JP6990244B2 - ヒトｃｄ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその応用 - Google Patents
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Description
本発明は生物医学技術または生物医薬技術の分野に属しており、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその応用に関する。
関連技術の説明
ＣＤ１２３、すなわちヒトインターロイキン３受容体α鎖（インターロイキン３受容体サブユニットアルファ、ＩＬ－３Ｒα）は、シグナルペプチドに１８個のアミノ酸（１～１８）を含み、細胞外領域に２８７個のアミノ酸（１９～３０５）を含み、膜貫通領域に２０個のアミノ酸（３０６～３２５）を含み、細胞内領域に５３個のアミノ酸（３２６～３７８）を含む全長３７８個のアミノ酸（ＮＰ＿００２１７４．１）を有する。過去２０年間にわたる研究の結果、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、及び芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含む多くの血液腫瘍でＣＤ１２３が過剰発現することがわかっている。Ｍｕｎｏｚ Ｌ ｅｔ ａｌ．は６４例の急性白血病患者を分析し、そのうち４５例のＡＭＬ患者のうちの４３例はＣＤ１２３陽性であり、ＣＤ１２３陰性はＭ７ ＡＭＬの２例であり、１３例のＢ細胞急性白血病患者はすべてＣＤ１２３陽性であったが、６例の急性Ｔ細胞白血病患者はすべてＣＤ１２３陰性であることを見出した（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００１，Ｄｅｃ；８６（１２）：１２６１－９）。Ｘｕｅｑｉａｎｇ Ｊｉ ｅｔ ａｌ．の報告によれば、健康な小児由来の骨髄リンパ球はＣＤ１２３の発現が陰性であり、９１例の小児Ｂ－ＡＬＬ患者のうち６５例由来の骨髄リンパ球はＣＤ１２３の発現が陽性であり（陽性率７１．４３％）、発現レベルが白血病細胞の成熟と負の相関をしていた（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）。またＡ Ｅｈｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．の報告によれば、ＡＭＬ患者の７９％（２３２／２９８）がＣＤ１２３分子を発現する細胞を有していた。これらの報告はすべて、ＣＤ１２３がＡＭＬの有効な血液疾患治療標的であることを示している（Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４）。
ＣＤ１２３、すなわちヒトインターロイキン３受容体α鎖（インターロイキン３受容体サブユニットアルファ、ＩＬ－３Ｒα）は、シグナルペプチドに１８個のアミノ酸（１～１８）を含み、細胞外領域に２８７個のアミノ酸（１９～３０５）を含み、膜貫通領域に２０個のアミノ酸（３０６～３２５）を含み、細胞内領域に５３個のアミノ酸（３２６～３７８）を含む全長３７８個のアミノ酸（ＮＰ＿００２１７４．１）を有する。過去２０年間にわたる研究の結果、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、及び芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含む多くの血液腫瘍でＣＤ１２３が過剰発現することがわかっている。Ｍｕｎｏｚ Ｌ ｅｔ ａｌ．は６４例の急性白血病患者を分析し、そのうち４５例のＡＭＬ患者のうちの４３例はＣＤ１２３陽性であり、ＣＤ１２３陰性はＭ７ ＡＭＬの２例であり、１３例のＢ細胞急性白血病患者はすべてＣＤ１２３陽性であったが、６例の急性Ｔ細胞白血病患者はすべてＣＤ１２３陰性であることを見出した（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００１，Ｄｅｃ；８６（１２）：１２６１－９）。Ｘｕｅｑｉａｎｇ Ｊｉ ｅｔ ａｌ．の報告によれば、健康な小児由来の骨髄リンパ球はＣＤ１２３の発現が陰性であり、９１例の小児Ｂ－ＡＬＬ患者のうち６５例由来の骨髄リンパ球はＣＤ１２３の発現が陽性であり（陽性率７１．４３％）、発現レベルが白血病細胞の成熟と負の相関をしていた（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）。またＡ Ｅｈｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．の報告によれば、ＡＭＬ患者の７９％（２３２／２９８）がＣＤ１２３分子を発現する細胞を有していた。これらの報告はすべて、ＣＤ１２３がＡＭＬの有効な血液疾患治療標的であることを示している（Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４）。
ヒトインターロイキン３（ＩＬ－３）はＣＤ１２３の天然リガンドである。ヒトＩＬ－３遺伝子は、ヒト５番染色体（５ｑ２３－３１）に位置し、分子量は約１５～１７ｋＤａである。ＩＬ－３分子は進化過程で保存されず、ヒトＩＬ－３分子とマウスＩＬ－３分子との間にはわずか２９％のアミノ酸相同性しか存在しない。ＩＬ－３とその受容体ＣＤ１２３（ＩＬ－３Ｒ）とは極めて高い親和性を有する（Ｋｄ＝０．１～１ｎＭ）。
ＤＴ３８８ＩＬ－３は、ＩＬ－３分子とジフテリアトキシンの融合タンパク質である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、ＤＴ３８８ＩＬ－３はＣＤ１２３との良好な親和性（Ｋｄ＝３ｎＭ）及び良好なＣＤ１２３抗原の選択的細胞傷害性（ＩＣ５０＝５～１０ｐＭ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２０００，Ａｕｇ；１３（８）：５７５－８１）を示し、正常細胞に対しては有意な細胞傷害性はない（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２，Ｍａｒ １５；６２（６）：１７３０－６）。マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＤＴ３８８ＩＬ－３は、有意な副作用を伴わずに、ＩＬ－３受容体陽性ＡＭＬ細胞をもつマウスの生存率を有意に増加させた（Ｌｅｕｋｅｍｉａ. ２００３ Ｊａｎ；１７（１）：１５５－９）。カニクイザルの安全性評価でも、ＤＴ３８８ＩＬ－３は良好な安全性を示した（Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２００４，Ａｕｇ；４５（８）：１６４７－５６）。ＤＴ３８８ＩＬ－３の良好な安全性はまた、ＩＬ－３とＣＤ１２３とのリガンドと受容体の相互作用を利用した疾患治療での安全性を明らかにしている。
近年、血液疾患治療の臨床試験においてキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）が有望な進歩を遂げている。２０１３年、Ｃａｒｌ．Ｈ Ｊｕｎｅが率いるグループが報告した、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ療法による小児（Ｅｍｉｌｙ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）の急性Ｂ細胞リンパ性白血病の初の完全寛解症例を皮切りに、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法はわずか数年で急速な開発段階に入った。Ｎｏｖａｒｔｉｓ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのグループによる共同開発に代表されるＣＤ１９を標的とするＣＴＬ０１９は、再発性／難治性急性リンパ性白血病（ｒ／ｒ ＡＬＬ）を患う小児及び若年成人において９０％超の完全寛解率を達成した。２０１６年８月時点で米国臨床試験登録ウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／）の情報を検索すると、全世界で１４２件、米国で７１件、中国で５１件のＣＡＲ－Ｔ臨床試験が登録されていることがわかる。現在、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、神経膠腫、結腸癌、前立腺癌などのような疾患に対するＣＡＲ－Ｔ療法に関して、包括的な研究及び製品開発が実施されている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍関連の抗原結合領域または抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される。ＣＡＲ抗原結合ドメインは通常、種々の形態の抗体で構成される。現在では、開発されるＣＡＲ－Ｔ免疫療法の大半が、ｓｃＦｖ抗体断片を基にした形態の抗原認識配列を有する。例えば、米国のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＡｂｒａｍｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ及びＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅの関連研究チームが使用した抗ヒトＣＤ１２３マウス抗体として、クローン３２７１６及びクローン２６２９２があり、クローン３２７１６はクローン２６２９２に優る、ＣＤ１２３陽性細胞を殺傷するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を示し、マウスモデルにおいて２週間以内にＣＤ１２３陽性腫瘍細胞を除去することができる（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００７，Ｓｅｐ；３０（６）：６０７－１３；ＵＳ２０１４０２７１５８２Ａ１；Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１８）：３１３８－３１４８）。フランスのＣＥＬＥＣＴＩＳはまた、ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔベクターを開発しており、それに使用されているＣＤ１２３抗体はＫｌｏｎ４３である（ＷＯ２０１５１９３４０６Ａ１）。米国臨床試験登録ウェブサイトに登録されているＡＭＬに対するＣＡＲ－Ｔ療法の臨床試験として、主にＣｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐｅのＮＣＴ０２１５９４９５及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＡｂｒａｍｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＮＣＴ０２６２３５８２が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体を基に設計されたこれらのＣＡＲ－Ｔ細胞及びその免疫療法はいずれも、選択された抗体自体の間で起こり得る交差反応性により、ＣＡＲ技術によくあるオフターゲット効果をもたらす場合がある。したがって、臨床試験においてその安全性を慎重に検証する必要がある。上記のＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔはすべて、ＣＤ１２３を標的とする分子としてマウスモノクローナル抗体を使用しているため、人体に応用した場合に潜在的な免疫原性が存在する可能性がある。
