JP2012524907A - 検出可能なタンパク質を用いた細胞分析 - Google Patents

Abstract

ここに開示するのは、例えば細胞プロセスに伴うタンパク質の過程を測定するための有用な分析である。いくつかの実施形態において、タンパク質の活性は、核酸タグを用いて、特に核酸タグの存在を検出することによって評価した。該分析は、例えばタンパク質活性のモジュレーターである、阻害剤、作用薬、拮抗剤等としての効果を研究するために使用することができる。

Description

１． 関連出願
本願は、２００９年４月２４日に出願された米国仮出願６１／１７２，６８０号の継続出願に基づくものであり、その内容の全てをここに参照して取り込む。

２． 技術分野
ここに開示する内容は、様々な細胞プロセスに関与するタンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニングおよび同定を含む、タンパク質修飾の検出の分野に関する。

３． 概要
本出願は、分析に有用な、例えば細胞プロセスに関与するタンパク質の活性の測定に関する。いくつかの実施形態において、タンパク質の活性は核酸タグを用いて、特に核酸タグの存在を検出することによって評価される。前記分析は、例えば被験化合物のモジュレーター、例えばタンパク質活性の阻害剤、作用薬および拮抗剤としての効果を調査するために使用できる。

したがって、１つの態様において、ここに開示するのは、目的の細胞プロセスによって修飾されたタンパク質の検出法であって、（ａ）（ｉ）目的の細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体と（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列とを含む核酸オリゴマーと、標的タンパク質と、核酸相互作用モチーフを包含する検出可能なタンパク質を接触させる工程；および（ｂ）抗体によっても結合する、検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーの存在を検出する工程を具えていて；工程（ｂ）における結合核酸オリゴマーの存在は、目的の細胞プロセスによるタンパク質の修飾の存在を示す。いくつかの実施形態では、検出可能なタンパク質を工程（ａ）において核酸オリゴマーと接触させる前に、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる。いくつかの実施形態では、検出可能なタンパク質を工程（ａ）において核酸オリゴマーと接触させた後、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる。いくつかの実施形態では、検出可能なタンパク質は、抗体および工程（ａ）の核酸オリゴマーに同時に接触させる。

いくつかの実施形態では、細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される。ある実施形態において、細胞プロセスはリン酸化である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はキナーゼ基質である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上の残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である。

いくつかの実施形態において、核酸相互作用モチーフはＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである。ある実施形態において、核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、オリゴマーは、約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。

他の態様において、本明細書に開示するのは、細胞プロセスを調節する被験化合物を同定する方法であって、細胞プロセスは標的タンパク質の修飾であり、前記方法が、（ａ）検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を被験化合物と接触させる工程であり、検出可能なタンパク質は、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、工程；（ｂ）（ｉ）細胞プロセスの結果として修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体と；（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとを、検出可能なタンパク質に接触させる工程；および（ｃ）抗体によっても結合する、検出可能なタンパク質に結合核酸オリゴマーを定量する工程とを具え、；前記被験化合物の不存在下で検出した結合核酸オリゴマーの量と比較した、前記被験化合物存在下での工程（ｃ）における結合核酸オリゴマー量の増加または減少により、被験化合物が細胞プロセスを調節することが示される。

いくつかの実施形態において、検出工程（ｃ）における、前記被験化合物の存在下での結合核酸オリゴマー量の増加（前記被験化合物の不存在下での値との比較で）は、被験化合物が細胞プロセスに悪影響を及ぼしたことを示す。いくつかの実施形態において、検出工程（ｃ）における前記被験化合物の存在下での結合核酸オリゴマー量の減少（前記被験化合物の不存在下での値との比較で）は、被験化合物が細胞プロセスを阻害することを示す。

いくつかの実施形態において、工程（ａ）は被験化合物と検出可能なタンパク質を含む細胞との接触を具える。いくつかの実施形態において、細胞は検出可能なタンパク質を一時的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は検出可能なタンパク質を安定的に発現する。

いくつかの実施形態において、細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される。ある実施形態において、細胞プロセスはリン酸化である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質はキナーゼ基質である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である。

いくつかの実施形態において、核酸相互作用モチーフは、ＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである。ある実施形態において、核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、オリゴマーは、約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＭｅｋ１であり、抗体はリン酸化したＭｅｋ１に特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルをさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいては、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は、被験化合物の代わりにＢｒａｆ阻害剤と接触させる。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、Ｂｒａｆ阻害剤との接触によって、阻害剤の不存在下で検出される結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＢｒａｆ阻害剤がＢｒａｆキナーゼ活性を阻害すること、例えばＭＥＫ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態では、Ｂｒａｆ阻害剤は、ＢＡＹ−４３−９００６、ＰＬＸ−４７２０、Ｃｈｉｒ−２６５から選択される。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＡｋｔ１であり、抗体はリン酸化したＡｋｔに結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＳｅｒ４７３またはＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＳｅｒ４７３でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１であり、抗体はリン酸化したＦＲＡＰ１またはリン酸化したＰＤＰＫ１にそれぞれ特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルをさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいて、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は、被験化合物の代わりに、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤と接触させた。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤との接触によって、阻害剤の不存在下において検出された結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＰＩＫ３ＣＡ阻害剤がＰＩＫ３ＣＡキナーゼ活性を阻害すること、例えばそれぞれＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤は、ＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４、ワートマニンおよびＰＩＫ−９３から選択される。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質は、ＡＫＴ１であり、抗体はリン酸化したＡＫＴ１に特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルをさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいて、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は、被験化合物の代わりに、ＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤と接触させた。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、ＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤との接触によって、阻害剤の不存在下において検出された結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤がＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害すること、例えばＡＫＴ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態において、ＰＤＰＫ１阻害剤はＢＸ−７９５である。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質は、ＦＯＸＯ１であり、抗体はリン酸化したＦＯＸＯ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＴｈｒ２４でリン酸化したＦＯＸＯ１に結合する。

いくつかの実施形態において、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具えることによって、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は被験化合物の代わりにＡＫＴ１阻害剤と接触させた。いくつかの実施形態において、Ａｋｔ１阻害剤はＧＳＫ−６９０６９３である。

いくつかの実施形態において、ここに開示する方法は、少なくとも２つの異なる濃度の被験化合物と、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を接触させ、被験化合物のＩＣ_５０を算出する工程を具える。

いくつかの実施形態において、核酸オリゴマーは、（ａ）ＰＣＲ増幅配列である第１の核酸配列および（ｂ）核酸相互作用モチーフに結合する第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列と第２の核酸配列とは非相同性である。

いくつかの実施形態において、ここに開示する方法は、検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーをｑＰＣＲで増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸オリゴマーは放射性標識、蛍光標識またはビオチン化されたものである。

ここに開示する方法のいくつかの実施形態において、抗体は固体支持体に固定される。いくつかの実施形態において、抗体は、マルチウェルプレートに固定される。

さらに他の態様において、ここに開示するのは：細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質を含む検出可能なタンパク質と、核酸相互作用モチーフを具えた細胞と；核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとを具えたキットである。いくつかの実施形態において、キットはさらに目的の細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、細胞プロセスはリン酸化であり、修飾された標的タンパク質はリン酸化された標的タンパク質である。

４． 図面の簡単な説明
標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質、細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体および核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを用いた細胞分析を示す模式図である。 ＰＩＫ３ＣＡシグナル経路の図である。 化合物の用量反応曲線を開示するものであり、ｘ軸はｎＭで化合物の濃度を示し、ｙ軸はプローブ等価単位でｑＰＣＲによって生じるシグナルを示す。リン酸化Ｍｅｋ１結合分析から得られるＢＡＹ−４３−９００６、ＰＬＸ−４７２０、Ｃｈｉｒ−２６５およびＣＩ−１０４０に関する用量反応曲線の図である。 化合物の用量反応曲線を開示するものであり、ｘ軸はｎＭで化合物の濃度を示し、ｙ軸はプローブ等価単位でｑＰＣＲによって生じるシグナルを示す。リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）結合分析およびリン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）結合分析から得られたＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４、ＢＸ−７９５、ワートマニンおよびＰＩＫ９３の用量反応曲線の図である。 化合物の用量反応曲線を開示するものであり、ｘ軸はｎＭで化合物の濃度を示し、ｙ軸はプローブ等価単位でｑＰＣＲによって生じるシグナルを示す。リン酸化Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）分析におけるＢＸ−７９５、ＴＧ−１００−１１５、ラジシコールおよびトリシリビンの用量反応曲線の図である。 化合物の用量反応曲線を開示するものであり、ｘ軸はｎＭで化合物の濃度を示し、ｙ軸はプローブ等価単位でｑＰＣＲによって生じるシグナルを示す。リン酸化Ａｋｔ１（Ｔｈｒ３０８）分析におけるラジシコールおよびトリシリビンの用量反応曲線の図である。 化合物の用量反応曲線を開示するものであり、ｘ軸はｎＭで化合物の濃度を示し、ｙ軸はプローブ等価単位でｑＰＣＲによって生じるシグナルを示す。Ａｋｔ１リン酸化ＦＯＸＯ（Ｔ２４）分析におけるＧＳＫ−６９０６９３、ＰＩ１０３およびＢＸ−７９５の用量反応曲線の図である。

５． 実施形態の詳細な説明
５．１ 用語
本明細書で使用される「標的タンパク質」の用語は、細胞プロセス、例えば本明細書に記載される過程によって修飾された、目的のあらゆるタンパク質とする。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、酵素または触媒活性のあるタンパク質によって修飾される。

本明細書で使用される「細胞プロセス」および「目的の細胞プロセス」の用語は、相互に入れ替えて使用することができ、細胞タンパク質の修飾を生じる細胞内に起こるあらゆる事象を示す。いくつかの実施形態において、細胞プロセスは、生存細胞の、例えば取り込み、輸送、受容体結合、代謝、融合、生化学反応、細胞分離、細胞遊走、細胞成長、壊死およびアポトーシスの間に生じる。他の実施形態において、細胞プロセスは、腫瘍形成、形質転換および／または転移の間に生じる。いくつかの実施形態において、細胞プロセスは触媒活性または酵素活性を有するタンパク質による、タンパク質、例えば標的タンパク質の修飾を起こす。他の実施形態において、細胞プロセスは、酵素または非酵素のタンパク質の修飾を起こす。ある実施形態において、酵素または非酵素タンパク質の修飾は、共有結合的修飾である。他の実施形態において、細胞プロセスは、非共有結合的な酵素のタンパク修飾を生じ、この修飾としては、タンパク質分解、ラセミ化または異性化が挙げられるがこれらに制限されるものではない。他の実施形態において、細胞プロセスは、非共有結合修飾、例えばタンパク質のホモまたはヘテロ二量化、または他の結合事象（リガンド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、アロステリック調節因子、共同因子、補酵素および第２のメッセンジャー）を生じさせる。細胞プロセスとしては、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明で使用される細胞プロセスによって修飾されたタンパク質は、細胞プロセスの結果としてアシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化の修飾を経たタンパク質であるが、これらに制限されるものではない。

本明細書で使用される「抗体」および「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」の用語は、相互に入れ替えて使用することができる。本発明で使用される「抗体」は、免疫グロブリン分子のあらゆるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、あらゆるクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４； ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）もしくはあらゆるサブクラス（例えばＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）またはそのあらゆる抗原認識（もしくは抗原結合）断片とすることができる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体とすることができ、マウス、ラット、ラビット、ウマもしくはヒトを含むあらゆる種を起源とすることができ、また、キメラ抗体とすることもできる。例えば、Walkerら., Molec. Immunol. 1989; 26: 403-411; Morrision et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 1984; 81 : 6851; Neubergerら, Nature 1984; 312: 604を参照のこと。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号（Reading）または米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyその他）に開示される方法によって生成された組み換え型モノクローナル抗体としてもよい。抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号（Segelら）に開示された方法にしたがって生成された、特異的な抗体によって化学的に構成することもできる。本発明の抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、組み換えにより生成された抗体、多種特異的な抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、短鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性等を含む）、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｒｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体およびエピトープ結合断片のあらゆる前記のものが挙げられるが、これらに制限されるものではない。特に、本発明の抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部位、（例えば抗原結合ドメイン、または例えば目的の修飾されたタンパク質に免疫特異的に結合する抗原結合部位）が挙げられる。ある実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体、例えばモノクローナルＩｇＧ抗体である。

本明細書で使用される「抗リン酸抗体」の用語は、キナーゼ抗原またはエピトープ（例えば、リン酸化チロシン、リン酸化スレオニまたはリン酸化セリンを含むエピトープ）のような、リン酸化形態のタンパク質抗原またはエピトープには特異的に結合し、非リン酸化形態のタンパク質またはエピトープには特異的に結合しない、抗体または抗体断片を意味する。抗原に特異的に結合する抗体または断片は、目的の抗原と交差反応を起こしてもよい。ある実施形態において、抗リン酸抗体は、キナーゼ抗原に特異的に結合する抗体または抗体断片であり、他の抗原と交差反応しない。キナーゼ抗原に特異的に結合する抗体または抗体断片は、例えばイムノアッセイ、ビアコア法（BIAcore）または当業者に既知の他の技術によって同定することができる。抗体または抗体断片は、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡのような実験技術において、あらゆる交差反応を起こし得る抗原と比較して、それがより高い親和性で抗原に結合する場合、抗原に特異的に結合するものといえる。一般的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より一般的には、バックグラウンドの１０倍を超える。ある実施形態において、抗リン酸抗体は、タンパク質または酵素の１以上のリン酸化されたチロシン残基（キナーゼの１以上のリン酸化されたチロシン残基を含む）に特異的に結合する抗リン酸化チロシン抗体（また「抗ｐＴｙｒ」または「抗ｐＹ」として表わされる）である。１つの実施形態において、抗リン酸抗体は、キナーゼの１以上のリン酸化されたセリン残基を含むタンパク質または酵素の１以上のリン酸化されたセリン残基（キナーゼの１以上のリン酸化されたセリン残基を含む）に特異的に結合する、抗リン酸化セリン抗体（また「抗ｐＳｅｒ」または「抗ｐＳ」）である。ある実施形態において、抗リン酸抗体は、タンパク質または酵素の１以上のリン酸化されたスレオニン残基（キナーゼの１以上のリン酸化されたスレオニン残基を含む）に特異的に結合する抗リン酸化スレオニン抗体（また「抗ｐＴｈｒ」または「抗ｐＴ」）である。ある実施形態において、抗リン酸抗体は、キナーゼの１以上の特異的位置における、１以上のリン酸化されたチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）残基に免疫特異的に結合する。他のある実施形態において、抗リン酸抗体は、タンパク質の１つのリン酸化されたアミノ酸残基のみに特異的に結合する。

