CN1635165A - 一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法 - Google Patents
一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1635165A CN1635165A CN200410090423.3A CN200410090423A CN1635165A CN 1635165 A CN1635165 A CN 1635165A CN 200410090423 A CN200410090423 A CN 200410090423A CN 1635165 A CN1635165 A CN 1635165A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleic acids
- probe
- sequence
- acids probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 127
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 175
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 42
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 42
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 claims description 35
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 9
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 9
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 9
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 8
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 8
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 claims description 3
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 claims description 2
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 claims description 2
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 12
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102000004586 YY1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010042669 YY1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101150092780 GSP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 2
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 2
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108091000371 single-stranded RNA binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 102000016662 ELAV Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010053101 ELAV Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102100023008 Single-stranded DNA-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710141937 Single-stranded DNA-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤：1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。本发明可以广泛用于疾病诊断、药物靶标筛选、疾病机理等领域。
Description
技术领域
本发明涉及核酸结合蛋白的检测方法，特别是涉及一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法。
背景技术
核酸结合蛋白包括双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白等。
双链DNA结合蛋白是一类可以与一段特定序列的双链DNA特异结合的蛋白质分子或是蛋白质分子复合物。双链DNA结合蛋白主要包括原核生物中的阻遏子、操作子蛋白和真核生物中的转录因子等。这些双链DNA结合蛋白通过与特定序列的DNA双链(operator/promoter)结合，从而激活、抑制、减弱或是增强特定基因的表达。原核生物中的阻遏子蛋白和操作子蛋白的功能相对简单，可以调控编码细胞代谢过程所需酶类、编码抗生素耐受基因的表达，使得细胞的生理活动与外界的环境相适应；真核生物的转录因子的功能繁多，细胞周期、细胞凋亡、癌变等各种现象都与特定的转录因子密切相关。在生物体，尤其是真核生物的基因表达调控网络中，编码蛋白质的基因的表达要经过转录因子介导的转录激活，转录，转录后修饰(包括RNA的剪切、加帽和加尾)，翻译，翻译后修饰(包括磷酸化、糖基化、乙酰化等)等过程，在转录前、转录后和翻译后三个水平受到调控。
转录因子介导的转录激活作为整个基因表达调控网络的第一环是非常重要的。生物体对外界环境的应激反应大多是通过特定的转录因子开启或是关闭一些特定的基因实现的。研究表明，绝大多数的真核生物的基因的表达都受到一个或是一些特定的转录因子的调节。愈是复杂的生物体，编码转录因子的基因一般愈多，基因表达调控的机制也更为复杂。据预测，人类基因组中有超过5％的编码蛋白质的基因是编码转录因子的。许多转录因子与癌症密切相关。例如有些转录因子是一些仅仅在恶性肿瘤组织中才表达或是会增强表达的原癌基因的产物(如FOS和C-Myc)，而又有一些转录因子仅仅在恶性肿瘤组织中微弱表达或是没有表达(如p53和E2F)。因此，如果可以检测生物体某一时刻的部分转录因子或是全部转录因子的表达水平，再结合已知的转录因子调控基因的数据，就可以得到转录前水平的调控信息，可能用以诊断组织是否发生癌变，还可以筛选药物靶点，研究一些细胞应激反应的机制，观察细胞的信号通路的激活或是关闭等。
现有的cDNA微阵列技术可以给出全基因组水平所有转录因子编码基因的mRNA表达状况的数据。但是只有具有活性的转录因子才可以调控基因的表达，而转录因子的活性往往受到磷酸化，乙酰化，糖基化等多种修饰方式的调控，转录因子在细胞中的定位也会影响转录因子的活性，所以具有活性的转录因子的数量和转录因子的mRNA或是蛋白水平的表达状况并不是直接相关的。例如在细胞周期各个阶段中，转录因子Yin Yang 1(YY1)的mRNA和蛋白水平的表达几乎是恒定的，但是具有活性的YY1数量是随着细胞周期有规律变化。所以cDNA微阵列从理论上是不能给出生物学家感兴趣的转录因子表达谱数据的。
