JP7274225B2 - 真核細胞系統 - Google Patents
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Description
(i)感染性ウイルス粒子へとアセンブリ可能なウイルスゲノムを更に含む本発明の第1の態様の細胞系統の細胞を、テトラサイクリン若しくはテトラサイクリン類似体の不存在下にてin vitroで増殖させる工程、又は、
(ii)本発明の第1の態様の細胞系統の細胞にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターを感染させる工程と、
(iii)ウイルス粒子を回収する工程と、
を含む、方法に関する。
以下で、本明細書で頻繁に使用される用語の幾つかの定義を示す。これらの用語は、それらがそれぞれ使用される場合に、本明細書の残りの部分では、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有することとなる。
以下で、本発明の種々の態様をより詳細に定義する。こうして定義される各々の態様は、そうでないことが明確に示されていない限り、任意のその他の1つ以上の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であることが示される任意の特徴は、好ましい又は有利であることが示される任意のその他の1つ以上の特徴と組み合わせることができる。
(i)感染性ウイルス粒子へとアセンブリ可能なウイルスゲノムを更に含む本発明の第1の態様の細胞系統の細胞を、テトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体の存在下又は不存在下にてin vitroで増殖させる工程、又は、
(ii)本発明の第1の態様の細胞系統の細胞にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターを感染させる工程と、
(iii)ウイルス粒子を回収する工程と、
を含む、方法を提供する。
(i)上記Tet-Rは、テトラサイクリン若しくはテトラサイクリン類似体の存在下若しくは不存在下にて、プロモーター内に1つ以上のテトラサイクリンオペレーター(TetO)を含む遺伝子の転写を抑制する、及び/又は、
(ii)上記Tet-R遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、好ましくは、上記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGK-1プロモーター、ユビキチンBプロモーター、β-アクチンプロモーター、EGR1プロモーター、HCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、マウスCMVプロモーター、CASIプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択され、より好ましくは、上記構成的プロモーターは、CAGプロモーターである、項目1~3のいずれかに記載の細胞系統。
感染性ウイルス粒子へとアセンブリすることができ、1つ以上のテトラサイクリンオペレーター(TetO)を含むプロモーターの制御下にある少なくとも1つの異種遺伝子を含むウイルスゲノムを更に含み、好ましくは、
(i)前記ウイルスゲノムは、ヘルペスウイルスゲノム、改変ワクシニアアンカラゲノム及びアデノウイルスゲノムからなる群から選択され、好ましくは、前記ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムである、及び/又は、
(ii)前記異種遺伝子は、細胞に対して毒性である、
項目1~11のいずれかに記載の細胞系統。
前記異種遺伝子は、自己抗原、ウイルス遺伝子、細胞起源の遺伝子、腫瘍関連ネオアンチゲンの組み合わせ物をコードする合成鎖及びネオエピトープをコードする鎖からなる群から選択され、好ましくは、
(i)前記自己抗原は、HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA、PSMA、テロメラーゼ、gp100、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ESO-1、サバイビン、ストロメリシン3、チロシナーゼ、MAGE3、CML6S、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NYC0-5S、NY-BR-62、hKLP2及びVEGFからなる群から選択される、
(ii)前記ウイルス遺伝子は、HCV E1-E2タンパク質、狂犬病糖タンパク質及びHIV-1 GP 160からなる群から選択される、及び/又は、
(iii)前記細胞起源の遺伝子は、Tim-3、Her2及びE2 F-1からなる群から選択される、
項目12に記載の細胞系統。
(i)項目12若しくは13に記載の細胞系統の細胞を、テトラサイクリン若しくはテトラサイクリン類似体の存在下若しくは不存在下にてin vitroで増殖させる工程、又は、
(ii)項目1~11のいずれかに記載の細胞系統の細胞に、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターを感染させる工程と、
