CN109557315B

CN109557315B - 一种光控微管示踪剂及其应用

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Publication number: CN109557315B
Application number: CN201811139213.7A
Authority: CN
Inventors: 李敏勇; 周育斌; 杜吕佩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109557315A

Abstract

本发明属于蛋白质结构检测技术领域，具体涉及一种光控微管示踪剂及其应用。所述光控微管示踪剂包括mCherry标记的光敏组件CRY2_1‑498，微管蛋白结合结构域或微管加端末端追踪蛋白；所述CRY2_1‑498的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明示踪剂能够实现在高时空分辨率下以可逆的方式跟踪和操纵MT细胞骨架以及MT加端，并且还可进一步用于评估单个细胞中的蛋白质—蛋白质相互作用，蛋白质与药物间相互作用和实时检测细胞中酶功能。

Description

一种光控微管示踪剂及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质结构检测技术领域，具体涉及一种光控微管示踪剂及其应用。

背景技术

微管蛋白(MT)是高度动态的聚合物，在细胞分裂和细胞内运输等生物过程中发挥重要作用。微管蛋白细胞骨架由于蛋白调节子(包括微管相关蛋白(MAPs)和分子马达)的协调作用，以空间和时间受控的方式经历动态变化。值得注意的是，微管加端追踪蛋白(+TIPs) 含有高度保守的SxIP模体，其特异性结合末端结合(EB)蛋白，因此可用于追踪微管加端。微管蛋白翻译后修饰(PTM)，例如去酪氨酸，乙酰化，聚谷氨酰化和聚甘氨酸化，使得微管在细胞和生物体内显示出多样化的功能。微管蛋白(MT)和翻译后修饰的失调可能导致基因组不稳定和细胞周期停滞，并常常与人类疾病相关，如癌症，心血管疾病和神经疾病。

可视化微管蛋白(MT)的时间和空间分布和翻译后修饰的动力学对于理解MT在细胞生长和分化过程中在各种细胞类型中的功能是至关重要的。目前，现存的用于检测微管蛋白细胞骨架及其动力学的工具包括荧光微管蛋白蛋白的异位表达，使用固定细胞的基于抗体的免疫染色，共价标记微管蛋白的荧光共轭化学试剂。尽管如此，微管蛋白的过表达或化学修饰倾向于干扰宿主微管蛋白(MT)聚合，而免疫染色需要使用固定的细胞而不是活细胞。能实时检测MT动态与最小化的宿主细胞扰动的方便方法尚待开发。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种微管蛋白示踪剂。该示踪剂能够实现在高时空分辨率下以可逆的方式跟踪和操纵MT细胞骨架以及MT加端，并且还可进一步用于评估单个细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质与药物间相互作用和实时检测细胞中酶功能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种光控微管蛋白示踪剂，包括mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498，微管蛋白结合结构域或微管加端末端追踪蛋白；所述CRY2_1-498的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述微管蛋白结合结构域与mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498融合得OptoMT 微管蛋白示踪剂；所述微管蛋白结合结构域为CLIP170，末端结合蛋白1-EB1，CAMSAP1，或CAMSAP2。

进一步优选的，所述微管蛋白结合结构域为CLIP170_129-350，氨基酸序列如SEQ IDNO： 2所示，末端结合蛋白1-EB1_1-191，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，CAMSAP1_1270-1473，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或CAMSAP2_1342-1488，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选的，所述微管加端末端追踪蛋白与mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498融合得OptoTIP微管蛋白示踪剂；

所述微管加端末端追踪蛋白为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1。

进一步优选的，所述腺瘤性息肉病菌APC为APC_2786-2824，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；肌动蛋白DST为DST_5469-5485或DST_5474-5485；所述DST_5469-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述DST_5474-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述基质相互作用分子1 为STIM1_630-685或STIM1_630-660；所述STIM1_630-685氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述STIM1_630-660氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

进一步优选的，所述光控微管蛋白示踪剂还包括光可切断结构域LOV2，LOV2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11；所述光可切断结构域LOV2插入在CRY2_1-498与DST_5469-5485之间，构成基于LOV2的OptoTIP的示踪剂。

本发明目的之二，提供所述的光控微管蛋白示踪剂在检测活细胞中微管蛋白中的应用。

优选的，在检测微管蛋白形态，追踪微管蛋白加末端及调节活细胞中的转录后修饰功能的应用。

本发明目的之三，提供所述的光控微管蛋白示踪剂在解析蛋白质-蛋白质/药物相互作用中的应用。

本发明目的之四，提供所述的光控微管蛋白示踪剂在实时检测单个细胞报告酶中的应用。

本发明取得的有益效果：

1.本发明首次建立了一系列具有可调动力学(活化半衰期<10秒；失活半衰期：40-960秒) 的光激活的MT示踪剂(OptoMT和OptoTIP)。这种光遗传学工具包能够快速和可逆地监测 MT形态，追踪MT加末端，并调节活细胞中的转录后修饰功能，同时避免了传统MT标记技术诸如固定和染色带来的影响。

2.实验条件下，使用OptoMT和OptoTIP似乎不会对照射细胞产生不利影响。这些工具对宿主细胞的微扰没有引起细胞活力，有丝分裂的显着改变。因此，在无光状态下活性低但具有高时空分辨率的OptoMT或OptoTIP非常适合于在各种细胞类型中长期监测MT分布，形态学和动力学。

3.以光控制的αTAT1为例，本发明进一步证明了αTAT1与OptoMT或OptoTIP结合使用来实现对微管蛋白进行光调谐修饰的能力，从而实时调节MT细胞骨架对化学解聚的弹性。同样，这种策略可以扩展到研究其他类型的微管蛋白的转录后修饰，如(脱)甲基化，(去) 酪氨酸化，聚谷氨酰化和聚甘氨酰化。

4.本发明光控微管蛋白示踪剂使在细胞中解析蛋白质-蛋白质/药物相互作用成为可能，并促进筛选破坏或促进这种相互作用的药物。

附图说明

图1：示意图说明OptoMT的设计和对微管的光诱导的结合。光敏组件CRY2(氨基酸1-498) 与衍生自EB1，CLIP170，CAMSAP1或CAMSAP2的微管蛋白结合结构域融合。V2为黑暗中低预激活但在蓝光刺激下显示强MT结合特新的表现最佳的构建体。

图2：荧光图像显示了在蓝光照射下(由灰条指示)mCh-OptoMT从细胞质到微管的重新分布。右侧的条形图显示光刺激1秒(470nm，40μW/mm2)之前和之后的归一化的 MT-over-cytosol荧光强度比。来自三次独立实验的n＝24个细胞。

