CN117487760A - 一种猪骨髓巨噬细胞及其构建方法、应用 - Google Patents

一种猪骨髓巨噬细胞及其构建方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，一种猪骨髓巨噬细胞及其构建方法、应用；所述的方法包含电穿孔原代猪骨髓巨噬细胞引入pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1基因使其永生化的方法，在该细胞上继续构建稳定表达Cre基因的猪骨髓巨噬细胞系的方法和利用该细胞系去除基因缺失重组毒株上筛选标记基因的方法。本发明采用的方法是将分别含有pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1的转座子载体和转座酶载体，以电穿孔的方式引入原代猪骨髓巨噬细胞，筛选出永生化猪骨髓巨噬细胞。在永生化的猪骨髓巨噬细胞上继续电穿孔引入Cre基因使其稳定表达Cre蛋白，可在构建基因缺失重组毒株过程中切除筛选标记基因中应用。

Description

一种猪骨髓巨噬细胞及其构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪骨髓巨噬细胞及其构建方法、应用。
背景技术
自上世纪80年代，猪伪狂犬病基因缺失疫苗的出现开创了动物传染病防控的新纪元，使用毒力决定基因(TK、gE或/和gI)缺失的基因工程活病毒疫苗，以及配合相应的鉴别诊断技术，使临床上区分自然感染野毒和疫苗免疫的动物成为可能，是一种实现净化传染病的有效工具。在几十年的临床应用中充分证明了基因缺失疫苗的优点：免疫原性好，保护效果佳；安全性好，毒力不返强；配合鉴别诊断，可实现根除效果。在研发或生产疫苗过程中，一般必须通过基因缺失病毒感染易感细胞实现。
洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的最重要的易感细胞之一为巨噬细胞。原代细胞进行大规模疫苗生产可行性低，原因在于制备原代巨噬细胞既费时又昂贵，且批次不稳定和可能发生污染。而除原代巨噬细胞，现缺乏合适的其他稳定传代细胞系用于嗜巨噬细胞病毒的分离和繁殖。为了解决这个难题，全球科学家一直在努力建立永生化猪巨噬细胞系。
目前国外已有文献报道的永生化猪巨噬细胞系有五个：WSL、IPAM、IPKM、IPIM和ZMAC-4。(一)德国弗里德利希—鲁夫勒联邦动物健康研究所(FLI)构建的WSL是一种自然永生化的野猪胚胎猪肺细胞，这株细胞高水平表达SLA II和SW3，但几乎不表达CD163和CD169，表明该细胞系是未成熟的巨噬细胞前体(Sánchez EG et al.,Phenotyping andsusceptibility of established porcine cells lines to African Swine FeverVirus infection andviralproduction.Scientific reports.2017Sep 4；7(1):10369)。(二)加拿大疫苗和传染病研究组织(VIDO)构建的IPAM是一种猪肺泡巨噬细胞的永生化细胞系，由原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)转染携带SV40大T抗原(SV40LT)基因的载体pSV3-neo，经过含有遗传霉素G418的培养基筛选获得三株单克隆细胞株3D4/2、3D4/21和3D4/31。IPAM与原代细胞PAM相比，仅低水平表达CD14和SW3，几乎不表达CD163和SLAII，因此IPAM亦非成熟的巨噬细胞(Weingartl HM et al.,Continuous porcine cell lines developed fromalveolar macrophages:partial characterization and virussusceptibility.Journal of virological methods.2002Jul；104(2):203-16)。(三)日本国家农业和食品研究组织(NARO)构建的IPKM是一种猪肾来源的巨噬细胞，通过在原代猪肾源巨噬细胞(PKM)感染携带SV40LT基因和猪端粒酶逆转录酶(pTERT)的重组慢病毒，经由含遗传霉素G418的培养基筛选获得细胞系。IPKM与原代肾巨噬细胞PKM具有相似的形态，表达巨噬细胞特异性表面分子Iba1、KT022和CD172a(Takenouchi T et al.Immortalizationand characterization ofporcine macrophages thathadbeen transducedwithlentiviral vectors encoding the SV40 large Tantigen andporcine telomerasereverse transcriptase.Frontiers in veterinary science.2017；4:132.)