「化合物」または「被験化合物」は、１以上の有機化合物、無機化合物、合成核酸、天然核酸、合成ポリペプチド、天然ポリペプチド、ペプチド断片および／またはタンパク質を意味する。本明細書で使用される「化合物」または「被験化合物」の用語は、実験に使用される低分子、ＦＤＡ許可された治療用低分子、抗体治療及び他の治療薬のために開発された抗体も含む。

５．２ 細胞プロセスによって調節されるタンパク質の同定方法
本明細書において開示する以下の実施形態は、例示的なものであり、これらに限定されるものではない。ここに開示される方法は、応用の範囲を有する。本明細書に開示する組成物および方法は、インビトロおよび／またはインビボとすることができる。

１つの態様において、ここに開示する方法は、目的の細胞プロセスにより修飾された標的タンパクを検出する、以下の工程を含む方法である；（ａ）（ｉ）目的の細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体と（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとを、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質に接触させる工程；および（ｂ）抗体にも結合する、検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーの存在を検出する工程。工程（ｂ）における核酸オリゴマーの存在は、目的の細胞プロセスによる標的タンパク質の修飾の存在を示す。いくつかの実施形態において、工程（ａ）における検出可能なタンパク質と核酸オリゴマーとの接触に前に、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる。いくつかの実施形態において、工程（ａ）における検出可能なタンパク質と核酸オリゴマーとの接触の後に、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる。いくつかの実施形態において、検出可能なタンパク質は、同時に抗体および工程（ａ）における核酸オリゴマーと接触させる。

いくつかの実施形態において、細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される。ある実施形態において、細胞プロセスはリン酸化である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、キナーゼ基質である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上の残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である。

いくつかの実施形態において、核酸相互作用モチーフは、ＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである。ある実施形態において、核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、オリゴマーは約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。

他の態様において、本明細書に開示する方法は、細胞プロセスを調節する被験化合物を同定する方法であって、細胞プロセスは標的タンパク質の修飾であり、該方法は以下の工程を具える；（ａ）被験化合物と検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物とを接触させる工程であり、検出可能なタンパク質は、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、工程；（ｂ）（ｉ）細胞プロセスにより修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとに、検出可能なタンパク質を接触させる工程；ならびに（ｃ）抗体にも結合する、検出可能なタンパク質に結合核酸オリゴマーを定量する工程。前記被験化合物の定量工程（ｃ）における結合核酸オリゴマーの量の増加または減少は、前記被験化合物の不存在下における結合核酸オリゴマーの量に対して、被験化合物が細胞プロセスを調節することを示す。

いくつかの実施形態において、工程（ｃ）における、前記被験化合物の不存在下での結合核酸オリゴマーの量と比較した、前記被験化合物の存在下の結合核酸オリゴマー量の上昇は、被験化合物が細胞プロセスに悪影響を及ぼしたことを示す。いくつかの実施形態において、工程（ｃ）における、前記被験化合物の不存在下での結合核酸オリゴマーの量と比較した、前記被験化合物の存在下の結合核酸オリゴマーの量の減少は、被験化合物が細胞過程を阻害することを示す。

いくつかの実施形態において、工程（ａ）は検出可能なタンパク質を含む細胞を接触させることを具える。いくつかの実施形態において、細胞は検出可能なタンパク質を一時的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は検出可能なタンパク質を安定的に発現する。

いくつかの実施形態において、細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される。ある実施形態において、細胞プロセスはリン酸化である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、キナーゼ基質である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である。いくつかの実施形態において、修飾された標的タンパク質は、１つ以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である。

いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である。

いくつかの実施形態において、核酸相互作用モチーフはＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである。ある実施形態において、核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、オリゴマーは約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＭｅｋ１であり、抗体はリン酸化したＭｅｋ１に特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルをさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいては、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物に、被験化合物の代わりに、Ｂｒａｆ阻害剤と接触させる。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、Ｂｒａｆ阻害剤との接触によって、阻害剤の不存在下において検出される結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＢｒａｆ阻害剤がＢｒａｆキナーゼ活性を阻害すること、例えばＭＥＫ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態において、Ｂｒａｆ阻害剤は、ＢＡＹ−４３−９００６、ＰＬＸ−４７２０、Ｃｈｉｒ−２６５から選択される。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質は、Ａｋｔ１であり、抗体はリン酸化したＡｋｔに結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＳｅｒ４７３またはＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＳｅｒ４７３でリン酸化したＡｋｔ１に結合する。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１であり、抗体はリン酸化したＦＲＡＰ１またはリン酸化したＰＤＰＫ１にそれぞれ特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいては、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は、被験化合物の代わりに、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤と接触させる。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤との接触によって、阻害剤の不存在下において検出される結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＰＩＫ３ＣＡ阻害剤がＰＩＫ３ＣＡキナーゼ活性を阻害すること、例えばそれぞれＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤は、ＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４、ワートマニンおよびＰＩＫ−９３から選択される。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＡＫＴ１であり、抗体はリン酸化したＡＫＴ１に特異的に結合して、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具える。陽性コントロールサンプルにおいては、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物は、被験化合物の代わりに、ＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤と接触させる。これらの実施形態では、工程（ｃ）において、ＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤との接触により、阻害剤の不存在下において検出された結合核酸オリゴマーの量に対して、検出した結合核酸オリゴマーの量が減少することが好ましく、これによりＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤がＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害すること、例えばＡＫＴ１のリン酸化を阻害することを示す。いくつかの実施形態において、ＰＤＰＫ１阻害剤はＢＸ−７９５である。

いくつかの実施形態において、キナーゼ基質はＦＯＸＯ１であり、抗体はリン酸化したＦＯＸＯ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はＴｈｒ２４でリン酸化したＦＯＸＯ１に結合する。

いくつかの実施形態において、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルをさらに具え、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を被験化合物の代わりにＡＫＴ１阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、Ａｋｔ１阻害剤はＧＳＫ−６９０６９３である。

いくつかの実施形態において、核酸オリゴマーは、（ａ）ＰＣＲ増幅配列である第１の核酸配列および（ｂ）核酸相互作用モチーフに結合する第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列と第２の核酸配列とは非相同性配列である。

いくつかの実施形態において、方法は、被験化合物が、修飾した形態の標的タンパク質に特異的に結合する抗体と、標的タンパク質の結合において競合するか否かを決定するため、コントロール試験を実施する工程をさらに具える。好適な実施形態において、本発明の方法は、標的タンパク質の修飾された形態と特異的に結合する抗体と標的タンパク質の結合において競合しない被験化合物を同定するために使用する。

いくつかの実施形態において、検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーの定量工程は、検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーをｑＰＣＲ増幅する工程を具える。いくつかの実施形態において、核酸オリゴマーは放射性標識、蛍光標識またはビオチン化されたものである。

１つの実施形態において、標的タンパク質は、細胞内で起こる細胞プロセスによって修飾される。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよび標的タンパク質を含む検出可能なタンパク質は、細胞溶解物から取得する。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよび標的タンパク質を含む検出可能なタンパク質を、化学的に合成する。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよび標的タンパク質を含む検出可能なタンパク質は、無細胞系で修飾される。

他の態様において、本明細書に開示するのは、酵素活性を調節する被験化合物を同定する方法であって、該酵素活性は標的タンパク質の修飾であり、該方法は以下の工程を具える；（ａ）被験化合物と検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物とを接触させる工程であり、検出可能なタンパク質は標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、工程；（ｂ）（ｉ）酵素活性により修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとに、検出可能なタンパク質を接触させる工程；ならびに（ｃ）抗体にも結合する、検出可能なタンパク質に結合核酸オリゴマーを定量検出する工程。工程（ｃ）において、前記被験化合物の不存在下で検出した結合核酸オリゴマーの量と比較した、結合核酸オリゴマーの量の増加または減少は、被験化合物が細胞過程を調節することを示す。

他の態様において、本明細書に開示するのは、酵素活性を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を具える；（ａ）被験化合物と検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物とを接触させる工程であり、検出可能なタンパク質は、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、工程；（ｂ）（ｉ）酵素活性により修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーとに、検出可能なタンパク質を接触させる工程；ならびに（ｃ）抗体にも結合する、検出可能なタンパク質に結合核酸オリゴマーを定量する工程。工程（ｃ）において、前記被験化合物の不存在下で検出した核酸オリゴマーの量と比較した、結合核酸オリゴマー量の減少は、被験化合物が酵素活性を阻害することを示す。

いくつかの実施形態において、酵素活性は、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される。ある実施形態において、酵素活性はキナーゼ活性である。ある実施形態において、細胞プロセスはリン酸化である。ある実施形態において、酵素活性はホスファターゼ活性である。他の実施形態において、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性である。他の実施形態において、酵素活性はアセチルトランスフェラーゼの活性である。

また他の態様において、本明細書に開示するのは、酵素に対する化合物のＩＣ_５０を測定する方法であって、（ａ）化合物の不存在下における少なくとも１つのサンプル、および化合物量を増加させた条件での複数のサンプルを調製する工程であり、それぞれのサンプルは検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物に由来するものであり、検出可能なタンパク質は、核酸相互作用モチーフおよび酵素基質を含む、工程；（ｂ）細胞プロセスによって修飾された酵素基質に結合する抗体と、検出可能なタンパク質とを接触させる工程；（ｃ）抗体結合した検出可能なタンパク質から、結合していない検出可能なタンパク質と結合していない抗体とを分離する工程；（ｄ）抗体結合した検出可能なタンパク質と核酸相互作用モチーフに結合核酸オリゴマーとを接触させる工程；および（ｅ）工程（ａ）において調製したそれぞれのサンプルについて結合核酸オリゴマーを定量する工程を具える。検出された結合核酸オリゴマー量が、化合物の不存在下で調製されたサンプルにおいて検出された結合核酸オリゴマーの量の半分となるときの化合物の濃度が、酵素に対する化合物のＩＣ_５０である。

ここに記載したあらゆる方法は、単連式または多連式のいずれかで行われた。１つの例示的な多連式において、被験化合物、胞プロセスに関与する関連する複数のタンパク質に対する調節的な特性に関して、それぞれ目的の伴う関連タンパク質のパネルから目的の複数のタンパク質に対して同時にスクリーニングし、試験した。複数のタンパク質を同時または順番に分析する場合、それぞれ目的のタンパク質によって調節されたタンパク質に固有の核酸オリゴマーを、目的のそれぞれのタンパク質活性を区別するため、使用することができる。

５．２．１ 検出可能なタンパク質
ある実施形態において、目的のタンパク質は、標的タンパク質と異種核酸相互作用モチーフの間のキメラ融合である。このようなキメラ融合において、それぞれ半分のキメラを示す少なくとも２つの遺伝子配列は、イン・フレームで融合することができ、適切なベクター中にクローニングして、選択した宿主細胞中に発現させてもよい。もしくは、標的タンパク質は、核酸相互作用モチーフと合成的に結合させてもよい（例えばポリペプチドリンカーを使用して）。ある実施形態において、標的タンパク質は、核酸相互作用モチーフ（例えばＤＮＡ結合タンパク質）のアミノ末端である。他の実施形態において、標的タンパク質は、核酸相互作用モチーフ（例えばＤＮＡ結合タンパク質）のカルボキシ末端である。結合は、直接的であっても、間接的であってもよい。ある実施形態において、標的タンパク質および／または核酸相互作用モチーフ（例えばＤＮＡ結合タンパク質）は、各野生型タンパク質の活性を保持している。ある実施形態において、核酸相互作用モチーフおよび標的タンパク質は、同じ生命体、例えばヒトから由来するものである。

