CN110256582B - 包含cd28和4-1bb的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

包含cd28和4-1bb的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4‑1BB功能区，所述4‑1BB功能区包括QEED和EEEE。本申请提供的CAR，包含了两个共刺激信号序列突变体的CAR在体外的增殖能力更强，为临床上治疗白血病提供新的肿瘤细胞药物，也为临床上用嵌合抗原疗法治疗实体瘤提供新的设计思路。

Description

包含CD28和4-1BB的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本申请涉及抗肿瘤药物制备领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，特别是，白血病、淋巴瘤等血液肿瘤的发病率居高不下。已用于临床治疗白血病和淋巴瘤的药物有KymriahTM和Yescart。它们在临床上达到了一定的治疗效果，但是，经其治疗后的白血病和淋巴瘤仍然会复发；并且存在细胞因子风暴，神经毒性等副反应。且病人的缓解率不够高，还需要桥接骨髓移植等其他治疗手段。
桥接骨髓移植也存在较大的缺陷，如符合配型要求的骨髓难以获取，移植并发症较多，移植后复发率较高等等。因此，临床上迫切需要开发新型血液肿瘤治疗手段，以便满足患者的需求。
发明内容
本申请提供一种嵌合抗原受体及其应用，可延长T细胞在体内的存续时间，改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。
第一方面，本申请实施例提供了一种嵌合抗原受体，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4-1BB功能区，所述4-1BB功能区包括QEED和EEEE。
在一些实施例中，所述肿瘤抗原结合结构域包括靶向CD19的单链抗体，所述靶向CD19的单链抗体的序列如SEQ NO:1所示；所述胞外铰链及跨膜结构域包括CD28胞外铰链及跨膜结构域；所述信号转导结构域包括CD3ζ，所述CD3ζ的序列如SEQ NO:3所示。
在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB全长序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQ NO:4所示。
在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQ NO:5所示；其中，在CD28序列和4-1BB功能区序列的组合中，CD28序列位于4-1BB功能区序列的N端。
在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为突变的CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；其中，突变的CD28为将CD28中四个连续的氨基酸突变为YMNM突变成AAAA得到的；所述的嵌合抗原受体序列如SEQ NO:6所示。
在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQ NO:7所示；其中，4-1BB功能区序列位于CD28序列的N端。
第二方面，提供了一种嵌合抗原受体表达载体，包括编码第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸。
第三方面，提供了一种表达第一方面所述的嵌合抗原受体的T细胞。
第四方面，提供了第三方面所述的T细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
在一个实施例中，所述肿瘤为血液肿瘤；所述血液肿瘤包括以下任一种：
白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
第五方面，提供了一种抗肿瘤药物，包括第三方面所述的载体或第一方面所述的T细胞。
在一个实施例中，所述肿瘤为血液肿瘤；所述血液肿瘤包括以下任一种：
白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
本申请提供的嵌合抗原受体包含了两个共刺激信号序列突变体的CAR在体外的增殖能力更强，为临床上治疗白血病提供新的肿瘤细胞药物，也为临床上用嵌合抗原疗法治疗实体瘤提供新的设计思路。
本申请改造了嵌合抗原受体的共刺激信号结构域，可刺激T细胞快速增殖，并且延长了T细胞在体内的存续时间，从而可改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。
附图说明
图1a为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB全长序列的组合的示意图；
图1b为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；
图1c为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；
图1d为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；
图2为包含本申请实施例提供的嵌合抗原受体的编码核苷酸序列的PUC57载体上的结构示意图；
图3为T细胞表达本申请实施例提供的嵌合抗原受体的结果展示图；
图4为T细胞增殖情况展示图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本申请的技术方案做进一步的详细描述。
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor gene-modified T cell，CAR-T)技术是一种新型的癌症治疗手段。CAR-T细胞是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建而成。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的发展经历了不同阶段。第一代CAR不具有共刺激信号结构域，因而CAR-T细胞的增殖效应较少，抗肿瘤效果不佳。第二代CAR含有单个共刺激信号结构域的CAR。
共刺激信号结构域是指存在于抗原提呈细胞表面，能与T细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的结构域。共刺激信号结构域一般有CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7-H3等。
含有不同共刺激信号结构域的CAR各有优缺点，有的可以刺激CAR-T细胞在体内迅速扩增，但同时也使得CAR-T细胞迅速耗竭，肿瘤复发率较高；有的虽然使得CAR-T在体内存续时间更长，但是其刺激CAR-T细胞扩增较慢，同样导致治疗效果不佳。已有的第三代CAR的共刺激信号结构域由两个共刺激因子组成，但疗效仍不佳，其原因在于已有的第三代CAR的设计不够优化。
本申请实施例提供了一种包含CD28和4-1BB的功能区的CAR，不但可刺激T细胞快速增殖，还可延长了T细胞在体内的存续时间，从而可改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。
在本申请实施例中，“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物，所述的核酸分子是合成的或重组的。
“表达载体”是指包括重组核苷酸的载体，所述重组核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)等等。
“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV和FIV等均属于慢病毒。
接下来，在各实施例中对本申请实施例提供的CAR进行具体介绍。
在进一步描述本申请具体实施方式之前，应理解，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本申请另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。
除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
本实施例提供了一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域。
