CN116063506A

CN116063506A - 一种分离的抗体及其用途

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Publication number: CN116063506A
Application number: CN202211073975.8A
Authority: CN
Inventors: 石磊; 狄升蒙; 张世伟; 李照润; 余学军; 龚鹏飞; 孙嘉熙; 董泰华; 马祖良; 王旭; 侯成成
Original assignee: Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Current assignee: Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2023-05-05

Abstract

本发明公开了一种分离的抗体及其用途。所述的分离的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的分离抗体包括如下技术特征中的一个或多个：重链可变区包括氨基酸序列如SEQID No.1所示的CDR‑H1；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR‑H2；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR‑H3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQID No.4所示的CDR‑L1；轻链可变区包括氨基酸序列为VAS的CDR‑L2；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR‑L3。本发明的分离的抗体能够高效靶向CD4抗原，高效富集CD4T细胞，且富集得到的CD4T细胞制备所得的CAR‑T细胞能被抗原特异性激活。

Description

一种分离的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种分离的抗体及其用途。

背景技术

CD4全称表面抗原分化簇4(Cluster of Differentiation 4)，是表达在包括辅助T细胞、调节T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等细胞表面的糖蛋白，是辅助T细胞的表面标记(surface markers)之一，是其行使其功能的重要受体，参与调节T免疫细胞的增殖、淋巴因子的释放以及参与免疫细胞的相互作用，调节抗体的产生。同时是许多病原体(包括人免疫缺陷病毒等)感染CD4+细胞的受体糖蛋白。

CD4 T细胞存在功能多样性已被研究者们所熟知。CD8 T细胞在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)感染，李斯特菌(Listeriamonocytogenes)感染以及移植物排斥反应中发挥细胞毒性作用；而CD4 T细胞被认为可以帮助B细胞产生抗体，增强并维持CD8 T细胞免疫反应，协调一系列抗病原体的免疫反应，以及调节/抑制免疫反应来控制自身免疫性疾病和炎症反应的强度和维持程度。CD4 T细胞是免疫记忆的重要参与者，当其数量大量减少或者功能减退时，宿主就会变得对很多病原体易感。例如，在HIV感染中，当患者血液中CD4 T细胞数量降低至200/mm³时，就很有可能会发生大量机会性感染。

过继转移经过改造以表达靶向肿瘤细胞表面相关抗原的人工嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是一种革命性的癌症免疫细胞疗法。CAR是人工合成的受体，可以重新定向淋巴细胞，最常见的是T细胞，以识别和杀伤表达特定抗原的靶细胞。近年来，快速发展的CAR-T细胞疗法临床试验积极探索其潜在的应用场景。CAR-T细胞疗法由于其具有持续优化的巨大潜力，如更好的靶点、更好的CAR结构和更高效的制备工艺，因此比传统药物更受关注。

CAR-T细胞的生产制造包含多个步骤，并且要在整个过程中进行质量控制测试。简单的来说，首先使用白细胞分离术从患者/正常人体内去除血液，分离白细胞，并将剩余的血液重新输回到循环系统，然后将白细胞进行CD4 T细胞和CD8 T细胞分选以富集T细胞，然后将富集得到的T细胞进行激活并通过基因工程方法使其表达特异性的CAR，继续扩增CAR-T细胞达到合适的数量，最后回输至病人体内。

对于细胞分选来说，抗体是必不可少的，综上所述，开发新的用于分选富集细胞的分离的抗体具有重要意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种分离的抗体及其用途。

本发明目的之一在于提供一种分离的抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述分离的抗体具有如下技术特征中的一个或多个：

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；

轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；

轻链可变区包括氨基酸序列为VAS的CDR-L2；

轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L3。

GYTFTDYV(SEQ ID No.1)

IYPGSGSA(SEQ ID No.2)

ARRGNGTGFAY(SEQ ID No.3)

QSVDYDGDSY(SEQ ID No.4)

QQSYKDPLT(SEQ ID No.5)

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2)：

A1)如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；

A2)与SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。优选地，与SEQ ID No.6所示的氨基酸序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYVIHWVKQATGQGLEWIGEIYPGSGSAYSNAKFKDRVTMTADKSSNTAYMELSSLTSDDTAVYFCARRGNGTGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.6)

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括B1)或B2)：

B1)如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

B2)与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有B1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。优选地，与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

DIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKAGQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEENDAATYYCQQSYKDPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID No.7)

优选地，所述的分离的抗体还包括框架区(FR)。所述框架区(FR)的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

更优选地，所述的重链可变区还包括框架区FR1-FR4：所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示，所述框架区FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.9所示，所述框架区FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.10所示，所述框架区FR4的氨基酸序列包括如SEQ IDNo.11所示。

QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID No.8)

IHWVKQATGQGLEWIGE(SEQ ID No.9)

YSNAKFKDRVTMTADKSSNTAYMELSSLTSDDTAVYFC(SEQ ID No.10)

WGQGTLVTVSS(SEQ ID No.11)

更优选地，所述的轻链可变区还包括框架区FR1-FR4：所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No.12所示，所述FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.13所示，所述FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.14所示，所述FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.15所示。

DIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKAG(SEQ ID No.12)

MNWYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID No.13)

NLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEENDAATYYC(SEQ ID No.14)

FGQGTKLEIK(SEQ ID No.15)

优选地，所述分离的抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。

更优选地，所述重链恒定区的序列包括如SEQ ID No.18所示。

gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID No.18)

更优选地，所述轻链恒定区的核苷酸序列包括如SEQ ID No.19。

cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagttcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID No.19)

本发明目的之二在于提供一种分离的多核苷酸，编码如上文所述分离的抗体。

优选地，编码所述分离的抗体的重链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID No.16所示序列caggtccaactcgtccaaagcggccccgagctcaaaaaacccggcgcctccgtcaaagtgtcatgcaaggcaagcggctacaccttcacagactacgtcatccactgggtcaaacaagcaaccggccagggcctcgaatggatcggagaaatctaccccggctccggctccgcctactccaacgctaaattcaaggaccgcgtgaccatgaccgccgacaaaagctcaaacaccgcttacatggagctgagcagcctgacctctgacgacaccgccgtttacttctgtgcccggaggggcaatggcaccggatttgcctattggggccagggaacactggtgaccgtcagcagc(SEQ ID No.16)

优选地，编码所述分离的抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID No.17所示序列。

gacattgtgctgacccagagccccgcctccctggctgtgagcctgggacagagagccaccataacctgcaaggccggacagagcgtggactacgacggcgactcctatatgaactggtatcagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatttacgtggcaagcaacctggagagcggcatccccgccagattctcaggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggaggagaacgacgccgccacctactactgccagcagagctacaaagaccccctcaccttcggccaaggcaccaaactggaaatcaaa(SEQ ID No.17)

本发明目的之三在于提供一种构建体，含有如上文所述的多核苷酸。

优选地，所述构建体可以由上文所述的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。构建体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。

更优选地，所述构建体为病毒载体或非病毒载体。例如，非病毒载体包括：质粒，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。病毒载体包括：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

本发明目的之四在于提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如上文所述构建体或基因组中整合有外源的如上文所述多核苷酸。

优选地，所述表达系统可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。

更优选地，所述的表达系统包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

本发明目的之五在于提供如上文所述分离的抗体或如上文所述构建体或如上文所述表达系统在如下至少一项中的用途：

富集CD4 T细胞；

检测CD4抗原；

制备富集CD4 T细胞的产品；

制备检测CD4抗原的产品；

制备或筛选CD4相关疾病的药物。

优选地，富集CD4 T细胞的方法，包括如下步骤：在外周血单个核细胞中添加如上文所述的分离的抗体和/或含有上文所述抗体的抗体偶联物，使CD4 T细胞与所述抗体和/或抗体偶联物结合，分离，得到所述的CD4 T细胞。

更优选地，所述方法包括如下：

1)上文所述的抗体或含有上文所述抗体的抗体偶联物与PBMC在流式缓冲液中孵育，得到孵育液；

2)将所述孵育液过分选柱，弃去流下来的细胞，用流式缓冲液冲洗柱子，收集流下的液体，得到所述的CD4 T细胞。

进一步优选地，所述外周血单个核细胞和分离的抗体的比例为16×10⁶个细胞：(0.5～1.5)μg。

进一步优选地，所述流式缓冲液为含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mM EDTA的1×PBS溶液。具体地，所述流式缓冲液为含有2％FBS和2mM EDTA的1×PBS溶液。

优选地，检测CD4抗原的方法，包括使待测样品与上文所述的抗体接触，并确定所述待测样品中CD4抗原的存在或量。

优选地，所述CD4相关疾病或病况可以是癌症、适应性免疫疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。

更优选地，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、复发性或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞性白血病)、骨髓瘤和淋巴瘤。

本发明目的之六在于提供一种抗体偶联物，包括如上文所述分离的抗体和标记物或分离辅助物。

优选地，所述标记物选自生物素、荧光素、辣根过氧化物酶中的一种或多种。

优选地，所述分离辅助物选自磁珠和琼脂糖珠。

更优先地，所述分离辅助物为磁珠。

进一步优选地，分离的抗体偶联磁珠形成抗体偶联物，所述抗体偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)羧基磁珠和如上文所述的分离的抗体在缓冲液中进行偶联反应；

(2)离心，去除上清液，加入BSA水溶液，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团；

(3)离心，取沉淀，洗涤，重悬浮于PBS保存溶液中，得到。

优选地，所述的羧基磁珠与所述的分离的抗体的质量比为(1～3):1。

优选地，所述的BSA水溶液的浓度为10～30mg/mL。更优选地，在某个优选的实施方式中，为20mg/mL。

本发明目的之七在于提供一种产品，所述的产品包含如上文所述分离的抗体或如上文所述抗体偶联物。

优选地，所述产品选自试剂、试剂盒。

更优选地，所述产品通常可以针对作用靶标CD4抗原，以CD4抗原作为生物标志物进行诊断。所述产品还可以包括抗体偶联物，所述抗体偶联物包括分离的抗体和标记物或分离辅助物，所述标记物或分离辅助物通常可以用于与分离的抗体偶联，可选用的标记物的种类包括但不限于生物素、荧光素、辣根过氧化物酶中的一种或多种，可选的分离辅助物的的种类包括但不限于磁珠和琼脂糖珠中的一种或多种。

