BR112020007772A2

BR112020007772A2 - linhagem celular, uso da linhagem celular e método para produzir partículas virais infecciosas

Info

Publication number: BR112020007772A2
Application number: BR112020007772-0A
Authority: BR
Inventors: Stefano Colloca; Alfredo Nicosia
Original assignee: Nouscom Ag
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-10-06
Also published as: MX2020004305A; SG11202003609VA; WO2019081673A1; CA3076026A1; KR20200101322A; AU2018356538A1; CN111386126B; AU2018356538B2; US20200308601A1; RU2020114699A; US11643666B2; CN111386126A; RU2020114699A3; IL274191A; EP3700560A1; JP2021500011A; JP7274225B2

Abstract

A presente invenção refere-se a uma linhagem celular, uso da linhagem celular e um método para a produção de partículas virais infecciosas utilizando a referida linhagem celular.

Description

“LINHAGEM CELULAR, USO DA LINHAGEM CELULAR E MÉTODO PARA PRODUZIR PARTÍCULAS VIRAIS INFECCIOSAS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma linhagem celular, uso da linhagem celular e um método para a produção de partículas virais infecciosas utilizando a referida linhagem celular.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Novas vacinas são necessárias para a prevenção ou tratamento de doenças como HIV, hepatite C, malária, tuberculose e câncer. As evidências pré-clínicas e clínicas apoiam o papel da imunidade das células T e, em particular, as células T CD8* na eliminação dessas doenças. Uma maneira de induzir uma resposta de células T CD8* contra um antígeno específico é expressar esse antígeno e ativadores inatos derivados de patógenos adequados intracelularmente através da entrega do gene; vacinas genéticas ou com base em genes cooptam o processamento fisiológico de antígenos e a apresentação do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe | para ativar uma resposta de células T CD8*. Os vectores de adenovírus defeituosos na replicação têm sido extensivamente utilizados para vacina genética, substituindo a região E1 essencial pelo cassete de expressão para o antígeno. Os vetores de Ad são atraentes como sistema de entrega de genes porque infectam células replicantes e não replicantes, têm um amplo tropismo tecidual, propagam-se muito eficientemente nas linhagens celulares de empacotamento disponíveis e têm um processo de produção escalável e acessível. De fato, os vetores com base em Ad suscitam células T CD8* específicas para antígenos mais potentes do que outros vetores genéticos de vacina com base em poxvírus, lentivírus, alfavírus e DNA nu em modelos animais e ensaios clínicos em humanos. No entanto, o desenvolvimento bem- sucedido de vetores de adenovírus como portadores de vacinas genéticas dependerá eventualmente não apenas de sua potência imunológica, mas também da disponibilidade de substratos celulares para processos de produção escalonáveis e reproduzíveis. Os vetores adenovirais são capazes de expressar altos níveis da proteína antigênica que eles entregam não apenas no tecido alvo in vivo, mas também durante o processo de produção na linhagem celular complementar. No sistema vetorial atual, a expressão do transgene é impulsionada pelo forte promotor imediato/ precoce do citomegalovírus humano (promotor de HCMV) que permite alto nível de expressão do transgene não apenas no tecido alvo, mas também na linhagem celular de empacotamento durante o processo de produção do vetor. Temos várias evidências indicando que a alta expressão de transgene na linhagem celular de empacotamento pode interferir na replicação de adenovírus. Em nossa extensa experiência com resgate e propagação de vetores adenovirais, observamos efeitos prejudiciais na replicação de vírus mediados pela superexpressão de transgene, variando de rendimentos de vetores reduzidos a inibição completa da replicação. Além disso, a interferência na replicação do vetor pode levar à instabilidade genética do próprio vetor com a seleção de espécies vetoriais reorganizadas.

[003] O desenvolvimento de uma linhagem celular capaz de reprimir a expressão do transgene transportado por um vetor adenoviral durante o processo de produção pode impedir os efeitos negativos da superexpressão do transgene. Portanto, o sistema é com base em uma linhagem celular que expressa altos níveis de TetR e por vetores Ad carregando um transgene sob controle do promotor de citomegalovírus humano ou outros promotores fortes, como o promotor de CASI, o promotor de CAG e o promotor de EF1 a com duas ou mais cópias do TetR locais de ligação inseridos a jusante da caixa TATA do promotor.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[004] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma linhagem celular, em que um repressor de tetraciclina (Tet-R) é expresso sob o controle de um promotor celular ou parcialmente celular.

[005] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um uso da linhagem celular de acordo com o primeiro aspecto da invenção para a produção de partículas virais infecciosas.

[006] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método para a produção de partículas virais infecciosas compreendendo as etapas de: (i) cultivar as células da linhagem celular do primeiro aspecto da invenção compreendendo ainda um genoma viral capaz de se reunir em uma partícula viral infecciosa in vitro na ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina; ou (ii) infectar as células da linhagem celular do primeiro aspecto da invenção com um vetor viral, de forma preferencial um vetor adenoviral; e (iii) recuperar as partículas virais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[007] A seguir, é descrito o conteúdo das Figuras compreendidas neste relatório descritivo. Neste contexto, consulte também a descrição detalhada da invenção acima e/ ou abaixo.

[008] Figura 1: Diagrama do pneo/ CAG-TetR. Pneo/ CAG-TetR contém o cassete de expressão para o repressor de tetraciclina e o gene de resistência a G418.

[009] Figura 2: Expressão de SeAP no clone M9 e M38. Os clones foram semeados nos frascos T25 e infectados com ChAdETetOSeap em moi 30 (multiplicidade de infecção) na presença ou ausência de tetraciclina. Uma pontuação para cada clone único foi então obtida calculando a razão com e sem tetraciclina 48 h após a infecção. O clone M9 apresentou a melhor razão +/- tet.

[010] Figura 3: Produção de AdTetO E1E2p7 nas células M9,

M38 e Hek293. M9, M38 e HEK 293 foram infectados em moi 100 (multiplicidade de infecção) com AdTetOE1/ F78E2p7 (um adenovetor que não é capaz de crescer sem o controle de expressão mediado por TetR). Os clones M9 e M38 mostram os melhores valores de produtividade.

[011] Figura 4: Expressão da proteína TetR nas células M9 e M38. A expressão de TetR foi avaliada por análise de Western blot no lisado celular do clone M9 e M38 usando o anticorpo TetR. TetR é expresso em altos níveis nas células M9 e M38.

[012] Figura 5: Eficiência do resgate de vetores ChAd em células M9. A eficiência do resgate dos vetores adenovirais das espécies C e E (ChAdN13 TPA4-T1Poly (Figura 5A) e ChAdE egfp (Figura 5B)) foi avaliada em células M9 em comparação com HEK-293. As monocamadas de células M9 e HEK293 foram transfectadas em paralelo com o DNA do plasmídeo preAd. À produção do vírus foi avaliada por QPCR 12 dias após a transfecção em lisados celulares. Os resultados demonstram uma maior eficiência da produção do vetor adenoviral nas células M9 após a transfecção.

