

申请人预期NACS将可发现基于TCR特异性的T细胞多重分类之外的用途。用于前述实施例的主要成分-链霉亲和素-半胱氨酸核心和正交的单链DNA序列-在理论上可被开发以实现定向结合和空间寻址。因此此平台可以接纳任何用生物素标记的结合蛋白或者小分子结合剂家族。由于SA的化合价而使p/MHC四聚物增长超过单体的亲合力同样可扩展至其它的捕获剂，这可以使从高至中等亲和力的探针产生细胞阵列成为可能，如抗体，核酸适配子或者肽。

特别地，NACS方法可被用于涉及复合物治疗和/或诊断用途。该MHC复合物由位于主要组织相容性复合体(MHC)分子的凹槽中的抗原(肽)的片段组成。TCR的一部分具有对于MHC的亲合力，并且一可变部分具有对于肽抗原的亲合力。此种肽可以是极短片段(＜＜10氨基酸长度)，因此在该TCR和MHC/抗原之间的亲合力较弱。不过，对于许多基础和临床目的，通过抗原特异性分类T细胞至关重要。这种分类可被用于测定免疫系统如何响应一些疾病，比如感染或者癌症。它还是各种可用于某些肿瘤(比如黑素瘤)治疗的免疫疗法的关键部分。在这种情况下，来自患者的T-细胞被收集，进行遗传改性，以使其变成编码为识别和杀死某些癌细胞的抗原特异性的T-细胞。

一经修改，这些T-细胞即被送回患者体内。此治疗中的所有步骤均涉及T-细胞分类，除了最后一步-识别哪些T-细胞演变为抗原特异性的T-细胞，其涉及通过抗原特异性分类这些T-细胞。可以从复合混合物中分类各种抗原特异性T-细胞的高亲合力试剂对于这种治疗是重要的。

存在需要通过各种膜蛋白分类细胞的其它实施例，但是膜蛋白对基于抗体的分类方法不提供优良的“操作性”。

一个实例是表达名为EGFR-VIII的EGFR蛋白的遗传突变体的癌细胞。EGFR-VIII是一种原癌蛋白，意即其为一种可以导致癌症的重要的基因突变体。然而，它还是一种膜蛋白，其中该蛋白的多数胞外部分已经被裂解。剩余部分只有小“把手”，因此抗体对EGFR-VIII仅呈现对蛋白的弱亲合力。通过各种癌症相关蛋白(比如EGFR，EGFR-VIII，等等)在肿瘤中对细胞进行多重分类可以提供关于该癌症的关键诊断信息，其可以接着被用于直接治疗或者联合治疗。

总之，在若干实施方式中在此提供的是用于靶标检测的多核苷酸-编码捕获剂，特别是模块化的含有靶标结合组分，支架组分和编码组分的多核苷酸-捕获剂，其由可以受控方式结合和分离的标准化分子单元形成，以及相关的组合物方法和系统。

以上所述实施例旨在向本领域普通技术人员提供如何制作和使用所公开的捕获剂，装置，系统和方法的实施方式的完整公开和说明，其不是为了限制发明人所认为的公开范围。对于本领域技术人员而言，用于实施所公开内容的上述方式的显而易见的改进被认为落入以下的权利要求范围。说明书中所有提及的专利和出版物提示了所公开内容涉及的本领域技术人员的技术水平。此公开内容中全部引用的参考文献如同各参考资料已经以参考方式被独立地全部并入。

各引用文件(包括专利，专利申请，杂志文章，摘要，实验手册，书籍，或者其它公开内容)在背景，详细说明，和实施例中的全部公开内容以参考方式被合并于此。此外，一同提交的序列表的硬拷贝和相应的计算机可读形式在此以参考方式被合并。

应当理解，所公开的内容不局限于特定的组合物或者生物系统，其可以毫无疑问地变化。还应当理解此处使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式的目的，不是为了作为限制。在此说明书和后附权利要求中使用时，单数形式“一”，“和”，“该”包括复数个指示物，除非有明确限定的内容。术语“复数个”包括两个或两个以上指示物，除非有明确限定的内容。除非另外定义，此处所用的此公开内容涉及的全部学术和科学术语具有和本领域普通技术人员通常理解相同的含义。