本发明目的之八在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如上文所述分离的抗体，以及药学上可接受的载体。

优选地，所述药学可接受的载体指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其他不适影响的载体。药学可接受的载体包括，例如，液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分或其各种组合。

优选地，所述药学可接受的载体可进一步包括能提高抗体的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

如上所述，本发明的具有以下有益效果：

1)本发明的分离的抗体能够高效靶向CD4抗原，且易于制备；

2)本发明的分离的抗体可以通过与琼脂糖、磁珠结合，进行生物样本的亲和富集和分离，对PBMC中CD4 T细胞进行富集时，超过90％的CD4 T细胞被富集，且富集后的细胞废液中仅剩不到2.5％的CD4 T细胞。

3)本发明分选得到的CD4 T细胞制备所得的CD22-CAR-T细胞能被抗原特异性激活。

附图说明

图1为本发明的实施例1中分离的抗体的亲和力测定结果图。

图2为本发明的实施例1中分离的抗体识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

图3为本发明的实施例1中抗CD4-3抗体识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

图4为本发明的实施例1中抗CD4-2抗体、抗CD4-4抗体、抗CD4-8抗体识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

图5为本发明的实施例1中抗CD4-6抗体、抗CD4-7抗体、抗CD4-9抗体、抗CD4-10抗体和抗CD4-13识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

图6A为本发明的实施例4中采用抗体偶联物分选富集前、后的PBMC细胞中CD4T细胞比例的结果图。

图6B为本发明的实施例4中采用抗体偶联物分选富集后废液中CD4 T细胞所占比例图。

图7A为本发明的实施例4中采用抗CD4-3偶联物分选富集前、后的PBMC细胞中CD4T细胞比例的结果图。

图7B为本发明的实施例4中采用抗CD4-3偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

图8A为本发明的实施例4中分别采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集前、后的PBMC细胞中CD4T细胞比例的结果图。

图8B为本发明的实施例4中分别采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

图9A为本发明的实施例4中分别采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集前、后的PBMC细胞中CD4T细胞比例的结果图。

图9B为本发明的实施例4中分别采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

图10为本发明的实施例6中的CD4 T细胞感染病毒后第5、8、11、14天后的总细胞数结果图。

图11A为本发明的实施例6中的CD4 T细胞感染病毒后第5天后CAR-T细胞中嵌合抗原受体表达率图。

图11B为本发明的实施例6中的CD4 T细胞感染病毒后第8天后CAR-T细胞中嵌合抗原受体表达率图。

图11C为本发明的实施例6中的CD4 T细胞感染病毒后第11天后CAR-T细胞中嵌合抗原受体表达率图。

图11D为本发明的实施例6中的CD4 T细胞感染病毒后第14天后CAR-T细胞中嵌合抗原受体表达率图。

图12A为本发明的实施例7中的CAR-T细胞(CD4⁺CD22-CAR-T)对K562-luci细胞的杀伤效果图。

图12B为本发明的实施例7中的CAR-T细胞(CD4⁺CD22-CAR-T)对K562-CD22-luci细胞的杀伤效果图。

图13为本发明的实施例7中的CAR-T细胞(CD4⁺CD22-CAR-T)作用于K562-luci和K562-CD22-luci后的IFN-γ细胞因子分泌水平图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，提供了一种与CD4特异性结合的抗体，以及偶联到纳米磁性颗粒上的免疫缀合物，并进一步从人外周血单个核细胞中富集分选得到CD4 T细胞，进而将CD22靶向的嵌合抗原受体基因导入所述CD4 T细胞，得到CD4⁺CD22-CAR-T细胞，能够有效杀伤表达CD22的肿瘤细胞，且能刺激肿瘤细胞释放细胞因子IFN-γ而发挥杀伤功能，且本发明的细胞具有高特异性，在此基础上完成了本发明。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请的下述实施例中：

HD SIN03 CD22(V29)41BBz(ka)慢病毒载体和K562-luci、K562-CD22-luci靶细胞可参见申请号CN 114149506 A。

流式缓冲液为含有2％FBS和2mM EDTA的1×PBS溶液。

实施例1分离的抗体表达载体的构建、分离和纯化

本实施例中，构建分离的抗体的表达载体，并进行分离和纯化，得到分离的抗体(标记为CD4-14)。包括如下：分离抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.6所示序列。

(SEQ ID No.6，粗体加下划线部分为重链可变区，依次为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)

分离抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.7所示序列。

(SEQ IDNo.7，粗体加下划线部分为重链可变区，依次为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)

1.1、获得分离抗体目标片段

通过二轮PCR扩增，获得分离抗体目标片段。分离抗体表达载体委托上海百英生物科技有限公司完成。

按照第一轮PCR反应体系和第一轮PCR反应条件，获得第一轮PCR产物。

第一轮PCR反应体系包括：0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.3μL模板、0.5μLDNA聚合酶、10μL 5×缓冲液、1μL 10mM dNTP，用ddH2O补足至50μL。

