JP4959691B2 - 繰り返し調製可能なタンパク質アレイ - Google Patents

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Description

本発明は、一方の担体表面上の核酸アレイから別の表面上に対応するタンパク質アレイを作製する方法、その方法によって作製されたタンパク質アレイ、そのアレイとされたタンパク質と他の分子との相互作用を同定する際のそのタンパク質アレイの使用、およびそのタンパク質アレイを作製するためのキットに関する。
アレイは正確に並べられた要素の配列であり、これにより要素を平行に陳列し試験することが可能となる(Emili, A. Q. and Cagney, G. (2000) Nature Biotechnology 18, 393-397)。アレイには通常、個々の種の分子または粒子のセットが規則正しい格子状の型式に配列されて含まれており、ここでアレイを利用して、アプライされた第２の分子または粒子のセットとの相互作用を認識または選択に基づいて検出することができる。
アレイは、複数のサンプルを取扱って調査する際に有利である。アレイでは各要素に固定位置が与えられているので、アッセイにおける陽性スコアを即座に同定でき、網羅的かつ高密度にすることが可能で、また高処理ロボット操作により少量の試薬を用いて作製およびスクリーニングすることができ、各アッセイ値を多数の同一アッセイの結果と比較することが可能である。
アレイの型式は核酸の包括的な分析のためによく確立されており、オリゴヌクレオチドおよびcDNAアレイ（DNAチップ）は遺伝子発現分析に利用される。よく知られている型式においては、多数の（例えば何千の）DNAハイブリダイゼーションプローブが、ナイロン、ガラスまたはシリコンなどの表面に秩序だったパターンで付着しており、蛍光標識化された全細胞mRNAまたはcDNAがハイブリダイズする；各アレイ要素の定量的シグナルを読み取り装置によって平行に測定する。
アレイによるアプローチはペプチドおよびタンパク質ディスプレイに適用することもできる；ディスプレイされる要素は関連するタンパク質もしくはペプチドのセット、または生物の全タンパク質補体であり得る。タンパク質アレイ技術により、遺伝子発現および分子相互作用のハイスループットスクリーニングが可能となる。タンパク質アレイを用いて、DNA配列のみが以前から知られている何千ものタンパク質の機能を平行に調べることが可能である。
タンパク質アレイの既知の使用例には、抗体の同定、抗体特異性の分析、包括的タンパク質発現プロファイリングの測定、バイオマーカーの同定と定量、リガンド−レセプター相互作用の同定、タンパク質修飾およびタンパク質−タンパク質相互作用の検出、およびライブラリーからのタンパク質またはリガンドのスクリーニングおよび選択などがある(Michaud, G. A. and Snyder, M. (2002) BioTechniques 33, 1308-13161)。
従って、タンパク質アレイは大規模な平行したタンパク質分析のための強力なプロテオミクス手段であり、タンパク質活性および相互作用のハイスループットスクリーニングに適用できる。タンパク質アレイは様々な起源のタンパク質を利用できるという利点があり、細菌、酵母、バキュロウイルスまたは無細胞系から発現される組換えタンパク質を固定化してしばしば作製される。それでもやはり、特にヒトなどの種におけるタンパク質の入手の難易度によって、しばしば生産が大いに妨げられる。さらに、DNAアレイとは異なり、タンパク質アレイはタンパク質が変質するため機能的に完全な状態で長期間保存するのは困難である。
国際公開第02/14860号パンフレット(Discerna Limited)には、「タンパク質インサイチュアレイ」（PISA）法が記載されており、そこでは遊離または固定化PCR DNAを含むアレイ表面をテンプレートとして用いてウサギ網状赤血球抽出物のような無細胞系によるタンパク質合成を行い、そのタンパク質はタグ配列を通して、アレイ表面に予めコーティングされている捕獲試薬と結合し同時固定化される。
国際公開第02/059601号パンフレット（Harvard大学の教授と研究者ら）には、DNAアレイテンプレートからタンパク質アレイを作製するための核酸プログラマブルタンパク質アレイ（NAPPA）が記載されており、そこではタンパク質捕獲抗体をコーティングしたガラススライド上にクローンプラスミドDNAが固定されている。無細胞転写／翻訳ライセートをその表面にアプライし、合成されたタンパク質を抗体によって捕獲する。これにより、そのタンパク質をコードするDNAの近傍にタンパク質が固定されるインサイチュアレイが創出される。
NAPPA法のアレイのスポットまたは位置には、プラスミドDNA、抗体および捕獲したタンパク質の混合物が含まれる。この配置には、アレイとされたタンパク質と共に局在化するDNAとの間に干渉が生じ得るという潜在的に不利な点がある。このような干渉は検出過程で邪魔なシグナルを引き起こす可能性が高く、その結果擬陽性が生じ得る。さらに、NAPPA法は単一のDNAアレイ変換しかできないため、１回使用しただけで貴重なDNAアレイを廃棄しなければならない。
従って、本発明の第１の局面によって、タンパク質アレイを作製する方法であって、第１の担体表面上の核酸アレイを、転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系に曝すことを含み、その核酸アレイから発現されたタンパク質が第２の担体表面上に対応するアレイとして固定化される方法を提供する。