常规的“活性”双链DNA结合蛋白(转录因子)的检测方法是凝胶滞留法(EMSA：Electrophoretic Mobility Shift Assay，gel shift，band shift)。将待测蛋白质样品与已知的带有同位素标记的DNA双链分子混合反应后，在非变性的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于在电泳过程中，结合了蛋白质的双链核酸分子比没有结合蛋白质的双链核酸分子迁移的慢一些，电泳后通过放射自显影，可以在胶片上得到分立的电泳条带，从而可以判断是否有预期的双链核酸和结合蛋白的相互作用的发生。近年来，凝胶滞留技术也得到了一些改进，例如使用荧光或是化学放光技术替代同位素进行检测。针对非特异结合现象，使用特异的双链DNA结合蛋白的抗体进行DNA-结合蛋白复合物的检测，称为Super-shift。凝胶滞留法这项技术的出现极大地推动了DNA和蛋白质相互作用的研究工作，但是它存在着明显的缺点：操作复杂；耗时耗力，往往需要一整天的时间进行实验；检测通量低，一次仅仅能对一种双链核酸结合蛋白进行检测，检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；检测如果使用同位素，对人体有潜在的伤害，如果使用化学发光或是荧光，价格昂贵。
美国的BD Biosciences Clontech公司(Palo Alto，CA)推出了一种MercuryTM转录因子试剂盒(MercuryTM Transcription Factor Kit)。该试剂盒给出了用以检测转录因子的96孔板。96孔板上的每个孔里包被有带有可以与一种转录因子特异结合的核酸序列的双链DNA探针。将待检测样品加入孔中进行反应，探针就会与待测样品中对应的转录因子结合。清洗后，再加入特异识别该转录因子的一抗，再加入酶标记的二抗与一抗结合，进行化学发光检测。该技术大大缩短了传统的凝胶滞留方法的实验时间，使用化学发光技术替代了可能对人体产生伤害的同位素。但是仍然存在通量较低的问题，即一次(一个孔中进行的反应)仅仅能对一种转录因子进行检测；检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；反应需要使用特异识别转录因子的抗体，而大多数转录因子并没有满足上述方法需要的商业化的一抗。
生物体内还有一些序列特异的单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白，它们大多可以调节生物体的生理活动。此外，通过体外进化(in vitro evolution)的方法，可以筛选出与靶标蛋白分子特异结合的类似于抗体的核酸配体，这些核酸结合蛋白还没有相应的高通量的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测通量高、灵敏特异的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法。
本发明所述提供的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤：1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。
其中，步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下五种过程进行：a)将步骤1)所得混合样品用常规凝胶电泳分离，经切胶、用试剂盒分离或用电洗脱得到所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。b)将步骤1)所得混合样品采用色谱柱方法分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。c)将步骤1)所得混合样品通过滤膜，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述滤膜可以吸附蛋白。d)将步骤1)所得混合样品中加入可以特异识别各个核酸结合蛋白的抗体，使用类似于抗体纯化的方法(例如使用protein A/G包被的agarose珠体结合抗体)，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。e)将步骤1)所得混合样品用毛细管电泳设备进行分离，自动收集所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
本发明方法可命名为“末端标记法”，可以用来检测核酸结合蛋白，如双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白，RNA结合蛋白(如HuB，HuC，ELAV等)等，通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体(如凝血酶(thrombin)的核酸配体(aptamer)等)也可以应用本发明方法进行检测。
在本发明中，所述核酸结合蛋白优选为双链DNA结合蛋白，更优选的是转录因子，如AP1，Sp1，p53，E2F等。
在应用本发明方法进行检测时，其中优选的情况是：所述核酸捕获探针的核酸序列含有一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列。
为了能提高核酸捕获探针与固定化探针的杂交能力，所述固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。
为方便进行杂交信号检测，所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链的一端还带有标记分子，其中，优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
为提高检测灵敏度，可以对本发明方法进行如下改进(“杂交前进行单链扩增法”)：每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端还均带有一段3’突出端序列，进行步骤3)所述杂交前，还利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交，以便于进行随后的核酸扩增步骤。
其中，优选的情况是：每组所述核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列与所述3’突出端序列完全互补。
此时，为方便进行杂交信号检测，可以在体系中加入标记分子，可以先使引物分子末端带有标记分子再进行扩增，也可以在进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸，其中，标记分子优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
为提高检测灵敏度，可以对本发明方法进行另一种改进(“杂交前进行双链扩增法”)：每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；进行步骤3)所述杂交前，还利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