５．２．１．１ 標的タンパク質
本明細書における「標的タンパク質」の用語は、ここに記載される細胞プロセスによって修飾され得る、目的のあらゆるタンパク質を示す。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、酵素または触媒活性を有するタンパク質によって修飾される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、キナーゼ、トランスフェラーゼ、酸化還元酵素、ヒドロラーゼ、リガーゼ、イソメラーゼまたはリアーゼの基質である。ある実施形態において、標的タンパク質は、ヒトのポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、切断、官能基の付加もしくは除去、または異性化を経ることによって修飾できる。ある実施形態において、標的タンパク質は、アシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、アミドトランスフェラーゼまたはサルファトランスフェラーゼ等の活性を有するトランスフェラーゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である。他の実施形態において、標的タンパク質は、ヒドロラーゼ、ペプダーゼまたはホスファターゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、キナーゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、脂質キナーゼ、例えばＰ１３Ｋ族（例えばｍＴＯＲ）の脂質キナーゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、プロテインキナーゼの基質である（例えばＭａｎｎｉｎｇ （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８： １９１２を参照のこと）。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、チロシンキナーゼまたはセリン／スレオニンキナーゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ヒトの非受容体チロシンキナーゼ、例えばＡＢＬ、ＡＣＫ、ＣＳＫ、ＭＡＴＫ、ＦＡＫ、ＰＹＫ２、ＦＥＳ、ＦＲＫ、ＪＡＫ、ＳＲＣ−Ａ、ＳＲＣ−Ｂ、ＴＥＣおよび／またはＳＹＫ族の一員である非受容体チロシンキナーゼの基質である。他の実施形態において、標的タンパク質は、ヒトの受容体チロシンキナーゼ、例えばＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ、ＦＧＦＲ、ＩＮＳＲ、ＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ、ＲＯＳ、ＲＹＫ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＡＡＴＹＫおよび／またはＳｕＲＴＫ １０６族の一員である受容体チロシンキナーゼの基質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＲＡＰ１、ＰＤＰＫ１、ＡＫＴ１、ＢＲａｆまたはＭＥＫ１の基質である。ある実施形態において、標的タンパク質は、ヒストン（例えばヒストンＨ３）である。ある実施形態において、標的タンパク質は、プロアポトーシスタンパク質（例えばＢＡＤ）である。ある実施形態において、標的タンパク質は、転写因子（例えばＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ６）である。ある実施形態において、標的タンパク質は、サイクリン（例えばサイクリンＢ１）である。ある実施形態において、標的タンパク質は、受容体（例えばアンドロゲン受容体）である。

ある実施形態において、標的タンパク質は、自己リン酸化によって調節される酵素である。ある実施形態において、標的タンパク質は、自己リン酸化によって調節されるキナーゼである。自己リン酸化キナーゼの例としては、ＣＳＦ１Ｒ、Ｋｉｔ、Ａｘｌ、ＥＧＦＲ、Ｆｌｔ３、ＡｕｒｏｒａＡ、Ｂｒｋ、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｆａｋ、ＳｒｃおよびＴｎｋ２が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

ある実施形態において、標的タンパク質は、基質として修飾され得るが、下流の活性に影響を及ぼさない、触媒不活性の酵素である。ある実施形態において、標的タンパク質は、リン酸化されるが、キナーゼドメインの触媒残基にキナーゼを不活性化するような突然変異を有するキナーゼである。

ある実施形態において、検出可能なタンパク質をコード化する核酸をプラズミド発現ベクター中にクローニングして、細胞株を一時的に形質転換し、検出可能なタンパク質を一時的に発現させる。ある実施形態において、検出可能なタンパク質をコード化する核酸をプラズミド発現ベクター中にクローニングして、細胞株を安定的に形質転換することで、検出可能なタンパク質を安定的に発現させる。ある実施形態において、検出可能なタンパク質をコード化する核酸をプラズミド発現ベクター中にクローニングして、細胞株を構成的に形質転換することで、検出可能なタンパク質を構成的に発現させる。ある実施形態において、構成的な発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。ある実施形態において、検出可能なタンパク質をコード化する核酸を誘導性のプラズミド発現ベクター中にクローニングして、細胞株を芸質転換し、検出可能なタンパク質の誘導発現を生じさせる。特徴的な実施形態において、誘導発現は、オペレーター部位を含むＣＭＶプロモーターの制御下にある。さらに特徴的な実施形態において、オペレーター部位は、テトラサイクリンオペレーター２部位である。さらに他の実施形態において、誘導プラズミド発現ベクターは、テトラサイクリンで調節された発現ベクターである。

５．２．１．２ 核酸相互作用モチーフ
核酸相互作用モチーフ、例えばＤＮＡ結合ドメインが従来技術において既知であり、本発明で開示する方法への使用に適した配列の例を表１に示す。核酸相互作用モチーフは、転写活性化因子およびレプレッサーを含む転写因子のＤＮＡ結合ドメインを包含する。適切なＤＮＡ結合ドメインの例としては、ＮＦ−κＢ（真核生物）、ｃｒｏリプレッサー（λバクテリオファージ）、ｌａｃリプレッサー（酵母）、ＧＡＬ４（酵母）、ＧＣＮ４（酵母）、Ｌｅｘ−Ａ（大腸菌）、Ｏｐａｑｕｅ−２（トウモロコシ）およびＴＧＡ１ａ（タバコ）が挙げられる。適切なＤＮＡ結合ドメインとしては、合成ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ホメオドメインおよびＰＯＵドメイン等の、自然発生および／または工学的なＤＮＡ結合モチーフの異なる部位の組み合わせから構成される合成ＤＮＡ結合ドメインも挙げられる。他の実施形態において、核酸相互作用モチーフは、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、制限酵素またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ等のＤＮＡ代謝酵素の全長、部分長または機能断片であってもよい。

ＤＮＡ結合ドメインの適合性は、特定のＤＮＡ結合ドメインのその標的配列への会合時間に依存し得る。例えば、ＮＦ−κＢは、その標的ＤＮＡ配列と４時間を超える解離半減期で、強い会合を形成する（Speight ら(2001) Chem. Biol. 8:951-965を参照のこと）。

ある実施形態において、核酸相互作用モチーフは、シス二量体化を可能にするため、タンデムリピートとして存在する。他の実施形態において、ＮＦ−κＢのモチーフは、ＮＦ−κＢのシス二量体化を可能にするため、タンデムリピートとして存在する。

５．２．１．３ 検出可能なタンパク質を作成する方法
ここに記載するように、検出可能なタンパク質は、核酸相互作用モチーフに結合した標的タンパク質を含み、任意に、標的タンパク質が膜タンパク質の場合、シグナルペプチドを含むことができる。本明細書に開示した検出可能なタンパク質は、当業者に既知のあらゆる様々な方法、例えば組み換えまたは合成のいずれを用いて作成してもよい。

１つの態様において、検出可能なタンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる。例えば、検出可能なタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチド、例えば発現ベクター内の核酸相互作用モチーフをコードする配列とイン・フレームで結合した標的タンパク質をコードする配列、例えばプラズミドベクターは、任意の適切な細胞、例えば細菌または哺乳類等の細胞で発現させることができる。

ある実施形態において、細胞は、単一の検出可能なタンパク質を発現するために使用される。他の実施形態において、細胞は、１を超える形態の検出可能なタンパク質が発現するように設計され、例えば第１の標的タンパク質と異なる標的タンパク質を含む検出可能なタンパク質とが発現するように設計される。

ある実施形態において、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフをコード化する配列に加えて、シグナルペプチドのアミノ酸をコードする配列さらに含む。シグナルペプチドは、細胞膜に分布するリソソームタンパク質、分泌タンパク質または膜タンパク質となる、新たに生成されたタンパク質を小胞体（ＥＲ）に導く短いアミノ酸配列である。１つの実施形態において、標的タンパク質が、リソソームタンパク質、分泌タンパク質または膜タンパク質である場合、シグナルペプチドは標的タンパク質をその最終目的部位に導くために用いられる。シグナルペプチドは、標的タンパク質、核酸相互作用モチーフの発現または活性と相互作用しないあらゆる部位に配置することができる。例えば、シグナルペプチドをコードする配列を、標的タンパク質をコードする配列の上流（５’）または下流（３’）に配置して、シグナルペプチドが、発現した検出可能なタンパク質中の標的タンパク質に対して、アミノまたはカルボキシとなるようにしてもよい。同様に、シグナルペプチドをコードする配列を、核酸相互作用モチーフをコードする配列の上流（５’）または下流（３’）に配置して、シグナルペプチドが、発現した検出可能なタンパク質中の核酸相互作用モチーフに対して、アミノまたはカルボキシとなるようにしてもよい。ある実施形態において、シグナルペプチドは、標的タンパク質配列中にある内部シグナル配列である。ある実施形態において、融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、シグナルペプチド、標的タンパク質、任意のリンカー配列および核酸相互作用モチーフを有する。ある実施形態において、シグナルペプチドは、検出可能なタンパク質のアミノ末端に存在する。ある実施形態において、検出可能なタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、シグナルペプチド、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを有する。ある実施形態において、検出可能なタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、シグナルペプチド、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを有し、標的タンパク質は受容体である。ある実施形態において、リンカー配列は標的タンパク質と核酸相互作用モチーフの間に存在する。ある実施形態において、リンカー配列は、１０〜２０アミノ酸の長さを有する。ある実施形態において、リンカー配列は、１６，１７または１８アミノ酸の長さを有する。他の実施形態において、リンカー配列は、可動性リンカーである。さらに他の実施形態において、リンカー配列は、タンパク分解酵素が認識し得る酵素切断部位である。このような実施形態において、標的タンパク質は、核酸モチーフからタンパク分解酵素で切断することができる。このような切断部位の例としては、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）タンパク分解酵素により認識、切断されるものが挙げられるが、この例示に制限されるものではない。

ある実施形態において、検出可能なタンパク質は、核酸相互作用モチーフのアミノ末端に結合した標的タンパク質を含む。このような実施形態において、検出可能なタンパク質をコードする配列は、順番に配列される。即ち、１つの実施形態において、標的タンパク質をコードする配列は、核酸相互作用モチーフとイン・フレームで、標的タンパク質の最もカルボキシ末端側のアミノ酸残基が、発現した検出可能なタンパク質内の核酸相互作用モチーフの最もアミノ末端側の近アミノ酸残基に隣接するように配置される。あるいは、他の実施形態において、標的タンパク質をコードする配列は、アミノ酸リンカー配列をコードする配列とイン・フレームで、つまり、順番に、核酸相互作用モチーフをコードする配列とイン・フレームに配置されるように配置される。このような実施形態において、標的タンパク質のアミノ酸配列は、核酸相互作用モチーフのアミノ末端とも結合しているが、リンカー配列によっても結合されている。

同様に、ある実施形態において、検出可能なタンパク質は、核酸相互作用モチーフのカルボキシ末端に結合した標的タンパク質を含む。このような実施形態において、検出可能なタンパク質をコードする配列は、順番に配列される。即ち、１つの実施形態において、核酸相互作用モチーフをコードする配列は、核酸相互作用モチーフの最もカルボキシ末端側のアミノ酸残基が、発現した検出可能なタンパク質内の標的タンパク質の最もアミノ末端側のアミノ酸残基と隣接するように、標的タンパク質をコードする配列とイン・フレームに配置される。あるいは、他の実施形態において、核酸相互作用モチーフをコードする配列は、アミノ酸リンカー配列をコードする配列とイン・フレームで配置され、つまり、標的タンパク質をコードする配列とイン・フレームで配置される。このような実施形態において、標的タンパク質のアミノ酸配列は、核酸相互作用モチーフのカルボキシ末端とも結合しているが、リンカー配列によっても結合されている。

発現ベクターの構築および発現ベクターを含む細胞内の遺伝子発現に関する技術は、従来技術において周知である。例えば、Sambrookら, 2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら編, Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照のこと。

発現ベクターに使用するのに有用なプロモーターとしては、アラビノースプロモーター、メタロチオネイン・プロモーター、構成的アデノウイルス・メジャー・レイト・プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒトの極初期ＣＭＶプロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および構成的なＣＭＶプロモーターが挙げられるが、これらに制限されるものではない。誘導性プロモーターについては、ここに記載の方法を実施する際に有用性が見出されており、例えば、Ｔ−ＲＥｘ（商標）システム（インビトロジェン社 カタログ番号 Ｋ１０２０−０２）等のｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆ系のテトラサイクリン制御性転写活性因子（ＴＲＥ）、金属塩の添加によって制御可能なメタロチオネイン・プロモーター、およびラパマイシン誘導性プロモーター（Riveraら, 1996, Nature Med, 2(9): 1028-1032; Yeら, 2000, Science 283: 88-91; Sawyer T Kら, 2002, Mini Rev Med Chem. 2(5): 475-88）等のプロモーターが挙げられる。従来の発明に使用される、多くの適切な制御可能なベクターおよびプロモーターが、当業者に周知であり、多くは市販されている。

発現ベクターは、検出可能なタンパク質が発現した細胞と互換性を有する、発現および複製シグナルを有する。検出可能なタンパク質をコードする構成に有用な発現ベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス、プラズミドベクター、コスミド等が挙げられる。ウイルスベクターおよびプラズミドベクターは、哺乳類細胞に発現ベクターを形質転換するのに好ましい。例えば、発現制御配列がＣＭＶプロモーターを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ１（インビトロジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ）は、優れた形質転換率、および形質転換された細胞における優れた発現率を実現させる。

検出可能なタンパク質は、例えば化学合成方法または合成方法および組み換え方法の組み合わせを用いても作成することができる。例えば、検出可能なタンパク質は、当業者に周知の標準的なポリペプチド合成技術を用いて、合成的に生成することができる。あるいはまた、検出可能なタンパク質の一部分は、精製するか、ここに記載した技術等を用いて組み換えて発現させることができ、当該部分は、検出可能な完全なタンパク質を得るために、合成技術を用いて結合してもよい。

検出可能なタンパク質の一部分を発現させて、または精製してから結合させた実施形態において、前記結合は、ペプチド結合等の共有結合または非共有結合であり、直接的な結合であってもよく、また、核酸相互作用モチーフと標的タンパク質を結合するリンカー部位等のリンカー部位を介したものであってもよい。

