CN111212913A - 多重测定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于分析活细胞中的两种或更多种多肽的测定。在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体、用于接受多顺反子报告载体的受体细胞和多报告细胞。提供了制备多顺反子报告载体、用于接受多顺反子报告载体的受体细胞和多报告细胞的方法。提供了包含多顺反子报告载体、用于接受多顺反子报告载体的受体细胞和多报告细胞的文库和试剂盒。提供了分析/测定多报告细胞和多报告细胞文库的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月16日提交的美国临时专利申请号62/507,169的权益，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的基金号1448764和1632576以及与美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)签订的合同HHSN271201600006C、HHSN271201500028C和HHSN271201600021C下在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
确定对内部或外部刺激的细胞反应需要可视化并且监测关键的参与者和途径。当前可视化此类反应的方法效率低下、成本高并且仅提供快照。例如，传统上使用体内临床前动物模型进行药物发现和/或候选药物的毒理学评估，所述体内临床前动物模型是低通量的、成本高、对人体毒性的预测性不足，并且对化合物毒性的机制所提供的了解甚少。这些传统方法的通量远远不及新化学品产生的速度，无论它们是出于药学上的、农业上的还是其他目的(如营养品、化妆品、个人护理等)开发的化合物。对这些新化学品的功效或可能对人体健康构成的风险评估的需求要求开发新的筛选工具，其可以在与每周评估数十万种化合物兼容的通量下提供与此类化合物相关的机制的有意义的了解。理想地，新的筛选工具将能够精确定位特定的化学品对细胞生理学的哪些方面产生干扰，并且测量所产生的细胞反应。这些需求可以通过适当配置的活细胞方法来解决，这是本发明的重点。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体并入。
发明内容
本发明提供了用于在多种细胞(包括永生细胞、原代细胞、人干细胞、人iPSC细胞和人iPSC衍生的细胞)中进行多重活细胞筛选(例如，活细胞高含量筛选(LC-HCS))的组合物和方法，作为需要高通量技术的药物发现和毒理学筛选的模型。
在一些方面，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其包含：与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，并且其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且其中插入所述两个或更多个多克隆位点中并且编码与所述报告多肽融合的多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。在一些实施方案中，所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。在一些实施方案中，所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。在一些实施方案中，一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。在一些实施方案中，所述报告多肽还包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。在一些实施方案中，所述报告多肽是荧光报告多肽。在一些实施方案中，每个顺反子的报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含两种可诱导元件。在一些实施方案中，所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体还包含组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列。在一些实施方案中，所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸和/或loxP核酸序列。
在一些实施方案中，所述载体的可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，将包含编码一种或多种多肽的核酸的多顺反子报告载体框内插入所述一个或多个MCS中。在一些实施方案中，所述一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体还包含一种、两种或三种转录单元，其包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。
在一些方面，本发明提供了一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞，其中所述受体细胞包含整合到宿主细胞基因组中的特定位点的重组核酸，其中所述重组核酸包含与编码融合多肽的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述融合多肽包含报告结构域和可选择标记结构域，并且其中所述核酸包含位于编码所述融合多肽的核酸的5'末端的位点特异性重组酶核酸序列。
在一些实施方案中，所述受体细胞的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
在一些实施方案中，所述受体细胞的位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
在一些实施方案中，所述融合多肽的报告结构域是荧光报告结构域。在一些实施方案中，所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。在一些实施方案中，所述融合多肽的报告结构域是mCherry报告结构域。
在一些实施方案中，所述融合多肽的可选择标记结构域赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，所述受体细胞的整合的重组核酸还包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。在一些实施方案中，所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
在一些实施方案中，将所述重组核酸整合到所述受体细胞的腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hipp11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)中。
在一些实施方案中，所述受体细胞是永生细胞。在一些实施方案中，所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞(multipotent cell)。在一些实施方案中，所述诱导多能干细胞是WTC-11细胞或NCRM5细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是原代细胞。
在一些方面，本发明提供了一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸、第一启动子、位点特异性重组酶核酸、编码第一报告多肽和可选择标记的核酸、用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸、第二启动子和编码第二报告多肽的核酸，其中表达所述第一报告多肽而不表达所述第二报告多肽指示将所述重组核酸的整合靶向所述细胞基因组中的特定位点，并且表达所述第一和第二报告多肽指示随机整合在所述细胞基因组中。在一些实施方案中，所述重组核酸还包含编码四环素阻遏物的核酸，其与用于靶向同源重组的第二核酸的5'的启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，使用以下将所述重组核酸整合到所述受体细胞的基因组中：a)包含核酸酶和指导RNA的RNA指导的重组系统、b)TALEN核酸内切酶或c)ZFN核酸内切酶。
在一些实施方案中，选择表达所述第一报告多肽但不表达所述第二报告多肽的细胞。
在一些实施方案中，引入所述受体细胞中的位点特异性重组酶核酸是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
在一些实施方案中，引入所述受体细胞中的第一报告多肽是荧光多肽，并且引入所述受体细胞中的第二报告多肽是不同的荧光多肽。在一些实施方案中，所述荧光多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。在一些实施方案中，所述第一报告多肽是mCherry报告物，并且所述第二报告多肽是GFP。
在一些实施方案中，引入所述受体细胞中的可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，所述第一启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，用于靶向同源重组的所述第一核酸和用于靶向同源重组的所述第二核酸将重组靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、H11基因座或CLYBL基因座。
在一些实施方案中，将所述受体位点引入永生细胞中。在一些实施方案中，所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。在一些实施方案中，引入所述受体位点的细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。在一些实施方案中，将所述受体位点引入原代细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用本文所述的方法产生的受体细胞系。
在一些方面，本发明提供了一种包含本文所述的任何受体细胞的多报告细胞，其中已经将本文所述的任何多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的基因组中。在一些实施方案中，已经将所述多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的AAVS1基因座中。
在一些方面，本发明提供了一种多报告细胞，其中所述报告细胞包含多顺反子报告构建体，其中所述多顺反子报告构建体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子；其中每个顺反子包含编码与不同报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；并且其中所述转基因产物的表达是本质上化学计量的。在一些实施方案中，所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。在一些实施方案中，每种所述报告多肽是荧光报告多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种自切割肽是一种或多种2A肽。在一些实施方案中，编码与所述报告多肽融合的转基因产物的核酸还包含一种或多种核酸，其编码在所述报告多肽和病毒自切割肽之间的肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
在一些实施方案中，所述多报告细胞包含多顺反子报告载体，其包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含编码与荧光报告多肽融合的转基因产物的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。在一些实施方案中，包含多顺反子报告载体的所述多报告细胞还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和所述开放阅读框之间。
在一些实施方案中，所述多报告细胞的可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
在一些实施方案中，所述多报告细胞的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述多报告细胞的启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。在一些实施方案中，所述多报告细胞的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是TRE启动子。
在一些实施方案中，所述多报告细胞编码一种或多种转基因产物，其中所述一种或多种转基因产物包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态、毒性反应或表型特征的多肽。在一些实施方案中，所述分析在单个细胞上进行。在一些实施方案中，所述报告多肽可以通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光或使用读板仪可视化。
在一些实施方案中，所述多报告细胞还包含一种、两种或三种转录单元，其包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于产生多报告细胞的方法，其包括将本文所述的任何多顺反子报告载体引入本文所述的任何受体细胞中。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸序列是FRT核酸序列，并且所述受体细胞包含flp重组酶。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸是attP，并且所述受体细胞包含Bxb1重组酶、PhiC31重组酶或R4重组酶。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸序列是loxP核酸序列，并且所述受体细胞包含CRE重组酶。
在一些实施方案中，本发明提供了一种多报告载体文库，其中所述文库包含多顺反子报告载体或如本文所述的多种报告细胞，所述多顺反子报告载体包含编码与报告多肽融合的多肽的不同转基因，其中当引入细胞中时，每种载体上的两个或更多个不同转基因是本质上化学计量地表达的。在一些实施方案中，所述文库包含编码一个或多个转基因的报告载体，一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态、毒性反应或表型特征的多肽。在一些实施方案中，所述生物途径是与疾病相关的途径。在一些实施方案中，所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。在一些实施方案中，所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。在一些实施方案中，所述文库包含等基因的报告细胞；即，通过引入多种不同的报告载体由单一受体细胞系制备所述报告细胞，从而基于所述单一受体细胞系产生多种不同的报告细胞。
在一些实施方案中，所述文库的每种多顺反子载体包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织或表型特征的转基因，对于每种多顺反子报告载体而言包含编码与不同报告多肽融合的多肽的共同转基因。在一些实施方案中，所述文库的包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应或表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与报告多肽融合的多肽的共同转基因。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞文库，其中所述文库包含本文所述的任何受体细胞。在一些实施方案中，所述文库中的每种细胞包含多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的多肽的不同转基因，其中当引入细胞中时，每种载体上的所述不同转基因是本质上化学计量地表达的。
在一些实施方案中，所述文库包含不同的永生细胞。在一些实施方案中，所述文库包括HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述文库包含不同的多能、多潜能和/或祖细胞。在一些实施方案中，所述不同的多能或多潜能细胞包括诱导多能干细胞、多潜能细胞、造血细胞、内皮祖受体细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，在引入所述多顺反子报告载体后，使所述多能或多潜能细胞多报告细胞文库分化。在一些实施方案中，所述文库包含不同的原代细胞。在一些实施方案中，所述原代细胞包含心肌细胞、肌肉细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经元或肿瘤细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述文库中的每种细胞包含相同的多顺反子报告载体。在一些实施方案中，所述文库中的细胞包含不同的多顺反子报告载体。在一些实施方案中，将所述不同的多顺反子报告载体引入等基因受体细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供了一种本文所述的细胞文库，其中所述报告载体编码一个或多个转基因，一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态或表型特征的多肽。在一些实施方案中，所述生物途径是与疾病相关的途径。在一些实施方案中，所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。在一些实施方案中，所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。
在一些实施方案中，所述文库的细胞的每种多顺反子载体包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织和/或表型特征的转基因，包含编码与不同报告多肽融合的多肽的共同转基因。在一些实施方案中，包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应和/或表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与报告多肽融合的多肽的共同转基因。
在一些方面，本发明提供了包含一种或多种本文所述的多顺反子报告载体的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种本文所述的受体细胞的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种本文所述的多顺反子报告载体和一种或多种本文所述的受体细胞。
在一些方面，本发明提供了包含一种或多种本文所述的多报告细胞的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含排列在多孔板中的受体细胞和/或报告细胞文库的试剂盒。在一些实施方案中，将在所述多孔板中的细胞冷冻保存。
在一些方面，本发明提供了分析活细胞中的两种或更多种多肽的方法，所述方法包括确定本文所述的任何多报告细胞的两个或更多个转基因的表达和/或两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，所述方法用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态、毒性反应和/或表型特征。在一些实施方案中，在一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，在所述分析开始后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天、30天、1个月、3个月、6个月、9个月、1年或之间的任何时间或1年以上中的一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
在一些实施方案中，本发明提供了测量药剂对活细胞中的两种或更多种多肽的谱的影响的方法，所述方法包括使如本文所述的多报告细胞经受(即，接触)所述药剂以及确定响应于所述药剂在所述细胞中所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，所述药剂是药物或候选药物。在一些实施方案中，所述药剂是癌症药物或癌症药物剂。在一些实施方案中，所述方法是毒理学筛选。
在一些实施方案中，本发明提供了在多报告细胞文库中进行的用于确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置的方法。在一些实施方案中，使用单个细胞获得所述谱。
在以上方法的一些实施方案中，通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光、使用读板仪、质谱或深度测序测量所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置、所述两个或更多个转基因的表达和/或位置。
附图说明
