CN112334479A - 用于治疗感染性疾病的共受体系统 - Google Patents

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Abstract

提供了免疫细胞(如T细胞)，所述免疫细胞包含嵌合受体(CR)、嵌合共受体(CCOR)和/或共受体(COR)。

Description

用于治疗感染性疾病的共受体系统
相关申请
本专利申请要求2018年7月13日提交的PCT/CN2018/095650和2019年5月16日提交的PCT/CN2019/087259的优先权权益，所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及免疫细胞(如T细胞)，所述免疫细胞包含可用于治疗感染性疾病如HIV的一种或多种工程化的受体。
发明背景
T细胞介导的免疫为产生抗原(Ag)特异性T淋巴细胞以消除病毒、细菌、寄生虫感染或恶性细胞的适应性过程。
暴露于Ag后，初始T细胞将成熟为活化的效应T细胞。这一过程通过呈递抗原呈递细胞(APC)表面上的Ag来进行。特别地，来自Ag(即病毒、细菌、寄生虫或恶性细胞)的抗原肽作为位于APC表面上的主要组织相容性复合物(MHC)的一部分呈递给T细胞。在T细胞表面上发现的T细胞受体(TCR)负责与MHC结合并识别所结合的肽。这一过程触发信号转导，从而引起T细胞活化和下游免疫应答。
除了TCR外，T细胞具有在其功能表征中起作用的其他细胞表面受体和标记物。例如，展示CD8的T细胞(CD8+T细胞，也称为细胞毒性或杀伤T细胞)负责靶向和破坏恶性细胞、病毒感染细胞或展示其他损伤迹象的细胞。展示CD4的T细胞(CD4+T细胞或辅助T细胞)的特征为通常有助于其他免疫细胞的功能。辅助T细胞也存在若干个子集，包括Th1、Th2和Th17。CD8+和CD4+T细胞在抗原应答和T细胞介导的免疫中发挥着重要作用，但并非免疫系统中仅有的T细胞：存在各种其他类别，包括调控性T细胞(Treg)和自然杀伤T(NKT)细胞。
CD4+T细胞可能在免疫系统中起着最重要的协调作用，在T细胞介导的免疫和B细胞介导的免疫或体液免疫中起着中心作用。在T细胞介导的免疫中，所述CD4+T细胞在CD8+T细胞的活化和成熟中发挥作用。在B细胞介导的免疫中，所述CD4+T细胞负责刺激B细胞增殖并诱导B细胞抗体类别转换。
CD4+T细胞发挥的中心作用可能从感染人免疫缺陷病毒(HIV)的后果中得到最佳说明。所述病毒为逆转录病毒，意指其携带呈RNA形式的遗传信息和逆转录酶，一旦进入宿主细胞，所述逆转录酶就允许从所述病毒RNA基因组产生DNA。DNA随后可并入受感染的宿主细胞中，此时病毒基因被转录，并且受感染的细胞产生并释放更多的病毒颗粒。
HIV优先靶向CD4+T细胞；结果，受感染患者的免疫系统受到的损害越来越大，因为免疫系统的主要协调细胞的群体大量减少。事实上，HIV发展为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的标志为患者的CD4+T细胞计数。病毒对CD4+T细胞的这种靶向也为导致受感染患者无法成功地针对各种病原体(包括机会性病原体)产生生产性免疫应答的原因。
1987年，美国食品和药品管理局(United States Food and DrugAdministration，FDA)批准了针对HIV的第一种治疗，即齐多夫定(ZDV)或叠氮胸苷(AZT)。这种药物分类为核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)。随着时间的推移，所述药物的初始成功率下降，因为病毒突变导致所述药物无法继续抑制感染。随后引入高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)以替代初始抗病毒疗法(ART)。
到20世纪90年代中期，研究者和临床医生观察到包括NRTI与蛋白酶抑制剂的组合治疗的益处。组合疗法今天仍在使用，并且有许多组合疗法可供患者使用。一般而言，组合疗法由两种NRTI加非核苷逆转录酶抑制剂(NNRIT)、蛋白酶抑制剂或整合酶抑制剂组成。总之，目前有六类药物用作组合疗法的一部分：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和整合酶抑制剂。
用各种药理学类别的药物靶向病毒防止病毒耐药性，并且已在受感染患者中显示出显著功效，但需要患者高度坚持才能确保其完全功效。事实上，不坚持可导致耐药毒株出现，从而导致在有效管控和治疗患者的疾病与后续并发症方面的进一步困难。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容特此以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本申请在一个方面中提供一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和细胞内CR信号传导结构域；以及嵌合共受体(CCOR)，所述嵌合共受体包含特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域、CCOR跨膜结构域和细胞内CCOR共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4。在一些实施方案中，所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞还包含一种或多种共受体(COR)。
