JP6038759B2 - 検出可能な核酸タグ - Google Patents

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Description

(分野)
本件出願で提供する主題は、対象とするタンパク質と連結するか、又は連結することが
できる核酸タグに関する。詳細には、本件出願で提供する主題は、レポーター機能及びタ
ンパク質タグ付け機能を含むオリゴヌクレオチドに関する。また、本件出願は、それを使
用した核酸タグ組成物、キット及び方法も提供する。
(背景)
タンパク質の存在を定量及び検出するための従来の技術には、ゲル電気泳動、ウェスタ
ンブロット法、ELISAベースの免疫吸収アッセイ及びタンパク質マイクロアレイが含まれ
る。これらの方法のそれぞれは扱いにくく、ハイスループット使用に適合しない。これら
の従来の方法には、検出感度及び特異性の限界もある。本件出願は、核酸タグ、及びその
核酸タグを用いる、非常に高感度で選択的な新しいタンパク質検出方法を提供する。
(概要)
本件出願は、タンパク質と連結するか又は連結することができ、そのタンパク質の高感
度検出を可能にする核酸タグを提供する。一実施態様では、核酸タグは、レポーター機能
及びタンパク質タグ付け機能を有するオリゴヌクレオチドである。一実施態様では、オリ
ゴヌクレオチド(オリゴマー)は、PCRプローブで判別可能なPCR増幅配列(アンプリコン)で
ある第一の核酸配列、及び対象とするタンパク質と共有結合で連結するか、非共有結合で
連結するか、複合体を形成するか、又はその他で結合する(例えば結合するか又は結合す
ることができる)第二の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。ある実施態様では、
アンプリコンは、ランダムに生成される、天然に存在しないPCR増幅配列である。一実施
態様では、第一の核酸配列及び/又は第二の核酸配列は、生物に内在しない。他の実施態
様では、第一の核酸配列及び/又は第二の核酸配列は、生物に内在する。ある実施態様で
は、第一の核酸配列及び第二の核酸配列は、異種性である。本明細書で用いるように、2
つの核酸配列が「異種性である」場合、第一及び第二の核酸配列は通常一緒に見いだされ
ないことを意味する。例えば、ある実施態様では、第一及び第二の核酸は同じタンパク質
をコードせず、及び/又は同じ生物体に由来しない。一部の実施態様では、第一の配列は
天然に存在する配列であり、第二の配列は天然に存在する配列であり、該第一及び第二の
配列は異なる。具体的な実施形態では、第一の核酸配列は、合成の及び/又はランダムに
生成される核酸配列、例えば天然に存在しない配列(例えば、任意の天然に存在する配列
から分岐したもの)などの核酸配列である。ある実施態様では、第一の核酸配列は、例え
ば対象とするタンパク質、融合タンパク質、核酸と相互作用するモチーフ、及び/又は本
件出願で提供されるスクリーニングアッセイで用いられるベクターで見いだされない、合
成の及び/又はランダムに生成される核酸配列などの核酸配列である。一部の実施態様で
は、第一の核酸配列は、本件出願で提供されるキナーゼアッセイで核酸タグを用いる予定
の場合などの、ヒトキノムに存在しない合成の及び/又はランダムに生成される核酸配列(
又は所与のアッセイで用いられる他の任意のヌクレオチド配列)などの核酸配列である。
これらの実施態様は、例えば、部分配列PCR増幅のために用いるプライマーが、第二のDNA
配列及び/又は他の任意の(例えば、天然に存在する)DNA配列、例えば所与のアッセイで用
いられるものと、交差反応及びミスプライムしないことを保証する。ある実施態様では、
例えば本件出願で提供される多重アッセイで用いる場合などに、プライマーが鋳型の間で
交差反応する機会がないように、各PCR鋳型は他とは異なる。
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、PCR増幅配列を含む第一の核酸配列、及び
核酸相互作用モチーフの標的配列でありそれに結合する核酸配列を含む第二の核酸配列を
含む。一例では、標的配列は、天然又は合成のDNA結合性タンパク質の認識配列である。
具体的な実施態様では、PCR増幅配列を含む第一の核酸配列は、核酸相互作用モチーフを
含む第二の核酸と分離し、異なっている。そのような実施態様では、核酸タグは、その核
酸タグを特異的に認識するDNA結合成分を有する対象とするタンパク質に結合し、又はそ
の他の方法で連結することができる。次に、核酸タグは、例えば定量PCR(qPCR)を用いて
、検出及び/又は定量することができる。qPCRによる核酸タグの検出は、信頼できる定量
検出方法であるだけでなく、非常に高感度で非常に選択的な検出方法である利点を有する
。qPCR検出方法の非常に高感度な性質のため、この方法は、非常に少ない量の標的タンパ
ク質の検出を可能にし、組換えタンパク質などの希少で高価なアッセイ成分の必要性を減
少させる。qPCR検出方法の非常に特異的な性質のため、qPCRは、複雑で不均一な混合物で
の特定のDNA配列の検出も可能にし、タンパク質検出を改善又は強化するためにタンパク
質試料になされるあらゆる種類の精製工程も不要にする。
本件出願で提供される核酸タグは、放射性標識、蛍光標識又はビオチン化などで、標識
することもできる。ある実施態様では、核酸相互作用モチーフに結合し、(a)第一の放射
性標識、蛍光標識又はビオチン化核酸配列、及び(b)核酸相互作用モチーフに結合する第
二の核酸配列、を含む核酸オリゴマーが本件出願で提供される。他の実施態様では、本件
出願は、核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを提供し、該オ
リゴマーは放射性標識、蛍光標識又はビオチン化されている。放射性標識タグ又は蛍光標
識タグなどの標識タグは、例えば、細胞画像化又は可視化アッセイで対象とするタンパク
質の存在又は場所を検出するために用いることができる。蛍光標識タグなどの標識タグは
、例えば、対象とする1つ以上のタンパク質を個々の試料に分離するために、選別アッセ
イで用いることもできる。ビオチン化標識などの標識タグは、例えば、免疫学的方法によ
る対象とするタンパク質の検出、又はアフィニティークロマトグラフィーによる対象とす
る標識タンパク質の精製も可能にする。核酸タグが標識されるある実施態様では、核酸タ
グは、PR増幅配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
本件出願は、核酸タグと連結若しくはその他の形で複合体を形成し、又は核酸タグと連
結若しくはその他の形で複合体を形成することができ、したがって、例えばその機能、活
性又は存在を研究又はモニターする場合に検出可能である、対象とするタンパク質も提供
する。一例では、対象とするタンパク質は、核酸相互作用モチーフに融合したキメラタン
パク質である。一例では、核酸相互作用モチーフは、DNA結合ドメインである。そのよう
な対象とするタンパク質は、DNA結合ドメインによって認識することができる標的配列を
有する核酸によって、タグ付けすることができる。キメラタンパク質は、ランダム突然変
異によって生成される発現ヌクレオチド配列、系統的に合成された配列を含む発現ヌクレ
オチド配列、発現cDNA又はこれらの可能形態の2つ以上の組合せでよい。対象とするタン
パク質をクローニングし、その後、細菌、昆虫、哺乳動物又は植物の宿主細胞など、適当
な宿主細胞で発現させることができる。ある実施態様では、宿主細胞は、その三次元構造
及び機能にとって重要となり得る任意の翻訳後修飾(例えば、ヒト宿主細胞における対象
とするタンパク質のグリコシル化又はプレニル化)の利点をタンパク質に与える。
本件出願は、タンパク質を標識して検出する核酸タグを用いて、対象とするタンパク質
と第二の分子との間の結合を検出する方法も提供する。ある実施態様では、この方法は、
試験化合物のライブラリを、対象とするタンパク質に結合するそれらの能力についてスク
リーニングすることを含み、その結合は、核酸タグの検出によって同定される。他の実施
態様では、この方法は、対象とするタンパク質に結合することが知られている固定化参照
リガンド(又は「ベイト」)の存在下で、対象とするタンパク質に競合的に結合する1つ以
上の試験化合物の同一性をスクリーニング及び判定する、競合結合アッセイを含む。その
ような競合結合アッセイは、既知の参照リガンドに加えて(又は、それに優先して)、対象
とするタンパク質に結合する代替の化合物の同定を可能にする。
本件出願は、対象とするタンパク質のパネルに対して、試験化合物を、該パネル中の1
つ以上のタンパク質に結合するその試験化合物の能力、及び/又はその化合物の結合特異
性プロフィールを生成する能力についてスクリーニングすることを含む方法も提供する。
スクリーニングをタンパク質のパネルに対して実施する場合、一部の実施態様では、スク
リーニングは多重化フォーマットで、例えば対象とする複数のタンパク質を含有するプー
ルされた試料に対して試験化合物の活性を同時に試験することによって、及び/又は、検
出段階において、対象とする特定のタンパク質にそれぞれ特異である複数の核酸タグを用
いることによって実施される。
本件出願は、以下の要素の1つ以上を含むキットも提供する：検出可能な核酸タグ、核
酸タグによって「タグ付けする」ことができるタンパク質、対象とするタンパク質に結合
する固定化参照リガンド、及び核酸タグの増幅を開始することができるPCRプライマー対
である。そのようなキットは、固定化参照リガンドに結合する分子、及び/又は対象とす
るタンパク質との結合について固定化リガンドと競合する分子を同定するために用いるこ
とができる。或いは、キットは、所与の検体中の、固定化参照リガンドに結合する分子の
存在を検出するための診断ツールとして用いることができる。
PCR増幅可能なDNA配列を含有する核酸タグを用いる競合結合アッセイを表す概要図である。
既知のキナーゼ阻害剤BIRB-796、SB202190及びVX-745とのp38の相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。SB202190は固定化参照リガンドとして用い、用いた核酸タグは、GAL4標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む融合体であった。
既知のキナーゼ阻害剤BIRB-796、SB202190及びVX-745とのp38の相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。SB202190は固定化ベイトとして用い、用いた核酸タグは、NF-κB標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む融合体であった。
4つの内部商標登録化合物とのBRAFの相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。化合物のうちの3つ、A、B及びCはキナーゼ阻害剤であり、キナーゼ阻害剤ではない化合物の1つは、陰性対照の役目を果たした。相互作用は、GAL4標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む核酸タグを用いて検出した。
4つの内部商標登録化合物とのBRAFの相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。化合物のうちの3つ、A、B及びCはキナーゼ阻害剤であり、キナーゼ阻害剤ではない化合物の1つは、陰性対照の役目を果たした。相互作用は、NF-κB標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む核酸タグを用いて検出した。
VX-680と2つの形態(活性及び不活性)のAblとの間の相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。相互作用は、NF-κB標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む核酸タグを用いて検出した。 イマチニブと2つの形態(活性及び不活性)のAblとの間の相互作用のKd計算値による結合曲線を示す図である。相互作用は、NF-κB標的DNA配列及びPCR増幅可能なDNA配列を含む核酸タグを用いて検出した。
(詳細な説明)
本件出願で提供される以下の実施態様は、例示であって制限ではない。本件出願で開示
される方法はある範囲の適用を有し、その全ては、検出可能な核酸によってタグ付けされ
る対象とするタンパク質を検出、定量化又は単離する能力に基づく。本件出願で提供され
る組成物及び方法は、インビトロ及び/又はインビボでタンパク質を標識するために用い
ることができる。
一部の実施態様では、核酸相互作用モチーフに結合し、(a)PCR増幅配列である第一の核
酸配列、及び(b)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列、を含む核酸オリゴ
マー(タグ)が本件出願で提供され、該第一の核酸配列は、該第二の核酸配列に対して異種
性である。
一実施態様では、核酸オリゴマーの長さは、約50〜約100、約50〜約200、約50〜約300
、約50〜約400、約50〜約500、約100〜約200、約100〜約300、約100〜約400、約100〜約5