图3：OptoMT介导的微管可逆标记的定量分析。将光刺激的两个明暗循环(470nm，40μW/ mm2，5秒)应用于表达mCh-OptoMT的HeLa细胞。所获得的数据点通过单组分指数衰减函数(t1/2，on＝10.1±4.2sec；t1/2，off＝210±28sec)进行拟合。来自三次独立实验的n＝ 37个细胞。

图4：共聚焦图像显示了mCh-OptoMT在胞质溶胶和MT之间在三次重复的暗光循环(功率密度为40μW/mm2下为470nm，10秒)下的可逆转位。

图5：示意图显示在蓝光照射下跟踪微管加端的OptoTIP与EB1可逆结合的设计。

图6：源自APC，肌动蛋白(DST或MACF2)和STIM1的EB1结合SxIP模体与光交换部分CRY2-PHR(氨基酸1-498)融合以产生19个OptoTIP变体(V1-V19)。APC，腺瘤性结肠息肉病(APC)；MTBD，微管结合结构域；DST，dystonin；GAS2，生长抑制特异性 2；STIM1，基质相互作用分子1；SP，信号肽；EF-SAM，EF-hand和不育的α模体；TM，跨膜结构域；CC1，卷曲螺旋；SOAR或CAD，STIM1Orai激活区或CRAC激活结构域； ID，抑制域；PS，脯氨酸-丝氨酸富集序列；K，多元富含赖氨酸的结构域。

图7：在重复的暗光循环期间，使用共聚焦拍摄与分析OptoTIP介导的MT加末端跟踪，随后加入诺考达唑(20μM)。蓝条表示光刺激(470nm，40μW/mm2)。使用单指数衰减函数来拟合数据点(t1/2，on＝11.1±4.7sec；t1/2，off＝204±44sec)，n＝10个细胞。

图8：mCh-OptoTIP构建体的光诱导性MT加端追踪(量化为彗星/细胞质mCherry强度比) 能力的比较。来自转染的HeLa细胞的mCherry信号在蓝光照射30秒之前和之后获得。

图9：A.在12种细胞类型中表达的mCh-OptoTIP(V17)的代表性图像。所有的细胞都表现出蓝光诱导的MT彗星形成而没有EB1过度表达；B.代表图像和荧光强度分布图，显示GFP-EB1(左)和mCh-OptoTIP彗星(右)在HeLa细胞中的共定位。

图10：A.mCh-OptoTIP蓝光依赖性招募到MT加端并没有显着改变GFP-EB1的彗星速度。使用表达mCherry而没有光刺激的HeLa细胞作为对照；B.三维模型化结构显示与人EB1复合的STIM1(₆₄₂TRIP₆₄₅；以棒表示)的EB1-结合模体(棕色表面呈现；PDB入口代码： 3GJO)。筛选超过80个STIM1-TRIP突变体后，从STIM1优化的EB1-结合模体的序列标志图。每个残基的高度与其加端跟踪能力成正比。

图11：所有80个OptoTIP-V17突变体的彗星形成的热度图表示。左列中指示的TRIP模板序列内的单个氨基酸残基分别被基质上方显示的其他19个氨基酸置换。

图12：示意图说明在表达mCh-OptoTIP-V17变体的HeLa细胞中可见的四种可能的光诱导情形：i)MT加上通过EB1结合的末端跟踪，ii)通过与PM-驻留的磷酸肌醇相互作用的 PM易位，iii)甚至胞质分布，或iv)由于CRY2同源寡聚化而聚集。EB1绑定的弱化或废除预计会导致后三种情况之一。

图13：A.拟南芥CRY2的N端光解酶同源(PHR)结构域的3D建模结构。位于距FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸；黄色棒)辅因子结合位点约10埃的两个位置(L348和W349；品红色棒)引入了突变；B.OptoTIP-V2突变体及其失活半衰期。长(L348F)或慢光周期突变(W349X) 被引入到CRY2中。

图14：A.示意图描绘了基于LOV2的OptoTIP变体的设计。为了实现可视的MT提示追踪， LOV2-SxIP-V2融合到四聚体DsRed(D变体；D1-D6)或光诱导寡聚体CRY2-PHR(V20) 上。SxIP模体来源于肌动蛋白(DST)。L1/L2，连接器1/2；B.基于LOV2的OptoTIP变体的设计(顶部)和定量分析(彗星-胞质溶胶荧光强度比；底部)显示出更快的失活动力学(t1/2，on＝9.1±4.1sec；t1/2，关闭＝40.2±6.6秒)。源自DST(aa 5469-5485)的SxIP 模体与光可切断结构域LOV2和四聚体标签(例如CRY2-PHR或DsRed)融合。在黑暗中，由于空间位阻，C端SxIP模体被LOV2笼住，从而阻止其与EB1的结合。当暴露于蓝光时， SxIP图案被暴露以恢复其正端跟踪能力。寡聚标签的存在有利于LOV2-SxIP与EB1的结合。来自三次独立实验的n＝16个细胞。

图15：描述光敏αTAT1设计的简化示意图。在蓝光刺激下，Opto-αTAT1经历细胞核至胞质溶胶的易位，并且通过与OptoTIP或OptoMT的光依赖性异聚化进一步募集至MT以有效地催化α-微管蛋白的乙酰化。mCh-Opto-αTAT1的光诱导性核输出，随后在共表达 GFP-OptoTIP的HeLa细胞中募集MT。上图，在470nm(40μW/mm2；蓝条)下暴露于蓝光之前和之后，相同细胞的代表性图像。下图，在两个重复的明暗循环中Opto-αTAT1的标准化的胞质mCherry信号。来自三次独立实验的n＝24个细胞。

图16：描绘Opto-αTAT1的设计的示意图。顶部：Opto-αTAT1的简化视图。需要两个光敏元件来实现对αTAT1的核出口和MT-靶向的严格控制。LEXY核输出系统1允许Opto-αTAT1 (αTAT1-mCh-CIBN-NLS-LEXY)的光诱导细胞核对胞质溶胶的易位。一旦出口，它将通过与OptoMT或OptoTIP中的CRY2模块异源化而向MT照相招募。底部：在黑暗中， Opto-αTAT1将被隔离在核内，因为NES信号被LOV2笼住。在蓝光照射和NES模体的暴露下，Opto-αTAT1被输出到胞质溶胶(步骤1)。在胞质溶胶中，GFP标记的OptoTIP (CRY2-SxIP)也被蓝光激活以追踪MT细胞骨架。与此同时，OptoTIP将通过CRY2-CIBN 异二聚体招募邻近MT的Opto-αTAT1以实现微管蛋白乙酰化。

