CN112195157A

CN112195157A - Cd19和cd22双靶点嵌合抗原受体t细胞及其应用

Info

Publication number: CN112195157A
Application number: CN202011086719.3A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 秦乐; 吴迪; 冯世忠; 冯嘉昆; 王艳艳; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Tang Chaoyang
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN112195157B

Abstract

本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体；所述信号转导结构域为4‑1BB、CD3ζ和TLR2。本发明采用串联的4‑1BB、CD3ζ和TLR2作为嵌合抗原受体的信号转导结构域，构建靶向CD19和CD22的双靶点CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞具有高效的CD19和CD22靶向活性和杀伤能力，有利于避免免疫逃逸现象。

Description

CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体T细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是靶向细胞表面抗原的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区三部分。其中，胞外抗原结合区负责识别抗原，跨膜区连接胞外抗原结合区和胞内信号区，影响导入CAR基因的表达能力，胞内信号区负责传导信号。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。

然而，医学诊断表明，某些血液肿瘤中的肿瘤细胞并不表达CD19分子，而表达CD22分子，仅利用靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗效果不佳，一段时间后部分患者出现了肿瘤复发现象。

因此，有必要开发双靶向CD19和CD22分子的嵌合抗原受体，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向和清除作用。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞可以同时靶向CD19和CD22分子，对CD19阳性和/或CD22阳性的肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用，在治疗血液恶性疾病方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；

所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体。

本发明中，将Toll样受体2(TLR2)连接在4-1BB和CD3ζ的C端作为信号转导结构域，配合CD19和CD22双靶点抗原结合结构域，构建的CAR-T细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤能力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象。

优选地，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

优选地，所述抗CD22单链抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVS。

优选地，所述抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体通过连接肽连接。

优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD8α。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB、CD3ζ和TLR2。

作为优选技术方案，本发明提供了一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD22单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQ TTAPSVYPLAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体的编码序列。

优选地，所述表达载体含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

atggcactgcctgtgactgccctgctgctccctctcgcactcctgctgcacgcagcccgcccagacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccg gtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatctgacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgacagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaactacctgaactggtaccagcagaagcccgacggcaccgtgaagctgctgatctactacaccagcatcctgcacagcggcgtgcccagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgactacagcctgaccatcagcaacctggagcaggaggacttcgccacctacttctgccagcagggcaacaccctgccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcgccttcagcatctacgacatgagctgggtgagacagacccccgagaagagactggagtgggtggcctacatcagcagcggcggcggcaccacctactaccccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaagagcgaggacaccgccatgtactactgcgccagacacagcggctacggcacccactggggcgtgctgttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaa gaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将第三方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞和/或第五方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD22阳性疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体与单靶点嵌合抗原受体相比，对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象；

(2)本发明表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤效力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性，细胞毒性低，反应温和，避免了细胞因子风暴。

附图说明

图1为WT、19-CAR-T和19-22-CAR-T对肿瘤细胞K562-CD19-GL在不同E:T比下的杀伤效率；

图2为WT、22-CAR-T和19-22-CAR-T对肿瘤细胞K562-CD22-GL在不同E:T比下的杀伤效率。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1CAR分子载体的构建

本实施例首先基因合成抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的编码基因(SEQ IDNO:4)，并在编码基因的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体。

本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR和抗CD22scFv的CAR，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，步骤如下：

将辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G与重组载体按比例混合后，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293T细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mM丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。

重组载体包括含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD22单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体。

实施例3CAR-T细胞的制备

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

分选出来的T细胞采用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/mL+链霉素0.1mg/mL)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞，即包被磁珠与T细胞以1:2比例混合，T细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞；

将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液。

本实施例构建的CAR-T细胞分别为19-22-CAR-T(表达抗CD19和CD22双靶点CAR)、19-CAR-T(表达抗CD19单靶点CAR)、22-CAR-T(表达抗CD22单靶点CAR)，同时设置WT对照组(转染空白对照eGFP慢病毒)。

实施例4体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD19的杀伤功能

将实施例3制备的WT、19-CAR-T和19-22-CAR-T分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD19-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、19-CAR-T和19-22-CAR-T对K562-CD19-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图1所示，19-CAR-T和19-22-CAR-T对K562-CD19-GL的体外杀伤效率显著高于WT。

实施例5体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD22-GL的杀伤功能

将实施例3制备的WT、22-CAR-T和19-22-CAR-T分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD22-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、22-CAR-T和19-22-CAR-T的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

结果如图2所示，22-CAR-T和19-22-CAR-T对K562-CD22-GL的体外杀伤效率显著高于WT。

综上所述，本发明构建的表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体T细胞及其应用

<130> 202009

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

145 150 155 160

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

165 170 175

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu

180 185 190

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

195 200 205

Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Pro

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile

165 170 175

Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His

210 215 220

Ser Gly Tyr Gly Thr His Trp Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245

<210> 3

<211> 914

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Asn Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