本発明の第２の局面によって、タンパク質アレイを作製する方法であって、第１の担体表面上の核酸アレイを、転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系に曝すことを含み、その核酸アレイから発現されたタンパク質が第２の担体表面上に対応するアレイとして固定化される方法であって、第２の担体表面が直接または間接的に第１の担体表面と接触することを特徴とする方法を提供する。
タンパク質アレイを作製する既知の方法（例えばPISAやNAPPA）に対する本発明の利点の１つは、同じ核酸アレイテンプレートから複数コピーのタンパク質アレイを作製できることである。例えば、第１の担体表面上の核酸アレイは保存可能であり（DNAは安定な分子であり乾燥形態で無期限に保存可能であるため）、同じ核酸アレイの転写および翻訳を繰り返し行うことによってタンパク質アレイを必要に応じて「オン・デマンド」で作製できる。この配列により、種々のプローブを用いて繰り返しスクリーニングを行うことが容易になり、また保存中に起こり得る劣化および機能低下を避けることができる。この方法で必要に応じて作製したタンパク質は、その生来の立体構造および機能性を保持している可能性が高く、アレイ表面上で乾燥せずよく水分を含んでいる。従って、本発明は安定に配列タンパク質を調製する繰り返し可能な方法を提供する。
PISAおよびNAPPA法に対する本発明のさらなる利点は、タンパク質アレイが核酸アレイとは別の表面に作製されることである。従って、単に第２の担体表面を取り外すだけで、タンパク質アレイは核酸アレイから簡単に取り去ることができる。こうして、「純粋な」タンパク質アレイが作製でき、共に局在化した核酸から起こり得るあらゆる干渉が回避される。
PISA法に対する本発明のさらなる別の利点には、核酸アレイが高密度でプリントできアレイの型式内に密に平行にタンパク質を作製することが可能となるために、かなり小型化できることが含まれる。本発明はまた、直接または間接的に第１の担体表面と接触する核酸／抽出物の混合物を液体にて操作する必要がない。
本発明の一態様において、タンパク質を捕獲する第２の担体表面は、核酸を担持する第１の担体表面と直接または間接的に接触している。直接に接触する方法は本明細書において表面接触法と記載する。これには、第１の担体表面（例えば膜）を第２の担体表面（例えばガラスまたは第２の膜）と接触させる前に、第１の担体表面に転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系をアプライすることが必要である。
もう１つの方法である間接的接触は、タンパク質浸透性物質（膜など）を第１と第２の担体表面の間に置くことによって為し得る。この方法は本明細書においてサンドイッチ法と記載する。
サンドイッチ法は本発明の特定の一態様を構成する。
タンパク質浸透性物質は、第１および第２の担体表面の間に置くことができ、かつ第１および第２の担体表面の間のタンパク質の自由な拡散を許容する、あらゆる剛性または半剛性物質であり得ると解されたい。一態様において、タンパク質浸透性物質は側方拡散を制限する空間またはチャネルを含む膜または他の物質である。さらなる態様において、その物質は、第１および第２のアレイ担体表面上の核酸およびタンパク質それぞれのスポットの位置に対応する開口部（例えば空間、穴またはチャネル）を含む。
サンドイッチ法の利点の１つは、タンパク質浸透性物質が、転写または翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を含むことができることである。その無細胞系をタンパク質浸透性物質にアプライすると、そこでタンパク質合成が起こり、次いでタンパク質が拡散し、第２の担体表面上に固定化される。このように、無細胞系をアプライする工程を別に踏むのではなく、タンパク質浸透性物質を第１の担体表面上に置くことにより無細胞系をアプライする。
一態様において、無細胞系は、原核もしくは真核系（大腸菌(E. coli)、ウサギ網状赤血球およびコムギ胚芽など）またはインビトロタンパク質合成が可能な人工構築系から選択される無細胞ライセートである。
一態様において、第１および第２の担体表面は、ガラス、プラスチック、ナイロン、または他のタイプの膜であり、核酸の固定化を増強するために適用する別の被膜および／またはタンパク質固定剤を任意に有していてもよい。
本明細書において核酸と記載する時は、転写および翻訳因子を含む無細胞系に曝した場合にインビトロタンパク質合成のテンプレートとなることが出来るあらゆる核酸部分を意味すると解されたい。一態様において、核酸アレイは、ゲノムDNA、クローニングDNAフラグメント、プラスミドDNA、cDNAライブラリー、PCR産物、合成オリゴヌクレオチドまたはmRNAを含む。インビトロ転写／翻訳のための核酸コンストラクトは、あらゆる既知のDNA配列（データベースやゲノムプロジェクトからのものなど）について設計されたプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）またはRT（逆転写）-PCR増幅によって得ることが出来る。核酸アレイがmRNAアレイを含む一態様において、タンパク質合成に用いる無細胞系は、翻訳のみのための非共役(uncoupled)無細胞系が適切である。