本発明は、リガンドと受容体との間の相互作用の原理に従って、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド（ＣＲＬ）を提供する。これは、ｓｃＦｖ断片抗体を基にした従来のＣＡＲと構成は異なるが、ＣＡＲのものと類似する、まったく新しい抗体依存性のヒトＣＤ１２３を標的とする構造体である。本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ（ＣＤ１２３ ＣＲＬ）は、天然のＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３特異的結合ドメイン、ヒンジ領域または非ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインなどを含み得る。本発明はさらに、ＣＲＬ改変免疫細胞、すなわちＣＤ１２３ ＣＲＬ改変Ｔ細胞（ＣＲＬ－Ｔ）を提供する。本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ及びその免疫細胞は、従来のｓｃＦｖ抗体を基にしたＣＤ１２３ ＣＡＲ－ＴよりもＣＤ１２３標的特異的腫瘍殺傷効果及び安全性に優れ、天然のヒトＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３を標的とする分子を免疫療法に用いても異種免疫原性をもたらさず、ＣＤ１２３陽性の血液疾患及び他の疾患の臨床治療に本発明は極めて有用である。
本発明の目的は、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドを提供することである。
本発明の別の目的は、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその免疫エフェクター細胞の用途を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその免疫エフェクター細胞の調製方法を提供することである。
本発明の目的は、以下の技術的解決策、すなわち、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３特異的結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドによって実現することができる。
本発明の一実施形態では、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドのＣＤ１２３特異的結合ドメインは、ＣＤ１２３に特異的に結合する配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
細胞内シグナル伝達ドメインのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２といった分子から選択することができ、好ましくはＣＤ３ゼータ分子である。
細胞内シグナル伝達ドメインの共刺激シグナル伝達ドメインは、以下のシグナル分子の細胞内ドメインから選択することができる：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（タクタイル）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦＩ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ８３特異的結合リガンドまたはそれらの組み合わせ。
より好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインは、以下の分子の細胞内シグナル伝達ドメインから選択される：ＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ、及び／またはＣＤ２８。
ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＣＤ１５２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＰＤ１、及び４－１ＢＢといった膜貫通領域から選択することができ、好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８、及び／または４－１ＢＢ膜貫通領域である。
本発明の一実施形態では、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＧＭ－ＣＳＦＲαシグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチド、またはＩＬ－３シグナルペプチドから選択することができ、好ましくはＩＬ－３シグナルペプチドであるタンパク質分泌関連シグナルペプチド配列を含む。
ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドは、ヒンジ領域構造を含んでもよく、またはヒンジ領域構造を含まず、ヒンジ領域はＣＤ８α及びＣＤ２８分子から選択することができる。
ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの細胞外領域と膜貫通領域にリンカー構造を含んでもよく、またはリンカー構造を含まない。
本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドには、直列に結合された２つ以上のＣＤ１２３キメラ受容体リガンドの繰り返し、互いが直列に結合されたＩＬ－３分子を基にした複数のＣＤ１２３結合ドメイン、または直列に結合されたＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインと抗体を基にした抗原結合ドメインとによって形成される多重標的特異的キメラ受容体リガンドの組み合わせを含んでよく、その場合、繰り返し単位の間を１つ以上のリンカー構造で連結することができる。
本発明の一実施形態では、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドは、コードされるアミノ酸配列が配列番号１４～配列番号１９で示されるか、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有する改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
核酸分子はヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドをコードするヌクレオチド配列を特徴とする。
本発明の一実施形態では、核酸分子は、ヌクレオチドコード配列が配列番号３３～配列番号３８で示されることを特徴とする。
ベクターはヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする。
遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドをコードする遺伝子配列を含む。
免疫エフェクター細胞は、好ましくは、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞を培養して分化することにより得られるＴリンパ球細胞、ＮＫ細胞、及び免疫細胞から選択され、より好ましくはＴリンパ球である。
遺伝子操作された免疫細胞は、発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３特異的結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
本発明の一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、発現するヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
本発明の一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞は、発現するヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
本発明は、上記のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその改変型免疫エフェクター細胞の調製方法を提供する。
本発明は、抗腫瘍免疫療法用の医薬品製造におけるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド及びその免疫エフェクター細胞の使用、好ましくは急性骨髄性白血病用の医薬品製造における使用に関する。
有益な効果：
本発明は、ＣＤ１２３分子を特異的標的とする細胞外結合領域としてヒトＩＬ－３分子を独創的に使用し、リガンド／受容体によって腫瘍関連表面抗原ＣＤ１２３を特異的に認識した後、細胞内共刺激分子によって細胞内に認識シグナルを転送し、免疫細胞の殺傷効果を活性化し、それによって腫瘍細胞を縮小及び排除する、ヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ（ＣＤ１２３ ＣＲＬ）を提供する。同時に、本発明は、腫瘍細胞表面のＣＤ１２３に特異的に結合することができ、それによって腫瘍細胞に対して特異的な殺傷効果を生み出すことができるヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ改変Ｔ細胞（ＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔ）を提供する。ｓｃＦｖ断片などの抗体を基にした従来のＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔは優れたＣＤ１２３標的特異的腫瘍殺傷効果及びサイトカイン放出量を示しており、その結果、標的治療の特異性及び安全性を向上させる。
本発明は、ＣＤ１２３分子を特異的標的とする細胞外結合領域としてヒトＩＬ－３分子を独創的に使用し、リガンド／受容体によって腫瘍関連表面抗原ＣＤ１２３を特異的に認識した後、細胞内共刺激分子によって細胞内に認識シグナルを転送し、免疫細胞の殺傷効果を活性化し、それによって腫瘍細胞を縮小及び排除する、ヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ（ＣＤ１２３ ＣＲＬ）を提供する。同時に、本発明は、腫瘍細胞表面のＣＤ１２３に特異的に結合することができ、それによって腫瘍細胞に対して特異的な殺傷効果を生み出すことができるヒトＣＤ１２３を標的とするＣＲＬ改変Ｔ細胞（ＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔ）を提供する。ｓｃＦｖ断片などの抗体を基にした従来のＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔは優れたＣＤ１２３標的特異的腫瘍殺傷効果及びサイトカイン放出量を示しており、その結果、標的治療の特異性及び安全性を向上させる。
本発明は、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドを提供する。
本明細書で使用される用語「ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン」とは、天然のヒトＩＬ－３アミノ酸配列由来のＣＤ１２３結合ドメインを指す。
天然のヒトＩＬ－３のアミノ酸配列は配列番号４０で示され、これには合計１５２個のアミノ酸残基を含む。天然のヒトＩＬ－３分子のＮ末端にある１９個のアミノ酸残基はＩＬ－３シグナルペプチドであり、これは配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。
天然のヒトＩＬ－３分子からシグナルペプチド部分（配列番号３）を除去すると、配列番号１の配列（１３３個のアミノ酸を含む）が得ることができる。配列番号１は、ＣＤ１２３に特異的に結合する能力を有する、ＩＬ－３受容体結合ドメイン（ＣＤ１２３結合ドメインとも称する）として使用することができる。
配列番号１のＣ末端にある９個のアミノ酸を除去すると、配列番号２（１２４個のアミノ酸を含む）を得ることができる。配列番号２の配列のみを含むＩＬ－３断片もＣＤ１２３に結合することができ、これをＩＬ－３受容体結合ドメインとして使用してもよい。