130 135 140

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr

180 185 190

Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp

225 230 235 240

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr

245 250 255

Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

275 280 285

Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val

290 295 300

Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp

305 310 315 320

Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr

325 330 335

Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

340 345 350

Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe

355 360 365

Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly

370 375 380

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys

385 390 395 400

Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys

420 425 430

Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg

435 440 445

Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu

485 490 495

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr

500 505 510

Gly Thr His Trp Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

515 520 525

Val Thr Val Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

530 535 540

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

545 550 555 560

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

565 570 575

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

580 585 590

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

595 600 605

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

610 615 620

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

625 630 635 640

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

645 650 655

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

660 665 670

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

675 680 685

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

690 695 700

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

705 710 715 720

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

725 730 735

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

740 745 750

Pro Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn

755 760 765

Ile Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp

770 775 780

Val Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe

785 790 795 800

Lys Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile

805 810 815

Asp Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val

820 825 830

Leu Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp

835 840 845

Phe Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu

850 855 860

Ile Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys

865 870 875 880

Lys Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met

885 890 895

Asp Glu Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile

900 905 910

Lys Ser

<210> 4

<211> 2742

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60

ccagacatcc agatgaccca gagccccagc accctgagcg ccagcgtggg cgaccgcgtg 120

accatcacct gccgcgccag ccagagcatc agcagctggc tggcctggta ccagcagaag 180

cccggcaagg cccccaagct gctgatctac aaggccagca gcctggagag cggcgtgccc 240

ccccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gagttcaccc tgaccatcag cagcctgcag 300

cccgacgact tcgccaccta ctactgccag cagtacaaca gcgcctacac cttcggccag 360

ggcaccaagc tggagatcaa gtccggtggc ggtggccagg tgcagctggt ggagagcggc 420

ggcggcgtgg tgcagcccgg ccgcagcctg cgcctgagct gcgccgccag cggcttcacc 480

ttcagccgcc acggcatgca ctgggtgcgc caggcccccg gcaagggcct ggagtgggtg 540

gccgtgatct ggtacgacgg cagcaaccag tactacgtgg acagcgtgaa gggccgcttc 600

accatcagcc gcgacaacag caagaacacc ctggacctgc agatgaacag cctgcgcgtg 660

gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcccgc cgcagcatca cctggtacgg cggcttcgac 720

atctggggcc agggcaccat ggtgaccgtg agcagcgccc agaccaccgc ccccagcgtg 780

taccccctgg cccccggtgg aggcggcagt ggcggaggtg ggagcggagg gggcggttcc 840

ggtggcgggg gatctgacat ccagatgacc cagaccacca gcagcctgag cgccagcctg 900

ggcgacagag tgaccatcag ctgcagagcc agccaggaca tcagcaacta cctgaactgg 960

taccagcaga agcccgacgg caccgtgaag ctgctgatct actacaccag catcctgcac 1020

agcggcgtgc ccagcagatt cagcggcagc ggcagcggca ccgactacag cctgaccatc 1080

agcaacctgg agcaggagga cttcgccacc tacttctgcc agcagggcaa caccctgccc 1140

tggaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 1200

cccggcagca gcgagggcag caccaagggc gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc 1260

ctggtgaagc ccggcggcag cctgaagctg agctgcgccg ccagcggctt cgccttcagc 1320

atctacgaca tgagctgggt gagacagacc cccgagaaga gactggagtg ggtggcctac 1380

atcagcagcg gcggcggcac cacctactac cccgacaccg tgaagggcag attcaccatc 1440

agcagagaca acgccaagaa caccctgtac ctgcagatga gcagcctgaa gagcgaggac 1500

accgccatgt actactgcgc cagacacagc ggctacggca cccactgggg cgtgctgttc 1560

gcctactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcacca cgacgccagc gccgcgacca 1620

ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 1680

ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 1740

tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1800

tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1860

caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1920

tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1980

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2040

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2100

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2160

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2220

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgccaggc caaaaggaag 2280

cccaggaaag ctcccagcag gaacatctgc tatgatgcat ttgtttctta cagtgagcgg 2340

gatgcctact gggtggagaa ccttatggtc caggagctgg agaacttcaa tccccccttc 2400

aagttgtgtc ttcataagcg ggacttcatt cctggcaagt ggatcattga caatatcatt 2460

gactccattg aaaagagcca caaaactgtc tttgtgcttt ctgaaaactt tgtgaagagt 2520

gagtggtgca agtatgaact ggacttctcc catttccgtc tttttgatga gaacaatgat 2580

gctgccattc tcattcttct ggagcccatt gagaaaaaag ccattcccca gcgcttctgc 2640

aagctgcgga agataatgaa caccaagacc tacctggagt ggcccatgga cgaggctcag 2700

cgggaaggat tttgggtaaa tctgagagct gcgataaagt cc 2742

Claims

1.一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体；

所述信号转导结构域为4-1BB、CD3ζ和TLR2。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述信号肽包括CD8α信号肽；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD8α。

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD22单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体的编码序列；

优选地，所述表达载体含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

优选地，所述表达载体包括病毒载体；

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求5所述的表达载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

7.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞；

9.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞和/或权利要求8所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括CD19阳性和/或CD22阳性疾病。