CN111693712A - 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法 - Google Patents

一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS‑CoV‑2 N蛋白的方法，核酸适配体为N Aptamer 1、N Aptamer 2或N Aptamer 3，不仅能特异性结合SARS‑CoV‑2病毒N蛋白，还能特异性的检测出稀释于人血清中的N蛋白和蛋白电泳样品中的N蛋白。通过上述方式，本发明不需进行核酸提取或依赖抗体进行检测，同时具有与靶标分子亲和力强、特异性高、易于制备、免疫原性和毒性低、化学结构稳定等优势，为早期检测2019 SARS‑CoV‑2病原体创造了条件。

Description

一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物医药应用技术领域，特别是涉及一种采用核酸适配体检测 新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法。
背景技术
此次新冠病毒以高传染性和强致病性迅速在全球范围内引起新 冠肺炎大流行，对人类健康和社会经济造成严重威胁。对疑似病例进 行快速且准确地诊断，有效隔离感染者并实施积极治疗，是疫情防治 的重要基础。
目前，应用于病毒学诊断的常规方法包括：1、病毒分离与培养(病毒的特 性、形态、染色及生化鉴定，金标准)；2、免疫学技术(以血清学和免疫化学 方法检测携带病毒情况)；3、分子生物学技术(核酸分子杂交、PCR、核酸测序 等)。
但各检测方法都有其缺点：1、病毒分离与培养：病毒的分离培养与鉴定是 病毒诊断的金标准，但其方法繁杂，对技术、设施要求高，需时较长，目前临 床实验室广泛开展存在困难；2、免疫学技术：目前，新版临床指南指出，患者 新冠病毒特异性IgM在发病后3～5天开始检出。IgG则更晚，在10-21天开始出 现，在恢复期才会有4倍升高，因此该方法仅能用于疾病中晚期诊断，并且由 于抗体检测方法学上的原因，其检测结果准确性不高，假阴和假阳的结果都有 可能产生；3、分子生物学技术-核酸检测：据报道，新冠病毒核酸检测的假阴性 比例最高可达30-50％，同时，试剂盒检测结果不仅与试剂盒质量、检测上下限 有关，还受新冠病毒自身的特点、采样部位、采样量、运输和储存环节，以及 实验室检测条件和人员操作等因素的影响。
此前，我国及韩国科学家均有报道，在SARS发病的早期(1～10天)，血清 中的病毒N蛋白检测比血清中病毒核酸和抗体检测更加灵敏。因此，血清中病 毒N蛋白是一个非常好的病毒检测指标，能够与核酸检测、抗体检测、CT检测 相互印证，成为新冠肺炎排查的重要手段。
核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸序列(DNA或RNA)，是新诊断方 法和药物研究的热点之一。核酸适体有诸多优势：与靶标分子亲和力强，特异 性高；易于制备，可在体外筛选，可高通量获得；免疫原性和毒性低；化学结 构稳定等等，因此被广泛应用于生物检测领域。
传统的抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好，酶联免疫反应在各种生物分 子的探测中发挥着举足轻重的作用，市场上的许多试剂盒就是基于此原理开发 的。但蛋白质作为探针分子，易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价 格昂贵，适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经 SELEX筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容 易，稳定性更好。韩国科学家已报道了一种能够特异性结合SARS病毒N蛋白 的单链DNA适配体，并推测其可用于病毒N蛋白的检测。我们经过生物信息学 比对，发现2003年SARS病毒与2019年新冠肺炎病毒SARS-CoV-2的N蛋白 有91～94％的蛋白同源性；分子结构模拟也推测，SARS-CoV-2的N蛋白与SARS 的N蛋白有相似的3D分子结构。因此，本发明将研究基于单链DNA核酸适配 体的新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白检测方法。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法，具有在新冠病毒感染的早期血清学诊断的应用前 景。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种采用核酸 适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法，所述核酸适配体能特异性结 合SARS-CoV-2病毒N蛋白，所述核酸适配体为N Aptamer 1、N Aptamer 2或N Aptamer 3，N Aptamer 1的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3；
N Aptamer2的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3；