。(四)NARO于2022年发表构建的IPIM是一种猪肠道来源的巨噬细胞，永生化细胞的方法同IPKM，通过慢病毒转染的方式表达SV40LT和pTERT。IPIM表达巨噬细胞特异性表面分子Iba-1、CD172a、CD204、CD203a和CD16，部分细胞表达CD163、CD169和MHC-II(Takenouchi T et al.,Isolation and immortalization ofmacrophages derived from fetal porcine smallintestine and their susceptibility to porcine viral pathogeninfections.Frontiers in veterinaryscience.2022Jul 18；9:919077)。(五)由美国Aptimmune Biologics,Inc和伊利诺伊大学选培获得的ZMAC-4来源于猪胚胎肺部灌洗液，该细胞系为未转化的巨噬细胞，其培养方式被称为“静止悬浮培养”，其培养基内需添加M-CSF维持培养，经过34天，细胞数可扩增大于100倍，截止发表时间已经在8个月传代超过75次，没有表现出增殖能力下降的迹象。2008年3月26日冻存的一批ZMAC-4细胞创建了主细胞库，该细胞库已获得美国农业部兽医生物制品中心的批准，可用于商业疫苗生产。该细胞系表达原代PAM的几种表面标志物，如CD14、CD163、CD172和E26家族转录因子PU.1，然而不表达CD203a，表明它们不如原代细胞PAM成熟(Portugal R et al.,Aporcine macrophagecell line that supports high levels ofreplication of OURT88/3,an attenuatedstrain of African swine fever virus.Emerging microbes&infections.2020Dec；9(1):1245-1253)。
目前在国内已发表的永生化猪巨噬细胞有4个：(一)专利申请公开号CN105793416A发表的《永生化的猪肺泡巨噬细胞》是在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)内转染携带SV40LT基因的转座子载体pPB-CAG-SV40TAg和pPB-CMV-hyPBase使其永生化，流式检测可表达巨噬细胞表面标志CD163和唾液酸粘附素P210，该细胞系截止专利公开的时间已经培养8个月(50～60代)。(二)专利申请公开号CN 113528453 A发表的《一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用》中是由原代猪骨髓源巨噬细胞(BMDM)感染携带SV40LT基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的慢病毒获得细胞系，使用的慢病毒载体GLV2-CMV-MCS-PGK-puro表达嘌呤霉素抗性基因，该细胞系经过流式检测显示可表达CD14。(三)专利公开号CN114292873 A《永生化猪骨髓巨噬细胞、其构建方法及应用》中的细胞系由在原代猪骨髓巨噬细胞(BMDM)中转染携带SV40LT基因的质粒pIED-Neo-SV40TAg，经含有嘌呤霉素的培养基筛选获得。(四)专利申请公开号CN 113151171 A发表的《猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用》是由猪肺泡巨噬细胞(PAM)经过特殊的细胞培养基结合自然驯化的方法筛选获得猪肺泡巨噬细胞系。
因此，据目前可查询的文献资料报道全世界仍然没有一株成熟的猪巨噬细胞株，该细胞株一起同时具备无外源病毒癌基因、无外源病毒载体基因、无抗药基因、传代稳定和操作简单等优势。有文献报道，用非病毒的人类基因(hTERT、hCyclin D1和hCDK4突变体)可使原代人卵巢表面上皮细胞(OSE)建立正常的二倍体OSE细胞系，并且不存在染色体不稳定的现象(Sasaki R et al.,Oncogenic transformation ofhuman ovarian surfaceepithelial cells with defined cellular oncogenes.Carcinogenesis.2009Mar；30(3):423-31.)。这套三基因组合的永生化细胞的效果，同样在其它类型的细胞上得到了验证，例如，人肌源性细胞(Shiomi,Ket al.,2011)、牛和猪的成纤维细胞(DonaiKet al.,2014)、猴成纤维细胞和胎牛结肠上皮细胞(KurodaK et al.,2015)以及其它一些濒危物种的细胞等。那么，使用相对应的猪源的三基因(pTERT、pCyclin D1和pCDK4突变体)是否能永生化猪巨噬细胞是未知的，永生化后的猪巨噬细胞是否保留巨噬细胞特性更是未知的。