第一轮PCR反应条件为：95℃3min，95℃25s，60℃20s，72℃40s，72℃1min，10℃∞，循环数为25。

重链核苷酸序列：

CAGGTCCAACTCGTCCAAAGCGGCCCCGAGCTCAAAAAACCCGGCGCCTCCGTCAAAGTGTCATGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACAGACTACGTCATCCACTGGGTCAAACAAGCAACCGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGGAGAAATCTACCCCGGCTCCGGCTCCGCCTACTCCAACGCTAAATTCAAGGACCGCGTGACCATGACCGCCGACAAAAGCTCAAACACCGCTTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACCTCTGACGACACCGCCGTTTACTTCTGTGCCCGGAGGGGCAATGGCACCGGATTTGCCTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACCGTCAGCAGC(SEQ ID No.16)

轻链核苷酸序列：

按照第二轮PCR反应体系和第二轮PCR反应条件，获得分离的抗体。

第二轮PCR反应体系包括：0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.3μL第一轮PCR产物、0.5μL DNA聚合酶、10μL 5×缓冲液、1μL 10mM dNTP，用ddH₂O补足至50μL。

第二轮PCR反应条件同第一轮PCR反应条件。

1.2、构建重组表达载体

胶回收步骤1.1的分离抗体目标片段(参考Axygen产品说明书)，进行同源重组。4μL胶回收的分离抗体目标片段、3.5μL线性化载体和2.5μL重组酶进行连接，在.50℃水浴25min，放置2-3min使温度降低，进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜，得到重组表达载体。

1.3、菌落筛选实验

1.3.1挑取步骤1.2的过夜平板中单菌落；

1.3.2用引物Bl-CMV-F和Bl-SEQ-R对步骤1.3.1得到的菌落进行PCR扩增；

Bl-CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID No.20)

Bl-SEQ-R：AGCGTAAAAGGAGCAACATAGT(SEQ ID No.21)

1.3.3电泳鉴定阳性克隆；

1.3.4随机选择4个阳性菌，阳性菌液用Bl-CMV-F/Bl-SEQ-R引物测序。

1.3.5选择测序正确克隆的阳性菌液，扩大培养后抽提低内毒素质粒，测序验证。

1.4、分离抗体的原核表达

1.4.1 CHO细胞的培养

CHO细胞株置于RPMI1640培养基中，RPMI1640培养基含10％灭活小牛血清、青霉素100IU/mL和链霉素100IU/mL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每隔48h换培液。

1.4.2转染与表达

1)取145M本实施例中步骤1.4.1得到的细胞，离心去上清，保留沉淀。

2)用0.5mL左右电转液加入1)得到的沉淀中，混匀后添加适量的1.3获得的构建重组表达载体(浓度500ng/μL)，得到细胞质粒混悬液。

3)上述细胞质粒混悬液充分混匀后取1mL加入1mL电击管，把电击管放入电转仪进行电击。

4)电击完成后，将电击管内细胞分装进提前准备好含有20mL培养液摇瓶内，静止孵育40min。

5)孵育结束后将摇瓶放入37℃，270rpm，8％CO₂培养，24h后添加补料/丁酸钠/双抗，继续培养3～7d。第5d抽检取样送测ELISA。

1.5、抗体纯化

实验方法：Protein A亲和层析柱纯化

(1)平衡层析柱：l×PBS，流速l mL/min，20mL；

(2)上样：流速l mL/min；

(3)洗杂：l×PBS，流速l mL/min，20mL；

(4)洗脱：柠檬酸缓冲液(PH3.4)，l mL/min，分管收集，每管约500μL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值；

(5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放l×PBS的烧杯中透析，得到纯化后的分离抗体。

1.6、抗体基础质控

1)浓度检测；

2)纯度检测(SEC-HPLC)；

实验材料：高效液相色谱仪、凝胶色谱柱、去离子水、流动相(Na₂HPO₄.12H₂O、NaH₂PO₄.2H₂O、NaCl)；

实验方法：

使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱进行SEC实验，实验条件如下：

流速：1mL/min；进样量：20μL

柱温：35℃

检测波长：214nm，280nm

采集时间：15min

将水更换为流动相，流速缓慢升至1.000mL/min，至基线平稳。取50μL的抗体至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的位置，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h。

结果显示，抗体纯度>90％。

实施例2分离抗体的亲和力测定和识别CD4抗原检测

本实施例中，对实施例1得到的纯化后的分离抗体进行亲和力测定和识别细胞表面CD4抗原实验，包括如下步骤：

2.1分离抗体的亲和力测定

取3×10⁵个Nalm6-CD4细胞(为过表达CD4的Nalm6细胞株)，4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；流式缓冲液稀释一抗至4μg/mL，依次4倍梯度稀释，共10个浓度，分别取100μL此梯度稀释的抗体重悬细胞，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg的APC标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自BioLegend)，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测，GraphPad计算得到EC50。

图1为本实施例中分离抗体的亲和力测定结果图。

从图1可知，分离抗体相对于CD4抗原的亲和力值EC50为0.1518μg/mL。

2.2分离抗体识别细胞表面的CD4抗原实验

2.2.1分离抗体识别细胞表面的CD4抗原

将K562-CD4细胞和K562细胞混合，取3×10⁵个混合细胞，4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg分离抗体，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg的APC标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自BioLegend，对应分离抗体)，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