图17：在HeLa细胞中的共定位的共焦图像。右侧显示了核出口的相应时间过程和量化。由于GFP激发通道将光激活CRY2或LOV2，所以首先使用562nm激光获得图像(左)以避免Opto-αTAT1的预活化。接下来，以3秒和30秒的脉冲施加外部蓝光照射(470nm，40μW/mm²)。不断监测Opto-αTAT1的核出口过程长达10分钟(右)。大约5-6分钟时胞质mCherry 强度达到最大值。最后，通过打开488nm和562nm激光器获得GFP和mCherry信号。尽管 Opto-αTAT1的大部分保留在细胞核中，但胞质部分足以诱导有效的微管蛋白乙酰化。

图18：A.乙酰化α-微管蛋白免疫染色后HeLa细胞的荧光图像。将细胞与Opto-αTAT1和 GFP-OptoTIP共转染，然后在固定和免疫染色之前使其经受不同时间的蓝光照射(470nm， 40μW/mm²)。B.由图22所示的图像测量α-微管蛋白乙酰化水平。从三个独立的实验中选择每个时间点的102个细胞。

图19：A.在2μM诺考达唑存在下共表达GFP-OptoMT和Opto-αTAT1的HeLa细胞中MT细胞骨架的实时成像。顶部面板(灰色条；黑暗)，细胞在黑暗中培养。为获得绿色荧光蛋白信号，细胞非常简单地受到绿光照射1-2秒，而不引起Opto-αTAT1出核。底部面板，细胞暴露于蓝光(470nm，40μW/mm²)6小时，然后以3秒开和30秒关的脉冲成像；B.示意图描绘了基于OptoMT的测定法的定量检查p53-MDM2抑制剂的细胞内功效的设计。在蓝光照射下，由于MDM2：P53相互作用，MDM2-OptoMT寡聚化以标记MT，随后将p53募集至MT。

图20：在存在MDM2抑制剂的情况下(左)，p53将从MT结合的MDM2-OptoMT中移出，从而在整个细胞质中呈现更均匀的分布；在不存在(中)或存在5μMnutlin-3(右)的情况下暴露于蓝光时共表达MDM2-GFP-OptoMT和mCh-p53的HeLa细胞的荧光图像。mCherry 信号的MT与胞质比率作为nutlin-3浓度(IC₅₀：3.1±0.2μM)的函数绘图。分析来自三个独立实验的50个细胞。

图21：共表达MDM2-GFP-OptoMT，mCherry-p53和CFP标记的抑制肽(p5317-28，pDI，pMI和pMI-F3A突变体)的HeLa细胞的荧光图像。图像被捕获在蓝色的光线下。在不存在抑制肽的情况下，mCh-p53的胞质分数与MT-结合的MDM2-GFP-OptoMT紧密共定位。相反，在抑制肽(CFP-pDI或CFP-pMI；由于与MDM2更强的相互作用而与MT结合)的存在下，mCh-p53从MT释放并且在胞质中展现更均匀的分布。在测定中使用CFP-pMI-F3A(细胞溶质中的平滑分布)作为阴性对照。比例尺，5微米。

图22：显示当向表达mCh-p53和MDM2-GFP-OptoMT的HeLa细胞添加有效的MDM2抑制剂，nutlin-3(5μM)时，从MT向胞质溶胶释放mCh-p53的时程。来自三次独立实验的 n＝10个细胞。数据显示为平均值±标准误。通过使用胞质mCh-p53强度作为替代读数，显示了nutlin-3介导的对p53-MDM2相互作用的抑制的剂量-反应曲线。绘制胞质mCherry 信号作为滴定的nutlin-3浓度的函数。来自三次独立实验的n＝31个细胞。数据以平均值 ±s.e.m表示。

图23：共表达MDM2-GFP-OptoMT，mCh-p53和CFP标记的p53-MDM2抑制肽(顶部，pMI；底部，失去其抑制活性的pMI突变体F3A)的HeLa细胞的荧光图像。分析肽抑制剂对p53:MDM2缔合的抑制作用。每列代表每个细胞5-6次测量，来自三次独立实验的n>59个细胞。数据显示为平均值±标准误。***P<0.001(双尾学生t检验)。

图24：A.示意图描绘了基于OptoTIP(f)或OptoMT的设计(i)监测HeLa细胞中半胱天冬酶3(Casp3)活性的测定。在蓝光的存在下，GFP-DEVD-OptoTIP或GFP-DEVD-OptoMT 跟踪MT加上末端或标记MT细胞骨架。在凋亡刺激(例如，添加STS)之后，GFP标签将被切割掉并随后分散到细胞质中；B.在与1μMSTS温育后表达GFP-DEVD-OptoMT的单个HeLa细胞的延时共焦图像。

图25：基于OptoTIP和OptoMT的半胱天冬酶活性记者实时监测HeLa细胞中的凋亡细胞死亡(与图5相关)。显示了在与1μM星形孢菌素(STS)温育后的指定时间点表达 GFP-DEVD-OptoTIP(a)或GFP-DEVD-OptoMT(b)的HeLa细胞的两个代表性视图。活化的半胱氨酸蛋白酶3切割DEVD以从MT结合的OptoTIP释放GFP，从而导致GFP信号在胞质溶胶中更均匀的分布。比例尺，5微米。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例中所用到的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

本发明所涉及的氨基酸序列，如下表1所示。

表1各氨基酸序列

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STIM1_590-685DKAHSLMELSPSAPPGGSPHLDSSRSHSPSSPDPDTPSPVGDSRALQASR NTRIPHLAGKKAVAEEDNGSIGEETDSSPGRKKFPLKIFKKP LKK

STIM1_620-685SPDPDTPSPVGDSRALQASRNTRIPHLAGKKAVAEEDNGSIGEETDSSPGRKKFPLKIFKKP LKK

基于mCh-CRY2_1-498-STIM1_630-685序列及突变位点： MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPL PFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQ DGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK GSGPPVATMKMDKKTIVWFRRDLRIEDNPALAAAAHEGSVFPVFIWCPEEEGQFYPGRAS RWWMKQSLAHLSQSLKALGSDLTLIKTHNTISAILDCIRVTGATKVVFNHLYDPVSLVRDH TVKEKLVERGISVQSYNGDLLYEPWEIYCEKGKPFTSFNSYWKKCLDMSIESVMLPPPWR LMPITAAAEAIWACSIEELGLENEAEKPSNALLTRACSPGWSNADKLLNEFIEKQLIDYAKN SKKVVGNSTSLLSPYLHFGEISVRHVFQCARMKQIIWARDKNSEGEESADLFLRGIGLREY SRYICFNFPFTHEQSLLSHLRFFPWDADVDKFKAWRQGRTGYPLVDAGMRELWATGWMH NRIRVIVSSFAVKFLLLPWKWGMKYFWDTLLDADLECDILGWQYISGSIPDGHELDRLDN PALQGAKYDPEGEYIRQWLPELARLPTEWIHHPWDAPLTVLKASGVELGTNYAKPIVDID TARELLAKAISRTREAQIMIGAAVYSGGGGGGGSGGGGGGGSGGGGGGGSGLRSG VGDSRALQASRNTRIPHLAGKKAVAEEDNGSIG EETDSSPGRK KFPLKIFKKP LKK

