CN103048463A

CN103048463A - 一种基于不同严谨度的用于检测dna结合蛋白的微孔板核酸杂交elisa方法

Info

Publication number: CN103048463A
Application number: CN2012101316784A
Authority: CN
Inventors: 曾令文; 方志远; 张文娟
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2012-05-02
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明公开了一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法。本发明所述方法是通过DNA结合蛋白在低严谨杂交条件下能增强双链DNA结合的稳定性，在高严谨洗脱条件下能够稳定的以双链形式存在而不被洗脱的原理，用来检测DNA结合蛋白。本发明所述方法是一种检测DNA结合蛋白表达和活化水平的新方法，具有高灵敏度、低费用、不需要使用核酸酶和针对DNA结合蛋白的特异性抗体的优点，既解决了以往检测方法中需要核酸酶和特异性抗体的问题，又能保证检测灵敏度，还可以对尚未有特异性抗体的DNA结合蛋白进行检测。

Description

一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法

技术领域

本发明涉及蛋白工程技术领域，具体涉及一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法。

背景技术

DNA binding protein（全文中统称为“DNA结合蛋白”）是指含有DNA结合结构域，可与单链或双链DNA特异性或普遍结合的一类蛋白。转录因子是序列特异性DNA结合蛋白，含有一个或多个DNA结合结构域（DBDs），可与特异的DNA序列结合进而调控遗传信息的转录表达，控制细胞通过细胞周期，分化以及对外界环境的应答。转录因子是基因表达调控通路及网络的枢纽，许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系。因此，有关检测分析转录因子表达及活化程度的方法技术研究一直是生物科学研究的热点和重点。

目前，已经建立多种基于DNA与蛋白质之间的相互作用来检测转录因子表达及活化程度的检测分析方法。最经典的是1981年Garner, M.M.发明的凝胶迁移阻滞实验，即EMSA（Electrophoresis Mobility Shift Assay）。该技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，以此来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析，但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此后来发展了一系列对此技术进行非放射性标记的改进。DNase印迹法(Galas, D.J., 1978)，外切核酸酶法(Wang. J.K,2006 )以及最近发展起来的染色质免疫共沉淀芯片(Bulyk, M.L, 2006; Zhu, C., etal., 2009; Viggiani, C.J., 2009)，蛋白质结合微阵列(Bulyk, M.L, 2006)和电化学方法(Boon,E.M., 2002)等等也是近年来发展起来的检测转录因子表达及活化程度的方法，但是这些方法都有一定的缺陷，如步骤复杂，耗时，需要相应的仪器，需要特异性抗体等等。

转录因子和DNA之间的相互作用一直是科研工作者关注的对象。鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，发展一种既不需要针对转录因子的特异性抗体又不需要放射性标记或核酸酶的转录因子的检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于根据现有检测转录因子表达和活化水平的检测技术中存在的问题和不足，提供一种基于不同严谨度杂交的DNA结合蛋白的ELISA检测方法，它主要通过DNA binding protein在低严谨杂交条件下能增强双链DNA 结合的稳定性，因而在高严谨洗脱条件下能够稳定的以双链形式存在而不被洗脱的原理，配合HRP显色，用来检测DNA binding protein。

本发明提供了一种检测DNA binding protein表达和活化水平的新方法。所述的基于不同严谨度杂交的DNA binding protein的ELISA检测方法，包括单链核酸分子包被微孔板的制备和运用制备的微孔板检测转录因子蛋白。

核酸分子包被微孔板的技术关键是如何将核酸分子牢固地连接固定到微孔板内，使固定的核酸分子既保持与液相中DNA binding protein的结合活性，又能够经受频繁的洗涤而不致脱落。为了使固定的核酸分子具有与液相中转录因子蛋白结合的活性，要求用于固定的核酸分子具有足够的长度，特别是核酸分子上所嵌合的转录因子蛋白结合序列，要与微孔板表面间存在充分的距离，避免微孔板表面对核酸分子与蛋白质的结合反应造成空间障碍。用于与微孔板表面连接的核酸分子的一端应连接较长的手臂分子（arm，linker, spacer molecules）,如C12、PEG（Hexaethylene glycol）等。微孔板表面固定的核酸分子密度要适宜，避免过密的核酸分子造成蛋白质结合的空间障碍。在微孔板内包被核酸分子过程中，要注意洗涤以除去那些未吸附到微孔板的核酸分子，还要注意进行封闭，避免造成非特异性结合的假阳性结果。