本発明における核酸は、１以上の転写プロモーター、転写調節配列、非翻訳リーダー配列、切断部位をコードする配列、組換え部分、転写ターミネーターまたはリボソーム侵入部位をさらに含み得る。本発明における核酸は、複数のシストロン（またはオープンリーディングフレーム）または、その存在量が定量化でき第２の担体表面上に固定化されたタンパク質の測定が可能となるレポータータンパク質をコードする配列をさらに含み得る。
本発明のさらなる態様において、第２の担体表面は、発現されたタンパク質または発現されたタンパク質上に存在する固定化タグと結合（例えば共有結合または非共有結合的）するように構成されたタンパク質固定剤によって予めコーティングされている。
一態様において、固定化タグはヘキサヒスチジンのようなポリヒスチジン配列であり、 タンパク質固定剤はNi-NTAなどのキレート化剤である。さらなる一態様において、固定化タグはペプチド、ドメインまたはタンパク質であり、タンパク質固定剤はそのタグに特異的な抗体である。さらなる別の態様において、固定化タグはビオチンであり、タンパク質固定剤はビオチン結合分子（アビジンなど）である。
本発明の一態様において、第２の担体表面は、発現されたタンパク質と結合（例えば共有結合または非共有結合的）するように構成されたタンパク質固定剤 （例えば抗体）によって予めコーティングされている。
本発明の第３の局面によって、タンパク質アレイを作製する、以下を含む方法を提供する：
(i) 無細胞系による転写および翻訳が可能なタンパク質コードDNA分子を、第１の担体表面上に固定化する；および
(ii) 転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を担持するタンパク質浸透性物質を、第１の担体表面とタンパク質固定剤を担持する第２の担体表面との間に配置する；ことにより
(iii) そのDNA分子から発現されたタンパク質がそれらが形成されると第２のタンパク質固定化担体表面上に固定化されるようにして、対応するタンパク質アレイを作製する。
本発明のさらなる局面によって、タンパク質アレイを作製する、以下を含む方法を提供する：
(i) 無細胞系による転写および翻訳が可能なタンパク質コードDNA分子を、第１の担体表面上に固定化する；
(ii) 転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を、第１の担体表面にアプライする；および
(iii) 第１の担体表面をタンパク質固定剤を担持する第２の担体表面に接触するよう配置する；ことにより
(iv) そのDNA分子から発現されたタンパク質がそれらが形成されると第２のタンパク質固定化担体表面上に固定化されるようにして、対応するタンパク質アレイを作製する。
無細胞系を使用することの利点は、外来性生体分子または分子によってタンパク質合成のコンディションを調整および制御できる環境が得られることである。これにより、翻訳時または翻訳後修飾を有するタンパク質、非天然または化学修飾アミノ酸（蛍光基など）のような修飾タンパク質の作製が可能となる。
従って、本発明の一態様において、無細胞系は追加物質を含有する。
一態様において、その追加物質は、アレイとされたタンパク質と相互作用する、またはその相互作用する追加物質をコードする（例えば無細胞系による転写および／またはタンパク質への翻訳が可能な核酸）。
さらなる態様において、追加物質は、翻訳時または翻訳後修飾、非天然または化学修飾アミノ酸（蛍光基など）のような修飾を行うのに必要な生体分子または分子である。さらなる別の態様において、追加物質は、レポータータンパク質（酵素など。例えばβガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼまたは同種のもの）または蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたは同種のもの）である。追加物質を無細胞ライセートへ適切に加え、生じる配列タンパク質が翻訳時または固定化後に修飾されてそのタンパク質が素早く検出できるようにする。一態様において、追加物質は１以上のタンパク質折り畳み促進剤を含む。これらの促進剤によって、確実にアレイが正しく折り畳まれたタンパク質から構成されるという効果が得られる。
本発明はまた、タンパク質と他の分子（タンパク質またはより小さな要素など）との相互作用を検出するのに用いることが出来る。そのような相互作用は、リン酸化、メチル化またはタンパク質分解を通して起こり得る。相互作用する可能性のある可溶性タンパク質をコードする核酸を無細胞系内に取り入れ、合成されアレイ上に固定化されたタンパク質と無細胞系により同時に合成された可溶性タンパク質との間で相互作用が起こるようにしてもよい。
従って、本発明のさらなる局面によって、アレイとされたタンパク質と１以上の分子との間の相互作用を同定するための、以下を含む方法を提供する：
(i) 無細胞系による転写および翻訳が可能なタンパク質コードDNA分子を、第１の担体表面上に固定化する；
(ii) 転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を担持し、かつ前記の１以上の分子を含有するタンパク質浸透性物質を、第１の担体表面とタンパク質固定剤を担持する第２の担体表面との間に配置する；ことにより
(iii) そのDNA分子から発現されたタンパク質がそれらが形成されると第２のタンパク質固定化担体表面上に固定化されるようにして、対応するタンパク質アレイを作製する；および
