CN109709080B

CN109709080B - 一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用

Info

Publication number: CN109709080B
Application number: CN201811139409.6A
Authority: CN
Inventors: 李敏勇; 周育斌; 杜吕佩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109709080A

Abstract

本发明属于蛋白质结构检测技术领域，具体涉及一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。本发明单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以广泛用于探测细胞中蛋白质的寡聚状态，可以准确反映胞内蛋白的真实状态。

Description

一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用

技术领域

本发明属于蛋白质结构检测技术领域，具体涉及一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。

背景技术

微管蛋白(MT)是高度动态的聚合物，在细胞分裂和细胞内运输等生物过程中发挥重要作用。微管蛋白细胞骨架由于蛋白调节子(包括微管相关蛋白(MAPs)和分子马达)的协调作用，以空间和时间受控的方式经历动态变化。值得注意的是，微管加端追踪蛋白(+TIPs)含有高度保守的SxIP模体，其特异性结合末端结合(EB)蛋白，因此可用于追踪微管加端。微管蛋白翻译后修饰(PTM)，例如去酪氨酸，乙酰化，聚谷氨酰化和聚甘氨酸化，使得微管在细胞和生物体内显示出多样化的功能。微管蛋白(MT)和翻译后修饰的失调可能导致基因组不稳定和细胞周期停滞，并常常与人类疾病相关，如癌症，心血管疾病和神经疾病。可视化微管蛋白(MT)的时间和空间分和翻译后修饰的动力学对于理解MT在细胞生长和分化过程中在各种细胞类型中的功能是至关重要的。

迄今为止，已经应用了多种技术来鉴定活细胞中蛋白质自缔合的状态，包括福斯特

共振能量转移(FRET)技术，双分子荧光互补(BiFC)技术，荧光相关光谱(FCS)技术和荧光波动光谱(FFS)技术。然而，FRET和BiFC更适合区分蛋白质从单体到寡聚体的聚集状态，而不提供关于其寡聚体状态的具体信息。此外，FCS和FFS的应用目前受限于灵敏度低，复杂的仪器和复杂的图像后处理。亟需直接读出的简单方法：可以在实验室中常规使用，同时避免费力的蛋白质表达和纯化程序，以帮助定量表征细胞内的蛋白质。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。本发明利用EB1蛋白共有的SxIP模体融合不同聚集状态的蛋白时，其显示的MT标记(MT/cytosol的比例来量化)与其聚集的状态成正比例关系，在活细胞内可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种光控示踪剂，所述光控示踪剂包含单体荧光蛋白和SxIP模体。

优选的，所述SxIP模体为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1的SxIP模体。

优选的，所述腺瘤性息肉病菌APC的SxIP模体为APC2786-2824，氨基酸序列如SEQID NO：1所示；肌动蛋白DST的SxIP模体为DST_5469-5485或DST_5474-5485；所述DST_5469-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述DST_5474-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述基质相互作用分子1的SxIP模体为STIM1_630-685或STIM1_630-660；所述STIM1_630-685氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述STIM1_630-660氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选的，所述单体荧光蛋白为mCherry、GB1或GFP。