結合としては、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミド、イミド、ジスルフィド、ペプチドまたは他の結合など、あらゆるさまざまな結合がを使用できるが、これらに制限されるものではない。同様に、あらゆる様々な官能基、例えばスルフヒドリル基、カルボン酸（ＣＯＯＨ）または遊離アミン（−ＮＨ_２）基を介したものでもよい。当業者は、通常、適切な結合、任意のリンカーを選択し、また、例えば核酸相互作用モチーフおよび／または標的タンパク質等の検出可能なタンパク質の要素の物理的および化学的特性に基づいて、検出可能なタンパク質の結合部位の結合方法を選択することができる。

リンカーを用いる場合の実施形態において、リンカーは核酸相互作用モチーフおよび標的タンパク質のポリペプチド等の検出可能なタンパク質部分に直接結合させてもよい。他の実施形態において、リンカー自体は、核酸相互作用モチーフおよび標的タンパク質等の検出可能なタンパク質の結合部位と会合する２つ以上の分子を含む。例えば、結合は、例えば、核酸相互作用モチーフに付与されたビオチンと、および標的タンパク質ポリペプチドに付与されたストレプトアビジンを介していてもよい。リンカーとしては、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、置換された炭素リンカー、不飽和性炭素リンカー、芳香性炭素リンカー、ペプチドリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。

リンカーが核酸相互作用モチーフを標的タンパク質ポリペプチドに接続させるために使用する場合の実施形態において、リンカーは、特に制限することなく、当業者に既知のあらゆる手段または方法によって核酸相互作用モチーフおよび／または標的タンパク質ポリペプチドに付与することができる。

さらに、検出可能なタンパク質の結合部位、例えば核酸相互作用モチーフおよび標的タンパク質は、検出可能なタンパク質の他の部位またはリンカーへの結合の促進に適した形に誘導体化させてもよい。該誘導体化は、例えばPierce Chemical Company（イリノイ州ロックフォード）から市販されているもの等の適した誘導体または複数の誘導体によって達成することができる。あるいは、誘導体化は、検出可能なタンパク質の１以上の結合部位、例えば核酸相互作用モチーフおよび／または標的タンパク質の化学処理を伴う。例えば、当業者は、通常の方法でタンパク質に遊離スルフヒドリル基を生成して、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル等の、結合を起こさせる反応部位を形成することができる。例えば、米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと。

ここに記載のあらゆる結合方法を、様々な構成での検出可能なタンパク質の結合部位、例えば核酸相互作用モチーフおよび標的タンパク質に使用することができる。例えば、核酸相互作用モチーフのカルボキシ末端は、直接的または間接的に標的タンパク質ポリペプチドのアミノ末端に結合させることができる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質のカルボキシ末端は、核酸相互作用モチーフのアミノ末端に、直接的または間接的に結合させることができる。他の実施形態において、核酸相互作用モチーフのアミノ末端は、標的タンパク質のアミノ末端に、直接的または間接的に結合させることができる。他の実施形態において、核酸相互作用モチーフのカルボキシ末端は、標的タンパク質のカルボキシ末端に、直接的または間接的に結合することができる。前記のように、ここでいうアミノ末端またはカルボキシ末端に「結合した」とは、最もアミノ末端側または最もカルボキシ末端側のアミノ酸ポリペプチドに直接的に結合することを必ずしも示すものではなく、１つ以上の残基、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５またはそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸配列等をリンカーとして介した結合であってもよい。前記方法によって生成されたあらゆる検出可能なタンパク質は、本明細書に開示する方法の一部として用いることができることを明らかとする。

５．２．２ 抗体
ここに開示する方法およびキットに使用する抗体としては、ポリクローナル抗体、合成抗体、モノクローナル抗体、組み換えによって生成される抗体、多特異的な抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、ヤギ抗体、ラビット抗体、キメラ抗体、細胞内発現抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば単一特異性、二重特異性等を含む）、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｒｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびこれらのいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ある実施形態において、本明細書に開示する方法およびキットに使用する抗体としては、免疫グロブリンの免疫グロブリン分子の免疫グロブリン分子および免疫学的に活性のある部位が挙げられる。本明細書に開示する免疫グロブリン分子としては、免疫グロブリン分子のあらゆるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスを使用できる。

使用可能な抗体としては、免疫グロブリンの変異体及び誘導体であり、エピトープに特異的に結合する能力を保持する断片を含むものを使用できるが、これらに制限されるものではない。好ましい断片としては、Ｆａｂ断片（抗原結合ドメインを有し、ジスルフィド結合によって架橋された軽鎖および重鎖の一部を含む抗体断片）；Ｆａｂ’（Ｆａｂと、それに付加されたヒンジ領域を有する重鎖部分とを含む単一の抗結合ドメインを包含する抗体断片）；Ｆ（ａｂ’）_２（重鎖のヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂ’分子；Ｆａｂ’分子は、同一のまたは異なるエピトープに対応する）；二重特異性Ｆａｂ（２つの抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子であって、それぞれのドメインは異なるエピトープに対応する）；可変領域を含む単鎖Ｆａｂ鎖ｓＦｖとしても知られる（１０−２５アミノ酸の鎖によって結合した単一の軽鎖および重鎖の抗体の可変、抗原結合決定領域）；ジスルフィド結合したＦｖまたはｄｓＦｖ（ジスルフィド結合によって結合した単一の軽鎖および重鎖の抗体の可変、抗原結合決定領域）；ラクダ化ＶＨ（ｃａｍｅｒｉｚｅｄ ＶＨ）（単一の軽鎖および重鎖の抗体の可変、抗原結合決定領域であって、ＶＨ接合部分でのアミノ酸のいくつかは、天然のラクダ抗体を生じる重鎖にみられる）；二重特異性ｓＦｖ（２つの抗原結合ドメインを有するｓＦｖまたはｄｓＦｖ分子であって、それぞれ異なるエピトープに対応する）；二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（第１のｓＦｖのＶＨドメインが第２のｓＦｖのＶＬドメインとともに組み立てられ、第１のｓＦｖのＶＬドメインが第２のｓＦｖのＶＨドメインとともに組み立てられて形成される二量体ｓＦｖ；二特異性抗体の２の抗原結合領域は、同一のまたは異なるエピトープに対応する）；三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）（３つの抗原結合ドメインが１つの複合体中に形成される以外は、二特異性抗体と同様の方法で形成される三量体ｓＦｖ；３つの抗原結合ドメインは同一のまたは異なるエピトープに対応する）。免疫グロブリンの誘導体である抗体は、抗体結合部位の１以上のＣＤＲ配列も有する。ＣＤＲ配列は、２以上のＣＤＲ配列が存在する場合、スカフォールド上で結合することができる。ある実施形態において、本発明に使用する抗体は、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であり、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能とする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore編 Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。

本明細書に開示する方法およびキットに使用する抗体は、トリおよび哺乳類を含むあらゆる動物由来のものを使用できる（例えばヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ラビット、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ）。本発明の方法およびキットのある実施形態において、本発明の抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書における「ヒト」抗体とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリまたはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから分離された抗体を含む。

ある実施形態において、細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体は、修飾されていない形態の標的タンパク質とは、結合または交差反応を起こさない。タンパク質の特定の修飾、例えば特定の修飾残基に特異性を有する抗体は、従来技術において周知である。したがって、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化を含む（ただし、これらに制限されない）、タンパク質修飾に特異性を有する従来技術に既知のあらゆる抗体についてが、ここに開示する方法に使用することができる。いくつかの実施形態において、ここに開示する方法に使用される抗体は、抗リン酸抗体である。他の実施形態において、ここに開示する方法に使用した抗体は、抗メチル抗体である。他の実施形態において、ここに開示する方法に使用される抗体は、抗アセチル抗体である。

標的タンパク質がヒストンＨ３である場合の実施形態において、修飾した形態のヒストンＨ３に特異的に結合する有用な抗体としては、抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ５）、（Epitomics社、Novus Biologicals社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ１２）（Novus Biologicals社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（BioVision社、EMD Biosciences社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）、（Active Motif社、USBIO社、Novus Biological社）;抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ１４）、抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ１８）、（Active Motif社、USBIO社、Epitmoics社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ２４）（Santa Cruz Biotechnology社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ２３）、抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７）、抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ５６）、（Active Motif社, Epitomics社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９／Ｌｙｓｌ４）（Cell Signaling Technology社、 Santa Cruz Biotechnology社）；抗アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９／Ｌｙｓ１８）（USBIO社）；抗過メチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）（Cell Signaling Technology社、Active Motif社、USBIO社）；抗モノメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）、抗モノメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ５６）、抗モノメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ７９）（Active Motif社）；抗リン酸化モノメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）（Cell Signaling Technology社）；抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）、抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）、ヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７）、抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ７９）、（Cell Signaling Technology社、Active Motif社、USBIO社）；抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ８０）（Santa Cruz Biotechnology社）；抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ５６）、（Cell Signaling Technology社、Active Motif社）;（Cell Signaling Technology社）；抗ジメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ３６）、（Active Motif社）；抗トリメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）、抗トリメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７）（Active Motif社）；抗トリメチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）（Epitomics社）；抗リン酸化（Ｔｈｒ８０）抗トリメチル化（Ｔｈｒ７９）ヒストンＨ３（USBIO社）；抗リン酸化（Ｔｈｒ３）抗メチル化（Ｌｙｓ４）ヒストンＨ３（Lifespan Biosciences社）;抗アセチル化（Ｌｙｓ９）抗リン酸化（Ｓｅｒ１０）ヒストンＨ３（USBIO社）;抗アセチル化（Ｌｙｓ１５）抗リン酸化（Ｓｅｒ１１）ヒストンＨ３（Santa Cruz Biotechnology社）;および抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ２８）（Santa Cruz Biotechnology社）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

標的タンパク質がサイクリンＢ１の場合の実施形態において、修飾した形態のサイクリンＢ１に特異的に結合する有用な抗体としては、抗リン酸化サイクリンＢ１（Ｓｅｒ１２６）（Rockland社、Meridian Life Science社）；および抗リン酸化サイクリンＢ１（Ｓｅｒ１３３）（Cell Signaling Technology社）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

標的タンパク質がＢＡＤの場合の実施形態において、サイクリンＢＡＤの修飾した形態に特異的に結合する有用な抗体としては、抗リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１１２）（Immuno-Biological Laboratories, Assay Designs,社、Cell Signaling Technology社、IMGENEX社、MBL International社）；抗リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１３６）（Immuno-Biological Laboratories社、Assay Designs社）；および抗リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１５５）（Immuno-Biological Laboratories社、IMGENEX社）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

標的タンパク質がＳＴＡＴ５Ａの場合の実施形態において、ＳＴＡＴ５Ａの修飾した形態に特異的に結合する有用な抗体としては、抗リン酸化ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）(Rockland社, ECM Biosciences社, Cell Signaling Technology社, Abgent社, Immuno-Biological Laboratories社, USBIO社、Lifespan Biosciences社、MBL International社、RayBiotech社、Biotrend社、IMGENEX社、AnaSpec社、Abeam社、EMD Biosciences社)；抗リン酸化ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９５／Ｔｙｒ６９９）（RayBiotech社）；抗リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ（Ｓｅｒ１２７／セリン１２８）；抗リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ（Ｓｅｒ７８０）（Abgent社）；抗リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ（Ｓｅｒ７８０）（IMGENEX社）；および抗リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂが挙げられるが、これらに制限されるものではない。

標的タンパク質がＳＴＡＴ６である場合の実施形態において、修飾した形態のＳＴＡＴ６に特異的に結合する有用な抗体としては、抗リン酸化ＳＴＡＴ６（Ｔｈｒ６４１）(Cell Signaling Technology社、R&D Systems社、Biotrend社、MBL International社、RayBiotech社、IMGENEX社、Biovision社、ミリポア社、EMD Biosciences社);および抗リン酸化ＳＴＡＴ６（Ｔｈｒ６４５）（IMGENEX社、Abeam社）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

タンパク質の修飾を検出する他の抗体としては、抗ファルネシル抗体(シグマ社)および抗Ｏ−グリケーション抗体（ミリポア社、Acris Antibodies GmbH、GeneTex社、Fitgerald社、Industries Internationl社）が挙げられる。特異的なタンパク質の修飾を認識し、結合する、カスタムモノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製してもよい。

いくつかの実施形態において、分析方法は、固体相分析の形式を用いて実施される。ここに開示する方法およびキットのある実施形態において、抗体は、固体支持体に固定する。ここで使用される「固体支持体」は、特に限定されるものではなく、あらゆるカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイターディッシュ、粒子（例えばマグネット、アガロースまたはセファロースビーズ）、マイクロチップ（例えばガラス、繊維ガラス、ラテックス、シリコン、シリコンガラスまたはゴールドチップ）、膜（例えばリポソームまたはベシクルの膜）、プラスチック材料（例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）、または、抗体が直接または間接的に（例えば他の抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ等の他の結合パートナーを間に介して）結合することができるか、または、抗体を埋め込むことができる（例えば受容体またはチャネルによって）センサチップ（例えばビアコアシステム）である。特定の実施形態において、抗体は、プロテインＧの固体支持体上への固定によって、間接的に固定される。

分析方法に使用される抗体は、あらゆる標準的な方法を用いて「捕捉」される。例えば、抗体をビオチン化した後、固定されたストレプトアビジン（例えばマグネットビーズまたはカラムに固定されたストレプトアビジン）を用いてビオチン化抗体を捕捉することができる。抗体（および検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマー）に結合する標的タンパク質は、固体支持体に結合したまま残り、一方で、結合していない結合試薬（例えば標的タンパク質および核酸オリゴマー）は、洗い流される。結合した標的タンパク質の捕捉後、検出可能なタンパク質の核酸相互作用モチーフへの結合を介して標的に結合する核酸オリゴマーは、通常、例えば核酸オリゴマーとハイブリッドを形成するプライマーを用いたＰＣＲ反応によって検出することができる。ある実施形態において、ＰＣＲ反応は、標準の定量方法を用いて（例えばパーキンエルマー社のTaqManを使用して）実施される。いくつかの実施形態において、目的の核酸オリゴマーと複合体をなす複数のタンパク質は、固体支持体上に残存する。この場合、分離されたプールの個々の要素は、例えば目的の特定のタンパク質に特異的なそれぞれ固有の核酸オリゴマーの増幅等を経て同定することができる。