在本实施例中，肿瘤抗原结合结构域可以为靶向CD19的单链抗体(single-chainantibody fragment/single-chain variable fragment，scFv)，所述靶向CD19的单链抗体的序列如SEQ NO:1所示，具体为MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS。
在本实施例中，胞内的信号转导结构域CD3zeta，序列如SEQ NO:3所示，具体为RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
在本实施例中，共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB全长序列的组合。该组合的结构可参阅图1a，4-1BB全长序列包括4-1BB功能区，4-1BB功能区包括QEED和EEEE。
为表述方便，将本实施例提供的CAR称为28BBZ。
本实施例提供的CAR可以利用两个二代CAR进行制备，该两个二代CAR的通用名称分别为为FMC28Z和FMCBBZ。具体制备过程如下。
在一个示例中，在NCBI相应数据库查找FMC28Z的核苷酸序列和FMCBBZ核苷酸序列，然后通过基因合成方法得到FMC28Z核苷酸，和FMCBBZ核苷酸。
以FMC28Z核苷酸为模板，进行PCR扩增，得到本实施例肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸。其中，正向引物(28BBZ第一正向引物)的序列如SEQ NO:8所示，具体为ttgtaaaacgacggccagtgaattcatggccttaccagtgaccgc；反向引物(28BBZ第二反向引物)的序列如SEQ NO:9所示，具体为ggagcgataggctgcgaagt。
以FMCBBZ和核苷酸为模板，进行PCR扩增，得到本实施例4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸。其中，正向引物(28BBZ第二正向引物)的序列如SEQNO:10所示，具体为cttcgcagcctatcgctcccgtttctctgttgttaaac；反向引物(28BBZ第二反向引物)的序列如SEQ NO:11所示，具体为ttgtaaaacgacggccagtgaattcttagcgagggggcagggcctg。
然后,将肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸，和4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸通过同源重组连接到PUC57载体上，以得到本实施例提供的CAR的核苷酸。其中，同源重组的所用的限制性内切酶为BamHⅠ和NotⅠ。参阅图2，其中的CSR代表共刺激信号结构域。
本实施例提供的CAR氨基酸序列如SEQ NO:4所示，具体为MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGG SGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
其中，靶向CD19的单链抗体和CD28共刺激信号域之间的接头(Linker)的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，具体为RAA。
实施例2
本实施例提供了一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域。
本实施例中，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、信号转导结构域与实施例1相同。
在本实施例中，共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合。该组合的结构可参阅图1b，其中，4-1BB功能区包括QEED和EEEE。
为表述方便，将本实施例提供的CAR称为28fBB。
本实施例提供的CAR的肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸制备同实施例1。
以FMCBBZ核苷酸为模板，进行PCR扩增，得到本实施例4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸。其中，正向引物(28fBBZ第一正向引物)的序列如SEQNO:12所示，具体为ttcgcagcctatcgctcccaaactactcaagaggaagatgc；反向引物的序列如SEQNO:11所示。
然后,将肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸，和4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸通过同源重组连接到PUC57载体上，以得到本实施例提供的CAR的核苷酸。其中，同源重组的所用的限制性内切酶为BamHⅠ和NotⅠ。参阅图2，其中的CSR代表共刺激信号结构域。
本实施例提供的CAR氨基酸序列如SEQ NO:5所示，具体为MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
实施例3
本实施例提供了一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域。
本实施例中，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、信号转导结构域与实施例1相同。
在本实施例中，共刺激信号结构域为CD28突变序列和4-1BB功能区序列的组合。该组合的结构可参阅图1c，其中，4-1BB功能区包括QEED和EEEE，CD28突变序列具体为将CD28中YMNM突变为AAAA。
为表述方便，将本实施例提供的CAR称为28fMutBB。
在本实施例中，可以将FMC28Z中CD28的YMNM对应的核苷酸序列突变为AAAA核苷酸序列，然后作为模版进行PCR扩增，得到肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸。其中正向引物如SEQ NO:8所示，反向引物如SEQ NO:9所示。
以FMCBBZ核苷酸为模板，进行PCR扩增，得到本实施例4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸。其中，正向引物(28fMutBB第一正向引物)的序列如SEQNO:13所示，具体为ttcgcagcctatcgctcccaaactactcaagaggaagatgc；反向引物的序列如SEQNO:11所示；反向引物的序列如SEQ NO:11所示。
然后,将肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及CD28共刺激信号域的核苷酸，和4-IBB的共刺激信号结构域和胞内的信号转导结构域的核苷酸通过同源重组连接到PUC57载体上，以得到本实施例提供的CAR的核苷酸。其中，同源重组的所用的限制性内切酶为BamHⅠ和NotⅠ。参阅图2，其中的CSR代表共刺激信号结构域。
本实施例提供的CAR氨基酸序列如SEQ NO:6所示，具体为MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDFAAATPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
实施例4
本实施例提供了一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域。
本实施例中，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、信号转导结构域与实施例1相同。
在本实施例中，共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合。该组合的结构可参阅图1d，其中，4-1BB功能区包括QEED和EEEE。与实施例2不同的时，本实施例的CD28序列和4-1BB功能区序列互换位置。
为表述方便，将本实施例提供的CAR称为BB28f。
在本实施例中，FMCBBZ为模板进行PCR扩增，以得到将肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及4-1BB共刺激信号域的核苷酸。其中，正向引物如SEQ NO:8所示，反向引物(BB28f第一反向引物)如SEQ NO:14所示，具体为cagttcacatcctccttcttc。