00、約200〜約300、約200〜約400、約200〜約500、約300〜約400、約300〜約500又は約40
0〜約500ヌクレオチド長である。
本明細書で用いるように、用語「約(about)」又は「約(approximately)」は、所与の値
又は範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内(又は1%以下)を意味する
。
一部の実施態様では、核酸タグは、レポーター機能及びタンパク質タグ付け機能を有す
る。本明細書で用いるように、核酸タグに関して「レポーター」機能は、視覚化、又はそ
の他の方法で検出若しくは定量される能力である。ある実施態様では、核酸タグのレポー
ター機能は、核酸タグの放射能標識、蛍光標識又はビオチン化に由来する。本明細書で用
いるように、「核酸タグ」は、異種性のポリヌクレオチド結合ドメイン(本明細書ではポ
リヌクレオチド相互作用モチーフとも呼ばれる)、例えばDNA結合ドメイン(例えば、NFκB
)を含むタンパク質(例えば、キナーゼ)融合体などの、対象とするタンパク質に結合する
か又は結合する能力があるポリヌクレオチド、例えばオリゴマーである。核酸タグは、一
本鎖若しくは二本鎖のDNA、一本鎖若しくは二本鎖のRNA、DNA-RNAハイブリッド、RNA-RNA
ハイブリッド又はそれらの天然若しくは合成の誘導体、類似体及びその断片であることが
できる。一部の実施態様では、核酸タグはDNAであり、レポーター機能標識は、例えば、
任意の標準の酵素反応、例えばニックトランスレーションによって、又は、32P、125I若
しくはビオチンによって標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)による末端標識
化によってそのDNAに導入することができ、或いは、標識を挿入剤として導入することが
できる。市販され、核酸タグを標識するために用いることができる、多くの蛍光基がある
。核酸タグを標識するために用いることができる蛍光標識の一部の例は、フルオレセイン
イソチオシアンテ(isothiocyante)、ローダミン及びクマリン、並びにそれらの市販の誘
導体、例えばTexas Red(登録商標)及びAlexa Fluor(登録商標)である。
ある実施態様では、核酸タグは、検出可能なタンパク質又はポリペプチドと、例えば共
有結合によって、複合体を形成するか、共有結合するか又は非共有結合的に連結する。核
酸とタンパク質との融合体は、任意の方法、例えば、ピューロマイシンなどのペプチド受
容体を共有結合連結剤として用いるRoberts及びSzostakの方法(米国特許第6,258,558号及
び6,261,804号;国際公開98/31700;Roberts及びSzostak (1997)の論文Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1997) 94:12297-12302)によって生成することができる。簡潔には、そのよう
な例示的な方法は、それ自身のmRNAの3'末端と共有結合するタンパク質、すなわちRNA-タ
ンパク質融合体を生成する、インビトロ又はin situの転写/翻訳プロトコルを含む。これ
は、その3'末端に結合するペプチド受容体を有するmRNA分子の合成及びインビトロ又はin
situ翻訳によって達成される。具体的な実施態様では、ペプチド受容体は、成長するペ
プチド鎖のC末端に付加され、翻訳を終結するヌクレオシド類似体であるピューロマイシ
ンである。一実施態様では、メッセージの末端とペプチド受容体との間に、リボソームに
読取り枠の終わりに停止させるように設計されているDNA配列が含まれ、ペプチド受容体(
例えば、ピューロマイシン)がペプチジル-tRNA結合の加水分解の前に発生期のペプチド鎖
を受容するための追加の時間が提供される。
本明細書で用いるように、「ペプチド受容体」は、リボソームのペプチジルトランスフ
ェラーゼ機能の触媒活性によって、成長するタンパク質鎖のC末端に追加することができ
る任意の分子である。ある実施態様では、そのような分子は、(i)ヌクレオチド又はヌク
レオチド様部分(例えば、アデノシン又はアデノシン類似体(N-6アミノ位置のジメチル化
が許容される))、(ii)アミノ酸又はアミノ酸様部分(例えば、20個のD-若しくはL-アミノ
酸又はその任意のアミノ酸類似体(例えば、O-メチルチロシン又はEllmanらの論文、(1991
) Meth. Enzymol. 202:301に記載の類似体のいずれか)、及び(iii)これら2つの間の結合(
例えば、3'又は2'位置のエステル、アミド又はケトン結合);を含み、好ましくは、この結
合は、天然のリボヌクレオチド高次構造の環のパッカリングを著しく乱すことはない。ペ
プチド受容体は求核基を有することもでき、それは、アミノ基、ヒドロキシル基又はスル
フヒドリル基でよいが、これらに限定されない。さらに、ペプチド受容体は、ヌクレオチ
ド模倣体、アミノ酸模倣体、又は複合ヌクレオチド-アミノ酸構造の模倣体で構成するこ
とができる。タンパク質コード配列の「3'末端」に位置するペプチド受容体は、そのペプ
チド受容体分子がそのタンパク質コード配列の最終コドンの後に位置することを意味する
。この用語には、それらに限定されないが、タンパク質コード配列の3'末端に正確に位置
するペプチド受容体分子、並びに、介在するコード配列又は非コード配列(例えば、停止
部位に対応する配列)によって最終コドンから分離されるものが含まれる。この用語には
、コード配列又は非コード配列がペプチド受容体分子の後に続く(すなわち、3'末端側に
ある)構築物も含まれる。さらに、この用語には、それらに限定されないが、タンパク質
コード配列と共有結合する(介在核酸配列を通して直接又は間接的に)ペプチド受容体分子
、並びに、何らかの非共有結合手段によって、例えば、タンパク質コード配列の3'末端で
又はその近くで結合し、それ自体がペプチド受容体分子に結合する第二の核酸配列を用い
るハイブリダイゼーションを介して、タンパク質コード配列に結合するペプチド受容体分
子が含まれる。
共有結合したRNA-タンパク質融合体に加えて、任意の他の特異なPCR増幅可能な核酸(例
えば、RNA、DNA、PNA、又は2つ以上の共有結合した天然の若しくは修飾されたリボヌクレ
オチド若しくはデオキシリボヌクレオチドを含む任意の他の核酸)を、検出可能なタンパ
ク質又はポリペプチドに共有結合又は非共有結合的に結合することができる。融合体のタ
ンパク質部分は、一般的に天然のアミノ酸残基で構成されるが、ペプチド又はペプトイド
結合で結合したアミノ酸類似体又は誘導体を含むこともできる。
他の実施態様では、核酸タグのレポーター機能は、PCRによって増幅可能である核酸配
列である(本明細書では「アンプリコン」とも称される)。増幅可能な配列は、PCRプライ
マーに配列特異的様式でハイブリダイズするか又はハイブリダイズすることができる。あ
る実施態様では、核酸タグは、複数のアンプリコン、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、
10個又はそれ以上のアンプリコンを含む。一部の実施態様では、複数のアンプリコンは、
単一のアンプリコンのタンデムリピートである。ある実施態様では、アンプリコンは、そ
のような核酸タグによってタグ付けされたタンパク質の定量化を可能にする、定量PCRに
よって増幅可能である。具体的な増幅方法では、PCR配列の増幅は、PCR増幅鋳型を含有す
る核酸、PCRプライマー及びqPCRプローブを、標準のPCR反応混合液(一般に、10mMトリス-
HCl(25℃でpH8.3)、1〜4mMのMgCl2、0.1〜1mMのdNTPの最終濃度を有する混合液)中で混合
すること、並びに非特異的アニーリング又はミスプライミングを最小にするために試料を
先ずホットスタート条件(例えば、95℃で5分間加熱)で処理すること、それに続く変性ス
テップ(例えば、95℃で45秒間)、それに続くアニーリングステップ(55℃で1分間)、及び
それに続く伸長ステップ(72℃で1分間)を含み、qPCRシグナルの増幅を完了するために、
変性、アニーリング及び伸長の連続ステップを最高40ラウンドまで繰り返す。
本明細書で用いるように、核酸タグに関して「タンパク質タグ付け」機能とは、例えば
(a)対象とするタンパク質(例えば、キナーゼ)、及び(b)核酸認識配列を含む異種性のポリ
ヌクレオチド相互作用モチーフ、例えばDNA結合性タンパク質(例えば、NFκB)を含む融合
タンパク質などの核酸相互作用モチーフを標的にして、(例えば、共有結合又は非共有結
合によって)それに結合するか、複合体を形成するか又はその他の形で連結する能力であ
る。融合タンパク質の核酸相互作用モチーフは、本明細書の他の箇所で記載の核酸オリゴ
マーに結合する。
一実施態様では、標的DNA配列は、転写因子のDNA結合ドメインによって認識可能な転写
因子結合部位である。例えば、核酸タグは、NF-κB、croリプレッサー、lacリプレッサー
、GAL4、GCN4、Lex-A、Opaque-2及びTGA1aなどの転写因子のDNA結合ドメインによって認
識される、標的DNA配列を含有することができる。一実施態様では、転写因子結合部位は
、天然又は野生型の配列である。他の実施態様では、転写因子結合部位は、突然変異配列
である。他の実施態様では、転写因子結合部位は、野生型配列、及び任意選択で突然変異
配列を包含するコンセンサス配列を特徴とし得る。他の実施態様では、転写因子結合部位
は、天然であるか、修飾されたか又は合成されたDNA結合タンパク質と複合体を形成する
ことができる、合成又は遺伝子操作された配列である。他の実施態様では、標的DNA配列
は、タンパク質二量体によって通常認識される回文配列を有することを特徴とする。Gal4
又はLexAの標的配列は、そのような2例である。他の実施態様では、転写因子結合部位は
、転写因子Sp1の標的部位などのGCに富む領域を有することを特徴とする。他の実施態様
では、転写因子結合部位は、その関連するDNA結合タンパク質と1、2、3、4、5又は6時間
を超えるDNA-タンパク質複合体半減期を有することを特徴とする。
したがって、本件出願で提供される、DNA結合タンパク質などの対象とするタンパク質
及び核酸相互作用モチーフを含む融合タンパク質は、例えばDNAタンパク質複合体形成を
介して、本件出願で提供される核酸オリゴマーによって「タグ付け」することができる。
ある実施態様では、核酸相互作用モチーフ及び対象とするタンパク質を含む融合タンパク
質は、ヒトなどの同じ生物体に由来する。特定の一実施態様では、核酸タグは、DNA結合
タンパク質(例えば、NFκB、croリプレッサー、GAL4、GCN4、LexA、Opaque-2及びTGA1a)
によって特異的に認識され得る標的DNA配列と連結されたアンプリコンを含む。他の実施
態様では、核酸タグは、転写因子のDNA結合ドメインのコグネイトDNA配列と連結されたア
ンプリコンを含む。そのようなDNA結合ドメインのコグネイトDNA配列は当技術分野で公知
であり、例示的な配列を表1に示す。
他の実施態様では、核酸タグのタンパク質タグ付け機能は、DNA代謝酵素、例えばメチ
ルトランスフェラーゼ、アルキルトランスフェラーゼ及び/又はグリコシダーゼによって
認識される標的DNA配列である。これらの酵素は、化学修飾されたDNA塩基と相互作用する
ことができ、タンパク質のアミノ酸と核酸タグのDNA配列との間で共有結合を形成するこ
とができる。例えば、タンパク質融合がO6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェ
ラーゼ(AGT)の機能的断片を含有するならば、該アルキルトランスフェラーゼ機能を用い
てO6-アルキルグアニン又はO6-ベンジルグアニンに結合させた核酸タグをAGT融合タンパ
ク質に移動させ、核酸タグと融合タンパク質との間で共有結合を形成して核酸-タンパク
質複合体を形成することができる(例えば、国際出願第WO02/083937号を参照)。OGTは、AG
Tが基質からAGT融合体へ標識を移動させるようにタンパク質とAGTとの融合体を標識基質
と接触させ、それによって、移動した標識のために標識されたAGT-タンパク質融合体の操
作及び又は検出を可能にする系において、対象とするタンパク質を標識し、その後任意選
択で操作及び/又は検出するために用いることができる。基質の標識部分は、融合タンパ
ク質の意図する用途に従って、当業技術者が選択することができる。標識の非包括的な例
には、(1)蛍光団、発色団、磁気プローブ又はコントラスト試薬などの分光学的プローブ;
(2)放射能標識分子;(3)パートナーに特異的に結合することができる特異結合対の一方で
ある分子;が含まれる。そのような特異結合対は当技術分野で公知であり、例えば、アビ
ジン若しくはストレプトアビジンに結合することができるビオチン;(4)他の生体分子と相
互作用すると思われる分子;(5)他の生体分子と相互作用すると思われる分子のライブラリ
;(6)当業技術者に公知である、他の生体分子と架橋させることができる分子(例えば、Nad
eauら(2002)の論文「タンパク質間相互作用:分子クローニングマニュアル(Protein-Prote
in interactions: a molecular cloning manual)」(E Golemis編, Cold Spring Harbor L
aboratory Press; pp. 75-92)を参照);(7)連結された金属キレートなどの、H2O2及びアス