其中，优选的情况是：所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述5’突出端序列均相同，所述两条引物一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
采用双链扩增法进行检测的操作流程如图7所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针；用两条引物6对所回收捕获探针进行扩增，扩增后的产物与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。所用的捕获探针、固定化探针和引物的优选结构如图8所示：捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有3’突出端和5’突出端；引物1的序列与该3’突出端序列互补，引物2的序列和5’突出端一致；固定化探针序列与该结合序列一致。
同样，为方便进行杂交信号检测，可以在体系中加入标记分子，可以先使引物分子末端带有标记分子再进行扩增，也可以在进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸，其中，标记分子优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
本发明采用生物芯片方法进行核酸结合蛋白，特别是转录因子的检测，通过捕获探针与固定化探针的杂交信号检测，具有检测灵敏度高和检测通量高的优点；而且，当采用本发明的两种改进方法(杂交前单链扩增、杂交前双链扩增)时，可以先对引物进行预先标记，而不再需要对每组核酸捕获探针进行分子标记修饰，能大大降低实验成本。本发明方法可以广泛用于疾病诊断、药物靶标筛选、疾病机理等领域。
附图说明
图1为本发明的使用“末端标记法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；
图2为本发明的使用“末端标记法”检测多种核酸结合蛋白的探针结构示意图；
图3A为实施例1芯片点阵设计图；
图3B为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果；
图3C为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了AP1的竞争性结合探针；
图3D为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了NFkB的竞争性结合探针；
图3E为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了Sp1的竞争性结合探针；
图4为本发明的使用“单链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；
图5为本发明的使用“单链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的探针、引物结构示意图；
图6A为实施例2使用“单链扩增法”同时检测三种结合蛋白(AP1、NFkB、Sp1)的实验结果；
图6B为实施例2采用与实施例1相同的“末端标记法”进行检测的实验结果；
图7为本发明的使用“双链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；
图8为本发明的使用“双链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的探针、引物结构示意图。
具体实施方式
实施例1、使用DNA芯片同时检测3种核酸结合蛋白AP1，NFkB和Sp1(末端标记法)
采用末端标记法进行检测的操作流程如图1所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针，然后与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。
其中，所用的捕获探针和固定化探针的优选探针结构如图2所示：捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有突出端和标记分子，图中为生物素(biotin)；固定化探针与捕获探针中的长链互补。
试验材料：
转录因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)来自Promega公司(Madison，WI)。通用结合缓冲液的成分为：10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的电泳缓冲液是0.5×TBE(0.9M Tris碱，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸缓冲液，0.1％Tween 20)作为清洗液。电泳用琼脂糖来自Biowest公司(Miami，FL)。牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3标记的链霉亲和素购自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
实验步骤：
A.DNA探针的制备：所有的探针都由上海博亚公司合成，探针的序列见表1(表中AP-1-IP为AP1的固定探针，AP-1-LP、AP-1-FP组成为AP1的捕获探针，AP-1-CP和AP-1-FP组成为AP1的竞争性结合探针，其他探针的表示与此类似；本实施例LP探针的突出端序列为5’-CGGGA-3’。)。每组中的固定探针都先用水溶解，配置在50％二甲亚砜(DMSO)的溶液中，探针的终浓度为10微摩尔每升。蛋白捕获探针都用水溶解，再把对应的探针(每组探针中的FP和LP探针)退火形成双链，其中每组探针的终浓度都为60纳摩尔每升。
B.DNA芯片的制作：使用PixSys5500(Cartesian Technologies，Irvine，CA)机械手将上述的固定探针按照图3A的点阵模式点制到氨基修饰的玻片上，点间距为350微米。点样完毕后，玻片在80摄氏度的温箱中烘烤1小时，再使用紫外胶连仪，在250毫焦的能量下胶连以固定点在玻片表面的核酸分子。图3A中A1-A5为AP1固定探针，B1-B5为NFkB固定探针，C1-C5为Sp1固定探针，D1-D5为TFIID固定探针，E1-E5为NC固定探针，F1-F5为HC固定探针，A6、B6、C6、D6、E6、F6为点样对照，该点样对照是一种本身带有荧光素的核酸分子，在点样结束后扫描玻片，可以检测到点样对照，证明玻片点样的步骤正确。
C.核酸—蛋白结合体系的配置：将三种转录因子(1.0μg AP1，300ng NFkB和1.0μgSp1)和蛋白捕获探针(就是LP和FP的退火产物)混合，加入通用结合缓冲液，使得缓冲液的终浓度达到1X。反应体系在室温结合30分钟。进行图3C、图3D、图3E所描述的实验时，在反应体系中还加有竞争性结合探针(CP)。
D.核酸—蛋白结合体系的分离：预先配置2％的琼脂糖凝胶和电泳用的TBE缓冲液，并预冷到4℃。将上述结合反应体系加入凝胶的加样孔，在120伏电压下电泳20分钟。根据电泳缓冲液中溴酚兰指示剂的位置，切出所需要的凝胶部分。
E.核酸的回收：使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝胶回收试剂盒回收上一步骤中得到的凝胶中的核酸，按照产品说明书进行。