本明細書で使用される「ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン」は、ＣＤ１２３に特異的に結合する能力を有する。例えば、本発明の一実施形態では、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号１の少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、例えば１０２個、１０５個、１１０個、１１５個、または１２０個の連続するアミノ酸残基を含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号１または配列番号２であり得る。
本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドは、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインを１つ含むことも、またはＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインを２つ以上含むこともできる。これらのＣＤ１２３結合ドメインは同一であっても同一でなくてもよい。例えば、直列に結合された２つ以上のＣＤ１２３キメラ受容体リガンドの繰り返し、互いが直列に結合されたＩＬ－３分子を基にした複数のＣＤ１２３結合ドメイン、または直列に結合されたＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインと抗体を基にした抗原結合ドメインとによって形成される多重標的特異的キメラ受容体リガンドの組み合わせが存在してよく、その場合、繰り返し単位の間を１つ以上のリンカー構造で連結することができる。
本明細書で使用される用語「リンカー」（連結ペプチドまたは連結リンカーとも称する）とは、２つのドメインを連結する柔軟なアミノ酸配列である。連結ペプチドの選択及び調製は当業者にとって容易である。
本明細書で使用される用語「膜貫通領域」（ＴＭと略記）は、「膜貫通ドメイン」と同義に使用することができ、細胞膜内に固定された熱力学的に安定なタンパク質構造領域を指す。膜貫通領域は天然タンパク質から得てもよく、ＣＤ８α分子またはＣＤ２８分子から選択することができる。例えば、配列番号６または７で示されるアミノ酸配列である。
本明細書で使用される用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、細胞エフェクター機能シグナルを伝達し、特定の機能を行うように細胞を誘導することができるタンパク質構造領域を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
本明細書で使用される用語、アミノ酸配列の「同一性」は、「類似性」と同義に使用することができ、ＢＬＡＳＴなどの配列比較ソフトウェアによって決定されるアミノ酸配列間の類似性の程度を指す。アミノ酸配列を比較する方法及びソフトウェアは当業者に周知されている。
既知のアミノ酸配列に対して１つまたは複数（例えば１～１５個、例えば２個、３個、５個、８個、１０個、または１２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、及び／または付加を行うことにより改変アミノ酸配列を得ることができる。
例えば、本発明の配列番号１で示されるＣＤ１２３結合ドメインを従来のタンパク質工学技術（例えば、保存的アミノ酸置換など）によって改変し、配列番号１と少なくとも８５％（例えば、８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％）の配列同一性を有し、実質的に同一のＣＤ１２３結合能力を有する（例えば、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、さらには９５％の結合能力を保持する）変異配列を得る。
本明細書で使用される用語「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ抗体」とは、１５～２０個のアミノ酸を有する短いペプチドによって抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を結合することにより作製される一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を指す。
好ましくは、本発明によるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドはさらに細胞外シグナルペプチド構造、例えばＩＬ－３シグナルペプチドまたはＣＤ８αシグナルペプチドを含み得る。
本発明は、天然のヒトＩＬ－３分子と、共刺激因子などのキメラ受容体結合リガンド構造を組み合わせることで設計される。具体的な実施例を参照して本発明を以下でさらに説明する。
本発明は以下の通りである。
［１］ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２］前記ＣＤ１２３結合ドメインが、配列番号１の少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基を含む、上記［１］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［３］前記ＣＤ１２３結合ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１または２で示されるか、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有する改変アミノ酸配列である、上記［１］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［４］前記キメラ受容体リガンドが、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインを２つ以上含む、上記［１］または［２］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［５］前記膜貫通領域が、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＰＤ１、及び／または４－１ＢＢ膜貫通領域から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［６］前記膜貫通領域がＣＤ８α膜貫通領域である、上記［５］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［７］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、以下のシグナル分子：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３特異的結合リガンドまたはそれらの組み合わせの細胞内ドメインから選択されるシグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［８］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメイン、さらに好ましくはＣＤ３、４－１ＢＢ、及び／またはＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、上記［７］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［９］細胞外シグナルペプチド構造、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチド、ＧＭ－ＣＳＦＲαシグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチド、またはＩＬ－３シグナルペプチドを含む、上記［１］～［８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１０］前記細胞外シグナルペプチドが、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチドまたはＩＬ－３シグナルペプチド、より好ましくはＩＬ－３シグナルペプチドである、上記［９］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１１］その前記細胞外シグナルペプチドが、配列番号３で示されるＩＬ－３シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む、［９］～［１０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１２］その前記細胞外シグナルペプチドが、配列番号４で示されるＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列を含む、上記［９］～［１０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１３］前記ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドがヒンジ領域構造を含まない、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１４］前記ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドがヒンジ領域構造、好ましくはＣＤ８α分子を含む、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１５］前記ヒンジ領域が、配列番号５で示されるＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列を含む、上記［１４］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１６］前記膜貫通領域構造が、配列番号６で示されるＣＤ８α膜貫通領域のアミノ酸配列または配列番号７で示されるＣＤ２８膜貫通領域のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１７］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号８で示されるＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１６］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１８］前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号９で示される４－１ＢＢのアミノ酸配列及び／または配列番号１０で示されるＣＤ２８のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１７］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１９］コードするアミノ酸配列が配列番号１４で示されるか、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、上記［１］～［１８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２０］コードされるアミノ酸配列が配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９で示されるか、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、上記［１］～［１８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２１］上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドのヌクレオチド配列をコードする核酸分子。