コルビン酸塩への曝露後にヒドロキシル基を生成することができる分子(例えば、Horiら(
2002)の論文「タンパク質間相互作用:分子クローニングマニュアル(Protein-Protein int
eractions: a molecular cloning manual)」(Ed. E Golemis, Cold Spring Harbor Labor
atory Press; pp. 288-311)を参照)(8)マラカイトグリーンなどの、光照射後に反応性基
を生成することができる分子(例えば、Jayらの論文(1999) Biochim. Biophys. Acta M39-
48を参照);(9)ガラススライド、マイクロタイタープレート又は当技術分野の熟練者に公
知である任意の重合体一般でよい固体支持体に共有結合した分子;(10)その相補鎖と塩基
対合が可能な核酸若しくはその誘導体;(11)膜挿入特性を有する脂質若しくは他の疎水性
分子;(12)好ましい酵素特性、化学特性若しくは物理特性を有する生体分子;(13)上記の特
性のいずれかの組合せを有する分子;などが挙げられる。
本明細書で用いるように、「対象とするタンパク質」は、研究する又はその他で特徴付
けるなどのために対象となり得る、任意の考え得るポリペプチド又はタンパク質であり得
る。一部の実施態様では、対象とするタンパク質は、トランスフェラーゼ、オキシドレダ
クターゼ、ヒドロラーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ又はリアーゼである。一実施態様では
、対象とするタンパク質は、ヒトのポリペプチド又はタンパク質である。ある実施態様で
は、対象とするタンパク質は、トランスフェラーゼ活性を有するトランスフェラーゼ、例
えばアシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、アミドトランスフェラ
ーゼ又は硫黄トランスフェラーゼである。他の実施態様では、対象とするタンパク質は、
ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ又はホスファターゼである。
ある実施態様では、キナーゼは、P13Kファミリーの脂質キナーゼなどの脂質キナーゼで
ある(例えば、mTOR)。具体的な実施態様では、対象とするタンパク質は、タンパク質キナ
ーゼである(例えば、Manning (2002)の論文Science 298:1912を参照)。具体的な実施態様
では、対象とするタンパク質は、チロシンキナーゼ又はセリン/スレオニンキナーゼであ
る。一部の実施態様では、対象とするタンパク質は、ヒトの非受容体チロシンキナーゼ、
例えば、ABL、ACK、CSK、MATK、FAK、PYK2、FES、FRK、JAK、SRC-A、SRC-B、TEC及び/又
はSYKファミリーのメンバーである非受容体チロシンキナーゼである。他の実施態様では
、対象とするタンパク質は、ヒトの受容体チロシンキナーゼ、例えば、ALK、AXL、DDR、E
GFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR、ROS、RYK、TIE、TRK、VEGF
R、AATYK及び/又はSuRTK106ファミリーのメンバーである受容体チロシンキナーゼである
。
一部の実施態様では、対象とするタンパク質は、G-タンパク質共役受容体(GPCR)などの
、7回膜貫通ヘリックスタンパク質などの膜貫通タンパク質である。対象とするタンパク
質は膜貫通イオンチャネルタンパク質でもよく、ある実施態様では、リガンド作動性イオ
ンチャネルタンパク質でよい。他の実施態様では、対象とするタンパク質は、核ホルモン
受容体タンパク質、例えば古典的ステロイドホルモン受容体及び/又はオーファンクラス
の核ホルモン受容体に含まれる受容体である。
さらに他の実施態様では、対象とするタンパク質は、細胞外のシグナル伝達分子若しく
は因子、例えばサイトカイン(例えば、インターフェロン及び/若しくはインターロイキン
)、成長因子、並びに/又はホルモン(例えば、インスリン、グルカゴン若しくはプロスタ
グランジン)である。ある実施態様では、対象とするタンパク質は、細胞内シグナルカス
ケードに関係するタンパク質、例えば、ホスファチジニル-イノシトールシグナル伝達、c
AMP又はcGMPの生成に関係する酵素又はコファクターである。
一部の実施態様では、対象とするタンパク質は、抗体、短鎖可変断片(small chain var
iable fragment)(scFv)、抗原又はエピトープである。
対象とするタンパク質は、一部の実施態様では、ランダム突然変異によって生成される
ヌクレオチド配列の発現、系統的に合成された配列を含有するヌクレオチド配列の発現で
あることができ、又は、それは発現したcDNAであることができる。ある実施例では、研究
され又は特徴付けられる対象とするタンパク質は、ヒトcDNAライブラリ(すなわち、ヒト
タンパク質)に由来する。
ある実施態様では、対象とするタンパク質は、対象とするタンパク質と異種性のDNA結
合タンパク質との間のキメラ融合体である。そのようなキメラ融合体では、キメラの各半
分に相当する少なくとも2つの遺伝子配列をインフレームで融合し、適当なベクターにク
ローニングし、選択した宿主細胞で発現させることができる。ある実施態様では、対象と
するタンパク質は、ヌクレオチド結合ドメイン(例えば、DNA結合タンパク質)の5'側であ
る。他の実施態様では、対象とするタンパク質は、ヌクレオチド結合ドメイン(例えば、D
NA結合タンパク質)の3'側である。具体的な実施態様では、対象とするタンパク質及び/又
はヌクレオチド結合ドメイン(例えば、DNA結合タンパク質)は、野生型タンパク質のそれ
ぞれの活性を保持する。キメラ融合体を含む対象とするタンパク質は、細菌、昆虫、哺乳
動物又は植物の宿主細胞を含む、様々な宿主細胞のいずれかにおいて発現させることがで
きる。対象とするタンパク質が適当な真核生物の宿主細胞で発現する場合は、それは、天
然のタンパク質に存在する翻訳後の真核生物の修飾を示すことができ、したがって、天然
のタンパク質の構造及び機能を有することが予想される。或いは、対象とするタンパク質
は、別の方法でヌクレオチド結合ドメインに合成的に連結することができる(例えば、ポ
リペプチドリンカーを用いる)。
本件出願は、本件出願で提供される複数の融合タンパク質を含み、該融合タンパク質の
少なくとも2つ以上は互いに異なる、融合タンパク質のライブラリも提供する。ある実施
態様では、本件出願は、本件出願で提供される複数のオリゴマーを含み、該オリゴマーの
少なくとも2つ以上は互いに異なる、オリゴマーのライブラリを提供する。本件出願は、
本件出願で提供される融合タンパク質をコードする核酸、並びに本件出願で提供される融
合タンパク質をコードする核酸を含むベクターも提供する。さらに、本件出願は、本件出
願で提供される融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供す
る。ある実施態様では、宿主細胞は、細菌、昆虫、哺乳動物又は植物の宿主細胞である。
ある実施態様では、本件出願は、対象とするタンパク質の活性を研究する機能アッセイ
も提供する。一部の実施態様では、対象とするタンパク質の活性は、核酸タグを用いて、
例えば核酸タグの存在を検出することによって評価される。そのような機能アッセイは、
タンパク質活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、又はより一般的にはモジュレー
ターとしての試験化合物の作用を研究するために用いることができる。
対象とするタンパク質は、(a)核酸相互作用モチーフ、及び(b)研究され又は特徴付けら
れるタンパク質、から構成されるキメラの一部であることができる(真の「対象とするタ
ンパク質」であるタンパク質の一部)。本発明の一実施態様では、核酸認識モチーフは、D
NA結合タンパク質であることができる。例示的なモチーフを表1に示す。DNA結合タンパク
質は、転写活性化剤及びリプレッサーを含む、転写因子のDNA結合ドメインを含むことが
できる。適するDNA結合ドメインの例には、NF-κB(真核生物)、croリプレッサー(λバク
テリオファージ)、lacリプレッサー(酵母)、GAL4(酵母)、GCN4(酵母)、Lex-A(大腸菌)、O
paque-2(トウモロコシ)及びTGA1a(タバコ)が含まれる。DNA結合ドメインの適合性は、そ
の標的配列への特定のDNA結合ドメインの結合時間に依存してもよい。例えば、NF-κBは
、その標的DNA配列と強い結合を形成し、解離半減期は4時間を超えると思われる。(Speig
htら(2001)の論文、Chem. Biol. 8:951-965を参照)。適するDNA結合ドメインには、天然
及び/又は人工のDNA結合モチーフ、例えば合成ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウ
ィングドヘリックス、ヘリックス-ループ-ヘリックス、ホメオドメイン及びPOUドメイン
の異なる断片を組み合わせることによって構築される、合成DNA結合ドメインも含まれる
。キメラタンパク質は、DNA結合ドメインの認識を介して、核酸タグのある結合認識配列
に「タグ付け」することができる。本発明の他の実施態様では、核酸認識モチーフは、上
で既に指摘した、DNAリガーゼ、DNA修復酵素、制限酵素又はDNAメチルトランスフェラー
ゼなどのDNA代謝酵素の完全長、部分長又は機能的断片であることができる。
Figure 0006038759
Figure 0006038759
本件出願で提供されるインビトロ方法は、核酸タグを使用して、標識タンパク質の細胞
下局在の研究、標識オルガネラの研究、タンパク質の転位、内在化若しくは分泌を含む標
識タンパク質の移動のモニタリング、及び/又は標識タンパク質の時空間発現プロフィー
ルのモニタリングのために、1つ以上のタンパク質を視覚化することを含む。
本件出願で提供される他の方法は、フローサイトメトリーを用いて標識タンパク質を検
出、定量及び/又は選別するための、核酸タグの使用を含む。そのような用途では、ある
実施態様において、核酸タグを蛍光標示式細胞分取(fluorescent-activated cell sortin
g)(FACS)のために蛍光標識することができる。
本件出願で提供されるさらに他の方法では、核酸タグをビオチン化し、それにより、免
疫学的方法による対象とするタンパク質の検出が可能となる。或いは、対象とする標識タ
ンパク質の精製を、アフィニティークロマトグラフィーによって達成することができる。
本件出願で提供される他の方法では、核酸タグはアレイ内に固定化される。そのような
アレイは、ある実施態様において、例えばタンパク質発現プロファイリング分析のために
、アドレス可能タンパク質アレイを作製するために用いることができる。
一実施態様において、本件出願は、リガンドに結合する対象とするタンパク質を同定す
る方法であって、(i)リガンドを、(a)対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び
(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させるこ
とであって、該対象とするタンパク質及び核酸相互作用モチーフは互いに異なる(例えば
、同じ生物体由来の異なるタンパク質若しくは異なる生物体由来の異なるタンパク質)こ
とと;(ii)融合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴ
マーを加えることと;(iii)未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を
除去することと;(iv)核酸オリゴマーが融合タンパク質に結合するかどうかを検出するこ
とと;を含み、これにより、結合した核酸オリゴマーの検出は、対象とするタンパク質が
リガンドに結合することを示す、前記方法を提供する。
本件出願で提供される方法及びアッセイは、任意の順序で実施することができる。例え
ばある実施態様では、核酸タグは、融合タンパク質と参照リガンドとの接触の前、その間
(例えば、同時に)、又は後に、融合タンパク質と接触させられる。本件出願で提供される
方法のある実施態様では、核酸オリゴマーは、核酸相互作用モチーフがオリゴマーに結合
する条件下で、核酸相互作用モチーフと接触させられる。
他の実施態様において、本件出願は、対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同
定する方法であって、(i)試験化合物の存在下及び不在下で、対象とするタンパク質に結
合する固定化参照リガンドを、(a)対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)
核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含む融合タンパク質と接触させることであ
って、該対象とするタンパク質及び核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;(ii)融
合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加える