[013] Figura 6: Produtividade dos vetores ChAd C - Venus e ChAd E - EGFP. A produtividade dos vetores de Ad de chimpanzés ChAd C - Venus (Figura 6A) e ChAd E - EGFP (Figura 6B) foi avaliada em células M9 em comparação às células HEK 293 e 293T. As monocamadas de células foram infectadas usando a mesma multiplicidade de infecção de ChAds. As células foram colhidas 72 horas após a infecção e o título do vetor foi avaliado por QPCR no lisado bruto. Os resultados são expressos como produtividade específica da célula.

[014] Figura 7: Avaliação do controle transcricional nas células M9 e T-Rex por análise FACS. As linhagens celulares foram semeadas em frascos T25 e infectadas com ChAd C TetO-VENUS usando um moi = 100 vp/ célula (multiplicidade de infecção). A expressão de quantidade suficiente de

TetR no nível de célula única deve interromper a expressão do gene repórter venus. 3,8% das células M9 mostraram um sinal fluorescente detectável contra 26% das células T-Rex. Demonstrou-se que a linhagem celular M9 é capaz de controlar a expressão gênica em 96,2% das células, enquanto 74% das células T-Rex controlam eficientemente a expressão.

[015] Figura 8: Produtividade do vetor ChAd nas linhagens celulares M9 (Figura 8A) e T-Rex (Figura 8B). A análise foi realizada em células semeadas em frascos T (frascos T25 semeados com células 5e6 em 10 ml de meio). As monocamadas celulares foram infectadas com ChAd-C TetO- VENUS usando uma multiplicidade de infecção de 100 vp/ célula. As células foram colhidas quando CPE completo foi observado por microscopia (7 dias após a infecção). A produtividade do vetor foi determinada pelo método QPCR com iniciadores e sonda projetada da sequência de DNA do promotor do HCMV.

[016] Figura 9: Diagrama de um vetor adenoviral e do cassete de expressão. O vetor adenoviral está carregando um promotor de HCMV com TetO e o cassete de expressão inclui sequências de TetO.

[017] Figura 10: Expressão de TetR dirigida pelo promotor de CAG em comparação com a expressão dirigida por HCMV. As células HCMV- TetR 293 foram primeiro desenvolvidas por transfecção do vetor de expressão HCMV-TetR em células HEK 293. Um clone expressando TetR foi isolado por seleção G418 e expandido. A expressão de TetR foi testada por western blot na passagem 40 e na passagem 60 e comparada à expressão de TetR nas células M9 na passagem 60. As proteínas totais das células foram extraídas das células 3E + 06, separadas em SDS-PAGE, transferidas para a membrana e sondadas com anticorpo anti-TetR (diluição do anticorpo: 1: 1000, incubação por 12 horas a 4 ºC). Os resultados demonstraram que a expressão de TetR dirigida pelo promotor de HCMV é perdida progressivamente ao longo da passagem da cultura de células, enquanto a expressão de TetR dirigida pelo promotor de CAG é mantida sobre-passagem (p60).

[018] Figura 11: Silenciador do promotor do HCMV por mecanismos epigenéticos. A perda gradual da expressão de TetR observada na linhagem celular HCMV-TetR pode ser revertida expondo as células a inibidores de HDAC (Belinostat). As células TetR do HCMV foram cultivadas na presença de 200 nM de Belinostat (inibidor de PXD101 - HDAC); em seguida, a expressão do TetR foi avaliada por western blot pela colheita das células. No entanto, a reativação do promotor de CMV humano é transitória e a expressão de TetR é perdida novamente na ausência de Belinostat.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[019] Antes da presente invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos aqui descritos, pois estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados que são comumente entendidos por um técnico no assunto.

[020] De forma preferida, os termos aqui utilizados são definidos como descrito em “Um glossário multilingue de termos biotecnológicos: (Recomendações da IUPAC)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e KIbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça).

[021] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreender” e variações como “compreende” e “compreendendo” serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas. Nas passagens seguintes, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer recurso indicado como opcional, preferido ou vantajoso pode ser combinado com qualquer outro recurso ou recursos indicados como opcional, preferido ou vantajoso.

[022] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados aqui (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções etc.), supra ou infra, é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder essa invenção em virtude da invenção anterior. Alguns dos documentos citados aqui são caracterizados como “incorporados por referência”. No caso de um conflito entre as definições ou ensinamentos de tais referências incorporadas e definições ou ensinamentos recitados no presente relatório descritivo, o texto do presente relatório descritivo tem precedência.

[023] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Esses elementos são listados com formas de realização específicas; no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar formas de realização adicionais. Os exemplos descritos de maneira diversa e formas de realização preferidas não devem ser interpretados para limitar a presente invenção apenas às formas de realização explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para apoiar e abranger formas de realização que combinam as formas de realização explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ ou preferenciais. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

DEFINIÇÕES

[024] A seguir, são fornecidas algumas definições de termos frequentemente usados neste relatório descritivo. Esses termos terão, em cada instância de seu uso, no restante do relatório descritivo, o significado definido e o significado preferido, respectivamente.

[025] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.

[026] O termo “expressa um gene” ou “expressa uma proteína” é usado no contexto da presente invenção para se referir ao processo de transcrição de MRNA seguido pela tradução do mMRNA na proteína codificada. O nível de expressão pode ser medido ao nível do MRNA e/ ou proteína. Se medida ao nível do MRNA, a quantidade de mMRNA fornecerá pelo menos uma indicação qualitativa da quantidade de proteína presente na célula. Na maioria dos casos, todo o MRNA será traduzido em proteína e, assim, a medição da quantidade de mMRNA permite quantificar a quantidade de proteína produzida recentemente. A quantidade de proteína pode ser determinada por vários métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo a marcação com anticorpos que se ligam de forma específica à proteína. O técnico no assunto conhece várias maneiras de detectar qualitativamente e/ ou quantitativamente a expressão de um gene com base em uma única célula. Esses métodos incluem FISH, coloração intracelular (ICS) e sequenciamento de RNA de célula única.

[027] O termo “mutação”, usado no contexto da presente invenção, refere-se à troca de um nucleotídeo ou aminoácido com outro nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico e com aminoácido em uma sequência de aminoácidos, respectivamente. O termo “deleção”, usado no contexto da presente invenção, refere-se à remoção de um nucleotídeo de uma sequência de ácidos nucleicos e de um aminoácido em uma sequência de aminoácidos, respectivamente. O termo “inserção”, conforme usado no contexto da presente invenção, refere-se à adição de um nucleotídeo a uma sequência de ácidos nucleicos e de um aminoácido a uma sequência de aminoácidos. Uma substituição também pode ser vista como um processo consecutivo de inserção e exclusão ou vice-versa. No contexto da presente invenção, o termo substituição é usado para uma alteração de uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que não altera o número de nucleotídeos da sequência de ácidos nucleicos ou o número de aminoácidos na sequência de aminoácidos.