发明内容
本发明提供了构建永生化猪巨噬细胞的方法，可获得无病毒癌基因、无病毒载体基因和无抗药基因的永生化猪骨髓巨噬细胞，在该细胞上进一步引入Cre基因获得稳定表达的细胞系，为构建基因缺失毒的过程中去除筛选标记基因提供便利条件。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种永生化猪骨髓巨噬细胞，其特征在于，所述的永生化猪骨髓巨噬细胞株为：
永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2023177；
或永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre，于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学，CCTCC NO:C2023176。
一种构建所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的方法，包括以下步骤：
(1)取猪的股骨和胫骨，分离骨髓细胞，在体外诱导培养成巨噬细胞后，消化收集；
(2)将含有pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1基因的转座子载体和转座酶载体，以电穿孔的方式引入原代猪骨髓巨噬细胞；
所述pTERT转座子载体包括如GenBank登录号为NM_001244300.2中“TERT”基因的CDS区所示的核苷酸序列；
所述pCDK4(R24C)转座子载体包括如GenBank登录号为NM_001123097.1中“CDK4”基因的CDS区的核苷酸序列，此外，将第24位氨基酸从精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)；
所述pCCND1转座子载体子载体包括如GenBank登录号为XM_021082686.1中“CCND1”基因的CDS区的核苷酸序列；
(3)存活的细胞进行有限稀释法筛选单克隆细胞株，连续传代培养，得到永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7；(4)将步骤(3)获得永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7引入Cre基因，获得永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre。
其中步骤(4)中将含有Cre基因的转座子载体和转座酶载体，以电穿孔的方式引入永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7；所述Cre基因的转座子载体包括GenBank登录号为NC_005856.1中“Cre”基因的CDS区所示的核苷酸序列；电穿孔后，经过G418选择性培养基筛选阳性克隆细胞株，得到稳定表达Cre的永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre。
本发明还提供了前述技术方案所述方法构建的稳定表达Cre基因的猪骨髓细胞系在去除猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组病毒中的筛选标记红色荧光基因中的应用方法。
所述一种永生化猪骨髓巨噬细胞在制备疫苗中的应用。
永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2023177。
永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre，于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学，CCTCC NO:C2023176。
有益效果：
1、本发明提供一种全新的永生化猪骨髓巨噬细胞