以FMC28Z为模板进行PCR扩增，以CD28的共刺激信号域的功能区和胞内的信号转导结构域的核苷酸。其中，正向引物(BB28f第二正向引物)如SEQ NO:15所示，具体为gaagaaggaggatgtgaactgaggagtaagaggagcaggctcctgcac；反向引物的序列如SEQ NO:11所示。
然后,将肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域以及4-1BB共刺激信号域的核苷酸，和CD28的共刺激信号域的功能区和胞内的信号转导结构域的核苷酸通过同源重组连接到PUC57载体上，以得到本实施例提供的CAR的核苷酸。其中，同源重组的所用的限制性内切酶为BamHⅠ和NotⅠ。参阅图2，其中的CSR代表共刺激信号结构域。
本实施例提供的CAR氨基酸序列如SEQ NO:7所示，具体为MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
需要说明的是，本申请实施例1、2、3、4的CAR也可以通过NCBI的相关数据库获取序列后，利用基因合成的方式制备得到，具体可以参考现有技术介绍，在此不再赘述。
实施例5
分别以上述实施例制备的28BBZ、28fBB、28fMutBB、BB28f为模板，进行PCR扩增，其中，正向引物(CAR正向引物)如SEQ NO:16所示，具体为catttcaggtgtcgtgattcgaattcgccgccaccatg；反向引物(CAR反向引物)如SEQ NO:17所示，具体为tgctcaccatgggtccgggattctcctc。
同时，PCR扩增EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein，增强绿色荧光蛋白)基因，其中，正向引物(EGFP正向引物)如SEQ NO:18所示，具体为ggcccctcgcggatctggagcaacaaac，反向引物(EGFP正向引物)如SEQ NO:19所示，具体为gacgcggtctagagtcgcgggatccttacttgtacagctcgtccatg。
然后通过同源重组将各个CAR分别和EGFP构建到慢病毒载体中(lenti)，EGFP用于检测CAR基因的表达，构建到慢病毒载体里用于产生慢病毒用于后续感染人原代T细胞做准备。
实施例6
在本实施例中，进行嵌合抗原受体anti-CD19-三代CAR慢病毒修饰T细胞的制备，具体步骤如下：
1)采用Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(MN公司)提取实施例5制备的各个三代CAR转染质粒和psPAX2，PMD.2G两个病毒包装质粒。三种质粒的比例按照4：3：1的比例用PEI试剂进行病毒包装，PEI与质粒的质量比为3：1。分别于转染后48小时和72小时收取病毒上清，于4℃3000rpm离心10分钟，经过0.45um的滤膜过滤后，44℃8500g离心12-16小时，将病毒浓缩两百倍后，-80度保存。
2)T细胞的制备：取新鲜的人的外周血10ml，采用人淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，同时用CD3/CD28抗体包被6孔板，CD3和CD28的浓度为1ug/ml。4℃过夜或者37℃两小时，弃掉抗体后用PBS洗残留的抗体2-3次，将分离的外周血单核细胞放在包被过的6孔板里培养48小时，同时加入200U/ml的IL-2。
3)将慢病毒感染T细胞：按照1百万(million)细胞加入100ul病毒液，然后加入polybrene(聚凝胺)，终浓度为8ug/ml，继续培养细胞。3-5天后，用流式检测感染的CAR的T的比例，结果如图3所示，其中图中纵坐标代表用Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Fab)抗体检测CAR的表达量，横坐标代表EGFP的表达量。图3显示，T细胞表面的CAR的比例大概为50％细胞以上。
实施例7
在本实施例中，验证实施例6制备的三代CAR慢病毒转染的T细胞在遇到肿瘤抗原3T3-CD19小鼠成纤维细胞的增殖情况，具体步骤如下：
在24孔板里铺上3T3-CD19细胞，用DMEM培养基培养过夜后，将实施例6制备的各个三代CAR慢病毒转染的T细胞调1million/ml，共培养一周后，继续用3T3-CD19细胞刺激PBMC细胞的增殖，结果如图4所示。由图4可知，各个三代CAR的增殖能力不同。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州普科亭生物医药有限公司
<120> 包含CD28和4-1BB的嵌合抗原受体及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
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260
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Ala Ala
1
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 4
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
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Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
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180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
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Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
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245 250 255
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405 410 415
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485 490 495
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
500 505 510
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
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530
<210> 5
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
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Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
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Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
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245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
260 265 270
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
275 280 285
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
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Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
325 330 335
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 6
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