图1A-1C描绘了受体细胞系的产生。图1A描绘了具有受体位点整合位点(IS)的AAVS1基因座和相关的受体位点设计。所述方案示出了连接PCR引物(粗体半箭头)和Southern印迹探针的定位。内部探针检测随机整合，而5'探针允许区分单或双等位基因整合。图1B描绘了PCR引物(半箭头)，其被设计为扩增同源重组连接，并且用于验证特异性且成功的整合。单个克隆的连接PCR的例子。*指示阳性克隆。图1C描绘了候选克隆的Southern印迹分析。将经EcoRI消化的基因组DNA与5'探针(*指示具有单等位基因整合的克隆)(图1A中的探针)杂交；箭头指示衍生自一个靶向等位基因整合(TI)的两个AAVS1杂交片段的位置。图1D描绘了进一步用内部探针(图1A)探测以验证基因组中的单整合(箭头)的具有单等位基因整合的克隆(*指示非特异性条带)。图1E示出了第一与第二受体位点设计。将细胞系最初用单拷贝受体位点工程化以用于重组，所述受体位点含有：SV40组成型启动子、翻转酶重组靶(FRT)位点、mCherry荧光标记和博莱霉素抗性基因。第二受体位点设计含有：SV40组成型启动子、翻转酶重组靶(FRT)位点、attP位点(用以通过丝氨酸重组酶进行重组)、mCherry荧光标记、博莱霉素抗性基因(博莱霉素)或杀稻瘟素抗性基因(杀稻瘟素-S脱氨酶，Bsd)和位于AAVS1右同源臂(AAVS1-R)之后的CMV-GFP。在重新设计的受体位点质粒中的CMV-GFP允许在随机和靶向整合之间区分。具有随机整合的细胞由于GFP的表达而发出绿色的荧光，而具有靶向整合的细胞由于CMV-GFP的丢失而没有发出绿色的荧光，因为它位于整合到细胞中的受体位点区域之外(在AAVS1-L和AAVS1-R之间)。图1F显示新的受体位点使得能够进行基于FACS的单细胞分选。野生型Hek293细胞(左图)和受体位点整合后的细胞(右图)的FACS数据的例子。双色(mCherry和GFP)允许选择在AAVS1基因座处具有至少一个整合并且没有随机整合(mCherry+/GFP-)的细胞。
图2示出了包含在可比较的pFIT载体骨架中的多顺反子平台的设计。定制的设计允许在同一启动子下并且具有重组(FRT位点)能力地从同一ORF表达四种多肽。重组到受体细胞系导致在所有细胞中平衡水平的相似的蛋白质表达水平。
图3是显示Ras/MAPK信号传导蛋白取决于途径激活状态而位于不同细胞区室中的图。
图4示出了如下方案，其描述了1)将受体位点掺入靶细胞系的安全港基因座中；2)多顺反子MAPK报告载体；和3)将MAPK报告载体重组到受体细胞系的受体位点以产生报告细胞系。
图5描绘了使用HEK293TA+4-MAPK报告细胞系来跟踪MAPK表达。诱导工程化的多报告细胞系表达MAPK报告物，并且将细胞用GDC-0879(Raf抑制剂)、FR 180204(Erk抑制剂)、洛伐他汀(KRas抑制剂)和PD0325901(Mek抑制剂)处理4或9h。将细胞在宽视野显微镜中成像(比例尺10μm)。
图6A示出了携带来自MAPK途径的4种蛋白质的24种MAPK多顺反子载体的文库的总结。mCherry-Erk、Venus-Ras和mCerulean-Raf被荧光标记，而Mek未被标记。mCherry-Erk和未标记的Mek对于所有载体都是固定的，而Ras和Raf具有在癌细胞中常见的不同的同种型和突变体。MAPK构建体表示为“MAPK R”，并且从“1-24”编号。图6B示出了通过用多报告载体和Bxb1工程化U2OSA细胞产生的二十三个MAPK报告细胞系。所有的报告细胞系均处于四环素诱导之下。用带有OKOLabTM培养箱系统的落射荧光NikonTM显微镜对细胞成像，并且使用Plan FluorTM 40x物镜和
软件(NikonTM)采集图像。
图7A-7C显示U2OSA-Tet MAPK R19、R20和R21报告细胞系对曲美替尼和PD 0325901抑制敏感。图7A示出了与经DMSO处理的细胞相比暴露于曲美替尼和PD 0325901持续1小时的表达K-Ras(wt)、K-Ras(G12C)和K-Ras(G12D)的细胞在细胞质中显示mCherry-Erk增加的代表性例子。图7B示出了以10μM(曲美替尼(黑色)、PD 0325901(灰色))开始的四点十倍系列稀释物作为单一药剂一式两份地测试的抑制剂的结果。计算每个样品的具有激活的MAPK信号传导的细胞的百分比，并且将其作为平均值与标准差绘图。虚线表示实验中的最小值和最大值。mCherry标记的ERK的亚细胞定位被用作MAPK途径激活的度量；具有激活的MAPK信号传导的细胞显示了ERK的核定位，而具有未激活的或受抑制的MAPK信号传导的细胞显示了ERK的核排除。测试了MAPK途径抑制剂在表达K-Ras野生型、K-Ras G12C或K-Ras G12D的三种不同细胞系中抑制mCherry标记的ERK核定位的能力。为了量化这些图像，我们计算了每个样品的四个图像的在单细胞中核与细胞质ERK的比率，并且将得出的值绘制为直方图。图7C示出了在三种细胞系中的每一种中针对两种抑制剂计算的来自重复实验的平均IC50值。
图8A-8C描绘了针对U2OSA-Tet受体细胞系克隆23进行的QC步骤的例子。图8A示出了在AAVS1基因座中受体位点整合的基因组DNA测序的结果，所述序列转换了整合的5'和3'侧翼区域，表明没有发生突变/缺失或插入。图8B示出了U2OS(wt)细胞和U2OSA-Tet受体细胞中的mCherry荧光水平的2D图和直方图，表明U2OSA-Tet细胞中超过99％的细胞是mCherry(+)。图8C示出了在U2OSA-Tet MTS-Venus:H2B-TagBFP报告细胞上进行的FACS分析的2D荧光密度图。未经诱导的报告细胞是mCherry阴性的，这证明了整合事件进入受体位点的特异性。用多西环素诱导后的相同报告细胞在多顺反子构建体整合后在细胞的多克隆群体内的报告物表达水平上显示出显著的一致性。相关系数(r)由Venus和TagBFP荧光水平计算得出，并且指示在不同的标记蛋白质表达之间存在线性关系。
图9描绘了可以使用的示例性多顺反子和通用平台。多顺反子和通用平台构建体被设计为包括示例性的组成型启动子，包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人胸苷激酶启动子(TK)和与CMV早期增强子(CAG)偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。报告载体也被设计为含有编码示例性抗性标记的基因，包括潮霉素抗性基因(Hygro)、博莱霉素抗性基因(Zeo)和嘌呤霉素抗性基因(Puro)。
图10A-10C描绘了U2OSA 3-ToxORG报告细胞系的表征。图10A示出了在宽视野显微镜中成像的工程化的多报告细胞系(比例尺10μm)。图10B和10C示出了使用流式细胞术分析(FACS)分析的工程化的多报告细胞系。图10B示出了由U2OSAToxORG细胞表达的3种荧光报告物的直方图，其显示了对于所有3种荧光标记的蛋白质的相似的变异系数(CV)；并且图10C示出了2D密度图，其显示MTS-Venus和H2B-TagBFP报告物的表达高度相关(r＝87％)。
图11A和11B示出了关于DNA损伤诱导剂的新的U2OSA ToxDUPR报告细胞系报告。图11A是暴露于媒介物、依托泊苷、新制癌菌素(NCS)、阿非迪霉素、毒胡萝卜素和衣霉素持续8h的表达53BP1-mCerulean、XBP1-Venus和H2B-mCherry(未显示)的U2OS ToxDUPR稳定细胞系的代表性例子。仅暴露于依托泊苷和NCS的细胞显示出每个核的灶点数量增加。所有其他化合物均显示出与DMSO对照相似的灶点数量。图11B示出了以四点十倍系列稀释物一式四份地测试的化合物的结果。对每个样品的灶点/核的数量评分，并且将其作为平均值与标准差绘图。图例中指示了平均EC50值。
图12A-12E描绘了来自U2OSToxDUPR细胞的53BP1报告物的测定度量。将U2OSToxDUPR报告细胞在用媒介物(DMSO)或1μM依托泊苷和500ng/μl NCS-DNA损伤诱导剂(其增加53BP1灶点的数量)处理的384孔板中铺板。对于每种条件，整个板上有48个孔，以确定空间一致性。将图像使用CellProfiler(用于图像分析的开源软件，Kamensty,L等人Bioinformatics(2011))处理以计数灶点/核的数量。使用python编程语言(Python Software Foundation，万维网网址python.org)进一步计算数据，并且将其使用GraphPad Prism 7.0软件(美国加利福尼亚州拉荷亚)生成图。图12A和12B显示没有观察到漂移或边缘效应。将反应的散点图(53BP1灶点/核的数量)相对于孔编号作图，其中将孔首先按行、然后按列排序(图12A)，或首先按列、然后按行排序(图12B)。图12C-12E示出了在用依托泊苷(图12C)或NCS(图12D)处理后并且与媒介物比较的U2OSToxD-UPR细胞中的灶点/核的平均数量的散点图。粗线表示平均值，并且虚线表示3倍标准差。图12E提供了每种化合物的平均值、StDev和Z'的总结。使用以下公式计算Z'：Z^'＝1-((3*StDev(Cpd)+3*StDev(DMSO)))/((平均(Cpd)-平均(DMSO))。
图13示出了使用U2OSA ToxORG和ToxDUPR报告细胞系作为单一报告物或在同一孔中合并以评估毒性。上图示出了U2OSA ToxORG或ToxDUPR的代表性图像、以及将两种细胞系以1:1的比率混合后的代表性图像。图像采集前24h将细胞铺板。下图是描绘在每种Tox报告物中含有的荧光标记的报告物的表。请注意，DNA标记(H2B)对于两种报告物是共同的，然而它被两种不同的荧光团标记-这使得两种报告细胞系在图像分析期间能够分离。
图14示出了使用U2OSAToxORG和ToxDUPR报告细胞系在同一孔中合并以评估毒性。上图示出了在同一孔中混合的U2OS ToxORG和U2OS ToxDUPR的代表性例子。使细胞暴露于媒介物和新制癌菌素(NCS)持续8小时。只有表达U2OSA ToxDUPR并且暴露于NCS的细胞显示出每个核的灶点数量增加。比例尺10μm。下图示出了以四点十倍系列稀释物一式两份地和对于最高浓度一式四份地测试NCS的结果。对每个样品的灶点/核的数量评分，并且将其作为平均值与标准差绘图。图例中指示了平均EC50值。
图15描绘了在U2OS细胞中瞬时表达的4色多报告物的表达。在U2OS细胞中瞬时转染含有H2B-TagBFP、mCherry-LC3、MTS-Venus和palm-miRFP的多顺反子报告物。转染后48h，将细胞在玻璃底板中铺板，并且在24小时后成像。
图16A和16B示出了用于报告物重组的iPS受体细胞系的成功产生。图16A示出了受体位点设计。图16B示出了具有受体位点正确整合(mCherry阳性且GFP阴性)的NCRM5 iPSC集落。
图17A-17C描绘了工程化iPS受体细胞系、设计4-TOX报告构建体以及将所述构建体克隆到受体系中的过程。具体而言，图17A示出了靶向载体的设计，以使用Cripsr-Cas9指导的sgRNA在AAVS1基因座中用“着陆架”工程化受体细胞系。注意：mCherry在SV40启动子和ATG-Frt起始位点下表达。图17B示出了4-TOX报告物的设计：四顺反子表达构建体，其掺入了由在αMHC启动子(或CAG启动子)下的3个独特的串联病毒2A切割肽插入物分开的4个多克隆位点(MCS)和IRES元件，随后是一个Frt。图17C示出了一旦发生重组并且在FRT位点处向基因组中插入4色报告物如何使SV40启动子和ATG起始密码子接近并且与潮霉素抗性基因在框内以及如何使mCherry基因失活。
图18描绘了用于产生可替代的报告细胞系的方案。开发了多报告物系，以掺入即插即用组分(由黑框指示)和可测试元件(由灰框指示)。所述质粒包括几种先前已验证的模块元件(由虚线框指示)。如图18所示，报告构建体被设计为包括示例性的组成型启动子，包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、人泛素C启动子(Ubc)和与CMV早期增强子(CAG)偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。报告载体也被设计为含有编码示例性抗性标记的基因，包括潮霉素抗性基因(Hygro)、ZeocinTM抗性基因(Zeo)、新霉素抗性基因(Neo)和嘌呤霉素抗性基因(Puro)。
具体实施方式
本发明提供了可以分析活细胞中(例如，单个活细胞中)的多种多肽的多重高含量测定。在一些方面，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其包含：与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且其中插入所述两个或更多个多克隆位点中并且编码与所述报告多肽融合的多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。在一些方面，本发明提供了用于接受多顺反子报告载体的受体细胞。在又其他方面，本发明提供了用于多重高含量测定的多报告细胞，其中所述多报告细胞包含本文所述的任何多顺反子报告载体。本文所述的多报告细胞可以用于活细胞测定中作为分析细胞行为方面和可能由候选治疗剂或其他化学化合物或其他刺激或其组合诱导的对这些行为的扰动的手段，以分析活细胞(例如，单个活细胞)中的多种多肽的表达和活性，所述细胞行为方面包括但不限于生物途径、生物途径之间的串扰、细胞稳态，细胞器稳态以及毒性。
活细胞筛选(例如，LC-HCS)提供了在细胞系统中筛选化合物的机会，所述细胞系统重演无法通过终点测定捕获的信号转导和细胞表型的动态特性。永生细胞系可以用于监测各种化合物的毒性，并且确定分子(如目标治疗性候选化合物)可能对特定途径的影响。轻松维持和使用这些细胞的能力允许永生细胞系在细胞和分子生物学中成为强大的工具。干细胞或人诱导多能干细胞(iPSC)因提供生理相关性和高繁殖力而具有作为在活细胞筛选中使用的细胞模型的巨大潜力。
本文描述了新颖的方法、细胞和多重高通量测定，其提供了在永生、原代和人iPS细胞(其具有在体外分化为多种细胞类型的潜力)中细胞应激、稳态和相关事件的机械和表型读出。已知多种多样的化学品会扰动稳态并且引起细胞应激，并且因此在理解候选治疗剂的活性或毒性机制的上下文中，其是细胞生理学监测的重要方面。本文所述的方法可以用于询问治疗剂(特别是抗癌药物)的任何潜在的附带细胞毒性。
在一些实施方案中，所述方法、细胞和多重高通量测定用于分析心脏毒性。心脏毒性表示癌症治疗的有害副作用，导致大量的发病和死亡。用于治疗癌症的细胞毒性剂和靶向疗法(包括经典的化学治疗剂、抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂以及化学预防剂)均影响心血管系统，并且可能导致严重的影响，如心力衰竭、心室功能异常和心肌缺血。癌症疗法诱导的心肌病的上升表明，在评估和开发任何抗癌药物期间必须仔细权衡心脏毒性的风险。
由于缺乏在生物学相关的心脏细胞中实时监测毒理学的这个方面的系统，人们尚未完全了解将癌症疗法与心肌病联系起来的分子机制，包括应激诱导的转录因子对细胞存活或死亡的具体贡献。本文所述的测定通过提供多重荧光报告系统满足了此需求，所述报告系统使用人iPSC衍生的心肌细胞提供了细胞应激和细胞器稳态的读出。可以评估分子和潜在的治疗剂的神经毒性、肝毒性或任何其他类型的组织毒性的影响。
使用原代心肌细胞、原代神经元或其他原代细胞类型的主要限制是与获得和维持这些细胞相关的技术困难。例如，尽管永生心脏细胞很方便，因为它们可以容易地增殖、搏动，并且在一些情况下可以稳定地维持心脏表型，但是它们的代谢和形态可能与心肌细胞不同，因此在毒理学研究中限制了它们的使用。衍生自干细胞或iPSC的心肌细胞克服了这些缺点，并且提供了不仅评估分子对终末分化细胞的影响，而且通过不同的分化阶段研究各种分子的发展或影响的工具。这是特别重要的，因为对祖细胞和分化细胞的可靠的测试虽然有价值但是很少。此外，可以从人类受试者中产生iPSC，以检查各种疾病表型和正常表型。
在一些实施方案中，所述方法、细胞和多重高通量测定用于药物发现。例如，所述方法、细胞和多重高通量测定用于治疗神经退行性变的药物发现。在一些实施方案中，本发明提供了iPSC衍生的细胞在用于治疗神经退行性疾病的药物开发中的用途。
定义
如本文所用，“载体”是指包含有待在体外或在体内递送到宿主细胞中的核酸的重组质粒或病毒。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸的骨架可以包含糖和磷酸基团(如通常可以在RNA或DNA中发现的)或者修饰或取代的糖或磷酸基团。可替代地，核酸的骨架可以包含合成亚基(如氨基磷酸酯)的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，双链核酸可以通过合成互补链并在适当条件下使链退火或者通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链而从化学合成的单链多核苷酸产物获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指相对于天然序列包括修饰(如缺失、添加和取代)的蛋白质(通常在本质上是保守的)，只要所述蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，“生物传感器”是指附着于另外的蛋白质序列使其对小生物分子或其他生理细胞内过程敏感的报告化合物。在非限制性例子中，生物传感器是包括遗传编码的荧光多肽的荧光生物传感器。将生物传感器引入细胞、组织或生物中，以允许作为FRET效率差异、荧光蛋白的转位或单一报告蛋白的报告物特性的调节进行检测(例如，通过荧光显微术)。许多生物传感器允许长期成像，并且可以被设计为专门靶向细胞区室或细胞器。生物传感器的另一个优点是，它们允许对信号传导途径进行研究或对生物分子进行测量，同时在很大程度上保留空间和时间细胞过程。
“受体细胞”是已经被工程化为在其基因组中包含受体构建体的细胞。
“受体构建体”是如下核苷酸序列，其包含可以包含报告核酸的核酸序列。
术语“转基因”是指引入细胞中并且能够被转录成RNA并且任选地在适当条件下翻译和/或表达的核酸。
如本文所用，除非另外定义，“干细胞”是指任何非体细胞。不是终末分化的或终末定型的细胞的任何细胞都可以称为干细胞。这包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞和部分分化的祖细胞。出于本申请的目的，具有分化为两种不同类型细胞的潜力的任何细胞均被视为干细胞。
如本文所用的“iPS”细胞是指通过对非多能细胞进行重编程而获得的任何多能细胞。重编程的细胞可能是通过对任何胚胎或胚外组织谱系的祖细胞、部分分化的细胞或完全分化的细胞进行重编程而产生的。
如本文所用的“重编程”是指使至少部分分化为多能状态的细胞去分化的过程。
如本文所用，“免疫赦免细胞”是指当引入外源宿主生物中时引起免疫应答减弱的细胞。
如本文所用，“顺反子”是指等同于基因并且编码单一功能单元(例如，单一多肽或包含转基因产物和报告结构域的融合多肽)的核酸区段。如本文所用，多顺反子载体是包含两个或更多个顺反子的核酸。在一些实施方案中，多顺反子载体在单个开放阅读框中包含两个或更多个顺反子。在一些实施方案中，单个开放阅读框在翻译时产生两种或更多种彼此分离的多肽。
如本文所用，关于两种或更多种报告多肽的表达的术语“本质上化学计量的”是指两种或更多种报告多肽的表达，其中所述两种或更多种报告多肽的表达水平相等或变化不超过彼此的约5％、10％、15％、20％或25％。
如本文所用，“位点特异性重组酶序列”是指位点特异性重组系统的靶序列。位点特异性重组系统包括但不限于Tyr重组酶、Ser整合酶、带有loxP靶序列的Cre重组酶、带有FRT靶序列的FLP重组酶。Tyr重组酶和Ser整合酶(例如，PhiC31)整合酶的位点特异性重组核酸序列包括但不限于attB和attP。CRE重组酶的位点特异性重组核酸序列包括但不限于loxP。FLP重组酶的位点特异性重组核酸序列包括但不限于FRT。
本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，除非另外说明，冠词的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含(comprising)”、“组成为(consisting)”和/或“基本上组成为(consisting essentially of)”方面和实施方案。
受体细胞
本公开文本提供了多报告细胞和产生多报告细胞的方法，其可以用于分析活细胞中的两种或更多种多肽。通过将多顺反子报告载体克隆到受体细胞的插入位点中来开发多报告细胞。通过将编码受体序列的重组核酸掺入细胞的基因组中来开发受体细胞。所述受体序列包含允许将所述多顺反子报告载体位点特异性整合到所述受体细胞基因组中的插入位点。如本文所述，所述多顺反子报告载体包含编码两种或更多种多肽的核酸，其中所述多肽与报告结构域融合。编码所述目标多肽的所述两个或多个核酸序列位于同一开放阅读框内，从而允许本质上化学计量地表达所述重组肽。在一些实施方案中，本质上化学计量表达是两种或更多种报告多肽的表达，其中所述两种或更多种报告多肽的表达水平本质上是相同的；即，具有1:1的化学计量。在一些实施方案中，所述两种或更多种报告多肽的表达水平相等或变化不超过彼此的约5％、10％、15％、20％或25％中的任一个。在一些实施方案中，本质上化学计量表达是两种、三种、四种或四种以上的报告多肽的化学计量表达。所述两种或更多种报告多肽的表达水平可以通过本领域已知的任何手段来测量；例如，通过荧光检测、通过免疫测定、通过酶测定、通过测量RNA水平(例如qPCR)等。
在一些方面，本发明提供了一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞，其中所述受体细胞包含整合到宿主细胞基因组中的特定位点的重组核酸，其中所述重组核酸包含与编码融合多肽的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述融合多肽包含报告结构域和可选择标记结构域，并且其中所述核酸包含位于编码所述融合多肽的核酸的5'末端的位点特异性重组酶核酸序列。在图1E中提供了受体位点的非限制性例子。
在一些实施方案中，所述启动子(例如，第一启动子)是组成型启动子。组成型启动子的例子包括但不限于巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子、胸苷激酶(TK)启动子、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。诱导型启动子的例子包括但不限于四环素响应型启动子、雷帕霉素调控型启动子和固醇诱导型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