原代细胞从活体组织分离后在体外通常只具有有限的代次，很大程度上决定于染色体末端的端粒长度。由于DNA半保留复制的特性，随着细胞的复制，端粒会不断缩短，最终短到细胞无法正常分裂，从而导致细胞死亡。端粒酶是参与端粒合成的复合体，在维持端粒长度的作用上尤为显著，从而提高细胞分裂能力。因此，过表达端粒酶逆转录酶(TERT)是常用的细胞永生化策略之一。在实际研究中，仅过表达TERT不足以永生化所有细胞类型，如原代猪骨髓巨噬细胞。导入癌基因是另外一种常见永生化的方法，除了导入常见的表达病毒癌基因(例如SV40LT、HPV E6E7)或细胞内的原癌基因(例如HRAS)外，还有一些抑癌基因也参与细胞永生，比如p53、pRb。有文献报道，通过阻断pRb通路(p16-CDK4/cyclinD1-pRb)可加快细胞进程。细胞周期蛋白Cyclin D1结合相应的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4，形成特定的CDK4-CyclinD1复合物，调节细胞周期或转录。CDK4(R24C)突变体与CyclinD1结合，无法激活pRb，可能跨过细胞永生化过程中的衰老期(M1)和危机期(M2)。但由于猪骨髓巨噬细胞与普通原代细胞不同，单独引入上述单个基因无法做到永生化或效果不佳。同时现有技术公开的永生化的生化猪巨噬细胞部分缺乏特有的表面抗原，与原代猪巨噬细胞存在差距，应用受限。
本发明提供一种全新的永生化猪骨髓巨噬细胞构建方法，即通过将电穿孔将pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1基因的转座子载体和转座酶载体引入原代猪骨髓巨噬细胞，其中pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1这个三基因永生化基因的组合未见在作为永生化猪骨髓巨噬细胞的文献报道。同时本发明发现单独采用pTERT或hTERT引入原代猪骨髓巨噬细胞后，不能永生化(小于6代)；而pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1组合导入骨髓巨噬细胞可以永生化，具有与癌基因SV40LT相当的永生化效果，而三基因组合是非病毒癌基因，避免了引入外源病毒癌基因；本发明构建了稳定表达Cre的猪骨髓巨噬细胞细胞株共3株，分别命名为IPBM 27w7-Cre-1、IPBM27w7-Cre-2和IPBM27w7-Cre-3；其中猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7均高表达CD14、CD16、CD163、CD172a、CD203a和CD169，稳定传代30代后，仍然保持与原代猪骨髓巨噬细胞相似的细胞形态，其细胞轮廓清晰，细胞传代稳定。综上所述，猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7是一种优质的猪巨噬细胞，具有显著优势：无病毒癌基因、无病毒载体基因、无筛选标签、与原代猪髓巨噬细胞形态相似、细胞轮廓清晰、细胞传代稳定和操作简单。通过流式检测，该细胞系可高水平表达巨噬细胞特异性表面分子：CD14、CD16、CD163、CD169、CD172a和CD203a，说明该细胞系是一株成熟的巨噬细胞。此外该细胞株还进行保藏(CCTCCNO:C2023177)。
2、无外源基因或筛选标签是理想疫苗的特殊要求
由于疫苗生产过程中不可避免可能引入外源基因，而外源基因可能会带来风险，例如如果永生化一般需要借助慢病毒载体引入病毒癌基因(例如SV40LT基因)，同时为了筛选方便会引入筛选标签，但上述外源病毒载体和病毒癌基因及筛选标签都会给疫苗带来新的风险和分离难度。世界卫生组织(WHO)、美国食品和药物管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)和中国兽药典等组织发布的指南以及药典中明确规定了生产用细胞的安全性检测的相关标准。对生产用细胞的全面了解至关重要，包括细胞特性、稳定性、纯度、外源和内源性因子的存在和致瘤性等，其中致瘤性和外源因子的检测是各组织规定要求中均需通过的安全检测项目。因此，在挑选已有的潜在生产用细胞过程中，人们往往更倾向选择风险性更小的选项，即尽可能在疫苗中避免或减少病毒基因或癌基因引入，降低风险。
构建基因缺失病毒方法：目前构建基因缺失病毒的主流技术包括三类：传统的标记辅助的定点诱变、基于已构建的病毒载体(例如，细菌人工染色体技术、重组粘粒系统、流感病毒的8质粒病毒拯救系统和复制缺陷型腺病毒载体)进行病毒基因缺失和CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。病毒载体的构建过程耗时耗力，实验操作难度较高，需要成熟的背景技术和长时间的验证。CRISPR/Cas9技术在近些年非常热门，但其在靶点选择上受限于前间隔序列邻近基序(Protospacer adjacentmotif，PAM)的序列特征，并且存在脱靶的风险，可能引起不必要的突变。