［２２］前記ヌクレオチドコード配列が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８で示される、上記［２１］に記載の核酸分子。
［２３］上記［２１］または［２２］に記載の核酸分子を含むベクター。
［２４］上記［２１］または［２２］に記載の核酸分子を含む、遺伝子操作された免疫細胞。
［２５］上記［２３］に記載のベクターを含む、上記［２４］に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２６］前記免疫細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞を培養して分化することにより得たＴリンパ球細胞、ＮＫ細胞、及び免疫細胞から選択することができ、より好ましくはＴリンパ球である、上記［２４］～［２５］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２７］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、細胞外シグナルペプチド、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、上記［２４］～［２６］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２８］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［２４］～［２７］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２９］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［２４］～［２７］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［３０］上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの調製方法。
［３１］上記［２４］～［２９］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞を調製するための上記［３０］に記載の方法。
［３２］抗腫瘍薬の調製における、上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの使用、好ましくは抗悪性血液腫瘍薬の調製におけるその使用。
［３３］抗腫瘍薬の調製における、上記［２４］～［２９］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞の使用、好ましくは抗悪性血液腫瘍薬の調製におけるその使用。
本発明は以下の通りである。
［１］ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２］前記ＣＤ１２３結合ドメインが、配列番号１の少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基を含む、上記［１］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［３］前記ＣＤ１２３結合ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１または２で示されるか、またはそれと８５％～９９％、９０％～９９％、または９５％～９９％の同一性を有する改変アミノ酸配列である、上記［１］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［４］前記キメラ受容体リガンドが、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインを２つ以上含む、上記［１］または［２］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［５］前記膜貫通領域が、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＰＤ１、及び／または４－１ＢＢ膜貫通領域から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［６］前記膜貫通領域がＣＤ８α膜貫通領域である、上記［５］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［７］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、以下のシグナル分子：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３特異的結合リガンドまたはそれらの組み合わせの細胞内ドメインから選択されるシグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［８］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメイン、さらに好ましくはＣＤ３、４－１ＢＢ、及び／またはＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、上記［７］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［９］細胞外シグナルペプチド構造、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチド、ＧＭ－ＣＳＦＲαシグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチド、またはＩＬ－３シグナルペプチドを含む、上記［１］～［８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１０］前記細胞外シグナルペプチドが、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチドまたはＩＬ－３シグナルペプチド、より好ましくはＩＬ－３シグナルペプチドである、上記［９］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１１］その前記細胞外シグナルペプチドが、配列番号３で示されるＩＬ－３シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む、［９］～［１０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１２］その前記細胞外シグナルペプチドが、配列番号４で示されるＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列を含む、上記［９］～［１０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１３］前記ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドがヒンジ領域構造を含まない、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１４］前記ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドがヒンジ領域構造、好ましくはＣＤ８α分子を含む、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１５］前記ヒンジ領域が、配列番号５で示されるＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列を含む、上記［１４］に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１６］前記膜貫通領域構造が、配列番号６で示されるＣＤ８α膜貫通領域のアミノ酸配列または配列番号７で示されるＣＤ２８膜貫通領域のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１７］前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号８で示されるＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１６］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１８］前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号９で示される４－１ＢＢのアミノ酸配列及び／または配列番号１０で示されるＣＤ２８のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１７］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［１９］コードするアミノ酸配列が配列番号１４で示されるか、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、上記［１］～［１８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２０］コードされるアミノ酸配列が配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９で示されるか、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、上記［１］～［１８］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
［２１］上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドのヌクレオチド配列をコードする核酸分子。
［２２］前記ヌクレオチドコード配列が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８で示される、上記［２１］に記載の核酸分子。
［２３］上記［２１］または［２２］に記載の核酸分子を含むベクター。
［２４］上記［２１］または［２２］に記載の核酸分子を含む、遺伝子操作された免疫細胞。
［２５］上記［２３］に記載のベクターを含む、上記［２４］に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２６］前記免疫細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞を培養して分化することにより得たＴリンパ球細胞、ＮＫ細胞、及び免疫細胞から選択することができ、より好ましくはＴリンパ球である、上記［２４］～［２５］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２７］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、細胞外シグナルペプチド、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、上記［２４］～［２６］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２８］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［２４］～［２７］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［２９］前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［２４］～［２７］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞。