ことと;(iii)未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること
と;(iv)核酸オリゴマーが融合タンパク質に結合するかどうかを検出することと;を含み、
試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化参照リガンドに結合した融
合タンパク質の量の減少は、試験化合物が対象とするタンパク質に結合することを示す、
前記方法を提供する。
一部の実施態様において、本件出願は、対象とするタンパク質に結合する試験化合物を
同定する方法であって、(i)融合タンパク質が検出可能なオリゴマーに結合する条件下で
前記融合タンパク質を前記オリゴマーと接触させることであって、前記融合タンパク質が
、核酸相互作用モチーフに融合した前記対象とするタンパク質を含み、前記検出可能なオ
リゴマーが、前記核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含むことと、(ii)前記試験
化合物の存在下及び不在下で、ステップ(i)の混合物を、前記対象とするタンパク質に結
合することができる固定化参照リガンドと接触させることと;(iii)未結合のオリゴマー及
び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;(iv)前記核酸オリゴマーを検出するこ
とによって、固定化参照リガンドに結合した融合タンパク質を定量化することと;を含み
、化合物の不在と比較した、化合物の存在下での固定化ベイトに結合した融合タンパク質
の量の減少は、前記試験化合物が前記対象とするタンパク質に結合することを示す、前記
方法を提供する。
他の実施態様において、本件出願は、対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同
定する方法であって、(i)融合タンパク質がオリゴマーに結合する条件下で前記融合タン
パク質を前記オリゴマーと接触させることであって、前記融合タンパク質が、核酸相互作
用モチーフに融合した前記対象とするタンパク質を含み、前記オリゴマーが、PCR増幅配
列、及び前記核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含むことと、(ii)前記試験化合
物の存在下及び不在下で、ステップ(i)の混合物を、前記対象とするタンパク質に結合す
ることができる固定化参照リガンドと接触させることと;(iii)未結合のオリゴマー及び/
又は未結合の融合タンパク質を除去することと;(iv)固定化参照リガンドに結合した融合
タンパク質をqPCRによって検出又は定量化することと;を含み、化合物の不在と比較した
、化合物の存在下での固定化ベイトに結合した融合タンパク質の量の減少は、前記試験化
合物が前記対象とするタンパク質に結合することを示す、前記方法を提供する。
具体的な実施態様では、スクリーニングアッセイで核酸タグを使用して、対象とするタ
ンパク質に結合することが知られている競合参照リガンドの存在下で、多数の候補リガン
ド(又は、「試験化合物」)から、対象とするタンパク質に競合的に結合するリガンドを同
定する。候補試験化合物には、1つ以上の有機化合物、無機化合物、合成核酸、天然核酸
、合成ポリペプチド、天然ポリペプチド、ペプチド断片及び/又はタンパク質を含めるこ
とができる。同様に、競合参照リガンドは、有機化合物、無機化合物、合成核酸、天然核
酸、合成ポリペプチド、天然ポリペプチド、ペプチド断片及び/又はタンパク質であって
よい。
例えば、医薬化合物のスクリーニングでは、溶液中で遊離し得る1つ以上の試験化合物
が、対象とするタンパク質との結合について、固定化参照リガンド又は「ベイト」と競合
する能力について評価される。ある実施態様では、固定化参照リガンドは医薬化合物であ
る。具体的な実施態様では、ベイトは、それらと対象とする複数のタンパク質との選択的
相互作用よりもむしろ乱交に基づいて選択することができる。一部の実施態様では、例え
ばベイトが、対象とする複数のタンパク質を含むパネル又はライブラリに対して用いられ
る場合など、ベイトが2、3、4、5、10、15、20、30、40、50個又はそれ以上の対象とする
タンパク質に結合するように、ベイトは選択される。
一実施態様では、スクリーニングはキナーゼ阻害剤(又は他のモジュレーター)について
である。固定化参照は、キナーゼの任意の既知の阻害剤又は他の結合剤であってよい。キ
ナーゼのパネルに対して競合結合アッセイを形成する実施態様では、ベイトは、複数のキ
ナーゼとの選択的相互作用よりもむしろそれらの乱交に基づいて選択することができる。
乱交プロフィールを有する例示的なベイトは、既知であり、例えば、SB202190、スタウロ
スポリン、プルバラノールB、SU5402、イマチニブメシレート、SU6668、イレッサ(Iressa
)及びPD-173955である。そのような参照化合物を固定化する技術は公知であり、例えば、
米国特許出願公開第20050153371号(例えば、実施例11)を参照のこと。本明細書で用いる
ように、「固体支持体」は、それらに限定されないが、任意のカラム(又はカラム物質)、
ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子(例えば、磁性、アガロース若しくはセ
ファロースビーズ)、マイクロチップ(例えば、ガラス、ファイバーグラス、ラテックス、
シリコン、シリコンガラス若しくは金のチップ)、又は膜(例えば、リポソーム若しくは小
胞の膜)、プラスチック物質(例えば、ポリスチレン若しくはポリビニルクロライド、又は
、参照リガンドなどのリガンドを直接若しくは間接に(例えば、他の抗体若しくはプロテ
インAなどの他の結合パートナー中間体を介して)結合することができるセンサーチップ(
例えば、BIAcoreシステムで用いるもの)、又は参照リガンドなどのリガンドを(例えば、
受容体若しくはチャネルを介して)包埋することができるセンサーチップである。
参照リガンド(ベイト)は、任意の標準手順を用いて、例えば、参照リガンドのビオチン
化と続く固定化ストレプトアビジン(例えば、磁性ビーズ若しくはカラムの上で固定化さ
れたストレプトアビジン)の使用によるビオチン化参照リガンドの捕捉によって捕捉する
ことができる。参照リガンドに結合する対象とするタンパク質(及び対象とするタンパク
質に結合する核酸タグ)は固体支持体に結合したままであるが、未結合の結合試薬(対象と
するタンパク質及び/又は核酸タグ)は洗い流される。結合した対象とするタンパク質の捕
捉後、試料中の標的に結合した核酸タグ(例えば、又は対象とするタンパク質のパネルの
対象とするタンパク質)は、核酸タグのアンプリコン部分にハイブリダイズするプライマ
ーを用いるPCR反応を実施することによって、簡単に検出される。ある実施態様では、PCR
反応は、標準の定量方法を用いて(例えば、Perkin-ElmerによるTaq Manを用いて)実施さ
れる。一部の実施態様では、対象とするタンパク質と核酸タグとの複数の複合体が固体支
持体によって保持され、その場合、単離されたプールの個々のメンバーは、例えば、パネ
ルの中の対象とする特定のタンパク質に特異的な各特有の核酸タグの増幅を介して同定す
ることができる。
一実施態様では、固定化参照リガンドはキナーゼのATP結合部位に結合し、スクリーニ
ングによりキナーゼのATP結合部位に競合的に結合する化合物の同定が可能になる。
他の実施態様では、固定化参照は、ATP結合部位を含む部位、及びATP結合部位に近接又
は隣接した部位に結合する。そのような参照「ベイト」を使用して、例えばATPの存在下
又は不在下で競合結合アッセイを実施して、キナーゼに対する試験化合物の見かけのKdに
及ぼすATPの影響を判定することによって、試験化合物がATP競合的に又は非ATP競合的に
結合するかを判定することができる。試験化合物がATP結合キナーゼに協同的に結合する
状況において、ATP競合的である試験化合物はATPの存在下で見かけのKdの上方シフトを示
すが、非ATP競合的である試験化合物は、ATPの存在下で見かけのKdの変化を示さず、及び
、試験化合物及びATPが協同的に結合する状況において見かけのKdの下方シフトを示さな
い。
他の実施態様において、本件出願は、ATP結合部位を有する対象とするタンパク質に結
合する試験化合物を同定する方法であって、前記試験化合物が、対象とするタンパク質に
対する非ATP競合的結合剤であり、(a)(i)試験化合物の存在下及び不在下で、並びに(ii)
外来性ATPの存在下及び不在下;で、対象とするタンパク質に結合する固定化参照リガンド
と、対象とするタンパク質を含む第一のドメイン及び核酸相互作用モチーフを含む第二の
ドメインを含む融合タンパク質とを接触させることであって、該対象とするタンパク質及
び核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;(b)融合タンパク質の核酸相互作用モチー
フに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;(c)未結合の核酸オリゴマー
及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;(c)核酸オリゴマーが融合タンパク
質に結合するかどうかを検出することと;を含み、(i)試験化合物の不在及びATPの不在と
比較した、試験化合物の存在下及びATPの不在下での固定化参照リガンドに結合した融合
タンパク質の量の減少は、試験化合物が対象とするタンパク質に結合することを示し、(i
i)試験化合物の存在及びATPの不在と比較した、試験化合物の存在下及びATPの存在下での
融合タンパク質に結合した核酸オリゴマーの量の増加は、試験化合物が対象とするタンパ
ク質に対する非ATP競合的結合剤であることを示す、前記方法を提供する。
一実施態様において、本件出願は、対象とするタンパク質と非ATP競合的に結合する試
験化合物を同定する方法であって、(i)融合タンパク質が検出可能なオリゴマーに結合す
る条件下で、前記融合タンパク質を前記オリゴマーと接触させることであって、前記融合
タンパク質が(a)前記対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用
モチーフを含む第二のドメインを含み、前記オリゴマーが、前記核酸相互作用モチーフに
結合する核酸配列を含むことと;(ii)前記試験化合物の様々な濃度の存在下及び前記試験
化合物の不在下で、ステップ(i)の混合物を固定化参照リガンドと接触させることであっ
て、前記固定化参照リガンドが前記融合タンパク質とATP結合部位で、及び、ATP結合部位
に近接又は隣接する領域(例えば、ATP結合部位の外部)に結合することと、(iii)未結合の
核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;(iv)試験化合物の各
濃度(例えば、結合曲線を得るために)でオリゴマーを検出することによって、固定化参照
リガンドに結合した融合タンパク質の量を定量化することと;(v)固定化リガンドに結合し
た対象とするタンパク質の量が化合物の不在下で固定化リガンドに結合した対象とするタ
ンパク質の量の50%での前記試験化合物の濃度を決定することであって、前記濃度が前記
試験化合物のKdであることと;(vi)ステップ(i)〜(v)を繰り返すことであって、ステップ(
ii)の混合液をATPとさらに接触させることと;を含み、ATPの存在下及びATPの不在下で計
算されたKdが変化しない場合、又は、ATPの存在下で計算されたKdがATPの不在下で計算さ
れたKdよりも小さい場合、前記試験化合物は前記融合タンパク質と非ATP競合的に結合す
る、前記方法を提供する。ある実施態様では、核酸オリゴマーはアンプリコンを含み、検
出はqPCRをさらに含む。
さらに他の実施態様では、固定化参照は、ATP結合部位に近接又は隣接し、任意選択でA
TP結合部位と重複する部位に結合する。そのような結合部位は、基質結合部位を含むこと
ができ、又は、基質結合部位の外部にあることもできる。参照分子が、基質結合部位を含
む部位においてキナーゼに結合する場合、そのような参照「ベイト」を使用して、基質の
存在下又は不在下で競合結合アッセイを実施して、キナーゼに対する試験化合物の見かけ
のKdに及ぼす基質の影響を判定することによって、試験化合物がキナーゼと基質競合的に
又は非基質競合的に結合するかを判定することができる。基質競合的である試験化合物は
基質の存在下で見かけのKdの上方シフトを示すが、非基質競合的である試験化合物は、基
質の存在下で見かけのKdの変化を示さず、及び、試験化合物及び基質が協同的に結合する
場合には、見かけのKdの下方シフトも示さない。試験化合物は、本明細書で記載のアッセ
イから該試験化合物が非ATP競合的分子であると既に判定されている場合、二次スクリー
ニングのそのような競合結合アッセイにかけることができる。
ある実施態様では、固定化参照リガンド又は「ベイト」から対象とするタンパク質を置
換するために必要とされる試験化合物の濃度は、対象とするタンパク質に対するその親和
性の目安である。対象とするタンパク質がDNA結合ドメインを含有する場合、固体支持体
の上で保持される対象とするタンパク質の量は、DNA結合ドメインと(対象とするタンパク
質との融合体として)複合体を形成することができる配列を含有する核酸タグで検出する