因此，传统的标记辅助的定点诱变虽然存在效率低的缺点，但是其在位点序列选择上不受限，并且具有高度保守性。在真核细胞内构建基因缺失重组病毒通常采用筛选标记联合同源重组的组合，其常规过程可分为三步：第一、在病毒易感的细胞内转染转移载体和病毒基因组(或者转染后再感染病毒)，使转移载体上的同源臂序列与病毒上的同源序列发生重组，转移载体上的筛选标记基因(例如荧光基因或/和者抗药基因)被引入病毒基因组；第二步、利用筛选标记基因的特点从野生毒和重组毒的混合物中分离和纯化出重组病毒；第三步、去除重组病毒中的筛选标记基因。早期去除筛选标记基因的方法可再次利用只带有两侧同源臂序列但不含筛选标记基因的重组质粒进行同源重组，替换筛选标记基因，这步工作相当于重复前两步，但此轮病毒纯化中将无筛选标记基因的辅助，病毒纯化难度和工作量极大。目前应用最多的位点特异性重组有Cre/LoxP和FLP/FRT系统，其中Cre和FLP均为特异性重组酶，属重组酶λ整合酶家族，它们催化的反应类型、靶位点及重组机制十分相似，LoxP和FRT为特异性位点，也有相似的结构。因此，在设计转移载体的过程中，在筛选标记基因两侧带上同向的特异性位点。那么，在病毒易感细胞内表达特异性重组酶和转染重组病毒基因组(或感染重组病毒)即可精准去除筛选标记基因。但是决定病毒纯化效率高低的唯一因素为表达特异性重组酶的细胞比例。如果采用常规的转染方式，受限于细胞特性，尤其巨噬细胞被公认为难以转染的细胞，因此常规转染不可能达到100％的表达效率，无法避免去除筛选标记基因过程中的病毒纯化步骤。如果存在一个表达特异性重组酶的巨噬细胞细胞系即可轻松解决去除筛选标记基因的难题，省掉去除筛选标记基因的纯化病毒步骤。
由上可知，构建嗜巨噬细胞病毒的基因缺失疫苗涉及基因缺失病毒和易感细胞。目前仍然存在缺少操作简单的优质易感细胞系的问题，和构建基因缺失疫苗的过程中往往加入筛选标记基因辅助筛选阳性毒株，但疫苗审批要求不可携带此类筛选标记，反向筛选阴性毒株工作量大的问题亟待解决。而去除单个筛选标记基因常用Cre/LoxP重组酶系统，但在嗜巨噬细胞的猪病毒性疫苗的研发中，因转染困难而难以去除筛选标记基因。
本发明所述方法构建的稳定表达Cre基因的猪骨髓巨噬细胞系可用于去除基因缺失重组病毒的筛选标记，例如本发明实施例所示的，利用本发明所述的表达Cre基因猪骨髓细胞系可有效去除猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组毒中的筛选标记——红色荧光基因，也可应用于适应该细胞系的其它基因缺失重组病毒中筛选标记基因的去除。因此，本发明提供的表达Cre的猪骨髓巨噬细胞系可高效简单的去除基因缺失疫苗构建过程中的筛选标记基因。
3、常规转染方式—化学转染，在引入外源核酸的同时，会引起巨噬细胞活化和不良反应。而电穿孔相较于其它转染方式简单高效，无生物和化学副作用，本发明采用电穿孔的方式进行转染。
附图说明
图1为pTERT(A)、pCDK4(R24C)(B)、pCCND1(C)、Cre(D)的转座子载体图谱；
图2为实施例1中分离得到的原代猪骨髓细胞(A)和诱导分化的猪骨髓巨噬细胞(B)形态图；
图3为实施例1中筛选得到的永生化的猪骨髓巨噬细胞第10代(A)、20代(B)和30代(C)细胞形态图；
图4为实施例1中检测永生化的猪骨髓巨噬细胞表达的巨噬细胞特异性细胞表面分子的流式图；
图5为实施例2中筛选得到的3株表达Cre的永生化猪骨髓巨噬细胞WB鉴定结果图；
图6为实施例3中表应用达Cre基因的猪骨髓巨噬细胞去除猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组毒中筛选标记的效果图；
图7为对比例2中三种常见转染方式在猪巨噬细胞上的转染效率对比；
图8为对比例3中瞬时转染和稳定表达Cre蛋白的方法去除基因缺失重组病毒筛选标记的效率对比。
具体实施方式
以下实施例为了更好的说明本发明的技术方案，而不是以此来限制本发明的保护范围。
实施例1永生化猪骨髓巨噬细胞的构建
1.1原代猪骨髓巨噬细胞的分离培养
1)取猪的股骨和胫骨，低温和无菌条件下转移至生物安全柜中；
2)剔肉后，75％酒精喷洒骨表面消毒，居中锯开暴露横截面；
3)用装有冲骨髓液的注射器冲出骨髓，过滤获得骨髓细胞悬液；
4)将悬液转入离心管，1500rpm，4℃，离心5分钟，弃上清；
5)用3-5倍体积的红细胞裂解液重悬细胞，静置2分钟，20mL细胞清洗液终止反应，1500rpm，4℃，离心5分钟，弃上清；
6)用细胞清洗液重悬，1500rpm，4℃，离心5分钟，弃上清，重复洗三次后，得到的沉淀为猪骨髓细胞；
7)用生长培养液(RPMI-1640培养基+10％FBS+10ng/mLpGM-CSF+1％双抗)重悬细胞，转移至10cm培养皿中，37℃，5％CO2，每三天半量换液，静置培养7天，获得猪骨髓巨噬细胞。