同时，以不加分离抗体作为空白对照组。

图2为本实施例中分离抗体识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

2.2.2抗CD4-3识别细胞表面的CD4抗原

取3×10⁵个K562-CD4(为过表达CD4的K562细胞株)细胞，于4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg CD4-3抗体，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg的APC标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自BioLegend)，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

同时，以不加抗CD4-3抗体作为空白对照组。

CD4-3购自BioLegend，货号：317402。

图3为本实施例中抗CD4-3抗体识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

2.2.3抗CD4-2和抗CD4-4分别识别细胞表面的CD4抗原

将K562-CD4细胞和K562细胞(购自ATCC)混合，取3×10⁵个混合后的细胞，于4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；加100μL流式缓冲液重悬细胞，分别加入1μg抗CD4-2和抗CD4-4，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加100μL流式缓冲液重悬细胞，然后在抗CD4-2抗体和抗CD4-4抗体得到的缓冲液重悬细胞中加入1μg的APC标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自BioLegend，分别对应CD4-2和抗CD4-4)，继续冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

同时，以不加CD4抗体作为空白对照组。

CD4-2氨基酸序列：

重链：

EVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID No.22)

轻链：

DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMICKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.23)

CD4-4氨基酸序列：

重链：

QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYFFTDYVINWVKQRTGQGLEWIGEIYPGSGSSYYSEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSADSAVYFCARRGTGLGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.24)

轻链：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.25)

图4为本实施例中抗CD4-2、抗CD4-4、抗CD4-8识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

2.2.4 CD4-6、抗CD4-7、抗CD4-9、抗CD4-10和抗CD4-13分别识别细胞表面的CD4抗原

与本实施例中步骤2.2.3不同点在于：加入APC标记的羊抗人IgG二抗(购自BioLegend，分别对应CD4-6、抗CD4-7、抗CD4-9、抗CD4-10和抗CD4-13)，其余步骤均相同。

CD4-6氨基酸序列：

重链：

QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.26)

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.27)

CD4-7氨基酸序列：

重链：

QVQLQQSGAEVARPRASVKLSCKASGYTFTSNGINWVKYRTGQGLEWIGEIYPRSGNIFYNERFEGKATLTADKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYFCARRVPYFDHWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.28)

轻链：

DVVMTQNLRFLPVSAGDRVAMTCKASQSVGNNVAWYQRKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYSSPFTFGTGTKLEIK(SEQ ID No.29)

CD4-8氨基酸序列：

重链：

QVQLQEAGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSISGDYYWFWIRQSPGKGLEWIGYIYGSGGGTNYNPSLNNRVSISIDTSKNLFSLKLRSVTAADTAVYYCASNILKYLHWLLYWGQGVLVTVSS(SEQ ID No.30)

轻链：

SYELSQPRSVSVSPGQTAGFTCGGDNVGRKSVQWYQQKPPQAPVLVIYADSERPSGIPARFSGSNSGNTATLTISGVEAGDEADYYCQVWDSTADHWVFGGGTRLTVL(SEQ ID No.31)

CD4-9氨基酸序列：

重链：

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVINWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.32)

轻链：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQHKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID No.33)

CD4-10氨基酸序列：

重链：

EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWVRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.34)

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID No.35)

CD4-13氨基酸序列：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYVISWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGSSYYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGDGSRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.36)

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSLQDPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID No.37)

图5为本实施例中抗CD4-6、抗CD4-7、抗CD4-9、抗CD4-10和抗CD4-13识别细胞表面的CD4抗原的结果图。

从图2、3、4和5可知，本发明的分离抗体能特异性识别细胞表面的CD4抗原。

实施例3分离抗体与磁珠偶联

本实施例，将实施例1中纯化后的分离抗体偶联至纳米磁性颗粒，得到抗体偶联物。实验步骤如下：

1)取1mg纳米磁颗粒，加入1mg的EDC和NHS(MES pH5.5溶解)，37℃震荡反应0.5h；20000g离心30min去除NHS和EDC，得到沉淀。

2)本实施例中步骤1)得到的沉淀中按照纳米颗粒和抗体的质量比为2:1混合，再加入500μL pH8.0的硼酸盐缓冲液，室温震荡2.5h。

3)然后于20000g离心30min，保留上清(上清后面一起离心去除干扰)，等待检测BCA。

4)使用含有20mg/mL的BSA的水溶液封闭1h，37℃摇床震荡反应，然后于20000g离心30min，去上清，得到沉淀。

5)将本实施例步骤4)得到的沉淀再用DEPC清洗，重悬至1mL，取20μL至1mL的纯水中，等待检测DLS。

6)20000g离心30min，去上清，用PBS保存液重悬至500μL，经0.22μm滤膜过滤，得到分离抗体偶联物。

同时，以抗CD4-2、抗CD4-4、抗CD4-6、抗CD4-7、抗CD4-8、抗CD4-9、抗CD4-10、抗CD4-13抗体为对照，采用与分离抗体相同的方法制备分别得到抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物、抗CD4-8偶联物、抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物、抗CD4-13偶联物。