[028] O termo “imortal” ou “imortalizado”, conforme usado no contexto da invenção, refere-se à propriedade de uma célula para se dividir indefinidamente. Uma célula imortalizada se transformará em uma população de células também denominada “linhagem celular. De preferência, essa linhagem celular compreende ou consiste em células isoladas. De preferência, essa linhagem celular não se tornará senescente. De preferência, também não entrará em apoptose em condições de cultura de células. Enquanto uma linhagem celular é tipicamente de origem clonal, isto é, todas as células são descendentes de uma célula transformada, é comum que haja heterogeneidade dentro de uma linhagem celular. Isso ocorre devido a rearranjoos cromossômicos, duplicações cromossômicas ou separação cromossômica inadequada que pode ocorrer durante a mitose. Tais eventos são mais comuns em células transformadas. O termo “transformado” refere-se a uma propriedade adicional de uma linhagem celular, ou seja, além do crescimento infinito. Essas propriedades são uma ou mais associadas a células tumorais, incluindo crescimento independente da ancoragem, perda de inibição de contato, invasividade e poliploidia. De preferência, a linhagem celular transformada é transformada por um adenovírus ou uma partícula adenoviral.

[029] O termo “linhagem celular” refere-se a uma linhagem celular que exibe heterogeneidade em relação a uma ou mais propriedades. Tipicamente, a heterogeneidade não muda significativamente ou durante os ciclos mitóticos subsequentes das células da linhagem celular. Uma propriedade específica em relação à qual a linhagem celular pode ser heterogênea é a expressão de um determinado transgene, de forma preferencial o Tet-R e/ ou o ploidia.

[030] O termo “Tet-R” é usado no contexto da invenção para se referir ao repressor de tetraciclina.

[031] Os termos “TRE” e “TetO” são usados para designar elementos de DNA aos quais o Tet-R se liga de forma específica. De preferência, a sequência TetO é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 (TCCCTATCAGTGATAGAGA).

[032] Se o TetO for inserido em várias cópias ou próximo ao promotor basal de um gene, o Tet-R poderá atuar como um repressor da transcrição desse promotor basal. Para maximizar o efeito da ligação de Tet-R, é frequentemente desejável incluir dois ou mais TetOs consecutivamente em um promotor. De preferência, duas, três, quatro, cinco, seis a pelo menos 7 cópias de TetOs são incluídas consecutivamente em um promotor.

[033] O termo “gene heterólogo” é usado no contexto da presente invenção para se referir a um gene que não ocorre naturalmente ou é retirado de seu contexto natural e inserido em uma posição diferente dentro do genoma em que ocorre naturalmente ou em outro organismo ou genoma. Por exemplo, um gene humano que codifica um antígeno tumoral que é inserido em um genoma adenoviral é heterólogo ao genoma adenoviral.

[034] O termo “tóxico” é usado no contexto da presente invenção para se referir à atividade de um composto para inibir a proliferação de uma linhagem celular. Dependendo do composto e da concentração, a inibição pode ser completa, isto é, as células individuais param de crescer ou entram em apoptose.

[035] O termo “partículas virais” é usado no contexto da presente invenção para se referir a um vírus, de forma preferencial um vírus recombinante ou um vírion que compreende uma sequência de ácido nucleico. Esta sequência de ácido nucleico pode ser um genoma viral total ou parcial. Neste último caso, o genoma viral compreende de forma preferencial um gene heterólogo. Para algumas partículas virais, são necessárias apenas sequências muito curtas do genoma viral para permitir a montagem de um vírus ou vírion. Por exemplo, para vírus adeno-associado, uma sequência curta (com cerca de 200 pb de comprimento) repetida, colocada nos 5' e 3' de um ácido nucleico heterólogo de um determinado comprimento (de forma geral entre 4,5 e 5,3 kB para um vírus adeno-associado) permitirá a montagem de vírus adeno-associado infeccioso. Uma partícula viral é “infecciosa” no significado da invenção, se puder transferir o ácido nucleico nela contido para uma célula, se entrar em contato com a célula.

[036] Uma linhagem celular preferida da invenção é a linhagem celular derivada de HEK293 referida como M9. Esta linhagem celular foi depositada em 9 de agosto de 2017 na Coleção Européia de Culturas de Células Autenticadas (ECACC) na Public Health England, Culture Collections, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, Reino Unido sob o número de acesso 17080901. O depósito foi feito em nome da Nouscom AG, Bâumleingasse 18, Basileia, CH- 4051, Suíça. A linhagem celular é derivada de uma linhagem celular renais embrionário humano de passagem precoce (Homo Sapiens).

FORMAS DE REALIZAÇÃO

[037] Nos seguintes aspectos diferentes da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica indicada como preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como preferidas ou vantajosas.

[038] No trabalho que levou à presente invenção, foi surpreendentemente demonstrado que a boa produtividade do vetor adenoviral pode ser alcançada pela linhagem celular de acordo com a presente invenção.

[039] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma linhagem celular, em que um repressor de tetraciclina (TetR) é expresso sob o controle de um promotor celular ou parcialmente celular. Também fornece uma linhagem celular, em que um repressor de tetraciclina (TetR) é expresso em pelo menos 70% das células da linhagem celular. De forma preferencial, pelo menos 75%, de forma mais preferencial pelo menos 80% e de forma mais preferencial pelo menos 85%, de forma mais preferencial pelo menos 90% e de forma mais preferencial pelo menos 95% das células nas linhagens celulares expressam Tet-R. A porcentagem de células na (s) linhagem (ens) celular (es) desse Tet-R expresso pode ser medida por métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo coloração fluorescente de proteínas ou análise de MRNA e FACS.

[040] O nível de expressão gênica por célula pode ser medido por reação quantitativa em cadeia da polimerase (QPCR), de forma preferencial QPCR de célula única. A reação quantitativa em cadeia da polimerase é um método conhecido para um técnico no assunto. Para referência, consulte o Sistema de PCR em tempo real QuantStudio?y 12K Flex da Applied Biosystems - Número da peça da publicação 4470050 Rev. A Data da revisão em março de 2012.

[041] Em uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, o Tet-R é expresso nas células da linhagem celular que expressam a proteína Tet-R em um nível de pelo menos 10º moléculas de proteína/ célula, de forma preferencial pelo menos 10º moléculas de proteína/ célula, de forma preferencial pelo menos 10º moléculas de proteína/ célula, de forma preferencial pelo menos 10º moléculas de proteína/ célula, de forma mais preferencial pelo menos 107 moléculas de proteína/ célula, tal como de 10º a 106, 10º a 105 moléculas de proteína/ célula. Correspondentemente, é preferido que a linhagem celular que expressa a proteína Tet-R compreenda entre 10º a 106, de forma mais preferencial 10º a 10º cópias de mMRNA por célula.