F.芯片的杂交分析：将上步得到的核酸，配置成15微升体系的杂交液(杂交液中还加有HC-LP探针)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃杂交1小时。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。在芯片上加入1％BSA进行封闭，反应条件为37℃30分钟。使用PBST清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。加15微升的1微克/毫升浓度的Cy3标记的链霉亲和素到芯片表面，37℃反应1小时。使用PBST清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。使用Scanarray 4000扫描仪进行图像扫描，图像使用GenePix进行分析处理。其中图3A是芯片的点阵设计图；图3B是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果；图3C是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白AP1的竞争性结合探针；图3D是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白NFkB的竞争性结合探针；图3E是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白Sp1的竞争性结合探针。结果表明，采用本发明的“末端标记方法”可以很明显地检测出三种转录因子，而NC中的序列来自于原核生物噬菌体的启动子序列，和真核生物的转录因子结合序列差异很大，不能与任何一个上述转录因子结合，所以NC探针的信号始终为阴性；HC是作为杂交对照，在杂交之前加入，用以对不同的点阵进行归一化处理，所以HC信号始终为阳性。
表1.几种转录因子的固定探针和捕获探针的探针序列表
| 组编号 | 转录因子 | 探针编号 | 探针名称 | 探针序列 |
| 1 | AP-1 | 1 | AP-1-IP | 5′-T20-CGCTTGA TGAGTCAGCCGGA-TCCCG-3′ |
| 2 | AP-1-LP | 5′-biotin-CGGGA-TCCGGC TGACTCATCAAGCG-3′ | ||
| 3 | AP-1-FP | 5′-CGCTTGA TGAGTCAGCCGGA-3′ |
| 4 | AP-1-CP | 5′-TCCGGC TGACTCATCAAGCG-3′ | ||
| 2 | NFκB | 5 | NFκB-IP | 5′-T20-AGTTGAG GGGACTTTCCCAGGA-TCCCG-3′ |
| 6 | NFκB-LP | 5′-biotin-CGGGA-TCCTG GGAAAGTCCCCTCAACT-3′ | ||
| 7 | NFκB-FP | 5′-AGTTGAG GGGACTTTCCCAGGA-3′ | ||
| 8 | NFκB-CP | 5′-TCCTG GGAAAGTCCCCTCAACT-3′ | ||
| 3 | SP1 | 9 | SP1-IP | 5′-T20-AAAGC CCCGCCCCGATATAAT-TCCCG-3′ |
| 10 | SP1-LP | 5′-biotin-CGGGA-ATTATATC GGGGCGGGGCTTT-3′ | ||
| 11 | SP1-FP | 5′-AAAGC CCCGCCCCGATATAAT-3′ | ||
| 12 | SP1-CP | 5′-ATTATATC GGGGCGGGGCTTT-3′ | ||
| 4 | TFIID | 13 | TFIID-IP | 5′-T20-CGCCTACCTCATT TTATATGCTCTGC-TCCCG3′ |
| 14 | TFIID-LP | 5′-biotin-CGGGA-GCAGAGCA TATAAAATGAGGTAGGCG-3′ | ||
| 15 | TFIID-FP | 5′-CGCCTACCTCATT TTATATGCTCTGC-3′ | ||
| 16 | TFIID-CP | 5′-GCAGAGCA TATAAAATGAGGTAGGCG-3′ | ||
| 5 | NC | 17 | NC-IP | 5′-T20-CTATGTGGTGAACTCCTCCTAAATA-TCCCG-3′ |
| 18 | NC-LP | 5′-biotin-CGGGA-CGGGATATTTAGGAGGAGTTCACCACATAG-3′ | ||
| 19 | NC-FP | 5′-CTATGTGGTGAACTCCTCCTAAATA-3′ | ||
| 6 | HC | 20 | HC-IP | 5′-T20-AGACGGAAGACATATGGCCGCTC-TCCCG-3′ |
| 21 | HC-LP | 5′-biotin-CGGGA-GAGCGGCCATATGTCTTCCGTCT-3′ |
实施例2、使用DNA芯片同时检测3种核酸结合蛋白AP1，NFkB和Sp1(单链扩增法)
采用单链扩增法进行检测的操作流程如图4所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针；用引物6对所回收捕获探针进行扩增，扩增后的产物与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。
其中，所用的捕获探针、固定化探针和引物的优选设计原理如图5所示：捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有3’突出端；引物序列与该3’突出端互补；固定化探针与该结合序列一致。
试验材料：
转录因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)来自Promega公司(Madison，WI)。通用结合缓冲液的成分为：10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的电泳缓冲液是0.5×TBE(0.9M Tris碱，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸缓冲液，0.1％Tween 20)作为清洗液。电泳用琼脂糖来自Biowest公司(Miami，FL)。牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3标记的链霉亲和素购自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
实验步骤：
A.DNA探针的制备：探针都由上海博亚公司合成，探针的序列见表2(每组探针中的LFP和LP’探针组成为对应转录因子的捕获探针；IP探针为固定探针)。每组中的固定探针制备方法同实施例1中的“DNA探针制备”部分。蛋白捕获探针都用水溶解，再把对应的探针(每组探针中的LFP和LP’探针)退火形成双链，其中每组探针的终浓度都为60纳摩尔每升。
B.DNA芯片的制作：同实施例1中的“DNA芯片的制作”部分。
C.核酸—蛋白结合体系的配置：将三种转录因子(1.0μg AP1，100ng NFkB和0.1μgSp1)和蛋白捕获探针混合，加入通用结合缓冲液，使得缓冲液的终浓度达到1X。反应体系在室温结合30分钟。
D.核酸—蛋白结合体系的分离：预先配置2％的琼脂糖凝胶和电泳用的TBE缓冲液，并预冷到4℃。将上述结合反应体系加入凝胶的加样孔，在120伏电压下电泳20分钟。根据电泳缓冲液中溴酚兰指示剂的位置，切出所需要的凝胶部分。
E.核酸的回收：使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝胶回收试剂盒回收上一步骤中得到的凝胶中的核酸，按照产品说明书进行。最后用20微升的洗脱液进行洗脱。