制备了单链核酸分子包被的微孔板为本发明转录因子蛋白的检测提供了工具。首先要将与之不完全互补的单链核酸，和含有转录因子蛋白的细胞全蛋白或核蛋白抽提物，与微孔板在适宜温度下孵育适当时间，使转录因子蛋白，微孔板包被的核酸，加入的不完全互补的核酸结合，形成“核酸/蛋白质”复合物。在这个过程中应在DNA 结合缓冲液中加入适量的非竞争性DNA，如鲑鱼精DNA，poly(dI-dC)等，防止形成非特异性结合。然后在适宜温度下进行高严谨洗脱，洗去那些没有DNA binding protein保护结合不牢固的核酸。最后进行化学生色或发光技术进行信号检测。

该方法通过以下步骤可以快速的实现DNA binding protein的检测分析：

（1）准备核酸分子，包括固定探针和显色探针，均为单链核酸；

（2）将固定探针连接固定到微孔板内；

（3）将DNA binding protein和显色探针与微孔板共孵育；

（4）高严谨洗脱，除去未稳定结合的核酸分子；

（5）显色系统进行显色，反应DNA binding protein的表达和活化水平。

与现有技术相比，本发明据有如下有益效果：

本发明提供了一种制备和使用成本较低的检测转录因子表达和活化水平的新方法，依靠用于传统酶联免疫吸附实验的酶标仪，运用成熟的酶联免疫吸附实验技术流程，在不需要核酸酶和针对转录因子的特异性抗体的情况下，实现转录因子表达和活化水平的高通量检测分析，具有高灵敏度、低费用、不需要使用核酸酶和针对DNA结合蛋白的特异性抗体的优点。

附图说明

图1为本发明所述方法的实验步骤示意图；

图2为不同浓度DNA结合蛋白c-jun的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

此处仅仅以基于不同严谨度的微孔板核酸杂交的ELISA方法检测转录因子蛋白c-Jun的实验，示例说明本发明专利的具体实施方式（图1）。

实施例地高辛标记的单链核酸和与之不完全互补的biotin标记的核酸的设计及化学合成

c-Jun是核转录激活蛋白1(AP-1)家族的组成成员。AP-1蛋白家族主要包括Jun(c-Jun、Jun-B和Jun．D)和Fos(c-Fos、 FosB、Fra-1和Fra．2)2个蛋白家族。c-Jun不仅和Jun或Fos家族成员结合，以AP-1的形式发挥生物学功能，也可以单独作为转录因子参与基因转录调控。各种刺激如生长信号、紫外线或环境污染物可以诱导c-Jun活化，活化的c-Jun通过调节靶基因转录，参与增殖、分化和细胞凋亡等多种生理过程。c-Jun功能异常与许多疾病如恶性肿瘤、脑血管病等的发生密切相关。

c-Jun是一类序列特异性转录因子，基因组中与c-Jun结合的共同基序（consensus）DNA序列发生序列特异性识别结合，调控基因的表达。基因组中与c-Jun结合的共同基序DNA序列表达一般为5'-TGA(G/C)TCA-3'。因此，设计和制备用于检测转录因子c-Jun的核酸分子时，所准备的哦核酸分子上必须含有c-Jun结合的共同继续DNA序列。

设计并由上海生工合成如下两条碱基序列反向互补的寡核苷酸，分别用于包被微孔板和检测：

c-Jun（固定探针）如SEQ ID NO:1所示；

c-Jun（显色探针）如SEQ ID NO:2所示。

将5'端修饰有地高辛的寡核苷酸以20nM浓度溶解在PBS中，将5'端修饰有biotin的寡核苷酸以5nM浓度溶解在高严谨杂交液 (10 mM HEPES, pH 7.9,50 mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA, 10% Glycerol, 5%BSA)中。

地高辛标记的单链核酸与包被有地高辛抗体的微孔板孵育。

地高辛抗体1：3000稀释，100ul/孔，4℃包被过夜后，倾去反应液，PBST洗三次除去多余的地高辛抗体；用封闭液（含有1%OVA和10ug/ml的鲑鱼精DNA）封闭，200ul/孔，37℃,封闭2h，倾去封闭液烘干备用。