(iii)ウイルス粒子を回収する工程と、
を含む、方法。
HEK 293細胞をDMEM、10%ウシ胎児血清中で培養して増殖させた。30代継代時に、細胞をT-75細胞培養フラスコに播種し、BsaX1で消化した24 μgのプラスミドpneo/CAG-TetRでトランスフェクションさせた。pneo/CAG-TetRは、テトラサイクリンリプレッサー及びG418耐性遺伝子の発現カセットを含む(図1)。トランスフェクションの48時間後に、HEK 293細胞を0.8 mg/mlのG-418が補充された完全DMEM中で1:80の比率に希釈した。G-418に耐性の単一の単離されたクローンを標準的な手順を使用して採取し、24ウェルプレートに移した。各24ウェルプレートを使用して3枚のプレートを作製した。そのうち2枚を単一クローンのスクリーニングに使用し、3枚目は「マスタープレート」として保持した。全てのクローンに、1 μg/mlのテトラサイクリンの存在下又は不存在下にてChAdE TetOSeapを2連で形質導入した。感染の48時間後に、製造業者の使用説明書に従って化学発光アッセイ(Phospha-Lightキット、Applied Biosystems社、カリフォルニア州、フォスターシティ)を使用することにより、分泌されたアルカリホスファターゼ発現について上清を評価した。テトラサイクリンの存在下/不存在下にてSEAP発現の比率を計算することにより、クローンを格付けした。その値は、転写制御の厳しさの尺度を表す。その値が高いほど、転写制御はより厳しくなる。最良のクローンをアデノウイルスベクターの生産性についても評価した。M9クローンは、テトラサイクリンリプレッサーを介した発現制御だけでなく、高レベルのアデノウイルスベクター生産の維持においても非常に効率的であるという結果となった。
クローンM9及びクローンM38をT25フラスコに3連で播種した。細胞単層が80%~90%のコンフルエンス(約3×106個の細胞/フラスコ)に達したときに、以下のように細胞単層を感染させた。馴化培地を吸引し、5 mlの新鮮な培地と置き換えた。次いで、テトラサイクリン(1μg/ml)の存在下又は不存在下にて、30個の粒子/細胞(vp/細胞)の多重感染度(moi)を使用して、細胞にChAdE TetOSeapを感染させた。SeAp発現を、感染2日後にフラスコ当たり50 μlの上清を試験することにより評価した。各フラスコから採取された上清を96ウェルプレートのウェル(50 μl/ウェル)中に移して、製造業者の使用説明書に従って化学発光アッセイ(Phospha-Lightキット、Applied Biosystems社、カリフォルニア州、フォスターシティ)によりアルカリホスファターゼ活性について試験した。Envision 2012 Multilabelリーダー(Perkin Elmer社)を使用することにより、シグナルを取得した。図2に報告されるように、テトラサイクリンの存在下及び不存在下にて得られるSeAp発現値の比率を計算することにより、転写制御の効率を評価した。テトラサイクリン(Tet)の存在下でのSeAp発現は2つのクローンで同等であることから、転写制御の不存在下にてHCMVプロモーターがM9細胞だけでなく、M38細胞においても完全に活性であることが指摘される。それに対して、Tetが培地中に存在せず、かつTetRが活性でプロモーターに結合されている場合に、SeAP活性はM9クローンにおいて約5倍低いことから、M38と比較してHCMVプロモーターの抑制がより強いことが指摘される。
M9クローン及びM38クローンをT25フラスコに2連で播種した。細胞が80%~90%のコンフルエンスに達したときに、100 vp/細胞のmoiを使用して、細胞にAdTetOE1/F78E2p7を感染させた。AdTetOE1/F78E2p7は、HEK293細胞において発現させた場合に毒性である遺伝子を有するアデノウイルスベクターであるため、このアデノウイルスベクターは転写制御なくして増殖することはできない。HEK 293細胞をコントロールとして並行して感染させた。顕微鏡検査により完全な細胞変性効果が確認されたときに(感染4日後)、細胞及び培地を各フラスコから採取し、-80℃で凍結させた。3サイクルの凍結/解凍(-80℃/37℃)により、感染された細胞からウイルスベクターが放出された。次いで、細胞溶解物を遠心分離により清澄化した。アデノベクターゲノム内に存在するヒトサイトメガロウイルスプロモーター(HCMVp)の特定の標的領域を増幅するように設計されたプライマーと二重標識された蛍光プローブ(FAM-TAMRA)とを用いてTaqMan社のレポーター-クエンチャー色素化学(Biorad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System)を使用するドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応により、清澄化された上清を分析した。ウイルス収量を粗製溶解物において評価し、比生産性としてvp/細胞で表現した。それらの結果(図3)により、クローンM9はM38と比較して生産性がより高く、親HEK293細胞は毒性遺伝子を発現するアデノベクターの生産性を維持することができないことが示された。M9細胞により示されたより高い生産性は、M38と比較してM9の転写制御がより良好であることを裏付ける図2に示された結果と一致している。さらに、HEK293細胞は毒性遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの複製を維持することができない。