本发明目的之二，提供所述光控示踪剂的构建方法：包括以下步骤：

(1)通过标准PCR扩增SxIP模体；

(2)在pmCherry-C1/下游的BspEI和EcoRI/BamHI位置插入所扩增的SxIP模体，得到mCherry(mCh)标记的SxIP模体，即得。

本发明目的之三，提供所述示踪剂探测蛋白质的低聚状态的方法，包括以下步骤：

(1)构建如权利要求1所述的光控示踪剂；

(2)将待测蛋白质与光控示踪剂进行融合；

(3)通过测定荧光信号比率Fcomet/Fcytosol，代入以下公式：

所得n值即为待测蛋白质的低聚状态数目。

优选的，步骤(2)具体步骤为：将待测蛋白质插入到光控示踪剂的单体荧光蛋白和SxIP模体之间。

本发明目的之四，提供所述光控示踪剂在探测蛋白质的低聚状态中的应用。

本发明目的之五，提供所述光控示踪剂在筛选控制蛋白质二级结构的关键结构子的应用。

本发明目的之六，提供所述光控示踪剂在检测触发蛋白质单体到寡聚体转变中的应用。

本发明原理：微管加端末端蛋白(+TIPs)利用SxIP模体通过与中心衔接蛋白(末端结合蛋白1，EB1)直接相互作用追踪延伸微管的末端，末端结合蛋白1(EB1)包含N-末端微管蛋白结合钙调蛋白同源性(CH)结构域，是一个能够招募+TIPs的中心接头和C末端EB同源(EBH)结构域。单独表达时，单体荧光蛋白(mCherry)标记的SxIP模体几乎不能跟踪微管末端。当融合不同聚集状态的蛋白时，由于聚集蛋白触发的SxIP模体寡聚化会增加对微管蛋白加端的亲和力，此时，其显示的对微管的标记(微管荧光强度/胞质中荧光强度的比例来量化)与其聚集的状态成正比例关系，在活细胞内可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)蛋白质的寡聚状态通常在体外用生物化学或生物物理学分析方法进行研究，这涉及繁琐的步骤去纯化靶标，忽略了细胞内环境的复杂性，因而不能准确实时反映细胞内蛋白的寡聚状态。本发明单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以广泛用于探测细胞中蛋白质的寡聚状态，可以准确反映胞内蛋白的真实状态。

(2)荧光能量转移(FRET)检测经常用来测量亚细胞同源寡聚化，但是它往往不能区分二聚体和更高级寡聚体。本发明单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态，并且定量剖析完整细胞内的蛋白质在其原生环境中的未知结构。

附图说明

图1源自APC，肌动蛋白(DST或MACF2)和STIM1的EB1结合SxIP模体与光交换部分CRY2-PHR(氨基酸1-498)融合以产生19个OptoTIP变体(V1-V19)。APC，腺瘤性结肠息肉病(APC)；MTBD，微管结合结构域；DST，dystonin；GAS2，生长抑制特异性2；STIM1，基质相互作用分子1；SP，信号肽；EF-SAM，EF-hand和不育的α模体；TM，跨膜结构域；CC1，卷曲螺旋；SOAR或CAD，STIM1 Orai激活区或CRAC激活结构域；ID，抑制域；PS，脯氨酸-丝氨酸富集序列；K，多元富含赖氨酸的结构域。

图2表达与mCh-SxIP融合的寡聚蛋白的HeLa细胞的共聚焦图像。在顶部显示了指示的蛋白质的三维结构：单体mCherry(mCh)，二聚谷胱甘肽S-转移酶(GST)，三聚耐盐蛋白3(AtHAL3)和四聚体DsRed。

图3SxIP作为融合标签来诱导彗星形成并监测蛋白质的寡聚状态(与图4相关)。比例尺，5微米。(a-d)表示与mCh-SxIP-V2融合的蛋白的HeLa细胞的代表性共焦图像(DST5469-5485)。寡聚蛋白通过与内源性EB1相互作用追踪微管加端。低聚物(三聚体或四聚体)的高级蛋白表现出更强的彗星强度或更长的MT彗星。对，MT荧光强度超过胞质荧光强度的量化。从至少16个细胞中的4-6个感兴趣的区域获得数据，并以平均值±s.e.m表示。(e)定量研究中测定的蛋白质的彗星-胞质溶胶荧光比率(Fcomet/Fcytosol)，以条形图表示。数据来自至少16个细胞的4-6个感兴趣区域，并以平均值±标准误表示。

图4在HeLa细胞中表达的MT彗星强度与SxIP融合蛋白的mCherry信号的胞质强度的比率的定量。

图5左图，描绘使用雷帕霉素诱导mCh-FKBP-FRB-SxIP二聚化或mCh-FRB-FKBP-SxIP四聚化的用途；右图为用1μM雷帕霉素处理之前和之后转染的HeLa细胞的荧光图像。