F.芯片的杂交分析：将上步得到的核酸，真空抽干，加入5微升水重新溶解，加入dNTP和PCR的缓冲液，再加入带有Cy3标记的T7 Pro的引物进行核酸扩增。PCR程序是：95度5分钟；95度30秒，53度30秒，72度20秒，重复40个循环；73度7分钟。扩增产物真空抽干，用5微升水重新溶解，配置成15微升体系的杂交液(HC-LP探针也于此时加入到杂交液中)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃杂交1小时。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。使用Scanarray 4000扫描仪进行图像扫描，图像使用GenePix进行分析处理。
以采用实施例1的“末端标记法”进行本实施例三种蛋白的检测，作为本实施例检测结果的对照。
检测结果分别如图6A和图6B所示，图6A是采用“单链扩增法”进行检测的实验结果图；图6B为采用实施例1的“末端标记法”进行检测的结果图，图中，A1-A5为AP1检测结果点；B1-B5为NFkB检测结果点；C1-C5为杂交对照点(HC点，HC-IP与HC-LP序列见表1)；D1-D5为Sp1检测结果点。结果表明，采用单链扩增法进行检测可以提高本发明方法的检测灵敏度，使采用末端标记法不能检测出来的信号点也能清楚、灵敏地检测出来。
表2.带3’突出端序列的探针序列表
| 组编号 | TF | 探针编号 | 探针名称 | 探针序列 |
| 1 | AP-1 | 1 | AP-1-IP | 5′-T20-CGCT TGATGAGTCAGCCGGA-TCCCG-3′ |
| 22 | AP-1-LFP | 5′-CGCTTGA TGAGTCAGCCGGA-CCCTATAGTGAGTCGTATTACCCC-3′ | ||
| 26 | AP-1-LP’ | 5′-CGGGA-TCCGGC TGACTCATCAAGCG-3′ | ||
| 2 | NFκB | 5 | NFκB-IP | 5′-T20-AGTTGAG GGGACTTTCCCAGGA-TCCCG-3′ |
| 23 | NFκB-LFP | 5′-AGTTGAG GGGACTTTCCCAGGA-CCCTATAGTGAGTCGTATTACCCC-3′ | ||
| 27 | NFκB-LP’ | 5′-CGGGA-TCCTG GGAAAGTCCCCTCAACT-3′ | ||
| 3 | SP1 | 9 | SP1-IP | 5′-T20-AAAGC CCCGCCCCGATATAAT-TCCCG-3′ |
| 24 | SP1-LFP | 5′-AAAGC CCCGCCCCGATATAAT-CCCTATAGTGAGTCGTATTACCCC-3′ | ||
| 28 | SP1-LP’ | 5′-CGGGA-ATTATATC GGGGCGGGGCTTT-3′ | ||
| 4 | 25 | T7 Pro | 5’-Cy3-GGGGTAATACGACTCACTATAGGG-3’ |
Claims (27)
1、一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤：1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行：将步骤1)所得混合样品用凝胶电泳分离，经切胶、用试剂盒分离或用电洗脱得到所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行：将步骤1)所得混合样品采用色谱柱方法分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行：将步骤1)所得混合样品通过滤膜，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述滤膜可以吸附蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行：将步骤1)所得混合样品中加入可以特异识别各个核酸结合蛋白的抗体，使用抗体纯化的方法，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行：将步骤1)所得混合样品用毛细管电泳进行分离，收集所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸结合蛋白为双链DNA结合蛋白，RNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白或通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双链DNA结合蛋白为转录因子。
9、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针的核酸序列含有一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列。
11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。
12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链还带有标记分子。
13、根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
14、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端还均带有一段3’突出端序列，进行步骤3)所述杂交前，还利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交。
15、根据权利要求14所述的方法，其特征在于：每组所述核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列与所述3’突出端序列完全互补。
16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述利用一条引物进行扩增时所述引物中还掺有标记分子。
17、根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述引物分子的5’端带有标记分子。
18、根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
19、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述利用一条引物进行扩增时还在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。
20、根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
21、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；进行步骤3)所述杂交前，还利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
22、根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述5’突出端序列均相同，所述两条引物一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述利用两条引物进行扩增时所述引物中还掺有标记分子。