如图2所示，左图为刚分离的猪骨髓细胞(BM)形态图，右图为经过GM-CSF诱导培养的猪骨髓巨噬细胞(BMDM)形态图。刚分离的猪骨髓细胞呈现球状，悬浮不贴壁。经过诱导分化的猪骨髓巨噬细胞，形状为“煎蛋”状，细胞轮廓清晰，贴壁生长。可见本发明分离培养的为正常的猪骨髓巨噬细胞。
1.2猪骨髓巨噬细胞的电穿孔
1)取步骤1.1的原代猪骨髓巨噬细胞，消化收集后，用适当的电转液重悬，细胞计数后，分装到离心管，每管106个细胞；
2)每管细胞加入质粒pTEG-pTERT、pTEG-pCDK4(R24C)、pTEG-pCCND1和pSB16，其中pTEG-pTERT、pTEG-pCDK4(R24C)、pTEG-pCCND1的载体图谱见图1；
3)细胞和质粒混匀后，转移入2mm的电击杯内；
4)在电转仪上设置参数：选择指数衰减脉冲，电容为940μF，电压在150V～300V，时间1ms～10ms；
5)电脉冲后立即转移细胞至含有生长培养基的12孔板内，轻轻吹打混匀；
6)37℃，5％CO2，静置培养3天。
1.3永生化猪骨髓巨噬细胞的筛选
1)取步骤1.2获得的电穿孔转染后的猪骨髓巨噬细胞，有限稀释法稀释成单个细胞接种到96孔板；
2)37℃，5％CO2静置培养，每五天换液，待细胞长满单个孔后，消化后转入24孔板继续培养；
3)待24孔板底部长满后，转入6孔板；待6孔板长满后再转入6cm细胞皿；待6cm细胞皿长满后，再转入10cm细胞皿中进行传代培养；
4)逐步扩大培养，筛选细胞形态均一、生长速度稳定的单克隆细胞株。最终筛选出最优的一株细胞，命名为IPBM 27w7，保藏编号为CCTCC NO:C2023177。
如图3所示，图片依次是永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7第10代、20代、30代的细胞形态图。可见IPBM 27w7仍然保持与原代猪骨髓巨噬细胞(图2右)相似的细胞形态，并且细胞轮廓清晰，细胞传代稳定。
对永生化的猪骨髓细胞IPBM 27w7流式检测巨噬细胞特异细胞表面分子：CD14、CD16、CD163、CD172a、CD203a和CD169。选用一抗均来自BIO-RAD公司(CD14货号：MCA1218GA、CD16货号：MCA1971GA、CD163货号：MCA2311GA、CD172a货号：MCA2312GA、CD203a货号：MCA1973GA和CD169货号：MCA2316GA)，FITC标记的二抗来自Invitrogen公司(货号：A11001)。流式检测结果如图4所示，猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7均高表达CD14、CD16、CD163、CD172a、CD203a和CD169，说明IPBM 27w7是一株成熟的巨噬细胞。
实施例2构建稳定表达Cre蛋白的猪骨髓巨噬细胞系
1)取步骤1.3获得的永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7，电穿孔步骤同步骤1.2，每管细胞电穿孔pTEG-Cre-IRES2-NeoR和pSB16，其中pTEG-Cre-IRES2-NeoR载体图谱见图1，电脉冲后立即转移细胞至含有生长培养基的12孔板内，轻轻吹打混匀；
2)37℃，5％CO2培养24小时，加入含有G418(100ug/mL)的筛选培养基，继续培养；
3)每天观察细胞存活情况，每隔3天更换筛选培养基；
4)维持培养直至获得存活情况良好的细胞孔，同步骤1.3，存活孔细胞进行有限稀释，获得细胞克隆，逐步扩大培养；
5)RT-PCR检测鉴定每个克隆细胞表达Cre基因的情况，获得稳定表达Cre基因的猪巨噬细胞系。
结果：得到稳定表达Cre的猪骨髓细胞株共3株，分别命名为IPBM27w7-Cre-1、IPBM27w7-Cre-2和IPBM27w7-Cre-3；如图5所示，经Western blot检测，这3株细胞均能表达38kDa左右的外源蛋白，表明这3株细胞均能有效表达Cre蛋白。
注：实施例中IPBM27w7-Cre-1为永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre，CCTCC NO:C2023176。
实施例3利用表达Cre蛋白去除伪狂犬病毒基因缺失重组病毒中的筛选标记
3.1构建猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组病毒