(iv) アレイとされたタンパク質と前記の１以上の分子との相互作用をタンパク質アレイ上で検出し得る。
本発明のこの態様は、タンパク質複合体をタンパク質アレイ上に局在化させてそこから相互作用パートナーを同定することができ、これによりタンパク質相互作用ネットワークの特性解析が可能となるという利点を有する。本発明のこの態様はまた、アレイとされたタンパク質との相互作用を抑制または増強する分子の同定にも用いることが出来ると理解されたい。
本発明の一態様において、前記の１以上の分子は抗体、他のタンパク質もしくはドメイン、ペプチド、低分子量要素もしくはリガンド、細胞抽出物または核酸から選択される。
一態様において、前記１以上の分子は、翻訳時または翻訳後にタンパク質アレイと相互作用するための１以上の可溶性タンパク質の合成を導くことができる、遊離のDNAまたはmRNAを含む。
タンパク質−タンパク質相互作用を調べるためのもう一つの態様では、複数の（例えば１より多い）異なる核酸分子を共にスポットし、それらのコードタンパク質の１つがタンパク質捕獲表面に固定化されるような核酸アレイを作製する。
この態様では、各スポットからインサイチュ合成されたタンパク質を互いに相互作用させることができる。それらが相互作用パートナーである場合、それらは捕獲表面上でタンパク質複合体として検出され、核酸アレイに基づいて同定することができる。
アレイとされたタンパク質と分子（標識化したリガンド、タンパク質または核酸など）との間の相互作用を同定するためのさらなるもう一つの態様において、前記分子をタンパク質アレイに直接曝し、酵素結合反応、蛍光、オートラジオグラフィーまたは質量分析によって個々のアレイ位置への結合を検出することも可能である。このようにして、そのアレイを用いて、抗体、リガンドまたはタンパク質などとの相互作用を直接スクリーニングすることができる。本発明によって単一核酸アレイの同一コピーを多数作製できるため、そのようなスクリーニングは数回繰り返すことができる。さらに、そのアレイの型式を維持しつつ、そのタンパク質アレイ表面を抗原などの標的分子で予めコーティングしたフィルターまたはプレートに移し、標識化した第２の試薬によって結合を検出することもできる。
本発明のさらなる局面によって、担体表面上に位置する核酸アレイテンプレートから無細胞タンパク質合成によって別の担体表面上に作製された対応するタンパク質アレイを提供する。一態様において、その担体表面はその別の担体表面と直接または間接的に接触している。
本発明のさらなる局面によって、担体表面上に位置する核酸アレイテンプレートから無細胞タンパク質合成によって別の担体表面上に作製された対応するタンパク質アレイであって、その第２の担体表面が直接または間接的にその第１の担体表面と接触していることを特徴とするアレイを提供する。
本発明のさらなる局面によって、抗体、他のタンパク質もしくはドメイン、ペプチド、低分子量要素もしくはリガンド、細胞抽出物または核酸から選択される１以上の分子とアレイとされたタンパク質との相互作用を同定するための、本明細書に記載のようなタンパク質アレイの使用を提供する。
本発明のさらなる局面において、ライブラリー（ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーなど）に掲示された他の分子とアレイとされたタンパク質との相互作用を同定し、個々のタンパク質をコードDNAまたはmRNAと関連づけるための、本明細書に記載のようなタンパク質アレイの使用を提供する。一態様において、リボソームディスプレイライブラリーは、アレイとされたタンパク質の合成に用いた無細胞系内に取り入れたDNAから生成される。アレイへの結合の後、例えばクローニングファージを用いて、またはPCR、RT-PCR、ハイブリダイゼーションもしくは他の方法を用いて、関連するDNAまたはmRNAを増幅および同定することにより、相互作用分子を同定する。
本発明のさらなる局面によって、細胞発現プロファイルを研究するための、本明細書に記載のようなタンパク質アレイの使用を提供する。
本発明のさらなる局面によって、細胞タンパク質の翻訳後修飾を研究するための、本明細書に記載のようなタンパク質アレイの使用を提供する。
本発明のさらなる局面によって、タンパク質アレイを作製するための以下を含むキットを提供する：
(i) タンパク質をコードするDNA分子をその上に固定化するのに適している、第１の担体表面；および
(ii) タンパク質固定剤をその上に固定化するのに適している、第２の担体表面。
本発明のさらなる局面によって、タンパク質アレイを作製するための、以下を含むキットを提供する：
(i) タンパク質をコードするDNA分子をその上に固定化するのに適している、第１の担体表面；および
(ii) タンパク質固定剤をその上に固定化するのに適している、第２の担体表面、
ここで、第１と第２の担体表面は互いが直接または間接的に接触できるように構成されている。
本発明のこの局面の一態様において、そのキットは、転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系をさらに含む。
本発明のこの局面のさらなる態様において、そのキットは、前記の無細胞系を第１の担体表面に輸送するためのマイクロ流体チャネリング系をさらに含む。
本発明のこの局面のさらなる別の態様において、そのキットは、第１の担体表面と第２の担体表面とが確実に接触し続けるようにするための固定手段をさらに含む。