实施例4抗体偶联物对PBMC进行分选富集

本实施例，使用实施例3得到的抗体偶联物对PBMC进行分选富集，并检测抗体偶联物对富集分选CD4T细胞的效率和纯度。实验步骤如下：

4.1抗体偶联物对PBMC进行分选富集

1)复苏PBMC，于37℃和5％CO₂培养条件静息2h；

2)将本实施例中步骤1)培养后的PBMC收集到15mL离心管，500g离心5min，弃上清，用2mL流式缓冲液洗涤PBMC沉淀一遍；

3)使用流式缓冲液将PBMC重悬，计数，取2.5×10⁶细胞，离心后用50μL流式缓冲液重悬，加入0.3125μL的实施例3得到的抗体偶联物，混匀后室温孵育15min；

4)加入500μL流式缓冲液终止反应，转移至MS Columns中，以分选富集细胞，待细胞悬液滴完后，使用500μL流式缓冲液洗涤MS Columns两次，收集细胞废液，备用；

5)在MS Columns中加入1mL流式缓冲液，使用活塞将分选富集的细胞收集到1.5mL离心管中。

4.2抗体偶联物分选富集CD4T细胞的效率和纯度测定

1)将本实施例4.1中步骤4)得到的细胞废液和步骤5)得到的分选富集的细胞以及分选富集前的PBMC中各取3×10⁵个细胞，4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；

2)加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg的APC标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自BioLegend)，冰上孵育30min，得到标记后的细胞；

3)流式缓冲液清洗2次后，加入100μL流式缓冲液重悬标记后的细胞，加入1μg的PE-anti-CD3抗体(购自BioLegend)，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测富集分选前PBMC、细胞废液和富集的细胞中的CD4T细胞比例。

同时，设立对照组，对照组与本发明的抗体偶联物不同点在于：本实施例5.1中步骤3)中不加入抗体磁珠偶联物，而是加入抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物、抗CD4-8偶联物、抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物、抗CD4-13偶联物，其余均相同。

图6A为本实施例中采用抗体偶联物分选富集前和后的细胞中CD4T细胞比例的结果图。

由图6A可知，分选富集前PBMC中CD4 T细胞所占比例为31.9％，分选富集后，CD4 T细胞所占比例大大提升，超过90％，表明本发明的抗体偶联物能够从PBMC中富集得到高纯度的CD4 T细胞。

图6B为本实施例中采用抗体偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

由图6B可知，细胞废液中仅剩少量CD4 T细胞，由图中比例可得，超过90％的CD4 T细胞被富集，表明本发明的抗体偶联物能够高效率地从PBMC中富集CD4 T细胞。

图7A为本实施例中采用抗CD4-3偶联物分选富集前和后的细胞中CD4T细胞比例的结果图。

由图7A可知，采用抗CD4-3偶联物分选富集前，PBMC中CD4 T细胞所占比例为33.7％；分选富集后，CD4 T细胞所占比例下降至23％。

图7B为本实施例中采用抗CD4-3偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

由图7B可知，采用抗CD4-3偶联物分选富集后，细胞废液中CD4 T细胞占比比较高，高达25.8％。

图8A为本实施例中分别采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集前和后的细胞中CD4T细胞比例的结果图。

由图8A可知，分别采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集前，PBMC中CD4 T细胞所占比例为31.0％；分选富集后，CD4 T细胞所占比例分别为38.1％、19.8％和52.7％。

图8B为本实施例中分别采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

由图8B可知，采用抗CD4-2偶联物、抗CD4-4偶联物和抗CD4-8偶联物分选富集后，细胞废液中CD4 T细胞占比分别为24.1％、34.8％和4.52％。

图9A为本实施例中分别采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集前和后的细胞中CD4T细胞比例的结果图。

由图9A可知，分别采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集前，PBMC中CD4 T细胞所占比例为29.0％；分选富集后，CD4 T细胞所占比例分别为65.8％、85.0％、22.1％、80.1％和80.8％。

图9B为本实施例中分别采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集后的细胞废液中CD4T细胞比例的结果图。

由图9B可知，采用抗CD4-6偶联物、抗CD4-7偶联物、抗CD4-9偶联物、抗CD4-10偶联物和抗CD4-13偶联物分选富集后，细胞废液中CD4 T细胞占比分别为25.2％、55.35％、27.2％、12.3％和9.68％。

综上可知，采用本发明的分离抗体分选富集能获得高纯度的CD4 T细胞，而采用抗CD4-2、抗CD4-4、抗CD4-8、抗CD4-6、抗CD4-7、抗CD4-9、抗CD4-10和抗CD4-13抗体对PBMC进行分选富集时，富集的细胞中有大量其他杂细胞，废液中还残留大量未被富集的CD4 T细胞。

实施例5慢病毒包装和浓缩

本实施例，进行慢病毒的包装和浓缩，并检测慢病毒的滴度。包括以下步骤：

5.1慢病毒的包装

5.1.1以1.6×10⁷细胞数接种293T细胞于直径为15cm培养皿中，于37℃和5％CO₂培养过夜准备包装病毒，培养基为DMEM，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)；

5.1.2将30μgHD SIN03 CD22(V29)41BBz(ka)慢病毒载体与12.5μg辅助质粒gag/pol和10μg包膜质粒VSVg溶入2000μL无血清DMEM培养液，混匀，得到DNA混合液；