N Aptamer 3的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGT-3。
在本发明一个较佳实施例中，所述核酸适配体采用单链DNA化学合成的方 法合成，5‘端加生物素标记。
在本发明一个较佳实施例中，所述核酸适配体结合SARS-CoV-2 N蛋白的 下限达到10ng/ml以下。
在本发明一个较佳实施例中，所述核酸适配体能特异性的检测出稀释于人 血清中的N蛋白。
在本发明一个较佳实施例中，所述核酸适配体能特异性检测出蛋白电泳样 品中的N蛋白。
本发明的有益效果是：本发明的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法，核酸适配体可以特异性结合2019 SARS-CoV-2病毒N蛋白，不 需进行核酸提取或依赖抗体进行检测，同时具有与靶标分子亲和力强、特异性 高、易于制备、免疫原性和毒性低、化学结构稳定等优势，为早期检测2019 SARS-CoV-2病原体创造了条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白的同源性比对结果图；
图2是本发明核酸适配体中N Aptamer 1核苷酸序列的二级结构图；
图3是本发明核酸适配体中N Aptamer 2核苷酸序列的二级结构图；
图4是本发明核酸适配体中N Aptamer 3核苷酸序列的二级结构图；
图5是本发明核酸适配体中Aptamer n.c.核苷酸序列的二级结构图；
图6是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中 SARS-CoV-2 N蛋白、S蛋白和3CLpro蛋白的表达与纯化图；
图7是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法的过 程图；
图8是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法的结 果示意图；
图9是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中特 异性检出人血清中N蛋白的结果示意图；
图10是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中 适配体用于蛋白印迹实验的结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 它实施例，都属于本发明保护的范围。
一、SARS与SARS-CoV-2的N蛋白的同源性分析
利用生物信息学方法，经过生物信息学比对，发现2003年SARS病毒与2019 年新冠肺炎病毒SARS-CoV-2的N蛋白有91％的蛋白同源性。分子结构模拟也 推测，SARS-CoV-2的N蛋白与SARS的N蛋白有相似的3D分子结构。 SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白的同源性比对结果如图1所示。
二、ssDNA N Aptamer设计与合成
将ssDNA aptamer 1(命名为N aptamer 1)用于2019的SARS-CoV-2的N 蛋白检测。在此基础上，以针对SARS-CoV N蛋白的Aptamer(N Aptamer 1) 序列为基础，改造了该核酸适配体，合成了更短的核酸适配体N aptamer 2和N aptamer 3。并验证了上述三个核酸适配体与SARS-Cov 2的N蛋白的结合特性。 其中，ssDNA aptamers采用常规单链DNA化学合成的方法合成，5‘端加生物 素(biotin)标记。
N Aptamer 1核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3；
化学合成的适配体用无菌水稀释到工作浓度100nM溶液以后，进行预处理：90度热变性10分钟，然后立即放冰里10分钟，让其形成二级结构。形成的二 级结构如图2所示。
N Aptamer 2核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3；
预处理后，可形成如图3所示的二级结构。
N Aptamer 3核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGT-3；
预处理后，可形成如图4所示的二级结构。
此外，为了证明核酸适配体的特异性，合成了一个阴性对照适配体(Aptamernegative ccontrol,Aptamer n.c..)，Aptamer n.c.核苷酸序列为:5-bio- GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTG-3。如图5所示预测的二级 结构。
三、SARS-CoV-2 N蛋白、S(S-RBD)蛋白和3CLpro蛋白的表达和纯化
如图6所示，将SARS-CoV-2 N蛋白与S蛋白使用融合标签His-tag在原核 表达系统中进行表达，纯化后得到的N蛋白约为46kD，S-RBD蛋白为55kD， 3CLpro约为35kD。
具体过程为：