在本发明的一些实施方案中，所述受体位点包含位点特异性重组酶序列。位点特异性重组酶序列的例子包括但不限于FRT核酸序列、attP核酸序列和loxP核酸序列。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attB核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是loxP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attB核酸。
在一些实施方案中，所述受体位点包含编码报告多肽的核酸。在一些实施方案中，所述受体位点包含编码选择多肽的核酸。在一些实施方案中，所述受体位点包含编码与选择多肽(例如，选择结构域)融合的报告多肽(例如，报告结构域)的核酸。在一些实施方案中，所述报告多肽在所述融合多肽的N末端，并且所述选择多肽在所述融合多肽的C末端。在其他实施方案中，所述选择多肽在所述融合多肽的N末端，并且所述报告多肽在所述融合多肽的C末端。
报告肽是可以容易地鉴定的肽；例如，经由显微术、读板仪、FACS、化学地、质谱或深层测序。例如，所述报告结构域可以是荧光或发光多肽。在一些实施方案中，所述报告结构域可以是绿色荧光蛋白(GFP)或其任何衍生物。在一些实施方案中，所述报告结构域是非GFP衍生的荧光肽。在一些实施方案中，所述报告结构域编码GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP或smURFP。所述报告结构域可以是萤光素酶。所述报告结构域可以是酶，其在表达时允许通过化学反应的产物可视化表达。在一些实施方案中，所述报告物是萤火虫萤光素酶或海肾萤光素酶。在一些实施方案中，所述报告结构域是β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。
可选择标记结构域可以是赋予对细胞通常不具抗性的分子的抗性或以细胞通常不具抗性的剂量赋予抗性的多肽。例如，所述可选择标记结构域可以是赋予对抗生素的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述可选择标记是赋予对杀稻瘟素、遗传霉素、潮霉素、嘌呤霉素、新霉素、ZeocinTM、卡那霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素、抗霉素(antinomycin)、安普霉素、霉酚酸、组氨醇、氨甲蝶呤或其任何盐或衍生物的抗性的多肽。
在一些实施方案中，所述受体细胞包含受体位点，其包含编码包含报告结构域和选择结构域的融合多肽的核酸。在一些实施方案中，所述融合多肽的报告结构域是mCherry报告结构域。在一些实施方案中，所述融合多肽的可选择标记结构域赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，所述受体位点还包含编码基因表达阻遏多肽的核酸。在一些实施方案中，所述受体位点包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。在一些实施方案中，所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
将所述受体位点整合在所述受体细胞基因组中的特定位点处。在一些实施方案中，所述特定位点是在所述受体细胞基因组中的无害位点。例如，将核酸插入所述特定位点中对所述受体细胞的功能影响很小。在一些实施方案中，将所述重组核酸整合到腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hipp11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)中。在一些实施方案中，所述受体位点包含异源核酸序列，将其用于将编码所述位点特异性重组酶核酸序列的重组核酸靶向所述受体细胞基因组中的特定靶基因座。在一些实施方案中，所述受体细胞包含用于靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座或小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hipp11(H11)基因座或CLYBL基因座的核酸。
本公开文本提供了产生受体细胞系的方法。所述方法包括工程化细胞，使得所述细胞可以包含报告核酸。任何细胞都可以是受体细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是植物细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是真菌细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是通过工程化永生细胞产生的。在一些实施方案中，所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞系是通过工程化原代细胞产生的。所述原代细胞可以从植物或动物中收获。在一些实施方案中，所述原代细胞是从哺乳动物中收获的。在一些实施方案中，所述原代细胞是从人中收获的。在一些实施方案中，收获啮齿动物的原代细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞是患者特异性细胞。
在一些实施方案中，所述受体细胞是干细胞。所述干细胞可以是全能、多能或多潜能干细胞。任何全能、多能、多潜能或祖干细胞均可以用于产生受体细胞系。所述干细胞可以是动物细胞。在一些实施方案中，所述干细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，所述干细胞来自人。在一些实施方案中，所述干细胞是患者特异性干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是自体干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是异体干细胞。在一些情况下，所述干细胞来自非人灵长类动物、犬或啮齿动物。所述干细胞可以衍生自滋养外胚层、囊胚的内细胞团或特定组织。所述干细胞可以是胚胎干细胞、诱导多能干细胞或祖干细胞。任何祖细胞均可以用于产生受体细胞系。例如，所使用的祖细胞可以是造血细胞、内皮祖细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞。
在一些实施方案中，所述受体细胞是细菌细胞、植物细胞、真菌细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述动物是无脊椎动物。在一些实施方案中，所述受体细胞是来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)物种成员的细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)物种成员的细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是脊椎动物动物细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述受体细胞是人细胞、灵长类动物细胞、啮齿动物细胞、猫细胞、犬细胞、牛细胞、猪细胞或绵羊细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸、第一启动子、位点特异性重组酶核酸、编码第一报告多肽和可选择标记的核酸以及用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸。在一些实施方案中，所述重组核酸包含上述任何受体位点，以产生上述任何受体细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸、第一启动子、位点特异性重组酶核酸、编码第一报告多肽和可选择标记的核酸、用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸、第二启动子和编码第二报告多肽的核酸，其中表达所述第一报告多肽而不表达所述第二报告多肽指示将所述重组核酸的整合靶向所述细胞基因组中的特定位点，并且表达所述第一和第二报告多肽指示随机整合在所述细胞基因组中。在一些实施方案中，所述重组核酸包含上述任何受体位点，以产生上述任何受体细胞。
在一些实施方案中，所述受体位点还包含编码基因表达阻遏多肽的核酸。在一些实施方案中，所述受体位点包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。在一些实施方案中，所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
在一些实施方案中，所述受体细胞是通过将受体位点引入所述受体细胞中产生的。在一些实施方案中，所述受体位点包含1)指导所述受体位点整合到AAVS1基因座中的两个AAVS1序列；2)通过显微术可见的荧光标记物(mCherry)；3)抗生素(博莱霉素-ThermoFisher)抗性选择标记；4)用于通过翻转酶(Flp)对报告构建体进行位点特异性重组的FRT位点；5)组成型启动子SV40，其驱动博莱霉素(Thermo ScientificTM)抗性基因和mCherry表达，从而使得能够分别进行抗生素选择和荧光筛选以鉴定阳性受体细胞克隆；6)驱动四环素阻遏蛋白(TetR)的人b-肌动蛋白启动子。
所述受体细胞是通过将细胞的基因组工程化为包括受体构建体产生的。有几种本领域已知的技术，其可以用于将细胞工程化为包含外源核酸序列。例如，所述受体细胞可以通过经由病毒转染系统将所述受体构建体插入细胞中来产生。在一些实施方案中，所使用的逆转录病毒是慢病毒或腺病毒。在一些实施方案中，所述受体构建体可以是载体。所述载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，如慢病毒载体、杆状病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，使用AAV转染系统将所述受体构建体递送到所述受体细胞中。可以根据所使用的细胞类型或基因座来修饰和优化所使用的AAV。例如，可以使用AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合。
所述受体构建体可以通过本领域已知的其他方法递送。已知许多递送手段(如酵母系统、微泡、基因枪/将载体附着于金纳米颗粒的手段)。在一些实施方案中，所述受体构建体可以经由脂质体、纳米颗粒、外泌体、微泡或基因枪递送。
在一些实施方案中，通过使用RNA指导的核酸内切酶系统将所述受体构建体插入细胞的基因组中。在一些实施方案中，使用CRISPR系统。在一些实施方案中，使用经由Cas9的RNA指导的基因组工程化将所述受体构建体插入所述细胞的基因组中。然而，在RNA指导的基因组工程化系统中起作用的任何核酸酶都起作用。可以使用的核酸酶包括Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8C、Cas10d、Cse、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Cas4、Csn2、Cpf1、C2c1、C2c3、C2c2。所使用的核酸内切酶的类型可能取决于待工程化的细胞和用于插入的靶基因座。
在一些实施方案中，通过使用TALEN或锌指核酸内切酶(ZFN)将所述受体构建体插入细胞的基因组中。
经由Cas9的RNA指导的基因组工程化提供了用于细胞系工程化的相对于TALEN和ZFN方法的改善。例如，使用ZFN有一些限制。首先，ZFN技术需要合成新的载体和RNA，用于在每个待修饰的新基因组整合基因座中的特异性DNA结合位点。这些通常需要昂贵的优化，因此成本和复杂性限制了将这些技术应用于一个或两个以上基因座的灵活性。相比之下，RNA指导的系统使用单一蛋白质(Cas9)，其仅需要短的RNA分子对其进行编程，用于位点特异性DNA识别。因此，Cas9-RNA复合物比类似的ZFN靶向蛋白更易于制备，并且因此所述系统更灵活。Cas9-RNA复合物在哺乳动物细胞中与TALEN和ZFN相比也具有更低的毒性。除Cas9外，也可以使用与RNA指导的基因组编辑相关的其他核酸酶。RNA指导的基因组工程化是本领域已知的。
可以将编码所述受体位点的核酸插入所述细胞基因组的任何部分，在其中可以插入DNA的外源序列而不会破坏内源基因的转录。在一些实施方案中，所述受体位点靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座或小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、H11基因座或CLYBL基因座。在一些实施方案中，将所述构建体插入基因组内没有表观遗传沉默的位置中。在一些实施方案中，将所述受体构建体插入所述宿主细胞的AAVS1基因组基因座中。在一些实施方案中，将编码所述受体位点的核酸的单拷贝掺入所述受体细胞基因组中(例如，在所述受体细胞基因组的单个等位基因上)。
编码所述受体位点的核酸可以包含两个核酸序列，其允许同源重组到细胞基因组中。在一些实施方案中，在将所述受体构建体整合到细胞的AAVS1基因组基因座中的情况下，所述受体构建体包含两个允许将所述受体构建体直接整合到所述细胞中的AAVS1序列。所述报告构建体可以包含一个或多个序列，其允许将所述构建体整合到细胞的不同基因组基因座中。可以经由同源重组或本领域已知的任何其他基因组工程化方法将所述受体构建体插入细胞基因组内的基因座中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含两个AAVS1序列，其允许将所述受体构建体直接整合到细胞的AAVS1基因座中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含两个CCR5序列，其允许将所述受体构建体直接整合到细胞的CCR5基因座中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含两个ROSA26序列，其允许将所述受体构建体直接整合到小鼠细胞的ROSA26基因座中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含小鼠ROSA26序列的两个人直向同源物，其允许将所述受体构建体直接整合到人细胞的小鼠ROSA26基因座的人直向同源物中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含两个CLYBL序列，其允许将所述受体构建体直接整合到细胞的CLYBL基因座中。在一些实施方案中，所述受体构建体包含两个H11序列，其允许将所述受体构建体直接整合到细胞的H11基因座中。
在一些实施方案中，所述文库使得能够对不同的报告细胞系进行合并筛选。例如，可以从单一等基因受体细胞系中开发出两种或更多种报告细胞系，其中可以区分所述两种或更多种报告细胞系；例如通过差异标记核。可以在一个单一测定中将所述两种或更多种报告细胞系混合在一起，从而以一种或多种途径提供多种多肽的结果。
在一些实施方案中，可以执行多达至少五个质量控制步骤，以选择整合位点完整并且以最佳性能具有完整功能的受体细胞系。在一些实施方案中，对所述受体细胞系的AAVS1基因组基因座中5'和3'插入位点处的基因组DNA测序，以确认重组过程不会触发重组位点侧翼的任何小插入、缺失或突变。在一些实施方案中，评估所述受体细胞的均质性以确保它们来自单个细胞-为此进行流式细胞术分析并且计算荧光团的变异系数(CV)。在一些实施方案中，确定所述受体细胞含有功能性四环素调控；例如，在四环素调控下，将所述细胞用BxB1和含有MTS-Venus、H2B-TagBFP的双色多顺反子构建体共转染。在一些实施方案中，报告细胞是通过抗生素抗性选择的。例如，对所形成的集落数量进行评分。选择后，将所述细胞用1μg/ml多西环素处理12-15h。接下来的验证和QC步骤是使用流式细胞术分析进行的。在一些实施方案中，将经诱导的细胞与未经诱导的细胞进行比较，以验证mCherry的损失以及Venus和TagBFP荧光的获得。在一些实施方案中，确定了报告物整合后多克隆群体中蛋白质表达的变异性。在一些实施方案中，蛋白质表达类似于在所述受体细胞系群体中的蛋白质表达。在一些实施方案中，确定了存在于所述多顺反子载体中的每种荧光团的荧光强度的CV，并且将其与亲本CV进行比较。在一些实施方案中，放置在所述受体位点上的不同蛋白质的表达是同质的，并且验证了有效载荷；例如，通过基于所表达的蛋白质的荧光强度的流式细胞术值确定相关系数(r)。
多顺反子报告载体
在一些方面，本发明提供了多顺反子报告载体，其包含：与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且其中插入所述两个或更多个多克隆位点中并且编码与所述报告多肽融合的多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。所述载体设计用于“即插即用”模式，其中根据所述多顺反子报告载体的特定用途，可以交换不同的启动子以驱动所述开放阅读框的表达，可以交换不同的目的多肽，可以交换不同的报告多肽，并且可以交换不同的选择多肽。同样，通过使用各种MCS序列插入编码任何目标多肽的核酸来设计所述多顺反子报告载体，使得标记为报告多肽的转基因产物由所述多顺反子报告载体表达。在一些实施方案中，所述多顺反子载体包含“骨架”载体，其中目的转基因尚未插入MCS序列中。在其他实施方案中，所述多顺反子载体包括其中目的转基因已经插入MCS序列中的载体，使得所述开放阅读框的表达产生不同的报告物标记的多肽。在图2和图18中提供了多顺反子报告载体的非限制性例子。
在一些实施方案中，本质上化学计量表达是与报告多肽融合的两种或更多种多肽的表达，其中与报告多肽融合的所述两种或更多种多肽的表达水平本质上是相同的；即，具有1:1的化学计量。在一些实施方案中，所述两种或更多种报告多肽的表达水平相等或变化不超过彼此的约5％、10％、15％、20％或25％中的任一个。在一些实施方案中，本质上化学计量表达是与报告多肽融合的两种、三种、四种或四种以上、两种或更多种多肽的化学计量表达。所述两种或更多种报告多肽的表达水平可以通过本领域已知的任何手段来测量；例如，通过荧光检测、通过免疫测定、通过酶测定、通过测量RNA水平(例如qPCR)等。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体的顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。在一些实施方案中，所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。在一些实施方案中，所述一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。在一些实施方案中，所述开放阅读框的一个或多个顺反子通过IRES序列与所述开放阅读框中的其他顺反子分开。在一些实施方案中，所述IRES是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、丙型肝炎病毒(HCV)IRES或肠病毒71(EV71)IRES。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含两个顺反子，其中所述两个顺反子通过编码病毒自切割肽或IRES的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述三个顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述三个顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，并且所述第二和第三顺反子通过编码自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸彼此分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述顺反子通过IRES序列彼此分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒的自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含五个或更多个顺反子，其中所述顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸和IRES序列的任何组合彼此分开。
在一些实施方案中，本发明的多顺反子报告载体包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含在一种或多种报告多肽之间的一种肽接头。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含在两种报告多肽之间的一种肽接头。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三种报告多肽，其中第一肽接头在第一报告多肽和第二报告多肽之间，并且第二肽接头在所述第二报告多肽和第三报告多肽之间。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体不存在所述第一肽接头和/或所述第二肽接头。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四种报告多肽，其中第一肽接头在第一报告多肽和第二报告多肽之间，第二肽接头在所述第二报告多肽和第三报告多肽之间，并且第三肽接头在所述第三报告多肽和第四报告多肽之间。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体不存在所述第一肽接头和/或所述第二肽接头和/或所述第三肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头是相同的肽接头(例如，Gly-Ser-Gly)。在其他实施方案中，所述多顺反子报告载体中的至少两种肽接头是不同的。