[042] Em uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, a linhagem celular compreende de forma estável integrada no seu genoma um gene que codifica o repressor de tetraciclina (Tet- R). De preferência, o gene que codifica Tet-R é integrado de maneira estável nas células que expressam Tet-R. De preferência, o gene que codifica Tet-R é integrado de forma estável em pelo menos 70%, de forma preferencial 75%, 80% ou 85% das células da linhagem celular. De forma mais preferencial, pelo menos 90%, ainda de forma mais preferencial pelo menos 95% e de forma mais preferencial pelo menos 97% das células dentro da linhagem celular compreendem estavelmente integrado em seu genoma um gene que codifica Tet-R.

[043] Em uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, a expressão de Tet-R é estável ao longo do tempo. “Tempo” no contexto da presente invenção pode ser definido como o número de passagens celulares da linhagem celular. Nelay 10 passagens correspondem a cerca de 30 a 70 dias, de forma preferencial a 40 a 60 dias e de forma mais preferencial a cerca de 50 dias. Dentro deste período de 10 dias, passagens podem, mas não necessariamente correspondem a 15 a 35 dias,

de forma preferencial 20 a 30 dias e de forma mais preferencial 25 dias.

Dentro do prazo de 10 dias, 1 passagem pode, mas não corresponde necessariamente a 3 a 7 dias, de forma preferencial 4 a 6 dias e de forma mais preferencial 5 dias.

De preferência, estável ao longo do tempo significa estável por pelo menos 40 (ou mais de 40) passagens, por pelo menos 45 (ou mais de 45) passagens, por pelo menos 50 (ou mais de 50) passagens, por pelo menos 60 (ou mais) de 60 passagens ou pelo menos 75 (ou mais de 75) passagens.

Para todas essas formas de realização, a expressão é de forma preferencial estável para até e incluindo 100 passagens.

O número de dias correspondentes pode ser calculado para essas e outras passagens usando a definição dada por 10, e/ ou 1 dias acima.

Por exemplo, 40 passagens correspondem a 120 a 280 dias, de forma preferencial 160 a 240 dias e de forma mais preferencial 200 dias; 45 passagens correspondem a 135 a 315 dias, de forma preferencial 180 a 270 dias e de forma mais preferencial 225 dias; 50 passagens correspondem a 150 a 350 dias, de forma preferencial 200 a 300 dias e de forma mais preferencial 250 dias; 60 passagens correspondem a 180 a 420 dias, de forma preferencial 240 a 360 dias e de forma mais preferencial 300 dias; 75 passagens correspondem a 225 a 525 dias, de forma preferencial 300 a 450 dias e de forma mais preferencial 375 dias; 100 passagens correspondem a 300 a 700 dias, de forma preferencial 400 a 600 dias e de forma mais preferencial 500 dias.

As formas de realização de limites superiores são combinadas com os limites inferiores de acordo com sua classificação de preferência. “Tempo” também é definido independentemente das passagens pelo número de dias apenas.

Nesse caso, os intervalos acima dados em relação ao número de passagens se aplicam como formas de realização (por exemplo, “120 a 280 dias” se refere a uma forma de realização de “pelo menos 120 a 280 dias”, que não é limitado por qualquer número de passagens, isto é, poderia ser menor ou mais de 40 passagens; os intervalos preferidos representam formas de realização preferidas). “Estável” neste documento significa um aumento da diminuição de não mais que 50%, de forma preferencial não mais que 25% e de forma mais preferencial não mais que 10% do nível médio de expressão durante as passagens 10 a 20. Em uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, o Tet-R reprime a transcrição de genes compreendendo em seus promotores um ou mais Operadores de Tetraciclina (TetOs) na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo de tetraciclina. Por exemplo, o promotor compreende 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 ou mais TetOs.

[044] Em uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, o gene Tet-R está sob o controle de um promotor constitutivo. Em uma forma de realização preferida adicional, o promotor constitutivo é selecionado a partir do grupo que consiste em promotor de alfa EF1, promotor de PGK-1, promotor de ubiquitina B, promotor de B-Actina, promotor de EGR1, promotor de HCMV, promotor de SV40, promotor de RSV, promotor de CMV de camundongo, promotor de CASI e promotor de CAG. De forma mais preferencial, o gene Tet-R está sob o controle do promotor de CAG. O promotor é de forma preferencial um promotor celular ou parcialmente celular. Um promotor celular é de forma preferencial um promotor de uma célula eucariótica. De preferência, o promotor é um promotor celular ou um promotor parcialmente celular. Exemplos de promotores celulares são camundongo, rato, coelho, porquinho da índia, galinha e, em particular, promotores humanos. “Promotores parcialmente celulares" são promotores híbridos compreendendo parte (s) de um ou mais promotores celulares e parte (s) de um ou mais promotores não celulares. O promotor não celular é de forma preferencial um promotor viral. As partes celulares e não celulares são uma fusão que possui atividade promotora (atividade que resulta na transcrição de uma sequência de codificação de interesse). Os promotores celulares preferidos são o promotor de EF1 alfa, o promotor de PGK-1, o promotor de ubiquitina B, o promotor de B-Actina e o promotor de EGR1. Os promotores parcialmente celulares preferidos são o promotor de CASI (parcialmente citomegalovírus e parcialmente frango) e o promotor de CAG. O promotor de CAG (o promotor utilizado nas células M9 dos exemplos) é o mais preferido. Compreende (C) o elemento potenciador precoce do citomegalovírus, (A) o promotor, o primeiro éxon e o primeiro íntron do gene da beta-actina de frango e (G) o aceitador splice do gene da beta-globina de coelho.

[045] Os promotores compreendendo um ou mais Operadores de Tetraciclina (TetOs), que podem ser reprimidos por Tet-R, não são particularmente limitados, por exemplo, eles podem ser promotores celulares, parcialmente celulares, virais ou parcialmente virais (promotores híbridos compreendendo uma parte de um promotor viral e uma parte de um promotor não viral).

[046] Em outra forma de realização preferida, o gene que codifica Tet-R é códon otimizado para expressão em células eucarióticas (de forma preferencial mamíferos). Aqui, o termo “códon otimizado” significa que a eficiência da tradução para expressão em células eucarióticas (de preferência em mamíferos) é aumentada substituindo códons que têm baixa frequência em células eucarióticas (de preferência em mamíferos) por códons que se traduzem no mesmo aminoácido, mas que têm uma alta frequência em células eucarióticas (de preferência mamíferos).

[047] Em uma forma de realização preferida adicional, a linhagem celular compreende ainda em seu genoma uma mutação, exclusão ou inserção que reduz ou impede a expressão de uma proteína funcional selecionada a partir do grupo que consiste em estimulador de um ou mais genes de IFN, de preferência cGas e STING, um ou mais ativador de transcrição JAK/ STAT e um ou mais genes estimulados por IFN (ISGs), de forma preferencial PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/ 2/3, BST2 e/ ou RSAD?2.