ある実施形態において、抗体を結合させる固体支持体は、マグネットビーズである。ある実施形態において、抗体は、ストレプトアビジン被覆ビーズに固定されたビオチン化抗体である（Invitrogenインビトロジェン社のDynabeads（商標）M280）。ある実施形態において、ビオチン化抗体は、１次抗体を捕捉するために使用される２次抗体であり、同様に、修飾された標的タンパク質を認識し、結合するために使用される。ある実施形態において、抗体はプロテインＧビーズ上に固定される（インビトロジェン社のDynabeads（商標）プロテインG）。ある実施形態において、抗体はプロテインＡビーズ上に固定される（インビトロジェン社のDynabeads（商標）プロテインＡ）。いくつかの実施形態において、抗体は、固体表面上に固定された２次抗体によって固定される（例えばDynabeads（登録商標）M-280ヒツジ抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン社）；Dynabeads（登録商標）M-280ヒツジ抗ラビットＩｇＧ（インビトロジェン社）。

ある実施形態において、抗体−標的タンパク質複合体の溶出が、例えば核酸オリゴマーのＰＣＲ検出に必要とされる場合、タンパク質複合体の溶出は、市販の溶出緩衝液を用いて実施してもよい。ある実施形態において、抗体標的タンパク質複合体は、プロテインＧビーズを用いて固定された場合、溶出は、リン酸フェニルを用いて、または市販の低ｐＨ緩衝剤を用いて実施してもよい。ある実施形態において、固定された抗体は、例えば１次抗体または２次抗体のいずれか、化学的切断または酵素切断することができる切断リンカーを含む。ある実施形態において、切断リンカーは、ホスフィンまたはジチオールを介した還元によって切断することができる。ある実施形態において、ホスフィンは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。

ある実施形態において、抗体は、複数のウェルを有するウェルプレート、例えばマルチウェルプレートまたはマルチドメインマルチウェルプレートに固定された。マルチウェルの分析プレートの使用は、並行処理およびプレート上のマルチウェルに分布された複数のサンプルの分析を可能とする。マルチウェルの分析プレート（別名マイクロプレートまたはマイクロタイタプレート）は、様々な形態、サイズおよび形状とすることができる（例えば９６−， ３８４−， １５３６−または９６００プレート；丸底型または平底型の複数のウェルプレート）。ここに開示する方法は、標準のプレートの形態において実施される場合は、これらのプレートの格納、移動が可能な市販の機器、ならびに液体をプレートの中および外で容易に調合することができる市販の機器を使用することができる（例えばマルチウェルピペット、プレート洗浄機等）。ここに開示する方法に使用することができるマルチウェルプレートの形態としては、９６ウェルプレート（ウェル１２×８の配列）、３８４ウェルプレート（ウェル２４×１６の配列）および１５３６ウェルプレート（ウェル４８×３２の配列）が例示できる。ここに開示する方法に使用することができる他の形態としては、単一または複数のドメインを含むマルチプレートが挙げられるが、これらに制限されるものではない。

５．２．３ 核酸オリゴマー
本発明で使用される核酸オリゴマーは、標的タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する。ある実施形態において、核酸オリゴマーは、（ａ）レポーター機能を有するＰＣＲ増幅産物（「アンプリコン」）である第１の核酸配列および（ｂ）タンパク質を捕捉するか、「標識を付す」機能を有する核酸相互作用モチーフの第２核酸配列、を含む。ある実施形態において、第１の核酸配列は、異種であり、即ち、通常、第２の核酸配列に隣接している。標的タンパク質および核酸相互作用モチーフ、例えばＤＮＡ結合タンパク質を含む検出可能なタンパク質は、核酸オリゴマー、例えばＤＮＡタンパク質の複合体形成によって捕捉するか、「標識を付す」ことができる。

ある実施形態において、核酸オリゴマーは、ＤＮＡ結合タンパク質によって特異的に認識される標的ＤＮＡ配列に結合したアンプリコンを含む（例えばＮＦκＢ、ｃｒｏリプレッサー、ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、ＬｅｘＡ、Ｏｐａｑｕｅ−２およびＴＧＡ１ａ）。他の実施形態において、核酸オリゴマーは、転写因子のＤＮＡ結合ドメインの同族ＤＮＡ配列に結合したアンプリコンを含む。ある実施形態において、第２の核酸配列は、天然のまたは合成のＤＮＡ結合タンパク質を認識する配列を含む。ある実施形態において、ＰＣＲ増幅産物を含む第１の核酸配列は、核酸相互作用モチーフを含む第２の核酸から分離されて、区別されるものである。このような実施形態において、核酸オリゴマーは、核酸オリゴマーを特異的に認識することができるＤＮＡ結合因子を有するタンパク質に結合することができる。核酸オリゴマーは、その後、検出され、および／または、例えば定量化ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはＰＣＲ増幅後の質量分析による検出等を用いて定量化される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅工程の間に、第２のレポーター機能が用いられる。ある実施形態では、ＰＣＲ増幅工程の間、プライマー伸長工程において、蛍光タグ等の第２のレポーター機能が核酸オリゴマーに付着する。

ある実施形態において、核酸オリゴマーは、ｑＰＣＲによって検出され、および／または定量化される。ｑＰＣＲによる核酸オリゴマー検出は、確実性のある定量的な検出方法であるだけでなく、高感度で、且つ、選択性の高い検出方法であるという利点も有する。ｑＰＣＲ検出方法が高感度であることから、この方法は、極めて微量の標的タンパク質の検出を可能とし、組み換え型タンパク質のような、少量で高価な分析対象の必要量を減少させることができる。ｑＰＣＲ検出方法の高特異性により、ｑＰＣＲは、複雑な異種混合物中の特異的なＤＮＡ配列の検出が可能となり、タンパク質の検出を改善するか、促進させるために、タンパク質サンプルに通常実施される、あらゆる種類の精製工程が不要となる。

増幅される配列は、配列特異的な方法で、ＰＣＲプライマーとハイブリッドを形成するか、形成することができるものである。ある実施形態において、核酸オリゴマーは、複数のアンプリコン、例えば２，３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上のアンプリコンを含む。いくつかの実施形態において、複数のアンプリコンは、単一のアンプリコンのタンデムリピートである。ある実施形態において、アンプリコンは、定量的ＰＣＲによって増幅可能であり、該核酸オリゴマーに標識を付されたタンパク質の定量化を可能とする。ある増幅方法において、最高４０回の変性、アニーリングおよび伸長の連続的な工程で、ｑＰＣＲシグナルの増幅を完成するため、ＰＣＲ配列の増幅は、標準のＰＣＲ反応混合物（通常、最終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５°ＣでｐＨ ８．３）、１−４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１−１ｍＭ ｄＮＴＰ）中にＰＣＲ増幅の鋳型を含む核酸、ＰＣＲプライマーおよびｑＰＣＲプローブを混合し、非特異的なアニーリングまたはミスプライミングを最小にするため、試料を最初にホットスタート条件下にて（例えば５分間９５℃で加熱して）処理し、変性工程（例えば４５秒間、９５℃）の後、伸長工程（１分間、７２℃）を実施することによって行う。

ある実施形態において、核酸オリゴマーの長さは、約５０〜約１００、約５０〜約２００、約５０〜約３００、約５０〜約４００、約５０〜約５００、約１００〜約２００、約１００〜約３００、約１００〜約４００、約１００〜約５００、約２００〜約３００、約２００〜約４００、約２００〜約５００、約３００〜約４００、約３００〜約５００または約４００約５００ヌクレオチドである。

ここで開示されるレポーター機能とは、それを視覚化あるいは検出または定量化することを可能とする核酸オリゴマーの特徴とするものであり、したがって、捕捉または「標識」されたタンパクを間接的に視覚化あるいは検出または定量化することを可能とする。ある実施形態において、核酸オリゴマーのレポーター機能は、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ社／ＡＢＩ、 BioTrove）、ＤＮＡマイクロアレイ（アフィメトリックス社、GeneChip（登録商標））、ビーズアレイ（Illumina's BeadArray Technology社Luminex's xMAP technology）、ＤＮＡキャピラリーアレイまたはキャピラリー電気泳動（アプライドバイオシステムズ社、ベックマンコールター社、GenomeLab（商標）GeXP Genetic Analysis System）、ナノテクノロジー（Nanostring(登録商標)社nCounter（商標）Analysis System）、ＤＮＡ塩基配列決定（454、Illumina社Solexa、イフテクノロジーズ社SOLiD（登録商標） System Sequencing、アプライドバイオサイエンス社／ＡＢＩ）、及び質量分析（Sequenom（商標）社、BioTrove社）等により検出されるが、検出方法はこれらに制限されるものではない。

ある実施形態において、核酸オリゴマーのレポーター機能は、核酸オリゴマーの放射性同位元素標識、蛍光標識またはビオチン化により付与される。核酸オリゴマーとしては、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはそれらの天然または合成誘導体、その類似体および断片が例示される。いくつかの実施形態において、核酸オリゴマーはＤＮＡとし、レポーター機能標識は、例えばニックトランスレーション等のあらゆる標準的な酵素反応、または^３２Ｐ、^１２５Ｉまたはビオチン化標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の末端標識のＤＮＡへの導入、または標識の挿入剤としての導入としてもよい。多くの蛍光剤または発光剤市販されており、核酸オリゴマーを標識するために使用することができる。核酸オリゴマーの標識に使用できる蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、クマリンならびにそれらの市販の誘導体、例えばテキサスレッド（登録商標）およびアレキサフルオル（登録商標）が例示される。発光剤としては、ランタニド複合体および発光ナノ粒子が例示される。ある実施形態において、核酸オリゴマーは、始めからレポーター機能を有するものでなく、レポーター機能は、核酸検出工程の前に付加される。

核酸オリゴマーおよび核酸相互作用モチーフの対の例を表１に示す。ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば転写活性化因子およびリプレッサーを含む転写因子のＤＮＡ結合ドメインを有する。適切なＤＮＡ結合ドメインとしては、ＮＦ−κＢ（真核生物）、ｃｒｏリプレッサー（λバクテリオファージ）、ｌａｃリプレッサー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＧＡＬ４（酵母）、ＧＣＮ４（酵母）、Ｌｅｘ−Ａ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｏｐａｑｕｅ−２（トウモロコシ）およびＴＧＡ１ａ（タバコ）が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインの適合性は、特定のＤＮＡ結合ドメインのその標的配列への相互作用時間にも依存し得る。例えば、ＮＦ−κＢは、その標的ＤＮＡ配列と４時間を超える解離半減期で、強い会合を形成する（Speight et al. (2001) Chem. Biol. 8:951-965を参照のこと）。適切なＤＮＡ結合ドメインは、自然発生的なおよび／または工学的なＤＮＡ結合モチーフ、例えば合成ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ホメオドメインおよびＰＯＵドメインの異なる部分の組み合わせから構成される合成ＤＮＡ結合ドメインを含んでいてもよい。検出可能なタンパク質は、核酸オリゴマーのある結合認識配列によるＤＮＡ結合ドメインの認識によって捕らえることができるか「タグを付す」ことができる。本発明の他の実施形態において、核酸相互作用モチーフは、全長、一部分、または、ここに記載のＤＮＡ代謝酵素、例えばＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、制限酵素またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼの機能的断片である。

表１：核酸オリゴマー、核酸相互作用モチーフおよび核酸相互作用モチーフ認識配列の例

５．２．４ 細胞
ここに開示する方法に使用する細胞は、あらゆる細胞種および生物由来の初代細胞、二代目の細胞または不死化細胞とできる。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトを含む哺乳類由来である。いくつかの実施形態において、細胞は異なる細胞種である。他の実施形態において、細胞は、実質的に均一な集団の細胞である。本発明の方法は、例えば４２、９６、３８４または１５３６のウェルの分析プレートを含有する大量の細胞サンプルの分析を可能とする。

ここに開示する方法は、通常の組織培養プラスチックウェア内に成長することができる、あらゆる細胞種を用いて実施することができる。このような細胞種としては、あらゆる既知の供給源、例えば哺乳類、植物、細菌、ウイルスまたは菌由来の、全ての野生型および形質転換細胞を含む。ある実施形態において、細胞は、哺乳類由来のものである（ヒトまたは齧歯動物もしくはサル等の動物）。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、細胞は、齧歯動物由来のものである。いくつかの実施形態において、細胞は、ネズミ由来のものである。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、あらゆる臓器または組織由来（例えば脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉、骨、骨髄または血液）および、あらゆる細胞種のものを使用できる。ここに開示した方法に使用するための適切な細胞種としては、線維芽細胞、基底細胞、上皮細胞、内皮細胞、血小板、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、顆粒白血球、単球、マスト細胞、神経細胞、神経芽細胞、巨細胞性、樹枝細胞、マクロファージ、分割球、内皮細胞、腫瘍細胞、介在性細胞、クップファー細胞、ランゲルハンス細胞、沿岸細胞、組織細胞、例えば筋細胞および脂肪細胞ならびに除核細胞等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