TRIP motif:T,R,I,P mutant to other 20 amino acids (ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY) respectively,total 80mutations

CIBN(CIB1_1-180)： MNGAIGGDLLLNFPDMSVLERQRAHLKYLNPTFDSPLAGFFADSSMITGGEMDSYLSTAG LNLPMMYGETTVEGDS RLSIS

NLS：GPKKKRKVGGTPAAKRAKLDG

LEXY： LATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSREEILGRNCRFLQGPETDRATVRKIR DAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGDVQYFIGVQLDGTEHVRDAAEREGVMLIKKTAENIDEA AKELAGLDL

p53_17-28

QETFSDLWKLLP

pDI：LTFEHYWAQLTS

pMI：TSFAEYWNLLSP

pMI-F3A：TSAAEYWNLLSP

侧翼8-10aa接头的半胱天冬酶3切割位点DEVD：GSGSGGDEVD RVYGSTSGGS OptoTIP变体序列： MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVV TVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQR LKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHST GGMDELYKGSGSGGDEVDRVYGSTSGGSGGPPVATMKMDKKTIVWFRRDLRIEDNPALA AAAHEGSVFPVFIWCPEEEGQFYPGRASRWWMKQSLAHLSQSLKALGSDLTLIKTHNTIS AILDCIRVTGATKVVFNHLYDPVSLVRDHTVKEKLVERGISVQSYNGDLLYEPWEIYCEKG KPFTSFNSYWKKCLDMSIESVMLPPPWRLMPITAAAEAIWACSIEELGLEN EAEKPSNALL TRACSPGWSNADKLLNEFIEKQLIDYAKNS KKVVGNSTSLLSPYLHFGEI SVRHVFQCAR MKQIIWARDK NSEGEESADL FLRGIGLREY SRYICFNFPF THEQSLLSHLRFFPWDADVD KFKAWRQGRTGYPLVDAGMREFWATGWMHNRIRVIVSSFAVKFLLLPWKWGMKYFWDT LLDADLECDILGWQYISGSIPDGHELDRLDNPALQGAKYDPEGEYIRQWLPELARLPTEWI HHPWDAPLTVLKASGVELGTNYAKPIVDIDTARELLAKAISRTREAQIMIGAAVYSGGGGG GGSGGGGGGGSGGGGGGGSGLRSGSRPSTAKPSKIPTPQR K

实施例1一类可逆标记细胞骨架的光控微管示踪剂(OptoMTs)的设计

设计光遗传工具，使得活细胞中微管的可逆标记对宿主细胞骨架的动力学干扰最小化。而相对较弱的微管蛋白结合剂的光诱导性寡聚化可能会改变结合平衡，以利于其与微管蛋白更紧密的结合，从而实现对单个细胞中微管蛋白(MT)细胞骨架的光可控标记(图1)。本发明通过融合拟南芥隐花色素2(CRY2)的N末端光解酶同源区(PHR；a-1-498)结构域与来自四个充分表征的MT相互作用物的微管蛋白结合结构域来制备一系列嵌合构建体-光控微管示踪剂OptoMTs(图1)，包括CLIP170(170kDa的胞质接头区)，EB1(末端结合蛋白1)，CAMSAP1和CAMSAP2(钙调蛋白调节血影蛋白相关蛋白1和2)。

光控微管示踪剂OptoMTs构建步骤如下：

1.1 pGFP-EB1购自Addgene(#17234)。

1.2通过标准PCR扩增拟南芥CRY2(Addgene#70159)的PHR结构域(氨基酸1-498)。

1.3将扩增序列插入修饰的pmCherry-C1或pEGFP-C1(Clontech)中。

1.4在pmCherry-C1/CRY2-PHR下游的BspEI和EcoRI/BamHI位置插入衍生自EB1(Addgene#17234)，CLIP170(Addgene#54044)，CAMSAP1和CAMSAP2(Addgene #59036和59037)的多个微管蛋白结合结构域作为之间的一个灵活连接器，得到 mCherry(mCh)标记的CRY2-PHR微管结合结构域序的4种融合体。

1.5将上述4种融合体在哺乳动物细胞中表达，融合体在黑暗中均匀分布于整个细胞中，在 470nm的光刺激下，可以在HeLa细胞的细胞质中观察到微管蛋白(MT)样结构的快速出现(图2)。

1.6在上述4种融合体中筛选出最强的标记效率，伴有高动态变化和良好的可逆性(图3和图4)的CRY2_1-498-CLIP170_129-350融合体(图1中的V2)。在撤掉蓝光后， CRY2_1-498-CLIP170_129-350融合体展示出10秒的激活半衰期(t_1/2,ON)和210秒的衰变半衰期。

实施例2一类光控微管示踪剂(OptoTIPs)用于可逆检测活细胞中的微管蛋白增长末端的设计

为了开发用于可逆追踪微管蛋白(MT)增长末端的光激发工具，本发明将类似的光遗传工程策略扩展到微管末端的定位信号，由三个微管蛋白加端(MT-plus)末端追踪蛋白质 (+TIPs)(包括腺瘤性息肉病菌(APC)，肌动蛋白(DST)和基质相互作用分子1)的共有模体组成(STIM1；图5和图6)，构建得到光控微管示踪剂OptoTIPs。

光控微管示踪剂OptoTIPs构建步骤如下：

2.1通过标准PCR扩增直接合成EB1结合SxIP模体(DST_5469-5485，DST5_474-5485和APC_2786-2824)。

2.2插入这些片段以取代微管结合结构域以产生mCh-OptoTIP或EGFP-OptoTIP。

2.3随后使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Agilent)制备OptoTIP变体(图6)。这些微管加端末端结合蛋白(+TIPs)利用SxIP模体通过与中心衔接蛋白(末端结合蛋白1， EB1)直接相互作用追踪延伸微管的末端，末端结合蛋白1(EB1)包含N-末端微管蛋白结合钙调蛋白同源性(CH)结构域，是一个能够招募+TIPs的中心接头和C末端EB同源(EBH)结构域。