[048] Em uma forma de realização preferida da primeira forma de realização da presente invenção, a linhagem celular compreende ainda um gene que codifica um marcador de seleção. De preferência, o gene de resistência está em ligação genética ao gene que codifica Tet-R. Em uma forma de realização preferida, o gene que codifica um marcador de seleção é selecionado a partir do grupo que consiste em um gene de resistência a G418, higromicina B, puromicina, blasticidina ou zeocina em ligação genética ao gene que codifica Tet-R. De forma mais preferencial, o gene que codifica um marcador de seleção é um gene de resistência a G418 em ligação genética ao gene que codifica Tet-R.

[049] Em uma outra forma de realização preferida, a linhagem celular expressa pelo menos um gene viral que é necessário para a formação de partículas virais infecciosas. De forma mais preferencial, se a linhagem celular é usada para a produção de adenovírus recombinantes, o pelo menos um gene viral é E1-A e/ ou E1-B, como codificado na região E1. Por exemplo, as regiões E1 podem ser derivadas de adenovírus humanos ou adenovírus de grandes símios, como Chimpanzee Ad, Bonobo Ad ou Gorilla Ad. De forma mais preferencial, a linhagem celular compreende no seu genoma uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 ou 2, ou uma variante do mesmo que codifica a mesma proteína E1-A e/ ou E1-B.

[050] Em uma forma de realização preferida, as células da linhagem celular são células transformadas.

[051] Em outra forma de realização preferida, as células da linhagem celular são células humanas. De forma mais preferencial, as células da linhagem celular são células renais embrionárias humanas.

[052] Em uma forma de realização preferida, as células da linhagem celular são selecionadas a partir do grupo que consiste em células HEK293, células A5S49, células HeLa, células MRC5, células VERO, células DF-1 ou células SK-OV-3.

[053] Em outra forma de realização preferida, a linhagem celular é a linhagem celular depositada sob o número de acesso 1708091 no ECACC.

[054] Em uma outra forma de realização preferida, a linhagem celular compreende ainda um genoma viral capaz de se reunir em uma partícula viral infecciosa e compreendendo pelo menos um gene heterólogo sob o controle de um promotor compreendendo um ou mais operadores de tetraciclina (TetO).

[055] Em outra forma de realização preferida, o genoma viral é selecionado a partir do grupo que consiste em um genoma do vírus da herpes, um genoma de Vaccinia Ankara modificado e um genoma adenoviral. De forma mais preferencial, o genoma viral é um genoma adenoviral. Um exemplo de um genoma do vírus da herpes é o HSV-1.

[056] Em uma forma de realização preferida, o gene heterólogo é tóxico para a célula ou interfere no ciclo de replicação viral.

[057] Em outra forma de realização preferida, o gene heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em auto-antígenos, genes virais, genes de origem celular, cadeias sintéticas que codificam para combinação de neo-antígenos associados a tumores e cadeias que codificam para neo- epítopos. De preferência, o auto-antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em HER2/ neu, CEA, Hepcam, PSA, PSMA, Telomerase, gplOO, Melan-A/ MART-1, Muc-1, NY-ESO0-1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinase, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYCO-5S, NY-BR-62, hKLP2 e VEGF. De preferência, o gene viral é selecionado a partir do grupo que consiste em proteina HC1 E1-E2,

glicoproteína da raiva e HIV-1 GP 160. De preferência, o gene de origem celular é selecionado a partir do grupo que consiste em Tim-3, Her2 e E2 F -1.

[058] O segundo aspecto da invenção fornece o uso da linhagem celular de acordo com o primeiro aspecto da invenção para a produção de partículas virais.

[059] O terceiro aspecto da invenção fornece um método para a produção de partículas virais infecciosas compreendendo as etapas de: (i) cultivar as células da linhagem celular do primeiro aspecto da invenção compreendendo ainda um genoma viral capaz de se reunir em uma partícula viral infecciosa in vitro na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina; ou (ii) infectar as células da linhagem celular do primeiro aspecto da invenção com um vetor viral, de forma preferencial um vetor adenoviral; e (iii) recuperar as partículas virais.

[060] Em uma forma de realização preferida da terceira forma de realização da presente invenção, a etapa de cultivar (i) ocorre na ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina.

[061] A invenção refere-se, entre outros, aos seguintes itens:

1. Uma linhagem celular, em que um repressor de tetraciclina (Tet-R) é expresso em pelo menos 70% das células da linhagem celular;

2. A linhagem celular de acordo com o item 1, em que o Tet-R é expresso nas células da linhagem celular que expressam Tet-R a um nível de pelo menos 1000 cópias de MRNA ou moléculas de proteína Tet-R por célula;

3. A linhagem celular de acordo com o item 1 ou 2, compreendendo, de maneira estável, integrada em seu genoma, um gene que codifica o repressor de tetraciclina (Tet-R);

4. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, em que

(i) o Tet-R reprime a transcrição de genes compreendendo em seus promotores um ou mais Operadores de Tetraciclina (TetOs) na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina e/ ou (ii) o gene Tet-R está sob o controle de um promotor constitutivo, de forma preferencial o promotor constitutivo é selecionado a partir do grupo que consiste em promotor de alfa EF1, promotor de PGK-1, promotor de ubiquitina B, promotor de B-actina, promotor de EGR1, promotor de HCMV, promotor de SV40, promotor de RSV, promotor de CMV de camundongo, promotor de CAS! e promotor de CAG, de forma mais preferencial o promotor constitutivo é o promotor de CAG;

5. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, em que o gene que codifica Tet-R é códon otimizado para expressão em células de mamíferos;

6. Linhagem celular, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, compreendendo ainda em seu genoma uma mutação, exclusão ou inserção que reduz ou impede a expressão de uma proteína funcional selecionada a partir do grupo que consiste em um ou mais estimuladores de um gene IFN, de preferência cGas e STING, um ou mais ativadores de transcrição JAK/ STAT e um ou mais genes estimulados por IFN (ISG), de preferência PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/ 2/3, BST2, e/ ou RSAD?2;

7. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, compreendendo ainda um gene que codifica um marcador de seleção, de forma preferencial um gene de resistência a G418, higromicina B, puromicina, blasticidina ou zeocina, em ligação genética ao gene que codifica Tet-R;

8. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7, em que as células da linhagem celular expressam pelo menos um gene viral que é necessário para a formação de partículas virais infecciosas, de preferência em que o pelo menos um gene viral é selecionado a partir de grupo que consiste em E1, compreendendo de forma preferencial um gene com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1;

9. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, em que as células da linhagem celular são células humanas, de preferência células renais embrionárias humanas;

10. —Alinhagem celular de acordo com o item 8 ou 9, em que as células da linhagem celular são células HEK293, células AS549, células HeLa, células MRC5, células VERO, células DF-1 ou células SK-OV-3;