24、根据权利要求23所述的方法，其特征在于：所述引物分子的5’端带有标记分子。
25、根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
26、根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述利用两条引物进行扩增时还在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100904233A CN1296492C (zh) | 2004-11-18 | 2004-11-18 | 一种基于生物芯片检测能结合特异序列的核酸结合蛋白的方法 |
| AU2004324960A AU2004324960A1 (en) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | A testing method of nucleic acid binding protein based on biochip |
| EP04797371A EP1816476B1 (en) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | A testing method of nucleic acid binding protein based on biochip |
| CA002586408A CA2586408A1 (en) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | A testing method of nucleic acid binding protein based on biochip |
| US11/791,157 US8680016B2 (en) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | Testing method of nucleic acid binding protein based on biochip |
| JP2007541638A JP4664373B2 (ja) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | バイオチップをベースにした核酸結合タンパク質の試験方法 |
| PCT/CN2004/001340 WO2006053463A1 (fr) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | Procede de test de proteine de liaison aux acides nucleiques |
| AT04797371T ATE545030T1 (de) | 2004-11-18 | 2004-11-23 | Testverfahren für nukleinsäurebindendes protein auf biochipbasis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100904233A CN1296492C (zh) | 2004-11-18 | 2004-11-18 | 一种基于生物芯片检测能结合特异序列的核酸结合蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1635165A true CN1635165A (zh) | 2005-07-06 |
| CN1296492C CN1296492C (zh) | 2007-01-24 |
Family
ID=34847597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100904233A Expired - Fee Related CN1296492C (zh) | 2004-11-18 | 2004-11-18 | 一种基于生物芯片检测能结合特异序列的核酸结合蛋白的方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8680016B2 (zh) |
| EP (1) | EP1816476B1 (zh) |
| JP (1) | JP4664373B2 (zh) |
| CN (1) | CN1296492C (zh) |
| AT (1) | ATE545030T1 (zh) |
| AU (1) | AU2004324960A1 (zh) |
| CA (1) | CA2586408A1 (zh) |
| WO (1) | WO2006053463A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102112626A (zh) * | 2008-04-09 | 2011-06-29 | 加州理工学院 | 用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8394590B2 (en) | 2006-08-02 | 2013-03-12 | California Institute Of Technology | Capture agents and related methods and systems for detecting and/or sorting targets |
| WO2008016680A1 (en) | 2006-08-02 | 2008-02-07 | California Institute Of Technology | Methods and systems for detecting and/or sorting targets |
| AU2008276027B2 (en) | 2007-07-16 | 2014-09-04 | California Institute Of Technology | Arrays, substrates, devices, methods and systems for detecting target molecules |
| KR101090982B1 (ko) | 2009-03-16 | 2011-12-08 | 경희대학교 산학협력단 | 양자점-앱타머 접합체를 이용한 생분석 방법 |
| JP2012524907A (ja) * | 2009-04-24 | 2012-10-18 | ディスカヴァーエックス コーポレイション | 検出可能なタンパク質を用いた細胞分析 |
| LT2783216T (lt) | 2011-11-21 | 2019-01-25 | Abaxis, Inc. | Imunoanalizė su signalo sustiprinimu |
| CN103048463A (zh) * | 2012-05-02 | 2013-04-17 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种基于不同严谨度的用于检测dna结合蛋白的微孔板核酸杂交elisa方法 |
| WO2014031997A1 (en) | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Yale University | System, device and method for high-throughput multi-plexed detection |