(a)将构建好的重组pET28a目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株 中，用IPTG诱导表达重组目的蛋白。
(b)采用Ni金属螯合亲合层析(Ni-NTA)介质进行His标签蛋白纯化，采用 咪唑竞争结合的方法进行洗脱，得到高纯度的目标蛋白。
(c)通过SDS-PAGE和BCA测量纯化的蛋白质浓度。
四、SARS-CoV-2 N蛋白、S蛋白、3CLpro蛋白与生物素化的ssDNA适配 体的相互作用
采用酶联核酸适体(Enzyme Linked Aptamer Assay，ELAA)方法测定核酸 适体与蛋白之间的相互作用：采用带生物素(biotin)标签的ssDNA探针，通过 生物素和链霉亲和素的特异相互作用，biotin可以结合HRP-Streptavidin(辣根 过氧化物酶标记的链霉亲和素)，HRP催化四甲基联苯胺(TMB)底物显色。
如图7所示，检测步骤为：
(1)含有病毒N蛋白(或其他对照蛋白)的样品，经包被缓冲液梯度稀释 以后，包被空白ELISA酶标板，室温1小时(或者4度过夜)；
(2)PBST洗涤3遍；
(3)Biotin-ssDNA适配体制备：100nM浓度，90度10分钟，立即放冰上；
(4)每孔加入100微升ssDNA适配体室温1h，轻轻震荡；
(5)PBST洗涤3遍；
(6)加入strepvidin-HRP抗体(1：1000)，室温1h，轻轻震荡；
(7)PBST洗涤3遍；
(8)加入HRP显色底物TMB 100微升，室温15min避光反应；
(9)加入100微升2N的浓硫酸终止；
(10)OD450检测吸光度。
结果如图8所示，结果表明，ssDNA适配体N aptamer 1/2/3都能够特异性 的与2019年SARS-CoV-2病毒N蛋白有特异性结合，与对照蛋白SARS-CoV-2 S， 3CLpro蛋白及BSA蛋白等均无结合。且N aptamer 1/2/3结合SARS-CoV-2 N 蛋白的下限达到了10ng/ml以下。
阴性对照适配体Aptamer n.c.与所有测试蛋白均无特异性结合，也进一步证 明了N aptamer 1/2/3与N蛋白的结合是特异性的。
五、ssDNA适配体检出人血清中稀释的SARS-CoV-2 N蛋白
将SARS-CoV-2 N蛋白梯度稀释于人血清中，利用上述酶联核酸适体 (EnzymeLinked Aptamer Assay，ELAA)方法，可以特异性检出N蛋白。
具体步骤为：
(1)梯度稀释的SARS-CoV-2 N蛋白(或对照蛋白3CLpro)，混合入1： 10稀释的人血清中，包被空白ELISA酶标板，室温1小时(或者4度过夜)；
(2)PBST洗涤3遍；
(3)1％BSA室温封闭1小时；
(4)Biotin-ssDNA适配体制备：100nM浓度，90度10分钟，立即放冰上；
(5)每孔加入100微升ssDNA适配体室温1h，轻轻震荡；
(6)PBST洗涤3遍；
(7)加入Avidin-HRP抗体(1：1000)，室温1h，轻轻震荡；
(8)PBST洗涤3遍；
(9)加入HRP显色底物TMB 100微升，室温15min避光反应；
(10)加入100微升2N的浓硫酸终止；
(11)OD450检测吸光度。
结果如图9所示，结果显示，核酸适配体2和3都能特异性的检出血清中 的N蛋白，灵敏度最高可达到10ng/mL。提示了将来用于感染者血清筛查的可 能性。本发明核酸适配体可以检测稀释于人血清中的N蛋白，提示了在新冠病 毒感染的早期血清学诊断的应用前景。
六、ssDNA适配体用于蛋白印迹实验
将含有梯度稀释的N蛋白和对照蛋白进行蛋白印迹实验(Western Blot)， 适配体能够特异性的检测出N蛋白，与抗体的功能类似。
具体步骤为：
(1)梯度稀释的SARS-CoV-2 N蛋白(10ug,1ug,0.1ug,0.01ug)(或对照 蛋白3CLpro 10ug)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
(2)凝胶电转移，使蛋白转移到醋酸纤维素膜上；
(3)用1％的BSA室温封闭1小时；
(4)PBST洗涤3遍；
(5)用适配体(100nM终浓度)或者N蛋白抗体(1：1000)分别室温孵 育1小时；
(6)PBST洗涤3遍；
(7)加入Avidin-HRP抗体(用于适配体)或者HRP-羊抗兔IgG二抗(用 于N蛋白抗体)室温孵育1小时；
(8)PBST洗涤3遍；
(9)用增强的化学发光试剂盒(ECL)显色并扫描拍照。
结果如图10所示，结果如下：N Aptamer 3能特异性结合醋酸纤维素膜上的 N蛋白，而不结合对照蛋白。提示N Aptamer能够应用于蛋白印迹(Western Blot) 检测N蛋白。本发明核酸适配体可以用于蛋白印迹(Western Blot)实验，特异 性检测蛋白电泳样品中的N蛋白，发挥类似抗体的功能。
本发明核酸适配体也可能与病毒N蛋白相互作用，抑制N蛋白的功能，或 者通过携带相关药物，达到抑制病毒的复制或促进细胞抗病毒的作用，从而对 新冠病毒疾病(COVID-19)的治疗具有潜在意义。
本发明中的核酸适配体能直接检测2019年SARS-CoV-2病毒N蛋白，具有 以下性质：
1、ssDNA aptamers(N aptamer 1/2/3)与靶标SARS-CoV-2 N蛋白亲和力 强、特异性高，结合的下限达到了10ng/ml以下，可在病毒感染早期直接对病毒 蛋白本身进行检测；可以取代抗体直接用于病毒蛋白检测。