在一些实施方案中，本发明提供了包含开放阅读框的多顺反子报告载体，所述开放阅读框与启动子可操作地连接，并且其中所述开放阅读框包括两个或更多个MCS序列，其与编码报告多肽的核酸连接，使得当将编码目的转基因的核酸插入MCS中时，由所述多顺反子报告载体编码的所得的多肽包括用所述报告多肽标记的目的转基因的产物。所述开放阅读框的每个顺反子编码不同的报告多肽，使得可以在活细胞分析每种标记的转基因产物。在一些实施方案中，所述报告多肽是荧光报告多肽。在一些实施方案中，所述报告多肽可以是绿色荧光蛋白(GFP)或其任何衍生物。在一些实施方案中，所述报告多肽是非GFP衍生的荧光肽。在一些实施方案中，所述报告多肽是GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP或smURFP。在一些实施方案中，所述报告多肽是萤光素酶。在一些实施方案中，所述报告多肽是酶，其在表达时允许通过化学反应的产物可视化表达。在一些实施方案中，所述报告结构域是萤火虫萤光素酶或海肾萤光素酶。在一些实施方案中，所述报告结构域是β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含两种可诱导元件。在一些实施方案中，所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是雷帕霉素调控型启动子或固醇诱导型启动子。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与组织特异性启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述载体还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列。
位点特异性重组酶序列的例子包括但不限于FRT核酸序列、attP核酸序列和loxP核酸序列。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attB核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是loxP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attB核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，本发明提供了多顺反子报告载体，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中将编码一种或多种多肽的核酸框内插入所述一个或多个MCS中。在一些实施方案中，所述一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种多肽包括ATF4、ATF6、XBP1ΔDBBD和H2B；α-微管蛋白、线粒体靶向序列(MTS)、LC3和H2B；或53BP1、Nrf2、p53RE和H2B；Mek、Erk、Raf和Ras；H2B、棕榈酰化信号和MTS；或H2B、MTS和α-辅肌动蛋白2。在一些实施方案中，本发明提供了多种多顺反子报告载体，其中所述多种多顺反子报告载体用于分析选自单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态和毒性反应的特定靶标；其中每种载体编码至少一种共同多肽(例如，H2B)，其可以用于鉴定接受了编码靶向特定靶标的多肽的一种或多种所述多顺反子载体的细胞。在一些方面，所述共同多肽可以被认为是所述特定靶标的条形码。
在一些实施方案中，本发明提供了一种如上所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含一种、两种或三种转录单元，其包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。在一些实施方案中，所述一种、两种或三种转录单元编码转录因子、或可能有助于本文所述的测定的其他因子。
在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含编码与报告多肽融合的H2B并且与MLC2v启动子、SLN启动子或SHOX2启动子可操作地连接的核酸，因此使得报告物能够在心脏亚型细胞中表达。在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含编码与报告多肽融合的H2B并且与vGAT启动子、TH启动子、GFAP启动子或vGLUT启动子可操作地连接的核酸，因此使得报告物能够在神经亚型细胞中表达。
多报告细胞
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含上述任何受体细胞的多报告细胞，其中已经将上述多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的基因组中。在一些实施方案中，已经将所述多顺反子报告载体整合到受体细胞基因组中的特定位点中。在一些实施方案中，所述受体细胞基因组中的特定位点是腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hipp11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)。在一些实施方案中，将所述多顺反子报告载体的单拷贝整合到所述受体细胞基因组中。
在一些实施方案中，将上述任何多顺反子报告载体插入受体细胞中以产生本发明的多报告细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种多报告细胞，其中所述报告细胞包含多顺反子报告构建体，其中所述多顺反子报告构建体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子；其中每个顺反子包含编码与不同报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；并且其中所述转基因产物的表达是本质上化学计量的。在一些实施方案中，所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。在图5中提供了多报告细胞中的报告构建体的非限制性例子。
在一些实施方案中，本质上化学计量表达是两种或更多种转基因产物的表达，其中所述两种或更多种转基因产物的表达水平本质上是相同的；即，具有1:1的化学计量。在一些实施方案中，所述两种或更多种报告多肽的表达水平相等或变化不超过彼此的约5％、10％、15％、20％或25％中的任一个。在一些实施方案中，本质上化学计量表达是两种、三种、四种或四种以上的转基因产物的化学计量表达。所述两种或更多种报告多肽的表达水平可以通过本领域已知的任何手段来测量；例如，通过荧光检测、通过免疫测定、通过酶测定、通过测量RNA水平(例如qPCR)等。
在一些实施方案中，插入所述多报告细胞中的多顺反子报告载体的顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。在一些实施方案中，所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。在一些实施方案中，所述一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。在一些实施方案中，所述开放阅读框的一个或多个顺反子通过IRES序列与所述开放阅读框中的其他顺反子分开。在一些实施方案中，所述IRES是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、丙型肝炎病毒(HCV)IRES或肠病毒71(EV71)IRES。
在一些实施方案中，所述多报告细胞包含多顺反子报告载体，其中所述多顺反子报告载体包含两个顺反子，其中所述两个顺反子通过编码病毒自切割肽或IRES的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述三个顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述三个顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含三个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，并且所述第二和第三顺反子通过编码自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸彼此分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述顺反子通过IRES序列彼此分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过编码病毒的自切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，所述第二和第三顺反子通过IRES序列分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含四个顺反子，其中所述第一和第二顺反子通过IRES序列分开，所述第二和第三顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸分开，并且所述第三和第四顺反子通过IRES序列分开。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含五个或更多个顺反子，其中所述顺反子通过编码病毒自切割肽的核酸和IRES序列的任何组合彼此分开。
在一些实施方案中，所述多报告细胞包含多顺反子报告载体，所述多顺反子报告载体包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，所述多顺反子报告载体包含开放阅读框，所述开放阅读框与启动子可操作地连接，并且其中所述开放阅读框包括两个或更多个MCS序列，其与编码报告多肽的核酸连接，使得当将编码目的转基因的核酸插入MCS中时，由所述多顺反子报告载体编码的所得的多肽包括用所述报告多肽标记的目的转基因的产物。
所述开放阅读框的每个顺反子编码不同的报告多肽，使得可以在活细胞分析每种标记的转基因产物。在一些实施方案中，所述报告多肽是荧光报告多肽。在一些实施方案中，所述报告多肽可以是绿色荧光蛋白(GFP)或其任何衍生物。在一些实施方案中，所述报告多肽是非GFP衍生的荧光肽。在一些实施方案中，所述报告多肽是GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP或smURFP。在一些实施方案中，所述报告多肽是萤光素酶。在一些实施方案中，所述报告多肽是酶，其在表达时允许通过化学反应的产物可视化表达。在一些实施方案中，所述报告结构域是萤火虫萤光素酶或海肾萤光素酶。在一些实施方案中，所述报告结构域是β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。在一些实施方案中，本发明提供了一种多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
在一些实施方案中，所述多报告细胞的多顺反子报告载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含两种可诱导元件。在一些实施方案中，所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是雷帕霉素调控型启动子或固醇诱导型启动子。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述开放阅读框与组织特异性启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述载体还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列，将其用于将所述多顺反子报告载体靶向所述细胞中的特定位点。位点特异性重组酶序列的例子包括但不限于FRT核酸序列、attP核酸序列和loxP核酸序列。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是attB核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是loxP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attP核酸。在一些实施方案中，所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸和attB核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含含有两个或更多个顺反子的开放阅读框，其中每个顺反子编码与报告多肽融合的转基因产物。在一些实施方案中，所述转基因编码可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包括ATF4、ATF6、XBP1ΔDBBD和H2B；α-微管蛋白、线粒体靶向序列(MTS)、LC3和H2B；或53BP1、Nrf2、p53RE和H2B；Mek、Erk、Raf和Ras；H2B、棕榈酰化信号和MTS；或H2B、MTS和α-辅肌动蛋白2。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如上所述的多顺反子报告载体的多报告细胞，其中所述载体包含一种、两种或三种另外的转录单元，其包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。在一些实施方案中，所述一种、两种或三种转录单元编码转录因子、或可能有助于本文所述的测定的其他因子。在一些实施方案中，至少所述另外的转录单元包含与启动子可操作地连接的编码报告分子的核酸。
在一些实施方案中，所述多报告细胞可以是干细胞，其可以分化为不同的谱系。例如，所述多报告细胞可以是全能、多能、多潜能或祖干细胞。在一些实施方案中，所述多报告细胞是全能干细胞，其具有至少分化为所有胚胎和胚外谱系的能力。在一些实施方案中，所述多报告细胞是多能干细胞。在一些实施方案中，所述报告多能干细胞是从动物中分离的胚胎多能干细胞。在一个特定的实施方案中，所述报告多能干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述报告多能干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述报告多能干细胞是诱导多能干细胞。用于开发报告iPS细胞的iPS细胞可能是通过经由转染、piggy-Bac、附加型或蛋白质重编程方法进行重编程而产生的。用于开发报告iPS细胞的iPS可能是通过对外胚层、内胚层、中胚层、胎盘、绒毛膜或滋养外胚层谱系的体细胞、终末分化细胞或部分分化的细胞进行重编程而产生的。例如，所述报告iPS细胞可能衍生自成纤维细胞、外周血细胞、脐带血内皮细胞、脐带血干细胞、脂肪衍生的干细胞、肝细胞、角质形成细胞、神经干细胞、胰腺β细胞或羊膜细胞。所述报告iPS细胞可能衍生自已建立的iPS细胞系，或可能衍生自患者特异性iPS细胞。在一些实施方案中，所述报告iPS细胞衍生自通过对免疫特权细胞进行重编程而产生的iPS细胞。
在一些实施方案中，所述多报告细胞是多潜能或祖细胞。所述多报告细胞可以是造血细胞、内皮祖细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞。在一些实施方案中，所述多报告细胞是脐带内皮细胞、脐带血干细胞、脂肪衍生的干细胞、肝细胞、角质形成细胞、神经干细胞、胰腺β细胞或羊膜细胞。
所述干细胞可以分化为任何祖细胞或终末细胞谱系。一般或谱系特异性分化的方法是本领域已知的。可以使用本领域已知的任何方法来使所述干细胞分化。例如，可以使用驱动分化的一种或多种因子或分子、一种或多种细胞基质、类胚体形成或上述的组合来使所述干细胞分化。在一些实施方案中，所分化的细胞是多报告细胞。
所述细胞可以分化为心肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、GABA能神经元、星形胶质细胞、多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元、肝细胞、成肝细胞、骨骼肌成肌细胞、巨噬细胞、皮层神经元、心房心肌细胞、心室心肌细胞、浦肯野纤维、基底细胞、鳞状细胞、肾细胞、胰腺β细胞、上皮细胞、间充质细胞、肾上腺皮质细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、胃肠道细胞、结直肠细胞、导管细胞、小叶细胞、淋巴细胞、视网膜细胞、光感受器细胞或耳蜗细胞。
在一些实施方案中，所述报告iPS细胞包含如以上实施方案中任一项所述的多顺反子报告物，其中所述多顺反子报告物通过仅在多能细胞中有活性的启动子驱动。例如，与包含两个或更多个顺反子的开放阅读框可操作地连接的所述启动子可以是Oct-4、Sox2、Nanog、KLF4、TRA-1-60、TRA-2-54、TRA-1-81、SSEA1、SSEA4或任何多能性相关基因的启动子。
可以通过监测与毒性相关的各种肽在细胞内或细胞之间的表达和或移动来测试毒性。例如，蛋白质的表达和移动参与未折叠的蛋白质反应、自噬、DNA损伤、氧化应激和p53依赖性应激反应。
在一些实施方案中，所述多报告细胞是永生细胞。例如，所述报告物可以是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。在一些实施方案中，所述多报告细胞是原代细胞。
多报告细胞可以用于测试毒性、测试和监测细胞中各种分子的作用、测试细胞中不同疗法的作用或监测响应于刺激蛋白质在细胞中的移动。分子和疗法的例子包括化学品、化学组合物、小生物制剂、纳米颗粒、肽、抗体、疫苗及其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于产生多报告细胞的方法，所述方法包括将本文所述的多顺反子报告载体引入如本文所述的任何受体细胞中。在一些实施方案中，将所述多特异性报告载体插入所述受体细胞重组酶系统的受体位点中。在一些实施方案中，所述多顺反子报告载体包含重组酶相关核酸，其可以经由所述受体细胞中的重组酶蛋白插入所述受体细胞的重组酶相关核酸中。在一些实施方案中，将编码所述重组酶蛋白的核酸稳定地引入所述受体细胞中。在一些实施方案中，将编码所述重组酶的核酸瞬时引入所述受体细胞中。在一些实施方案中，在引入所述多顺反子报告载体之前、同时或之后，将编码所述重组酶的核酸瞬时引入所述受体细胞中。在一些实施方案中，将所述重组酶蛋白引入所述受体细胞中。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸序列是FRT核酸序列，并且所述受体细胞包含flp重组酶。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸是attP，并且所述受体细胞包含Bxb1重组酶、PhiC31重组酶或R4重组酶。在一些实施方案中，所述重组酶相关核酸序列是loxP核酸序列，并且所述受体细胞包含CRE重组酶。
文库
在一些方面，本发明提供了一种或多种多顺反子报告载体文库，其中所述文库包含含有不同转基因的多顺反子报告分子，所述转基因编码与报告多肽融合的多肽，其中当引入细胞中时，每种载体上的两个或更多个所述不同转基因是本质上化学计量地表达的。在一些实施方案中，所述文库包含编码一个或多个转基因的报告载体，所述转基因编码可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态、毒性反应和/或表型特征的多肽。在一些实施方案中，所述文库用于使用表型读出可视化生物途径或靶读出。在一些实施方案中，所述文库包含两种或更多种不同的多顺反子报告载体。在一些实施方案中，所述文库包含约两种和约10种、约10种和约20种、约20种和约30种、约30种和约40种、约40种和约50种、约50种和约100种、约100种和约500种、约500种和约100种、约1000种和约10,000种中的任一个之间的不同的多顺反子报告载体。在一些实施方案中，所述文库包含超过约10,000种不同的多顺反子报告载体。
在一些方面，本发明提供了一种或多种多顺反子报告细胞文库，其中所述文库包含含有不同转基因的多种多顺反子报告细胞，所述转基因编码与报告多肽融合的多肽，其中当引入细胞中时，每种载体上的两个或更多个所述不同转基因是本质上化学计量地表达的。在一些实施方案中，所述文库包含编码一个或多个转基因的多种报告细胞，所述转基因编码可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。在一些实施方案中，所述文库包含约两种和约10种、约10种和约20种、约20种和约30种、约30种和约40种、约40种和约50种、约50种和约100种、约100种和约500种、约500种和约100种、约1000种和约10,000种中的任一个之间的不同的多顺反子报告细胞。在一些实施方案中，所述文库包含超过约10,000种不同的多顺反子报告细胞。在一些实施方案中，所述多个多顺反子报告细胞是等基因的；即，衍生自引入了不同多顺反子载体的共同受体细胞。
在一些实施方案中，本质上化学计量表达是两个或更多个转基因的表达，其中所述两个或更多个转基因的表达水平本质上是相同的；即，具有1:1的化学计量。在一些实施方案中，所述两种或更多种报告多肽的表达水平相等或变化不超过彼此的约5％、10％、15％、20％或25％中的任一个。在一些实施方案中，本质上化学计量表达是所述多顺反子报告载体的两个、三个、四个或四个以上的转基因的化学计量表达。所述两个或更多个转基因的表达水平可以通过本领域已知的任何手段来测量；例如，通过荧光检测、通过免疫测定、通过酶测定、通过测量RNA水平(例如qPCR)等。