| WO2015060511A1 (ko) * | 2013-10-22 | 2015-04-30 | 주식회사 바이오이즈 | 생체분자와 핵산의 결합정보를 생성하기 위한 마커, 이의 제조방법, 이를 이용한 생체분자 분석방법 및 장치 |
| TWI691716B (zh) | 2014-08-13 | 2020-04-21 | 美商艾巴希斯公司 | 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大 |
| CN107407638B (zh) | 2014-12-03 | 2021-01-12 | 伊索普莱西斯公司 | 细胞分泌特征的分析和筛选 |
| US11353448B2 (en) | 2015-02-13 | 2022-06-07 | California Institute Of Technology | Methods and compositions for quantifying metabolites and proteins from single cells |
| CN117434261A (zh) | 2015-08-04 | 2024-01-23 | 硕腾服务有限责任公司 | 基于溶液的等离子体特异性结合配偶体测定中的信号放大 |
| DK3538891T3 (da) | 2016-11-11 | 2022-03-28 | Isoplexis Corp | Sammensætninger og fremgangsmåder til samtidig genomisk, transkriptomisk og proteomisk analyse af enkeltceller |
| CN110226084A (zh) | 2016-11-22 | 2019-09-10 | 伊索普莱克西斯公司 | 用于细胞捕获的系统、装置和方法，以及其制造方法 |
| AU2018212009B2 (en) | 2017-01-30 | 2022-07-14 | Zoetis Services Llc | Solution-based plasmon specific-binding partner assays and metallic nanostructures |
| CA3138367A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Encodia, Inc. | Methods for preparing analytes and related kits |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5449603A (en) * | 1989-10-24 | 1995-09-12 | Stratagene | Method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein |
| DE69334048D1 (de) * | 1992-01-28 | 2006-08-31 | Harvard College | Verfahren fur nuklein saure hibridisierung mit verwendung von einzelstrangige dna bindende proteine |
| US20030054378A1 (en) * | 1997-05-08 | 2003-03-20 | Isao Karube | Method for detecting target nucleotide sequence |
| US20030207295A1 (en) * | 1999-04-20 | 2003-11-06 | Kevin Gunderson | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20060292560A1 (en) * | 2000-08-14 | 2006-12-28 | Robert Burgess | Transcription factor target gene discovery |
| CA2327561A1 (en) | 2000-12-27 | 2002-06-27 | Pierre Rousseau | Methods for the screening and/or for the identification of differentially active nucleic acid binding factors of nucleic acid binding elements using dna microarray technology (dpa):dna proteomic array |
| JP2004537039A (ja) * | 2001-03-30 | 2004-12-09 | クローンテック ラボラトリーズ インク． | 試料中の多数のｄｎａ結合タンパク質およびｄｎａ相互作用を検出する方法並びにこれを実施するための装置、システムおよびキット |
| AU2002305585A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-11-05 | Michael F. Chou | Transcription factor network discovery methods |
| US20030219801A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-11-27 | Affymetrix, Inc. | Aptamer base technique for ligand identification |
| AU2003256814A1 (en) | 2002-07-26 | 2004-02-16 | Alfa Wasserman, Inc. | Macromolecular protection assay |
| US20060166206A1 (en) * | 2002-11-15 | 2006-07-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analysis of regulatory sequences |
| US20040115794A1 (en) | 2002-12-12 | 2004-06-17 | Affymetrix, Inc. | Methods for detecting transcriptional factor binding sites |
| CN1435492A (zh) * | 2003-03-05 | 2003-08-13 | 东南大学 | 一种非标记检测dna结合蛋白的芯片及其制备、应用方法 |
| JP3944576B2 (ja) * | 2003-03-28 | 2007-07-11 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | マイクロアレイを用いたアプタマーの取得方法 |
-
2004
- 2004-11-18 CN CNB2004100904233A patent/CN1296492C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-23 AT AT04797371T patent/ATE545030T1/de active
- 2004-11-23 EP EP04797371A patent/EP1816476B1/en not_active Not-in-force