2、ssDNA aptamers(N aptamer 1/2/3)序列确定，可通过化学方法批量制 备，且性质稳定，能长期存放，变性后还可以复性，整体成本低；
3、与抗体相比，核酸适配体制备时间短，不需要免疫动物；
4、核酸适配体比抗体更容易进行各种修饰，便于开发各种快速检测试剂盒；
5、与抗体相比，适配体因为是特定序列化学合成，各批次之间几乎没有差 异，性质稳定；
6、与抗体(～150kDa)相比，核酸适配体分子量小(～5kDa)，没有免疫原型, 后续可能继续开发成为体内使用的试剂，安全性高。
7、由于核酸适配体能与病毒蛋白特异性结合，而不与其他蛋白结合，有可 能特异性的感染病毒蛋白的功能，从而成为潜在的抗病毒药物候选。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其 它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表：
N Aptamer 1核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA -3。
N Aptamer 2核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3。
N Aptamer 3核苷酸序列为：
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGT-3。
Aptamer n.c.核苷酸序列为:
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTG-3。
序列表
<110> 苏州大学 上海市计划生育科学研究所
<120> 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
<130> 2020
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcaatggtac ggtacttccg gatgcggaaa ctggctaatt ggtgaggctg gggcggtcgt 60
gcagcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcaatggtac ggtacttccg gatgcggaaa ctggctaatt ggtgaggctg gggcggtcgt 60
gcagcaaaag tgcacgct 78
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gcaatggtac ggtacttccg gatgcggaaa ctggctaatt ggtgaggctg gggcggt 57
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gcaatggtac ggtacttccg gatgcggaaa ctg 33

Claims (5)

1.一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2N蛋白的方法，其特征在于，所述核酸适配体能特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白，所述核酸适配体为N Aptamer 1、N Aptamer 2或N Aptamer 3，N Aptamer 1的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3；
N Aptamer2的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3；
N Aptamer 3的序列为
5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGT-3。
2.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2N蛋白的方法，其特征在于，所述核酸适配体采用单链DNA化学合成的方法合成，5‘端加生物素标记。
3.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2N蛋白的方法，其特征在于，所述核酸适配体结合SARS-CoV-2N蛋白的下限达到10ng/ml以下。
4.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2N蛋白的方法，其特征在于，所述核酸适配体能特异性的检测出稀释于人血清中的N蛋白。
5.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2N蛋白的方法，其特征在于，所述核酸适配体能特异性检测出蛋白电泳样品中的N蛋白。
CN202010256645.7A 2020-04-02 2020-04-02 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法 Active CN111693712B (zh)

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