在一些实施方案中，所述文库包含多顺反子报告载体，以分析与疾病相关的生物途径。在一些实施方案中，所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。在一些实施方案中，所述文库包含多顺反子报告载体，以分析与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、或氧化应激、染色质/表观遗传学(例如染色质乙酰化)、MAPK信号传导(例如MAPK/Erk)、PI3K/Akt信号传导(例如mTor信号传导)、翻译控制(例如eIF2调控)、细胞周期和检查点控制(G1/S检查点)、细胞代谢(例如胰岛素受体信号传导)、发育和分化信号传导(例如Wnt信号传导)、免疫学和炎症信号传导(例如JAK/STAT信号传导)、酪氨酸激酶信号传导(例如ErbB/HER信号传导)、膜泡运输、细胞骨架调控或蛋白质降解(例如泛素途径)相关的生物途径以及这些途径的任何合成致死组合。在一些实施方案中，所述文库的包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态或特定的毒性反应的转基因的每种多顺反子载体包含编码与报告多肽融合的多肽的共同转基因。此类共同报告转基因可以用于鉴定接受针对共同谱靶标的多顺反子报告载体的细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了用于接受多顺反子报告载体的受体细胞文库。在一些实施方案中，所述文库包含两种或更多种如本文所述的不同的受体细胞。在一些实施方案中，所述文库包含约两种和约10种、约10种和约20种、约20种和约30种、约30种和约40种、约40种和约50种、约50种和约100种、约100种和约500种中的任一个之间的不同的受体细胞。在一些实施方案中，所述文库包含超过约500种不同的受体细胞。在一些实施方案中，可以将共同多顺反子报告载体引入两种或更多种受体细胞中，以比较不同细胞背景下的谱。
在一些实施方案中，本发明提供了多报告细胞文库，其中每种细胞包含多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的多肽的不同转基因，其中当引入细胞中时，每种载体上的所述不同转基因是本质上化学计量地表达的。在一些实施方案中，所述文库包含约两种和约10种、约10种和约20种、约20种和约30种、约30种和约40种、约40种和约50种、约50种和约100种、约100种和约500种中的任一个之间的不同的多报告细胞。在一些实施方案中，靶向共同途径的不同多顺反子报告载体具有共同的报告多肽，作为鉴定接受了相关多顺反子报告载体的细胞的手段。
在一些实施方案中，所述受体细胞文库和/或所述多报告细胞文库包含不同的永生细胞。在一些实施方案中，所述文库包括HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述受体细胞文库和/或所述多报告细胞文库包含不同的多能、多潜能和/或祖细胞。在一些实施方案中，所述不同的多能或多潜能细胞包括诱导多能干细胞、多潜能细胞、造血细胞、内皮祖受体细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，在引入所述多顺反子报告载体后，使所述多能或多潜能细胞多报告细胞文库分化。在一些实施方案中，所述文库包括WTC-11iPSC或NCRM5 iPSC中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述受体细胞文库和/或所述多报告细胞文库包含不同的原代细胞。在一些实施方案中，所述原代细胞包含心肌细胞、肌肉细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经元或肿瘤细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述多报告细胞文库中的每种细胞包含相同的多顺反子报告载体。在其他实施方案中，所述多报告细胞文库中的细胞包含不同的多顺反子报告载体。在一些实施方案中，将所述不同的多顺反子报告载体引入等基因受体细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供了多报告细胞文库，其中所述报告细胞包含编码与报告多肽融合的一种或多种多肽的多顺反子报告载体，所述报告多肽可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰或细胞稳态。在一些实施方案中，所述生物途径是与疾病相关的途径。在一些实施方案中，所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。在一些实施方案中，所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复或氧化应激、染色质/表观遗传学(例如染色质乙酰化)、MAPK信号传导(例如MAPK/Erk)、PI3K/Akt信号传导(例如mTor信号传导)、翻译控制(例如eIF2调控)、细胞周期和检查点控制(G1/S检查点)、细胞代谢(例如胰岛素受体信号传导)、发育和分化信号传导(例如Wnt)、免疫学和炎症信号传导(例如JAK/STAT信号传导)、酪氨酸激酶信号传导(例如ErbB/HER信号传导)、膜泡运输、细胞骨架调控或蛋白质降解(例如泛素途径)相关的途径以及这些途径的合成致死组合。在一些实施方案中，所述多报告细胞文库包含含有转基因的不同多顺反子载体，所述转基因用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态或特定的毒性反应，其中每种不同的多顺反子报告载体包含与编码报告多肽的核酸融合的共同转基因。在一些实施方案中，与报告多肽融合的共同转基因产物用作鉴定接受了相关多顺反子报告载体的细胞的手段。
测定
本发明提供了使用本文所述的细胞和载体的活细胞测定。在一些实施方案中，所述测定在单个活细胞上进行。在一些实施方案中，本发明提供了一种分析活细胞中的两种或更多种多肽的方法，所述方法包括确定如本文所述的多报告细胞的所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，所述方法用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态、毒性反应和/或表型特征。在一些实施方案中，所述测定用于使用表型读出可视化生物途径或靶读出。在一些实施方案中，在一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，在所述分析开始后1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天、30天、1个月、3个月、6个月、9个月、1年或之间的任何时间或1年以上中的一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
在一些实施方案中，转基因产物的位置是细胞膜、细胞核、细胞核膜、线粒体、线粒体膜、自噬体、溶酶体、内体、高尔基体或胞质溶胶中的一种或多种。
在一些实施方案中，本发明提供了测量药剂对活细胞中的两种或更多种多肽的谱的影响的方法，所述方法包括使如本文所述的多报告细胞经受所述药剂以及确定响应于所述药剂在所述细胞中所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。在一些实施方案中，所述药剂是药物或候选药物。在一些实施方案中，所述药剂是癌症药物或癌症药物剂。在一些实施方案中，所述方法是毒理学筛选。
在一些实施方案中，转基因产物的位置是细胞膜、细胞核、细胞核膜、线粒体、线粒体膜、自噬体、溶酶体、内体、高尔基体或胞质溶胶中的一种或多种。
在以上测定和方法的一些实施方案中，从单个活细胞中获得所述谱。在一些实施方案中，为多个活细胞确定所述谱。在一些实施方案中，将所述细胞在组织培养板上培养，所述组织培养板包括但不限于多孔组织培养板，如96孔或384孔组织培养板。在一些实施方案中，将所述细胞悬浮培养。
在以上测定和方法的一些实施方案中，在多报告细胞文库中确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
在一些实施方案中，通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光、使用读板仪、质谱或深度测序测量所述两种或更多种多肽的表达和/或位置。
在一些实施方案中，将所述谱配置为一组三种多色报告物，针对共同的细胞反应。这些报告物使得10个不同的荧光读出能够区分所述细胞反应的方面。所有三种报告物都有H2B作为DNA/核标记，我们将其用不同的荧光标记谱地进行标记，以便使得在合并测定中使用时能够区分它们的谱。由于H2B/核标记物允许通过报告物进行自动图像分析聚类，因此在同一孔中合并等基因报告细胞使得能够进行至少10个读出的高度多重测定。
在一些实施方案中，将所述谱配置为一组三种多色“Tox”报告物，针对未折叠的蛋白质反应组(panel)、细胞器组以及DNA损伤、氧化和p53应激组。这些报告物使得10个不同的荧光读出能够将早期应激反应(氧化应激、UPR和p53依赖性细胞应激反应)与后期应激反应(DNA双链断裂、自噬、细胞周期以及总体核和线粒体稳态)区分开来。所有三种Tox报告物都有H2B作为DNA/核标记，我们将其用不同的荧光标记谱地进行标记，以便使得在合并测定中使用时能够区分它们的谱。由于H2B/核标记物允许通过报告物进行自动图像分析聚类，因此在同一孔中合并等基因报告细胞使得能够进行至少10个读出的高度多重测定。
试剂盒和制品
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种如本文所述的多顺反子报告载体的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种如本文所述的受体细胞的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种本文所述的多报告细胞的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种本文所述的多顺反子报告载体和一种或多种如本文所述的受体细胞的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含使用本文所述的多顺反子报告载体、受体细胞和/或多报告细胞的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包含等基因但差异标记的多报告细胞的混合物。此类细胞使得能够直接铺板合并测定。
在一些实施方案中，本发明提供了一种排列在多孔板(例如，96孔板或384孔板)中的受体细胞和/或报告细胞文库。在一些实施方案中，将在所述多孔板中的细胞冷冻保存。
本文所述的多顺反子报告载体、受体细胞和/或多报告细胞可以包含在制品内。所述制品可以包含含有本文所述的多顺反子报告载体、受体细胞和/或多报告细胞的容器。在一些实施方案中，所述制品包含：(a)容器，在所述容器内包含本文所述的多顺反子报告载体、受体细胞和/或多报告细胞；和(b)包装说明书，其具有使用本文所述的多顺反子报告载体、受体细胞和/或多报告细胞的说明。
在一些实施方案中，所述制品包含容器以及在所述容器上或与其相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料(如玻璃或塑料)形成。所述制品还可以包括从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、试剂、组织培养基、过滤器、针和注射器。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含排列在多孔板中的受体细胞或报告细胞文库的试剂盒。在一些实施方案中，将所述细胞铺板、冷冻保存。
示例性实施方案
1.一种多顺反子报告载体，其包含：与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，并且其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且其中插入所述两个或更多个多克隆位点中的编码多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。
2.根据实施方案1所述的多顺反子报告载体，其中所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。
3.根据实施方案2所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。
4.根据实施方案3所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。
5.根据实施方案4所述的多顺反子报告载体，其中一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。
6.根据实施方案2-5中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽还包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。
7.根据实施方案6所述的多顺反子报告载体，其中所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽是荧光报告多肽。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的多顺反子报告载体，其中每个顺反子的所述报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。
11.根据实施方案1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。
12.根据实施方案1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。
13.根据实施方案1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。
15.根据实施方案14所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含两种可诱导元件。
16.根据实施方案14或15所述的多顺反子报告载体，其中所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组成型启动子。
18.根据实施方案17所述的多顺反子报告载体，其中所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
19.根据实施方案1-16中任一项所述的多顺反子载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
20.根据实施方案19所述的多顺反子载体，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
21.根据实施方案1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
22.根据实施方案21所述的多特异性报告载体，其中所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列。
24.根据实施方案23所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。
25.根据实施方案24所述的多顺反子报告载体，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸和/或loxP核酸序列。
26.根据实施方案24或25所述的多顺反子报告载体，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的多顺反子报告载体，其中将编码一种或多种多肽的核酸框内插入所述一个或多个MCS中。
28.根据实施方案27所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含一种、两种或三种转录单元，所述转录单元包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。
30.一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞，其中所述受体细胞包含整合到宿主细胞基因组中的特定位点的重组核酸，其中所述重组核酸包含与编码融合多肽的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述融合多肽包含报告结构域和可选择标记结构域，并且其中所述核酸包含位于编码所述融合多肽的核酸的5'末端的位点特异性重组酶核酸序列。
31.根据实施方案30所述的受体细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
32.根据实施方案31所述的受体细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
33.根据实施方案32所述的受体细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
34.根据实施方案33所述的受体细胞，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
35.根据实施方案30-34中任一项所述的受体细胞，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
36.根据实施方案30-35中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是荧光报告结构域。
37.根据实施方案30-36中任一项所述的受体细胞，其中所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
38.根据实施方案30-37中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是mCherry报告结构域。
39.根据实施方案30-38中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的可选择标记结构域赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
40.根据实施方案30-39中任一项所述的受体细胞，其中所整合的重组核酸还包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。
41.根据实施方案40所述的受体细胞，其中所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
42.根据实施方案30-41中任一项所述的受体细胞，其中将所述重组核酸整合到腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hip11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)中。
43.根据实施方案30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是永生细胞。
44.根据实施方案30-43中任一项所述的受体细胞，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
45.根据实施方案30-44中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
46.根据实施方案30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是原代细胞。
47.一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含
a)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸，
b)第一启动子，
c)位点特异性重组酶核酸，
d)编码第一报告多肽和可选择标记的核酸，
e)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸，
f)第二启动子和编码第二报告多肽的核酸，
其中表达所述第一报告多肽而不表达所述第二报告多肽指示将所述重组核酸的整合靶向所述细胞基因组中的特定位点，并且表达所述第一和第二报告多肽指示随机整合在所述细胞基因组中。
48.根据实施方案47所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码四环素阻遏物的核酸，其与用于靶向同源重组的第二核酸的5'的启动子可操作地连接。
49.根据实施方案47或48所述的方法，其中使用以下将所述重组核酸整合到所述细胞的基因组中：
a)包含核酸酶和指导RNA的RNA指导的重组系统，
b)TALEN核酸内切酶，或
c)ZFN核酸内切酶。
50.根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中选择表达所述第一报告多肽但不表达所述第二报告多肽的细胞。
51.根据实施方案47-50中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶核酸是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
52.根据实施方案47-51中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是荧光多肽，并且所述第二报告多肽是不同的荧光多肽。
53.根据实施方案47-52中任一项所述的方法，其中所述第一和第二报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
54.根据实施方案47-53中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是mCherry报告物，并且所述第二报告多肽是GFP。