虽然本公开内容描述了特定的方法和材料，任何此处所述方法和材料的类似或等效物均可在实践中用于试验此处所描述的特定实施例。

本公开内容的许多实施方式已有叙述。不过应当理解，在不离开本文公开内容的精神和范围前提下，可以作出各种改进。相应地，其它实施方式也落入以下权利要求的范围。

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Claims (27)

1.一种模块化多核苷酸编码捕获剂，其被设置为与靶标特异性结合，该模块化多核苷酸编码捕获剂含有

至少一个被设置为与靶标特异性结合的结合分子，

被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，和

被设置为以位置可区分的支架结合区域与该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结合的支架分子，

该位置可区分的支架结合区域被布置在支架分子上，以在该至少一个结合分子以及该编码多核苷酸附着后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性结合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。

2.如权利要求1所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中

该支架结合域包括用于结合该至少一个结合分子的第一支架结合区域，以及用于结合该编码多核苷酸的第二支架结合区域，和

其中该第一支架结合域和该第二支架结合域通过正交化学过程结合该至少一个结合分子和该编码多核苷酸。

3.如权利要求2所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该第一支架结合域和该第二支架结合域被布置在该支架结合分子上，以最小化结合于该支架分子的该至少一个结合分子和结合于该支架分子的该编码多核苷酸之间的相互作用。

4.如权利要求1至3任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子包括多个第一支架结合域和/或多个第二支架结合域。

5.如权利要求4所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子上的每一个多重第一支架结合域结合至该至少一个结合分子，并且该支架分子上的每一个多重第二支架结合域结合至该编码多核苷酸。

6.如权利要求2至5任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该第一支架结合域用连结物分子结合至该至少一个结合分子，该连结物分子用至少一个结合分子连接第一支架结合域。

7.如权利要求6所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该连结物分子是条件性连结物。

8.如权利要求1至7任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该至少一个结合分子包括用于结合靶细胞的多个相同的或者不同的结合分子。

9.如权利要求1至8任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该编码多核苷酸包括至少一个布置限制性内切酶位点，其被布置在该编码多核苷酸中，以用于通过相应的限制性内切酶裂解。

10.如权利要求1至9任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中至少一个该支架分子和该至少一个结合分子是蛋白。

11.如权利要求10所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子是链霉亲和素，SAC，SAC3，抗体或者其优化变体。

12.如权利要求10或11所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中至少一个结合分子是MHC二聚物，MHC三聚物，或者MHC四聚物，适配体，小分子或者抗体。

13.如权利要求1至12任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该模块化多核苷酸编码捕获剂是极性的模块化多核苷酸编码捕获剂。

14.一种在样品中检测靶标的方法，该方法包括

将附着于基质的基质多核苷酸和模块化多核苷酸编码捕获剂结合，该模块化多核苷酸编码捕获剂包括结合至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合分子特异性结合至该靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合至附着于该基质的该基质多核苷酸；和

检测与附着于该基质的基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中将附着于基质的基质多核苷酸和模块化多核苷酸编码捕获剂进行结合是通过

提供附着于该基质的基质多核苷酸；

提供包括附着有至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该至少一个结合分子特异性结合至该靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合至该基质多核苷酸；和

将该模块化多核苷酸编码捕获剂和样品并且和基质在允许该结合分子和模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物中的靶标结合的条件下接触一段时间；和

将该编码多核苷酸与该基质多核苷酸结合。

16.如权利要求14所述的方法，其中该模块化的多核苷酸捕获剂是权利要求1至13任一项所述的模块化的多核苷酸捕获剂。

17.一种用于在样品中检测靶分子的系统，该系统包括

具有附着于该基质的基质多核苷酸的基质；

至少一个特异性结合靶标的结合分子，

特异性结合附着于该基质的该基质多核苷酸的编码多核苷酸，和

被设置为以位置可区分的支架结合区域与该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结合的支架分子，

该位置可区分的支架结合区域被布置在该支架分子上，以在和该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结合后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性结合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。