图6定量中所示的代表性图像的荧光信号的彗星对胞质溶胶比率。

图7a左侧，与mCh-SxIP融合的蓝光诱导型二聚化(iLID/sspB)和四聚化(CRY21-498)系统的示意图；在蓝光照射之前和之后(60秒，470nm，40μW/mm2)的转染的HeLa细胞的右图，代表性图像。

图7b所示代表性图像的荧光信号的彗星对胞质溶胶比的定量。

图8荧光信号的彗星对胞质溶胶比率(以Log10标度)对所示蛋白质的寡聚状态作图。两个变量之间呈正相关。

图9实时评估突变或截短对p53寡聚化的影响。

(a)人p53(上图)的域结构和p53四聚化域(TD；PDB条目：1C26)的3D结构。TAD，激活域；DBD，DNA结合结构域；REG，监管领域。

(b)作为自组装四聚体结合DNA的p53 DNA结合结构域(DBD)的3D结构(单位A-D；PDB输入：3KMD)。卡通图下面显示了结合的DNA双链体的核苷酸序列。(c)在研究中测定的p53变体的Fcomet/Fcytosol比率的定量。虚线表示对应于组装为单体，二聚体或四聚体的蛋白质的标准值。从三个独立实验中选择至少15个细胞。数据显示为平均值±标准误。(d-f)表达与SxIP-V2融合的NES-mCh-p53变体(DST5469-5485)的HeLa细胞的代表性共焦图像。加入源自cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂的NES以最小化p53变体的核积累。(d)WT和突变型p53。已知L330P消除TD结构并将p53保持为单体2；而据报道S392E增强p53四聚化3。R248Q突变倾向于引起p53聚集4,5。(e)p53截短或缺失变体。(f)在不存在或存在同源DNA双链体的情况下的p53 DBD。共聚焦显像前6小时，将mCh-DBD-SxIP转染的HeLa细胞与10μgDNA寡聚体在Lipofectamine 3000存在下共温育。所有比例尺条，5μm。

图10实时评估人类HSF1截短的寡聚状态。

(a)HSF1的域名组织。529个残基的HSF1蛋白包含N末端DNA结合结构域，亮氨酸拉链区1-3(LZ1-3，也称为HR-A/B：七肽重复区A和B)，α(RD)，亮氨酸拉链结构域4(LZ4，也称为HR-C)和C末端调控结构域(CTAD)。LZ1-3和LZ4之间分子间卷曲螺旋相互作用的弱化可引发HSF1的单体-四聚体转换。

(b)作为同源三聚体的HSF1同系物CtSkn7的晶体结构(PDB条目：5D5Z)。

(c)在研究中测定的HSF1变体的Fcomet/Fcγ比值的定量。虚线表示与组装为单体，二聚体或三聚体的蛋白质对应的标准值。从三个独立实验中选择至少27个细胞。数据显示为平均值±标准误。(d)表达与mCherry-HSF1截短变体融合的SxIP-V2的HeLa细胞的代表性共焦图像。所有的比例尺，5微米。

图11(–a-d)表征的低聚状态p53截断(–a-b)和突变(–c-d)与mCh-SxIP融合。(a)研究中使用的p53和截短变体的结构域。(c)表达WT或突变体p53的HeLa细胞的代表性共焦图像。(b，d)在用所示的p53变体转染的HeLa细胞中对Fcomet/Fcytosol细胞溶胶的定量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明涉及相关氨基酸序列，如下表1所示。

表1不同氨基酸序列

本发明涉及的相关引物序列，如下表2所示。

实施例一：单体荧光蛋白标记的SxIP模体用于探测单个细胞中的蛋白质寡聚状态。

本发明技术人员发现一个低聚但不是单体的SxIP模体能跟踪MT加末端，因此本发明探索彗星形成的程度是否可以被利用作为方便的读数来确定蛋白质在细胞中的寡聚状态。为了验证这个想法，本发明将来自DST(图1中的V2)的17聚体SxIP模体标记为一组充分表征的单体，二聚体，三聚体或四聚体蛋白质(图2和图3)。