ことができる。先に述べたように、核酸タグは、放射能標識、蛍光標識又はPCR増幅配列
の増幅によって検出可能である。
このように、本件出願は、対象とするタンパク質に結合する化合物(例えば、キメラ融
合体)を同定する方法であって、溶液中の少なくとも1つの候補試験分子の存在下及び不在
下で、対象とするタンパク質を固体支持体上に固定されている参照リガンド「ベイト」に
接触させることと、該支持体に保持される対象とするタンパク質の量を、濃度ゼロから始
めて次第に高くなる濃度の試験分子で滴定することと、該混合液に検出可能な核酸タグを
加えて該対象とするタンパク質を標識することと、試験化合物の各濃度につき固定化され
た対象とするタンパク質の量を決定することとを含む、前記方法を提供する。試験分子の
不在と比較した試験分子の存在下での結合した対象とするタンパク質の量の減少は、対象
とするタンパク質に結合する試験分子を同定する。「フォワードスクリーニング」では、
多数の試験化合物を速やかにスクリーニングして、対象とするタンパク質に結合する化合
物を同定することができる。試験化合物の濃度を調節することによって、代替の競合分子
がタンパク質に結合する際の親和性をあらかじめ選択することもできる。より高い親和性
が所望される場合、より低い濃度の候補が提供され、これらのより低い濃度では、固定化
参照リガンドからの対象とするタンパク質の除去が成功することが必要とされる。参照リ
ガンドは、対象とする特定のタンパク質に結合することが同定されているか又は知られて
いる標的分子であることができる。本明細書で記載されるように、この参照リガンドは、
任意の従来の方法を用いて固体支持体に固定化することができる。次に、固定化参照リガ
ンドを、参照リガンドが結合することが既知である1つ又は複数の対象とするタンパク質
と接触させることができる。ある実施態様では、この相互作用は、少なくとも1つの試験
化合物を含有する試料、及び試験化合物を含有しない試料で試験される。本件出願で提供
される検出可能な核酸タグを次に用いて、試験化合物の存在下及び不在下で固定化参照リ
ガンドに結合したタンパク質の量を決定することができる。首尾よく結合した試験化合物
は、試験化合物の不在と比較して参照リガンドに結合する対象とするタンパク質の量を減
少させる。
この手法では、プール中の試験化合物を供給する最初の競合反応を実施することによっ
て、多数の試験化合物を速やかにスクリーニングすることができる。各プール内の候補の
数は任意であるが、2、5、10、50又はそれ以上であってもよい。結合した対象とするタン
パク質の量を減少させることにプールが不成功となる場合、プールのメンバーをさらに試
験する必要はない。プールが成功する場合、プールに存在する個々の試験化合物を試験す
ることができ、又は、当初用いたものの中間サイズのプールを使用することができる。例
えば、最初のプールが50個の試験化合物を含有する場合、50個の試験化合物のうちの10個
をそれぞれ含有する5つのプールで試験を続けることができる。次に、成功したプールだ
けが、以降の試験ラウンドのためにさらに細分化される。競合結合スクリーニングは、例
えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれているFabianら(2005)の論文Nature Bio
technology 23(3), 329-336、及び米国特許出願公開第2003/0186221号);2004/0009470号
及び2005-0009099号でさらに詳細に開示される。
本件出願で提供される他の方法では、試験分子の解離定数は、あるアッセイ条件が満た
される場合に決定することができる:第一に、対象とするタンパク質の濃度が、タンパク
質の濃度が、対象とするタンパク質に対する試験分子のKdよりも小さいように十分に低く
維持されること、第二に、固定化参照リガンドの濃度が、対象とするタンパク質に対する
参照リガンドのKd(Kref)よりも小さいことである。
第一の条件を満たすために、アッセイでの対象とするタンパク質の濃度は非常に低く、
一般的に0.1nM未満に維持される。試験化合物が対象とするタンパク質の非常に強い結合
剤であることが予想される場合、対象とするタンパク質はより低い濃度に希釈される。結
合実験では過剰なタンパク質はなく、タンパク質濃度は、対象とするタンパク質に対する
試験分子のKdよりも低い濃度に維持される。
試験化合物に対する見かけのKdが対象とするタンパク質に対する参照リガンドのKd(Kre
f)によって影響を受けるのは、固定化参照リガンドの濃度がKrefよりも高い場合だけなの
で、第二の条件は満たされなければならない。この第二の条件を満たすために、Kref(す
なわち、対象とするタンパク質に対する参照分子のKd)の一般的範囲である0.3nM〜300nM
の範囲の濃度の固定化参照リガンドを用いて、競合結合アッセイを実施する。これらの条
件が満たされる場合、競合的結合は、以下の方程式:
f/f0 = Kcomp/(Kcomp + [comp])
によって記載することができ、上式で、fは、溶液中の競合試験分子の存在下で固定化参
照リガンドに結合した対象とするタンパク質の分画であり;f0は、溶解した試験分子の不
在下で結合した分画であり;Kcompは、溶液中の対象とするタンパク質と競合試験分子との
間の相互作用の平衡解離定数(Kd)であり;[comp]は、溶液中の競合試験分子の濃度である
。試験分子濃度の関数としての参照リガンドに結合した対象とするタンパク質の数は、グ
ラフ上にプロットすることができ、Kdは、その曲線を結合方程式f/f0 = (L + (H-L))×(K
comp/(Kcomp + [comp]))にあてはめることによって計算することができ、上式で、Lは下
のベースラインであり、Hは上のベースラインであり、Kcompは試験分子と対象とするタン
パク質との間の相互作用の結合定数であり、[comp]は試験分子の濃度である。50%競合で
は、試験分子の存在下での結合したタンパク質の分画は、試験分子の不在下でのそれの半
分であり、すなわち、f/f0 = 1/2であり、Kcompは[comp]と同等である。
対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値を決定する方法であって、(i)様々な
濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、対象とするタンパク質に結合する固定化参照リ
ガンドを、(a)対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチー
フを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させることであって、該対象とす
るタンパク質及び核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;(ii)融合タンパク質の核
酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;(iii)未結
合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;(iv)試験化合物
の様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において固体支持体上に保持される融合タンパク
質に結合する核酸オリゴマーを検出し、又はその他の方法で定量することによって、競合
結合曲線を得ることとを含む、前記方法であって;対象とするタンパク質に対する試験化
合物のKd値は、試験化合物の存在下で参照リガンドに固定化される対象とするタンパク質
が、試験化合物の不在下で保持される対象とするタンパク質の50%である濃度である。
本件出願で提供されるスクリーニングアッセイを用いて、試験化合物を対象とするタン
パク質のパネルに対して試験し、その特定のパネルに対する試験化合物のKdプロフィール
を生成することができる。Kdプロフィールは、標的が、例えば類似した基質結合部位を共
有するタンパク質のファミリーに属し、化合物交差反応の可能性が大きい場合に有用であ
り得る特徴である標的特異性を、ある化合物が有するかどうか判定するために有用である
。
本明細書で記載されるスクリーニングアッセイのいずれかを、一重又は多重フォーマッ
トで実行することができる。一例示的多重フォーマットでは、試験化合物は、対象とする
タンパク質のパネルからの複数のタンパク質に対するその結合特性について同時にスクリ
ーニング及び試験される。対象とする複数のタンパク質を同時又は逐次的に分析する場合
、対象とする各タンパク質に特異な核酸タグ(例えば、異なるアンプリコン)を用いて、異
なるタンパク質を識別することができる。例えば、核酸タグがPCR増幅マーカーを含有す
る場合、PCR増幅マーカーは検出される対象とする特定のタンパク質に特異的となろう。
したがって各タンパク質は、対象とするタンパク質に各々特異的であるDNA標的配列及びP
CR増幅マーカーを含む核酸タグによって、タグ付けすることができる。この特定のフォー
マットでは各核酸タグが特定のタンパク質と特異的に結合するので、対象とするタンパク
質は、競合結合工程でプールすること、及び/又は各タンパク質について競合結合工程を
個々に実施した後に溶出工程でプールすることができる。次に、プールからの分画は、試
験化合物との個々のタンパク質の相互作用について分析することができる。
或いは、多重フォーマットで一緒に分析されている対象とするタンパク質が同じ核酸相
互作用タンパク質(例えば、NFκB)で構成される場合、核酸タグは、異なる対象とするタ
ンパク質を識別するために用いることができる特異なPCR増幅マーカーなどの、同じDNA標
的配列であるが特異なレポーターを含有することができる。この代替の実施態様では、そ
のコグネイトDNAに対する高い親和性及び/又は長いタンパク質-DNA複合体半減期を有する
核酸相互作用タンパク質を選択することもできる。一実施態様では、NF-κBは、そのコグ
ネイトDNAに対する高親和性(表1を参照)、及び4〜40時間のその長い複合体半減期のため
に選択される。そのような実施態様では、対象とするキメラ融合タンパク質は、対象とす
るタンパク質、及びNF-κBのDNA結合ドメインを含む。多重フォーマットのこの代替の実
施態様では、競合結合ステップは、最初に各融合タンパク質に特異なアンプリコンを含有
する核酸タグを各融合タンパク質に「プリロード」し、その後、例えば2つの「プリロー
ド」されたキナーゼ、又は最高6つの(若しくはそれより多い)「プリロード」された融合
タンパク質を共通の容器内へ組み合わせることにより、多重フォーマットで競合結合を実
行することで、実施することができる。
ある実施態様において、本件出願は、2つ以上の対象とするタンパク質に結合する試験
化合物を同時に同定する方法であって、(i)試験化合物の存在下及び不在下で、2つ以上の
対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを2つ以上の融合タンパ
ク質と接触させることであって、各融合タンパク質が独立して(a)2つ以上の対象とするタ
ンパク質の1つだけを含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のド
メインを含み、対象とするタンパク質及び核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;(
ii)2つ以上の核酸オリゴマーを加えることであって、2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞ
れが、2つ以上の融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する核
酸配列を含むことと;(iii)未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を
除去することと;(iv)2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又はその他の方法で
定量することと;を含み、試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化
参照リガンドに結合した2つ以上の融合タンパク質の量の減少は、試験化合物が2つ以上の
対象とするタンパク質のそれぞれに結合することを示す、前記方法を提供する。
2つ以上の対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値を同時に決定する方法であ
って、(i)様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、2つ以上の対象とするタンパク
質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを2つ以上の融合タンパク質と接触させるこ
とであって、各融合タンパク質が独立して(a)2つ以上の対象とするタンパク質の1つだけ
を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該
対象とするタンパク質及び核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;(ii)2つ以上の核