11. A linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, em que a referida linhagem celular é depositada sob o número de acesso 17080901 junto ao ECACC;

12. —Alinhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, compreendendo ainda um genoma viral capaz de se reunir em uma partícula viral infecciosa e compreendendo pelo menos um gene heterólogo sob o controle de um promotor compreendendo um ou mais operadores de tetraciclina (TetO), de preferência em que: (1) o genoma viral é selecionado a partir do grupo que consiste em um genoma do vírus da herpes, um genoma de vaccinia Ankara modificado e um genoma adenoviral, de preferência, o genoma viral é um genoma adenoviral e/ ou (ii) o gene heterólogo é tóxico para a célula;

13. A linhagem celular de acordo com o item 12, em que o gene heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em auto- antígenos, genes virais, genes de origem celular, cadeias sintéticas que codificam para combinação de neo-antígenos associados a tumores e cadeias que codificam para neo epítopos, de preferência em que: (i) o auto-antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em HER2/ neu, CEA, Hepcam, PSA, PSMA, Telomerase, gplOO, Melan-A/ MART-1, Muc-1, NY-ESO0-1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinase, MAGES3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYCO-5S, NY- BR-62, hKLP2 e VEGF, (ii) o gene viral é selecionado a partir do grupo que consiste em proteína HC1 E1-E2, glicoproteína da raiva e HIV-1 GP 160, e/ ou (iii) o gene de origem celular é selecionado a partir do grupo que consiste em Tim-3, Her2 e E2 F-1;

14. Uso da linhagem celular de acordo com qualquer um dos itens 1 a 13 para a produção de partículas virais infecciosas;

15. Método para produzir partículas virais infecciosas, compreendendo as etapas de: (i) cultivar as células da linhagem celular dos itens 12 ou 13 in vitro na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina; ou (ii) infectar as células da linhagem celular de qualquer um dos itens 1 a 11 com um vetor viral, de forma preferencial um vetor adenoviral; e (iii) recuperar as partículas virais.

EXEMPLOS

[062] Exemplo 1: Geração de um clone estável que expressa TetR.

[063] As células HEK 293 foram cultivadas em DMEM, soro fetal bovino a 10% e expandidas. Na passagem 30, as células foram plaqueadas em um balão de cultura de células T-75 e transfectadas com 24 ug de plasmídeo pneo/ CAG-TetR digerido com BsaX1. Pneo/ CAG-TetR contém o cassete de expressão para o repressor de tetraciclina e o gene de resistência a G418 (Figura 1). 48 horas após a transfecção, as células HEK 293 foram diluídas para a proporção 1:80 em DMEM completo suplementado com 0,8 mg/ ml de G418. Os clones isolados resistentes a G-418 foram colhidos usando procedimentos padrão e transferidos em placas de 24 poços. Cada placa de 24 poços foi usada para gerar 3 placas: 2 delas foram usadas para a triagem de clones únicos, a terceira foi mantida como “placa principal”. Todos os clones foram transduzidos com ChAdE TetOSeap em duplicado na presença ou ausência de 1 ug/ ml de tetraciclina. 48 horas após a infecção, o sobrenadante foi avaliado quanto à expressão de fosfatase alcalina segregada usando um ensaio de quimioluminescência (kit Phospha-Light, Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os clones foram classificados calculando a razão da expressão de SEAP na presença/ ausência de tetraciclina. O valor representa uma medida da rigidez do controle transcricional: quanto maior o valor, mais rigoroso é o controle transcricional. Os melhores clones também foram avaliados quanto à produtividade de vetores adenovirais. O clone M9 resultou ser muito eficiente no controle da expressão via repressor de tetraciclina, bem como no suporte a altos níveis de produção de vetores adenovirais.

[064] Exemplo 2: Avaliação da regulação TetR pelo ensaio SeAp - comparação do clone M9 e M38.

[065] Os clones M9 e M38 foram semeados em triplicado em frascos T25. Quando as monocamadas celulares atingiram 80 a 90% da confluência (cerca de 3E + 06 células/ balão) foram infectadas como se segue. O meio condicionado foi aspirado e substituído por 5 ml de meio fresco. As células foram então infectadas com ChAdE TetOSeap usando uma multiplicidade de infecção (moi) de 30 partículas/ célula (vp/ célula) na presença ou na ausência de tetraciclina (1 ug/ ml). A expressão de SeAp foi avaliada dois dias após a infecção testando 50 ul de sobrenadante por balão. Os sobrenadantes colhidos de cada frasco foram transferidos para um poço de uma placa de 96 poços (50 ul/ poço) para serem testados quanto à atividade da fosfatase alcalina por um ensaio quimioluminescente (kit Phospha-Light, kit

Phospha-Light, Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O sinal foi adquirido usando o leitor Envision 2012 Multilabel (Perkin Elmer). A eficiência do controle transcricional foi avaliada calculando-se a razão do valor de expressão de SeAp obtido na presença e ausência de tetraciclina, conforme relatado na Figura 2. A expressão de SeAp na presença de tetraciclina (Tet) é comparável nos dois clones, indicando que na ausência de controle transcricional o promotor do HCMV é totalmente ativo nas células M9 e M38. Pelo contrário, quando Tet não está presente no meio e TetR está ativo e ligado ao promotor, a atividade SeAP é cerca de 5 vezes menor no clone M9, indicando uma repressão mais forte do promotor do HCMV em comparação com M38.

[066] Exemplo 3: Avaliação da produtividade do Adenovetor em células M9 e M38.

[067] Os clones M9 e M38 foram semeados em duplicado em frascos T25. Quando as células atingiram 80 a 90% de confluência foram infectadas com AdTetOE1/ F78E2p7 usando um moi de 100 vp/ célula. AdTetOE1/ F78E2p7 é um vetor adenoviral que carrega um gene que é tóxico quando expresso em células HEK293 e, portanto, não pode ser propagado sem controle transcricional. As células HEK 293 foram infectadas em paralelo como controle. Quando um efeito citopático completo era visível por microscopia (4 dias após a infecção), as células e o meio foram colhidos de cada frasco e congelados a -80 ºC. O vetor viral foi liberado das células infectadas por três ciclos de congelamento/ descongelamento (-80 ºC/ 37 ºC). Em seguida, os lisados celulares foram clarificados por centrifugação. Os sobrenadantes clarificados foram analisados por reação em cadeia da polimerase digital de gotículas, empregando a química de corante repórter-extintor TaqMan (Sistema de PCR digital de gotas Biorad QX200 AutoDG) com primers projetados para amplificar uma região-alvo específica do promotor de citomegalovírus humano

(HCMVp) presente no genoma do adenovetor e com uma sonda fluorescente de dupla marcação (FAM-TAMRA). O rendimento do vírus foi avaliado no lisado bruto e expresso como produtividade específica em vp/ célula. Os resultados (Figura 3) mostraram que os clones M9 têm maior produtividade em comparação com M38 e que as células HEK293 parentais não são capazes de suportar a produção de um adenovetor expressando um gene tóxico. A maior produtividade mostrada pelas células M9 é consistente com os resultados mostrados na Figura 2, demonstrando um melhor controle transcricional do M9 em comparação com o M38. Além disso, as células HEK293 não são capazes de suportar a replicação do vetor adenoviral que expressa um gene tóxico.

