CN111484559A

CN111484559A - 第三代nkg2d嵌合抗原受体t或nk细胞的构建及应用

Info

Publication number: CN111484559A
Application number: CN202010139179.4A
Authority: CN
Inventors: 高基民; 魏成; 王春玲; 赵爱
Original assignee: Zhejiang Kai Xin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Kai Xin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2040-03-03
Also published as: CN111484559B

Abstract

本发明公开了一种涉及第三代NKG2D嵌合抗原受体T或NK细胞的构建及应用，主要包括全长NKG2D，41BB共刺激分子，以及CD3z，该结构不仅利用了41BB共刺激分子，而且还利用了NKG2D天然共刺激分子DAP10，其中NKG2D为NK细胞表面活化性受体，可与NKG2D的8种配体(MICA，MICB，ULBP1‑6)结合。NKG2D配体(NKG2DL)在正常细胞表面不表达或者表达量非常少，但当细胞受到病原体感染或者发生癌变或者衰老时，这些配体的表达量则会大幅度上升，使其成为理想的免疫治疗靶点。

Description

第三代NKG2D嵌合抗原受体T或NK细胞的构建及应用

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到第三代NKG2D CAR-T或CAR-NK细胞的构建与应用(以多发性骨髓瘤及非小细胞肺癌为例)。

背景技术

CAR-T或CAR-NK疗法是一种以嵌合型抗原受体(CAR)为基础的细胞免疫疗法。通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞或NK细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞或NK细胞。普通的CAR-T或CAR-NK细胞是包括膜外段单链识别抗体，跨膜段，胞内段共刺激分子(41BB，CD28等)和CD3z，NKG2D CAR-T细胞或CAR-NK细胞与其不同之处在于胞外段是由NKG2D受体组成，直接识别杀伤肿瘤细胞。

NKG2DL是NKG2D的配体，在正常细胞表面不表达或者表达量非常少，但当细胞受到病原体感染或者发生癌变或者衰老时，这些配体的表达量则会大幅度上升。NKG2D通过识别感染细胞或衰老细胞或肿瘤细胞表面NKG2DL促进NK或T细胞活化，进而裂解靶细胞。NKG2DL在各种类型的肿瘤细胞(如血液肿瘤、实体瘤)和肿瘤微环境中免疫抑制细胞(如调节性T细胞、髓源性抑制细胞)的表面表达上调。与许多靶向策略不同，NKG2D能靶向肿瘤细胞、免疫抑制细胞等微环境中支持肿瘤存活和进展的基质细胞，从而通过对肿瘤微环境的多重攻击有效诱导机体主动的抗肿瘤免疫效应。

发明内容

为解决上述背景技术中的问题和缺陷，本发明主要解决现在存在的第二代NKG2DCAR没有利用41BB/CD28共刺激分子和第三代NKG2D CAR没有利用天然DAP10共刺激分子。本发明第三代NKG2D CAR-T细胞既可以利用NKG2D天然共刺激分子DAP10，又可以利用41BB共刺激分子，增加抗肿瘤疗效。

通过基因工程技术构建plenti-CD3z-41BB-NKG2D质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转导T/NK细胞，培养五天后通过流式分别检测anti-NKG2DLs CAR的表达率，体外验证CAR-T/NK细胞对多发性骨髓瘤细胞和肺癌细胞的体外杀伤作用。

与现有技术相比，本发明涉及如下优点：

1.本发明中的第三代CAR包括完整的NKG2D分子(见SEQ ID NO.4核苷酸序列编)，41BB共刺激分子(见SEQ ID NO.3核苷酸序列编)，CD3z(见SEQ ID NO.2核苷酸序列编)。

2.本发明中的第三代CAR可利用两个共刺激分子，分别为DAP10以及41BB。

本发明中的第三代CAR-T/NK细胞在CD3z传导的第一信号和4-1BB共刺激分子和DAP10共同作为第二信号从而可提高效应细胞的活化以及杀伤效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1是靶向NKG2DL的第三代与第二代CAR结构示意图；

图2是利用第三代慢病毒包装体系制备CAR病毒颗粒，以MOI＝10感染人原代T细胞，流式细胞术检测NKG2D CAR在T细胞膜上的表达情况；

图3是表达荧光素酶以及GFP荧光报告基因的A549以及MMIS细胞株的成功构建；

图4是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下第三代NKG2D CAR-T细胞对表达荧光素酶的A549细胞的杀伤活性。

图5是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下第三代NKG2D CAR-T细胞与第二代NKG2D CAR-T细胞对表达荧光素酶的MMIS细胞的杀伤活性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例

主要实验材料：

EcoRI-HF、MluI-HF(NEB公司)，无缝克隆酶(和元生物)，高保真Prime GXL STAR酶(TAKARA公司)，TransStbl3感受态细胞(全式金生物科技有限公司)，Plasmid Mini Kit I(OMEGA)，

Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培养基、Gibco FBS(Thermo Fisher Scientific)，Sanger测序(上海桑尼生物有限公司)、酵母粉、蛋白胨、EDTA、NaOH(上海生工生物工程股份有限公司)，引物(江苏金唯智生物科技有限公司)。

一、构建重组质粒

①构建Plenti-anti-NKG2DL-CAR(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4核苷酸序列首尾连接)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，使用Ndel和MluI-HF双酶切plenti-EF1a--MCS载体以及合成的NKG2D CAR基因，使其双方均带有Ndel和MluI粘性末端，反应条件为37℃3h，65℃20min，酶切体系如表3。酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳获得载体片段，然后用XYGENE胶回收试剂盒回收Plenti载体片段以及NKG2D CAR(操作步骤见下表1)，检测浓度和纯度。载体片段和目的片段通过T4克隆(体系如表2)，16℃16-24h，65℃10min，然后进行质粒转化(T4克隆产物在冰上放置5min后，将其转入50ul TransStbl3感受态中，冰上放置30min，42℃45s，再冰上5min，加入500ul LB，在37℃，225rpm/min摇床中活化1h，然后5000rpm/min 20℃离心5min，弃去上清，将剩余菌液混匀后涂板，37℃培养12-14小时)。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用Ndel和MluI限制性内切酶酶切鉴定，最后进行Sanger测序。

表1.胶回收

表2.T4克隆体系

表3.限制性酶切体系

二、利用Plenti载体质粒及辅助质粒转导293T细胞以包装慢病毒，并将包装出的慢病毒转染Jurkat Cell以计算病毒滴度

(1)在15cm细胞皿中培养293T细胞，等待293T细胞长满至全视野70％时，用1.5mlPBS重悬60ugPEI，1.5ml PBS重悬总质量为20ug的Plenti载体质粒及辅助质粒；

(2)室温静置5min，将PBS-PEI混合液加至PBS-DNA混合液中，室温静置20min；

(3)准备OPTI-DMEM全培于37℃培养箱中复温，吸弃293T细胞中的DMEM原培养基，将OPTI-DMEM沿皿壁加入到293T细胞；

(4)将PEI-DNA-PBS混合液加至培养皿中，37℃培养48h；

(5)收集上清液中的慢病毒于50ml离心管，再加20ml培养基孵育24h，以收集72h内的病毒；

(6)1500rpm离心5min去除细胞碎片，或用针筒通过0.45um过滤器过滤后，3000×g离心12-14h，4℃以浓缩病毒；

(7)吸弃上清，以1:200-1:400加入Vivo全培或AIM-V全培(最好加1％HEPES)，重悬病毒；

(8)将病毒分装于1.5ml Ep管中，保存于-80℃，避免反复冻融(冻融使滴度降低一个数量级)，剩少许病毒用于下步的病毒滴度检测实验；

(9)jurkat细胞1500rpm离心5min后，弃上清，1ml 1640培养基重悬，计数；

(10)于96孔板中加入0.5x10⁶ jurkat细胞，以1:50、1:500、1:1000、1:2000等梯度比例加入病毒，再补充培养基至每孔总体积为200ul；

(11)每孔加入0.1ul PolybreneB蛋白促转导(0.1ul/200ul体系)；

(12)将96孔板经1200g，90min，32℃离心，离心后，于37℃培养箱孵育4h；

(13)将96孔板各孔的jurkat细胞悬液吹打混匀后转至1.5mlEp管中，1500rpm离心5min后，弃上清，用1ml 1640全培重悬后转至24孔板中扩大培养48h，37℃。

三、密度梯度离心法分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，慢病毒转染T细胞并检测T细胞表面CAR表达情况

(1)取健康人外周血10ml至EDTA-Na2抗凝管，与DPBS按照1:1的比例混匀；

(2)取四只15ml无菌离心管，分别加入5ml Ficoll分离液，将外周血与DPBS的混合液缓慢加至Ficoll分离液面上，注意不要破坏液面；

(3)水平离心800g，20min，25℃，加减速度均调到“0”；

(4)离心后用巴氏吸管将离心管中的白色絮状层即PBMC层吸出，置于新的无菌离心管中，加入PBS，将PBMC离心洗两遍；

(5)1500rpm/min，5min水平离心，弃掉上清,加入1ml Buffer1(DPBS含5％FBS)重悬计数PBMC；

(6)用流式细胞术确定PBMC中CD3阳性细胞的比例。在细胞悬液中以CD3/CD28dynabeads:CD3阳性细胞＝3:1的比例加入CD3/CD28 beads(106个CD3阳性细胞加30ulbeads)，4℃以1rpm速度旋转摇晃30min使磁株与细胞充分接触结合；

(7)30分钟以后，在试管中加足够(大于1ml)Buffer1，然后把试管放于磁力架上左右旋转1～2分钟，吸弃上清；

(8)配制Vivo完全培养基：Vivo空培+5％FBS+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1:30谷氨酰胺+1:10000IL-2+1:2000IL-7+1:2000IL-15，并用Vivo全培重悬细胞与磁珠，计数；