ここに記載の方法に従って特定の分析を発展するため、使用する細胞種および／または細胞株は、当業者によって容易に選択することができ、その選択は、研究対象たる細胞プロセスの特性、分析の意図する目的等のいくつかの要因によって決定される。例えば、細胞株の選択は、基質に作用する研究対象たるタンパク質（形質転換した検出可能な標的タンパク質）が、細胞に内因的に存在するかどうかに部分的に依存する。いくつかの実施形態において、細胞プロセスを調節する被験化合物の１次スクリーニング用に構築された分析（即ち、第１回目のスクリーニング）は、市販の、通常は成長させるのが比較的容易な確立された安定な細胞株を用いて実施することができる。分析結果が薬剤開発の後の工程に使用される場合において、分析は、初代および二代目の細胞を用いて実行される。初代および二代目の細胞は、不死化細胞を比較して、取得、維持及び／または成長が、通常は困難であるものの、優れた生体内条件（ｉｎ ｖｉｖｏ）の実験モデルを示す。

いくつかの実施形態において、ここに記載の方法は、被験化合物と細胞とを接触させる前に、細胞を飢餓状態にする工程を含む。細胞の飢餓状態は、分析する細胞プロセスが１以上のプロテインキナーゼによるリン酸化であり、目的のプロテインキナーゼが、構造的に活性状態でない場合に特に有利である。飢餓は、細胞成長および分裂の正常なサイクルを中断して、細胞を静止（不活性）状態にして、細胞のリン酸化レベルをベースラインまで低下させる。細胞の飢餓は、あらゆる適切な方法、例えば血清または成長補助剤を含まない培地での細胞培養によって実行される。

本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質を発現するように、遺伝子操作してもよい。発現ベクターは、当業者に既知のあらゆる方法によって宿主細胞内に発現するように導入することができる。係る方法としては、例えば細胞による溶液からの分子の直接的な取り込み；またはリポソームまたは免疫リポソーム等を用いたリポフェクションを介した促進された取り込み；粒子を媒介した形質転換等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号、Goeddelら編, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA;Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Sambrookら, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY；およびAusubelら編, Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照のこと。発現ベクターに使用するための実用的なプロモーターとしては、メタロチオネイン・プロモーター、構成的アデノウイルス・メジャー・レイト・プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、構成的なＭＰＳＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒトの極初期ＣＭＶプロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ））および構成的なＣＭＶプロモーターが挙げられるが、これらに制限されるものではない。発現ベクターは、検出可能なタンパク質を発現する細胞と互換性を持つ、発現および複製シグナルを含むべきである。検出可能なタンパク質を発現するための発現ベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス、プラズミドベクター、コスミド等が挙げられる。

組み換え型ポリペプチドを発現するのに有用な当業者に既知のあらゆる哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ３７５細胞、ＨＥＫ２９３またはＬｎＣａｐ細胞が、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質を発現するために使用できる。標的タンパク質が適切な宿主細胞に発現している場合、それは天然タンパク質に存在する翻訳後の修飾を発現することができ、したがって、天然タンパク質の構造および機能を保持することが期待できる。

５．３ キット
また、ここに開示されるキットは、候補分子または細胞プロセスを調節する被験化合物をスクリーニングするためのキットであり、細胞プロセスは、標的タンパク質を修飾する。係るキットは、細胞分析において、検出可能な基質としての役割を果たす、検出可能なタンパク質で形質転換された細胞株を含む。前記キットは、細胞プロセスの結果として修飾された、標的タンパク質に特異的に結合する抗体をさらに含む。抗体は、任意に固体支持体または容器、例えばマルチウェルプレートのウェルに固定される。いくつかの実施形態において、キットは、さらに検出可能な核酸オリゴマー、および核酸オリゴマーによって「標識を付す」ことができる標的タンパク質を含む。核酸オリゴマーをｑＰＣＲによって検出することができる場合、キットは、核酸オリゴマー内のＰＣＲ開始配列を認識することができるＰＣＲプライマーをさらに含む。係るキットは、前記のように、細胞プロセスを調節する被験化合物を同定するための方法を実施するために使用することができる。

他の実施形態において、キットは、細胞プロセスの結果として修飾された標的タンパク質の存在を検出するために使用してもよい。前記キットは、生体試料中にある分子が存在するか否かを試験する診断キットとして使用してもよく、前記分子は細胞プロセスを調節するか、細胞プロセスを誘発する化合物であり、前記細胞プロセスにより、標的タンパク質の修飾が起こる。ある例において、キットは、細胞プロセスの結果として修飾され、固体表面に固定される標的タンパク質に特異的に結合する抗体；核酸オリゴマーによって標識を付すことができる標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質；および検出可能な核酸オリゴマーを含む。キットは、任意に、ｑＰＣＲ増幅を可能とするため、核酸オリゴマー内のＰＣＲ開始配列を認識することができるＰＣＲプライマーをさらに含む。

６． 実施例
６．１ 実施例１；ＮＦ−κＢおよびキナーゼ融合タンパク質の構築
構成的発現のための発現ベクター
以下の遺伝要素は、標準の分子生物学技術を用いた遺伝子合成に続いて、制限酵素による消化、およびその後のライゲーションによって、一般的な細菌プラズミドであるｐＧＥＭのバックボーンにクローニングした。５’末端から３’末端まで記載すると、それらは下記の通りである：
多く細胞種にて、強い構成的発現を可能とするＣＭＶ（サイトメガロウイルス）エンハンサー／プロモーター領域；
ヒトβ−グロビン遺伝子の最初のイントロン、ならびにリーダー、および免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域の主体から構成されるキメライントロン（形質転換の研究は、ｃＤＮＡ挿入に隣接するようなイントロンの存在が、しばしば遺伝子発現のレベルを上昇することを示した）；
ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）のタンパク分解酵素の認識配列に続いて、いくつかの固有な制限酵素部位を有する多重クローニング領域とイン・フレームで融合した酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインまたはヒトＮＦ−κＢ転写活性因子（表１参照）；
ｍＲＮＡの安定性および翻訳を向上させるＳＶ４０（シミアンウイルス４０）後期ポリアデニル化シグナル；
Ｅ．ｃｏｌｉの増殖のためのｐＭＢＩの複製起点；および
Ｅ．ｃｏｌｉの選択／増殖のためのアンピシリン耐性（Ａｍｐ^Ｒ）遺伝子。

構成的発現のための発現ベクター
細胞で検出可能なタンパク質の発現レベルを調節することで、細胞系を混乱させないよう、Ｔ−Ｒｅｘ（商標）系 (インビトロジェン カタログ番号 K 1020-02)と使用するために設計されたｐｃＤＮＡ（商標）５／ＴＯ（インビトロジェン カタログ番号K1020-01）を、５．１．１．に記載されたタンパク質のクローニングにも使用した。前記ベクターは、２つのテトラサイクリンオペレーター２（ＴｅｔＯ_２）部位を、テトラサイクリン調節発現を可能とするＣＭＶプロモーターの内に有する。ＴｅｔＯ_２部位は、ｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲに発現した４つのＴｅｔリプレッサー分子の結合部位の役割を果たす。Ｔｅｔリプレッサーの結合は、検出可能なタンパク質の発現をテトラサイクリンの不存在下において抑制する。テトラサイクリンの添加により、検出可能なタンパク質の非抑制および発現が生じる。検出可能なタンパク質の発現は、細胞内に存在するテトラサイクリンの量を調整するか、または細胞内を共形質転換するｐｃＤＮＡ（商標）５／ＴＯおよびｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲの比率を調整するかのいずれかによって制御することができる。

６．１．１ タンパク質のクローニング
全長ヒトキナーゼＭｅｋ１（GenBank 登録番号NP_002746.1）（配列番号：22）、全長ヒトＥｒｋ１（参照配列P27361）（配列番号：23）、全長ヒトキナーゼＡｋｔ１（GenBank登録番号NP_005154.2） （配列番号：24）、全長ヒト転写因子ＦＫＨＲ／ＦＯＸＯ１（GenBank登録番号NP_002006）（配列番号：25）、アミノ酸１−７８７のヒトのＡｃｋ１／Ｔｎｋ２（参照配列Q07912）（配列番号：26）、全長ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ（参照配列014965）（配列番号：27）、全長ヒトＳｒｃ（参照配列P12931）（配列番号：28）、全長ヒトプロアポトーシスタンパク質ＢＡＤ（参照配列CAG46757）（配列番号：29）、全長ヒトヒストンＨ３（参照配列P68431及びQ71DJ3）（配列番号：30）、アミノ酸１４２−５４０のヒトアンドロゲン受容体（ＡＲ）（参照配列P 10275）（配列番号：31）、全長ヒト転写因子ＳＴＡＴ５Ａ（P42229）（配列番号：32）、全長転写因子ＳＴＡＴ６（P42226）（配列番号：33）および全長サイクリンＢ１（参照配列14635）（配列番号：34）をコード化する配列は、逆翻訳から取得でき、ヒトのＤＮＡ結合ドメインＮＦ−κＢ（配列番号：５）のアミノ酸３５−３６（ＭｅｔＡｌａ）およびアミノ酸４１−３５９をコード化する配列とイン・フレームでそれぞれ融合して、また逆転写により取得した。対応する触媒的に不活性なキナーゼは、前記野生型配列、キナーゼドメインの触媒残基に突然変異を導入することによって、クローニングした。したがって、以下のミスセンス突然変異をコード化する配列（括弧内に記載した特定のアミノ酸置換）であって、全長ヒトＭｅｋ１（Ｋ９７Ａ）、全長Ｅｒｋ１（Ｋ７１Ｒ）、全長Ａｋｔ１（Ｋ１７９Ａ）、全長Ａｃｋ１／Ｔｎｋ２（Ｋ１５８Ｒ）、全長ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ／ＡｕｒＫＡ（Ｋ１６２Ｒ）、全長Ｓｒｃ（Ｋ２９８Ｒ）およびアミノ酸１４２−５４０のアンドロゲン受容体／ＡＲ（Ｙ５３４Ｆ）をコード化する配列は、逆翻訳から得られ、配列番号：５をコード化する配列とイン・フレームでそれぞれ融合して、また逆翻訳から取得した触媒的に不活性なキナーゼが、下流効果を発揮しないリン酸基の受動的な受容体として構成され、宿主これにより、細胞系の混乱を最小限にすることができる。

配列は、通常の分子クローニングプロトコルに従って、制限酵素を用いた切断、及びライゲーションによってクローニングした。クローンの配列は、ＡＢＩシーケンサーで確認した。

構築された各ＤＮＡの発現レベルおよび品質は、ＧＡＬ４およびＮＦ−κＢに対する抗体（Santa Cruz Biotechnology社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット法によって解析した。

６．１．２ 核酸オリゴマーの構築
任意の配列を生成して、ソフトウェアPrimer Express（登録商標）（ＡＢＩ）を用いて、アンプリコンを設計するに使用した。アンプリコンは、ヒトのキノーム（ｋｉｎｏｍｅ）に対して、および他のアンプリコンに対してＢＬＡＳＴ検索して、ＢＬＡＳＴ検索の配列の最小類似性に基づいて選択した。選択されたアンプリコンを、ＡＢＩに送ることで、適切なプライマーおよびｑＰＣＲ蛍光プローブが、ＡＢＩで調製された。アンプリコンを、ＧＡＬ４またはＮＦ−κＢ認識部位の添加によってさらに修飾し、完全な核酸オリゴマーを生成した。オリゴヌクレオチドは、細菌プラズミドにクローニングして、オリゴマーはＰＣＲを用いて複製した。

６．２ 実施例２：リン酸化Ｍｅｋ１細胞分析
この細胞分析において、化合物について、Ｂｒａｆの直接的なキナーゼ基質であるＭｅｋ１のリン酸化を測定することによって、それらのＢｒａｆを阻害する能力に関して試験した。構成的に活性なＢｒａｆ Ｖ６００Ｅ突然変異を発現するＡ３７５細胞は、３ｅ５細胞／ｍＬの濃度で１０ｃｍプレートに播種して、４０μＬのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）で１ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ緩衝剤（ギブコ社／インビトロジェン社）中で検出可能なタンパク質（１６μｇ）をコード化する発現プラズミドに形質転換して、３７℃で１８−２２時間インキュベートした。次の日に、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理して、Ｍ３培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で停止させた。細胞は、計数し、Ｍ３完全培地中に濃度５ｅ６細胞／ｍＬまで再懸濁して、５０，０００細胞／ウェル／１００μＬで９６ウェルプレートに播種して、３７℃で３時間インキュベートした。その後、培地を取り除き、飢餓培地（０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）をウェルに添加し、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＭ３飢餓培地中の化合物とともに、３７℃で２時間インキュベートした。

タンパク質抽出工程のため、ウェルから培地を取り除き、Ｍ−ＰＥＲ（Pierce社）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＤＴＴ／１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡフリー（ロシュ社）抗タンパク分解酵素混合物／２５０ｎＭオカダ酸を添加して、プレートは冷蔵室にて３０分間最大速度で振とうした。細胞は、２０分間、３０００ｒｐｍ遠心分離機で分離した。上清３０μＬは、収集して、１０μＬの４×タンパク質安定化混合剤（Pierce社 カタログ番号89806）を含む冷却したポリプロピレンプレートにピペットで取り、混合し、２つの１０μＬのアリコートを取り出し、プレートを−８０℃で凍結して、結合分析のために保存した。溶解物の希釈は、２工程で実施した。１０μＬの抽出物のアリコートを内包する９６ウェルプレートを、室温で解凍して、ＮＦ−κＢプローブとしての役割を果たす２ｎＭ核酸タグを有する０．１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ溶液４０μＬを添加して、軌道振とうによって４５０ｒｐｍ、室温で１０分間振とうした。それから、０．１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ０．０５％に懸濁されたせん断されたサケ精子ＤＮＡの溶液２７０μＬを添加して、ピペッティングにより軽く混合した。