本专利使用的猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组毒JSY7△gE-LoxP-RFP是JSY7毒株(JSY7基因组序列GeneBank登录号为MT150583.1)缺失部分gE编码基因(序列号MT150583.1的核苷酸序列的第124465～125483位)，并且携带筛选标记基因——红色荧光基因TurboRFP，两端分别带有同向LoxP位点DNA序列：ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。本发明中采用常规构建病毒基因缺失重组毒的方法构建gE基因缺失重组病毒，例如专利文献CN114657151A、CN113249341A或CN104830810A公开的方法。
3.2去除基因缺失重组病毒中的筛选标记基因
1)接种细胞：将实施例2中获得的表达Cre基因的猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre-1接种于6孔板，每孔106个细胞，37℃，5％CO2培养过夜；
2)接种病毒：将步骤3.1中构建的猪伪狂犬病毒gE基因缺失重组毒JSY7△gE-LoxP-RFP接种于6孔板中，感染量为MOI＝0.1；
3)收集病毒液：每天观察接种病毒后细胞孔内红色荧光及细胞病变情况，直至孔内80％以上细胞病变明显甚至死亡脱落，收集病毒培养物，分为两份，一份反复冻融3次，10000rpm，离心5分钟，收集上清，保存于-80℃备用；另一份收集细胞，提取基因组。
4)接种细胞：同步骤1)接种IPBM27w7-Cre-1细胞于6孔板，每孔106个细胞，37℃，5％CO2培养过夜；
5)接种病毒：将步骤3)收集的病毒液，以100微升/孔接种到6孔板细胞。
6)观察荧光：连续观察三天接种病毒细胞孔内红色荧光及病变情况。
实验结果见图6，图6A的“P1”是步骤3)中，IPBM27w7-Cre-1细胞第一次感染gE基因缺失重组毒JSY7ΔgE-LoxP-RFP，三天后仍可见少量红色荧光细胞，收集第一代病毒液，以同样的方法再次感染IPBM27w7-Cre-1，如图6A中“P2”所示，未见表达红色荧光的细胞。同时，如图6A所示，亲本细胞IPBM 27w7感染野生毒JSY7不表达荧光蛋白，而反复感染JSY7△gE-LoxP-RFP仍可见红色荧光。在gE基因两侧设计引物(前引：5’-CCGGGAAGATAGCCATGGTG-3’；后引：5’-CGTCACCGTCGTAGTAGTCCTCG-3’)，进行PCR扩增，核酸电泳结果如图6B所示，亲本细胞IPBM 27w7感染野生毒JSY7的基因组样品可扩增出1834bp的条带，与预期符合；亲本细胞IPBM 27w7感染JSY7△gE-LoxP-RFP的基因组样品可扩增出3339bp的条带，与预期符合；IPBM14w3-Cre-1细胞系第一次感染JSY7△gE-LoxP-RFP的基因组样品仅扩增出1074bp的条带，与预期符合，说明Cre/LoxP重组酶系统功能完整，细胞系内的Cre蛋白成功去除gE缺失重组毒中的筛选标记——红色荧光蛋白基因。因此，稳定表达Cre基因的细胞系IPBM27w7-Cre-1仅需单次感染缺失重组毒，即可成功去除筛选标记基因。
对比例1不同永生化基因组合对原代猪骨髓巨噬细胞的永生化效果
为了选择合适的永生化基因对原代猪骨髓巨噬细胞进行永生化，采用实施例1中1.2猪骨髓巨噬细胞的电穿孔方法，对原代猪巨噬细胞进行相同条件的电穿孔后，进行常规持续传代，结果如表1所示。对健康的原代猪骨髓巨噬细胞进行常规传代，传代次数往往小于3次。进行大量重复实验后，总结经验：引入永生化基因后传代超过6次的存活细胞可能具备部分永生化的潜质。原代猪骨髓巨噬细胞难以自发永生化，经过大量实验发现，猪源三基因组合(TERT+CDK4(R24C)+CyclinD)不仅具有与癌基因SV40LT相当的永生化效果，而且这三基因组合具有非病毒癌基因的显著优势。
表1原代猪骨髓巨噬细胞电穿孔不同永生化基因组合后的传代情况
对比例2对比三种常见转染方式在猪巨噬细胞上的转染效率
在细胞内引入外源核酸的常用转染方法包括化学转染、病毒转染和电穿孔。在原代猪骨髓巨噬细胞BMDM和永生化猪骨髓细胞系IPBM 27w7上采用分别转染荧光质粒pEGFP-C1来对比转染效率。选取商品化的常规化学转染试剂lipofectamine2000(Invitrogen公司)、Mirus TransIT-X2(Mirus公司)和针对巨噬细胞的转染试剂jetPEI macrophag(PolyPlus公司)，根据说明书的使用操作，在BMDM上转染pEGFP-C1，24小时后，如图7A所示，在荧光显微镜的FITC通道下几乎看不到表达绿色荧光蛋白的细胞。以相同方法，在IPBM27w7转染pEGFP-C1，可见零星细胞表达绿色荧光蛋白(见图7B)。在显微镜的明场下观察，BMDM和IPBM经过化学转染后细胞状态变差，说明化学转染试剂对猪骨髓巨噬细胞具有毒性，在BMDM上尤为明显(见图7A和图7B)。使用表达绿色荧光的慢病毒以30MOI的剂量接种BMDM，5天后，如图7C所示，虽然慢病毒感染对细胞状态影响较小，但不仅操作过程繁琐，并且仅见少量细胞表达绿色荧光蛋白。在BMDM和IPBM 27w7上按照实施例1中1.2的操作方法进行电穿孔质粒pEGFP-C1。如图7D所示，电穿孔的方法在BMDM和IPBM 27w7上均具有明显高水平的转染效率，并且对细胞状态的影响较小。