酸オリゴマーを加えることであって、2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれが、2つ以上の
融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する核酸配列を含むこ
とと;(iii)未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
(iv)試験化合物の様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において固体支持体上に保持され
た2つ以上の融合タンパク質に結合する2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又
はその他の方法で定量することによって、競合結合曲線を得ることとを含む前記方法が提
供され;2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに対する試験化合物のKd値は、試験化
合物の存在下で固定化参照リガンドに保持された2つ以上の対象とするタンパク質のそれ
ぞれが、試験化合物の不在下で保持された2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれの5
0%である濃度である。
他の実施態様では、結合ステップの実施前に、サイレントデコイ核酸タグを共通の容器
に加えることができる。サイレントデコイは、共通の核酸相互作用タンパク質(例えば、N
FκB)によって認識されるが、いかなる種類のレポーター機能も含まないDNA標的配列(例
えば、コグネイトNFκBのDNA配列)を含む核酸タグであることができる。この代替の実施
態様で用いられるレポーター機能がqPCR増幅である場合、サイレントデコイはいかなる種
類のPCR増幅配列も含まない「qPCR-サイレント」デコイであることができ、したがって、
qPCR工程でいかなるシグナルも発生しない。核酸相互作用タンパク質が転写因子のDNA結
合ドメインである場合のように、核酸相互作用タンパク質がそのコグネイトDNAと可逆的
に結合する場合には、そのようなデコイを加える。そのようなデコイの目的は、タグ間の
任意の交換が2つのタグ間での交換よりもむしろ「サイレント」デコイタグを含み、した
がって、任意の交換が特定のタンパク質への結合シグナルを乱雑化させるよりも減少させ
る可能性を高くすることによって、異なる融合タンパク質の間での核酸タグの交換から生
じるシグナルの乱雑化を最小にすることである。
多重アッセイのある実施態様では、結合アッセイから個々の容器に溶出液を等分して移
し、各一定量をqPCRによって分析することによって、対象とする各タンパク質(例えば、
キナーゼ)について結合シグナルを個々に読み取る。或いは、各試料が、例えば多重化qPC
Rによって、同じ試料中の2つ又は3つ以上の異なるシグナルについて分析されるように、
結合アッセイからの試料を等分することによって、結合シグナルを多重フォーマットで判
定することができる。多重フォーマットの他の実施態様では、多重化は、結合シグナルが
測定される読出工程でのみ起こることができる。そのような実施態様では、競合結合工程
は各対象とするタンパク質について個々に実施され、次に、溶出ステップでプールされ、
そこで、試験化合物との個々のタンパク質の相互作用についてプールの各分画を分析する
ことができる。
多重フォーマットで試験されるタンパク質のパネルは、同じタンパク質ファミリーに属
してもよく、属さなくてもよい。一実施態様では、タンパク質のパネルは、受容体チロシ
ンキナーゼファミリーのキナーゼなどのキナーゼを含む。
多重フォーマットの他の実施態様では、試験化合物が対象とするタンパク質との結合に
ついて参照リガンドと競合する程度を判定するために、複数の試験化合物が、対象とする
タンパク質と同時に試験される。多重化は、このように大きな試験化合物ライブラリの迅
速なスクリーニングを可能にする。対象とするタンパク質に対して所望の結合親和性を有
する特定の化合物を同定するために、所望の競合結合範囲を示すある試験化合物プールだ
けをさらに試験する必要性がある。
試験化合物及び/又は対象とするタンパク質のKdプロフィールは、使いやすさ及び以降
の分析のために、データベース又は他の表の様式に入力することができる。一データフォ
ーマットでは、スクリーニングした試験化合物のアイデンティティは表の行で表示され、
対象とするタンパク質のアイデンティティは列で表示され、表の各セルは、各試験化合物
についての各タンパク質の解離定数値を含む。したがって、表の各行はタンパク質のパネ
ルに対する試験化合物の特異性プロフィールを表し、複数のタンパク質に対して乱雑な結
合を示す試験化合物よりも、選択的結合を示す試験化合物の同定及び選択を容易に可能に
する。あらゆる試験分子及びあらゆる対象とするタンパク質の結合プロフィールを互いに
関係付けることができるような方法でデータを表すために、コンピュータによるクラスタ
リング方法を用いることもできる。クラスター化されたデータ表示の一例では、同じ試験
分子に結合する傾向があるタンパク質は互いに近接して位置するが、異なる試験分子に結
合する傾向があるタンパク質は離れて位置する。クラスターマップに試験化合物が結合す
る場所を示すことにより、化合物ファミリーの構造活性相関を予測するために価値があり
得るさらなる洞察がもたらされ得る。
本件出願で提供されるスクリーニングアッセイは、他のスクリーニングフォーマットに
比べて多数の利点を可能にする。例えば、スクリーニングされる試験化合物は固定化及び
化学修飾することが不要であり、したがって、スケールアップ、多重化及びハイスループ
ットスクリーニングに直ちに利用でき、試験分子の速やかで広範な試験を可能にする。さ
らに、競合結合アッセイは非常に高感度な検出方法(例えば、qPCR)を用いるので、本方法
組換えタンパク質などの希少で高コストの物質のより少ない量を必要とする。定量的PCR
などのシグナル増幅技術は、極微量の標的タンパク質さえも用いるスクリーニングアッセ
イの実施を可能にする。したがって、定量PCRによって低ピコモルの量のタンパク質を正
確に検出することができ、Kd測定をピコモルの範囲で実施することができる。qPCRなどの
高感度であるだけでなく非常に選択的でもある検出方法の使用も、非特異的タンパク質干
渉の潜在的問題を除去し、タンパク質精製ステップ及び、通常、より従来的な技術を用い
て分析されるタンパク質試料に対して実施される他の種類の操作を不要にする。したがっ
て、本発明は、少量の細胞物質及びタンパク質だけを必要とする、速くて効率的な大容量
スクリーニング方法を可能にし、それらの理由のために、本発明は、細胞ベースのアッセ
イの代替となる経済的スクリーニング方法である。
本件出願は、対象とするタンパク質に結合することが知られている競合参照リガンドの
存在下で、対象とするタンパク質に競合的に結合する候補分子又は試験化合物をスクリー
ニングするためのキットも提供する。そのようなキットは、多重ウェルプレート内のウェ
ルなどの固体支持体又は容器に場合によっては固定化されている参照リガンド(又は「ベ
イト」);検出可能な核酸タグ;及び、核酸タグによって「タグ付け」することができる対
象とするタンパク質;で構成することができる。核酸タグがqPCRによって検出可能である
場合、キットはさらに、核酸タグ内にPCR開始配列を認識することができるPCRプライマー
を含んでよい。そのようなキットを使用して、先に記載したような競合結合スクリーニン
グアッセイを実施することができる。
他の実施態様では、キットは、参照又は「ベイト」リガンドに直接結合する分子(対象
とするタンパク質など)の存在を検出するために用いることができる。より具体的な実施
態様では、そのようなキットは、化合物、ペプチド又はタンパク質であれ、ある分子の存
在について生体試料を試験するための診断キットであってよい。一例では、キットは固体
表面に固定されるベイト分子;核酸タグによってタグ付けすることができる対象とするタ
ンパク質;及び検出可能な核酸タグ;を含む。qPCR増幅を可能にするために、キットはさら
に、核酸タグ内にPCR開始配列を認識することができるPCRプライマーを含んでよい。その
ようなキットでは、ベイト分子に結合するペプチド、タンパク質又は化合物などの分子の
存在を、ベイト分子に結合することもできる対象とするタンパク質の結合の減少によるシ
グナルの減少によって検出することができるように、ベイト分子は最適化された濃度で存
在する。特定の一実施態様では、検出可能なタンパク質は、核酸タグによってタグ付けす
ることができる抗体である。より具体的な実施態様では、検出可能なタンパク質は、核酸
タグと複合体を形成することができるDNA結合ドメインと融合している抗体である。その
ような診断キットは、例えば、患者の病態を判定するためにある生物学的マーカーの存在
を判定又は確認するために、血液、唾液、尿、精液又は他の検体などの生体試料を、抗原
マーカーの存在について試験するために用いることができる。この診断検査は、生体試料
中の天然又は合成のホルモン又は化合物の存在を検出するために用いることもできる。他
の実施態様では、診断キットは、ある場合には病原体に由来する、参照又は「ベイト」リ
ガンドに結合する化学分子又は生体分子の存在について、環境試料を試験するために用い
ることができる。
以下の実施例は、本発明を例示する役目を果たすことを意図するものであり、本発明を
限定するものと解釈してはならない。
本件出願で提供されるシステム及び方法の実施では、特に明記しない限り、分子生物学
、微生物学、遺伝分析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチドの合成
及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション並びに当該分野の技術の範囲内である関連分野に
おける従来の技術が使用される。これらの技術は本明細書で引用される参照内に記載され
、その文献で詳細に説明されている。例えば、Maniatisら(1982)の論文「分子クローニン
グ:研究マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor L
aboratory Press);Sambrookら(2001)の論文「分子クローニング:研究マニュアル(Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual)」第三版(Cold Spring Harbor Laboratory Press);Au
subelらの論文「分子生物学の現行プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology
)」(John Wiley & Sons)(1987年版及び現在までのアニュアルアップデート);Gait(編)(19
84)「オリゴヌクレオチド合成:実際的な手法(Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach)」(IRL Press);Eckstein(編)(1991)「オリゴヌクレオチド及び類似体:実際的な
手法(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)」(IRL Press);Birrenら
(編)「ゲノム分析:研究マニュアル(Genome Analysis: A Laboratory Manual)」(1999)(Co
ld Spring Harbor Laboratory Press)を参照。
(一時的な哺乳動物インビトロ発現ベクターの構築)
標準の分子生物学技術を用いて、下記の遺伝要素を、遺伝子合成とそれに続く制限消化
及びその後のライゲーションによって、一般的な細菌性プラスミドpGEMの主鎖にクローニ
ングした。5'末端から3'末端にかけて記載すると、それらは以下の通りである:
- 多くの細胞型で強い構成的発現を可能にするCMV(サイトメガロウイルス)エンハンサ
ー/プロモーター領域、
- ヒトβ-グロビン遺伝子の第一のイントロン、及び免疫グロブリン遺伝子重鎖可変部
のリーダーと本体との間のイントロンで構成されるキメライントロン(トランスフェクシ
ョンの研究は、cDNA挿入断片に連なるイントロンの存在が遺伝子発現レベルをしばしば増
加させることを証明している)、
- TEV(タバコエッチ病ウイルス)プロテアーゼ認識配列と、その後のいくつかの特異な
制限部位を有する複数のクローニング領域とインフレーム融合させた酵母GAL4又はヒトNF
-κB転写活性化剤のDNA結合ドメイン(表1を参照)、
- 増強されたmRNA安定性及び翻訳のためのSV40(シミアンウイルス40)後期ポリアデニル
化シグナル、
- 大腸菌での増殖のためのpMB1複製起点、及び
- 大腸菌での選択/増殖のためのアンピシリン耐性(AmpR)遺伝子。
(キナーゼのクローニング)
ヒトp38α(GenBank番号NP_620581.1)及びBRAF(GenBank番号NP_004324.1)キナーゼ配列
を、DNA結合ドメイン(GAL4又はNF-κB;表1を参照)とインフレーム融合させ、標準の分子
クローニングプロトコルを用いて制限消化及びその後のライゲーションによってクローニ
ングした。クローンの配列は、ABI配列決定によって検証した。
(一時的なインビトロ発現及びタンパク質抽出物調製)