55.根据实施方案47-54中任一项所述的方法，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
56.根据实施方案47-55中任一项所述的方法，其中所述第一启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
57.根据实施方案47-56中任一项所述的方法，其中用于靶向同源重组的所述第一核酸和用于靶向同源重组的所述第二核酸将重组靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、H11基因座或CLYBL基因座。
58.根据实施方案47-57中任一项所述的方法，其中所述细胞是永生细胞。
59.根据实施方案47-58中任一项所述的方法，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
60.根据实施方案47-59中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述诱导多能干细胞是WTC-11细胞或NCRM5细胞。
62.根据实施方案47-58中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
63.一种受体细胞系，其用根据实施方案47-62中任一项所述的方法产生。
64.一种多报告细胞，其包含根据实施方案30-46中任一项所述的受体细胞，其中已经将根据实施方案27或28所述的多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的基因组中。
65.根据实施方案64所述的多报告细胞，其中已经将所述多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的AAVS1基因座中。
66.一种多报告细胞，其包含多顺反子报告构建体，其中所述多顺反子报告构建体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子；其中每个顺反子包含编码与不同报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；并且其中所述转基因产物的表达是本质上化学计量的。
67.根据实施方案66所述的多报告细胞，其中所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。
68.根据实施方案66或68所述的多报告细胞，其中每种所述报告多肽是荧光报告多肽。
69.根据实施方案66-68中任一项所述的多报告细胞，其中所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
70.根据实施方案66-69中任一项所述的多报告细胞，其中所述一种或多种自切割肽是一种或多种2A肽。
71.根据实施方案66-70中任一项所述的多报告细胞，其中编码与所述报告多肽融合的转基因产物的核酸还包含一种或多种核酸，其编码在所述报告多肽和病毒自切割肽之间的肽接头。
72.根据实施方案71所述的多报告细胞，其中所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
73.根据实施方案66-72中任一项所述的多报告细胞，其中所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含编码与荧光报告多肽融合的转基因产物的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
74.根据实施方案66-73中任一项所述的多报告细胞，其中所述多顺反子报告载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和所述开放阅读框之间。
75.根据实施方案74所述的多报告细胞，其中所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
76.根据实施方案66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
77.根据实施方案76所述的多报告细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
78.根据实施方案66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是组织特异性启动子。
79.根据实施方案78所述的多报告细胞，其中所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
80.根据实施方案66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
81.根据实施方案80所述的多报告细胞，其中所述诱导型启动子是TRE启动子。
82.根据实施方案66-81中任一项所述的多报告细胞，其中所述一种或多种转基因产物包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
83.根据实施方案82所述的多报告细胞，其中所述分析在单个细胞上进行。
84.根据实施方案64-83中任一项所述的多报告细胞，其中所述报告多肽可以通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光或使用读板仪可视化。
85.根据实施方案66-84中任一项所述的多报告细胞，其还包含一种、两种或三种转录单元，所述转录单元包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列。
86.一种用于产生多报告细胞的方法，所述方法包括将根据实施方案27或28所述的多顺反子报告载体引入根据实施方案33-49中任一项所述的受体细胞中。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述重组酶相关核酸序列是FRT核酸序列，并且所述受体细胞包含flp重组酶。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述重组酶相关核酸是attP，并且所述受体细胞包含Bxb1重组酶、PhiC31重组酶或R4重组酶。
89.根据实施方案87所述的方法，其中所述重组酶相关核酸序列是loxP核酸序列，并且所述受体细胞包含CRE重组酶。
90.一种多报告载体文库，其中所述文库包含根据实施方案1-29中任一项所述的多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，或者其中所述文库包含根据实施方案64-85中任一项所述的多种报告细胞，其中当引入细胞中时，每种载体上的两种或更多种所述不同转基因产物是本质上化学计量地表达的。
91.根据实施方案90所述的文库，其中所述报告载体编码两个或更多个转基因，其编码可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
92.根据实施方案90或91所述的文库，其中所述生物途径是与疾病相关的途径。
93.根据实施方案92所述的文库，其中所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。
94.根据实施方案92或93所述的文库，其中所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。
95.根据实施方案92或93所述的文库，其中所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。
96.根据实施方案90-95中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织的转基因的每种多顺反子载体对于每种多顺反子报告载体而言包含与不同报告多肽融合的共同转基因产物。
97.根据实施方案90-96中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态或特定的毒性反应的转基因的每种多顺反子载体包含与报告多肽融合的共同转基因产物。
98.一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞文库，其中所述文库包含根据实施方案30-46所述的受体细胞。
99.一种多报告细胞文库，其中所述文库中的每种细胞包含多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中当引入细胞中时，每种载体上的编码不同转基因产物的所述不同核酸是本质上化学计量地表达的。
100.根据实施方案98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的永生细胞。
101.根据实施方案100所述的文库，其中所述文库包含HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞中的一种或多种。
102.根据实施方案98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的多能、多潜能和/或祖细胞。
103.根据实施方案102所述的文库，其中所述不同的多能或多潜能细胞包含诱导多能干细胞、多潜能细胞、造血细胞、内皮祖受体细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞中的一种或多种。
104.根据实施方案98或99所述的文库，其中在引入所述多顺反子报告载体后，使所述多能或多潜能细胞多报告细胞文库分化。
105.根据实施方案98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的原代细胞。
106.根据实施方案105所述的文库，其中所述原代细胞包含心肌细胞、肌肉细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经元或肿瘤细胞中的一种或多种。
107.根据实施方案99-106中任一项所述的文库，其中所述文库中的每种细胞包含相同的多顺反子报告载体。
108.根据实施方案99-107中任一项所述的细胞文库，其中所述文库中的细胞包含不同的多顺反子报告载体。
109.根据实施方案108所述的细胞文库，其中将不同的多顺反子报告载体引入等基因受体细胞中。
110.根据实施方案99-109中任一项所述的细胞文库，其中所述报告载体编码一个或多个转基因，一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态或表型特征的多肽。
111.根据实施方案110所述的文库，其中所述生物途径是与疾病相关的途径。
112.根据实施方案111所述的文库，其中所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。
113.根据实施方案110中任一项所述的文库，其中所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。
114.根据实施方案110-113中任一项所述的文库，其中所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。
115.根据实施方案99-114中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织或特定的表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与不同报告多肽融合的多肽的共同转基因。
116.根据实施方案99-115中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应或特定的表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与报告多肽融合的多肽的共同转基因。
117.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-29中任一项所述的一种或多种多顺反子报告载体。
118.一种试剂盒，其包含根据实施方案30-46中任一项所述的一种或多种受体细胞。
119.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-29中任一项所述的一种或多种多顺反子报告载体和根据实施方案30-46中任一项所述的一种或多种受体细胞。
120.一种试剂盒，其包含根据实施方案64-85中任一项所述的一种或多种多报告细胞。
121.根据实施方案118-120中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含排列在多孔板中的受体细胞和/或报告细胞文库。
122.根据实施方案121所述的试剂盒，其中将在所述多孔板中的细胞冷冻保存。
123.一种分析活细胞中的两种或更多种多肽的方法，所述方法包括确定根据实施方案64-85中任一项所述的多报告细胞或包含根据实施方案1-29中任一项所述的多顺反子载体的细胞的所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
124.根据实施方案123所述的方法，其中所述方法用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应。
125.根据实施方案123或124所述的方法，其中在一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
126.根据实施方案125所述的方法，其中在1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天、30天、1个月、3个月、6个月、9个月、1年或1年以上中的一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
127.根据实施方案123-126中任一项所述的方法，其中所述细胞通过根据实施方案86-89中任一项所述的方法来制备。
128.根据实施方案123-126中任一项所述的方法，其中所述细胞是根据实施方案90-116所述的细胞文库。
129.根据实施方案129所述的方法，其中所述细胞衍生自等基因受体细胞。
130.根据实施方案128或129所述的方法，其中在分析之前将所述细胞或所述文库合并。
131.一种测量药剂对活细胞中的两种或更多种多肽的谱的影响的方法，所述方法包括使根据实施方案64-85中任一项所述的多报告细胞经受所述药剂以及确定响应于所述药剂在所述细胞中所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
132.根据实施方案131所述的方法，其中所述药剂是药物或候选药物。
133.根据实施方案131或132所述的方法，其中所述方法是毒理学筛选。
134.根据实施方案131-133中任一项所述的方法，其中在多报告细胞文库中确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
135.根据实施方案131-134中任一项所述的方法，其中使用单个细胞获得所述谱。
136.根据实施方案131-135中任一项所述的方法，其中通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光、使用读板仪、质谱或深度测序测量所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
本说明书中公开的所有特征能以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另外明确说明，所公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的例子。
通过以下非限制性实施例说明本发明的进一步细节。本说明书中所有参考文献的公开内容明确地通过引用并入本文。
实施例
实施例1.单克隆受体细胞的开发
优化了基因组编辑工具，以产生含有“受体位点”的单克隆细胞系。使用受体位点使得能够可靠、快速并且一致地位点特异性整合精选的报告构建体。受体位点(图1A，下图)包含1)指导受体位点整合到AAVS1基因座中的两个AAVS1序列；2)通过显微术可见的荧光标记物(mCherry)；3)抗生素(博莱霉素-Thermo Fisher)抗性选择标记；4)用于通过翻转酶(Flp)对报告构建体进行位点特异性重组的FRT位点；5)组成型启动子SV40，其驱动博莱霉素(Thermo ScientificTM)抗性基因和mCherry表达，从而使得能够分别进行抗生素选择和荧光筛选以鉴定阳性受体细胞克隆；6)驱动四环素阻遏蛋白(TetR)的人b-肌动蛋白启动子。
使用Cas9介导的基因组编辑方案，将受体位点稳定地整合到目的细胞的基因组中。根据受体位点的设计，将AAVS1基因座用作整合位点。合成受体位点并且将其克隆到AAVS1-供体载体(GeneCopoeiaTM)中，并且用Cas9:sgRNA(AAVS1)(一种指导RNA(gRNA)，与目标AAVS1序列互补)共转染，从而在单个整合位点(IS)(即位于19号染色体PPP1R12C基因座外显子1和2之间的AAVS1基因座)处得到稳定的整合。将转染和连接PCR与Southern印迹分析相结合用于确认选择后在受体细胞克隆中获得的正确的受体位点整合。
将受体位点转染到HEK 293T、U2OS、A549、HeLa、RPE和NPC1细胞(在2-4个96孔板中铺板)中。使用Lipofectamine 3000(Life TechnologiesTM)并且按照制造商建议的方案，成功转染了HEK 293T、U2OS、A549和Hela细胞，效率超过60％(如通过mCherry阳性细胞的数量估计的)。使用Lipofectamine和相同的方案，RPE和NPC1细胞系显示出非常低(<2％)的转染效率。
还尝试使用
转染系统(Thermo ScientificTM)在变化的细胞密度、构建体浓度和施加电压的4种不同条件下通过电穿孔转染RPE和NPC1细胞系。其中一种测试条件(1350V，20ms脉冲，两个脉冲，尖端为10μl)导致RPE细胞的转染效率高(>60％)，然而NPC1系的转染未成功。
使用博莱霉素选择富集具有受体位点整合的U2OS、HEK293T、RPE、A549和HeLa克隆后，产生每种细胞系的单个集落，并且通过PCR和随机整合筛选在AAVS1基因座处的整合；并且通过Southern印迹筛选位点特异性单/双等位基因整合。将mCherry阳性且具博莱霉素抗性的克隆以1-2个细胞/孔在3-5个96孔板中铺板，并且使用连接PCR进行筛选。如通过连接PCR评估的，确认约58％-91％的克隆具有位点特异性整合(表1)。
表1
设计了两种用于Southern印迹的探针：5'探针(图1A，上图)，用以确认在AAVS1基因座处受体位点的单等位基因整合；和内部探针(图1A，下图)，用以确认基因组中的单拷贝整合而没有随机整合。用EcoRI消化基因组DNA后，在整合在两个等位基因中的情况下，5'探针会在2.8kb处检测到单个条带，或者在没有整合的情况下，会在8.2kb处检测到单个条带。由于在一个等位基因中整合(2.8kb)而在另一个中没有整合(8.2kb)，因此具有单等位基因整合的样品具有2个条带(图1C)。确定非放射性Southern印迹方案对筛选的敏感性不足。对于每种细胞系，选择至少9个PCR阳性克隆以便用5'探针进行筛选。然后用内部探针探测用5'探针确认具有单等位基因整合的克隆的基因组DNA，以鉴定在其他基因组基因座中无受体位点的随机整合的克隆(通过在10Kb处存在单个条带鉴定)(图1D)。
在不存在随机整合的情况下，在RPE细胞中获得了位点特异性受体位点，效率为56％。对于A549和Hela，通过PCR和southern印迹共筛选了21和13个克隆，并且只有1个克隆在AAVS1基因座处具有受体位点的单拷贝整合，分别对应于5％和8％的总体重组效率。然而，对9个U2OS和13个HEK293T克隆的Southern印迹筛选未能鉴定出在正确基因座处具有受体位点的单拷贝整合的任何克隆(表1)。
实施例2.多顺反子平台的开发
四顺反子报告物被设计为掺入组成型启动子(CMV)，其驱动单个开放阅读框(ORF)的表达，所述开放阅读框含有由2个独特的病毒2A自切割肽分开的3个多克隆位点(MCS)和由内部核糖体进入位点(IRES)元件分开的第四个MCS，所述内部核糖体进入位点允许在mRNA序列的中间开始翻译(图2)。2A自切割肽允许将多种蛋白质编码为多蛋白，其在翻译时分离为组分蛋白质。2A肽序列通过核糖体跳跃机制损害正常的肽键形成。从肽2A切割序列的家族中，P2A和T2A版本被鉴定为最佳候选，因为这些版本已显示出展示最有效的切割效果(Kim等人,PLOS One,2011)。为了提高病毒肽的切割效率，在蛋白质的N末端和2A肽序列之间添加了Gly-Ser-Gly接头(图2)。紧接着在启动子的下游有2个拷贝的Tet操纵子2(TetO2)，TetR(从受体位点表达)与之结合，从而抑制目的基因的表达。添加多西环素(一种四环素类似物)后诱导基因表达。此外，FRT序列与无启动子的潮霉素抗性基因融合，所述基因仅在发生正确的基因靶向时才能表达。将报告构建体使用InFusion组装。克隆后，通过Sanger序列验证载体。报告物完成后，再次验证序列，以确保插入了3种或4种报告物。
为了测试报告物的定位或激活，瞬时转染细胞，并且通过显微术评估定位，或者如果它是生物传感器，则用激活相应的途径的化合物处理细胞，以验证生物传感器是否有反应。
某些被C'中存在额外的氨基酸干扰的蛋白质不能放在第一位或第二位，因为2A切割会在蛋白质的C'上留下额外的氨基酸。将所合成的核苷酸序列克隆到pCDNA5/FRT载体骨架中。将FRT靶位点与mCherry报告基因连接，以允许荧光筛选。此载体被设计为重组到受体细胞系中，所述受体细胞系是当用包含翻转酶(Flp)的第二载体(pOG44，Thermo FisherScientific)共转染时产生的。
将多顺反子载体与pOG44共转染到受体细胞系中，并且优化了转染条件以生产多色稳定的报告细胞系，其可以用作测定开发和疾病建模的基础。所采用的翻转酶(Flp)重组酶的重组率是10-6个细胞分之一(O'Gorman,S.,Fox,D.T.&Wahl,G.M.Science 251,1351-1355(1991))。