微孔板封闭处理好后，每孔内加入100ul溶解在PBS中的地高辛标记的寡核苷酸，37℃孵育30分钟。倾去反应液，用PBST洗三次。

至此则制备好了可用于检测转录因子c-Jun的单链核酸分子包被微孔板。包被好的微孔板密闭保存在4℃冰箱。

将DNA binding protein（纯蛋白），biotin修饰的核酸与微孔板共孵育；将转录因子c-Jun蛋白以不同的浓度稀释在DNA结合缓冲液（10 mM HEPES，pH7.9、50 mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，10% Glycerol，5%BSA）中，以每孔10ul的体积加入包被的微孔板中，再加入100ul/孔biotin修饰的寡核苷酸，37℃孵育20分钟。趁热倾去反应液，拍干。

杂交液稀释的SA-HRP与biotin修饰的核酸反应；每孔加入100ul 用杂交液1：1000稀释的SA-HRP,37℃孵育20分钟。趁热倾去反应液，拍干。

高严谨洗脱3次，除去未稳定结合的核酸分子；200ul/孔杂交液，37℃孵育10分钟,除去没有转录因子保护的不稳定结合的核酸分子。

HRP底物显色，反应DNA binding protein的表达和活化水平。

加入辣根过氧化物酶的化学生色底物，100ul/孔，室温孵育适宜时间，加入浓硫酸，50ul/孔，终止显色反应。将终止显色反应的微孔板置于酶标仪中，在480nm波长下读取吸光值。依据蛋白梯度和吸光值制作标准曲线。

用细胞全蛋白或核蛋白抽提物进行检测时，需要先测出蛋白浓度，然后用DNA结合缓冲液稀释至一定浓度后进行检测，方法同纯蛋白的检测。在DNA结合缓冲液中加入0.05mg/ml的poly(dI-dC)用于抑制非特异性结合反应。

检测结果

检测结果表明该方法能检测到3.75ng的c-jun蛋白，具有很高灵敏度，且在0-60ng之间有较好的线性。

申请人：中国科学院广州生物医药与健康研究院

名称：一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法

SEQ ID NO:1：c-Jun（固定探针）：AAAAAAAAAAAAAACGCTGACTCAT

SEQ ID NO:2：c-Jun（显色探针）：AAAAAAAATGAGTCAG

Claims

1.一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于所述方法是根据当DNA结合蛋白存在时，在高严谨洗脱条件下能增强双链DNA结合的稳定性而不被洗脱的原理，设计两条核酸序列，一条核酸序列是固定探针，含有DNA结合蛋白特异结合的核酸序列，该序列末端依据微孔板表面的化学基团进行相应的化学修饰，以便连接固定到微孔板表面；另一条核酸序列是显色探针，是与固定探针不完全互补的核酸序列，其末端依据显色系统进行相应的修饰，以便检测分析；显色探针与含DNA结合蛋白的细胞全蛋白或核蛋白抽提物与微孔板共孵育时，在高严谨洗脱条件下能够形成稳定双链而不被洗脱下来，通过末端修饰标记进行显色时有颜色显示；若不含有DNA结合蛋白，显色探针在高严谨洗脱条件下将会被洗脱下来，显色时将无颜色显示。

2.根据权利要求1所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（2）将固定探针连接固定到微孔板内；

（3）将DNA结合蛋白和显色探针与微孔板共孵育；

（4）高严谨洗脱，除去未稳定结合的核酸分子；

（5）显色系统进行显色，反映DNA结合蛋白的表达和活化水平。

3.根据权利要求2所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于步骤（1）中所述核酸分子均为化学合成的单链寡核苷酸，其序列中含有DNA蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于步骤（2）和（3）中所述的微孔板表面带有氨基、羧基、C12或PEG。

5.根据权利要求2所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于步骤（2）中所述将固定探针连接固定到微孔板是核酸分子末端修饰的化学基团与微孔板表面修饰的化学基团间发生的化学反应，将固定探针固定到微孔板表面。

6.根据权利要求2所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于步骤（3）中所述DNA结合蛋白包括人工表达制备的、含有DNA结合蛋白的细胞全蛋白或核蛋白抽提物。

7.根据权利要求2所述的基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白微孔板核酸杂交ELISA方法，其特征在于步骤（3）中所述共孵育是核酸序列碱基互补配对和DNA结合蛋白与两条核酸分子间特异性识别并结合的过程。