クローンM9及びクローンM38におけるTetRの生産を、細胞溶解物を使用したウェスタンブロットによって評価した。細胞性タンパク質をM9クローン及びM38クローンから抽出し、ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて作成した標準曲線によりBio-Rad社のプロテインアッセイを使用することにより定量した。45 μgのタンパク質抽出物を、SDSを含むローディングバッファーの存在下、100℃で変性させ、4%~12%のBis-Tris NuPAGE(商標)ゲル上にロードした。電気泳動後に、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写し、1:1000に希釈したTetRモノクローナル抗体(Clontech社、カタログ番号631131)と一緒にインキュベートした。そのメンブレンを、1:3000に希釈したHRP(SIGMA社、カタログA9044)とコンジュゲートさせた抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートすることにより、シグナルが現れた。図4に示されるように、TetRの発現はM9細胞においてM38細胞よりも高かった。
アデノウイルスベクターの生産の維持におけるM9細胞の効率を更に評価するために、DNAトランスフェクションによるC種及びE種のアデノウイルスベクターのレスキューの効率(ChAdN13 TPA4-T1Poly(図5A)及びChAdE egfp(図5B))について、親HEK293と比較して試験した。M9細胞及びHEK293細胞をT25フラスコ中で培養して、製造業者の使用説明書に従ってLipofectamine(商標)2000(Thermo Fisher Scientific社のカタログ番号11668-019)を使用することにより、10 μgのpreAdプラスミドDNAで並行してトランスフェクションさせた。アデノウイルスベクターのレスキュー及び増幅を、トランスフェクションの12日後に細胞溶解物におけるQPCRによって評価した。アッセイで使用されるプライマーは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)プロモーターの特定の標的領域を増幅するように設計されており、二重標識された蛍光プローブ(FAM-TAMRA)はアンプリコン内でハイブリダイズする。結果は図5に示されており、C種及びE種の両方のアデノウイルスベクターについて、トランスフェクションした場合のM9細胞におけるアデノウイルスベクター生産の効率がより高いことが裏付けられる。
レポーター遺伝子を有する2つの異なるチンパンジーAdベクター(ChAdC-Venus(図6A)及びChAdE-EGFP(図6B))の生産性を、M9細胞において親HEK 293細胞及び293T細胞と比較して評価した。T25フラスコ中の細胞の単層を、両方のChAdについて同じ感染多重度を使用して感染させた。完全な細胞変性効果が明らかとなった感染の72時間後に細胞を採取した。3サイクルの凍結/解凍(-80℃/37℃)により、感染された細胞からベクターが放出された。次いで、細胞溶解物を遠心分離によって清澄化し、清澄化された細胞溶解物においてベクター力価をリアルタイムQPCRによって評価した。使用されるプライマーは、アデノゲノム内に存在するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)プロモーターの特定の標的領域を増幅するように設計された。二重標識された蛍光プローブ(FAM-TAMRA)はアンプリコン内でハイブリダイズする。それらの結果は、図6に示されている。
細胞系統における転写制御の均質性は、アデノウイルスベクター生産過程を通じて発現を制御するように設計された細胞系統の重要な特徴である。生産に使用される細胞系統における単一細胞レベルでの不均質な発現は、転写を効率的に抑制しない細胞の亜集団における再配列されたベクター種の選択を導き得る。転写制御の均質性を、M9細胞において、Tet-Rを発現する市販のT-Rex細胞(Invitrogen社、ロット番号1804535)と比較して評価した。細胞をT25フラスコに播種し、moi=100 vp/細胞を使用して、細胞にChAdC-Venusを感染させた。感染の2日後に、細胞をフラスコから剥離し、PBS(1X)で洗浄し、遠心分離により回収した。細胞ペレットを、1%のホルムアルデヒド、2.5 mMのEDTAを含むPBS(1X)中に1.5×106個の細胞/mlの最終細胞密度で再懸濁した。200 μlの細胞懸濁液(合計で約3×105個の細胞)を96ウェルプレートのウェルに移し、FACSにより分析した。図7に報告されているFACS分析の結果により、蛍光シグナルがM9細胞系統の3.8%で検出され、一方で、T-Rex細胞の26%が陽性の結果であることが示された。この結果により、M9細胞系統がより均質であり、T-Rex(74%)と比較して発現を制御可能な細胞の%がより高い(96.2%)ことが裏付けられた。
