CN113025660A - 一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。本申请的试剂盒，包括细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系；细胞体外预激活培养体系中含有浓度100‑300ng/mL的SCF、100‑300ng/mL的Flt3L、10‑500ng/mL的TPO和25‑100ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有dmPGE2和Ploxamer407。本申请试剂盒，通过对细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系进行优化，能稳定高效进行慢病毒感染人造血干细胞，提高病毒感染效率，降低病毒用量，降低生产成本，减轻细胞治疗产品使用者经济负担，为慢病毒体外转染人造血干细胞推广应用奠定了基础。

Description

一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法
技术领域
本申请涉及造血干细胞移植领域，特别是涉及一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。
背景技术
异体造血干细胞移植是治疗血液病，尤其是血液癌的一种有效的方法，然而，由于HLA配型率极低等原因，患者往往无法得到及时治疗。
临床研究数据显示，体外转基因改造后的自体造血干细胞重新回输到患者体内后，能有效发挥正常功能，治愈率极高。该技术成为一种新的有效的治疗方式，有效解决了异体造血干细胞移植存在的HLA配型率低，免疫排斥，移植物抗宿主等问题。
目前，体外转基因改造自体造血干细胞技术，即重组的慢病毒体外转染人造血干细胞，主要包括以下几个方面：(1)患者自体造血干细胞动员；(2)动员造血干细胞的体外预激活培养处理；(3)构建携带正常基因的慢病毒转染预激活后的人造血干细胞；(4)将转染后的造血干细胞回输到患者体内。
虽然该技术治疗效果较好，但是仍然存在一些不足：(1)目前，造血干细胞的体外预激活培养体系差异大，尚未有一种比较统一稳定的培养体系；(2)慢病毒感染造血干细胞的效率低。针对以上存在的问题，现有的措施是：(1)在造血干细胞的体外预激活培养时，使用GMP级别来源的基础培养基，例如Stemspan-ACF、X-VIVO、SCGM等，并向基础培养基中添加预激活因子SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL6等替代研究级别的产品；但是，所用预激活因子的浓度较高，增加了生产成本，培养效果参差不齐。(2)在慢病毒感染人造血干细胞时，通过添加药用级别的促慢病毒感染辅剂到人造血干细胞中促进转染效率，例如PGE2、Poloxamer407、Protamine、UM171、Retronectin等；但是，现有的方案，尽管添加促慢病毒感染辅剂，其转染效率仍然偏低，难以满足使用需求。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。
本申请具体采用了以下技术方案：
本申请的第一方面公开了一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒，包括用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，和用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系；其中，细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100-300ng/mL的SCF、100-300ng/mL的Flt3L、10-500ng/mL的TPO和25-100ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有dmPGE2和Ploxamer407。
需要说明的是，本申请的试剂盒通过对预激活因子的组合跟浓度进行优化，可以在不改变细胞质量的前提下，采用更低浓度剂量的预激活因子组合，有效的降低慢病毒体外转染人造血干细胞的成本；并且，通过对促病毒感染试剂的组合进行优化，提高慢病毒对预激活后的人造血干细胞的感染效率，降低病毒用量，从而降低整体成本，提高生产效益。
优选的，细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3L、100ng/mL的TPO和25ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有浓度为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407。
需要说明的是，本申请试剂盒的细胞体外预激活培养体系中，各组分的具体浓度是本申请的一种实现方式中经过验证的，一组预激活因子浓度相对低，但是细胞质量最好的组合。同样的，慢病毒感染培养体系中，各组分的具体浓度也是本申请的一种实现方式中经过验证的，效果最好的组合。可以理解，在本申请限定的浓度下，进行正负10％左右的调整，同样可以达到本申请相似的优势和效果；而对于试验要求相对较低的情况下，可以对本申请的浓度进行正负20％甚至更大范围的调整，相应的本申请的优势和效果也相对减弱。
优选的，细胞体外预激活培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
优选的，慢病毒感染培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
需要说明的是，本申请的关键在于预激活因子和促病毒感染试剂的组合跟浓度的优化，至于慢病毒体外转染人造血干细胞使用的基础培养基和培养参数条件，可以参考现有的技术和工艺。本申请的一种实现方式中优选采用SCGM培养基作为细胞体外预激活培养体系的基础培养基。
还需要说明的是，本申请的试剂盒关键在于细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系的改进，可以理解，这两个培养体系可以组合到一个试剂盒中，也可以单独售卖。
因此，本申请的第二方面公开了一种用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，其中，含有浓度为100-300ng/mL的SCF、100-300ng/mL的Flt3L、10-500ng/mL的TPO和25-100ng/mL的IL3。
优选的，SCF的浓度为100ng/mL，Flt3L的浓度为100ng/mL，TPO的浓度为100ng/mL，IL3的浓度为25ng/mL。
需要说明的是，本申请研究发现SCF、Flt3L、TPO和IL3四者组合使用的造血干细胞体外预激活培养效果较好；其中，SCF的有效浓度为100-300ng/mL，Flt3L的有效浓度为100-300ng/mL，TPO的有效浓度为10-500ng/mL，IL3的有效浓度为25-100ng/mL。特别是，SCF的浓度为100ng/mL、Flt3L的浓度为100ng/mL、TPO的浓度为100ng/mL和IL3的浓度为25ng/mL四者的组合使用效果最佳。
优选的，细胞体外预激活培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
本申请的第三方面公开了一种用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系，其中，含有dmPGE2和Ploxamer407。
优选的，dmPGE2的浓度为10μmol/L，Ploxamer407的浓度为100μg/mL。
需要说明的是，本申请研究发现dmPGE2和Ploxamer407组合使用能够提高转染效率，尤其是dmPGE2的浓度为10μmol/L和Ploxamer407的浓度为100μg/mL的组合使用效果最佳。
优选的，慢病毒感染培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
本申请的第四方面公开了一种慢病毒体外转染人造血干细胞的方法，包括采用本申请的试剂盒进行动员造血干细胞体外预激活培养处理和慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤。
优选的，本申请的方法中，在慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤，还包括，通过离心的方式提高慢病毒感染造血干细胞的效率，即在将慢病毒与人造血干细胞混匀后，离心处理，然后再进行感染培养。
优选的，本申请的方法中，离心处理的条件为400-1000g离心0.5-2h。
优选的，离心处理的条件为800g离心30mim。
需要说明的是，虽然本申请可以通过离心处理提高感染效率，但是，理论上离心速度越高，时间越长，对细胞的伤害越大；因此，综合考虑感染效率和可能存在的对细胞的伤害，本申请限定离心处理的条件为400-1000g离心0.5-2h，优选为800g离心30mim。
本申请的有益效果在于：
本申请的慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒，通过对细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系进行改进和优化，能够稳定高效的进行慢病毒感染人造血干细胞，提高病毒感染效率，降低病毒用量，降低生产成本，从而减轻慢病毒体外转染人造血干细胞使用者的经济负担，为慢病毒体外转染人造血干细胞的推广应用奠定了基础。
附图说明
图1是本申请实施例中添加不同预激活因子工作浓度的细胞体外预激活培养体系培养的CD34阳性率的流式分析结果图；
图2是本申请实施例中添加不同促病毒感染试剂的人造血干细胞染病毒后的病毒插入拷贝数检测结果图；
图3是本申请实施例中GFP慢病毒载体结合促病毒感染试剂后，离心处理或不离心处理，两种试验下的感染造血干细胞荧光表达情况的结果图；
图4是本申请实施例中GFP慢病毒载体结合促病毒感染试剂后，离心处理或不离心处理，两种试验下的感染造血干细胞流式鉴定阳性率的结果图；
图5是本申请实施例中GFP慢病毒载体结合促病毒感染试剂后，离心处理或不离心处理，两种试验下感染造血干细胞的病毒插入拷贝数检测结果图。
具体实施方式
目前，采用体外转基因改造自体造血干细胞技术，已开发并被报道应用于临床的慢病毒载体，例如BB305病毒，可能由于病毒构造原因，生产工艺复杂、成本高，最终产品售价高达180万美元。本申请发明人分析认为，造成细胞治疗产品价格昂贵的原因，主要是产品生产过程中涉及的各个环节成本高；例如，在造血干细胞的体外预激活培养时，大量使用高浓度的预激活因子，或者，在慢病毒感染人造血干细胞时，由于感染效率低，需要大量使用慢病毒；这些因素都会导致最终产品的价格昂贵。
基于以上分析和认识，本申请针对其中关键环节进行优化，主要从造血干细胞预激活因子浓度，辅剂组合和离心促慢病毒感染造血干细胞两方面进行优化。从而获得一套稳定高效的慢病毒感染人造血干细胞效率的方法和试剂盒体系，即本申请的慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒和方法。本申请的一种实现方式中试剂盒包括用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，和用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系；细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3L、100ng/mL的TPO和25ng/mL的IL3，慢病毒感染培养体系中含有浓度为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407。
本申请的试剂盒，在不改变细胞质量的前提下，优化获得了低浓度剂量的预激活因子组合，预激活培养因子浓度降低到目前的约30％；并通过大量试验研究摸索，获得高效慢病毒感染造血干细胞的促感染辅剂组合型，本申请的促感染效率高于其他组合至少20％。采用本申请的试剂盒，一方面可以降低使用材料的生产成本，另一方面，可以提高感染率，降低慢病毒的用量，从而降低成本，减轻患者经济负担。
本申请的慢病毒体外转染人造血干细胞的方法，不仅使用本申请的试剂盒，而且，进一步的改进方案中，通过离心方式提高慢病毒感染造血干细胞的效率，本申请优化的离心条件为800g离心30mim。其中，通过离心的方式，具体的，即在慢病毒转染人造血干细胞时，将慢病毒与人造血干细胞混合均匀后，在离心条件下，一边进行离心，一边进行转染。通过离心方式，本申请提高了约80％慢病毒感染效率，整体上提高产品效率，降低生产成本，进一步减轻患者的经济负担。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例以体外自主构建携带GFP基因的慢病毒转染脐带血造血干细胞为例，通过体外预激活与感染后正常培养五天，利用流式细胞技术(FACS)鉴定造血干细胞GFP表达情况，和PCR技术检测病毒插入拷贝数(VCN)来鉴定系统有效性。具体如下：
一、试验方法
1.脐带血单核细胞富集分离
1)新鲜采集的新生儿脐带血20mL，放置4℃保温箱保存，并运输到细胞间；
2)取出保温箱中样品，血袋表面喷洒75％酒精擦拭消毒灭菌，转移到超净台内；
3)超净工作台内，用剪刀剪开采血袋出口，转移采血袋内20mL脐带血到50mL离心管；
4)沿离心管内壁缓缓加入等体积DPBS，拧紧盖子，轻轻上下颠倒几次混匀稀释，室温静置10min；
5)在新的50mL离心管内加入20mL密度梯度分离液(LymphoprepTM，STEMCELL)；
6)30°倾斜放置装有梯度分离液的50mL离心管，用巴氏吸管或电动移液枪吸取步骤4)稀释后的血液样品，沿着离心管内壁、分离液上方缓慢加入等体积的步骤4)稀释后的血液样品，加入血液样品的速度缓慢匀速，避免过快使血液样品与分离液发生混合；
7)样品加好后，放在50mL离心架上，平稳转移到水平转子离心机上，调好离心参数，500g离心20min，升速为3，降速为0；
8)离心后，轻轻转移样品到离心管架上，在超净台内，用巴士吸管小心吸取血浆与淋巴分离液间的白膜层细胞到新的50mL离心管中；吸取时巴士吸管管口尽可能放在白膜层上方与血清分界处，小心避免吸到下层的密度梯度分离液和上层血清；
9)根据获取的白膜层细胞的体积，加入5倍白膜层样品体积的DPBS，上下颠倒充分混匀，300g离心10min；
10)离心后，小心弃掉上清液；
11)加入15mL的DPBS重悬沉淀，混匀，转移到新的50mL离心管中，300g离心10min；
12)离心后，小心弃掉上清液，即获得脐带血单核细胞。
2.脐带血CD34+造血干细胞分离纯化
本例采用Stemcell Technologies试剂盒进行脐带血CD34+造血干细胞分离纯化，详细如下：
1)加入0.5mL的DPBS重悬单核细胞沉淀，转移到5mL圆底离心管中；
2)按照100μL/mL比例添加EasySep CD34+分离试剂，吹打混匀，室温孵育10min；
3)剧烈振荡RapidSpheres 30s，吹打混匀；
4)按照50μL/mL比例添加RapidSpheres到样品中，混匀，室温孵育1min；
5)加入1.5mL的DPBS，轻轻吹打混匀；
6)把离心管放入磁力架中，室温孵育3min；
7)拿起磁力架倒掉上清液，从磁力架上取下离心管，重复3次5)和6)步骤；
8)取下离心管，加入3mL的DPBS吹打混匀，将重悬液平均分为三份，分别转移到15mL离心管中，300g离心10min，去除上清液，保留沉淀备用；
3.动员造血干细胞体外预激活培养处理
本例用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，采用SCGM培养基作为基础培养基，在此基础上，本例分别试验了在培养基中添加不同工作浓度预激活因子对细胞培养的影响，不同组合的预激活因子浓度如表1所示。
表1不同组合的预激活因子的工作浓度
预激活因子 SCF(ng/mL) TPO(ng/mL) Flt-3L(ng/mL) IL3(ng/ml)
组合1 100 100 100 25
组合2 300 10 300 75
组合3 300 100 300 75
表1中，预激活因子的工作浓度是指，预激活因子在细胞体外预激活培养体系中的浓度。本例按照表1的组合分别配置了含不同预激活因子浓度的细胞体外预激活培养体系，分别标记为体系1、体系2、体系3。动员造血干细胞体外预激活培养处理，详细如下：
1)将体系1、体系2、体系3分别加入“2.脐带血CD34+造血干细胞分离纯化”的步骤8)的细胞沉淀中，即纯化后的CD34+细胞中，重悬混匀；
2)细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/mL；
3)37℃，5％CO2的培养箱孵育培养五天，期间，每两天换液一次，培养到第五天时，细胞进行CD34抗体免疫染色，采用流式鉴定CD34阳性率，筛选阳性率最高的体系作为最优的细胞体外预激活培养体系。
4.GFP慢病毒载体构建
本例使用目的表达基因为EF1a-GFP，具体基因序列为SEQ ID NO.1所示序列，本例使用的慢病毒骨架载体为pCDH。选择pCDH载体多克隆位点的一对限制性内切酶将载体线性化，本例具体采用的是SnaBI和SalI，然后根据线性化载体末端序列设计Gibson组装引物扩增EF1a-GFP编码区片段，具体引物序列，Gibson正向引物为SEQ ID NO.2所示序列，Gibson反向引物为SEQ ID NO.3所示序列。
其中EF1a-GFP序列是由北京六合华大基因科技有限公司进行全基因合成并构建到pMV载体上。以EF1a-GFP为模板，使用SEQ ID NO.2和3所示序列的Gibson组装引物扩增出EF1a-GFP并回收，取0.2pmol的EF1a-GFP基因片段以及0.05pmol的线性化的pCDH载体混合并使用去离子水将总体积补至10μL，加入10μL的2×Gibson assemblymastermix(NEB，E2611L)混匀。将组装反应液置于50℃条件下反应1小时，然后立即置于冰上冷却。使用Stbl3感受态细胞进行热激转化，在氨苄青霉素抗性的固体LB平板上37℃培养16小时，挑单克隆测序鉴定。
EF1a-GFP序列SEQ ID NO.1：
5’-AGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTGATCCCTGTGACCGGCGCCTACGCTGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA-3’
EF1a-GFP Gibson正向引物SEQ ID NO.2：
5’-CTACTTGGCAGTACATCTACGTAAGTGGGAATTGGCTCCGGT-3’
EF1a-GFP Gibson反向引物SEQ ID NO.3：
5’-TGTAATCCAGAGGTTGATTGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’
5.GFP慢病毒包装
本例的重组慢病毒载体可以与三代慢病毒包装质粒系统(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)共转染293T细胞。具体操作如下：
将4×105数量的293T细胞接种到DMEM高糖完全培养基的10cm细胞培养皿中，37℃、5％CO2培养24h至细胞密度达到70-80％。其中，DMEM高糖完全培养基中包含10％FBS、1％双抗、1％GlutaMAX、1％MEM NEAA。
取12μg重组慢病毒载体，7.8μg psPAX2和4.2μg pMD2.G质粒使用Lipofectamine3000Transfection Reagent(Invitrogen，L3000001)转染293T细胞，培养24小时后收集细胞培养上清液，使用0.45μm膜过滤，向50mL滤液中加入全能核酸酶(Benzonase)5μL，37℃消化2h，将消化后的病毒上清液转移至超速离心管中，30000g离心2h，倒去上清，使用SCGM培养基500μL重悬病毒，按照50μL一管分装，置于-80℃长期保存。
6.慢病毒滴度鉴定
将293T细胞消化吹打形成单细胞悬液，进行细胞计数后，使用DMEM(10％FBS)培养基稀释成1×105cells/mL悬液，并加入终浓度为6μg/mL的polybrene(HexadimethrineBromide)，充分混匀按照1mL/孔加入12孔板中。取12μL病毒液按照五倍梯度做三个稀释度，c)按照10μL/孔加入到铺好细胞的12孔板中，每种稀释度做两个重复孔，阴性对照孔加入10μL DMEM培养基。将混合均匀的孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。消化收集细胞使用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304-03)提取细胞基因组，定量后将基因组浓度稀释到40ng/μL。标准品质粒稀释成1×109拷贝/mL的标准液。依次进行十倍稀释，制备108-104拷贝/mL的稀释液。按照10μL反应体系加入2pmol荧光探针和引物混合物和4μL样品比例制备荧光定量反应液，分装到96孔荧光定量PCR板中，使用StepOnePlus Real-Time PCRSystem探针法标准程序进行荧光定量PCR反应。根据标准曲线，计算各个样品ApoB和Gag基因的拷贝数，通过Gag拷贝数/ApoB拷贝数计算VCN。按照以下公式计算病毒滴度：
Titer(TU/mL)＝(10^5(细胞数量)×VCN(平均每个细胞Gag基因拷贝数))/(病毒液体积(mL))
病毒滴度需达到1×108TU/mL以上
其中，荧光探针和引物混合物包括检测ApoB基因的特异性引物和探针，以及检测Gag基因的特异性引物和探针。ApoB基因的特异性引物的正向因为为SEQ ID NO.4所示序列，反向引物为SEQ ID NO.5所示序列，探针为SEQ ID NO.6所示序列，探针的5’端具有VIC荧光基团修饰，3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。Gag基因的特异性引物的正向因为为SEQ IDNO.7所示序列，反向引物为SEQ ID NO.8所示序列，探针为SEQ ID NO.9所示序列，探针的5’端具有FAM荧光基团修饰，3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。
SEQ ID NO.4：5’-TGAAGGTGGAGGACATTCCTCTA-3’
SEQ ID NO.5：5’-CTGGAATTGCGATTTCTGGTAA-3’
SEQ ID NO.6：5’-CGAGAATCACCCTGCCAGACTTCCGT-3’
SEQ ID NO.7：5’-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3’
SEQ ID NO.8：5’-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3’
SEQ ID NO.9：5’-ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG-3’
7.脐带血造血干细胞慢病毒感染
本例采用“3.动员造血干细胞体外预激活培养处理”获得的最优的细胞体外预激活培养体系培养的造血干细胞进行试验。具体如下：
1)收集利用上述筛选获得的最优预激活培养体系体外培养预激活的造血干细胞到15mL离心管，300g离心5min；
2)弃上清，加入2mL的DPBS重悬，300g离心5min；
3)加入预热好的通过筛选获得的最优的细胞体外预激活培养体系重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106个/mL；
4)轻轻吹打混匀解冻后的携带GPF的慢病毒浓缩液，其病毒滴度为7×108TU/mL，加入7μL浓缩病毒液到100μL细胞重悬液中，轻轻混匀后，本例分别进行了离心处理和不离心处理的试验，然后在采用相同的条件下进行培养，具体如下：
a)不离心处理：加入7μL浓缩病毒液到100μL细胞重悬液中，同时，按照表2加入不同单独或组合的辅剂，轻轻吹打混匀，将细胞转移接种到96孔板中，37℃，5％CO2培养箱中感染24h；
表2单独或不同组合的促感染辅剂的工作浓度
辅剂 浓储液(100×) 工作浓度 加入体积(μL)
protamine 800μg/mL 8μg/mL 1
UM171 3.5μM 35nM 1
dmPGE2 1mM 10μM 1
poloxamer407 10mg/mL 100μg/mL 1
表2中，浓储液指辅剂预先配制好的储存浓度，工作浓度是指促病毒感染时使用的辅剂浓度，加入体积指加入到感染培养体系中的浓储液体积；本例分别试验了各辅剂单独加入到感染培养体系，以及两两任意组合加入到感染培养体系。
b)离心处理：加入7μL浓缩病毒液到100μL细胞重悬液中，同时，加入a)筛选出来的最佳组合辅剂dmPGE2+poloxamer407到100μL细胞重悬液，轻轻吹打混匀，将细胞转移接种到96孔板中，800g离心30min，然后，37℃，5％CO2培养箱中感染24h；
5)感染24h后，轻轻吹打细胞培养基，重悬细胞，转移到含有2mL DPBS的15mL离心管；
6)300g离心5min；
7)弃上清，加入3mL的DPBS重悬细胞，细胞计数，300g离心5min；
8)弃上清，加入1mL预激活培养基重悬细胞；
9)携带GFP基因的慢病毒感染的造血干细胞继续体外培养，每两天换液一次，每次添加1mL培养基培养；
10)培养第五天后，细胞收集到15mL离心管中，300g离心5min；
11)弃上清，加入4mL DPBS重悬细胞，平分到两管新15mL离心管中，300g离心5min；
12)弃上清，分别进行流式鉴定细胞GFP蛋白表达情况与PCR鉴定细胞病毒插入拷贝数(VCN)，详细如下：
a)流式细胞术鉴定GFP表达情况
1mL DPBS重悬细胞沉淀，40μm滤网过滤后，收集转移到流式管中，流式细胞仪鉴定表达GFP蛋白阳性细胞情况；
b)细胞病毒插入拷贝数(VCN)值鉴定
提取细胞基因组DNA(TIANGEN，DP304-03)，定量后将基因组浓度稀释到40ng/μL。标准品质粒稀释成1×109拷贝/mL的标准液。依次进行十倍稀释，制备108-104拷贝/mL的稀释液。按照10μL反应体系加入2pmol荧光探针和引物混合物(即SEQ ID NO.4至9所示序列的引物和探针)和4μL样品比例制备荧光定量反应液，分装到96孔荧光定量PCR板中，使用StepOnePlus Real-Time PCR System探针法标准程序进行荧光定量PCR反应。根据标准曲线，计算各个样品ApoB和Gag基因的拷贝数，通过Gag拷贝数/ApoB拷贝数计算VCN。
二、试验结果
1.预激活因子工作浓度试验结果
采用流式分析“3.动员造血干细胞体外预激活培养处理”中分别采用体系1、体系2、体系3进行预激活培养后的CD34阳性率，结果如图1所示。图1中，A图为体系1培养后的流式分析结果图，B图为体系2培养后的流式分析结果图，C图为体系3培养后的流式分析结果图。图1的结果显示，体系1、体系2、体系3培养的造血干细胞CD34阳性率分别为92.21％，90.50％，90.66％。可见，组合1的CD34+阳性率最高，并且，组合1使用的预激活因子浓度SCF、Flt-3L和IL3都是其他两种组合的1/3，说明组合1可以在较低预激活因子浓度下维持造血干细胞的活性。因此，本例选定组合1的体系作为最优的细胞体外预激活培养体系。
2.小分子辅剂组合和离心处理的试验结果
根据造血干细胞感染GFP病毒后的病毒插入拷贝数(VCN)以及病毒表达荧光的强度，我们对不同小分子辅剂以及离心对转染效率的影响进行了分析。结果如图2至图5所示。图2是不同小分子辅剂单独或组合后GFP病毒插入拷贝数鉴定结果，图2的纵坐标为PCR检测获得的VCN值，横坐标由左至右依序为control、protamine、UM171、dmPGE2、poloxamer407、protamine+UM171、protamine+dmPGE2、protamine+poloxamer407、UM171+dmPGE2、UM171+poloxamer407、dmPGE2+poloxamer407的试验结果，其中control是指体外只添加GFP病毒感染的造血干细胞。图2的结果显示，dmPGE2+poloxamer407小分子组合的助转染效果最好，VCN值约为3.0，其余的促病毒感染辅剂单独使用或组合使用的VCN值约为1.2-2.2，虽然相对于control对照组约为0.5的VCN值而言明显效果较佳，但都比dmPGE2+poloxamer407的组合差。
图3为GFP慢病毒载体结合dmPGE2+poloxamer407辅剂组合，离心处理或不离心处理，在感染造血干细胞24h后，体外继续培养五天，在显微镜下观察GFP荧光蛋白表达情况的结果图，图中，control是指不离心处理的检测结果图，centrifuge是离心处理的检测结果图。图3的结果显示，明显离心处理能够观察到更多的GFP荧光蛋白表达，说明离心处理能够提高感染效率。
图4为GFP慢病毒载体结合dmPGE2+poloxamer407辅剂组合，离心处理或不离心处理，在感染造血干细胞24h后，体外继续培养五天，流式鉴定表达GFP荧光蛋白细胞的阳性率的结果图，图中，FACS表示流式细胞技术，纵坐标是GFP阳性率，control是指不离心处理的检测结果图，centrifuge是离心处理的检测结果图。图4的结果显示，不离心处理的阳性率约为19.4％，离心处理检测的阳性率约为34.1％；感染效率提高约(34.1-19.4)/19.4＝75.8％。
图5为GFP慢病毒载体结合dmPGE2+poloxamer407辅剂组合，离心处理或不离心处理，感染造血干细胞VCN鉴定结果，图中，纵坐标为VCN值，横坐标control是指不离心处理的检测结果，centrifuge是离心处理的检测结果。图5的结果显示，离心处理的VCN值明显高于不离心处理。
图3至图5的结果显示，在添加促病毒感染试剂的条件下，使用离心处理，即800g离心30min，可以提高约75.8％的转染效率。因此，本例确定了最优的转染辅剂组合为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407，并进一步确定，可以通过离心方式提高慢病毒感染造血干细胞的效率。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法
<130> 19I29051
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1952
<212> DNA
<213> EF1a-GFP基因序列
<400> 1
agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60
gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120
ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180
tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240
ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300
gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360
aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420
tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480
tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540
ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600
ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660
gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720
tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780
gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840
aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900
ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960
gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020
ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080
cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140
gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaattgatcc 1200
ctgtgaccgg cgcctacgct ggatccgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 1260
ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 1320
tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatttgca 1380
ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 1440
agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 1500
ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 1560
gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 1620
acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 1680
acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 1740
acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 1800
gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 1860
aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 1920
tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aa 1952
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctacttggca gtacatctac gtaagtggga attggctccg gt 42
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaatccag aggttgattg tcgacttact tgtacagctc gtccatgccg a 51
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaaggtgga ggacattcct cta 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggaattgc gatttctggt aa 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagaatcac cctgccagac ttccgt 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggttgtagct gtcccagtat ttgtc 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggagctagaa cgattcgcag tta 23
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acagccttct gatgtttcta acaggccagg 30

Claims (10)

1.一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒，其特征在于：包括用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，和用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系；
所述细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100-300ng/mL的SCF、100-300ng/mL的Flt3L、10-500ng/mL的TPO和25-100ng/mL的IL3；
所述慢病毒感染培养体系中含有dmPGE2和Ploxamer407。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3L、100ng/mL的TPO和25ng/mL的IL3；
所述慢病毒感染培养体系中含有浓度为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞体外预激活培养体系的基础培养基为SCGM培养基；
优选的，所述慢病毒感染培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
4.一种用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，其特征在于：含有浓度为100-300ng/mL的SCF、100-300ng/mL的Flt3L、10-500ng/mL的TPO和25-100ng/mL的IL3。
5.根据权利要求4所述的细胞体外预激活培养体系，其特征在于：含有浓度为100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3L、100ng/mL的TPO和25ng/mL的IL3；
优选的，所述细胞体外预激活培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
6.一种用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系，其特征在于：含有dmPGE2和Ploxamer407。
7.根据权利要求6所述的慢病毒感染培养体系，其特征在于：含有浓度为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407；
优选的，所述慢病毒感染培养体系的基础培养基为SCGM培养基。
8.一种慢病毒体外转染人造血干细胞的方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的试剂盒进行动员造血干细胞体外预激活培养处理和慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤，还包括，通过离心的方式提高慢病毒感染造血干细胞的效率，即在将慢病毒与人造血干细胞混匀后，离心处理，然后再进行感染培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述离心处理的条件为400-1000g离心0.5-2h；优选的，离心条件为800g离心30mim。
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