SxIP标记的构建体，编码具有不同寡聚状态的蛋白质(单体：mCherry，GFP，GB1；二聚体：GST，GCN4，STIM1343-448(SOAR)；三聚体：AtHAL3，OsHAL3，HSF1121-210和Tetramer：DsRED，Dronpa(145N)，p53324-356)以代替OptoTIP中的CRY2(mCh-CRY2-SxIP-V2)。

雷帕霉素诱导的二聚化(FKBP-FRB)和四聚化(FRB-FKBP)构建体的构建方法：

1.1pET3a-FKBP-FRB和pET3a-FRB-FKBP来自TomonaoInobe实验室(ref:DOI:10.1016/j.jbiosc.2015.12.004)

1.2通过标准PCR扩增HindIII-FKBP-FRB-Xhol和HindIII-FRB-FKBP-Xhol。

1.3将扩增序列插入修饰的pmCherry-C1中。

对于光诱导的SxIP模体的iLID/sspB二聚化，从Venus-iLID-CAAX和MBP-sspB(Addgene#60411和#60409)扩增iLID和sspB。通过连接由mCh-iLID-SxIP和P2A-mCh-sspB-SxIP组成的扩增片段，使用HiFi DNA组装方法产生P2A形式mCh-iLID-SxIP-P2A-mCh-sspB-SxIP。

接下来观察了彗星形成的程度(量化为F_comet/F_cytosol：彗星强度与周围细胞质荧光强度的比率；图4)，并观察到彗星形成与蛋白质低聚化之间的正相关(图3)。为了更严格地验证在相同细胞内的这种相关性，本发明进一步将DST SxIP模体与建立在FK506结合蛋白(FKBP)和mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合结构域的(FRB)上的化学诱导型异源化系统融合。当以单链多肽共价连接时，FKBP-FRB融合蛋白发生单体—二聚体转变；而FRB-FKBP嵌合体在加入雷帕霉素后表现出单体—四聚体转变。当附着到两个嵌合体中的任一个时，mCherry标记的SxIP显示雷帕霉素诱导的MT加上末端跟踪(图5)，彗星强度与蛋白质的寡聚状态正相关(图6)。光诱导多聚体系(包括由iLID和sspB47组成的光学二聚体以及上述基于CRY2的光可激活低聚体系(图7)独立证实了类似的趋势。通过绘制十几个测试蛋白质(对数尺度)的彗星强度与其已知寡聚体状态的关系，可以观察到两个变量(图8)之间的线性关系。这一发现明确确定了使用单体荧光蛋白标记的SxIP模体区分以单体，二聚体，三聚体或四聚体形式组装的蛋白质的可行性。

Fcomet/Fcytosol比率(mCh-[Protein]-SxIP信号的彗星-胞质溶胶比率)与测定蛋白的寡聚状态之间的关系。EB1在调节+TIP相互作用网络的动态过程中发挥着核心作用。它含有N-末端calponin同源(CH)结构域(与微管结合)，独特的C-末端EB同源性(EBH，识别来自结合配偶体如APC，DST和STIM1的SxIP基序)和EEY/F基序(结合α-微管蛋白和CLIP170的CAG-Gly基序)。因此，带有SxIP基序的蛋白质可以通过与EB16的EBH结构域物理相互作用而被募集到微管加端。以下等式(1-3)描述了mCh-[蛋白质]-SxIP(缩写P)与MT末端(MT)的结合：

[P]＝[mCh-Protein-SxIP],[MT]＝[Tubulin],K_d＝Dissociation constant

如果P是单体蛋白(n＝1，n代表寡聚状态)：MT-结合的mCh-[蛋白质]-SxIP的分数(θ)可以表示为(等式4)，

由于SxIP-EB1和EB1-MT共享相似的结合机制，它们的解离常数(Kd1和Kd2)已被报道落入相似的范围，具有可比较的值。已显示含SxIP的肽与EB1化学计量比为1：1，解离常数(Kd1)范围为0.5μM至10μM(基于来自APC和MACF的SxIP基序)。对于EB1与MT的结合，解离常数(Kd2)被确定为～10-20μM13。在活细胞中，细胞内微管蛋白([MT])和EB1([EB1])的浓度分别为10～20μM14～16和0.25～2μM17～19。考虑到[MT]通常小于Kd2，单体mCh-[蛋白]-SxIP的MT结合分数(θ[P-EB1-MT])应小于0.5(方程式5)。因此，也被表示为比率[边界]/分数(未绑定)，也被表示为θ[P-EB1-MT]/(1-θ[P-EB1-MT])，预计不大于1)。