リン酸Ｍｅｋ１検出分析における第１工程として、２．５μｇの抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体を、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中のプロテインＧビーズ（インビトロジェン社Dynabeads-Protein G (カタログ番号100-04D））にそれぞれ固定して、室温で約４５分間回転させた後、１％ＢＳＡ／０．０２％アジ化ナトリウムを抗体／ビーズ混合物に添加して、４℃で一晩回転させた。翌日、ビーズを沈殿させ、洗浄／ブロッキングし、１−２×２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴに再懸濁して、最初のストック濃度の半分の濃度となるように、９６ウェルのポリプロピレンプレート上に播種した。リン酸化Ｍｅｋ１結合分析は、２５μＬビーズおよび１００μＬの２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴを有する別のプレート上にて実施し、細胞溶解剤を添加するまで振とうした。結合分析のために、まずビーズを沈殿させ、緩衝剤を吸引し、次いで希釈された溶解剤１００μＬを各ウェルに添加して、プレートを室温で１時間振とうした。結合工程後、ビーズを４分間で沈殿させ、緩衝剤を吸引し、ＰＢＳＴ１５０μＬを添加した。プレートを、短時間振とうさせて、マグネット上で沈殿させ、２〜４回洗浄緩衝剤（１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄して結合していないタンパク質を除去した。最終洗浄後、ビーズは、０．０５％までＴｗｅｅｎ２０を追加したＩｇＧ溶離緩衝液（Pierce社カタログ番号21004）１５０μＬに再懸濁して、振とうしながら室温で５０分間インキュベートした。ビーズを沈殿させた後、溶離された混合液５０μＬを取り除き、２００ｍＭトリス塩基３０μＬに添加して、よく混合して、ＤＮＡ検出分析に移した。ｑＰＣＲのため、２．５μＬを、適切なプライマーおよびプローブ（アプライドバイオサイエンス社）とともにマスターミックス７．５μＬに移された。

選択的に、結合分析を核酸オリゴマー不存在下にて実施し、結合していないタンパク質の洗浄除去後に核酸オリゴマーを添加してもよい。抗体固定の代替方法によって、同等の結果が得られた：ストレプトアビジンの支持体上のビオチン−プロテインＧ（Pierce社）の固定、デスチオビオチン標識された抗体、切断可能なジスルフィド結合による抗体のビオチンへの結合およびマグネットストレプトアビジンＭ−２８０ビーズ（インビトロジェン社）へのビオチン化された抗体の固定。

結合分析は、全体のウェルに亘って測定されたリン酸化Ｍｅｋ１の量を正常化するため、抗トータルＭｅｋ１抗体を用いても実行した。抗リン酸化Ｍｅｋ分析は、文献公知のＢｒａｆ阻害剤を用いて確認した：ＢＡＹ−４３−９００６， ＰＬＸ−４７２０， Ｃｈｉｒ−２６５。

図３は、陰性コントロールとして試験したＣＩ−１０４０と、前記プロトコルを用いて、Ｂｒａｆに対するＢＡＹ−４３−９００６、ＰＬＸ−４７２０、Ｃｈｉｒ−２６５に関して得られたＩＣ_５０を示す。

６．３ 実施例３；リン酸化Ａｋｔ１細胞分析
図２に示すように、ＰＩＫ３ＣＡキナーゼは、２つの独立した経路、例えば共にＡｋｔをリン酸化するキナーゼ基質ＦＲＡＰ１（ｍＴＯＲのキナーゼドメイン）の直接活性、または「ＰＤＫ２」として文献公知のものおよびＰＤＰＫ１といった他のあまり研究されていないキナーゼによるシグナリングを媒介する。ＦＲＡＰ１およびＰＤＰＫ１は、それぞれ固有のリン酸化部位においてＡｋｔ１を活性化するため（ＦＲＡＰ１はＡｋｔ１キナーゼのアミノ酸４７３のセリンをリン酸化して、ＰＤＰＫ１はＡｋｔキナーゼのアミノ酸３０８のスレオニンをリン酸化する）、それぞれの経路の活性化は、それぞれのリン酸化部位に特異的な抗リン酸化抗体を用いて、分離して試験することができる。したがって、この細胞分析を用いて、Ａｋｔのリン酸化特異的部位を測定し、ＰＩＫ３ＣＡに対するもののみでなく、ＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１に対するものについても、化合物の阻害機構に関して調査した。細胞株Ｈｅｋ２９３を使用して、密度５ｅ５／ｍＬで播種される以外は、実施例１に記載されたプロトコルに従った。リン酸化Ａｋｔ１検出工程のため、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ａｋｔ１キナーゼのアミノ酸４７３でリン酸化されるセリン抗体を含むペプチドに対する抗体）を、ＦＲＡＰ経路からの阻害を測定するために使用し、抗リン酸化Ａｋｔ１（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ａｋｔ１キナーゼのアミノ酸３０８でリン酸化されるスレオニン抗体を含むペプチドに対する抗体）は、ＰＤＰＫ１経路からの阻害を測定するために使用した。抗トータルＡｋｔ１抗体を用いた結合分析は、またウェルに亘って測定されたリン酸化Ａｋｔ１の量を正常化するのと並行して実行した。

抗リン酸化Ａｋｔ１の細胞分析は、文献公知の選択的なＰＩＫ３ＣＡ阻害剤、例えばＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４、ワートマニンおよびＰＩＫ−９３ならびに文献公知のＰＤＰＫ１阻害剤、例えばＢＸ−７９５を用いて評価した。

図４は、ＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４およびＢＸ−７９５について、抗リン酸化Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）および抗リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）分析から得られたＩＣ_５０を示す。文献に確立されているように、細胞分析は、ＰＩ１０３がＦＲＡＰ１およびＰＤＰＫ１経路を通して、ほぼ等量のＩＣ_５０を有することを示し、これにより、ＰＩ１０３が選択的なＰＩＫ３ＣＡ阻害剤として働くことを示す。同様に、細胞分析は、ＺＳＴＫ−４７４およびワートマニンの双方が、ＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１経路を調査する各試験においてほぼ等量のＩＣ_５０を有することを示し、これは、ＺＳＴＫ−４７４およびワートマニンを選択的なＰＩＫ３ＣＡ阻害剤として確立した文献の記載と一致する。対照的に、ＰＤＰＫ１を特異的に阻害する文献公知の化合物であるＢＸ−７９５は、細胞分析において、ＦＲＡＰ１を通して選択的にＰＤＰＫ１を阻害することを示す（ＦＲＡＰ１に対するＢＸ−７９５のＩＣ_５０は、ＰＤＰＫ１に対する該化合物から得られたＩＣ_５０より非常に高い）。

以下の化合物について、抗リン酸化Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）細胞分析においても試験した：ＰＩＫ３ＣＧを阻害する文献公知の化合物ＴＧ−１００−１１５（ＰＩ３ＫＣのγアイソフォーム）；ＨＳＰ９０の阻害剤として既知のラジシコールおよびＡｋｔ１リン酸化の阻害剤として既知のトリシリビン。また、それぞれに関して得られた容量反応極性を図５に示す。ＢＸ−７９５およびＴＧ−１００−１１５に関する結果は、リン酸化Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）分析が、ＰＤＰＫ１およびＰＩＫ３ＣＧ阻害剤に対して感度が低いことを示す。ラジシコールに関する結果は、分析がＨＳＰ９０阻害に部分的に感度が高く、ｐＡｋｔ阻害剤トリシリビンは、ラジシコールと同様の用量反応曲線を表示することを示す。

トリシリビンおよびラジコールは、また抗リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）の細胞分析においても（図６）試験し、用量反応曲線は、両方の化合物が、Ｔｈｒ３０８のリン酸化を部分的のみ阻害することができることを示す。

６．４ 実施例４；ＰＩＫ３ＣＡリン酸化ＦＯＸＯ１細胞分析
この細胞分析において、Ａｋｔ１の直接的なキナーゼ基質である転写因子ＦＯＸＯ１（別名ＦＫＨＲ）のリン酸化を測定することによって、化合物のＡｋｔ１を阻害する能力に関して試験した。細胞株Ｈｅｋ２９３を使用して、濃度５ｅ５／ｍＬで播種した以外は、実施例１に記載されたプロトコルに従った。リン酸化ＦＯＸＯ１検出工程に関して、抗リン酸化ＦＯＸＯ（Ｔｈｒ２４）抗体（ＦＯＸＯ１転写因子のアミノ酸２４でリン酸化されたスレオニンに対する抗体）を使用し、また、ＮＦ−κＢに対する抗体を、ウェルに亘って測定されたリン酸化ＦＯＸＯ１の量を正常化して完全に捕らえるために使用した。

図７は、Ａｋｔ１阻害剤として既知のＧＳＫ−６９０６９３に関して、ならびにＰＩＫ３ＣＡおよびＰＤＰＫＩを阻害すると文献公知の化合物ＰＩ１０３およびＢＸ−７９５に関して、得られる用量反応曲線を示す。図７は、抗リン酸化ＦＯＸＯ１（Ｔｈｒ２４）分析が、ＰＩ１０３（７６２ｎＭのＩＣ_５０を示す）のようなＰＩＫ３ＣＡ阻害剤と比較して、例えばＧＳＫ−６９００６９３（１６５ｎＭのＩＣ_５０を示す）のようなＡｋｔ１阻害剤に高い感度があることを示す。したがって、ＰＩＫ３Ｃの上流阻害からの直接的なＡｋｔ１阻害の分化を可能とする。

したがって、実施例３および４に記載の分析は、図２に示すようなＰＩＫ３ＣＡ経路に働く、化合物の作用機構を調べることを可能とする、本発明の分析の一群を示すものである。

６．５ 実施例５；リン酸化ＡｕｒｋＡ細胞分析
この分析で、化合物のＡｕｒｏｒａ Ａの自己リン酸化能力への阻害能力について試験した。ＨｅＬａ細胞を、５ｅ６／ｍＬの濃度で１０ｃｍプレートに播種し、４０μＬリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を含む２ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ緩衝剤中（ギブコ社／インビトロジェン社）の検出可能なタンパク質（８μｇ）をコード化する発現プラズミドで形質転換して、３７℃で１８−２２時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理して、Ｍ３培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で停止させた。細胞を計数して、Ｍ３完全培地中に濃度５ｅ６ｍＬとなるように再懸濁し、５０，０００細胞／ウェル／５０μＬとなるように９６ウェルプレートに播種し、３７℃で４時間インキュベートした。

結合実験の前に実施されるビーズ調製として、プロテインＧビーズ（インビトロジェン社Dynabeads-Protein G（カタログ番号100-04D））を、１５ｍＬチューブ中で洗浄し、マグネット上で沈殿させ、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で再度洗浄した。次いでビーズを再懸濁し、１％ＢＳＡ／０．０２％アジ化ナトリウムを抗体／ビーズの混合物に添加し、一晩４℃で回転させた後、抗リン酸化Ａｕｒｏｒａ Ａ（Ｔｈｒ２８８）抗体を、１００μＬプロテインＧビーズ当り、抗体２．５μｇの比率で添加して、室温で約４５分間回転させた。ここに開示した分析の全てに関して、ビーズに対する抗体の適した比率が、複数の抗体濃度について試験して、未処理の細胞（リン酸化されたもの）に対する処理された細胞（標的タンパク質のリン酸化を阻害する特異的な阻害剤で処理したもの）について、最も高いシグナル比率を得られるような濃度を選択することによって実験的に決定した。

一晩インキュベーション翌日に、細胞を、Ｍ３中の被験化合物中で、３７℃で２時間インキュベートした。タンパク質抽出工程のため、培地をウェルから除去し、Ｍ−ＰＥＲ（Pierce社)／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＤＴＴ／１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（ロシュ社）抗タンパク分解酵素混合物／２５０ｎＭオカダ酸を含む抽出緩衝材５０μＬを添加して、プレートを冷所で３０分間、３０００ｒｐｍで振とうした。細胞は、２０分間、３０００ｒｐｍの条件で遠心分離機にて分離した。上清３０μＬを収集し、１０μＬの４×タンパク質安定化混合剤（Pierce社カタログ番号89806）を含む、冷却したポリプロピレンプレートにピペットで分注した。

溶解物の希釈を２工程で実施した。細胞抽出物を、ＮＦ−κＢプローブとしての役割を果たす核酸オリゴマー０．５ｎＭ及び８０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡの存在下で、１×ＰＢＳ／０／０５％Ｔｗｅｅｎ／０．１％ＢＳＡで最初に２倍に希釈し、約３０分間室温でインキュベートした。第２の希釈工程で、希釈された抽出物を、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／０．１％ＢＳＡおよび４０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ中にさらに７．５×希釈して、結果的に、最終希釈物として、０．０３ｎＭ核酸オリゴマーおよび４０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む、原品を１５倍希釈したものを得た。

ビーズを調製した翌日、また、ビーズを沈殿させ、洗浄し、ブロッキングして、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／２％ＢＳＡが２倍の体積になるように再懸濁し、半分の濃度となるように、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／２％ＢＳＡを包含する９６ウェルプレートに、１ウェル当り体積５０μＬを播種した。細胞溶解物５０μＬを、各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間振とうした。