产生稳定的报告细胞系后，评估了多顺反子载体内位置的影响。使用多轮优化来确定最佳构建体，其将在受体细胞系中产生功能性荧光标记的目的蛋白质的稳定平衡表达。此类细胞系将成为基于活细胞显微术的测定的有用基础。
实施例3.活细胞中RAS-MAPK信号转导的多参数可视化。
细胞中Ras/MAPK途径信号传导蛋白的时空调节(图3)是其信号传导行为的重要方面。Ras/MAPK信号传导蛋白取决于途径激活状态而位于不同细胞区室中。全面探测完整细胞中整个途径的动态活性的新测定可以帮助鉴定和优化规避抗性机制的下一代抑制剂。本文描述了一种新颖的方法，用于在高通量相容性多重测定中监测推定抑制剂的细胞活性，所述测定报告活细胞中整个Ras/MAPK途径的动态活性。为了监测途径的存活，使用了平衡表达荧光标记蛋白的稳定细胞系。
为了产生两种颜色的细胞系，将具有N末端荧光蛋白标签的CRaf和突变型KRas(G12C)构建体克隆到四环素诱导型双顺反子表达载体中。使用
(PromegaTM)通过用双顺反子载体和Flp-重组酶表达质粒共转染Flp-In TREx 293细胞，然后用潮霉素B选择来产生稳定细胞系。
将两种颜色的稳定细胞系在96孔玻璃底板中铺板过夜，并且用1μg/ml的多西环素处理，以诱导荧光报告物表达。将细胞用不同的化合物处理四或九小时。用带有OKOLabTM培养箱系统的落射荧光NikonTM显微镜对细胞成像，并且使用Plan FluorTM 40x物镜和
软件(NikonTM)采集图像。将类似的程序(使用克隆到多顺反子构建体中的N末端标记的KRas(G12C)、CRaf、Mek和Erk)用于产生具有大致平衡的报告构建体表达水平的单克隆的可诱导的4色细胞系(图4和图5，对照)。
将4色系用于可视化活细胞中的MAPK途径。表达KRas(G12C)、C-Raf、Mek和Erk报告物的HEK293多色稳定细胞系显示4种蛋白质分别正确定位在质膜、质膜和细胞质、细胞质、细胞核上(图5)。在显微镜下监测细胞允许可视化对Ras-MAPK途径抑制剂的反应。为了监测对抑制剂的反应，在蛋白质诱导后，将细胞用GDC-0879、FR180204、洛伐他汀和PD0325901处理四或九小时。不同处理的代表性图像示于图5中。
GDC-0879是一种ATP-模拟物Raf抑制剂，其与活性CRaf构象结合并且诱导CRaf质膜靶向。洛伐他汀是一种HMG-CoA拮抗剂，其经由抑制异戊烯化来阻断Ras蛋白的加工和膜定位。FR180204是一种Erk抑制剂，其防止Erk的催化活性，但不能阻止Erk的磷酸化。用GDC-0879(一种Raf抑制剂)处理显示化合物处理后CRaf明显富集在质膜上，而其他蛋白质相对于对照保持在相同位置。用FR180204(一种Erk抑制剂)处理显示质膜上的CRaf水平适度增加。这可以解释为由于活性Erk触发的负反馈的释放，直接作用于C-Raf。用洛伐他汀处理(其影响KRas失活)导致膜上不存在KRas，因此C-Raf在膜上不富集，并且MAPK途径的下游效应子mCherry-Erk改变了其在细胞质中的定位。用PD0325901(一种Mek抑制剂)处理导致下游效应子Erk的重新分布(从细胞核到细胞质)，表明Erk没有活性。正如预期的那样，Mek上游蛋白质(KRas和C-Raf)均未显示出定位改变。
洛伐他汀导致KRas相对于细胞膜明显的位移(***p<0.0001)。TA-155处理导致KRas相对于细胞膜类似的位移(***p<0.0001)，从而验证了此分子是所述途径的效应子。
为了进一步显示多重测定的实用性，使用24种MAPK载体的文库产生了具有23种不同的报告细胞的文库(图6A)。MAPK文库由包含4种蛋白质的多顺反子构建体的集合组成：3种荧光标记的蛋白质-mcherry-Erk、mCerulean-Raf(同种型和突变体)、Venus-Ras(同种型和突变体)以及另外地未标记的蛋白质Mek。未标记的Mek和mCherry-Erk在所有构建体中是固定的。每种Ras和Raf野生型或同种型(K-、H-、N-Ras和A-、B-、C-Raf)和突变体(K-RasG12C、K-RasG12D、H-RasQ61L和B-RafV600E)在MAPK构建体中组合。MAPK报告构建体表示为“MAPK R”，并且从“1-24”编号。使用
(PromegaTM)将24种载体的集合与Bxb1重组于U2OSA -Tet受体细胞系中以产生报告细胞系。将细胞用75ug/ml潮霉素B选择3天。选择后，使细胞扩增并且通过测试四环素诱导进行验证，并且在96个玻璃底板中铺板进行成像，以验证3种荧光标记蛋白的存在。将所有的报告细胞系用1μg/ml的多西环素处理12-16小时，以诱导荧光报告物表达。用带有OKOLabTM培养箱系统的落射荧光NikonTM显微镜对细胞成像，并且使用Plan FluorTM 40x物镜和
软件(NikonTM)采集图像(图6B)。
使用三种MAPK报告细胞系可视化活细胞中的MAPK途径并且分析MAPK抑制剂的剂量反应。将表达mCerulean-CRaf、未标记的Mek、mCherry-Erk和Venus-KRas的U2OS MAPKR19、R20和R21多色稳定细胞系(分别为wt、G12C和G12D)在玻璃底96孔板中铺板。细胞铺板后二十四小时，将细胞用1μg/ml的多西环素处理5h，以诱导荧光报告物表达。在显微镜下监测细胞允许可视化对Ras-MAPK途径抑制剂的反应。在测定中使用了两种抑制剂：曲美替尼(一种Mek1抑制剂)和PD 0329501(一种Mek1/2抑制剂)。曲美替尼是MEK1/2的可逆的变构抑制剂，其与激活环中的丝氨酸12结合。在添加化合物后1小时，以10μM开始的四点十倍系列稀释物一式两份地测试抑制剂，并收集数据。在Nikon Ti-E倒置显微镜中采集图像，所述显微镜配备了具有自动对焦装置的电动载物台和OkoLab载物台顶部环境控制室(供应有CO2，并且控制温度以用于活细胞成像)。使用CFP、YFP、TexasRed和Dapi滤光镜套件以20×plan-apo物镜获得每孔的4个位置(图7B)。
mCherry-Erk的亚细胞定位被用作MAPK途径激活的度量；具有激活的MAPK信号传导的细胞显示了Erk的核定位，而具有未激活的或受抑制的MAPK信号传导的细胞显示了Erk的核排除。对于每种测定，使用CellProfiler(用于图像分析的开源软件，Kamensty,L.等人,Bioinformatics(2011))分析图像，以量化核与细胞质Erk荧光强度的比率，并且将所生成的数据进一步处理以确定化合物IC50。
图像分析使用开源软件CellProfiler。导入图像后，将核从Hoescht图像中鉴定为主要对象。使用来自主要对象的增殖，将每个细胞的细胞质从K-Ras图像中鉴定为次要对象。细胞质面积减去每个细胞的核面积以得到最终的细胞质掩膜。从原始mCherry-Erk图像计算出每个细胞的核和细胞质的mCherry强度，并且计算出每个细胞的mCherry强度的核质比率，并且输出为HDF5文件用于分析。将来自CellProfiler分析的数据导出到Python编程语言(PythonSoftware Foundation，万维网网址python.org)用于进一步的计算。
为了量化每种化合物的抑制程度(mCherry-Erk细胞质定位)，我们使用了Python开源软件的SciPy文库进行的高斯核密度估计。每种细胞系的未经处理(媒介物)和受最大抑制(最强抑制剂的最高浓度)对照值用于生成值分布的密度图。将来自各个孔的数据相对于对照密度图作图，并且将每个细胞归为抑制或未抑制的概率用于确定每种化合物在4种不同浓度下的抑制百分比。将值导出到GraphPad Prism 7.0软件(美国加利福尼亚州拉荷亚)，并且我们使用了非线性回归拟合数据并计算浓度，在所述浓度下我们观察到抑制剂的50％活性(IC50)(图7B和7C)。
在所有3种细胞系中检测到曲美替尼活性(图7A)，对于表达K-Ras(wt)的细胞，IC50值为9nM；对于表达K-Ras(G12C)和K-Ras(G12D)的细胞，IC50值分别为55nM和28nM。型细胞系表现出更高的IC50(图7C)。
在所有3种细胞系中检测到PD 0329501活性(图7A)，对于表达K-Ras(wt)的细胞，IC50值为9nM；对于表达K-Ras(G12C)和K-Ras(G12D)的细胞，IC50值分别为13nM和76nM。型细胞系表现出更高的IC50(图7C)。
这些结果证明，多重测定允许监测、测量和比较MAPK抑制剂的活性、剂量反应并且确定不同KRas背景下的IC50。
实施例4.受体位点的优化
受体位点被进一步优化为更易于适应，并允许在靶向和非靶向整合之间更有效地区分。如图1E所说明，更新的受体位点除FRT位点外还包括1)CMV驱动的GFP元件和2)用于使用Bxb1重组酶进行重组的attP位点。通过在AAVS1右同源重组臂之后重新设计受体位点以含有由CMV启动子驱动的GFP(CMV-GFP)(图1E)，其更易于区分在AAVS1基因座处的靶向整合或在基因组中的随机整合。具有随机整合的重新设计的受体位点的细胞将发出绿色荧光。具有整合的重新设计的受体位点(靶向的或随机整合的)的细胞会由于mCherry的表达而发出红色荧光。因此，具有靶向整合的细胞将仅是红色，而具有任何随机整合的细胞也将表达GFP，并且为红色和绿色。这第二种方法允许使用荧光显微术来鉴定无随机整合的细胞，或者使用FACS来分类无重组的细胞，而不必进行southern印迹筛选。(图1F)。attP位点使得能够在受体位点中进行位点特异性重组。
使用已建立的Cas9介导的基因组编辑方案，将新的受体位点稳定地整合到目的细胞的基因组内的整合位点中。关于受体位点的设计，根据受体位点的设计，将安全港AAVS1基因座用作整合位点。合成受体位点并且将其克隆到AAVS1-供体载体(GeneCopoeia)中，并且用Cas9:sgRNA(AAVS1)(一种指导RNA(gRNA)，与目标AAVS1序列互补)共转染，从而在单个整合位点(IS)(即位于19号染色体PPP1R12C基因座外显子1和2之间的AAVS1基因座)处得到稳定的整合。转染和稳定整合是使用RNA指导的Cas9-CRISPR介导的基因组编辑，然后使用博莱霉素进行抗生素选择来进行的。克隆细胞生长后，使用2次连接PCR(图1A)鉴定受体位点的单等位基因整合。引物对被设计为检测在插入位点(IS)处的单个PCR产物条带。第二对引物从发生整合的等位基因扩增PCR产物。具有单等位基因整合的克隆细胞两次PCR均应当表现出扩增。接下来，为了确定在正确位点处的拷贝数整合，使用针对mCherry基因的特异性探针进行微滴式数字PCR(ddPCR)。将针对在人类基因组中具有2个拷贝的管家基因RPP30的探针用于量化样品中的相对拷贝数(表2)。
表2
在不存在随机整合的情况下，在HepG2、U2OS、A549和A375细胞中获得了经优化的受体位点的位点特异性、单拷贝、单等位基因整合，效率分别为26％、16％、10％和14％。通过PCR和ddPCR筛选出43个HepG2克隆；其中11个在正确的基因座处具有单拷贝整合。通过PCR和ddPCR共筛选了61个U2OS克隆，并且其中10个在AAVs1基因座处具有单整合。对于A549细胞，通过PCR和ddPCR共筛选了20个克隆，并且2个克隆在AAVS1基因座处具有受体位点的单拷贝整合，对应于10％的总体重组效率。对于A375细胞，共筛选了73个克隆，并且10个在AAVS1基因座处具有单拷贝整合。在U2OS和A549的情况下，先前通过PCR和Southern印迹进行的筛选未能鉴定出在正确的基因座处具有受体位点的单拷贝整合的任何集落。因此，经优化的受体细胞平台对于受体细胞的产生要有效得多。
执行五个质量控制步骤，以选择整合位点完整并且以最佳性能具有完整功能的受体细胞系(表3)。第一步是对受体细胞系的AAVS1基因组基因座中5'和3'插入位点处的基因组DNA测序，以确认重组过程不会触发重组位点侧翼的任何小插入、缺失或突变。第二步是评估受体细胞的均质性以确保它们来自单个细胞-为此进行流式细胞术分析并且计算mCherry荧光团的变异系数(CV)(步骤2-CV(mCherry)＝51％)。为了确定受体细胞是否含有功能性四环素调控，在四环素调控下，将细胞用BxB1和含有MTS-Venus、H2B-TagBFP的双色多顺反子构建体共转染。将报告细胞用潮霉素B选择3天，并且使其生长6-10天。对所形成的集落数量进行评分(步骤4)。选择后，将所述细胞用1μg/ml多西环素处理12-15h。接下来的验证和QC步骤是使用流式细胞术分析进行的。对于步骤3，将经诱导的细胞与未经诱导的细胞进行比较，以验证mCherry的损失以及Venus和TagBFP荧光的获得。为了确定报告物整合后多克隆群体中蛋白质表达的变异性是否与受体细胞系群体中蛋白质表达的变异性相似，确定了存在于多顺反子载体中的每种荧光团的荧光强度的CV(步骤4-CV(TagBFP)＝67％和CV(Venus)＝69％)，并且将其与亲本CV进行比较。为了验证放置在受体位点上的不同蛋白质的表达是否是同质的，以及有效载荷是否完整，我们基于所表达的蛋白质的荧光强度的流式细胞术值确定了相关系数(r)(相关系数r＝0.89，步骤5)。
表3
仅选择了通过所有检查点的受体细胞系。一种受体细胞系的结果的例子示于图8A-8C中。
实施例5.多顺反子平台的优化
已经开发了多顺反子平台的几种变体，包括包含以下的一种变体：(1)即插即用重组酶位点；在受体细胞系中与attP序列进行Bxb1特异性丝氨酸型重组的attB位点以及使用酪氨酸家族位点特异性重组酶的翻转酶(frt)进行重组的FRT位点；(2)即插即用启动子；(3)即插即用抗性标记；(4)在IRES序列上游的三个2A肽酶序列，以从同一启动子表达多达四个基因(图18)。尽管多顺反子平台含有单一转录单元(TU)，其中所有转录物均由单一启动子驱动；通用平台除了上述多顺反子单元之外还包括通过添加避免启动子干扰的核心绝缘子序列(鸡超敏位点四个核心元件)而整合多达三种不同TU中的两种的选项(图9，下图)。
通过用高效丝氨酸重组酶Bxb1共转染，可以高效获得报告载体的重组(Duportet,X.等人,NAS(2014))。重组伴随着mCherry转录损失，这是由于mCherry相对于“受体位点”启动子的位移。
实施例6.用于预测毒理学研究的多重高含量测定以测量细胞应激机制
毒性是医药行业以及环境化学品的主要关注点。候选药物和经批准的药物都面临诱导的细胞毒性问题。需要新的高通量测定平台，其快速查明化合物的作用机制和毒性可能性，并且监测毒性的多个方面。本文描述了一组稳定地整合到与化合物毒性评估相关的细胞系中的多色细胞应激报告物。所得组的多色稳定报告细胞系可以用作毒性多重测定的基础。
用含有重组酶Bxb1的载体和组成型表达TagBFP的载体(“测试物-报告物”)转染U2OS和HepG2受体细胞，以确定最佳重组条件：转染方法；重组酶:报告物比率；药物选择添加；细胞铺板数量。测试物-报告物载体允许通过流式细胞术分析(FACS)快速量化转染效率和重组效率。
转染效率是通过总群体中TagBFP+细胞的数量来计算的。通过具有位点特异性整合(mCherry-且TagBFP+)的细胞数量与经转染(TagBFP+)的细胞总数量之间的比率来计算重组效率。发生了位点特异性重组的细胞将是TagBFP+，因为TagBFP将由来自测试物-报告物的CAG启动子表达；并且将是mCherry-，因为受体位点的重组将使其起始密码子移位。测试了几种条件。
用含有重组酶Bxb1的构建体和多顺反子Tox报告物(命名为U2OSA:ToxORG)共转染U2OS受体细胞，所述报告物携带三种荧光标记蛋白：MTS-Venus、H2B-TagBFP和mCherry-LC3(图10A)。转染后3天，用潮霉素处理3天后，使存活的细胞再生长10天，而无需在FACS分析前进行任何选择。正如期望的那样，我们获得了三种荧光蛋白的高度同质表达。我们观察到，通过变异系数(CV)测量的整合后多克隆群体中表达的变异性(图10BmCherry：＝69％；TgBFP：CV＝67％，Venus：CV＝73％)与单克隆基础细胞系群体中表达的变异性(mCherry：CV＝68％)相似。我们还观察到以同一有效载荷放置的转基因的表达高度相关(相关系数r＝0.81，图10C)。
用含有重组酶Bxb1的构建体和多顺反子Tox报告物(命名为U2OSA:ToxDUPR)共转染U2OS受体细胞，所述报告物携带三种荧光标记蛋白：与DNA双链断裂结合的53BP1-mCerulean、H2B-mCherry和作为UPR应激相关传感器的XBP1Δ-Venus。一旦选择出并且扩增细胞，就对其进行测定以确定依托泊苷和新制癌菌素(NCS)的剂量反应。依托泊苷抑制DNA合成，并且在细胞周期的S和G2后期对细胞具有非常高的活性，在完整细胞中诱导DNA的双链和单链断裂。NCS抑制DNA合成、G2周期阻滞、细胞凋亡。两种化合物都是DNA损伤的诱导剂，并且因此增加了53BP1核灶点的数量。将细胞在玻璃底孔384孔板中铺板。为了评估报告物的特异性，与DNA诱导剂一起，使用了其他三种化合物作为对照。毒胡萝卜素通过抑制将钙摄取进ER来诱导UPR相关应激(Ca2+是伴侣辅因子，因此抑制蛋白质折叠)，衣霉素也通过抑制新合成的蛋白质糖基化参与UPR相关应激，并且阿非迪霉素在真核生物中抑制DNA复制。在添加化合物后8小时，以四点十倍系列稀释物一式四份地测试所有化合物，并收集数据。在Nikon Ti-E倒置显微镜中采集图像，所述显微镜配备了具有自动对焦装置的电动载物台和OkoLab载物台顶部环境控制室(供应有CO2，并且控制温度以用于活细胞成像)(图11A)。
将53BP1-mCerulean的数量用作双链断裂和DNA损伤的度量。对于每种测定，使用开源软件CellProfiler分析图像以量化每个核的灶点数量，并且对所生成的数据进行进一步处理以确定化合物EC50。
使用开源软件CellProfiler进行图像分析。导入图像后，将核从H2B-mCherry图像中鉴定为主要对象，然后增强了mCerulean结构，并且将这些增强的结构的检测作为对象。核与灶点相关，并且对每个核的子代(灶点)数量计数。将来自CellProfiler的数据导出到Python编程语言用于进一步的计算。
使用Python，将数据按孔分组，并且确定灶点/核的平均数量。将对应于相同条件的孔分组。将所有数据导出到GraphPad Prism 7.0软件以生成图。使用非线性回归来拟合数据并且计算浓度，在所述浓度下我们观察到增强剂的50％活性(EC50)(图11B)。
依托泊苷活性通过U2OSA:ToxDUPR报告细胞来检测(图11A和11B)，EC50值为161nM。
NCS活性通过U2OSA:ToxDUPR报告细胞来检测(图11A和11B)，EC50值为257ng/ml。
衣霉素、毒胡萝卜素和阿非迪霉素对53BP1灶点的数量没有显示出任何影响，证明53BP1灶点的数量与DNA损伤特别相关。
在U2OSA:ToxDUPR报告细胞中包括的53BP1-mCerulean是DNA损伤和双链断裂的功能性且具特异性的报告物。U2OSA:ToxDUPR报告细胞的性能度量确认所述报告物和所述测定适用于高通量测定(图12A-12E)。所述测定的Z因子(Z’)>0.5，验证了其对于高通量定量测定的适用性，以监测、测量和比较化合物的活性、剂量反应并且确定诱导DNA损伤的化合物的EC50。
将U2OSA:ToxDUPR和U2OSA:ToxORG与具有5种生物传感器和表型读出的聚集体(MTS-Venus、H2B-TagBFP、mCherry-LC3、53BP1-cerulean、XBP1-Venus和H2B-mCherry)在合并测定中组合，其中DNA在两种报告细胞系中的每一种中被不同地标记(图13)。
将U2OSA ToxORG和ToxDUPR两种报告细胞系1:1混合，并且在添加化合物之前24h在384孔板中铺板。测试了两种DNA损伤诱导剂：依托泊苷和新制癌菌素(NCS)。依托泊苷抑制DNA合成，并且在细胞周期的S和G2后期对细胞具有非常高的活性，在完整细胞中诱导DNA的双链和单链断裂。NCS抑制DNA合成、G2周期阻滞、细胞凋亡。两种化合物都是DNA双链断裂的诱导剂，并且因此增加了53BP1核灶点的数量。添加化合物后八小时，在NikonTi-E倒置显微镜中采集图像，所述显微镜配备了具有自动对焦装置的电动载物台和OkoLab载物台顶部环境控制室(供应有CO2，并且控制温度以用于活细胞成像)(图14)。当与媒介物对照孔相比时，观察到在用NCS处理的孔中在ToxD-UPR报告细胞中灶点/核数量的明确增加。不管通过报告细胞自身测定(图11B，EC50 NCS＝257ng/μl)还是与其他报告细胞系合并测定(图14EC50NCS＝376ng/μl)，获得了相似的EC50。
合并测定证明，将报告细胞系与不同的报告物混合允许明确地推断化合物毒性的机制。
开发了包含三种应激信号传导途径(未折叠的蛋白质反应、DNA损伤、氧化应激和p53依赖性应激反应)与具有七种生物传感器和表型读出的聚集体的三种3色报告载体，所述生物传感器和表型读出可以单独使用或合并以指纹识别化合物毒性的机制。
开发了用于毒性化合物评估的另外的平台。使用上述方法开发并测试了包含四种表型标记(DNA、线粒体、质膜和自噬体)的一种四色报告载体(图15)，所述表型标记可以单独使用或合并以指纹识别化合物毒性的机制。
实施例7.多色iPS细胞系的产生
开发了一种稳健的靶向策略，其使用由Cas9介导的RNA指导的基因组工程化工具将“受体位点”(图16A)引入iPSC系的内源AAVS1基因座中。受体位点含有：(1)用以通过丝氨酸重组酶Bxb1进行重组的attP位点；(2)用以确认受体位点整合的mCherry荧光标记；(3)由巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)启动子驱动的抗生素抗性基因，从而使得能够进行细胞选择；以及(4)位于同源重组区的下游的由CMV启动子驱动的GFP基因，从而使得能够在随机整合和靶向整合之间迅速区分(具有随机整合的细胞会由于GFP表达而发出绿色荧光，而具有靶向整合的细胞由于CMV-GFP的损失则不会发出绿色荧光)(参见图16B)。抗生素选择后，从单个细胞产生克隆并且手动分离。使用PCR在这些克隆中鉴定在正确基因座处受体位点的单等位基因整合，然后进行微滴式数字PCR以确认单拷贝整合(表3)。基于PCR的整合鉴定是本领域常用的，并且所述方法是众所周知且常规的。如实施例1-3中所解释，此策略用于产生一组人永生受体细胞，并且以建立具有受体位点的单拷贝整合的两种iPSC受体系(表3)。
表3.