T-REX細胞(Invitrogen社、ロット番号1804535)と比べて、M9細胞におけるアデノウイルスベクターの細胞特異的生産性及び容量的生産性を比較するために、細胞系統をT25フラスコ中に播種した。コンフルエンスに近い細胞単層に100 vp/細胞のmoiを使用してChAdC-Venusを感染させた。完全なCPEが顕微鏡観察により明らかになったとき(感染7日後)に細胞を採取した。次いで、HCMVプロモーターの配列に対して設計されたプライマーとアンプリコン内でハイブリダイズする二重標識された蛍光プローブ(FAM-TAMRA)とを用いたリアルタイムQPCRによって、ベクターの生産性を決定した。図8の結果により、T-RexよりもM9細胞においてChAdC-Venusの生産性の方が高いことが示された。
各試料の3×106個の細胞(図10を参照)を、細胞ペレットを20 mMのTRIS-HCl(pH 7.4)、150 mMのNaCl、1 mMのEDTA(pH 8.0)、10%のTriton-X、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社のカタログ11697498001)中に4℃で30分間再懸濁させることにより溶解させた。インキュベート後に、試料を4℃で14000 rpmで30分間遠心分離することで清澄化させた。総タンパク質濃度をBio-Rad社のプロテインアッセイにより製造業者の使用説明書に従って評価し、その後にウェスタンブロッティングにより分析した。
HCMVサイレンシングの機構を調べるために、60代継代時のHEK293 hCMV TetR細胞をHDAC阻害剤の存在下にて培養した。細胞培養培地に200 nMのベリノスタット(PXD101)を補充した後に、細胞培養培地を図11に示される種々の時点で採取した。先の実施例に示されるように、TetR発現をウェスタンブロットにより評価した。それらの結果は、TetR発現がベリノスタットにより再活性化され得るが、発現に対する効果は一過性にすぎないことを明確に示している。ベリノスタット(belinostat)がより長時間の曝露後に細胞に対して毒性を示すので、そのような再活性化は実用的な目的のためには適していない。
図1
pUC replication origin pUC複製起点
HSV TK polyA HSV TKポリA
Kan/Neo resistance Kan/Neo耐性
SV40 promoter SV40プロモーター
CAG promoter CAGプロモーター
図2
Ratio +/- tet +/- tet比
SeAp assay SeApアッセイ
図3
Vp/cell Vp/細胞
図4
clone クローン
tubulin チューブリン
図5
Vp/cell Vp/細胞
図6
Productivity of ChAdC-Venus ChAdC-Venusの生産性
Productivity ChAd E-EGFP ChAd E-EGFPの生産性
Vp/cell Vp/細胞
図7
Venus positive cells Venus陽性細胞
Count 数
Venus pos. Cell 3,8% Venus陽性細胞 3.8%
Venus pos. Cell 26% Venus陽性細胞 26%
図8
Volumetric productivity 容量的生産性
Cell-specific productivity 細胞特異的生産性
Vp/cell Vp/細胞
図9
ITR left 左側ITR
Transgene 導入遺伝子
BghPolyA BghポリA
hexon ヘキソン
Fiber ファイバー
ITR-R 右側ITR
Adenoviral vector carrying a HCMV promoter with TetO TetOを含むHCMVプロモーターを有するアデノウイルスベクター
TATA BOX TATAボックス
Diagram of the expression cassette including TetO sequences TetO配列を含む発現カセットの図
図10
tubulin チューブリン
図11
Pretreatment 前処理
Time post-treatment(hours) 処理後の時間(時間)
Claims (13)
- テトラサイクリンリプレッサー(Tet-R)がCAGプロモーターの制御下に発現される細胞株であって、ここで細胞株の細胞が、HEK293細胞である、細胞株。
- 前記細胞株の細胞の少なくとも90%でテトラサイクリンリプレッサー(Tet-R)が発現される、請求項1に記載の細胞株。
- 前記発現は、少なくとも40代の継代にわたって安定的である、請求項1又は2に記載の細胞株。
- 前記Tet-Rは、テトラサイクリン、又はテトラサイクリン類似体の存在下、又は不存在下にて、プロモーター内に1つ以上のテトラサイクリンオペレーター(TetO)を含む遺伝子の転写を抑制する、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞株。