結合反応後、ビーズを４分間で沈殿させ、緩衝剤を吸引し、ＰＢＳＴ１５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを振とうし、マグネット上で沈殿させ、結合していないタンパク質を取り除くため、２から４回ＰＢＳＴで洗浄して、結合していないタンパク質を除去した。最後の洗浄工程で、ビーズをマグネット上の新しいプレートに移した。最後の緩衝液をアスピレータで除去し、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＩｇＧ溶離緩衝液（Pierce社カタログ番号21004）１５０μＬを添加し、３０分間室温で振とうしながらインキュベートした。

選択的に、結合分析を核酸オリゴマーの不存在下で実施し、結合していないタンパク質を除去する洗浄工程後に核酸オリゴマーを添加してもよい。結合分析は、全体のウェルに亘って測定されるリン酸化ＡｕｒｋＡの量を正常化するため、抗Ａｕｒｏｒａ Ａ抗体を用いて実行してもよい。

ｑＰＣＲ検出工程のため、溶離液５０μＬを、新しい３８４ウェルのポリプロピレンプレートに分注した。ｐＨを中和するため、そこに中和緩衝剤（２００ｍＭトリスｐＨ９．４／０．０５％アジ化ナトリウム）３０μＬを添加した。中和した溶離液２．５μＬを、ｑＰＣＲ反応混合物（カスタムメイドのTaqMan（登録商標）マスターミックス（アプライドバイオシステムズ社））７．５μＬを含むＰＣＲプレートに移して、７９００リアルタイムＰＣＲ機器（アプライドバイオシステムズ社）を用いて示した。ＭＬＮ−８０５４（ＡｕｒｋＡ阻害剤として文献公知）、ＡＺＤ−１１５２ＨＱＰＡ（ＡｕｒｋＢ阻害剤として文献公知）およびＶＸ−６８０（ｐａｎ Ａｕｒｏｒａ阻害剤）に関するＩＣ_５０曲線を得た。

６．６ 実施例６；リン酸化Ｅｒｋ１細胞分析
この分析において、化合物のＭｅｋ１を阻害する能力に関して、実施例４に記載のプロトコルに従い、Ｅｒｋ１のリン酸化を測定することによって試験した。触媒的に不活性なＥｒｋ１−ＮＦκＢの検出可能なタンパク質をコード化するベクターで、Ａ３７５細胞を形質転換し、また、抗リン酸化Ｅｒｋ１（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体を結合分析に使用した。結合分析は、ウェル全体に亘って測定されるリン酸化Ｅｒｋ１の量を正常化するため、抗トータルＥｒｋ１抗体を用いて実施した。ＩＣ_５０曲線は、ＣＩ−１０４０（PD0325901）を等の文献公知のＥｒｋ１阻害剤に関するＩＣ_５０曲線を得た。

６．７ 実施例７；リン酸化Ｔｎｋ２細胞分析
この分析において、化合物のＴｎｋ２の（Ａｃｋ１としても知られる）自己リン酸化を阻害する能力に関して、実施例４に記載のプロトコルに従って試験した。Ｔｎｋ２−ＮＦκＢの検出可能なタンパク質をコード化するベクターで、Ｈｅｋ２９３細胞を形質転換して、結合反応において、抗リン酸化チロシン抗体をＴｙｒ２８４でＴｎｋ２のリン酸化を検出するために使用した。結合反応は、ウェル全体に亘って測定されるリン酸化Ｔｎｋ２の量を正常化するため、抗トータルＮＦκＢ抗体を用いて実施した。

６．８ 実施例８；リン酸化Ｓｒｃ細胞分析
この分析において、化合物のＳｒｃの自己リン酸化を阻害する能力に関して、実施例４に記載されたプロトコルに従って試験した。Ｓｒｃ−ＮＦκＢの検出可能なタンパク質をコード化するベクターで、Ｈｅｋ２９３細胞を形質転換して、結合反応において、抗リン酸化チロシン抗体を、Ｔｙｒ４１６でＳｒｃのリン酸化を検出するために使用した。結合反応は、ウェル全体に亘って測定されるリン酸化Ｓｒｃ１の量を正常化するため、抗トータルＳｒｃ抗体を用いて実施した。ＳＫＩ６０６（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ＣＧＰ−５２４２１、ＰＤ−１８０９７０およびＢＭＳ−３５４８２５（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を含む既知のＳｒｃ阻害剤に関するＩＣ_５０曲線を得た。

本明細書中で引用する全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照して援用し、各刊行物または特許出願を明示的かつ個別的に援用したのと同様の扱いとする。上記の発明の明確な理解のために、図と例を挙げて詳細に記載されているが、これらは添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の改変と変更態様がそれにされていることは、本発明の教示を考慮すれば当業者にとって明確である。

Claims (60)

1. ａ）標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む検出可能なタンパク質を；
   ｉ）目的の細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体；および
   ｉｉ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマー；
   と接触させる工程；ならびに
   ｂ）抗体を結合した検出可能なタンパク質に結合した、核酸オリゴマーの存在を検出する工程；を具え：
   工程（ｂ）における核酸オリゴマーの存在は、目的の細胞プロセスによるタンパク質の修飾の存在を示す、
   目的の細胞プロセスによって修飾されたタンパク質を検出する方法。
2. 検出可能なタンパク質を工程（ａ）の核酸オリゴマーと接触させる前に、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる、請求項１記載の方法。
3. 検出可能なタンパク質を工程（ａ）の核酸オリゴマーと接触させた後、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる、請求項１記載の方法。
4. 検出可能なタンパク質を、抗体および工程（ａ）の核酸オリゴマーに同時に接触させる、請求項１記載の方法。
5. 細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される、請求項１記載の方法。
6. 細胞プロセスはリン酸化である、請求項１記載の方法。
7. 標的タンパク質はキナーゼ基質である、請求項１記載の方法。
8. 修飾された標的タンパク質は、１以上の残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸抗体である、請求項７記載の方法。
9. 修飾された標的タンパク質は、１以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である、請求項７記載の方法。
10. 修飾された標的タンパク質は、１以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である、請求項７記載の方法。
11. 修飾された標的タンパク質は、１以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である、請求項７記載の方法。
12. 標的タンパク質はＧ、結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である、請求項１記載の方法。
13. 核酸相互作用モチーフはＤＮＡ結合ドメインである、請求項１記載の方法。
14. ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである、請求項１記載の方法。
15. 核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
16. 前記オリゴマーは、約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１記載の方法。
17. 細胞プロセスを調節する被験化合物を同定する方法であって、
    前記細胞プロセスは標的タンパク質を修飾するものであり、
    前記方法は、
    ａ）検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を、被験化合物と接触させる工程であって、前記検出可能なタンパク質は、標的タンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、工程；
    ｂ）検出可能なタンパク質を、
    ｉ）細胞プロセスにより修飾された標的タンパク質に特異的に結合する抗体；および
    ｉｉ）核酸相互作用モチーフと結合する核酸配列を含む核酸オリゴマー；
    と接触させる工程；ならびに
    ｃ）抗体と結合した検出可能なタンパク質に結合した、核酸オリゴマーの量を検出する工程；
    を具え、
    前記被験化合物の存在下で検出された、工程（ｃ）の結合核酸オリゴマー量の増加または減少は、前記化合物の不存在下において検出された結合核酸オリゴマーの量との比較により、被験化合物が細胞プロセスを調節していることを示す、細胞プロセスを調節する被験化合物を同定する方法。
18. 検出可能なタンパク質を工程（ｂ）の核酸オリゴマーと接触させる前に、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる、請求項１７記載の方法。
19. 検出可能なタンパク質を工程（ｂ）の核酸オリゴマーと接触させた後、検出可能なタンパク質を抗体と接触させる、請求項１７記載の方法。
20. 検出可能なタンパク質を、抗体および工程（ｂ）の核酸オリゴマーに同時に接触させる、請求項１７記載の方法。
21. 工程（ａ）は、検出可能なタンパク質を含む細胞の接触を具える、請求項１７記載の方法。
22. 細胞は、検出可能なタンパク質を一時的に発現する、請求項２１記載の方法。
23. 細胞は、検出可能なタンパク質を安定的に発現する、請求項２１記載の方法。
24. 細胞は、検出可能なタンパク質を構成的に発現する、請求項２１記載の方法。
25. 細胞は、検出可能なタンパク質を誘導発現する、請求項２１記載の方法。
26. 細胞プロセスは、アシル化、アセチル化、脱アセチル、ホルミル化、アルキル化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、酸化、還元、ヒドロキシル化、脱アミド化、カルボキシル化、ジスルフィド形成、プレニル化、糖化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、タンパク質分解、ラセミ化および異性化から選択される、請求項１７記載の方法。
27. 細胞プロセスはリン酸化である、請求項１７記載の方法。
28. 標的タンパク質はキナーゼ基質である、請求項２７記載の方法。
29. 修飾された標的タンパク質は、１以上のチロシン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化チロシン抗体である、請求項２８記載の方法。
30. 修飾された標的タンパク質は、１以上のセリン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化セリン抗体である、請求項２８記載の方法。
31. 修飾された標的タンパク質は、１以上のスレオニン残基でリン酸化されていて、抗体は抗リン酸化スレオニン抗体である、請求項２８記載の方法。
32. 標的タンパク質は、Ｇ結合タンパク質受容体、イオン・チャネルタンパク質、核内受容体タンパク質、転写制御因子、キナーゼ、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体または短鎖型可変部（ｓｃＦＶ）である、請求項１７記載の方法。
33. 核酸相互作用モチーフはＤＮＡ結合ドメインである、請求項１７記載の方法。
34. ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合ドメイン、ｃｒｏリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ｌａｃリプレッサーＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｌｅｘ−Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、Ｏｐａｑｕｅ−２ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＧＡ１ａ ＤＮＡ結合ドメインである、請求項１７記載の方法。
35. 核酸相互作用モチーフは、配列番号：５または配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１７記載の方法。
36. 前記オリゴマーは、約５０〜５００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１７記載の方法。
37. キナーゼ基質はＭｅｋ１であり、工程（ａ）が陽性コントロールサンプルの調製をさらに具え、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を、被験化合物の代わりにＢｒａｆ阻害剤と接触させる、請求項２８記載の方法。
38. Ｂｒａｆ阻害剤は、ＢＡＹ−４３−９００６、ＰＬＸ−４７２０、Ｃｈｉｒ−２６５から選択される、請求項３７記載の方法。
39. キナーゼ基質はＡｋｔ１であり、抗体はリン酸化したＡｋｔに結合する、請求項２８記載の方法。
40. 抗体はＳｅｒ４７３またはＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する、請求項３９記載の方法。
41. 抗体はＴｈｒ３０８でリン酸化したＡｋｔ１に結合する、請求項４０記載の方法。
42. 抗体はＳｅｒ４７３でリン酸化したＡｋｔ１に結合する、請求項４０記載の方法。
43. キナーゼ基質はＦＲＡＰ１またはＰＤＰＫ１であり、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具え、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を、被験化合物の代わりにＰＩＫ３ＣＡ阻害剤と接触させる、請求項２８記載の方法。
44. ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤はＰＩ１０３、ＺＳＴＫ−４７４、ワートマニンおよびＰＩＫ−９３からから選択される、請求項４３記載の方法。
45. キナーゼ基質はＡＫＴ１であり、工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具え、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を、被験化合物の代わりにＰＤＰＫ１、ＦＲＡＰ１またはｍＴＯＲ阻害剤と接触させる、請求項２８記載の方法。
46. ＰＤＰＫ１阻害剤はＢＸ−７９５である、請求項４５記載の方法。
47. キナーゼ基質はＦＯＸＯ１であり、抗体はリン酸化したＦＯＸＯ１と結合する、請求項２８記載の方法。
48. 抗体はＴｈｒ２４でリン酸化したＦＯＸＯ１と結合する、請求項４７記載の方法。
49. 工程（ａ）は陽性コントロールサンプルの調製をさらに具え、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を、被験化合物の代わりにＡＫＴ１阻害剤と接触させる、請求項２８記載の方法。
50. Ａｋｔ１阻害剤はＧＳＫ−６９０６９３である、請求項４９記載の方法。
51. 少なくとも２種類の濃度の被験化合物と、検出可能なタンパク質を含む細胞または細胞溶解物を接触させて、被験化合物のＩＣ_５０を算出する工程をさらに具える、請求項１７記載の方法。
52. 前記被験化合物の存在下において検出した工程（ｃ）の結合核酸オリゴマーの量の、前記被験化合物の不存在下において検出した結合核酸オリゴマーの量に対する増加は、被験化合物が細胞プロセスに悪影響を及ぼしたことを示す、請求項１７記載の方法。
53. 被験化合物の存在下において検出した工程（ｃ）の結合核酸オリゴマーの量の、前記被験化合物の不存在下において検出した結合核酸オリゴマーの量に対する減少は、被験化合物が細胞プロセスを阻害したことを示す、請求項１７記載の方法。
54. 核酸オリゴマーは（ａ）ＰＣＲ増幅配列である第１の核酸配列、および（ｂ）核酸相互作用モチーフに結合する第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は第２の核酸配列と非相同性である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 検出可能なタンパク質に結合する核酸オリゴマーのｑＰＣＲ増幅をさらに具える、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 核酸オリゴマーは、放射性標識、蛍光標識またはビオチン化される、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 抗体は、マルチウェルプレート上に固定される、請求項１〜５６のいずれか１項に記載された方法。
58. （ａ）検出可能なタンパク質を含む細胞であって、前記検出可能なタンパク質が細胞プロセスによって修飾されたタンパク質および核酸相互作用モチーフを含む、細胞；ならびに
    （ｂ）核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマー、
    を含むキット。
59. （ｃ）目的の細胞プロセスによって修飾された標的タンパク質に結合する抗体をさらに含む、請求項５８記載のキット。
60. 細胞プロセスはリン酸化である、請求項５８記載のキット。

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