CN111875711A - 一种增强型免疫细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强型免疫细胞及其应用，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体和NKG2D。本发明的嵌合抗原受体对MUC1特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用，构建的表达嵌合抗原受体的免疫细胞在靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞的同时，还调动内源NKG2D的功能，靶向具有异质性的肿瘤细胞，实现对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞的清除杀伤作用。

Description

一种增强型免疫细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种增强型免疫细胞及其应用。
背景技术
近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。
尽管CAR-T细胞可以靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞，但是很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原，肿瘤异质性是细胞疗法治疗实体肿瘤面临的一大障碍。增加嵌合抗原受体分子识别不同靶标的能力是解决以上问题的方案之一，例如可以借鉴固有免疫中的识别广谱抗原蛋白的受体构建CAR-T细胞，从而增强传统CAR-T细胞对无特异性抗原表达肿瘤的识别能力。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种增强型免疫细胞及其应用，所述增强型免疫细胞对表达特异性抗原的肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向清除杀伤作用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体和NKG2D。
本发明中，抗原结合结构域为抗MUC1单链抗体和NKG2D的嵌合抗原受体对MUC1特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用，显著增强了传统CAR分子对无特异性抗原表达肿瘤的识别能力。
优选地，所述抗MUC1单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS。
优选地，所述NKG2D包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
FNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV。
优选地，所述抗MUC1单链抗体和NKG2D通过连接肽连接。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗MUC1单链抗体、连接肽、NKG2D、CD28、OX40、DAP10、CD3ζ和TLR1串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:3：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKILCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK。
第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达第一方面所述的嵌合抗原受体的T细胞。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达第一方面所述的嵌合抗原受体的NK细胞。
第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞的步骤。
第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞在制备疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将NKG2D同抗MUC1 scFv和信号传导结构域相嵌合构建嵌合抗原受体，对MUC1特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用；
(2)本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞不仅具有靶向清除表达特异性抗原的肿瘤细胞的作用，还可以发挥内源NKG2D受体识别MICA/B抗原、ULBP家族抗原等细胞压力应激蛋白的作用，对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有显著的清除杀伤作用。
附图说明
图1为联合肿瘤抗原MUC1 scFv和内源性NKG2D的双靶点CAR分子的结构示意图；
图2为不同E:T比的CAR-T细胞对肺癌细胞的杀伤效率；
图3为不同CAR-T细胞与肺癌细胞共培养上清中IFN-γ的表达水平。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1CAR分子载体的构建
本实施例首先基因合成联合肿瘤抗原MUC1 scFv和内源性NKG2D的双靶点CAR分子(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的编码基因，并在编码基因的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；
利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到抗原结合结构域为抗MUC1 scFv和NKG2D的CAR分子，结构示意图如图1所示。
将构建好的质粒转入大肠杆菌，挑选带有目的质粒的单克隆进行过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，得到重组慢病毒载体。
本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗MUC1 scFv的CAR(antiMUC1scFv-CD28-OX40-DAP10-CD3ζ-TLR1)和NKG2D CAR(NKG2D-CD28-OX40-DAP10-CD3ζ-TLR1)，并构建相应的慢病毒载体。
实施例2慢病毒包装
本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，步骤如下：
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，配制转染试剂，取500μL opti-DMEM至15mL离心管中，加入7.2μL浓度为10μg/μL的PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(4)取500μL opti-DMEM至1.5mL离心管中，取重组慢病毒载体9μg、pMD2.G辅助质粒3μg和psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀，加入到转染试剂中，颠倒混匀，静置20min；
(5)将上述混合液全部加到293T细胞中，孵育6h后，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(6)在更换培养基24h后收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(7)24h后再次收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(9)培养基上清收集完毕后，在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，得到重组慢病毒。
重组慢病毒载体包括含有antiMUC1-NKG2D CAR的编码基因的慢病毒载体、含有antiMUC1 CAR的编码基因的慢病毒载体、含有NKG2D CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体。
实施例3T细胞激活和慢病毒转染
(1)从脐带血中分选出Pan T细胞后，对细胞进行计数，将浓度调整至1×106个/mL，随后向每毫升细胞悬液中加入10μL美天旎TransAct T细胞试剂，激活48小时后更换为新鲜培养基(IMDM培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+IL-2)；
(2)T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞。
本实施例构建的CAR-T细胞分别为antiMUC1-NKG2D-CAR-T、antiMUC1-CAR-T、NKG2D-CAR-T，同时设置WT对照组(转染空白对照慢病毒)。
实施例4体外检测CAR-T细胞对肺癌细胞的杀伤功能
将实施例3制备的antiMUC1-NKG2D-CAR-T、antiMUC1-CAR-T、NKG2D-CAR-T、WT分别与1×104个肿瘤细胞H460按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较antiMUC1-NKG2D-CAR-T、antiMUC1-CAR-T、NKG2D-CAR-T、WT对H460的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图2所示，可以看出，相对于阴性对照和仅能识别单一靶点的antiMUC1-CAR-T和NKG2D-CAR-T，协同内源NKG2D的antiMUC1-NKG2D-CAR-T对肺癌细胞也具有杀伤作用。
实施例5
将H460细胞按照5×105细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入antiMUC1-NKG2D-CAR-T、antiMUC1-CAR-T、NKG2D-CAR-T或WT，于孵箱中共培养12h；采用IFN-γELISA检测试剂盒对共培养上清进行检测。
结果如图3所示，相较于antiMUC1-CAR-T、NKG2D-CAR-T或WT与肺癌细胞的共培养上清，antiMUC1-NKG2D-CAR-T与肺癌共培养的上清中IFN-γ细胞因子的水平得到显著升高。
综上所述，本发明的嵌合抗原受体对MUC1特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用，构建的表达嵌合抗原受体的免疫细胞在靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞的同时，还调动内源NKG2D的功能，靶向具有异质性的肿瘤细胞，实现对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞的清除杀伤作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种增强型免疫细胞及其应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro
1 5 10 15
Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe
20 25 30
Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln
35 40 45
Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr
65 70 75 80
Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu
85 90 95
Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile
115 120 125
Cys Met Gln Arg Thr Val
130
<210> 3
<211> 859
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
35 40 45
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His
50 55 60
Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val
65 70 75 80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr
85 90 95
Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu
100 105 110
Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu Gly Ser Glu Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His
195 200 205
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
210 215 220
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asn Gln Glu
275 280 285
Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn
290 295 300
Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu
325 330 335
Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys
340 345 350
Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp
355 360 365
Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile
370 375 380
Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg
405 410 415
Thr Val Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
420 425 430
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
435 440 445
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
450 455 460
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
465 470 475 480
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ile Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys
565 570 575
Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
580 585 590
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
595 600 605
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
610 615 620
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
625 630 635 640
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
645 650 655
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
660 665 670
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
675 680 685
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Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp
705 710 715 720
Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly
725 730 735
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740 745 750
Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe
755 760 765
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785 790 795 800
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805 810 815
His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro
820 825 830
Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala
835 840 845
Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala Lys Lys
850 855

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体和NKG2D。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗MUC1单链抗体包括SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述NKG2D包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述抗MUC1单链抗体和NKG2D通过连接肽连接。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α；
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗MUC1单链抗体、连接肽、NKG2D、CD28、OX40、DAP10、CD3ζ和TLR1串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求5所述的编码基因的慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
8.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有权利要求5所述的编码基因；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的T细胞；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞为表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的NK细胞。
9.一种权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因导入免疫细胞的步骤。
10.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒或权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞在制备疾病治疗药物中的应用；
优选地，所述疾病包括肿瘤；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
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