在实验上，测量单体mCh-[蛋白]-SxIP的彗星对胞质溶胶荧光比(Fcomet/Fcytosol；与分数(结合)/分数(未结合)成比例)，其未显示明显的MT加末端跟踪。

在共聚焦显微镜下，单体mCh-[蛋白质]-SxIP显示mCherry信号的均匀胞质分布，没有MT尖端跟踪(或彗星形成)。荧光信号比率(Fcomet/Fcytosol)可以被认为是分数(结合)/分数(未结合)。本发明Fcomet/Fcytosol的测量值为1.0，对应于log[Fcomet/Fcytosol]为0。本发明对单体mCh-[蛋白]-SxIP的观察也与先前的报道一致，其中单体EB1或SxIP基序未显示MT结束加追踪，而二聚化可促进其MT结束追踪。

如果P呈现低聚状态并且以非合作方式(n>1)与EB1/MT相互作用：寡聚mCh-[蛋白质]-SxIP如下结合于MT：

MT-结合的mCh-[蛋白质]-SxIP的分数(θ)：

比率(分数(结合)/分数(未结合))和低聚状态(n)之间的对数关系表示为：

据报道，二聚体或寡聚体SxIP与EB1的结合亲和力比单体SxIP10强100-1000倍。因此，Kd1*Kd2被认为是“Kd2*[EB1]n，因此可以忽略(当n>1时)。等式(13)因此可以被转换和简化，

Kd₁*Kd₂<<Kd₂*[EB1]ⁿ n>1 (14)

a＝Log[MT] b＝Log[Kd₂]

基于方程(16)，分数(结合)/分数(未结合)(以Log10标度)和低聚状态(n)之比呈线性关系(a为斜率)。

实验上，我们已经广泛地检测了十几种已知寡聚体状态的蛋白质的彗星-胞质溶胶荧光信号(Fcomet/Fcytosol；理论上相当于分数(结合)/分数(未结合))。荧光信号的彗星对胞质溶胶比率(以Log10标度)相对于所示蛋白质的寡聚状态绘图确实表现出线性关系(方程式17)。斜率确定为0.21。这些结果明显证明了使用上述简单的数学模型来解释所获得的实验数据。

K＝0.21；n表示低聚状态的数目，n＝1,2,3或4

基于在尼康共聚焦显微镜和DeltaVision成像工作站上的广泛测试，SxIP与感兴趣的蛋白质的融合，随后方便地记录Fcomet/Fcytosol，可以快速区分装配成单体，二聚体，三聚体和四聚体的蛋白质。由于缺乏足够的分辨率和灵敏度，该测定未能区分四聚体和更高级寡聚体(n>4)。超分辨率显微镜可能更适合满足这一更苛刻的要求。值得注意的是，倾向于破坏或改变MT动力学的蛋白质可能不适用于该测定。此外，通过使用SxIP融合策略不能区分具有无序聚集的错误折叠的蛋白质(例如，淀粉样蛋白-β，α-突触核蛋白和朊病毒)。

实施例二：单体荧光蛋白标记的SxIP模体用于评估人类p53或热休克转录因子1(HSF1)中的突变和截短将如何影响其二级结构

为了产生p53-SxIP和HSF1-SxIP融合变体，使用KOD热启动DNA聚合酶分别扩增一系列来源于p53和HSF1的截短的或缺失的片段，然后在HindIII和Xhol处插入mCh-SxIP-V2主链。通过使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed Mutagenesis试剂盒引入p53中的突变。