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Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
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Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
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Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
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Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
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225 230 235 240
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
260 265 270
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
275 280 285
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Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
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Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
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Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
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Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 7
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
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225 230 235 240
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245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
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Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
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Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
340 345 350
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Ser Lys Arg Ser Arg
355 360 365
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
370 375 380
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405 410 415
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
420 425 430
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
435 440 445
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
450 455 460
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
465 470 475 480
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
485 490 495
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
500 505 510
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515
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagcgatag gctgcgaagt 20
<210> 10
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cttcgcagcc tatcgctccc gtttctctgt tgttaaac 38
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<212> DNA
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ttgtaaaacg acggccagtg aattcttagc gagggggcag ggcctg 46
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<212> DNA
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ttcgcagcct atcgctccca aactactcaa gaggaagatg c 41
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<212> DNA
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cagttcacat cctccttctt c 21
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<212> DNA
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gaagaaggag gatgtgaact gaggagtaag aggagcaggc tcctgcac 48
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catttcaggt gtcgtgattc gaattcgccg ccaccatg 38
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<211> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcccctcgc ggatctggag caacaaac 28
<210> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gacgcggtct agagtcgcgg gatccttact tgtacagctc gtccatg 47

Claims (5)

1.一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，
所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其中，4-1BB功能区序列位于CD28序列的 N端。
2.一种嵌合抗原受体表达载体，包括编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
3.一种表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的T细胞。
4.权利要求3所述的T细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
5.一种抗肿瘤药物，包括权利要求2所述的载体或权利要求3所述的T细胞。
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