对比例3对比瞬时转染和稳定表达Cre蛋白系的方法去除基因缺失重组病毒筛选标记的效率为了比较常规瞬时转染表达Cre的方法和本发明所提供的IPBM27w7-Cre-1细胞系去除基因缺失重组病毒中筛选标记基因的效率。按照实施例1中1.2所述的电穿孔方法，在亲本细胞系IPBM 27w7电穿孔Cre的真核表达载体pcDNA3-Cre，24小时后接种gE基因缺失重组毒株JSY7ΔgE-LoxP-RFP，48小时后，提取细胞基因组，按照实施例3中提及的PCR扩增方法进行检测，核酸电泳的结果如图8所示，IPBM27w7-Cre-1细胞系感染JSY7ΔgE-LoxP-RFP的样品，仅能扩增出一条1074bp的条带；而IPBM 27w7电穿孔pcDNA3-Cre后感染JSY7ΔgE-LoxP-RFP的样品，仍可扩增出两条条带3339bp和1074bp。因此，IPBM27w7-Cre-1细胞系不仅可高效的去除基因缺失重组病毒筛选标记，并且操作简单，规避了重复病毒纯化的步骤。
综上所述，本发明提供的方法构建得到永生化猪骨髓巨噬细胞无病毒癌基因、无病毒载体基因、无筛选标签、细胞传代稳定，高水平表达巨噬细胞特异性表面分子，是一株成熟的猪巨噬细胞系。并能够利用其构建稳定表达的细胞系，例如表达Cre基因的猪骨髓巨噬细胞系，可高效去除基因缺失重组毒中的筛选标记，为基因缺失疫苗的构建提供了便利。
以上所述为本发明的优选实施例，应当指出，对于本领域的技术人员来说，依然可对前述各实施例所记述的技术方案进行修改或者同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的修改和替换，均应包含也应视为本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种永生化猪骨髓巨噬细胞，其特征在于，所述的永生化猪骨髓巨噬细胞株为：
永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2023177；
或永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre，于2023年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学，CCTCC NO:C2023176。
2.一种构建权利要求1所述的永生化猪骨髓巨噬细胞的方法，包括以下步骤：
(1)取猪的股骨和胫骨，分离骨髓细胞，在体外诱导培养成巨噬细胞后，消化收集；
(2)将含有pTERT、pCDK4(R24C)和pCCND1基因的转座子载体和转座酶载体，以电穿孔的方式引入原代猪骨髓巨噬细胞；
所述pTERT转座子载体包括如GenBank登录号为NM_001244300.2中“TERT”基因的CDS区所示的核苷酸序列；
所述pCDK4(R24C)转座子载体包括如GenBank登录号为NM_001123097.1中“CDK4”基因的CDS区的核苷酸序列，此外，将第24位氨基酸从精氨酸(R)突变为半胱氨酸(C)；
所述pCCND1转座子载体子载体包括如GenBank登录号为XM_021082686.1中“CCND1”基因的CDS区的核苷酸序列；
(3)存活的细胞进行有限稀释法筛选单克隆细胞株，连续传代培养，得到永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7；
(4)将步骤(3)获得永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7引入Cre基因，获得永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中将含有Cre基因的转座子载体和转座酶载体，以电穿孔的方式引入永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM 27w7；所述Cre基因的转座子载体包括GenBank登录号为NC_005856.1中“Cre”基因的CDS区所示的核苷酸序列；电穿孔后，经过G418选择性培养基筛选阳性克隆细胞株，得到稳定表达Cre的永生化猪骨髓巨噬细胞IPBM27w7-Cre。
4.根据权利要求1所述一种永生化猪骨髓巨噬细胞在分离培养病毒和制备疫苗中的应用。
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