本発明のこの局面のさらなる別の態様において、そのキットは、第１と第２の担体表面の間に配置するべき、本明細書に記載のようなタンパク質浸透性物質をさらに含む。
本発明のこの局面のさらなる別の態様において、そのキットは、本明細書に記載のような方法に従ってキットを使用するための説明書をさらに含む。
まず図１について言及すると、本発明の「サンドイッチ」態様には、第１と第２の担体表面（例えばガラススライド）の間に配置したタンパク質浸透性物質（例えばメンブランフィルター）内で起こる無細胞タンパク質合成が含まれる。第１の担体表面（DNAアレイ表面）１は、固定化DNA分子のアレイを担持し、一方、第２の担体表面３はタンパク質捕獲試薬でコーティングされている（タンパク質捕獲表面）。メンブランフィルター２は、無細胞抽出物を保持することに加え、タンパク質の側方拡散を制限するように機能し得る。そのフィルターはタンパク質合成のための共役(coupled)無細胞ライセートに予め浸され；これらはインビトロタンパク質合成に標準的に用いられる大腸菌、ウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽抽出物であり得る。工程(a)は、DNAアレイ表面１、メンブランフィルター２およびタンパク質捕獲表面３を集合させ組み合わせることを含む。工程(b)は、無細胞タンパク質発現および固定化（一般的に１−２時間かかり得る）を含む。個々のDNA分子はタンパク質４の合成を導き、次いでそのタンパク質はフィルターを通して第２の担体表面３に拡散し、そこで捕獲試薬との相互反応を通じてインサイチュに固定化される。膜平面内でのタンパク質の拡散は記載の条件下で制限されるので、タンパク質アレイ５上のタンパク質スポットの位置はDNAアレイ上の位置と相補的であり、これによりタンパク質の同定の準備が整う。
図２は、本発明の「表面接触」態様を図解しており、第１の担体表面６（例えば、核酸検出用に設計されたハイブリダイゼーション膜などの膜表面）上にアレイとして固定化されたDNA分子を含む。このDNAアレイはタンパク質合成成分７を含有する無細胞抽出物に浸され、工程(a)は、第１の担体表面６を、タンパク質捕獲試薬で予めコーティングした第２のタンパク質固定化担体表面３（例えばガラススライドまたは膜）に直接接触させることを含む。工程(b)は、無細胞タンパク質合成および固定化（一般に１−２時間）を含み、これは膜とタンパク質固定化表面の間の境界で起こるもので、タンパク質４は上記サンドイッチ法に記載のようにタンパク質アレイ５として固定化される。
材料と方法
1.材料
オリゴヌクレオチドプライマー(RTST7/B: 5’-GATCTCGATCCCGCG-3’、Cy5結合RTST7/B: 5’ Cy5-GATCTCGATCCCGCG-3’およびNH2結合ターミネーター/F: 5’NH2-AAAACCCCTCAAGACCCG-3’)をSigma-Genosys (UK)から入手した。GFPをコードするプラスミドをRoche(UK)から入手した。Nexterion（商標）スライドH（ハイドロゲルコーティング）およびNexterion（商標）スライドE（エポキシシランコーティング）をSCHOTT Nexterionから入手した。ポリヒスチジン結合のためにニッケルキレートでコーティングしたスライドをXENOPOREから入手した。ウサギ網状赤血球ライセートTNTをPromegaから入手し、大腸菌(E. coli) S30抽出物は周知の方法によって合成するか、またはRoche (UK)から購入した。タンパク質コーティングのためのMaxisorp（商標）スライドはNunc (UK)から入手した。
2.方法
2.1 DNA固定化のためのPCRコンストラクト
標準的PCR法を用いて無細胞タンパク質合成のためのPCRコンストラクトを作製した。タンパク質の固定化のために、標的タンパク質のC末端に二重(His)6タグを融合させた（国際公開第02/14860号パンフレット）。DNAフラグメントの標識化は、必要な化学基を有する修飾プライマーを用いてPCRにより行った。DNA固定化のために、5’末端をアミノ(NH2)基で標識化した3’プライマー（NH2結合ターミネーター/F、材料を参照）を用いた。DNA検出および固定化の両方のために、Cy5結合プライマーRTST7/BおよびNH2結合ターミネーター/Fを用いた。30サイクル後、アガロースゲル電気泳動によって標識化PCR産物を分析し、Gene-Elute PCRクリーンアップキット(Sigma)を用いて過剰な3’プライマーを除去して精製した。Duraporeメンブランフィルター(0.22μm)はMillipore (UK)から入手した。
2.2 DNAの固定化
DNAのガラススライド上への固定化は、Nexterion（商標）スライドHまたはNexterion（商標）スライドEのいずれかを用い、メーカーの説明書に若干の変更を加えて行った。簡潔に説明すると、Nexterion（商標）スライドHにおいては、NH2標識化PCRフラグメント(100-200ng/μl)を6xプリンティングバッファー(300mMリン酸ナトリウムpH 8.5)と5:1（PCRフラグメント：6xプリンティングバッファー）の割合で混合した。次いで混合物をガラススライド上にスポットし、箱形加湿室で室温で一晩インキュベートした。Nexterion（商標）スライドHにおいては、スライドをブロッキング溶液（0.1M Tris-HCl、50mMエタノールアミン、pH9.0）に室温で１時間浸してブロックした。滅菌水で３回洗浄した後、スライドを200xgで5分間遠心分離して乾燥させ、4℃で保存した。Nexterion（商標）スライドEにおいては、上記のようにDNAをプリントした後、スライドを60℃で30分間インキュベートし、0.1％Triton X-100による5分間の洗浄を１回、1mM HClによる2分間の洗浄を２回、100mM KClによる10分間の洗浄を１回そして水による1分間の洗浄を１回行った。スライドをブロッキング溶液によって50℃で15分間ブロックし、水で1分間洗浄し、上記のように乾燥させ、4℃で保存した。