- 2004-11-23 CA CA002586408A patent/CA2586408A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-23 AU AU2004324960A patent/AU2004324960A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-23 US US11/791,157 patent/US8680016B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-23 WO PCT/CN2004/001340 patent/WO2006053463A1/zh active Application Filing
- 2004-11-23 JP JP2007541638A patent/JP4664373B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102112626A (zh) * | 2008-04-09 | 2011-06-29 | 加州理工学院 | 用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1816476B1 (en) | 2012-02-08 |
| JP2008520212A (ja) | 2008-06-19 |
| US20090018025A1 (en) | 2009-01-15 |
| ATE545030T1 (de) | 2012-02-15 |
| US8680016B2 (en) | 2014-03-25 |
| AU2004324960A1 (en) | 2006-05-26 |
| JP4664373B2 (ja) | 2011-04-06 |
| EP1816476A1 (en) | 2007-08-08 |
| WO2006053463A1 (fr) | 2006-05-26 |
| EP1816476A4 (en) | 2008-08-20 |
| CA2586408A1 (en) | 2006-05-26 |
| CN1296492C (zh) | 2007-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1296492C (zh) | 一种基于生物芯片检测能结合特异序列的核酸结合蛋白的方法 | |
| US7179638B2 (en) | Microarrays and their manufacture by slicing | |
| US20050202433A1 (en) | Novel high density arrays and methods for analyte analysis | |
| US20020015952A1 (en) | Microarrays and their manufacture by slicing | |
| CN1500150A (zh) | 在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法 | |
| JP2002500374A (ja) | 高分子アレイおよび結合アッセイにおけるそれらの使用のための方法 | |
| JP2003014755A (ja) | マイクロアレイおよびその製造方法 | |
| CN1522304A (zh) | 脓毒症或脓毒相关综合症生物芯片在诊断上的应用 | |
| JP2008520212A5 (zh) | ||
| EP3299474A1 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
| CN103003444B (zh) | 用于结肠直肠癌预后的方法和试剂盒 | |
| EP1457573B1 (en) | Method for integrated nucleic acid integrity assessment and analysis | |
| US20030211532A1 (en) | Methods and compositions for analyzing nucleic acids | |
| CN113026111A (zh) | 用于构建人单细胞tcr测序文库的试剂盒及其应用 | |
| CN1644709A (zh) | 一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别dna鉴定方法及其检测试剂盒 | |
| CN1312293C (zh) | 一种高通量生物芯片及其应用 | |
| US20220025430A1 (en) | Sequence based imaging | |
| CN1590560A (zh) | 一种从复杂组分物质如中药和化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的方法 | |
| CN1721547A (zh) | 核酸外切酶ⅲ消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白 | |
| CN1470873A (zh) | Dna固相扩增与流式检测分析技术与试剂盒 | |
| CN1597986A (zh) | 一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片及其应用方法 | |
| WO2019229792A1 (ja) | 標的核酸断片を検出する方法 | |
| CN1733933A (zh) | 核酸外切酶Ⅲ消化Label－dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白 | |
| Anderson | Microarrays and their manufacture by slicing | |
| JP2008107227A (ja) | 物質間相互作用検出部とセンサーチップ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1079552 Country of ref document: HK |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: CAPITALBIO CORPORATION CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: CAPITALBIO CORPORATION |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Patentee after: CAPITALBIO Corp. Patentee after: TSINGHUA University Address before: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Patentee before: CAPITALBIO Corp. Patentee before: Tsinghua University |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070124 Termination date: 20211118 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |