CN114921416B - 一种nk细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种NK细胞，所述NK细胞包含CD38敲除且过表达CD16a的多核苷酸。相比较于常规的NK细胞，本发明的NK细胞插入了CD16a过表达基因，同时又敲除了CD38基因，提高了对肿瘤细胞系的杀伤功能，同时又减弱了NK细胞之间的相互杀伤，提高细胞的存活率和生长速率，减少细胞内耗。

Description

一种NK细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种增强杀伤效果及降低细胞内耗的NK细胞及其制备方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫应答的重要淋巴细胞，其来源还不十分清楚，一般认为来源于骨髓，其发育成熟依赖于骨髓微环境，占外周血淋巴细胞总数的5％～20％，具有广谱抗肿瘤作用。NK细胞作为杀伤肿瘤的主要效应细胞具有杀瘤谱广，不需抗原刺激，也不需抗体参与，不受MHC限制，直接杀伤肿瘤的特点。
抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cell mediatedcytotoxicity，ADCC)作用是指具有杀伤活力的免疫细胞，通过细胞表面的FC受体和单克隆抗体结合，识别被单克隆抗体结合的靶抗原(如细菌或者肿瘤细胞)，直接杀伤靶细胞。研究发现，ADCC作用是单克隆抗体治疗肿瘤或其他疾病的重要机制和手段之一。其中，NK细胞是介导ADCC作用的主要细胞，比单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞介导的ADCC作用要强。
FcγRⅢa(CD16a)属于免疫球蛋白的超家族成员，为低亲和力的IgG受体，是一种表达于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞等免疫效应细胞表面的跨膜蛋白，是机体细胞免疫功能发挥作用的一个比较重要的结合位点。CD16a与人IgG1和IgG3的Fc段结合，诱导免疫效应细胞(主要是NK细胞)的细胞毒作用-即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞，也可直接介导NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤作用；还可促进IFN-γ、TNF和基质金属蛋白酶等细胞因子的分泌，影响细胞免疫功能发挥。以ADCC为作用基础的单克隆抗体介导分子靶向治疗在恶性肿瘤中应用越来越广泛，作为结合位点的CD16a越来越受到关注。
曾有人设想通过基因转移技术在NK细胞的表面过表达CD16a，以增加NK细胞的细胞毒作用-即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)或增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
然而，在实践过程中发现，过表达CD16a的NK细胞的存活率不够高，对于肿瘤细胞的杀伤力依然不够强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞，其可以提高对肿瘤细胞系的杀伤功能，同时又减弱了NK细胞之间的相互杀伤，提高NK细胞的存活率和生长速率，减少细胞内耗。
本发明的具体技术方案如下：
一种NK细胞，所述NK细胞包含CD38敲除且过表达CD16a的多核苷酸。
人类CD38抗原是一种Ⅱ型穿膜糖蛋白，在各种类型血液肿瘤细胞中表达，但也存在于NK细胞表面。本申请人在研究过表达CD16a的NK细胞的生存率和杀伤性能时，发现敲除掉CD38基因后，过表达CD16a的NK细胞的生存率和对肿瘤细胞的杀伤性能均有提升。由于NK细胞特殊的杀伤特点，NK细胞之间也会相互杀伤，理论推测是，敲除掉CD38基因后，降低了NK细胞之间的内耗，提高NK细胞的存活率和生长速率，同时也提高了对肿瘤细胞系的杀伤功能。
优选的，其中NK细胞是NK92MI细胞。NK92MI细胞相对于其他NK细胞而言，更易培养，且转染后的存活性高。
另一方面，本发明提供了一种NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建敲除CD38基因的CRISPR-Cas编辑系统；
(2)培养过表达CD16a的NK细胞；
(3)将步骤(1)的CRISPR-Cas编辑系统和转染试剂混合均匀，得到混合物；
(4)将步骤(3)的混合物加入到培养好的NK细胞中，孵育，继续培养；
(5)继续培养步骤(4)所得的细胞，取样，检测阴性率；
(6)筛选CD38阴性细胞。
优选的，其中步骤(3)的具体操作为：在第一EP管加入250μl的opti-MEM和7.5μl的lipofectamine 3000，轻轻混匀；在第二EP管中加入250μl的opti-MEM，步骤(1)的CRISPR-Cas编辑系统15～100μg以及10μl的P3000，轻轻混匀；室温静置5分钟后，将第二EP管加入到第一EP管中，轻轻混匀，孵育10～40分钟后，均分滴加到步骤(2)的NK细胞中。
优选的，其中步骤(2)中采用的培养基为第一细胞培养基，具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.005～0.6mM，叶酸0.00005～0.6mM，巯基乙醇0.0005～0.6mM，胎牛血清0～2vol％，马血清0～2vol％，双抗0～2vol％。
优选的，其中步骤(4)中继续培养采用的培养基为第二细胞培养基，具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.5～50mM，叶酸0.05～5mM，巯基乙醇0.05～5mM，胎牛血清8～50vol％，马血清8～50vol％，双抗0.5～5vol％。
优选的，其中步骤(5)中继续培养采用的培养基为第三细胞培养基，具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.05～5mM，叶酸0.005～0.5mM，巯基乙醇0.005～0.5mM，胎牛血清5～20vol％，马血清5～20vol％，双抗0.5～5vol％。
本发明在不同的转染和培养阶段，采用精细化配置的不同培养基对细胞进行更精细化的培养，而不是在不同的阶段均采用同一种培养基，可以高效地提高转染后NK细胞的存活率和转染稳定性。
优选的，其中制备过表达CD16a的NK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)构建具有CD16a的目标质粒和包装质粒的慢病毒转染体系；
(2)培养用于慢病毒的HEK 293T细胞，对所述HEK 293T细胞进行饥饿处理(HEK293T细胞为人胚肾细胞，可以商业化购买)；
(3)将减血清培养基或者无血清培养基平均分成两份，一份加入具有CD16a的目标质粒、第一包装质粒和第二包装质粒的慢病毒转染体系，混合均匀，得到质粒混合物；另一份加入聚乙烯亚胺，混合均匀，然后室温放置1～10min，得到转染试剂；
(4)将转染试剂逐滴加入质粒混合物中，混合均匀后，室温放置5～40min，得到含有聚乙烯亚胺和质粒的混合溶液；
(5)将步骤(4)得到的混合溶液逐滴加入到含有HEK 293T细胞的培养瓶上清中，充分混匀，并放入培养箱中培养6～9h，吸弃上清，加入含有0.1-5vol％胎牛血清的细胞培养基，继续培养；
(6)每隔24h收集一次病毒转染后的上清，共收取1～3次；
(7)过滤和浓缩病毒液；
(8)取第一细胞培养基重悬培养好的NK细胞，按Moi＝5～100加入浓缩后慢病毒液，再加入聚凝胺，预热；
(9)离心；
(10)加入含有聚凝胺的第二细胞培养基，混匀，继续培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养期间采用第三细胞培养基。
(11)当细胞传代至起始数10倍以上时，取细胞做流式检测阳性率；当细胞生长至5-10×106万个细胞左右时，做流式分选，筛选出阳性细胞，接种相应体系继续扩增培养并建库。
本发明的制备方法采用了精细化配置的多种培养基，第一培养基、第二培养基、第三培养基，结合其所采用的聚乙烯亚胺转染试剂、聚凝胺助感染剂，以及特定的操作方式，有效提高了NK细胞的存活率和CD16a的过表达效率，且使得NK细胞多次传代后依然能够稳定过表达CD16a，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
优选的，其中第一包装质粒为psPAX2质粒，第二包装质粒为pMD2.G质粒，且pMD2.G、psPAX2、具有CD16a的目标质粒三者的质量比为(1～3):(1～5):(2～8)。psPAX2和pMD2.G分别编码HIV-1gag-pol和水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G，pMD2.G质粒是包膜质粒，能感染更广泛的细胞类型，psPAX2质粒是包装质粒，减少重组病毒自我复制能力，提升使用的安全性。使得三者的质量比在(1～3):(1～5):(2～8)范围内，可以有效提高整个慢病毒转染体系的包装效率，为之后实现较高的NK细胞转染阳性率做好前期准备。
优选的，包装质粒包括第一包装质粒、第二包装质粒和第三包装质粒，第一包装质粒为pLP1质粒，第二包装质粒为pLP2质粒，第三包装质粒为pLP/VSVG质粒，且具有CD16a的目标质粒为插入pLenti的表达载体；其中pLP1质粒、pLP2质粒、pLP/VSVG质粒、具有CD16a的目标质粒四者的重量比为1.5～7.5:1.2～5.8:3.2～9.3:6.8～10。插入pLenti的表达载体，用于插入CD16a基因，上面包括ψ包装信号以及截短的HIV 3'及5'LTR，便于病毒包装；pLP1质粒表达形成慢病毒结构所必需的gag基因以及病毒复制和整合必需的pol基因；pLP2质粒用以表达Rev蛋白，它能与pLP1上的反应元件共同作用诱导gag和pol表达，并指导病毒RNA的核运输；pLP/VSVG质粒表达VSV-G，使宿主范围更广。必须这4个质粒共同作用，才能产生有感染能力的病毒。优选的，其中聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为1～10:1。本发明采用聚乙烯亚胺作为转染试剂，且控制其和质粒混合物的比例，可以有效提高整个慢病毒转染体系的病毒滴度和包装效率。
优选的，其中离心的具体操作为：将恒温离心机调成600～1000g，30～36℃，10min离心预热至30～36℃，将预热后的培养板转移至离心机中，600～1000g离心30min～3h，30～36℃。采用该离心方式，可以促进病毒转染体系转染细胞。
优选的，其中聚凝胺终浓度为8～100μg/mL。
优选的，其中过滤和浓缩病毒液的具体操作为：病毒转染后的上清用0.45um滤膜过滤；每10～80ml过滤后的病毒初始液加入PEG-6000NaCl母液5～10ml，4℃放置，每20～30min混合摇匀，共进行3～5次；4℃放置过夜后；4℃，4000～6000g，离心10～40min；吸弃上清，静置1～2min，吸走残余液体，加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀，混匀，分装。采用该过滤和浓缩方法，可以提高慢病毒的病毒滴度。
另一方面，本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的敲除了CD38且过表达CD16a的NK细胞。
本发明的NK细胞敲除掉CD38基因且过表达CD16a，其生存率和对肿瘤细胞的杀伤性能均有提升。
同时，本发明的制备方法采用了精细化配置的多种培养基，结合其所采用的聚乙烯亚胺转染试剂、聚凝胺转染增强试剂，以及特定的操作方式，有效提高了NK细胞的存活率、CD38的阴性率和CD16a的过表达效率，且使得NK细胞多次传代后依然能够稳定过表达CD16a，降低NK细胞的自我杀伤，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
附图说明
图1为实施例2构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆1的流式细胞图；
图2为实施例2构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆1培养2个月后的流式细胞图；
图3为实施例3构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆2的流式细胞图；
图4为实施例3构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆2培养2个月后的流式细胞图；
图5为对比实施例1构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆3的流式细胞图；
图6为对比实施例1构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆3培养2个月后的流式细胞图；
图7为对比实施例2构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆4的流式细胞图；
图8为对比实施例2构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆4培养2个月后的流式细胞图；
图9为对比实施例3构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆5的流式细胞图；
图10为对比实施例3构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆5培养2个月后的流式细胞图；
图11为对比实施例4构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆6的流式细胞图；
图12为对比实施例4构建的敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞克隆6培养2个月后的流式细胞图；
图13为敲除CD38的过表达CD16a的NK92MI细胞多个克隆对于不同肿瘤细胞的杀伤性统计图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明公开和描述之前，应该了解的是，下面描述的各个方面并不限于具体的组合物、制备所述组合物的方法或其用途，因为这些方面当然可能发生变化。还应该了解的是，本申请使用的术语仅仅是为了描述特定方面，而并非用于限制。
除非另有规定，本申请使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。
本申请使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，并不是用于限制本发明。如在本发明中使用的，除非上下文中清楚表明，否则，单数形式的“一”、“一个”和“所述”也包括复数形式。所有数值表示，例如，pH、温度、时间、浓度、剂量和分子量，包括范围，若合适的话，是在(+)或(-)10％、1％或0.1％变化的近似值。应该了解的是，虽然并未总是明确指出，但是，所有数值前面都可以加上术语“大约”。还应该了解的是，虽然并不总是明确指出，但是，本申请描述的试剂只是示例性的，并且所述试剂的等同试剂是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”指的是随后描述的事件或环境可以出现或不出现，所述描述包括其中事件或环境出现的情况及不出现的情况。
术语“包括”指的是组合物和方法包括引用的要素，但不排除其它要素。定义组合物和方法时使用的“基本上由……组成”应理解为排除对组合具有任何基本意义以外的其它要素。例如，基本上由本申请定义各要素组成的组合物将不排除实质上不影响所述发明基本新特点的其它要素。“由……组成”应理解为不包括列举的超过痕量的其它组分和实质性方法步骤。这些过渡术语定义的实施例属于本发明的范围。
如本文所用，所述的“过表达”是指细胞内CD16a的含量(如表达量)显著地超过初始细胞(未转入该外源基因的细胞)的水平；如与初始细胞相比，其含量高20％，较佳地高50％；更佳地高100％以上，如高200％，300％...500％或更高。一种“过表达”的情形是将外源的转录因子的编码基因转入细胞中且发生表达。
本发明中，所述的NK细胞可以是分离自机体的，包括自体和异体来源的NK细胞；所述的NK细胞可以是体外培养的，可以是原代培养或传代培养的细胞。现在，也已经有一些商品化的NK细胞，可以供本领域技术人员方便地获得，例如，人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK92MI，其可获自ATCC(ATCC CRL-2408)；此外，其它本领域已建立的NK细胞系还包括有：NK92，NKL，YT，HANK-1，NK-YS和SNK-6等，应理解，它们均可被应用于本发明中。
术语“慢病毒载体”指的是包含主要来源于慢病毒的结构和功能基因元件或其一部分的病毒载体或质粒。
术语“慢病毒载体”或“慢病毒表达载体”可用于指慢病毒转移质粒和/或感染慢病毒颗粒。应该了解的是，核酸序列元件(如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等)在本发明的慢病毒颗粒中以RNA形式存在，在本发明的DNA质粒中以DNA形式存在。
实施例1：NK916细胞(过表达CD16的NK92MI细胞)的制备
(1)准备三质粒系统，三质粒系统分别是过表达CD16的目标质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
(2)配制基本培养基：5-20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素的DMEM完全培养基。
(3)将约(1～10)×106个293T细胞接种到T75培养瓶中，加入基本培养基，培养过夜，当细胞密度达到50～90％时，吸弃培养瓶中的上清，加入10mL只含0.1-2vol％胎牛血清的DMEM培养基对细胞进行饥饿处理1-3h，得到工具细胞；
(4)按照每份病毒1～10mL的量吸取Opti-MEM培养基，平均分成两等分。一份加入慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G以及目标表达质粒，混合均匀，得到质粒混合物；另一份加入聚乙烯亚胺，混合均匀，然后室温放置1～10min，得到转染试剂；其中，pMD2.G、psPAX2、目标表达质粒三者的质量比为1:1:8，聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为10:1；
(5)将转染试剂逐滴加入质粒混合物中，混合均匀后，室温放置5～40min，得到含有聚乙烯亚胺和质粒的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液逐滴加入到含有工具细胞的培养瓶上清中，滴加时枪头悬空，动作轻柔，注意不能将细胞吹起，加完后，按照十字法轻轻晃动培养瓶，使病毒包装成分和培养基充分混匀，并放入培养箱中培养6～9h，吸弃上清，每个培养瓶中加入5～20mL新鲜提前预热的含有0.1-5vol％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养72h；
(7)自加入新鲜的含有0.1-5vol％胎牛血清的DMEM培养基开始算，每隔24h收集一次病毒转染后的上清并用0.45um滤膜过滤，并更换新鲜的含有0.1-5vol％胎牛血清的DMEM培养基，共收取3次，暂存于4℃；
(8)每10～80ml过滤后的病毒初始液，加入PEG-6000NaCl母液7.5ml。4℃放置，每20～30min混合一次，8字摇匀，共进行3～5次；4℃放置过夜后；4℃，4000～6000g，离心10～40min。其中PEG-6000NaCl母液的配置方法为：NaCl 20～40g；PEG6000100～300g；500ml超纯水；溶解后将液体置于121℃高温灭菌30min；将灭菌后母液用0.45um滤膜过滤后保存在4℃；
(9)吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体，加入适量的慢病毒溶解液(DMEM基础培养基)溶解慢病毒沉淀。将混匀后溶解病毒悬液分装，得到NK916慢病毒，储存在-80℃，按需取用。
(10)取适量生长状态较好的NK92MI细胞悬液，300g离心2-5min，去上清，收集NK92MI细胞，用第一培养基重悬细胞，向12孔板一个孔中加入(5～500)×104万个细胞(不超过1mL)，按MOI＝5～100向12孔板中加入NK916慢病毒，再加入聚凝胺(聚凝胺终浓度为100μg/mL)，并加入第一培养基至总体积为3mL，将孔板置于37℃培养箱预热10min，
(11)同时将恒温离心机调成600～1000g，30～36℃，10min离心预热至30～36℃。将预热后的12孔板转移至离心机中，600～1000g离心30min～3h，30～36℃；
(12)离心结束后，将12孔板取出，按1mL/孔加入聚凝胺(聚凝胺终浓度100μg/mL)的第二培养基，移液枪于孔正中间轻轻吹打混匀3-5次，将孔板转移回培养箱中培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养基为第三培养基。
(13)当细胞传代至起始数10倍以上时，取20万个细胞做流式检测阳性率。当细胞生长至(5～10)×106万个细胞左右时，准备细胞做流式分选，分选出阳性细胞接种相应体系继续扩增培养并建库。
其中，第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.5mM，叶酸0.5mM，巯基乙醇0.05mM，胎牛血清2vol％，马血清2vol％，双抗2vol％。
第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇1mM，叶酸0.5mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清20vol％，马血清30vol％，双抗1vol％。
第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇2mM，叶酸0.1mM，巯基乙醇0.005mM，胎牛血清20vol％，马血清5vol％，双抗0.5vol％。
实施例2：NK986细胞(敲除掉CD38且过表达CD16的NK92MI细胞)的制备在实施例1的基础上，继续进行以下步骤：
(14)利用CRISPR构建CD38-的gRNA表达载体：设计针对CD38基因的引导RNA(5′TGAACTCGCAGTTGGCCATA 3′)，与cas9核酸酶形成复合物，该复合物转导进细胞时将敲除CD38。
(15)按(1～10)×105个/孔接种实施例1制备得到的NK916细胞到六孔板，2个孔，2mL第一细胞培养基处理2～6h。
(16)EP管①：opti-MEM 250μl+lipofectamine 3000 7.5μl,轻轻混匀；EP管②opti-MEM 250μl+目标质粒15～100μg+P3000 10μl，轻轻混匀。室温静置5分钟后，将EP管②加到EP管①，轻轻混匀，孵育10～40分钟后均分滴加到NK916细胞的2孔中。
(17)3～12h后，补加1mL第二细胞培养基继续培养。
(18)第二天开始，第三细胞培养基继续培养细胞至起始数5倍左右，取样20万个细胞测流式，检测阴性率。当细胞生长至(5～10)×106个细胞左右时，取细胞孵育抗体后做流式分选CD38阴性细胞。
实施例2中所采用的第一、第二和第三细胞培养基与实施例1相同。
NK986细胞相比较于NK92MI细胞，在NK92MI细胞基础上插入了CD16过表达基因，同时又敲除了CD38基因。
实施例2构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆1的流式细胞图如图1所示，且实施例2构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆1培养2个月后的流式细胞图如图2所示。
其中，流式细胞图中，FITC-H是CD16a的指标，PE-H是CD38的指标。可以看到Q1和Q4代表CD38的区域都是空的，坐标轴代表每个细胞表达特异性抗原的数量，Q2的点越多代表过表达CD16a程度越大。
实施例3
实施例3的操作方式与实施例1+2基本相同，主要区别在于将实施例1+2中的第一、第二和第三培养基替换如下；且pMD2.G、psPAX2、目标表达质粒三者的质量比为3:5:2，聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为1:1，聚凝胺终浓度为8μg/mL。
第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.1mM，叶酸0.2mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清2vol％，马血清2vol％，双抗2vol％。
第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇1mM，叶酸0.05mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清25vol％，马血清25ol％，双抗1vol％。
第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.05mM，叶酸0.05mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清10vol％，马血清10vol％，双抗5vol％。
实施例3构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆2的流式细胞图如图3所示，且实施例3构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆2培养2个月后的流式细胞图如图4所示。
对比实施例1
对比实施例1的操作方式与实施例1+2基本相同，主要区别在于将实施例1+2中的第一、第二和第三培养基替换如下，且其中聚凝胺终浓度为15μg/mL。
第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入叶酸0.05mM，巯基乙醇0.05mM，胎牛血清1vol％，马血清2vol％，双抗1vol％。
第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入叶酸2mM，巯基乙醇0.5mM，胎牛血清15vol％，马血清30vol％，双抗15vol％。
第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入叶酸0.5mM，巯基乙醇0.5mM，胎牛血清10vol％，马血清5vol％，双抗15vol％。
对比实施例1构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆3的流式细胞图如图5所示，且对比实施例1构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆3培养2个月后的流式细胞图如图6所示。
对比实施例2
对比实施例2的操作方式与实施例1+2基本相同，主要区别在于将实施例1+2中的第一、第二和第三培养基替换如下；且pMD2.G、psPAX2、目标表达质粒三者的质量比为3:5:2，聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为10:1，聚凝胺终浓度为20μg/mL。
第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.6mM，巯基乙醇0.6mM，胎牛血清2vol％，马血清1vol％，双抗1vol％。
第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.5mM，巯基乙醇1mM，胎牛血清40vol％，马血清10vol％，双抗1vol％。
第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.1mM，巯基乙醇0.5mM，胎牛血清5vol％，马血清5vol％，双抗1vol％。
对比实施例2构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆4的流式细胞图如图7所示，且对比实施例2构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆4培养2个月后的流式细胞图如图8所示。
对比实施例3
对比实施例3的操作方式与实施例1+2基本相同，主要区别在于将实施例1+2中的第一、第二和第三培养基替换如下；且pMD2.G、psPAX2、目标表达质粒三者的质量比为3:5:8，聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为5:1，聚凝胺终浓度为50μg/mL。
第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.01mM，叶酸0.05mM，胎牛血清2vol％，马血清1vol％，双抗1vol％。
第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.5mM，叶酸0.05mM，胎牛血清30vol％，马血清30vol％，双抗2vol％。
第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.1mM，叶酸0.05mM，胎牛血清4vol％，马血清6vol％，双抗2vol％。
对比实施例3构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆5的流式细胞图如图9所示，且对比实施例3构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆5培养2个月后的流式细胞图如图10所示。
对比实施例4
对比实施例4的操作方式与实施例1相同，但是不进行实施例2的操作步骤，也就是，对比实施例4仅仅只是过表达CD16a的NK细胞，但是其没有敲除掉CD38基因。
对比实施例4构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆6的流式细胞图如图11所示，且对比实施例4构建的敲除CD38且过表达CD16a的NK92MI细胞克隆6培养2个月后的流式细胞图如图12所示。
测试：阴性率/阳性率检测
本测试例的参试对象为实施例2～3和对比例1～4所制得的敲除CD38的过表达CD16a的NK细胞，对其去病毒并取样，利用流式细胞仪进行检测。
a、CD38:孵育anti-CD38+PE链霉素
b、CD16：FITC直接检测
具体步骤：
1.取2个流式管，根据计数的结果各加入对照细胞和实验组细胞约10-50万。
2.将流式管置离心机中200g，25℃，离心3-10分钟。
3.取出流式管，弃上清。
4.每管加入100-300μL生理盐水重悬和5-10μL anti-CD38抗体，2-8℃孵育30-60min
5.取出流式管，每个样品管加入1ml生理盐水，200g，离心5分钟，洗一遍，弃上清。
6.每管加入100-300μL生理盐水重悬和5-10μL PE链霉素二抗抗体，2-8℃孵育30-60min
7.取出流式管，每个样品管加入1ml生理盐水，混匀，置离心机中200g，20℃，离心3-10分钟；取出流式管，弃上清，重复洗涤1次。
8.弃上清，每管中加入生理盐水500μl，漩涡震荡混匀。
9.上机检测FITC和PE，并根据对照组画十字门，该十字门由CD16门(门为对照组细胞群上侧的横向线)和CD38门(门为对照组左侧竖向线)组成，分析实验组CD16+，CD38-目标细胞群占比(在十字门的左上方处的细胞占十字门内所有细胞的比例)。
流式细胞仪的检测结果如图1、3、5、7、9和11所示。可以看出，初始转染的NK细胞的CD16a阳性率均很高，均可达到90％以上，CD38阴性率稳定。
将这些转染后的细胞继续传代培养2个月后，再次利用流式细胞仪检测阴性率。流式细胞仪的检测结果如图2、4、6、8、10和12所示。可以看出，除了实施例2和实施例3的细胞克隆能够稳定的高表达CD16a外，其他实施例的细胞克隆均发生了不同程度的脱靶。尤其是对比实施例3和4，经2个月培养后，阳性率跌落到了5％以下；但实施例1和实例2的NK细胞在培养2个月后，依然能够高效稳定的过表达CD16a。
测试：杀伤性能检测
将实施例2～3和对比例1～3所制得的敲除CD38且过表达CD16a的NK细胞(称为NK986细胞)传代培养2个月后，按照以下方式检测其杀伤性能：
1.洗板：吸掉板内液体，每个孔用高压灭菌水洗涤2次；再用NaOH溶液浸泡1-4h，用高压灭菌水洗涤2次；最后用DPBS润洗1次。
2.铺板：将培养好的目标肿瘤细胞系(BxPC-3、OVCAR-3、AGS、HO8910这四种肿瘤细胞)消化、离心、重悬、台盼蓝染色计数，按1-10万活细胞/孔接种电流板，补加适量培养基，上机放入培养箱中监测。细胞生长曲线为平滑上升，且孔间差异不大，则视为细胞生长正常。
3.加入实施例2～3和对比例1～3所制得的敲除CD38且过表达CD16a的NK细胞：以肿瘤细胞系生长曲线平缓期开端点为加NK细胞时间点。将待测NK细胞取出离心、重悬、台盼蓝染色计数，按肿瘤细胞接种量：NK细胞＝3：1的比例加入电流板中，上机(实时细胞分析仪)放入培养箱中持续监测杀伤情况，且采用未经转染的NK92MI细胞作为阴性对照，同时采用未敲除CD38仅过表达CD16a的NK92MI细胞(NK916细胞)作为对照。
由图13可知，实施例2和3敲除CD38且过表达CD16a的NK细胞对于这四种肿瘤细胞相对于阴性对照和未敲除CD38的916细胞，均有明显增强的杀伤性能。而对比例1-3的敲除CD38且过表达CD16a的NK细胞对于这四种肿瘤细胞的杀伤性能也有一定的增强，但是增强程度明显较实施2和3更低一点，未经转染的NK92MI细胞以及未敲除CD38仅过表达CD16a的NK92MI细胞(NK916细胞)的杀伤性更低一点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，所述NK细胞包含CD38敲除且过表达CD16a的多核苷酸，其中所述NK细胞是NK92MI细胞；
所述NK细胞的制备方法包括以下步骤：
（1）构建敲除CD38基因的CRISPR-Cas编辑系统；
（2）培养过表达CD16a的NK细胞；
（3）将步骤（1）的CRISPR-Cas编辑系统和转染试剂混合均匀，得到混合物；
（4）将步骤（3）的混合物加入到培养好的NK细胞中，孵育，继续培养；
（5）继续培养步骤（4）所得的细胞，取样，检测阴性率；
（6）筛选CD38阴性细胞；
其中步骤（2）中采用的培养基为第一细胞培养基，具体组成如下：在MEM 基础培养基中加入肌醇0.5mM，叶酸 0.5mM，巯基乙醇0.05mM，胎牛血清2vol%，马血清2vol%，双抗2vol%；
其中步骤（4）中继续培养采用的培养基为第二细胞培养基，具体组成如下：在MEM 基础培养基中加入肌醇1mM，叶酸0.5mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清20vol%，马血清30vol%，双抗1vol%；
其中步骤（5）中继续培养采用的培养基为第三细胞培养基，具体组成如下：在MEM 基础培养基中加入肌醇2mM，叶酸0.1mM，巯基乙醇0.005mM，胎牛血清20vol%，马血清5vol%，双抗0.5vol%。
2.如权利要求1所述的NK细胞的制备方法，其中步骤（3）的具体操作为：
在第一EP管加入250μL的 opti-MEM和7.5μL的lipofectamine 3000，轻轻混匀；
在第二EP管中加入 250μL的opti-MEM，步骤（1）的CRISPR-Cas编辑系统15~100μg 以及10μL的 P3000，轻轻混匀；
室温静置5分钟后，将第二EP管加入到第一EP管中，轻轻混匀，孵育10~40分钟后，均分滴加到步骤（2）的NK细胞中。
3.如权利要求1所述的NK细胞的制备方法，其中，步骤（2）中过表达CD16a的NK细胞采用以下步骤制备：
（1）构建具有CD16a的目标质粒和包装质粒的慢病毒转染体系；
（2）培养用于慢病毒的HEK293T细胞，对所述HEK 293T细胞进行饥饿处理；
（3）将减血清培养基平均分成两份，一份加入具有CD16a的目标质粒、第一包装质粒和第二包装质粒的慢病毒转染体系，混合均匀，得到质粒混合物；另一份加入聚乙烯亚胺，混合均匀，然后室温放置1~10min，得到转染试剂；
（4）将转染试剂逐滴加入质粒混合物中，混合均匀后，室温放置5~40min，得到含有聚乙烯亚胺和质粒的混合溶液；
（5）将步骤（4）得到的混合溶液逐滴加入到含有HEK 293T细胞的培养瓶上清中，充分混匀，并放入培养箱中培养6~9h，吸弃上清，加入含有0.1-5vol%胎牛血清的细胞培养基，继续培养；
（6）每隔24h收集一次病毒转染后的上清，共收取1~3次；
（7）过滤和浓缩病毒液；
（8）取第一细胞培养基重悬培养好的NK细胞，按 Moi=5~100加入浓缩后慢病毒液，再加入聚凝胺，预热；
（9）离心；
（10）加入含有聚凝胺的第二细胞培养基，混匀，继续培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养期间采用第三细胞培养基；
（11）当细胞传代至起始数10倍以上时，取细胞做流式检测阳性率；当细胞生长至5-10×106万个细胞时，做流式分选，筛选出阳性细胞，接种相应体系继续扩增培养并建库。
4.如权利要求3所述的NK细胞的制备方法，其中包装质粒包括第一包装质粒和第二包装质粒，其中第一包装质粒为psPAX2质粒，第二包装质粒为pMD2.G质粒，且pMD2.G、psPAX2、具有CD16a的目标质粒三者的质量比为1~3:1~5:2~8；
或者，其中包装质粒包括第一包装质粒、第二包装质粒和第三包装质粒，第一包装质粒为pLP1质粒，第二包装质粒为pLP2质粒，第三包装质粒为pLP/VSVG质粒，且具有CD16a的目标质粒为插入pLenti的表达载体；其中pLP1质粒、pLP2质粒、pLP/VSVG质粒、具有CD16a的目标质粒四者的重量比为1.5~7.5:1.2~5.8:3.2~9.3:6.8~10。
5.如权利要求4所述的NK细胞的制备方法，其中聚乙烯亚胺与三种质粒的总量比为1~10:1。
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