[068] Exemplo 4: Expressão da proteína TetR em células M9 e M38.

[069] A produção de TetR nos clones M9 e M38 foi avaliada por Western blot utilizando lisado celular. As proteínas celulares foram extraídas dos clones M9 e M38 e quantificadas usando o ensaio de proteína Bio-Rad com uma curva padrão feita com albumina de soro bovino (BSA). 45 ug de extrato de proteína foram desnaturados a 100 ºC na presença de tampão de carregamento contendo SDS e carregados em 4 a 12% de gel Bis-Tris NUPAGEº. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose e incubadas com anticorpo monoclonal TetR (Clontech, cat. N º 631131) diluído 1: 1000. O sinal foi revelado através da incubação da membrana com anticorpo secundário anti-ccamundongo conjugado com HRP (SIGMA, cat A9044) diluído 1: 3000. Como mostrado na Figura 4, a expressão de TetR foi maior nas células M9 do que nas células M38.

[070] Exemplo 5: Eficiência no resgate de vetores ChAd em células M9.

[071] Para avaliar ainda mais a eficiência das células M9 no suporte à produção de vetores adenovirais, testamos a eficiência do resgate dos vetores adenovirais das espécies C e E por transfecção de DNA (ChAdN13 TPA4-T1Poly - Figura 5A e ChAdE egfp - Figura 5B) em comparação com o HEK293 parental. As células M9 e HEK293 foram cultivadas em balão T25 para serem transfectadas em paralelo com 10 ug de DNA do plasmídeo preAd usando Lipofectamine? 2000 (Thermo Fisher Scientific cat. Nº 11668-019) de acordo com as instruções do fabricante. O resgate e amplificação do vetor adenoviral foi avaliado por QPCR em lisados celulares 12 dias após a transfecção. Os iniciadores utilizados no ensaio foram projetados para amplificar uma região alvo específica do promotor do Citomegalovírus Humano (HCMV) e uma sonda fluorescente de dupla marcação (FAM-TAMRA;) hibrida dentro do amplicon. Os resultados são mostrados na Figura 5 e demonstram uma maior eficiência da produção de vetores adenovirais em células M9 após a transfecção para os vetores adenovirais das espécies Ce E.

[072] Exemplo 6: Produtividade dos vetores ChAd C-Venus e ChAd E-EGFP.

[073] A produtividade de dois vetores Ad diferentes de chimpanzés portadores de genes repórteres - ChAdC-Venus (Figura 6A) e ChAdE-EGFP (Figura 6B) foi avaliada em células M9 em comparação às células parentais HEK 293 e 293T. As monocamadas de células no balão T25 foram infectadas usando a mesma multiplicidade de infecção para ambos os ChAds. As células foram colhidas 72 horas após a infecção, quando um efeito citopático completo foi evidente. Os vetores foram liberados das células infectadas por três ciclos de congelamento/ descongelamento (-80 ºC/ 37 ºC). Em seguida, os lisados celulares foram clarificados por centrifugação e o título do vetor foi avaliado por QPCR em tempo real no lisado celular clarificado. Os iniciadores utilizados foram projetados para amplificar uma região alvo específica do Citomegalovírus Humano (HCMV) presente no genoma de

Adeno. Uma sonda fluorescente de dupla marcação (FAM-TAMRA) hibrida dentro do amplicon. Os resultados são mostrados na Figura 6.

[074] Exemplo 7: Avaliação da homogeneidade do controle transcricional nas células M9 e T-Rex - expressão do gene repórter Venus no nível de célula única por análise FACS.

[075] A homogeneidade do controle transcricional na linhagem celular é uma característica importante de uma linhagem celular projetada para controlar a expressão através do processo de produção de vetores adenovirais. Uma expressão heterogênea no nível de célula única na linhagem celular usada para a produção pode levar à seleção de espécies rearranjadas de vetor na subpopulação de células que não reprimem a transcrição com eficiência. A homogeneidade do controle transcricional foi avaliada na célula M9 em comparação com as células T-Rex disponíveis comercialmente expressando Tet-R (Invitrogen, lote nº 1804535). As células foram semeadas em frascos T25 e infectadas com ChAdC-Venus usando um moi = 100 vp/ célula. Dois dias após a infecção, as células foram separadas dos balões e lavadas com PBS 1X e recuperadas por centrifugação. O sedimento celular foi ressuspenso em PBS 1X contendo formaldeído a 1%, EDTA 2,5 mM a uma densidade celular final de 1,5E + O6 células/ ml. 200 ul da suspensão celular (- 3e5 células no total) foram transferidos para um poço de placa de 96 poços e analisados por FACS. Os resultados da análise FACS relatada na Figura 7 mostraram que um sinal de fluorescência é detectado em 3,8% da linhagem celular M9 enquanto 26% das células T-Rex foram positivas. Este resultado demonstrou que a linhagem celular M9 é mais homogênea com uma % mais alta de células (96,2%) que são capazes de controlar a expressão em comparação com o T-Rex (74%).

[076] Exemplo 8: Produtividade do vetor ChAd nas linhas de células M9 e T-Rex.

[077] A fim de comparar a produtividade específica da célula e a volumétrica dos vetores adenovirais nas células M9 em comparação com as células T-REX (Invitrogen, lote nº 1804535), as linhagens celulares foram semeadas em frascos T25. As monocamadas de células próximas à confluência foram infectadas com ChAdC-Venus usando um moi de 100 vp/ célula. As células foram colhidas quando o CPE completo era evidente por observação microscópica (7 dias após a infecção). A produtividade do vetor foi então determinada por QPCR em tempo real com iniciadores projetados na sequência do promotor de HCMV e uma sonda fluorescente de dupla marcação (FAM-TAMRA) hibridiza dentro do amplicon. Os resultados na Figura 8 mostraram uma maior produtividade de ChAdC-Venus nas células M9 do que no T-Rex.

[078] Exemplo 9: Análise de expressão de TetR em células HCMV-TetR e M9 por Western blot.

[079] As células 3E + 06 de cada amostra (ver Figura 10) foram lisadas por ressuspensão do sedimento celular em TRIS-HCI 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, Triton-X 10%, coquetel inibidor de protease, Roche. Cat. 11697498001 por 30 min a 4 ºC. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 4 ºC por 30 min a 14000 rpm para clarificação. A concentração total de proteína foi avaliada pelo ensaio de proteína Bio-Rad seguindo as instruções do fabricante e depois analisada por Western blot.