Hybond（商標）N+膜上にDNAを固定化するために、NH2標識化または非標識化プラスミドDNAまたはPCRフラグメントをHybond（商標）N+膜の表面上にスポットした。短時間乾燥させた後、その膜を80℃で2時間インキュベートした；あるいは、UV架橋（自動架橋設定、120mJ/cm2、UV Stratalinker 3600）によって処理した。次いでその膜を乾燥させ4℃で保存した。
2.3 サンドイッチアレイ法
MilliporeのDuraporeメンブランフィルターを初めに大腸菌無細胞ライセートに浸した（1cm2につき25μlライセート）。次いで、それを２つの表面（DNAアレイスライドとタンパク質捕獲スライド）の間に配置し、その表面の間をしっかりと接触させた。30℃で（用いた無細胞系に応じて）1-4時間インキュベートした後、スライドを分離し、タンパク質捕獲表面を0.05％Tweenを含有するPBSで３回洗浄した。
2.4 表面接触アレイ法
固定化DNAを担持するHybond（商標）N+膜(Amersham, UK)を、タンパク質捕獲試薬で予めコーティングした表面（例えば膜またはガラススライド）に接触するよう配置した。そのDNAアレイを担持する膜の、DNAを被覆していない側の上に、共役無細胞ライセートを広げることによって、無細胞タンパク質合成を開始させた。密着させるために、Hybond（商標）膜にガラススライドをかぶせ、第２の表面に押しつけた。無細胞タンパク質合成および固定化の条件は上記2.3の項目に記載した通りである。
2.5 スライドのスキャンニング
Cy5およびCy3の検出はAffymetrix 428アレイスキャナーを用いて行った。画像解析はImagene（商標）4.0 (BioDiscovery, Inc.)で行った。
実施例１：サンドイッチ法によるGFPアレイの作製
二重(His)6タグを付加した野生型緑色蛍光タンパク質GFP (Roche)をコードするPCRフラグメントをNexterion（商標）スライドH上に固定化した。対照として、一本鎖VH/K抗体フラグメントをコードするPCRフラグメントを同じスライド上に固定化した。Ni-NTAをコーティングしたスライドをタンパク質捕獲表面として用いた。大腸菌無細胞抽出物(Roche, UK)に予め浸しておいたメンブランフィルター(Millipore Durapore)をその２つの表面の間に挿入した。30℃で1.5時間インキュベートした後、Ni-NTAコーティングスライドを0.1％Tween 20を含有するPBSで３回洗浄した。スライドを、ビオチン化抗GFP抗体(Abcam, Cambridge, UK)(1:4000)、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジン(1:4000)を用いてプローブ探索した。チラミド（tyramide）-Cy3基質(PerkinElmer Life Science, UK)を用いて蛍光に基づく検出によりHRPを現像した。図３は抗GFPによるプローブ探索に次いで蛍光に基づく検出(Cy3)を行ったGFPアレイの結果を示す。レーンAは、固定化DNAパターンに対応するアレイとしてGFPが検出されたことを示すが、一方、対照のレーンBの一本鎖抗体フラグメント(VH/K)は抗GFPについて陰性であった。
実施例２：同一DNAアレイを繰り返し用いてタンパク質アレイを作製することの実証
GFPプラスミドをテンプレートとし修飾プライマー（NH2結合ターミネーター/FおよびCy5結合RTST7/B、材料を参照）を用いてPCRを行った。これにより一方の末端にNH2基、もう一方の末端にCy5を有する標識化PCRフラグメントが生成された。実施例１に記載の方法を用いて、結合したNH2基によってPCRフラグメントをNexterion（商標）スライドH上に固定化した。固定化したPCRフラグメントはCy5基を含有するので、スライド上でスキャンして検出することができ、その結果配列したDNAスポット（図４に特徴10として示す）が明らかになった。次いでDNAアレイを担持するスライドからサンドイッチ法を行ってGFPタンパク質アレイを作製し、実施例１のように抗GFP抗体を用いて検出した。図４は、得られたGFPアレイを示し（アレイAとして示す）、そのパターンはDNAアレイのパターンと非常によく似ている。DNAアレイの再利用を実証するために、同一DNAアレイをテンプレートとして用いてサンドイッチ法を繰り返した。これによりGFPアレイの第２および第３のコピーが作製され（それぞれ図４のアレイBおよびC）、この方法によって単一のDNAアレイテンプレートを繰り返し用いてタンパク質アレイが作製できることが確認された。
実施例３：サンドイッチ法によるTIMP-1アレイの作製