- 前記Tet-Rをコードする遺伝子は、真核細胞、又は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞株。
- (i)(1) cGas及びSTING を含んでなる1以上のIFN遺伝子の刺激因子、(2)1つ以上のJAK/STAT転写アクチベーター、並びに、(3) PKR、MX1、OAS1、APOBEC3G、TRIM5、ZAP、ISG15、ADAR、IFITM1/2/3、BST2及びRSAD2を含んでなる1つ以上のIFN刺激遺伝子(ISG)からなる群から選択される機能的タンパク質の発現を減らす又は抑える突然変異、欠失又は挿入をゲノム内に更に含む、及び/又は、
(ii)Tet-Rをコードする遺伝子と遺伝的に連鎖している耐性遺伝子である、G418耐性遺伝子、ハイグロマイシンB耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子又はゼオシン耐性遺伝子を含んでなる選択マーカーをコードする遺伝子を更に含む、
請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞株。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞株が、そのゲノム内に安定的に組み込まれたテトラサイクリンリプレッサー(Tet-R)をコードする遺伝子を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞株。
- 前記細胞株の細胞は、感染性ウイルス粒子の形成に必要な少なくとも1つのウイルス遺伝子を発現する、請求項1~7のいずれか一項に記載の細胞株、又は、
前記細胞株の細胞は、感染性ウイルス粒子の形成に必要な少なくとも1つのウイルス遺伝子を発現し、該少なくとも1つのウイルス遺伝子は、E1領域にコードされるE1-A及びE1-Bからなる群から選択される、若しくは、配列番号1のヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項1~7のいずれか一項に記載の細胞株。 - 前記細胞株は、ECACCでアクセッション番号17080901として寄託された細胞株である、請求項1~8のいずれか一項に記載の細胞株。
- 感染性ウイルス粒子へとアセンブリすることができ、1つ以上のテトラサイクリンオペレーター(TetO)を含むプロモーターの制御下にある少なくとも1つの異種遺伝子を含むウイルスゲノムを更に含む、又は
感染性ウイルス粒子へとアセンブリすることができ、1つ以上のテトラサイクリンオペレーター(TetO)を含むプロモーターの制御下にある少なくとも1つの異種遺伝子を含むウイルスゲノムを更に含み、
(i)前記ウイルスゲノムは、ヘルペスウイルスゲノム、改変ワクシニアアンカラゲノム及びアデノウイルスゲノムからなる群から選択され、又は、前記ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムである、及び/又は、
(ii)前記異種遺伝子は、細胞に対して毒性である、若しくはウイルス複製サイクルを妨害する、
請求項1~9のいずれか一項に記載の細胞株。 - 前記異種遺伝子は、自己抗原、ウイルス遺伝子、細胞起源の遺伝子、腫瘍関連ネオアンチゲンの組み合わせ物をコードする合成鎖及びネオエピトープをコードする鎖からなる群から選択される、又は、
前記異種遺伝子は、自己抗原、ウイルス遺伝子、細胞起源の遺伝子、腫瘍関連ネオアンチゲンの組み合わせ物をコードする合成鎖及びネオエピトープをコードする鎖からなる群から選択され、
(i)前記自己抗原は、HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA、PSMA、テロメラーゼ、gp100、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ESO-1、サバイビン、ストロメリシン3、チロシナーゼ、MAGE3、CML6S、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NYC0-5S、NY-BR-62、hKLP2及びVEGFからなる群から選択される、
(ii)前記ウイルス遺伝子は、HCVE1-E2タンパク質、狂犬病糖タンパク質及びHIV-1 GP 160からなる群から選択される、及び/又は、
(iii)前記細胞起源の遺伝子は、Tim-3、Her2及びE2F-1からなる群から選択される、請求項10に記載の細胞株。 - 感染性ウイルス粒子の生産のための、請求項1~11のいずれか一項に記載の細胞株の使用。
- 感染性ウイルス粒子を生産する方法であって、
(i)請求項10、若しくは11に記載の細胞株の細胞を、テトラサイクリン若しくはテトラサイクリン類似体の存在下、若しくは不存在下にてin vitroで増殖させる工程、又は、
(ii)請求項1~9のいずれか一項に記載の細胞株の細胞に、ウイルスベクター、又は、アデノウイルスベクターを感染させる工程と、
(iii)ウイルス粒子を回収する工程と、
を含む、方法。
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