［３０］上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの調製方法。
［３１］上記［２４］～［２９］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞を調製するための上記［３０］に記載の方法。
［３２］抗腫瘍薬の調製における、上記［１］～［２０］のいずれかに記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの使用、好ましくは抗悪性血液腫瘍薬の調製におけるその使用。
［３３］抗腫瘍薬の調製における、上記［２４］～［２９］のいずれかに記載の遺伝子操作された免疫細胞の使用、好ましくは抗悪性血液腫瘍薬の調製におけるその使用。
実施例１ ＣＤ１２３を発現するＫ５６２細胞株Ｋ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃの構築
Ｋ５６２細胞はＣＤ１２３をほとんど発現しない。最初に本発明では、遺伝子合成によりヒトＣＤ１２３分子をコードするヌクレオチド配列を得る。遺伝子合成サービスは南京のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．が提供した。Ｔ４リガーゼの作用下、合成したＣＤ１２３ヌクレオチド配列を、事前にＢａｍＨ１及びＸｂａＩ制限部位の消化を施したｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１６４）レンチウイルスベクターと２０℃で一晩かけて連結する。ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、細菌プレートの上に広げる。複数のクローンパッチを採取してプラスミドを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍｅｇａキット）。制限酵素で消化し、配列決定して比較し、配列の一致する構築の成功したベクターをｐＬＶＸ－ＣＤ１２３－Ｐｕｒｏと命名する。
Ｋ５６２細胞はＣＤ１２３をほとんど発現しない。最初に本発明では、遺伝子合成によりヒトＣＤ１２３分子をコードするヌクレオチド配列を得る。遺伝子合成サービスは南京のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．が提供した。Ｔ４リガーゼの作用下、合成したＣＤ１２３ヌクレオチド配列を、事前にＢａｍＨ１及びＸｂａＩ制限部位の消化を施したｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１６４）レンチウイルスベクターと２０℃で一晩かけて連結する。ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、細菌プレートの上に広げる。複数のクローンパッチを採取してプラスミドを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍｅｇａキット）。制限酵素で消化し、配列決定して比較し、配列の一致する構築の成功したベクターをｐＬＶＸ－ＣＤ１２３－Ｐｕｒｏと命名する。
抽出したｐＬＶＸ－ＣＤ１２３－Ｐｕｒｏ発現プラスミドと、ｐＣＭＶ－ΔＲ－８．７４及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドとを一定の比率に従って混合し、２９３ＦＴ細胞を同時トランスフェクトする。トランスフェクションの９６時間後、ウイルスを含有する細胞培養上清を回収し、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。０．４５μｍフィルターを通して濾過した後、上清を４℃、２５０００ｒｐｍで１２０分間高速遠心分離にかける。上清を廃棄し、再懸濁して溶解させることで濃縮ウイルス液を得る。この濃縮ウイルス液を後ほど使用するため－８０℃で保存する。ホタルルシフェラーゼ／ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するレンチウイルスベクターも同様の方法で調製する。
Ｋ５６２細胞株をＡＴＣＣから購入し（カタログ番号ＣＣＬ－２４３）、９０％ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）＋１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１００９９－１４１）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１５１４０－１２２）を使用して従来通り培養する。構築したＣＤ１２３遺伝子をもつレンチウイルスベクターと、ホタルルシフェラーゼ／ルシフェラーゼレポーター遺伝子をもつレンチウイルスベクターをＫ５６２細胞の培養上清に加え、Ｋ５６２細胞に同時形質導入する。形質導入の２４時間後、最終濃度１０μｇ／ｍｌでピューロマイシンを加え、培地を３日に１回交換し、同じ濃度のピューロマイシンを加え、モノクローナルのスクリーニングをさらに実施して若干のモノクローナル細胞を得る。
上記で得られるモノクローナル細胞に対するフローサイトメトリーを用いてＣＤ１２３の発現を同定する。ＣＤ１２３遺伝子で形質導入されていないＫ５６２細胞を陰性対照として使用する。細胞数５×１０５の細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心チューブにピペットで移し、室温、３００ｇで遠心分離し、１０分後に上清を廃棄する。ＤＰＢＳを使用して再懸濁し、１回洗浄した後、２００μｌのＤＰＢＳに再懸濁する。さらに２μｌの抗ＣＤ１２３－ＦＩＴＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９８－８８６）を加え、室温で４５分間インキュベートする。１ｍｌのＤＰＢＳを加え、室温、３００ｇで遠心分離を実施し、１０分後に上清を廃棄する。１ｍｌのＤＰＢＳをさらに加え、室温、３００ｇで遠心分離を実施し、１０分後に上清を廃棄する。最後に２００μｌのＤＰＢＳ再懸濁細胞を加え、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｉｎｃ．）でＦＩＴＣシグナルを検出する。Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）を用いて次のようにルシフェラーゼアッセイを実施する。各クローンの細胞密度を２０００細胞／２０μｌに調整し、次いで３８４ウェルマイクロウェルプレートに加え、２０μｌのＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに加え、室温、３００ｇで遠心分離を実施し、１分後、プレートを１０分間静置したままにする。続いて、化学発光シグナルをＰＨＥＲＡｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧから購入）で検出する。
上記の手順によって、ＣＤ１２３分子及びルシフェラーゼを高発現する９つの安定細胞株を得る。表１に列挙するように、構築細胞株のＣＤ１２３発現の陽性率及びルシフェラーゼの相対酵素活性（ＲＬＵ、相対発光量）の検出結果は、クローン番号の異なる構築細胞株がそれぞれ異なるレベルのＣＤ１２３分子及び異なるレベルのルシフェラーゼを発現することを示している。クローン８はＣＤ１２３分子の発現レベルが最も高く、細胞の９２．９％がＣＤ１２３陽性細胞であるのに対して、形質導入されていないＫ５６２細胞のＣＤ１２３陽性率はわずか３．３１％である。同時に、クローン８のルシフェラーゼレベルも比較的高く、そのシグナル値は形質導入されていないＫ５６２細胞陰性対照の値の６５９倍（相対酵素活性７６１６２３／１１５６）である。要約すると、クローン８は優れた細胞株であり、クローン８をＫ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃと命名し、以降の実験でツール細胞として使用する。
実施例２ ヒトＩＬ－３分子を基にしたヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの構築物
本発明に従って、ヒト細胞での発現を最適化するようにヒトＩＬ－３分子のヌクレオチド配列のコドン最適化を行う。コドン最適化は、南京のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）コドン最適化技術を用いて実施する。コドン最適化後のＩＬ－３ヌクレオチド配列は配列番号３９で示され、それによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４０で示され、その遺伝子によって発現されるＩＬ－３分子は、ＩＬ－３シグナルペプチド及びＩＬ－３受容体結合ドメインを含む。
本発明に従って、ヒト細胞での発現を最適化するようにヒトＩＬ－３分子のヌクレオチド配列のコドン最適化を行う。コドン最適化は、南京のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）コドン最適化技術を用いて実施する。コドン最適化後のＩＬ－３ヌクレオチド配列は配列番号３９で示され、それによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４０で示され、その遺伝子によって発現されるＩＬ－３分子は、ＩＬ－３シグナルペプチド及びＩＬ－３受容体結合ドメインを含む。
本発明によれば、ＣＤ１２３ ＣＲＬ融合遺伝子断片は、細胞外シグナルペプチド、ＩＬ－３を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、ヒンジ領域（ヒンジ）、膜貫通領域（ＴＭ）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインの順に遺伝子をコードするように設計されている。融合遺伝子を合成する技術サービスを南京のＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．が提供している。本発明によるＩＬ－３を基にしたヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドの基本構造を表２に示す。これには、ＣＲＬ１～ＣＲＬ６で示されるキメラ受容体リガンド構造が含まれ、そのキメラ受容体リガンドの対応するアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１４～配列番号１９で示されている。
本発明によれば、従来のＣＡＲも実験対照として設計し、融合遺伝子を、ＣＤ８αシグナルペプチド、抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域（ヒンジ）、ＣＤ８α膜貫通領域（ＴＭ）、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの順に遺伝子合成技術を使用して直接合成し、それぞれＣＡＲ１、ＣＡＲ２、及びＣＡＲ３構造として表２に記載する。
本発明によって設計するＣＤ１２３ ＣＲＬの主な構造的要素及び配列は以下の通りである。
ＣＤ１２３結合ドメイン：ＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列内の少なくとも１００個の連続したアミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態では、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む。それをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号２１で示される。