ヒト胚腎臓(human embryonic kidney)(HEK)293細胞での一時的なインビトロ発現を、Li
pofectamine(登録商標)(Invitrogen社製)を用いて実施し、配列検証したプラスミドDNAを
、標準のQiagenプラスミド精製キットを用いて得た。トランスフェクションは、10cmの丸
型ペトリプレート内の80%コンフルエント細胞を用いて、37℃で24時間実施した。
タンパク質抽出は、150mMのNaCl、10mMのDTT及びComplete(商標)(Roche社製)抗タンパ
ク分解酵素混合物を含有する抽出緩衝液M-PER(Pierce社製)を用いて4℃で実施した。細胞
は、低温PBS洗浄の後プレート上で直接溶解し、細胞の細片は遠心分離によって除去した
。タンパク質濃度は、Bradfordタンパク質用量アッセイ(Bio-Rad社製)で測定した。抽出
物を等分し、液体窒素で冷凍し、使用時まで-80℃で保存した。
あらゆるDNA構築物の発現のレベル及び質は、GAL4及びNF-κBに対する抗体(Santa Cruz
Biotechnology社製)を用いて、SDS-PAGE/ウェスタンブロット法によって分析した。
(核酸タグの構築)
ランダムな配列を生成し、ソフトウェアPrimer Express(登録商標)(ABI社製)を用いて
アンプリコン配列を設計するために用いた。アンプリコン配列を、ヒトキノム、T7ファー
ジゲノム、及び他のアンプリコン配列に対してBLASTで検索し、BLAST検索における配列と
の最小の類似性に基づいて選択した。選択されたアンプリコン配列をABIに送り、適切な
プライマー及びqPCR蛍光プローブをABIによって調製した。GAL4又はNF-κB認識部位を加
えることによってアンプリコン配列をさらに修飾し、完全な核酸タグを作製した。オリゴ
ヌクレオチドを細菌性プラスミドにクローニングし、PCRを用いてタグを複製した。
(競合結合アッセイ)
競合結合アッセイのための親和性樹脂は、以下の通りに調製した。Dynabeads(商標)M28
0(ストレプトアビジン(Dynal社製#602.10))を振盪及び撹拌によって再懸濁し、ビーズは1
0mg/mLで懸濁し、アッセイウェルにつき0.4mgを用いた。ビーズを3回洗浄し、1×PBS/0.0
5%ツイーン20(PBST)で10mg/mLに再懸濁し、2mL試験管に分配した。ビオチン化参照リガン
ドを調製する技術は公知であり、例えば、米国特許出願公開第20050153371号を参照のこ
と。ビオチン化参照部分を、0.025〜0.25:1のモル比(参照リガンド:ビオチン結合能力)で
試験管に加え、混合し、室温において30分間ローテータ上でインキュベートした。次にビ
ーズを過剰のビオチン(ビオチン対ビオチン結合能力のモル比2:1)でブロックし、ブロッ
ク緩衝液(SeaBlock(Pierce社製)、1% BSA、0.05%ツイーン20、1mM DTT)で洗浄して未結合
のリガンドを除去し、非特異的タンパク質結合を低減させた。
ポリスチレンプレートを、ウェルにつき200μLのSBTB(Pierce社製#37527 Seablock/1%
BSA、0.05%ツイーン20)でブロックした。前の工程からのビーズ溶液を、SBTBを除去せず
に、ウェルにつき12.5μLのビーズの割合でポリスチレンプレートに加えた。プレートを7
00rpmで簡単に振盪し(洗浄1)、次に、ペレット化、デカント及びSBTBとの振盪による追加
の洗浄(洗浄2)を実施し、その後3回目の洗浄を行い、そこではビーズをSBTBで少なくとも
15分間振盪した。
試験化合物はDMSOで1000×ストックとして調製し、水性環境(最終1%DMSO)に速やかに希
釈した。DMSO(終濃度1%)を、試験化合物が含まれない対照アッセイに加えた。
タンパク質抽出物を氷中で徐々に解凍し、1×結合緩衝液(20% SeaBlock、0.17×PBS、0
.05%ツイーン20、6mM DTT)で希釈した。結合反応は、10nMの核酸タグ(GAL4又はNF-κBに
結合した標的配列、及び定量PCR検出のための1単位の増幅(アンプリコン)を含むキメラDN
Aオリゴヌクレオチド)を含有する1×結合緩衝液中で、希釈したタンパク質抽出物及び2nM
〜30μMの最終濃度を有するDMSO中の試験分子の1μLを混合することにより、ビーズ含有
ポリスチレンプレート内で組み立てた。アッセイプレートを1時間振盪しながら室温でイ
ンキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%ツイーン20、1mM DTT)で4回
洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。最終洗浄の後、ビーズを溶離緩衝液(1×PBS
、0.05%ツイーン20及び2μM非ビオチン化親和性リガンド)で再懸濁し、30分間振盪しなが
ら室温でインキュベートした。溶出液中のキナーゼの量は、定量PCRで測定した。或いは
、結合反応は核酸タグの不在下で実施することができ、核酸タグは、未結合のタンパク質
を除去する洗浄工程の後に加えてもよい。
(p38 MAPキナーゼによる競合結合アッセイ)
競合結合アッセイは、HEK293細胞で発現するp38タンパク質、及びp38のATP結合部位に
結合する固定化リガンドを特徴とする。p38タンパク質を生成するために、先に述べたよ
うに標準のクローニングプロトコルを用いて、p38αのコード領域をGAL4又はNF-κBのDNA
結合ドメインとインフレームで融合し、発現ベクターにクローニングした。高い親和性で
p38のATP結合部位に結合することが知られている化合物であるSB202190を、固定化参照リ
ガンドとして用いた。ビオチン化した柔軟なリンカーを、p38結合部位を妨害しない位置
で、SB202190に結合させた。次に、そのビオチン化リンカーを介して、SB202190をストレ
プトアビジンでコーティングした磁性ビーズ上に固定化した。
3つの化合物を、p38と固定化SB202190:SB201290(修飾されず、溶液中では遊離する)、B
IRB-796及びVX-745との間の相互作用と競合するそれらの能力について試験した。相互作
用の親和性を決定するために、固体支持体に結合したp38の量を、試験化合物の濃度の関
数として定量化した。3つの化合物のKdを、図2及び3に示す。
(BRAFキナーゼによる競合結合アッセイ)
BRAFキナーゼタンパク質を生成するために、BRAFのコード領域をGAL4又はNF-κBのDNA
結合ドメイン(表1を参照)とインフレームで融合し、前記発現ベクターにクローニングし
、次にHEK293細胞で発現させた。高い親和性でBRAFのATP結合部位に結合することが知ら
れている化合物であるPD-173955を、固定化参照リガンドとして用いた。この連結した化
合物は、SB202190ベイトを作製するために用いたものと同じ戦略を用いて生成した。
4つの商標登録試験化合物を、BRAFと固定化参照リガンドとの間の相互作用と競合する
それらの能力について試験した。4つの化合物の1つは、他の3つと化学的に関連するが参
照リガンドに結合しないので、陰性対照として用いた。相互作用の親和性を決定するため
に、固体支持体に結合したBRAFの量を、試験化合物の濃度の関数として定量化した。4つ
の化合物のKdを、図4及び5に示す。
(キナーゼのパネルによる競合結合アッセイ)
下の表2は、キナーゼのパネルに対して実施した競合結合アッセイのシグナル対バック
グラウンド比を示し、各キナーゼは、NFκBのDNA結合ドメインとの融合タンパク質として
調製した。上記のプロトコルを用い、いくつかの既知のATP競合キナーゼ阻害剤を含む溶
液中で、潜在的競合試験化合物の混合物の存在下又は不在下で、各キナーゼを、そのコグ
ネイトベイト(参照リガンド)を用いて試験した。30:1のシグナル対バックグラウンド比が
許容可能とみなされ、100:1の比が好ましい。
Figure 0006038759
Figure 0006038759
(多重化競合結合アッセイ)
競合結合アッセイは、以下の方法で多重化した:そのコグネイトDNAに対するNF-κBのDN
A結合ドメインの高親和性、及び4〜40時間のその長いタンパク質DNA複合体半減期に基づ
いて、NF-κBのDNA結合領域をキナーゼの融合パートナーとして選択した。競合結合アッ
セイには、ビオチン化参照リガンドベイトを0.0025〜0.25:1のモル比でビーズに加え、上
記方法で処理することによって、リガンドされたビーズを調製することが含まれた。タン
パク質抽出物の調製には、二段階希釈が含まれた。第一の希釈ステップでは、各タンパク
質抽出物ストックを、10μMの特異なキメラ核酸タグ及び200μg/mLのサケ精子DNAの存在
下で、室温において1×PBS/0.05%ツイーン20/0.1% BSA/10mM DTTで100倍に希釈した。第
二の希釈ステップは、1μMの「qPCRサイレント」デコイDNAの存在下で異なる希釈抽出物
を混合し、1×PBS/0.05%ツイーン20/0.1%BSA/10mM DTTでさらに100倍希釈し、これにより
最終希釈物は、各キナーゼ融合タンパク質のキメラ核酸タグの各々の0.1〜1nMを含有する
10,000倍希釈のストックを生じる、多重化ステップであった。強いアッセイシグナルを発
生する特定のキナーゼをより弱いアッセイシグナルを発生する他のキナーゼで多重化した
状況では、異なるキナーゼ抽出物を混合するステップで、弱いシグナルを発生するキナー
ゼと関連するタグが強いシグナルを発生するキナーゼへ交換される可能性を減少させるた
めに、強いシグナルを発生するキナーゼの第一の希釈ステップは、10nMよりも100nMの核
酸タグを含有した。その後の競合結合アッセイステップは、前記の方法で実施した。結合
量をqPCRによって決定する読取ステップでは、結合アッセイからの溶出液を異なる試料に
等分し、各試料は二重フォーマットで読み取った。或いは、試料は、三色読取りを用いる
三重フォーマットでもよい。
一例では、ビーズは、米国特許出願公開第2005015337号で記載される方法で、PEGリン
カーを介してビオチン化したスタウロスポリンでベイト化した。各々NF-κBのDNA結合ド
メインにインフレームで融合させた3つのキナーゼ、PRKCE、ROCK2及びZAP70を、クローニ
ングして、HEK293細胞で発現させた。各キナーゼ融合体のタンパク質抽出物は、10nMの核
酸タグを含有する緩衝液で先ず希釈したが、前の実験からZAP70融合タンパク質がPRKCE及
びROCK2融合タンパク質と比較してより強いシグナルを発生することが分かったので、ZAP
70融合タンパク質を含有する試料は100nMの核酸タグを含有する緩衝液で希釈した。希釈
した抽出物は、「qPCRサイレント」デコイDNAの存在下でさらに希釈し、次に、競合結合
アッセイのために試験化合物及びリガンド化ビーズと混合した。結合実験から得られたタ
ンパク質溶出液を2つの試料に等分し、各試料を、二色qPCR読取りを用いて分析した。
(活性及び不活性なキナーゼ高次構造を用いた競合結合アッセイ)
不活性形態のAbl1キナーゼは、Abl1融合タンパク質を発現するHEK293細胞を、150mM Na
Cl、25×無EDTA COMPLETE(Roche社製#11873 580 001)及び10mM DTTを有する1×M-PER緩衝
液(Pierce社製#78501)中で溶解することによって調製した。タンパク質抽出物をPCR試験
管へ移して、30℃で45分間サーモサイクラー内でインキュベートし、細胞抽出物中の内因
性ホスファターゼにAbl1タンパク質を脱リン酸化させ、それによって不活性(非リン酸化)
状態のタンパク質分画を増加させた。
活性形態のAbl1キナーゼは、最初に、細胞溶解/タンパク質抽出工程の直前に、Abl1で
トランスフェクトしたHEK293細胞を以下のホスファターゼ阻害剤中で2時間インキュベー
トすることで調製した:2mMオルトバナジン酸ナトリウム(Calbiochem社製#567540)又は1×
ホスファターゼ阻害剤カクテルセットII(Calbiochem社製#524625)。細胞を、150mM NaCl
、25×無EDTA COMPLETE(Roche社製#11873 580 001)、10mM DTT及び1×ホスファターゼ阻
害剤カクテルセットII(Calbiochem社製#524625)を含有する1×M-PER緩衝液(Pierce社製#7
8501)中で溶解した。
固定化ベイトとしてプルバラノールB結合ビーズを用いて、活性及び不活性の形態のAbl
1を上記の方法で実施した競合結合アッセイで用いた。キナーゼの活性及び不活性の形態
に対して試験した化合物の1つはVX-680であり、これは、Ablの活性形態に結合することが
できることが文献で公知である化合物である(Youngら(2006)の論文Cancer Res 66(2): 10
07-1014)。活性/不活性キナーゼ構造に対して試験するために選択された第二の化合物は
イマチニブ(STI571)であり、これは、Abl1の不活性構造に優先的に結合する阻害剤である
化合物である(Schindler, T.らの論文Science (2000) 289:1938-1942、Liuらの論文Natur
e Chemical Biology (2006) 2(7):358-364)。活性リン酸化形態及び不活性非リン酸化形
態のAblに対するVX-680及びイマチニブのKd値を、図6Aに示す。図6Aは、Ablに対するVX-6
80のKdが、リン酸化Ablキナーゼ及び非リン酸化Ablキナーゼの間で不変のままであること