5.1.3将157.5μg PEI(1μg/μL)溶解于2000μL的无血清DMEM培养液中，1000rpm涡旋5秒钟，25℃孵育5min，得到PEI混合液；

5.1.4将PEI混合液加入本实施例中步骤5.1.2得到的DNA混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，25℃下孵育20min，得到转染复合物；

5.1.5将本实施例步骤5.1.4得到的转染复合物4mL滴加入含25mL DMEM培养基的15cm培养皿中，4h小时后，更换新鲜培养基；

5.1.6于48h后，收集病毒液上清，得到慢病毒上清。

5.2慢病毒的浓缩

将本实施例中5.1制备的病毒液上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50mL离心管中，加入1/4的PEG-NaCl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入RPMI 1640培养基(含10％FBS)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中，储存在-80℃。

5.3慢病毒滴度检测

将500μL Jurkat细胞(1×10⁵个细胞)接种细胞于24孔培养板，得到Jurkat细胞悬液；

将本实施例中5.2浓缩后的慢病毒悬液分别以1μL、0.2μL和0.04μL添加到Jurkat细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/mL；37℃，5％CO₂培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，400×g离心5min，弃上清收集细胞，加100μL PBS+2％FBS重悬细胞，加入1μg的PE-anti-VHH抗体，冰上孵育30min；PBS+2％FBS清洗2次后，加入300μLPBS+2％FBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；取阳性率为15％的细胞样品为宜，计算滴度，滴度为4.5×10⁸TU/mL。

滴度(TU/mL)＝细胞数量(10⁵)×阳性率/病毒体积(mL)。

实施例6慢病毒转导CD4 T细胞

本实施例，利用实施例5得到的浓缩后的慢病毒悬液转导至实施例4分选富集得到的CD4T细胞，并检测慢病毒感染效率的检测。包括以下步骤：

6.1慢病毒转导CD4 T细胞

用PBS将抗人CD3抗体和抗人CD28抗体稀释，终浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1mL PBS洗两次；用T细胞培养基(X-VIVO+10％FBS+IL-2(300U/mL))将实施例4中分选富集的CD4 T细胞调整至密度为1×10⁶/mL，然后接种到CD3和CD28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的CD4 T细胞，调整细胞密度为1×10⁶/mL，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)＝10加入实施例5制备的浓缩后的慢病毒悬液，添加polybrene至终浓度为5μg/mL；于37℃、5％CO₂环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2天进行传代，得到特异性靶向CD22的CAR-T细胞。

6.2慢病毒感染效率的检测

6.2.1、在本实施例6.1慢病毒转导CD4 T细胞后，于感染5天、8天、11天、14天后，分别计数(图10，感染病毒当天记为第0天)并取3×10⁵的T细胞，4℃、400×g离心5min，弃上清，PBS+2％FBS清洗一次；

6.2.2、加100μL PBS+2％FBS重悬细胞，加入1μg的iF488-anti-VHH抗体(购自金斯瑞)，冰上孵育30min；PBS+2％FBS清洗2次后，加入300μL PBS+2％FBS重悬细胞，以未经感染T细胞作为对照，采用流式细胞仪检测感染效率，感染病毒后第5、8、11、14天的感染效率分别见图11A、11B、11C和11D。

图10为本实施例中的CD4 T细胞感染病毒后第5、8、11、14天后的总细胞数结果图。

从图10可知，CD4 T细胞感染病毒第14天后相较于感染病毒当天增殖超过1000倍，表明分选富集的CD4 T细胞在正常T细胞培养条件下可快速增殖。

图11A、11B、11C和11D分别为本实施例中CD4 T细胞感染病毒第5天、8天、11天、14天后的感染率结果图。

从图11A、11B、11C和11D可知，CD4 T细胞感染病毒第5天、8天、11天、14天后，嵌合抗原受体能够比较稳定的表达，感染率在77.3％以上。

实施例7体外毒性和细胞因子释放实验

本实施例，利用实施例6制备的特异性靶向CD22的CAR-T细胞进行体外毒性实验和细胞因子释放实验，包括以下步骤：

7.1体外毒性实验

7.1.1、靶细胞接种

以肿瘤细胞K562-luci(CD22^-)、K562-CD22-luci(CD22⁺)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为2×10⁵/mL，取50μL接种到96孔板。

7.1.2、效应细胞接种

以实施例6制备的特异性靶向CD22的CAR-T细胞以及对照T细胞(未进行慢病毒感染)为效应细胞；按效靶比0.3:1、1:1和3:1向本实施例中步骤7.1.1接种靶细胞后的96孔板中加入CAR-T细胞及对照T细胞；

各组均设2个复孔，取2个复孔的平均值，其中实验组和对照组如下：

实验组(CD4-14 CD22-CAR)：CAR-T细胞+靶细胞；

对照组(Control CD4 T)：对照T细胞+靶细胞；

7.1.3、效应细胞与靶细胞共培养18h后，使用

萤光素酶检测试剂盒进行检测，具体检测步骤参照

萤光素酶检测试剂盒说明书，结果如图12A和12B所示。

从图12A和12B可知，本发明构建的CAR-T细胞对CD22阳性的肿瘤细胞具有较高杀伤活性，而对CD22阴性细胞无杀伤作用，说明本发明构建的特异性靶向CD22的CAR-T细胞具备高特异性，特异性靶向CD22的CAR-T细胞能够特异性的杀伤CD22阳性细胞，且杀伤作用与效靶比呈正相关。