(9)加培养基使CD3阳性细胞浓度在0.5-1x106/ml之间。铺板细胞浓度为0.5～1.0×106/ml，置于37℃培养箱培养；

(10)T细胞培养24-36h，5％CO2，37℃；

(11)在24-36h内，以MOI值＝5、20、40、80转导CAR慢病毒载体，MOI(病毒感染复数)＝[病毒滴度x病毒体积(ml)]/细胞数；

(12)1200xg，90min，4℃离心后，在37℃培养箱孵育至96孔板长满细胞后转至24孔板中，1,3,5日计数监测细胞生长状况，绘其生长曲线，5-7天时测CAR转导率。结果如图2所示。

四，A549/MMIS-Luc细胞系建立。

A549/MMIS细胞转导表达luc-GFP慢病毒，第二天观察其GFP绿色荧光表达情况，继续培养，最后通过流式细胞术分选GFP阳性细胞，进一步进行培养，最后分析，结果如图3所示。

五.通过荧光素酶法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)培养A549/MMIS-Luc-GFP细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数；

(2)96孔平底不透明白板中加入10⁴个A549/MMIS-Luc-GFP细胞，培养基补充至100uL；

(2)第三代anti-NKG2DLCAR-T细胞与A549/MMIS-Luc-GFP细胞数比例设定为1:2、1:1、2:1、5:1，将相应的CAR-T细胞加入每孔混合培养；

(4)设置Mock细胞组，T细胞的数目与上述(3)中CAR-T细胞数相同；

(5)同时设置两个对照，阴性对照为A549/MMIS-Luc-GFP细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的Triton-X 100，两者均不加Mock细胞或CAR-T细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即Kmin和Kmax。

(6)培养24小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞；

(7)每孔加入0.5mM的D-荧光素，避光静置10min后，在酶标仪用化学发光模式(Luminometric Measurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(8)统计各孔的荧光强度值K，比较CAR-T与Mock细胞对A549/MMIS-Luc-GFP细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)x100％，结果如图4如图5所示。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 浙江启新生物技术有限公司

<120> 第三代NKG2D嵌合抗原受体T或NK细胞的构建及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

115 120 125

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

130 135 140

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Met Gly Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr

165 170 175

Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln

180 185 190

Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe

195 200 205

Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile

210 215 220

Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln

225 230 235 240

Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys

245 250 255

Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser

260 265 270

Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser

275 280 285

Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val

290 295 300

Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser

305 310 315 320

Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile

325 330 335

Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys

340 345 350

Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln

355 360 365

Arg Thr Val

370

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtgaaat tctctagaag cgctgatgcc cccgcctatc agcaaggcca gaaccagctc 60

tacaacgagc tcaatctggg cagaagagag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 120

agagatcccg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaagaggg actgtacaat 180

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggct tactccgaga tcggaatgaa gggagagagg 240

agaaggggca agggccacga cggactgtat caaggcctca gcaccgctac caaggacacc 300

tacgacgctc tgcacatgca agccctccct cccagaaag 339

<210> 3

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaggggaa gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgag gcccgtgcag 60

acaacccaag aggaagatgg ctgcagctgc agatttcccg aggaggaaga aggcggatgc 120

gagctg 126

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggctgga ttagaggaag aaggtctaga cacagctggg agatgagcga gttccacaac 60

tacaatctgg atctgaagaa gtccgacttc agcacaagat ggcaaaagca gaggtgcccc 120

gtggtgaaga gcaagtgcag agaaaacgcc tcccctttct tcttctgctg cttcattgcc 180

gtggctatgg gcattagatt catcatcatg gtggccatct ggagcgccgt ctttctgaac 240

agcctcttca accaagaggt gcagatccct ctgaccgaga gctattgcgg cccttgcccc 300

aagaactgga tttgttataa gaataattgc taccagtttt ttgacgagag caagaattgg 360

tacgagagcc aagccagctg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 420

gaggaccaag atctgctgaa gctggtgaag agctaccatt ggatgggcct cgtgcacatc 480

cctaccaacg gaagctggca gtgggaggac ggctccattc tgagccctaa tctgctgacc 540

attatcgaga tgcagaaggg cgattgcgct ctgtatgcct ccagcttcaa gggctacatc 600

gagaactgta gcacccccaa cacctacatc tgcatgcaga ggaccgtgtg a 651

Claims

1.编码的第三代嵌合抗原受体，其特征在于：包括NKG2D全长序列，41BB共刺激分子以及CD3z，所述嵌合抗原受体结构由氨基酸序列SEQ ID NO.1编码得到。

2.第三代NKG2D CAR-T或者CAR-NK细胞其特征在于：其表达一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

3.一种用于表达形成NKG2D-41BB-CD3z的第三代嵌合抗原受体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.3的核苷酸序列和SEQ ID NO.4的核苷酸序列首尾连接而成。