2.4单独表达时，单体荧光蛋白(mCherry)标记的SxIP模体几乎不能跟踪微管末端；用光学多功能仪将CRY2-PHR与含有不同长度片段(12aa到453aa；19种变体；图6)的SxIP融合，然后使用延时共聚焦呈像技术去测定它们响应蓝光去追踪微管末端的能力。所有19种CRY2-SxIP融合构建体黑暗环境下在HeLa细胞中表达时均匀分布于细胞溶胶中，但在暴露于蓝光(470nm；40μW/mm²)后在整个胞质中显示出彗星状移动，此发现充分证明了他们以光依赖的方式追踪微管加末端的能力(图7和图8)。

2.5在所有构建体中，CRY2_1-498-DST_5469-5485融合构建体显示出最有效的彗星形成模式 (图8)。因此，本发明选择这个构造进一步表征。在重复循环的明暗刺激之后，mCh-CRY2_1-498-DST_5469-5485表现出可逆的彗星样细胞溶质分布模式，活化半衰期为11秒，失活半衰期为204秒(图7，表2)。

表2 OptoMT,OptoTIP,和Opto-αTAT1变体的激活与失活半衰期。

加入诺考达唑(一种干扰微管聚合的抗肿瘤剂)后，即使在光刺激存在的情况下也能立即终止其跟踪微管末端的活性。OptoTIP可以在来源于可兴奋组织和非兴奋组织的12种细胞类型中广泛表达，如Sk-Mel-28，NIH 3T3，HeLa，Neuron 2A，C2C12，HEK293，COS-7，H9C2，U87，Miapaca，MEF，A549细胞，用于微管加端的光诱导追踪(图9)。当在同一细胞中共表达时，在蓝光照射后(图8，图9)，mCh-OptoTIP与GFP-EB1紧密共定位，在微管生长末端中两个彗星的荧光强度分布保持很大程度上的一致性(图10)。为了确定 OptoTIP是否改变了增长的微管末端的行为，本发明比较了HeLa细胞中在蓝光刺激之前和之后表达空载体(单独作为对照)和mCh-OptoTIP的GFP-EB1彗星的微管末端跟踪速度。这些组之间没有显着差异(图11)。总之，这些结果证实了OptoTIP与EB1标记的+TIPs的光诱导结合，以实时追踪生长的微管末端而不显着干扰宿主微管细胞骨架。

可见光激活的彗星形成提供了一个简单的直接的读出方式来详尽说明控制EB1和EB1- 结合蛋白(例如STIM1)之间相互作用的结构决定因素，由于缺乏适当的工具，迄今为止还没有在细胞中对其进行系统验证。

基于mCh-CRY2_1-498-STIM1_630-685模板，本发明通过将EB1-结合模体(₆₄₂TRIP₆₄₅)中的一个位置替换为另外的19个氨基酸，同时保持剩余的三个位置不变，从而产生了总共80 个变体(图12)。当在HeLa细胞中单独表达并受到蓝光照射时，每个位置处的替换导致彗星模式的变化。本发明全面的细胞分析显示，在第3位(Ile或Leu)和第4位(Pro或Ala) 仅允许两个取代，清楚地说明这两个氨基酸残基在介导紧密对接EB1中的关键作用。相比之下，位置1显示出了更不严格的要求(5个替代可接受)；而位置2对氨基酸选择的限制最少(图12和图13)。值得注意的是，CRY2-STIM1_630-685嵌合体不仅追踪踪+TIPs，而且还可以转移到质膜(PM)，大概是通过STIM1的多碱基C-末端结构域(PB；a 666-682) 和质膜内部小叶带负电荷的磷酸肌醇的之间的相互作用。因此探究改变+TIP结合的相对强度是否会影响PM易位的程度(图14)。原来，大多数突变体展示了微管和PM之间的二元开关：显示出强的微管末端跟踪的突变体常常不能移向PM；而具有不同PM定位的突变体通常几乎不显示微管加端的追踪。这一发现意味着在TIP跟踪和PM-靶向之间的STIM1 切换开关可能涉及在哺乳动物细胞中微调STIM介导的信号传导，例如Ca²⁺进入。总之，所有结果显示OptoTIP可成为便利的嫁接支架，以测试假定的EB1-结合模体的微管末端跟踪活性。

实施例3 OptoTIPs动力学性质的优化设计

为了使OptoTIP的动力学性质多样化，本发明在CRY2的两个关键位置(L348和W349) 引入了最近发现的光周期突变体，两者都位于离FAD辅因子结合口袋约

处(图15)。长周期的OptoTIP-L348F突变体显示延长的半衰期为15.9分钟。相比之下，位置349处的 W到X置换导致加速衰减速率(例如W349H/L/E)或废止微管末端跟踪(图16)。不管这些工程方面的努力如何，基于CRY2的OptoTIP工具的整体恢复速度较慢(t_1/2，OFF～2-16 min)。

构建基于LOV2的OptoTIP变体构建步骤如下：

3.1为了产生基于LOV2的OptoTIP，扩增来自燕麦向光素的燕麦光漂蛋白LOV2(轻氧电压敏感域2)序列-具有更短光周期的蓝光响应光开关，然后插入到寡聚蛋白 (CRY2-PHR或DsRed)和SxIP模体之间。

3.2通过标准PCR，连接区和LOV2长度进一步变化。

3.3将LOV2-SxIP构建体与四聚体DsRed或CRY2融合，得到了基于LOV2的OptoTIP构建体。

经过对此构建体的鉴定，在优化接头区和SxIP模体(图17)之后，本发明鉴定了基于 LOV2的OptoTIP构建体，对于重复的深蓝色光循环而快速相应，可实现快速，可逆的细胞溶胶-彗星转化，其中失活半衰期从2-16分秒减少到40秒(表1)。其原理为LOV2的C 末端Jα螺旋下游的SxIP模体的邻位将阻碍黑暗中SxIP-EB1的缔合，因为LOV2核心体施加的空间位阻。在蓝光刺激下，C450与黄素单核苷酸(FMN)之间形成的光致加合物引发一系列构象变化，随后引起Jα螺旋的解旋和展开，由此暴露SxIP模体以恢复其与微管EB1 的相互作用尖端跟踪(图18)。已经创建了一整套基于CRY2或LOV2的光遗传学工具，通过使用简单的蓝光脉冲，以不同的动力学(几秒到几分钟)可逆地跟踪不断增长的MT末端。