細胞外シグナルペプチド：ＩＬ－３シグナルペプチドまたはＣＤ８αシグナルペプチドから選択することができる。ＩＬ－３シグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号３で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２２で示され、ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号４で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２３で示される。
ヒンジ領域：種々の分子のヒンジ領域から選択することができる。ＣＲＬ１にはＣＤ８αヒンジ領域が選択されており、そのアミノ酸配列は配列番号５で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２４で示される。
膜貫通ドメイン：ＣＤ８α膜貫通領域またはＣＤ２８膜貫通領域から選択することができる。ＣＤ８α膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号６で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２５で示され、ＣＤ２８膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号７で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２６で示される。
細胞内シグナル伝達ドメイン：ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列は配列番号８で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２７で示される。
細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン：４－１ＢＢシグナル伝達分子またはＣＤ２８シグナル伝達分子から選択される。４－１ＢＢシグナル伝達分子のアミノ酸配列は配列番号９で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２８で示される。ＣＤ２８シグナル伝達分子のアミノ酸配列は配列番号１０で示され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号２９で示される。
実施例３ ＣＤ１２３特異的キメラ受容体リガンド改変Ｔ細胞の調製
（Ｉ）ＣＤ１２３キメラ受容体リガンドのレンチウイルスベクター構築物
本発明に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したｐＬＶＸ－ＰｕｒｏベクターをＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化反応させてＣＭＶプロモーターをノックアウトし、消化されたベクターにヒトＥＦ１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４６１７．１）をクローニングしてｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクターを得る。遺伝子合成で得たＣＤ１２３ ＣＲＬ融合遺伝子配列を発現プラスミドｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αにクローニングして組換えＣＲＬ発現プラスミドを作製する。組換えＣＲＬ発現プラスミド（ｐＬＬＶ－ＣＲＬ）を抽出してｐＣＭＶ－ΔＲ－８．７４及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドと一定の比率に従って混合し、２９３ＦＴ細胞を同時トランスフェクトする。トランスフェクションの９６時間後、ウイルスを含有する細胞培養上清を回収し、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。０．４５μｍフィルターを通して濾過した後、上清を４℃、２５０００ｒｐｍで１２０分間高速遠心分離にかける。上清を廃棄し、再懸濁して溶解させることで濃縮ウイルス液を得る。この濃縮ウイルス液を後ほど使用するため－８０℃で保存する。
（Ｉ）ＣＤ１２３キメラ受容体リガンドのレンチウイルスベクター構築物
本発明に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したｐＬＶＸ－ＰｕｒｏベクターをＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化反応させてＣＭＶプロモーターをノックアウトし、消化されたベクターにヒトＥＦ１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４６１７．１）をクローニングしてｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αベクターを得る。遺伝子合成で得たＣＤ１２３ ＣＲＬ融合遺伝子配列を発現プラスミドｐＬＶＸ－ｈＥＦ１αにクローニングして組換えＣＲＬ発現プラスミドを作製する。組換えＣＲＬ発現プラスミド（ｐＬＬＶ－ＣＲＬ）を抽出してｐＣＭＶ－ΔＲ－８．７４及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドと一定の比率に従って混合し、２９３ＦＴ細胞を同時トランスフェクトする。トランスフェクションの９６時間後、ウイルスを含有する細胞培養上清を回収し、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。０．４５μｍフィルターを通して濾過した後、上清を４℃、２５０００ｒｐｍで１２０分間高速遠心分離にかける。上清を廃棄し、再懸濁して溶解させることで濃縮ウイルス液を得る。この濃縮ウイルス液を後ほど使用するため－８０℃で保存する。
上記方法を用いて得られる組換えＣＲＬレンチウイルスベクターに、それぞれｐＬＬＶ－ＣＲＬ１、ｐＬＬＶ－ＣＲＬ２、ｐＬＬＶ－ＣＲＬ３、．．．、ｐＬＬＶ－ＣＲＬ６と命名する。
実験では対照として、上記のクローン３２７１６、クローン２６２９２、及びＫｌｏｎ４３のｓｃＦｖ抗体配列を合成し、本発明によるレンチウイルスベクターにクローニングし、それぞれｐＬＬＶ－ＣＡＲ１、ｐＬＬＶ－ＣＡＲ２、及びｐＬＬＶ－ＣＡＲ３と命名する。
上記ベクターの構築には、当業者が容易に把握して操作することができる従来の分子生物学的技術、すなわち消化、ライゲーション、形質転換、及びクローニング同定技術を使用している。
（ＩＩ）Ｔリンパ球の調製
新鮮な末梢血５０ｍＬを志願者から採取し、リンパ球分離液及び密度勾配遠心分離法を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離する。Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、細胞を磁気ビーズで標識し、Ｔリンパ球を単離して精製する。さらにＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを使用して、精製Ｔ細胞でＴリンパ球の活性化及び増殖を行う。
新鮮な末梢血５０ｍＬを志願者から採取し、リンパ球分離液及び密度勾配遠心分離法を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離する。Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、細胞を磁気ビーズで標識し、Ｔリンパ球を単離して精製する。さらにＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを使用して、精製Ｔ細胞でＴリンパ球の活性化及び増殖を行う。
（ＩＩＩ）Ｔリンパ球のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔリンパ球を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁する。レンチウイルスを使用して１×１０６個の活性化Ｔリンパ球を感染させ、細胞懸濁液を６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに一晩置く。翌日、再度遠心分離を行い、培養液を新鮮な培地と交換する。２日ごとに新鮮な培地を加え、培養液の増殖を続ける。
活性化Ｔリンパ球を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁する。レンチウイルスを使用して１×１０６個の活性化Ｔリンパ球を感染させ、細胞懸濁液を６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに一晩置く。翌日、再度遠心分離を行い、培養液を新鮮な培地と交換する。２日ごとに新鮮な培地を加え、培養液の増殖を続ける。
（ＩＶ）ＣＲＬ形質導入効率の蛍光定量的リアルタイムｑＰＣＲ検出
調製したＣＲＬ－Ｔ及びＣＡＲ－Ｔ細胞を遠心分離により回収し、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトゲノム抽出キットＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから購入）を使用してゲノムＤＮＡを調製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、調製したＤＮＡのＯＤ２６０ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍの吸光度を検出し、濃度を算出する。キットＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックスプラス（Ｔｏｙｏｂｏから購入）の説明書に従って５０μｌの反応系を構成し、次いで蛍光定量的ＰＣＲ装置（ＡＢＩ＃７３００）で遺伝子コピー数を検出する。ｑＰＣＲ検出には、正確に定量された目的の断片を含有するプラスミドを陽性対照として使用し、標準曲線をプロットする。種々のコピー数濃度及び対応するコピー数でのｑＰＣＲのＣＴ値に従って、標準曲線に適合するように直線をプロットする。標準曲線のフィッティング式に従って、他の検出試料に対する相対コピー数を算出する。
調製したＣＲＬ－Ｔ及びＣＡＲ－Ｔ細胞を遠心分離により回収し、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトゲノム抽出キットＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから購入）を使用してゲノムＤＮＡを調製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、調製したＤＮＡのＯＤ２６０ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍの吸光度を検出し、濃度を算出する。キットＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックスプラス（Ｔｏｙｏｂｏから購入）の説明書に従って５０μｌの反応系を構成し、次いで蛍光定量的ＰＣＲ装置（ＡＢＩ＃７３００）で遺伝子コピー数を検出する。ｑＰＣＲ検出には、正確に定量された目的の断片を含有するプラスミドを陽性対照として使用し、標準曲線をプロットする。種々のコピー数濃度及び対応するコピー数でのｑＰＣＲのＣＴ値に従って、標準曲線に適合するように直線をプロットする。標準曲線のフィッティング式に従って、他の検出試料に対する相対コピー数を算出する。
本発明のＣＲＬ－Ｔ細胞によって発現するキメラ受容体リガンドの検出には、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現するＣＡＲを陽性対照として使用し、非形質導入Ｔリンパ球（ＵｎＴ）をブランク対照として使用する。