[080] 45 ug de extrato de proteína foram separados em 4 a 12% de SDS-PAGE sob condições redutoras e depois transferidos para a membrana de nitrocelulose por Dry Blot (sistema de transferência de gel iBlot, Invitrogen). Após a transferência de proteínas, a membrana foi tratada com o tampão de bloqueio (Leite 5% em PBS-Tween 0,1%) por 1 hora à temperatura ambiente e incubada por 12 horas a + 4 ºC com o anticorpo monoclional anti- TetR (clone 9G9 - Clontech Cat. N. 4 631132) diluído 1: 1000. No dia seguinte, a membrana foi incubada com IgG de coelho anti-camundongo conjugada com

HRP (SIGMA, cat. A9044) por 1 hora à temperatura ambiente e depois visualizada com o substrato de transferência Western Pierce ECL Western (Thermo Scientific, Rockford, IL), de acordo com o protocolo do fabricante. O anticorpo anti-tubulina foi utilizado como controle e para normalizar os resultados.

[081] Os resultados mostrados na Figura 10 demonstram que a expressão de TetR acionada pelo promotor do HCMV diminui ao longo do tempo e indicada pela comparação entre as amostras HEK293 p40 - hoMV TetR e HEK293 p60 - hnCMV TetR mostrando uma forte redução do sinal TetR. Em contraste, a expressão de TetR conduzida pelo promotor de CAG não diminuiu ao longo do tempo.

[082] Exemplo 10: Reativação da expressão de TetR expondo a célula HEK293 p60 - hnocMV TetR ao inibidor de histona desacetilase (HDAC).

[083] Para explorar o mecanismo de silenciamento do HCMV, as células TKR HEK293 hoMV na passagem 60 foram cultivadas na presença de um inibidor de HDAC. O meio de cultura de células foi suplementado com 200 nM de belinostat (PXD101) e depois colhido em diferentes momentos, como indicado na Figura 11. A expressão de TetR foi avaliada por western blot, como indicado no exemplo anterior. Os resultados mostram claramente que a expressão de TetR pode ser reativada com belinostat, mas o efeito na expressão é apenas transitório. Essa reativação não é adequada para fins práticos, uma vez que o belinostat é tóxico para as células após uma exposição mais prolongada.

[084] Os inventores assumem com base nesta experiência que o hCMV-IE (promotor viral) é propenso ao silenciamento transcricional que está associado à metilação do DNA. Em contraste, a expressão de TetR dirigida pelo promotor de CAG (o promotor parcialmente celular mais preferido da invenção) é estável ao longo da passagem celular. Os inventores acreditam que esta descoberta surpreendente se deve ao fato de as células serem mais propensas a silenciar os promotores virais do que os promotores celulares ou parcialmente celulares.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelas células da linhagem celular serem células HEK293, e em que um repressor de tetraciclina (Tet-R) é expresso sob o controle de um promotor celular ou parcialmente celular.

2. LINHAGEM CELULAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo promotor celular ser um promotor eucariótico e o promotor parcialmente celular compreender parte (s) de um ou mais promotores eucarióticos e partes de um ou mais promotores não celulares, preferencialmente virais.

3. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por um repressor de tetraciclina (Tet-R) ser expresso em pelo menos 90% das células da linhagem celular.

4. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela expressão ser estável ao longo do tempo.

5. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo Tet-R reprimir a transcrição de genes compreendendo em seus promotores um ou mais Operadores de Tetraciclina (TetOs) na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo de tetraciclina.

6. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo gene Tet-R estar sob o controle de um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em promotor de alfa EF1, promotor de PGK-1, promotor de ubiquitina B, promotor de B-actina, promotor de EGR1, promotor de CASI e promotor de CAG.

7. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo gene que codifica Tet-R ser códon otimizado para expressão em células eucarióticas, de forma preferencial em células de mamíferos.

8. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por compreender ainda: (i) em seu genoma, uma mutação, exclusão ou inserção que reduz ou impede a expressão de uma proteína funcional selecionada a partir do grupo que consiste em um ou mais estimuladores de um gene IFN, de preferência cGas e STING, um ou mais ativadores de transcrição JAK/ STAT e um ou mais gene estimulado por IFN (ISG), de forma preferencial PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/8, BST2 e/ ou RSAD? e/ ou (ii) um gene que codifica um marcador de seleção, de forma preferencial um gene de resistência a G418, higromicina B, puromicina, blasticidina ou zeocina, em ligação genética ao gene que codifica Tet-R.

9. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por compreender de forma estável integrada em seu genoma um gene que codifica o repressor de tetraciclina (Tet-R).

10. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelas células da linhagem celular expressarem pelo menos um gene viral que é necessário para a formação de partículas virais infecciosas, de preferência em que o pelo menos um gene viral é selecionado a partir de grupo que consiste em E1, compreendendo de forma preferencial um gene com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

11. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo promotor de Ser o promotor de CAG.

12. LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pela referida linhagem celular ser a linhagem celular depositada sob o número de acesso 17080901 junto ao ECACC.

13. — LINHAGEM CELULAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por compreender ainda um genoma viral capaz de se reunir em uma partícula viral infecciosa e compreender pelo menos um gene heterólogo sob o controle de um promotor compreendendo um ou mais operadores de tetraciclina (TetO), de preferência em que: (i) o genoma viral é selecionado a partir do grupo que consiste em um genoma do vírus da herpes, um genoma de vaccinia Ankara modificado e um genoma adenoviral, de preferência, o genoma viral é um genoma adenoviral e/ ou (ii) o gene heterólogo é tóxico para a célula ou interfere no ciclo de replicação viral.

14. LINHAGEM CELULAR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo gene heterólogo ser selecionado a partir do grupo que consiste em auto-antígenos, genes virais, genes de origem celular, cadeias sintéticas que codificam para combinação de neo-antígenos associados a tumores e cadeias que codificam para neo epítopos, de preferência em que: (i) o auto-antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em HER2/ neu, CEA, Hepcam, PSA, PSMA, Telomerase, gplOO, Melan-A/ MART-1, Muc-1, NY-ESO0-1, Survivino, Estromelisina 3, Tirosinase, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYCO0-5S, NY- BR-62, hKLP2 e VEGF, (ii) o gene viral é selecionado a partir do grupo que consiste em proteína HC1 E1-E2, glicoproteína da raiva e HIV-1 GP 160, e/ ou (iii) o gene de origem celular é selecionado a partir do grupo que consiste em Tim-3, Her2 e E2 F-1.

15. USO DA LINHAGEM CELULAR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para a produção de partículas virais infecciosas.

16. MÉTODO PARA PRODUZIR PARTÍCULAS VIRAIS INFECCIOSAS, caracterizado por compreender as etapas de:

(i) cultivar as células da linhagem celular, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 14, in vitro na presença ou ausência de tetraciclina ou um análogo da tetraciclina; ou

(ii) infectar as células da linhagem celular, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, com um vetor viral, de forma preferencial um vetor adenoviral; e

(iii) recuperar as partículas virais.