实施例4一组光控制蛋白“Nucleus-to-MT”传递的平台，控制微管蛋白翻译后修饰

得到光激活的MT追踪标签后，本发明进一步探究了使用OptoTIP或OptoMT对活细胞中微管进行诱导性翻译后修饰的功能。αTAT1是一种主要的酶，介导α-微管蛋白Lys40的乙酰化，使微管对诺考达唑和机械破坏更有抵抗力。本发明通过赋予α-微管蛋白乙酰转移酶(αTAT1)光敏感性来测试光诱导性微管乙酰化的想法。具体步骤为：

4.1使用HiFi DNA组装方法构建Opto-αTAT1(αTAT1-mCh-CIBN-NLS-LEXY)。pmFherry-C1，CIB1-CreC(N1)(Addgene#75367)和NLS-mCherry-LEXY(Addgene#72655)。使用NEBuilder HiFi DNA装配酶(New England BioLabs)连接扩增的片段。

4.2将源自SV40大T抗原(PKKKRKV)和c-Myc(PAAKRVKLD)的两个核定位信号(NLS)与αTAT1融合，使胞质溶胶中的αTAT1的基础活性最小化，且在蓝光存在的情况下隔离酶与细胞核。

4.3接下来，将基于LOV2的光诱导核输出系统(LEXY)与αTAT1相结合，实现光依赖的核质穿梭。(称为OptoTAT1；图19和20)。

将包含与CRY2发生光依赖性结合的CIB1(CIBN；aa 1-81)的N末端结构域的第三元件进一步整合入工程化的αTAT1中，以使其与基于CRY2的OptoTIP和OptoMT兼容(图20)。在光刺激下，由于LEXY内的核输出信号的光诱导暴露(t_1/2，ON＝1.9分钟；t_1/2，OFF＝1.7分钟)，一部分核Opto-αTAT1被输出到胞质溶胶，随后通过光诱导与MT驻留的OptoTIP或 OptoMT多聚体异聚化结合(图19和图21)，向MTs快速募集。因此，观察到明显的MT 乙酰化的光转换增加，这体现在1蓝光照射后增强的乙酰化α-微管蛋白免疫染色(图22)。作为严格的对照，不表达Opt-αTAT1的细胞仅显示抗α-微管蛋白染色的基础水平(图23)。

为了进一步验证光诱导的MT乙酰化的功能性后果，本发明在具有和不具有光刺激的条件下测量了微管(通过GFP-OptoMT显现)针对MT去稳定剂诺考达唑的抗性。当用蓝光照射屏蔽时，用诺考达唑处理的HeLa细胞在90分钟内显示MT细胞骨架的逐渐解体(图 24)。相比之下，由于MT结合的OptoTAT1在细胞质溶胶中的催化活性，相似细胞暴露于蓝光下表现出较高水平的微管蛋白乙酰化，对诺考达唑诱导的MT细胞骨架的去稳定作用更强。在相同的90分钟窗口内，即使在诺考达唑处理后，MT细胞骨架也基本上保持不受干扰，从而清楚地证明了αTAT1通过翻译后修饰调节MT动力学中的保护作用。由上可知，本发明展示了光敏MT结合剂与微管蛋白修饰酶结合的应用，以同时实时监测和操纵MT 动态行为。

实施例5 OptoMT或OptoTIP在研究p53-MDM2相互作用中的应用

本发明进一步探索了使用OptoMT或OptoTIP探测蛋白质—蛋白质异聚化以及药物对这种相互作用的影响的可能性。考虑到其已知的化学计量和已知特征性抑制剂，包括小分子(例如nutlin-3)和多肽(例如来自p53(残基17-28)，pMI或pDI)的可用性，本发明决定使用 p53-MDM2相互作用作为测试案例(图25)。

具体步骤为：

5.1为了产生p53-SxIP和HSF1-SxIP融合变体，使用KOD热启动DNA聚合酶分别扩增一系列来源于p53和HSF1的截短的或缺失的片段，然后在HindIII和Xhol处插入 mCh-SxIP-V2主链

5.2通过使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed Mutagenesis试剂盒引入p53中的突变。MDM2-YFP购自Addgene(#53962)。

5.3将扩增的p53片段插入到pmCherry-C1中HindIII和XhoI限制性位点获得mCh-p53。

5.4对于CFP标记的肽，通过Integrated DNA Technologies直接合成p53_17-28，pDI，pMI 和pMI-F3A，然后在HindIII和XhoI位点插入pECFP-C1。

在共表达mCh-p53和MDM2-GFP-OptoMT的HeLa细胞中，可以观察到在蓝光存在下这两种蛋白质在MT细胞骨架附近的共定位。在加入增加量的MDM2抑制剂nutlin-3后，本发明技术人员注意到mCH-p53从结合MT的MDM2上解离，随后在数秒内立即分散到细胞溶质中(IC₅₀:～5μM)。在HeLa细胞中观察到类似的MT与胞质溶胶的易位，并有额外的有效p53-MDM2抑制肽的表达。作为严格的对照，MDM2抑制活性降低的突变肽(pMI-F3A) 不能从MT去除mCh-p53。显然，诱饵蛋白向MT细胞骨架的光诱导栓系可以作为一个独特的亚细胞读数来定量检测其与潜在的结合配偶体的关联。这样的平台可以被进一步优化以筛选可能破坏蛋白质—蛋白质异聚的化合物。

实施例6利用OptoTIP或OptoMT作为融合标签来检测活细胞中半胱天冬酶3介导的凋亡活性

为了产生半胱天冬酶报告子，通过使用退火的引物引入具有侧翼8-10aa接头的半胱天冬酶3切割位点DEVD，并随后在BsRGI和AgeI位点中插入消化的EGFP-OptoMT或 EGFP-OptoTIP载体。本发明将经典半胱天冬酶3切割位点DEVD与GFP和侧翼接头一起融合到OptoTIP或OptoMT的N端。在蓝光的存在下，嵌合蛋白GFP-DEVD-OptoTIP和 GFP-DEVD-OptoMT追踪MT加端或与MT细胞骨架结合。在加入星形孢菌素(STS)以激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3并诱导细胞凋亡之后，在2-3小时内观察到MT跟踪或结合的逐渐丧失，伴随着分散的胞质GFP信号的增益。因此，本发明设计的光敏MT示踪剂可以重新用于在单个细胞中实时报告酶功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种光控微管示踪剂及其应用

<130>

<160> 83

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Met Asp Lys Lys Thr Ile Val Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg

1 5 10 15

Ile Glu Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Ser Val

20 25 30

Phe Pro Val Phe Ile Trp Cys Pro Glu Glu Glu Gly Gln Phe Tyr Pro

35 40 45

Gly Arg Ala Ser Arg Trp Trp Met Lys Gln Ser Leu Ala His Leu Ser

50 55 60

Gln Ser Leu Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Thr Leu Ile Lys Thr His