本发明接下来试图应用这一策略来评估人类p53(图9)或热休克转录因子1(HSF1；图10)中的突变和截短将如何影响其二级结构，由于缺乏有力的工具，迄今为止尚未系统地在活细胞中被探究。在生成的所有p53-SxIP构建体中，N末端转录激活结构域(TAD)或DNA结合结构域(DBD)结构域未能诱导彗星形成并因此作为单体存在(图11和图9)。相反，与SxIP融合的四聚化结构域(TD)由于其四聚体结构而引发明显的彗星形成(图9)。其他带有TD的截短的p53变体，以及野生型(WT)p53，都表现出不同程度的彗星形成，如体外研究报道结果：可能是由于它们的二聚体或混合寡聚体装配。当TD破坏性突变L330P⁵⁰被引入p53时，本研究观察到由于TD的四聚体组装而受损的彗星形成消失。相反，p53调节结构域(REG)中的磷酸化模拟突变S392E⁵¹似乎稳定了四聚体构型的p53(图11)。最有趣的是，当本发明用含有其同源DNA双链体的脂质体转染表达DBD的HeLa细胞时，根据相应条件下的彗星强度(图11和图9)。除了经历了单体—三聚体转变(图11)之外，单体HSF1-DBD与其同源DNA复合时也可以看到类似的情况。因此，单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以广泛地扩展到筛选控制给定蛋白质的二级结构的关键结构决定子，并且报告触发单体到寡聚体转变的分子事件。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用

<130>

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

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His Leu Ala Gly Lys Lys Ala Val Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ser Ile

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<212> PRT

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Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

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225 230 235

<210> 8

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

1 5 10 15

Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln

20 25 30

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

50 55

<210> 9

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser

210 215

<210> 10

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn

1 5 10 15

Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu

20 25 30

Arg

<210> 11

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Pro Glu Ala Leu Gln Lys Trp Leu Gln Leu Thr His Glu Val Glu Val

1 5 10 15

Gln Tyr Tyr Asn Ile Lys Lys Gln Asn Ala Glu Lys Gln Leu Leu Val

20 25 30

Ala Lys Glu Gly Ala Glu Lys Ile Lys Lys Lys Arg Asn Thr Leu Phe

35 40 45

Gly Thr Phe His Val Ala His Ser Ser Ser Leu Asp Asp Val Asp His

50 55 60

Lys Ile Leu Thr Ala Lys Gln Ala Leu Ser Glu Val Thr Ala Ala Leu

65 70 75 80

Arg Glu Arg Leu His Arg Trp Gln Gln Ile Glu Ile Leu Cys Gly Phe

85 90 95

Gln Ile Val

<210> 12

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Leu Ala Thr Thr Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asn Phe Val Ile Thr Asp

1 5 10 15

Pro Arg Leu Pro Asp Asn Pro Ile Ile Phe Ala Ser Asp Ser Phe Leu

20 25 30

Gln Leu Thr Glu Tyr Ser Arg Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Cys Arg

35 40 45

Phe Leu Gln Gly Pro Glu Thr Asp Arg Ala Thr Val Arg Lys Ile Arg

50 55 60

Asp Ala Ile Asp Asn Gln Thr Glu Val Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Thr Lys Ser Gly Lys Lys Phe Trp Asn Val Phe His Leu Gln Pro Met

85 90 95

Arg Asp Tyr Lys Gly Asp Val Gln Tyr Phe Ile Gly Val Gln Leu Asp

100 105 110

Gly Thr Glu Arg Leu His Gly Ala Ala Glu Arg Glu Ala Val Cys Leu

115 120 125

Ile Lys Lys Thr Ala Phe Gln Ile Ala Glu Ala Ala Asn Asp Glu Asn

130 135 140

Tyr Phe

145

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ser Ser Pro Lys Arg Pro Lys Leu Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Trp Leu