ＣＲＬ及びＣＡＲの組み込みコピー数の検出結果を表３に示す。結果から、ＣＲＬ１遺伝子組み込みがＣＲＬ１－Ｔ細胞ゲノムに検出され、そのコピー数（２．３４×１０５コピー／ｎｇゲノムＤＮＡ）はＣＡＲ－Ｔ細胞に形質導入されたＣＡＲ遺伝子のコピー数（３．１×１０４～２．７７×１０５コピー／ｎｇゲノムＤＮＡ）と同等であり、ブランク対照のＵｎＴ検出値は非常に低く（１６コピー／ｎｇゲノムＤＮＡ）、これはバックグラウンド検出であることがわかる。
実施例４ ＣＤ１２３分子標的リガンドキメラ受容体リガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性機能に関する試験
ＲＰＭＩ８２２６細胞は一定レベルのＣＤ１２３受容体を発現し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１８ ５２９１－ＩＬ－３ＲＡ／ｔｉｓｓｕｅ）、ＣＤ１２３分子を標的とするＣＡＲ－ＴはＲＰＭＩ８２２６細胞に対して良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を有することが報告されている（ＷＯ２０１５１９３４０６Ａ１）。本発明に従って、ルシフェラーゼを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞株を構築する（ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ）。この構築方法については実施例１で参照することができる。本発明によれば、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞をＣＲＬ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能に関する試験のためのモデル細胞として使用し、ＣＡＲ１、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３改変Ｔ細胞を対照として使用し、これらをそれぞれＣＡＲ１－Ｔ、ＣＡＲ２－Ｔ、及びＣＡＲ３－Ｔと命名する。
ＲＰＭＩ８２２６細胞は一定レベルのＣＤ１２３受容体を発現し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１８ ５２９１－ＩＬ－３ＲＡ／ｔｉｓｓｕｅ）、ＣＤ１２３分子を標的とするＣＡＲ－ＴはＲＰＭＩ８２２６細胞に対して良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を有することが報告されている（ＷＯ２０１５１９３４０６Ａ１）。本発明に従って、ルシフェラーゼを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞株を構築する（ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ）。この構築方法については実施例１で参照することができる。本発明によれば、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞をＣＲＬ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能に関する試験のためのモデル細胞として使用し、ＣＡＲ１、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３改変Ｔ細胞を対照として使用し、これらをそれぞれＣＡＲ１－Ｔ、ＣＡＲ２－Ｔ、及びＣＡＲ３－Ｔと命名する。
ＣＲＬ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びＵｎＴ細胞を標的細胞とそれぞれ２０：１の割合で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩共培養する。共培養の終了後、各細胞を遠心分離にかけ、次いでＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加する。ＰＨＥＲＡＳｔａｒ Ｐｌｕｓを使用してＲＬＵの読取値を検出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を評価する。図４ａに示すように、Ｙ軸は共培養終了後の反応ウェル中の残存する相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ、相対発光量）を示す。示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が高い場合、殺傷されていない多くの標的細胞が反応ウェル中に残存しており、ウェル内の細胞傷害性が低いことを示す。逆に、示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が低い場合、殺傷されていない標的細胞が反応ウェル中にあまり残存しておらず、ウェル内の細胞傷害性が高いことを示す。
図４ａに示すように、ＣＡＲ１－Ｔ、ＣＡＲ２－Ｔ、ＣＡＲ３－Ｔ、及びＣＲＬ１－Ｔ細胞はすべて、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対して良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を有する。ここで、ＣＡＲ１－Ｔ処置群に残存する生存細胞の相対ルシフェラーゼシグナル値は１４１３±１５２であり、ＣＡＲ２－Ｔ処置群に残存する生存細胞の相対ルシフェラーゼシグナル値は３８８３±４２３ＲＬＵであり、ＣＡＲ３－Ｔ処置群に残存する生存細胞の相対ルシフェラーゼシグナル値は３１８４±２６２であり、ＣＲＬ１－Ｔ処置群に残存する生存細胞の相対ルシフェラーゼシグナル値は４５３１±２７６であり、ＵｎＴ処置群に残存する生存細胞の相対ルシフェラーゼシグナル値が９４４２±１５５３であるのと比較して良好な殺傷活性を示している。
抗原特異的刺激下でのサイトカイン（γ－インターフェロン／ＩＦＮ－γ及びインターロイキン２／ＩＬ－２）の放出は、ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及び応用安全性を評価する指標である。良好なＣＡＲ－Ｔベクターは標的抗原の存在下で上記のサイトカインを放出できる一方、標的抗原の非存在下では放出レベルが比較的低い。図４ｂの検出結果は、ＣＡＲ１－Ｔ、ＣＡＲ２－Ｔ、ＣＡＲ３－Ｔ、及びＣＲＬ１－Ｔ細胞がすべて、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の存在下でサイトカインＩＦＮγを放出できることを示す。これらのうち、ＣＡＲ１－ＴはＣＡＲ２－Ｔ、ＣＡＲ３－Ｔ、及びＣＲＬ１－Ｔよりも優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を有するが（図４ａ）、ＣＡＲ１－ＴはＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ標的細胞の非存在下でＣＡＲ２－Ｔ、ＣＡＲ３－Ｔ、及びＣＲＬ１－Ｔによって放出されるサイトカインＩＦＮγのレベルよりも有意に高いレベルでサイトカインＩＦＮγを放出することができ、これは非特異性が比較的高いことを示す。ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ標的細胞の非存在下では、ＣＲＬ１－Ｔは、ＣＡＲ１－Ｔ、ＣＡＲ２－Ｔ、及びＣＡＲ３－Ｔよりも低いサイトカインＩＦＮγの放出量を示すと同時に、ＣＲＬ１－ＴはＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃに対してＣＡＲ２－Ｔ及びＣＡＲ３－Ｔと同等の細胞傷害性を有しおり、これは比較的良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性及び安全性を示している。
実施例５ ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔ細胞による腫瘍サイトカインの放出
本発明に従って、好ましくはＴ細胞の改変にＣＲＬ１ベクターを選択し、ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対するサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－２による刺激試験を実施する。本発明では、ＣＲＬ－Ｔ細胞及び分化標的細胞を一定比率で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩共培養する。共培養の終了後、試験用マイクロプレートを２００ｇで５分間遠心分離した後、上清の一部を慎重に取り出して、リアルタイム蛍光分解技術用キット（ＨＴＲＦ、Ｃｉｓｂｉｏ＃６４ＩＬ２ＰＥＢ）を使用して、上清中のＩＦＮ－γ及びＩＬ－２分泌レベルを検出する。
本発明に従って、好ましくはＴ細胞の改変にＣＲＬ１ベクターを選択し、ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞に対するサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－２による刺激試験を実施する。本発明では、ＣＲＬ－Ｔ細胞及び分化標的細胞を一定比率で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩共培養する。共培養の終了後、試験用マイクロプレートを２００ｇで５分間遠心分離した後、上清の一部を慎重に取り出して、リアルタイム蛍光分解技術用キット（ＨＴＲＦ、Ｃｉｓｂｉｏ＃６４ＩＬ２ＰＥＢ）を使用して、上清中のＩＦＮ－γ及びＩＬ－２分泌レベルを検出する。
図５ａに示すように、ＣＤ１２３分子を過剰発現するＫ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃの存在下では、ＣＲＬ１－Ｔ細胞が、高レベルのＩＦＮ－γ（４３８３±２３６．１ｐｇ／ｍｌ）を放出するのに対して、陰性Ｔ細胞（ＵｎＴ）の放出レベルは非常に低く（１０８．６±２３．９７ｐｇ／ｍｌ）、ベースライン（２９．７８±３７．５２ｐｇ／ｍｌ）付近である。Ｋ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃが存在しない場合には、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はベースライン（２９．７８±３７．５２ｐｇ／ｍｌ）付近の非常に低いバックグラウンドレベルのＩＦＮ－γ（１０９．３±１０．４１ｐｇ／ｍｌ）しか放出しない。ＣＤ１２３分子が低発現であるＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞によって刺激したとき、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はまた、ＵｎＴ細胞で起こるよりも高レベルのＩＦＮ－γ（６９７．４±０．００ｐｇ／ｍｌ、２６１．６±３．１ｐｇ／ｍｌ）を放出することができる（図５ｂ）。ＣＤ１２３陰性Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞によって刺激したとき、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はＵｎＴ細胞対照と同様に、どちらも低レベルのＩＦＮ－γ（３１５±０．００ｐｇ／ｍｌ、５８．５４±１１．５３ｐｇ／ｍｌ）を放出する（図５ｃ）。