65 70 75 80

Asn Thr Ile Ser Ala Ile Leu Asp Cys Ile Arg Val Thr Gly Ala Thr

85 90 95

Lys Val Val Phe Asn His Leu Tyr Asp Pro Val Ser Leu Val Arg Asp

100 105 110

His Thr Val Lys Glu Lys Leu Val Glu Arg Gly Ile Ser Val Gln Ser

115 120 125

Tyr Asn Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Pro Trp Glu Ile Tyr Cys Glu Lys

130 135 140

Gly Lys Pro Phe Thr Ser Phe Asn Ser Tyr Trp Lys Lys Cys Leu Asp

145 150 155 160

Met Ser Ile Glu Ser Val Met Leu Pro Pro Pro Trp Arg Leu Met Pro

165 170 175

Ile Thr Ala Ala Ala Glu Ala Ile Trp Ala Cys Ser Ile Glu Glu Leu

180 185 190

Gly Leu Glu Asn Glu Ala Glu Lys Pro Ser Asn Ala Leu Leu Thr Arg

195 200 205

Ala Cys Ser Pro Gly Trp Ser Asn Ala Asp Lys Leu Leu Asn Glu Phe

210 215 220

Ile Glu Lys Gln Leu Ile Asp Tyr Ala Lys Asn Ser Lys Lys Val Val

225 230 235 240

Gly Asn Ser Thr Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Leu His Phe Gly Glu Ile

245 250 255

Ser Val Arg His Val Phe Gln Cys Ala Arg Met Lys Gln Ile Ile Trp

260 265 270

Ala Arg Asp Lys Asn Ser Glu Gly Glu Glu Ser Ala Asp Leu Phe Leu

275 280 285

Arg Gly Ile Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Arg Tyr Ile Cys Phe Asn Phe

290 295 300

Pro Phe Thr His Glu Gln Ser Leu Leu Ser His Leu Arg Phe Phe Pro

305 310 315 320

Trp Asp Ala Asp Val Asp Lys Phe Lys Ala Trp Arg Gln Gly Arg Thr

325 330 335

Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ala Gly Met Arg Glu Leu Trp Ala Thr Gly

340 345 350

Trp Met His Asn Arg Ile Arg Val Ile Val Ser Ser Phe Ala Val Lys

355 360 365

Phe Leu Leu Leu Pro Trp Lys Trp Gly Met Lys Tyr Phe Trp Asp Thr

370 375 380

Leu Leu Asp Ala Asp Leu Glu Cys Asp Ile Leu Gly Trp Gln Tyr Ile

385 390 395 400

Ser Gly Ser Ile Pro Asp Gly His Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Pro

405 410 415

Ala Leu Gln Gly Ala Lys Tyr Asp Pro Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln

420 425 430

Trp Leu Pro Glu Leu Ala Arg Leu Pro Thr Glu Trp Ile His His Pro

435 440 445

Trp Asp Ala Pro Leu Thr Val Leu Lys Ala Ser Gly Val Glu Leu Gly

450 455 460

Thr Asn Tyr Ala Lys Pro Ile Val Asp Ile Asp Thr Ala Arg Glu Leu

465 470 475 480

Leu Ala Lys Ala Ile Ser Arg Thr Arg Glu Ala Gln Ile Met Ile Gly

485 490 495

Ala Ala

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Gly Leu Gln Thr Thr Pro Ala Ser Arg

1 5 10 15

Ala Thr Ser Pro Leu Cys Thr Ser Thr Ala Ser Met Val Ser Ser Ser

20 25 30

Pro Ser Thr Pro Ser Asn Ile Pro Gln Lys Pro Ser Gln Pro Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Pro Ser Ala Thr Pro Pro Ile Ser Asn Leu Thr Lys Thr Ala

50 55 60

Ser Glu Ser Ile Ser Asn Leu Ser Glu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Gly

65 70 75 80

Glu Arg Glu Leu Lys Ile Gly Asp Arg Val Leu Val Gly Gly Thr Lys

85 90 95

Ala Gly Val Val Arg Phe Leu Gly Glu Thr Asp Phe Ala Lys Gly Glu

100 105 110

Trp Cys Gly Val Glu Leu Asp Glu Pro Leu Gly Lys Asn Asp Gly Ala

115 120 125

Val Ala Gly Thr Arg Tyr Phe Gln Cys Gln Pro Lys Tyr Gly Leu Phe

130 135 140

Ala Pro Val His Lys Val Thr Lys Ile Gly Phe Pro Ser Thr Thr Pro

145 150 155 160

Ala Lys Ala Lys Ala Asn Ala Val Arg Arg Val Met Ala Thr Thr Ser

165 170 175

Ala Ser Leu Lys Arg Ser Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ser Ser Met Ser

180 185 190

Ser Val Ala Ser Ser Val Ser Ser Arg Pro Ser Arg Thr Gly Leu Leu

195 200 205

Thr Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Arg Lys Ile Ser Gly Thr

210 215 220

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Val Asn Val Tyr Ser Thr Ser Val Thr Ser Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Arg His Asp Met Leu Ala Trp Ile Asn Glu Ser Leu Gln Leu Asn Leu

20 25 30

Thr Lys Ile Glu Gln Leu Cys Ser Gly Ala Ala Tyr Cys Gln Phe Met

35 40 45

Asp Met Leu Phe Pro Gly Ser Ile Ala Leu Lys Lys Val Lys Phe Gln

50 55 60

Ala Lys Leu Glu His Glu Tyr Ile Gln Asn Phe Lys Ile Leu Gln Ala

65 70 75 80

Gly Phe Lys Arg Met Gly Val Asp Lys Ile Ile Pro Val Asp Lys Leu

85 90 95

Val Lys Gly Lys Phe Gln Asp Asn Phe Glu Phe Val Gln Trp Phe Lys

100 105 110

Lys Phe Phe Asp Ala Asn Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Asp Pro Val Ala

115 120 125

Ala Arg Gln Gly Gln Glu Thr Ala Val Ala Pro Ser Leu Val Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Asn Lys Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ser Ser Ser Ala Ala Pro

145 150 155 160

Gln Arg Pro Ile Ser Thr Gln Arg Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Gly

165 170 175

Pro Gly Val Val Arg Lys Asn Pro Gly Val Gly Asn Gly Asp Asp

180 185 190

<210> 4

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Ser Leu Ser Leu Ala Ser Ala Ala Thr Thr Glu Pro Glu Ser Val