二重(His)6タグが付加されたTIMP-1（メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤）をコードするPCRフラグメントをGFPについて記載したように作製した。実施例１に記載のようにDNAの固定化を行い、Ni-NTAでコーティングしたスライドを用いてタンパク質を捕獲した。サンドイッチアレイ法を30℃で4時間インキュベートして行った後、Ni-NTAスライドを抗His抗体(1:4000)(Sigma, UK)でプローブ探索した。その結果は、TIMP-1がDNAアレイと同じアレイパターンで検出されたことを示している（図５のアレイ11を参照）。
実施例４：サンドイッチ法による、リガンド(MMP-2)コーティングスライド上へのタンパク質アレイの作製。
TIMP-1のリガンドであるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP-2)を用いて、Nunc Maxisorp（商標）スライド(3μg/ml)をメーカーの説明書に従いコーティングした。このリガンドコーティング表面を用いて、DNAアレイから合成されたTIMP-1を捕獲した。この方法において、その特異的リガンド結合活性を有するタンパク質のみが検出され、機能的結合活性および特異性の直接スクリーニングが可能となる。二重(His)6タグ付加GFPを陰性対照として用いた。サンドイッチアレイ法を4時間インキュベートして行った後、MMP-2コーティングスライドを抗His抗体によってプローブ探索した。図６は、抗His抗体によるプローブ探索に次いで蛍光の基づく検出(Cy3)を行ったTIMP-1アレイの結果を示す。レーンBはTIMP-1が固定化DNAのパターンに対応するアレイとして強く検出されたことを示すが、一方、レーンAの二重(His)6タグ付加GFP対照は結合を示さなかった。
実施例５：表面接触法によるGFPアレイの作製
二重(His)6タグ付加GFPをコードするプラスミドをHybond N+膜上に固定化し、そのDNA表面を、モノクローナル抗His抗体(5μg/ml)を予めコンジュゲートしたニトロセルロース表面にかぶせた。Rocheの大腸菌無細胞ライセートをアプライし、その２つの膜を２つのガラススライドの間に配置し、クリップで互いをしっかりと挟んだ。30℃で3時間インキュベートしたあと、ニトロセルロース膜を、ビオチン化抗GFP次いでHRP結合ストレプトアビジンでプローブ探索した。HRPを化学発光により現像し、DNAスポットに対応する位置にGFPを検出した（図７に特徴12として示す）。
ここで、単なる例示のために以下に解説する添付の図面を参照して本発明を説明する。
図１は、本発明のサンドイッチ法を行うことができる方法の模式図を示す。 図２は、本発明の表面接触法を行うことができる方法の模式図を示す。 図３は、サンドイッチ法を用いて単一の核酸アレイから単一のタンパク質アレイを作製した後の、タンパク質検出アッセイの結果を示す。 図４は、サンドイッチ法を用いて単一の核酸アレイから３コピーのタンパク質アレイを作製した後の、タンパク質検出アッセイの結果を示す。 図５は、サンドイッチ法を用いて単一の核酸アレイから単一のタンパク質アレイを作製した後の、タンパク質検出アッセイの結果を示す。 図６は、サンドイッチ法を用いて単一の核酸アレイからリガンドコーティングスライド上に単一のタンパク質アレイを作製した後の、タンパク質検出アッセイの結果を示す。 図７は、表面接触法を用いて単一の核酸アレイから単一のタンパク質アレイを作製した後の、タンパク質検出アッセイの結果を示す。

Claims (27)

  1. タンパク質アレイを作製する方法であって、第１の担体表面上の核酸アレイを、転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系に曝すことにより、その核酸アレイから発現されたタンパク質が第２の担体表面上に対応するアレイとして固定化されることを含み、タンパク質浸透性の膜を第１と第２の担体表面の間に配置することにより、第２の担体表面が間接的に第１の担体表面と接触することを特徴とする方法。
  2. タンパク質浸透性の膜が、第１と第２の担体表面の間で自由なタンパク質拡散が可能となる開口部を含む、請求項１に記載の方法。
  3. タンパク質浸透性の膜が、転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を含有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 無細胞系が、原核または真核系から選択される無細胞ライセートである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 第１および第２の担体表面が、ガラス、プラスチック、ナイロンまたは他のタイプの膜である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 核酸アレイが、ゲノムDNA、クローニングDNAフラグメント、プラスミドDNA、cDNAライブラリー、PCR産物、合成オリゴヌクレオチドまたはmRNAを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 第２の担体表面が、発現されたタンパク質または発現されたタンパク質上に存在する固定化タグのいずれかに、共有結合または非共有結合的に結合するよう構成されたタンパク質固定剤で予めコーティングされている、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 第２の担体表面が、発現されたタンパク質に共有結合または非共有結合的に結合するよう構成されたタンパク質固定剤で予めコーティングされている、請求項７に記載の方法。