7.2体外细胞因子释放实验

7.2.1、细胞培养上清

将本实施例中7.1中效靶比为1:1的细胞培养物于400×g离心10min去除沉淀物，取细胞培养上清置于-80℃贮存待检，细胞培养上清记为K562-CD22-luci。

同时，分别以CAR-T细胞单独培养物以及K562-luci和CAR-T的培养物作为阴性对照组。

7.2.2、试剂准备

使用联科生物ELISA试剂盒(货号为：人γ干扰素ELISA试剂盒：EK180-96)进行检测，检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃，按照使用说明配制1×洗液，1×检测缓冲液，检测抗体。

7.2.3、标准品及样品配制

标准品：使用5％1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。

样品：使用5％1640培养基按比稀释样品。

7.2.4、检测步骤

(1)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30s，弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干；

(2)加标准品：标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL 5％1640培养基；

(3)加样本：样本孔加入100μL细胞培养上清；

(4)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1：100稀释)；

(5)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育2h；

(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次；

(7)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1：100稀释)；

(8)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育45min；

(9)洗涤：重复步骤(6)；

(10)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，25℃孵育15min；

(11)加终止液：每孔加入100μL终止液，充分混匀；

(12)检测读数：使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去630nm的测定值。

图13为本实施例中IFN-γ因子分泌结果图。

从图13可知，在自发以及K562-luci和CAR-T共培养物中检测到微量IFN-γ因子，而在K562-CD22-luci与CAR-T共培养物中检测到较高含量的IFN-γ因子，表明本发明构建的特异性靶向CD22的CAR-T细胞还能够对CD22阳性的肿瘤细胞释放细胞因子而发挥杀伤功能，且具备高特异性，对CD22阴性细胞无明显细胞因子分泌。

综上所述，本发明制备得到高效靶向CD4抗原的分离抗体，该分离抗体与磁性颗粒偶联得到的抗体偶联物，能高效地从PBMC分选富集得到高纯度的CD4 T细胞，分选富集前CD4T细胞所占比例为31.9％，分选富集后，CD4 T细胞所占比例大大提升，超过90％，同时废液中的CD4 T细胞仅仅为2.38％，表明本发明的分离抗体能高效率地从PBMC中富集得到高纯度的CD4 T细胞。

此外，本发明将CD22靶向的嵌合抗原受体基因导入分选富集得到的CD4 T细胞中，制备得到特异性靶向CD22的嵌合抗原受体细胞，特异性靶向CD22的嵌合抗原受体细胞能快速增长且稳定表达，且在体外能够有效特异性靶向并杀伤CD22阳性的肿瘤细胞，并能激活细胞因子从而发挥杀伤功能，且具备高特异性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.一种分离的抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述分离抗体包括如下技术特征中的一个或多个：

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；

轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；

轻链可变区包括氨基酸序列为VAS的CDR-L2；

轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L3。

2.如权利要求1所述的分离的抗体，其特征在于，所述分离的抗体包括1)-4)中的至少一项：

1)所述重链可变区的氨基酸序列包括A1)或A2)：

A1)如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；

A2)与SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列；

2)所述轻链可变区的氨基酸序列包括B1)或B2)：

B1)如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

B2)与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有B1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列；

3)所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4：所述框架区FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNo.8所示，所述框架区FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.9所示，所述框架区FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No.10所示，所述框架区FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.11所示；

4)所述轻链可变区还包括框架区FR1-FR4：所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No.12所示，所述FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No.13所示，所述FR3的氨基酸序列包括如SEQID No.14所示，所述FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No.15所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1或2所述分离的抗体。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述分离的抗体的重链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID No.16所示序列；

和/或，编码所述分离的抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID No.17所示序列。

5.一种构建体，其特征在于，含有如权利要求3或4所述多核苷酸。

6.一种抗体的表达系统，其特征在于，所述的表达系统含有如权利要求5所述构建体或基因组中整合有外源的如权利要求3或4所述多核苷酸。

7.如权利要求1或2所述分离的抗体或如权利要求3或4所述多核苷酸或权利要求5所述构建体或如权利要求6所述表达系统在如下至少一项中的用途：

富集CD4 T细胞；

检测CD4抗原；

制备富集CD4 T细胞的产品；

制备检测CD4抗原的产品；

制备或筛选CD4相关疾病的药物。

8.一种抗体偶联物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述分离的抗体和标记物或分离辅助物；优选地，所述的标记物选自生物素、荧光素、辣根过氧化物酶中的一种或多种；优选地，所述分离辅助物选自磁珠和琼脂糖珠。

9.一种靶向CD4抗原的产品，其特征在于，所述的产品包含如权利要求1或2所述分离的抗体或如权利要求8所述抗体偶联物；优选地，所述产品选自检测试剂、试剂盒、试纸或膜条。

10.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述分离的抗体，以及药学上可接受的载体。