を示す。このデータは、該化合物が不活性構造のAblに結合することができることの確認
を、初めて提供する。対照的に、図6Bは、イマチニブのKdがリン酸化形態と比較して非リ
ン酸化形態のAblでより低いことを示し、このことは、該化合物が不活性形態に優先的に
結合することを示す。
(非ATP競合的キナーゼ阻害剤を同定する競合結合アッセイ)
本明細書で記載される競合結合アッセイでベイトとして用いる参照リガンドは、一般に
ATP分子自体よりも大きい。したがって、これらの参照リガンドはATP結合部位よりも多く
結合し、それらは、基質結合部位及びドメイン間間隙などの正規のATP結合部位及び隣接
部位を含む活性部位に結合するとより正確に記載される。したがって、これらの参照リガ
ンドは、ATP結合部位の結合剤だけでなく、基質結合部位に結合するものを含む、ATP部位
に隣接して結合する結合剤も置換する能力を有する。
BMS-345541のIKKβへの結合の非ATP競合的性質を確認するように設計された一実験では
、前にIKKβの活性部位に結合すると同定された化合物をビオチン化して、参照ベイトと
して用いた。BMS-345541は、ADP/ATPと非相互排除的に部位に結合することが前に多重阻
害分析によって示され、したがって、非ATP競合的結合剤であると判断された(Burkeらの
論文J of Biol Chem (2003) 278(3):1450-1456)。IKKβキナーゼによる結合実験を既記載
の方法で実施したが、さらに、ATPの存在下で結合活性を測定するアッセイで、20mMのMgC
l2、及びIKKβに対するATPのKdの10倍と計算された濃度のATPを反応混合液に加えた。IKK
βキナーゼによる平行実験を、ATP競合対照として既知のATP競合分子、スタウロスポリン
を用いて実施した。競合結合実験の結果を、表3に示す。結果は、ATP競合結合剤スタウロ
スポリンはATPの存在下でKdの上方シフトを示すが、BMS-345541はATPの影響を受けないKd
値を示すことを示し、このことは、その分子が古典的な非ATP競合結合剤であることを確
認する。
PD184352のMEK1及びMEK2への結合の非ATP競合的性質を確認するように設計された第二
の実験では、MEK1及びMEK2キナーゼの活性部位に結合すると同定された化合物を、参照ベ
イトとして用いた。PD184352は、ATP結合部位と別であるが隣接した新規の結合ポケット
に結合することがX線結晶学によって前に示され、非ATP競合結合剤であると判断された(
例えば、Ohrenらの論文Nature Structural & Molecular Biology (2004) 11(12):1192-11
97を参照)。MEK 1キナーゼ結合実験を前記方法で実施したが、結合反応工程では、ATPの
存在下で結合活性を測定するアッセイのために、20mMのMgCl2、及びMEK1に対するATPのKd
の10倍と計算された濃度のATPを反応混合液に加えた。同様に、MEK2キナーゼ結合アッセ
イのための結合反応には、標準の結合アッセイ混合液に加えて、20mMのMgCl2、及びMEK2
に対するATPのKdの10倍と計算された濃度のATPが含まれた。ATP競合対照を提供するため
に、既知のATP競合的結合剤であるスタウロスポリンも、両方のMEKアッセイで試験した。
ATPの存在下及び不在下での競合結合アッセイの結果を、表4及び5に示す。結果は、ATP競
合的である化合物で予想されるように、MEK1/2に対するスタウロスポリンの見かけのKdの
顕著な増加と対照的に、ATPの存在下でのMEK1/2に対するPD184352の見かけのKdの顕著な
減少を示す。BMS-345541の場合がそうであったように、ATPが見かけのKdに影響を及ぼさ
ないというよりも、見かけのKdを減少させる影響を有する事実は、PD184352が、未結合の
MEKと比較してATP結合MEKに優先的に結合し、したがって、ATP協同的非ATP競合結合剤で
あることを示唆する。
Figure 0006038759
Figure 0006038759
Figure 0006038759
(hAGT融合タンパク質のクローニング)
ヒトO6-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ(hAGT)をコードする哺乳動物
の発現ベクターを、標準の分子クローニング手順を用いて構築した。クローニングベクタ
ー中の遺伝的エレメントには、5'末端から3'末端にかけて、CMVエンハンサー/プロモータ
ー、TEVプロテアーゼ認識配列、続いて完全長p38αキナーゼ、続いてHA11エピトープタグ
をコードする配列とインフレームで融合した、ヒトO6-アルキルグアニンDNAアルキルトラ
ンスフェラーゼをコードする配列が含まれた。
hAGT融合タンパク質は、HEK293細胞内においてインビトロで発現させた。
核酸タグは、O6-ベンジルグアニン-ポリエチレングリコールマレイミド(Covalys社製)
を、PCR増幅マーカーを含むDNA配列に連結することによって構築することができる。核酸
タグを付けた基質は、融合タンパク質に共有結合する核酸標識を移動させる、hAGT融合タ
ンパク質によって認識することができる。
本明細書で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が
参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されているかのように、本明細書で
参照により組み込まれている。

Claims (30)

  1. ATP結合部位を有する対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定する方法であって、該試験化合物が該対象とするタンパク質に対する非ATP競合結合剤であり、
    該方法が、(i)試験化合物の存在下及び不在下、並びに(ii)外来性ATPの存在下及び不在下;で、
    (a)該対象とするタンパク質に、ATP結合部位を含む該対象とするタンパク質上の部位、又はATP結合部位に近接若しくは隣接した部位で、結合する固定化参照リガンドを、(I)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(II)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させることであって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
    (b)該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;
    (c)未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
    (d)該核酸オリゴマーが該融合タンパク質に結合するかを検出することと;を含み、
    (A)試験化合物の不在及びATPの不在と比較した、試験化合物の存在下及びATPの不在下での該固定化参照リガンドに結合した融合タンパク質の量の減少は、該試験化合物が該対象とするタンパク質に結合することを示し、(B)試験化合物の存在及びATPの不在と比較した、試験化合物の存在下及びATPの存在下での該融合タンパク質に結合した核酸オリゴマーの量に影響がないことは、該試験化合物が該対象とするタンパク質に対する非ATP競合結合剤であることを示す、前記方法。
  2. 前記核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)前記核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列、を含み、該第一の核酸配列は該第二の核酸配列に対して異種性である、請求項1記載の方法。
  3. 前記融合タンパク質に結合する前記核酸オリゴマーをqPCR増幅することをさらに含む、請求項2記載の方法。
  4. 前記核酸オリゴマーが放射標識、蛍光標識又はビオチン化されている、請求項1記載の方法。
  5. 前記参照リガンドが多重ウェルプレートに固定化される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記対象とするタンパク質が活性又は不活性な高次構造のキナーゼである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記キナーゼがヒトキナーゼである、請求項6記載の方法。
  8. 前記キナーゼが非受容体チロシンキナーゼである、請求項6記載の方法。
  9. 前記キナーゼが受容体チロシンキナーゼである、請求項6記載の方法。
  10. 前記キナーゼがセリン-スレオニンキナーゼである、請求項6記載の方法。
  11. 前記核酸相互作用モチーフがDNA結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
  12. 前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメイン、croリプレッサーのDNA結合ドメイン、lacリプレッサーのDNA結合ドメイン、GAL4のDNA結合ドメイン、GCN4のDNA結合ドメイン、Lex-AのDNA結合ドメイン、Opaque-2のDNA結合ドメイン又はTGAIaのDNA結合ドメインである、請求項11記載の方法。
  13. 前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメインである、請求項11記載の方法。
  14. 前記融合タンパク質が、細菌、昆虫、哺乳動物又は植物の宿主細胞において、該融合タンパク質をコードする核酸の発現によって生成される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞である、請求項14記載の方法。
  16. ATP結合部位を有する対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定するためのキットであって、該試験化合物が、請求項1記載の方法による非ATP競合結合剤であり、
    (a) (a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質であって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なる、前記融合タンパク質;
    (b) 該対象とするタンパク質に、ATP結合部位を含む該対象とするタンパク質上の部位、又はATP結合部位に近接若しくは隣接した部位で、結合する参照リガンド、並びに
    (c) 該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマー
    を含む、前記キット。
  17. 前記核酸オリゴマーが、(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)前記核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列、を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である、請求項16記載のキット。
  18. 前記PCR増幅配列にハイブリダイズするPCRプライマー対をさらに含む、請求項17記載のキット。
  19. 前記核酸オリゴマーが放射標識、蛍光標識又はビオチン化されている、請求項16記載のキット。
  20. 前記参照リガンドが固体支持体に結合している、請求項16〜19のいずれか一項記載のキット。
  21. 前記対象とするタンパク質が活性又は不活性な高次構造のキナーゼである、請求項16〜20のいずれか一項記載のキット。
  22. 前記キナーゼがヒトキナーゼである、請求項21記載のキット。
  23. 前記キナーゼが非受容体チロシンキナーゼである、請求項21記載のキット。
  24. 前記キナーゼが受容体チロシンキナーゼである、請求項21記載のキット。
  25. 前記キナーゼがセリン-スレオニンキナーゼである、請求項21記載のキット。
  26. 前記核酸相互作用モチーフがDNA結合ドメインである、請求項16〜25のいずれか一項記載のキット。
  27. 前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメイン、croリプレッサーのDNA結合ドメイン、lacリプレッサーのDNA結合ドメイン、GAL4のDNA結合ドメイン、GCN4のDNA結合ドメイン、Lex-AのDNA結合ドメイン、Opaque-2のDNA結合ドメイン又はTGAIaのDNA結合ドメインである、請求項26記載のキット。
  28. 前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメインである、請求項26記載のキット。
  29. 前記融合タンパク質が、細菌、昆虫、哺乳動物又は植物の宿主細胞において、該融合タンパク質をコードする核酸の発現によって生成される、請求項16〜28のいずれか一項記載のキット。
  30. 前記宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞である、請求項29記載のキット。
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