Claims (136)
1.一种多顺反子报告载体，其包含：
与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子，并且其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；
其中每个顺反子包含多克隆位点(MCS)和编码报告载体的核酸，并且其中每个顺反子编码不同的报告多肽；并且
其中插入所述两个或更多个多克隆位点中的编码多肽的两种或更多种核酸的表达是本质上化学计量的。
2.根据权利要求1所述的多顺反子报告载体，其中所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。
3.根据权利要求2所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种自切割肽是病毒自切割肽。
4.根据权利要求3所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种病毒自切割肽是一种或多种2A肽。
5.根据权利要求4所述的多顺反子报告载体，其中一种或多种2A肽是T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽还包含一种或多种核酸，其编码在一种或多种所述报告多肽与一种或多种所述自切割肽之间的肽接头。
7.根据权利要求6所述的多顺反子报告载体，其中所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述报告多肽是荧光报告多肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多顺反子报告载体，其中每个顺反子的所述报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子和第二顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码病毒切割肽的核酸分开。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子和第三顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，并且所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码第三病毒切割肽的核酸分开。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含含有MCS的核酸、编码报告多肽的核酸、编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和开放阅读框之间。
15.根据权利要求14所述的多顺反子报告载体，其中所述载体包含两种可诱导元件。
16.根据权利要求14或15所述的多顺反子报告载体，其中所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组成型启动子。
18.根据权利要求17所述的多顺反子报告载体，其中所述组成型启动子是巨细胞病毒a(CMV)、胸苷激酶(TK)、eF1-α、泛素C(UbC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
20.根据权利要求19所述的多顺反子载体，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
21.根据权利要求1-16中任一项所述的多顺反子报告载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
22.根据权利要求21所述的多特异性报告载体，其中所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含位于所述开放阅读框的3'的位点特异性重组酶序列。
24.根据权利要求23所述的多顺反子报告载体，其中所述载体还包含编码可选择标记的核酸，其中当所述位点特异性重组酶序列未重组时，编码所述可选择标记的核酸不与所述启动子可操作地连接，并且当所述位点特异性重组酶序列与其靶位点特异性重组酶序列重组时，编码所述可选择标记的核酸与所述启动子可操作地连接。
25.根据权利要求24所述的多顺反子报告载体，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸和/或loxP核酸序列。
26.根据权利要求24或25所述的多顺反子报告载体，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素或新霉素的类似物的抗性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的多顺反子报告载体，其中将编码一种或多种多肽的核酸框内插入所述一个或多个MCS中。
28.根据权利要求27所述的多顺反子报告载体，其中所述一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的多顺反子报告载体，其还包含一种、两种或三种转录单元，所述转录单元包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列和polyA序列。
30.一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞，其中所述受体细胞包含整合到宿主细胞基因组中的特定位点的重组核酸，其中所述重组核酸包含与编码融合多肽的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述融合多肽包含报告结构域和可选择标记结构域，并且其中所述核酸包含位于编码所述融合多肽的核酸的5'末端的位点特异性重组酶核酸序列。
31.根据权利要求30所述的受体细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
32.根据权利要求31所述的受体细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
33.根据权利要求32所述的受体细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
34.根据权利要求33所述的受体细胞，其中所述诱导型启动子是四环素响应型启动子。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的受体细胞，其中所述位点特异性重组酶序列是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是荧光报告结构域。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的受体细胞，其中所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的报告结构域是mCherry报告结构域。
39.根据权利要求30-38中任一项所述的受体细胞，其中所述融合多肽的可选择标记结构域赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的受体细胞，其中所整合的重组核酸还包含与启动子可操作地连接的编码四环素阻遏多肽的核酸。
41.根据权利要求40所述的受体细胞，其中所述启动子是人β-肌动蛋白启动子或CAG启动子。
42.根据权利要求30-41中任一项所述的受体细胞，其中将所述重组核酸整合到腺相关病毒S1(AAVS1)基因座、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、hip11(H11)基因座或柠檬酸裂解酶β样基因基因座(CLYBL)中。
43.根据权利要求30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是永生细胞。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的受体细胞，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
46.根据权利要求30-42中任一项所述的受体细胞，其中所述细胞是原代细胞。
47.一种产生用于接受多顺反子报告载体的受体细胞的方法，所述方法包括将重组核酸引入细胞中，其中所述重组核酸从5'至3'包含
a)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第一核酸，
b)第一启动子，
c)位点特异性重组酶核酸，
d)编码第一报告多肽和可选择标记的核酸，
e)用于将同源重组靶向所述细胞中的特定位点的第二核酸，
f)第二启动子和编码第二报告多肽的核酸，
其中表达所述第一报告多肽而不表达所述第二报告多肽指示将所述重组核酸的整合靶向所述细胞基因组中的特定位点，并且表达所述第一和第二报告多肽指示随机整合在所述细胞基因组中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码四环素阻遏物的核酸，其与用于靶向同源重组的第二核酸的5'的启动子可操作地连接。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中使用以下将所述重组核酸整合到所述细胞的基因组中：
a)包含核酸酶和指导RNA的RNA指导的重组系统
b)TALEN核酸内切酶，或
c)ZFN核酸内切酶。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中选择表达所述第一报告多肽但不表达所述第二报告多肽的细胞。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶核酸是FRT核酸序列和/或attP核酸序列和/或loxP核酸序列。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是荧光多肽，并且所述第二报告多肽是不同的荧光多肽。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的方法，其中所述第一和第二报告多肽选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的方法，其中所述第一报告多肽是mCherry报告物，并且所述第二报告多肽是GFP。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述可选择标记赋予对潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素或潮霉素、ZeocinTM、嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素的类似物的抗性。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的方法，其中所述第一启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
57.根据权利要求47-56中任一项所述的方法，其中用于靶向同源重组的所述第一核酸和用于靶向同源重组的所述第二核酸将重组靶向AAVS1基因座、CCR5基因座、小鼠ROSA26基因座的人直向同源物、H11基因座或CLYBL基因座。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的方法，其中所述细胞是永生细胞。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中所述永生细胞是HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞。
60.根据权利要求47-59中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞、诱导多能干细胞或多潜能细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述诱导多能干细胞是WTC-11细胞或NCRM5细胞。
62.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
63.一种受体细胞系，其用根据权利要求47-62中任一项所述的方法产生。
64.一种多报告细胞，其包含根据权利要求30-46中任一项所述的受体细胞，其中已经将根据权利要求27或28所述的多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的基因组中。
65.根据权利要求64所述的多报告细胞，其中已经将所述多顺反子报告载体整合到所述受体细胞的AAVS1基因座中。
66.一种多报告细胞，其包含多顺反子报告构建体，其中所述多顺反子报告构建体包含
与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含两个或更多个顺反子；
其中每个顺反子包含编码与不同报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中所述开放阅读框在细胞中的表达产生来自每个顺反子的分离的组分多肽产物；并且
其中所述转基因产物的表达是本质上化学计量的。
67.根据权利要求66所述的多报告细胞，其中所述顺反子通过编码一种或多种自切割肽和/或一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的核酸彼此分开。
68.根据权利要求66或67所述的多报告细胞，其中每种所述报告多肽是荧光报告多肽。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的多报告细胞，其中所述荧光报告结构域选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。
70.根据权利要求66-69中任一项所述的多报告细胞，其中所述一种或多种自切割肽是一种或多种2A肽。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的多报告细胞，其中编码与所述报告多肽融合的转基因产物的核酸还包含一种或多种核酸，其编码在所述报告多肽和病毒自切割肽之间的肽接头。
72.根据权利要求71所述的多报告细胞，其中所述肽接头包含序列Gly-Ser-Gly。
73.根据权利要求66-72中任一项所述的多报告细胞，其中所述多顺反子报告载体包含与开放阅读框可操作地连接的启动子，其中所述开放阅读框包含第一顺反子、第二顺反子、第三顺反子和第四顺反子，其中每个顺反子从5'至3'包含编码与荧光报告多肽融合的转基因产物的核酸和编码接头肽的核酸；其中所述第一顺反子和所述第二顺反子通过编码第一病毒切割肽的核酸分开，所述第二顺反子和所述第三顺反子通过编码第二病毒切割肽的核酸分开，所述第三顺反子和所述第四顺反子通过编码IRES的核酸分开。
74.根据权利要求66-73中任一项所述的多报告细胞，其中所述多顺反子报告载体还包含一种或多种可诱导元件，其位于所述启动子和所述开放阅读框之间。
75.根据权利要求74所述的多报告细胞，其中所述可诱导元件是Tet操纵子2(TetO2)可诱导元件。
76.根据权利要求66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
77.根据权利要求76所述的多报告细胞，其中所述组成型启动子是CMV启动子、TK启动子、eF1-α启动子、UbC启动子、PGK启动子、CAG启动子、SV40启动子或人β-肌动蛋白启动子。
78.根据权利要求66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是组织特异性启动子。
79.根据权利要求78所述的多报告细胞，其中所述组织特异性启动子对心脏、血液、肌肉、肺、肝、肾、胰腺、脑或皮肤的细胞具有特异性。
80.根据权利要求66-75中任一项所述的多报告细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
81.根据权利要求80所述的多报告细胞，其中所述诱导型启动子是TRE启动子。
82.根据权利要求66-81中任一项所述的多报告细胞，其中所述一种或多种转基因产物包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
83.根据权利要求82所述的多报告细胞，其中所述分析在单个细胞上进行。
84.根据权利要求64-83中任一项所述的多报告细胞，其中所述报告多肽可以通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光或使用读板仪可视化。
85.根据权利要求66-84中任一项所述的多报告细胞，其还包含一种、两种或三种转录单元，所述转录单元包含位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的启动子和编码转基因的核酸，其中所述报告载体还包含位于所述转录单元的3'且位于包含两个或更多个顺反子的开放阅读框的5'的核心绝缘子序列。
86.一种用于产生多报告细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求27或28所述的多顺反子报告载体引入根据权利要求33-49中任一项所述的受体细胞中。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述重组酶相关核酸序列是FRT核酸序列，并且所述受体细胞包含flp重组酶。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述重组酶相关核酸是attP，并且所述受体细胞包含Bxb1重组酶、PhiC31重组酶或R4重组酶。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述重组酶相关核酸序列是loxP核酸序列，并且所述受体细胞包含CRE重组酶。
90.一种多报告载体文库，其中所述文库包含根据权利要求1-29中任一项所述的多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，或者其中所述文库包含根据权利要求64-85中任一项所述的多种报告细胞，其中当引入细胞中时，每种载体上的两种或更多种所述不同转基因产物是本质上化学计量地表达的。
91.根据权利要求90所述的文库，其中所述报告载体编码两个或更多个转基因，其编码可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应的多肽。
92.根据权利要求90或91所述的文库，其中所述生物途径是与疾病相关的途径。
93.根据权利要求92所述的文库，其中所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。
94.根据权利要求92或93所述的文库，其中所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。
95.根据权利要求92或93所述的文库，其中所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。
96.根据权利要求90-95中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织的转基因的每种多顺反子载体对于每种多顺反子报告载体而言包含与不同报告多肽融合的共同转基因产物。
97.根据权利要求90-96中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态或特定的毒性反应的转基因的每种多顺反子载体包含与报告多肽融合的共同转基因产物。
98.一种用于接受多顺反子报告载体的受体细胞文库，其中所述文库包含根据权利要求30-46所述的受体细胞。
99.一种多报告细胞文库，其中所述文库中的每种细胞包含多顺反子报告载体，其包含编码与报告多肽融合的不同转基因产物的核酸，其中当引入细胞中时，每种载体上的编码不同转基因产物的所述不同核酸是本质上化学计量地表达的。
100.根据权利要求98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的永生细胞。
101.根据权利要求100所述的文库，其中所述文库包含HEK293T细胞、A549细胞、U2OS细胞、RPE细胞、NPC1细胞、MCF7细胞、HepG2细胞、HaCat细胞、TK6细胞、A375细胞或HeLa细胞中的一种或多种。
102.根据权利要求98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的多能、多潜能和/或祖细胞。
103.根据权利要求102所述的文库，其中所述不同的多能或多潜能细胞包含诱导多能干细胞、多潜能细胞、造血细胞、内皮祖受体细胞、间充质祖细胞、神经祖细胞、骨软骨祖细胞、淋巴祖细胞或胰腺祖细胞中的一种或多种。
104.根据权利要求98或99所述的文库，其中在引入所述多顺反子报告载体后，使所述多能或多潜能细胞多报告细胞文库分化。
105.根据权利要求98或99所述的文库，其中所述文库包含不同的原代细胞。
106.根据权利要求105所述的文库，其中所述原代细胞包含心肌细胞、肌肉细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经元或肿瘤细胞中的一种或多种。
107.根据权利要求99-106中任一项所述的文库，其中所述文库中的每种细胞包含相同的多顺反子报告载体。
108.根据权利要求99-107中任一项所述的细胞文库，其中所述文库中的细胞包含不同的多顺反子报告载体。
109.根据权利要求108所述的细胞文库，其中将不同的多顺反子报告载体引入等基因受体细胞中。
110.根据权利要求99-109中任一项所述的细胞文库，其中所述报告载体编码一个或多个转基因，一种或多种多肽包含可以用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、细胞稳态或表型特征的多肽。
111.根据权利要求110所述的文库，其中所述生物途径是与疾病相关的途径。
112.根据权利要求111所述的文库，其中所述疾病是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病或自身免疫性疾病。
113.根据权利要求110中任一项所述的文库，其中所述生物途径是与所述细胞内的毒性反应机制相关的途径。
114.根据权利要求110-113中任一项所述的文库，其中所述生物途径是与细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、细胞凋亡、自噬、DNA损伤和修复、氧化应激、染色质/表观遗传学、MAPK信号传导、PI3K/Akt信号传导、翻译控制、细胞周期和检查点控制、细胞代谢、发育和分化信号传导、免疫学和炎症信号传导、酪氨酸激酶信号传导、膜泡运输、细胞骨架调控或泛素途径相关的途径。
115.根据权利要求99-114中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、合成致死性、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应、特定的组织或特定的表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与不同报告多肽融合的多肽的共同转基因。
116.根据权利要求99-115中任一项所述的文库，其中包含用于分析特定的单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的特定串扰、特定的细胞稳态、特定的细胞器稳态、特定的毒性反应或特定的表型特征的转基因的每种多顺反子载体包含编码与报告多肽融合的多肽的共同转基因。
117.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-29中任一项所述的一种或多种多顺反子报告载体。
118.一种试剂盒，其包含根据权利要求30-46中任一项所述的一种或多种受体细胞。
119.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-29中任一项所述的一种或多种多顺反子报告载体和根据权利要求30-46中任一项所述的一种或多种受体细胞。
120.一种试剂盒，其包含根据权利要求64-85中任一项所述的一种或多种多报告细胞。
121.根据权利要求118-120中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含排列在多孔板中的受体细胞和/或报告细胞文库。
122.根据权利要求121所述的试剂盒，其中将在所述多孔板中的细胞冷冻保存。
123.一种分析活细胞中的两种或更多种多肽的方法，所述方法包括确定根据权利要求64-85中任一项所述的多报告细胞或包含根据权利要求1-29中任一项所述的多顺反子载体的细胞的所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述方法用于分析单一生物途径、两种或更多种生物途径之间的串扰、合成致死性、细胞稳态、细胞器稳态或毒性反应。
125.根据权利要求123或124所述的方法，其中在一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
126.根据权利要求125所述的方法，其中在1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天、30天、1个月、3个月、6个月、9个月、1年或1年以上中的一个或多个时间点确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
127.根据权利要求123-126中任一项所述的方法，其中所述细胞通过根据权利要求86-89中任一项所述的方法来制备。
128.根据权利要求123-126中任一项所述的方法，其中所述细胞是根据权利要求90-116所述的细胞文库。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述细胞衍生自等基因受体细胞。
130.根据权利要求128或129所述的方法，其中在分析之前将所述细胞或所述文库合并。
131.一种测量药剂对活细胞中的两种或更多种多肽的谱的影响的方法，所述方法包括使根据权利要求64-85中任一项所述的多报告细胞经受所述药剂以及确定响应于所述药剂在所述细胞中所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述药剂是药物或候选药物。
133.根据权利要求131或132所述的方法，其中所述方法是毒理学筛选。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的方法，其中在多报告细胞文库中确定所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
135.根据权利要求131-134中任一项所述的方法，其中使用单个细胞获得所述谱。
136.根据权利要求131-135中任一项所述的方法，其中通过显微术、高通量显微术、荧光激活细胞分选(FACS)、发光、使用读板仪、质谱或深度测序测量所述两个或更多个转基因的表达和/或所述两种或更多种转基因产物的位置。
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