1 5 10 15

His Ser Gly Gly Thr Pro Ser Gln Arg Val Glu Ser Met Glu Ala Leu

20 25 30

Pro Ile Leu Ser Arg Asn Pro Ser Arg Ser Thr Asp Arg Asp Trp Glu

35 40 45

Thr Ala Ser Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser Val Ala Glu Tyr Thr Gly

50 55 60

Pro Lys Leu Phe Lys Glu Pro Ser Ser Lys Ser Asn Lys Pro Ile Ile

65 70 75 80

His Asn Ala Ile Ser His Cys Cys Leu Ala Gly Lys Val Asn Glu Pro

85 90 95

His Lys Asn Ser Ile Leu Glu Glu Leu Glu Lys Cys Asp Ala Asn His

100 105 110

Tyr Ile Ile Leu Phe Arg Asp Ala Gly Cys Gln Phe Arg Ala Leu Tyr

115 120 125

Cys Tyr Tyr Pro Asp Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Leu Thr Gly Thr Gly

130 135 140

Pro Lys Asn Ile Thr Lys Lys Met Ile Asp Lys Leu Tyr Lys Tyr Ser

145 150 155 160

Ser Asp Arg Lys Gln Phe Asn Leu Ile Pro Ala Lys Thr Met Ser Val

165 170 175

Ser Val Asp Ala Leu Thr Ile His Asn His Leu Trp Gln Pro Lys Arg

180 185 190

Pro Ala Val Pro Lys Lys Ala Gln Thr Arg Lys

195 200

<210> 5

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Thr Glu Tyr Thr Gly Pro Lys Leu Tyr Lys Glu Pro Ser Ala Lys

1 5 10 15

Ser Asn Lys His Ile Ile Gln Asn Ala Leu Ala His Cys Cys Leu Ala

20 25 30

Gly Lys Val Asn Glu Gly Gln Lys Lys Lys Ile Leu Glu Glu Met Glu

35 40 45

Lys Ser Asp Ala Asn Asn Phe Leu Ile Leu Phe Arg Asp Ser Gly Cys

50 55 60

Gln Phe Arg Ser Leu Tyr Thr Tyr Cys Pro Glu Thr Glu Glu Ile Asn

65 70 75 80

Lys Leu Thr Gly Ile Gly Pro Lys Ser Ile Thr Lys Lys Met Ile Glu

85 90 95

Gly Leu Tyr Lys Tyr Asn Ser Asp Arg Lys Gln Phe Ser His Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Thr Leu Ser Ala Ser Val Asp Ala Ile Thr Ile His Ser His

115 120 125

Leu Trp Gln Thr Lys Arg Pro Val Thr Pro Lys Lys Leu Leu Pro Thr

130 135 140

Lys Ala

145

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Val Thr Pro Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Pro Arg Lys Ser Ser Ala Asp

1 5 10 15

Ser Thr Ser Ala Arg Pro Ser Gln Ile Pro Thr Pro Val Asn Asn Asn

20 25 30

Thr Lys Lys Arg Asp Ser Lys

35

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Arg Pro Ser Thr Ala Lys Pro Ser Lys Ile Pro Thr Pro Gln Arg

1 5 10 15

Lys

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ala Lys Pro Ser Lys Ile Pro Thr Pro Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Val Gly Asp Ser Arg Ala Leu Gln Ala Ser Arg Asn Thr Arg Ile Pro

1 5 10 15

His Leu Ala Gly Lys Lys Ala Val Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ser Ile

20 25 30

Gly Glu Glu Thr Asp Ser Ser Pro Gly Arg Lys Lys Phe Pro Leu Lys

35 40 45

Ile Phe Lys Lys Pro Leu Lys Lys

50 55

<210> 10

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Val Gly Asp Ser Arg Ala Leu Gln Ala Ser Arg Asn Thr Arg Ile Pro

1 5 10 15

His Leu Ala Gly Lys Lys Ala Val Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ser Ile

20 25 30

Gly Glu Glu Thr Asp Ser Ser Pro Gly

35 40

<210> 11

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Leu Ala Thr Thr Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asn Phe Val Ile Thr Asp

1 5 10 15

Pro Arg Leu Pro Asp Asn Pro Ile Ile Phe Ala Ser Asp Ser Phe Leu

20 25 30

Gln Leu Thr Glu Tyr Ser Arg Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Cys Arg

35 40 45

Phe Leu Gln Gly Pro Glu Thr Asp Arg Ala Thr Val Arg Lys Ile Arg

50 55 60

Asp Ala Ile Asp Asn Gln Thr Glu Val Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Thr Lys Ser Gly Lys Lys Phe Trp Asn Val Phe His Leu Gln Pro Met

85 90 95

Arg Asp Tyr Lys Gly Asp Val Gln Tyr Phe Ile Gly Val Gln Leu Asp

100 105 110

Gly Thr Glu Arg Leu His Gly Ala Ala Glu Arg Glu Ala Val Cys Leu

115 120 125

Ile Lys Lys Thr Ala Phe Gln Ile Ala Glu Ala Ala Asn Asp Glu Asn

130 135 140

Tyr Phe

145

Claims

1.一种光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，包括mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498，微管蛋白结合结构域或微管加端末端追踪蛋白；所述CRY2_1-498的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述微管蛋白结合结构域为CLIP170，末端结合蛋白1-EB1，CAMSAP1，或CAMSAP2；所述微管加端末端追踪蛋白为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1；所述肌动蛋白DST为DST_5469-5485或DST_5474-5485；所述DST_5469-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述DST_5474-5485氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，所述微管蛋白结合结构域与mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498融合得OptoMT微管蛋白示踪剂。

3.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，所述微管蛋白结合结构域为CLIP170_129-350，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，末端结合蛋白1-EB1_1-191，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，CAMSAP1_1270-1473，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或CAMSAP2_1342-1488，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，所述微管加端末端追踪蛋白与mCherry标记的光敏组件CRY2_1-498融合得OptoTIP微管蛋白示踪剂。

5.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，所述腺瘤性息肉病菌APC为APC_2786-2824，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述基质相互作用分子1为STIM1_630-685或STIM1_630-660；所述STIM1_630-685氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述STIM1_630-660氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

6.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂，其特征在于，还包括光可切断结构域LOV2，LOV2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11；所述光可切断结构域LOV2插入在CRY2_1-498与DST_5469-5485之间，构成基于LOV2的OptoTIP的示踪剂。

7.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂在检测活细胞中微管蛋白中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在检测微管蛋白形态，追踪微管蛋白加末端及调节活细胞中的转录后修饰功能的应用。

9.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂在解析蛋白质-蛋白质/药物相互作用中的应用。

10.根据权利要求1所述的光控微管蛋白示踪剂在实时检测单个细胞报告酶中的应用。