1 5 10 15

Val Asp Asn Ser Phe Thr Pro Tyr Leu Val Val Asp Ala Thr Tyr Leu

20 25 30

Gly Val Asn Val Pro Val Glu Tyr Val Lys Asp Gly Gln Ile Val Leu

35 40 45

Asn Leu Ser Ala Ser Ala Thr Gly Asn Leu Gln Leu Thr Asn Asp Phe

50 55 60

Ile Gln Phe Asn Ala Arg Phe Lys Gly Val Ser Arg Glu Leu Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Met Gly Ala Ala Leu Ala Ile Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Asp Gly

85 90 95

Val Met Phe Glu Pro Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Leu Asn Ile Gly

100 105 110

<210> 14

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

20 25 30

Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys

35 40 45

Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val

50 55 60

Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala

85 90 95

Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Met Gly Leu Trp

100 105 110

His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe

115 120 125

Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His

130 135 140

Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn

145 150 155 160

Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys

165 170 175

Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu

180 185 190

Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln

195 200

<210> 15

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser

1 5 10 15

Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu

20 25 30

Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu

35 40 45

Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu

50 55 60

Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln

65 70 75 80

Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Met

85 90 95

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

100 105 110

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

115 120 125

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

130 135 140

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

145 150 155 160

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

165 170 175

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

180 185 190

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

195 200

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggaagcttg gaggtagcat ggaggagccg cagtcagatc ct 42

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cggctcgagg tctgagtcag gcccttctgt ctt 33

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cggaagcttg gaggtagcaa tctccgcaag aaaggggagc ct 42

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cggctcgaga ccctttttgg acttcaggtg gct 33

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cggaagcttg gaggtagcga tggagaatat ttcacccttc agatccgt 48

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cggctcgagc ccagcctggg catccttgag 30

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cggaagcttg gaggtagcga agacccaggt ccagatgaag ct 42

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgggaattct tactcgagtg gctggggaga ggagctggt 39

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cggaagctta tggatctgcc cgtgggcccc 30

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cggaagctta gtgtgtccac cctgaagagt gaa 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cggaagcttc tgatgctgaa cgacagtggc tca 33

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cggaagcttg aaaagtgcct cagcgtagcc tgc 33

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cggctcgagt atgtcttcac tcttcagggt gga 33

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cggctcgagg gggatctttc tcttcacccc cag 33

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cggctcgagg tccaggcagg ctacgctgag gca 33

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cggctcgagg ctgaacaggt ccagcagggc act 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cggctcgagg gagacagtgg ggtccttggc ttt 33

Claims

1.一种光控示踪剂，其特征在于，所述光控示踪剂包含单体荧光蛋白和SxIP模体；其中，所述SxIP模体为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1的SxIP模体。

2.根据权利要求1所述光控示踪剂，其特征在于，所述腺瘤性息肉病菌APC的SxIP模体为APC_2786-2824，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；肌动蛋白DST的SxIP模体为DST_5469-5485或DST_5474-5485；所述DST_5469-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述DST_5474-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述基质相互作用分子1的SxIP模体为STIM1_630-685或STIM1_630-660；所述STIM1_630-685氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述STIM1_630-660氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1所述光控示踪剂，其特征在于，所述单体荧光蛋白为mCherry、GB1或GFP。

4.根据权利要求1所述光控示踪剂的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)通过标准PCR扩增SxIP模体；

(2)在pmCherry-C1/下游的BspEI和EcoRI/BamHI位置插入所扩增的SxIP模体，得到mCherry标记的SxIP模体，即得。

5.一种利用权利要求1所述示踪剂探测蛋白质的寡聚状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建如权利要求1所述的光控示踪剂；

(2)将待测蛋白质与光控示踪剂进行融合；

(3)通过测定荧光信号比率Fcomet/Fcytosol，代入以下公式：

所得n值即为待测蛋白质的寡聚状态数目。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤为：将待测蛋白质插入到光控示踪剂的单体荧光蛋白和SxIP模体之间。

7.根据权利要求1所述光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。

8.根据权利要求1所述光控示踪剂在筛选控制蛋白质二级结构的关键结构子的应用。

9.根据权利要求1所述光控示踪剂在检测触发蛋白质单体到寡聚体转变中的应用。