図６ａに示すように、ＣＤ１２３分子を過剰発現するＫ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃの存在下では、ＣＲＬ１－Ｔ細胞は、高レベルのＩＬ－２（２．４１±０．０６ＩＵ／ｍｌ）を放出するのに対して、ＵｎＴ細胞の放出レベルは非常に低く（０．６０±０．００ＩＵ／ｍｌ）、ベースライン（０．５９±０．００ＩＵ／ｍｌ）付近である。Ｋ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃ細胞による刺激がない場合には、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はベースライン（０．５９±０．００ＩＵ／ｍｌ）と同様に非常に低レベルのＩＬ－２（０．５９±０．００ＩＵ／ｍｌ）しか放出しない。ＣＤ１２３分子が低発現であるＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞によって刺激したとき、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はまた、比較的低レベルのＩＬ－２（０．６１±０．００ＩＵ／ｍｌ）を放出する（図６ｂ）。ＣＤ１２３陰性Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞によって刺激したとき、ＣＲＬ１－Ｔ細胞はＵｎＴ細胞陰性対照と同様に、どちらも非常に低レベルのＩＬ－２（０．６０±０．００ＩＵ／ｍｌ、０．６０±０．００ＩＵ／ｍｌ）を放出する（図６ｃ）。
実施例６ ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３ ＣＲＬ－Ｔ細胞の機能及び特異性の評価
ＣＲＬ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びＵｎＴ細胞をそれぞれ標的細胞と２０：１の比率で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩共培養する。共培養の終了後、各細胞を遠心分離にかけ、次いでＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加する。ＰＨＥＲＡＳｔａｒ Ｐｌｕｓを使用してＲＬＵの読取値を検出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を評価する。図７に示すように、実施例４と同様に、Ｙ軸は共培養終了後の反応ウェル中の残存する相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を示し、これはウェル中の相対的な生存細胞数に相当する。示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が高い場合、殺傷されていない多くの標的細胞が反応ウェル中に残存しており、ウェル内の細胞傷害性が低いことを示す。逆に、示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が低い場合、殺傷されていない標的細胞が反応ウェル中にあまり残存しておらず、ウェル内の細胞傷害性が高いことを示す。
ＣＲＬ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びＵｎＴ細胞をそれぞれ標的細胞と２０：１の比率で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩共培養する。共培養の終了後、各細胞を遠心分離にかけ、次いでＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加する。ＰＨＥＲＡＳｔａｒ Ｐｌｕｓを使用してＲＬＵの読取値を検出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を評価する。図７に示すように、実施例４と同様に、Ｙ軸は共培養終了後の反応ウェル中の残存する相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を示し、これはウェル中の相対的な生存細胞数に相当する。示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が高い場合、殺傷されていない多くの標的細胞が反応ウェル中に残存しており、ウェル内の細胞傷害性が低いことを示す。逆に、示されたルシフェラーゼＲＬＵ値が低い場合、殺傷されていない標的細胞が反応ウェル中にあまり残存しておらず、ウェル内の細胞傷害性が高いことを示す。
図７に示すように、ＣＲＬ１－Ｔは、ＣＤ１２３を過剰発現するＫ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃ細胞に対して良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性効果を示し、Ｋ５６２．ＣＤ１２３．Ｌｕｃ細胞はＣＲＬ１－Ｔによって９７．５％が殺傷され、陰性対照ＵｎＴでは殺傷されない。ＣＲＬ１殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は７３０７±３６３９であり、対する陰性対照ＵｎＴ細胞殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は２９２４２０±１９１０２である（図７ａ）。ＣＲＬ１－ＴはＣＤ１２３陰性のＫ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性がほとんどない。ＣＲＬ１殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は４１１６２９±１４３９９であり、対する陰性対照ＵｎＴ細胞殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は４５８０３０±１１２２２である（図７ｂ）。図７ａ及び図７ｂは、ＣＲＬ１－Ｔの細胞傷害性が厳密な標的特異性を有することを示す。
本発明に従って、ＣＤ１２３分子が低発現である多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ及びＣＤ１２３分子を発現しない肺癌細胞株Ａ５４９．Ｌｕｃに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷実験をさらに実施する。図７ｃに示すように、実施例４と同様、ＣＲＬ１－Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞株に対して良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性効果を有し、ＣＲＬ１殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は２４６７±２３９．６であり、対する陰性対照ＵｎＴ細胞殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は１３２４８±３３１．３である。一方、ＣＲＬ１－Ｔは、ＣＤ１２３分子を発現しない肺癌細胞株Ａ５４９．Ｌｕｃに対してまったくｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を有さず、ＣＲＬ１殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は５７７３４１±１７３６５であり、対する陰性対照ＵｎＴ細胞殺傷群の残存細胞のルシフェラーゼ相対発光値は５２２８９５±１４１９８である（図７ｄ）。図７ｃ及び図７ｄはさらに、ＣＲＬ１－Ｔ細胞の細胞傷害性が厳密な標的特異性及び安全性を有することを示す。
本明細書に詳細に記載されていない実験方法はすべて当技術分野の従来技術であり、出願日に先立つ文書または技術的手段に従って実施することができる。
配列
Claims (16)
- ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドであって、前記ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインが、配列番号１の少なくとも１２０個の連続するアミノ酸残基を含むか、または、前記ＣＤ１２３結合ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１もしくは２で示されるか、もしくはそれと９０％～９９％の同一性を有する改変アミノ酸配列であり、かつ、前記ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインが、ＣＤ１２３に特異的に結合する能力を有する、キメラ受容体リガンド。
- 前記キメラ受容体リガンドが、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメインを２つ以上含む、請求項１に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- 前記膜貫通領域が、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＰＤ１、及び／または４－１ＢＢ膜貫通領域から選択される、請求項１または２に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、以下のシグナル分子：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３特異的結合リガンドまたはそれらの組み合わせの細胞内ドメインから選択されるシグナル伝達ドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- 細胞外シグナルペプチド構造を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- 前記細胞外シグナルペプチド構造がＣＤ８αシグナルペプチド、ＧＭ－ＣＳＦＲαシグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチド、またはＩＬ－３シグナルペプチドである、請求項５に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- コードするアミノ酸配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９で示されるか、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンド。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドをコードする核酸分子。
- ヌクレオチドコード配列が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８で示される、請求項８に記載の核酸分子。
- 請求項８または９に記載の核酸分子を含む、遺伝子操作された免疫細胞。
- 前記免疫細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞を培養して分化することにより得たＴリンパ球細胞、ＮＫ細胞、及び免疫細胞から選択することができる、請求項１０に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
- 前記免疫細胞がＴリンパ球細胞である、請求項１１に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
- 前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、細胞外シグナルペプチド、ＩＬ－３分子を基にしたＣＤ１２３結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
- 前記発現されるヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のヒトＣＤ１２３を標的とするキメラ受容体リガンドまたは請求項１０～１４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を含む、抗腫瘍治療に使用するための組成物。
- 前記抗腫瘍治療が抗悪性血液腫瘍治療である、請求項１５に記載の組成物。
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