  9. 固定化タグがポリヒスチジン配列であり、タンパク質固定剤がキレート化剤である、請求項７に記載の方法。
  10. 固定化タグがペプチド、ドメインまたはタンパク質であり、タンパク質固定剤が該タグに特異的な抗体である、請求項７に記載の方法。
  11. 固定化タグがビオチンであり、タンパク質固定剤がビオチン結合分子である、請求項７に記載の方法。
  12. ビオチン結合分子がアビジンである、請求項１１に記載の方法。
  13. タンパク質アレイを作製する、以下を含む方法：
    (i) 無細胞系による転写および翻訳が可能なタンパク質コードDNA分子を、第１の担体表面上に固定化する；および
    (ii) 転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を担持するタンパク質浸透性の膜を、第１の担体表面とタンパク質固定剤を担持する第２の担体表面との間に配置する；ことにより
    (iii) 該DNA分子から発現されるタンパク質がその発現ないし合成後に第２のタンパク質固定化担体表面上に固定化されるようにして、対応するタンパク質アレイを作製する。
  14. 無細胞系が、アレイとされたタンパク質と相互作用する追加物質、または該相互作用する追加物質をコードする物質を含有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記の相互作用する追加物質をコードする物質が、無細胞系による転写および／またはタンパク質への翻訳が可能な核酸を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 無細胞系が、アレイとされたタンパク質に修飾を行う追加物質を含有する、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記追加物質が、翻訳時もしくは翻訳後修飾または非天然もしくは化学修飾アミノ酸を生ぜしめる生体分子または分子を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. アレイとされたタンパク質と１以上の分子との間の相互作用を同定する、以下を含む方法：
    (i) 無細胞系による転写および翻訳が可能なタンパク質コードDNA分子を、第１の担体表面上に固定化する；
    (ii) 転写および翻訳によるタンパク質合成が可能な無細胞系を担持し、かつ前記１以上の分子を含有するタンパク質浸透性の膜を、第１の担体表面とタンパク質固定剤を担持する第２の担体表面との間に配置する；ことにより
    (iii) 該DNA分子から発現されるタンパク質がその発現ないし合成後に第２のタンパク質固定化担体表面上に固定化されるようにして、対応するタンパク質アレイを作製する；および
    (iv) アレイとされたタンパク質と前記１以上の分子との相互作用をタンパク質アレイ上で検出し得る。
  19. 前記の１以上の分子が、抗体、他のタンパク質もしくはドメイン、ペプチド、低分子量要素もしくはリガンド、細胞抽出物または核酸から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記核酸が、タンパク質アレイと相互作用するための１以上の可溶性タンパク質の合成を導くことができる、遊離のDNAまたはmRNAを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. アレイとされたタンパク質と１以上のさらなるタンパク質との相互作用を同定するための方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載されているようにタンパク質アレイを作製することを含み、第１の担体表面に複数の異なる核酸分子を共にスポットする方法。
  22. 第１の担体表面上に位置する核酸アレイテンプレートから無細胞タンパク質合成によって第２の担体表面上に作製された対応するタンパク質アレイであって、タンパク質浸透性の膜が第１と第２の担体表面の間に配置されることにより、第２の担体表面が間接的に第１の担体表面と接触することを特徴とするタンパク質アレイ。
  23. 抗体、他のタンパク質もしくはドメイン、ペプチド、低分子量要素もしくはリガンド、細胞抽出物または核酸から選択される１以上の分子とアレイとされたタンパク質との相互作用を同定するための、請求項２２に記載のタンパク質アレイの使用。
  24. ライブラリーに掲示された他の分子とアレイとされたタンパク質との相互作用を同定するための、請求項２２に記載のタンパク質アレイの使用。
  25. ライブラリーが、アレイとされたタンパク質の合成に用いた無細胞系内に取り入れたDNAから生成されるリボソームディスプレイライブラリーである、請求項２４に記載のタンパク質アレイの使用。
  26. 細胞内に存在するタンパク質の発現プロファイルを研究するための、請求項２２に記載のタンパク質アレイの使用。
  27. 細胞内タンパク質の翻訳後修飾を研究するための、請求項２２に記載のタンパク質アレイの使用。
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