18.如权利要求17所述的系统，其中该支架结合域包括用于结合该至少一个结合分子的第一支架结合区域和用于结合该编码多核苷酸的第二支架结合区域，和

其中该第一支架结合域和该第二支架结合域通过正交化学过程结合该至少一个结合分子和该编码多核苷酸。

19.如权利要求18所述的系统，其中该第一支架结合域和该第二支架结合域被布置在该支架结合分子上，以最小化结合于该支架分子的该至少一个结合分子和结合于该支架分子的该编码多核苷酸之间的相互作用。

20.一种用于分类复数个靶标中的靶标的方法，该方法包括

将复数个附着于基质的基质多核苷酸和复数个模块化多核苷酸编码捕获剂结合，各基质多核苷酸是序列特异性和彼此位置可区分的，并且该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂中每一个模块化多核苷酸编码捕获剂包括附着有至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合分子特异性结合每一个该复数个靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合该复数个基质多核苷酸中序列特异性和位置可区分的基质多核苷酸，每一个结合分子和编码多核苷酸彼此是结合可区分的；和

在复数个结合至基质的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标-复合物中分类该复数个靶标。

21.如权利要求20所述的方法，其中该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂包括权利要求1至13任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂。

22.一种用于在样品中分类复数个靶标中的靶标的方法，该方法包括

提供复数个附着于基质的基质多核苷酸，各基质多核苷酸是序列特异性和彼此位置可区分的；

提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂，各模块化多核苷酸编码捕获剂包括附着至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合分子特异性结合该复数个靶标中的预定靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合该复数个基质多核苷酸中序列特异性和位置可区分的基质多核苷酸，各结合分子和编码多核苷酸是彼此结合可区分的；

将该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂和该样品在允许该至少一个结合分子和该靶标结合的条件下接触一段时间，由此提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-目标体系；和

将该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-目标体系和该复数个基质多核苷酸在允许该编码多核苷酸结合至附着于该基质的该基质多核苷酸条件下接触一段时间，

由此在复数个结合至基质的多核苷酸-编码蛋白-靶标-复合物中分类该复数个靶标。

23.如权利要求22所述的方法，其中该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂包括权利要求1至13任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂。

24.一种用于分类复数个靶标的系统，该系统包括

具有复数个附着于基质的基质多核苷酸的基质，附着于该基质的该复数个基质多核苷酸的各多核苷酸是序列特异性和彼此位置可区分的；

复数个结合分子，各结合分子特异性结合该复数个靶标中的互补靶标，

复数个编码多核苷酸，各编码多核苷酸特异性结合附着于该基质的该复数个基质多核苷酸的每个多核苷酸，

至少一个支架分子，其被设置为用位置可区分的支架结合区域结合该复数个结合分子中每个结合分子，以及该复数个编码多核苷酸中每个编码多核苷酸，

该位置可区分的支架结合区域被布置在该支架分子上，以在和该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结合后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性结合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。

25.一种支架分子，包括

被设置为附着至少一个结合分子的第一支架结合区域和

被设置为附着编码多核苷酸的第二支架结合区域，

其中该至少一个结合分子被设置为与靶标特异性结合，并且该编码多核苷酸被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合；和

其中该第一支架结合域和该第二支架结合域是位置可区分的，并被布置于该支架分子中，以在该至少一个结合分子和该第一结合域结合，并且该编码多核苷酸和该第二结合域结合后，最小化该至少一个结合分子和该编码多核苷酸之间的相互作用。

26.如权利要求25所述的支架分子，其中该支架分子是SAC或者SAC3。

27.一种多核苷酸编码捕获剂，包括：

特异性结合靶标的结合分子和

附着于该结合分子的编码多核苷酸，

其中该编码多核苷酸包括特异性结合至基质多核苷酸的序列，并且该序列包括至少一个布置限制性内切酶位点，其被布置在该编码多核苷酸中，以用于通过相应的限制性内切酶裂解。

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