在一个方面中，本发明提供一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含CR，所述CR包含特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。在其他实施方案中，所述工程化的免疫细胞还包含一种或多种COR。在一些实施方案中，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分、CCR5结合部分和抗HIV抗体部分(如广泛中和抗体(“bNAb”)部分)中的至少两者。在一些实施方案中，所述CR为包含CD4结合部分和CCR5结合部分的串联CR。在一些实施方案中，所述CR为包含CD4结合部分和抗HIV抗体部分(如bNAb部分)的串联CR。在一些实施方案中，所述CR为包含CCR5结合部分和抗HIV抗体部分(如bNAb部分)的串联CR。所述CD4部分、CCR5部分和/或bNAb部分彼此可直接或经由接头连接。
在一些实施方案中，本发明提供一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含编码CR的第一核酸，其中所述CR包含特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和细胞内CR信号传导结构域；以及编码CCOR的第二核酸，其中所述CCOR包含特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域、CCOR跨膜结构域和细胞内CCOR共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4。在一些实施方案中，所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，所述免疫细胞还包含编码一种或多种COR的一种或多种核酸。
在一些实施方案中，本发明提供一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含编码CR的核酸，其中所述CR包含特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。在一些实施方案中，所述免疫细胞还包含编码一种或多种COR的一种或多种核酸。
在根据一些或更多上述实施方案的一些实施方案中，所述CR还包含细胞内CR共刺激结构域。在其他实施方案中，所述CR不包含细胞内共刺激结构域。
在根据一个或多个上述实施方案的一些实施方案中，编码CR的核酸处于诱导型启动子下。在其他实施方案中，编码CR的核酸为组成型表达。
在根据任一个或多个上述实施方案的一些实施方案中，编码CCOR和/或COR的核酸处于诱导型启动子下。在其他实施方案中，编码CCOR和/或COR的核酸为组成型表达。在其他实施方案中，编码CCOR和/或COR的核酸可在免疫细胞活化时诱导。
在一些实施方案中，所述第一核酸和第二核酸在同一载体上。在一些实施方案中，所述第一核酸和第二核酸处于同一启动子控制下。在其他实施方案中，所述第一核酸和第二核酸在不同载体上。
在一些实施方案中，一种或多种COR编码核酸在与所述第一核酸相同的载体上。在一些实施方案中，一种或多种COR编码核酸在与所述第二核酸相同的载体上。在一些实施方案中，所述一种或多种COR编码核酸和所述第一核酸或第二核酸处于同一启动子控制下。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4。在其他实施方案中，所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种COR选自由CXCR5、α4β7和CXCR9组成的组。在一些实施方案中，所述一种或多种COR中的至少一者为CXCR5。在其他实施方案中，所述一种或多种COR中的至少一者为α4β7。在其他实施方案中，所述一种或多种COR中的至少一者为CCR9。在其他实施方案中，一种或多种COR包含α4β7和与CCR9两者。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述免疫细胞经修饰以减少或消除细胞内CCR5的表达。在一些实施方案中，通过使用选自由以下组成的组的方法使所述CCR5基因失活：CRISPR/Cas9、TALEN ZFN、siRNA和反义RNA。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述CR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fc(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至所述CR靶抗原的肽配体。在一些实施方案中，所述CR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述CCOR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fc、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CCOR靶抗原的肽配体。在一些实施方案中，所述CCOR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述细胞内CR信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在根据一个或多个上述实施方案的一些实施方案中，所述CR或CCOR共刺激结构域选自由以下组成的组：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、OX40、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、CD83和与CD83特异性结合的配体中的一者或多者的共刺激结构域。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴样细胞和肥大细胞。在一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞选自细胞毒性T细胞、辅助T细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞为细胞毒性T细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含任一上述实施方案的工程化的免疫细胞和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种不同类型的工程化的免疫细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗个体的感染性疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的上述药物组合物。在一些实施方案中，所述感染性疾病为由选自HIV和HTLV的组的病毒感染。在一些实施方案中，所述感染性疾病为HIV。
在上述方法的一些实施方案中，所述个体为人。
在一些实施方案中，本发明还提供一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括提供免疫细胞群体和将编码CR的第一核酸引入所述免疫细胞群体中。
在一些实施方案中，将编码CCOR的第二核酸引入免疫细胞群体中。在一些实施方案中，将所述第一核酸和第二核酸同时引入细胞中。在其他实施方案中，将所述第一核酸和第二核酸依序引入细胞中。在一些实施方案中，将编码一种或多种COR的一种或多种核酸引入免疫细胞群体中。在一些实施方案中，所述第一核酸和第二核酸和/或COR编码核酸经由病毒载体引入细胞中。
在一些实施方案中，制备工程化的免疫细胞的方法还包括使细胞中的CCR5基因失活。在一些实施方案中，通过使用选自由以下组成的组的方法使所述CCR5基因失活：CRISPR/Cas9、TALEN ZFN、siRNA和反义RNA。在一些实施方案中，所述免疫细胞群体从个体的外周血获得。在一些实施方案中，所述免疫细胞群体进一步富集CD4+细胞。在其他实施方案中，所述免疫细胞群体进一步富集CD8+细胞。
本文所引用的所有参考文献、包括专利申请和出版物以引用的方式整体并入本文。
附图说明
图1A和图1B示出具有不同抗原结合结构域(包括抗CCR5/CXCR4和抗CD4)的若干示例性受体分子的示意性图示。
图2A和图2B示出靶向构建体加CXCR5表达的示例性通用抗原(图2B)和特异性抗原(HIV)(图2A)的示意性图示。
图3A和3B示出靶向构建体加CCR9和α4β7的示例性通用抗原(图3B)和特异性抗原(HIV)(图3A)的示意性图示。
图4示出靶向构建体加CCR5基因敲除的示例性HIV的示意性图示。
图5示出靶向构建体加CCR9和α4β7加CXCR5加CCR5基因敲除的示例性HIV的示意性图示。
图6A和图6B示出含有抗CD4或抗CCR5或抗CXCR4 scFv或sdAb(图6A)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图6B)的示例性CAR构建体的示意性图示。图6C示出含有串联连接至识别HIV的广泛中和抗体的抗CD4或抗CCR5 scFv或sdAb的示例性CAR构建体的示意性图示。
图7示出带有不同scFv序列的CAR-T的体外筛选结果。图7A示出14种抗CCR5 CAR-T的相对靶标杀死效应。图7B示出16种抗CD4 CAR-T的相对靶标杀死效应。图7C示出8种抗CXCR4细胞的相对靶标杀死效应。
图8A-8E示出多种构建体的CAR表达。8A：与未转导的T细胞相比，13号抗CD4-CART细胞上的CAR表达；图8B：与未转导的T细胞相比，13号抗CCR5-CAR T细胞上的CAR表达；图8C：表达CXCR5的抗CD4-CAR T细胞上的CAR表达。图8D：表达CXCR5的抗CCR5-CAR T细胞上的CAR表达；图8E：抗CD4/抗CCR5串联CAR T细胞、抗CD4/抗CCR5串联CAR-CXCR5 T细胞、抗CD4/抗CCR5串联CAR-CXCR5-C34 T细胞上的CAR表达。
图9示出体外13号抗CD4 CART细胞的增殖。在第0天用CAR慢病毒转导5×105个细胞。在转导后第4天、第6天和第10天对细胞进行计数。
图10A-F示出多种CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性效应。使用CFSE标记的pan T细胞作为靶细胞。图10A：13号抗CD4 CART细胞；图10B：13号抗CCR5 CART细胞；图10C：表达CXCR5的抗CD4 CART细胞；图10D：表达CXCR5的抗CCR5 CAR T细胞；图10E：抗CD4-抗CCR5串联CART细胞；图10F：抗CD4-抗CCR5串联CAR T细胞与抗CD4/抗CCR5串联CAR-CXCR5-C34 T细胞之间的比较。
图11示出13号抗CD4 CAR T细胞的细胞因子表达。将效应13号抗CD4 CAR T细胞与靶细胞以2:1和0.5:1比率共培养24小时。收集细胞培养物的上清液并且通过均相时间解析荧光(HTRF)测定检测上清液中的细胞因子水平。
图12A和图12B示出含有抗CD4或抗CCR5 scFv或sdAb(图12A)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图12B)的示例性eTCR的示意性图示。图12C示出13号CD4 CAR-T、CD4eTCR、11号CD4 eTCR的相对靶细胞杀死能力。图12D示出若干CCR5 eTCR细胞的相对靶细胞杀死能力。
图13示出eTCR T细胞表征的结果。图13A示出抗CD4 eTCR-T和抗CCR5 eTCR-T细胞上的转导基因表达的检测。图13B示出抗CD4 eTCR-T T细胞的细胞因子表达。将效应抗CD4eTCR T细胞与靶细胞以2:1和0.5:1比率共培养24小时。收集来自细胞培养物的上清液并且通过HTRF测定检测上清液中的细胞因子水平。图13C示出体外抗CD4 eTCR-T细胞的扩增。在第0天用eTCR慢病毒转导5×105个细胞。在转导后第4天、第6天和第10天对细胞进行计数。
图14A和图14B示出抗CD4和抗CCR5 eTCR-T细胞的细胞毒性效应。将抗CD4 eTCR T细胞、抗CCR5 eTCR T细胞或对照UnT细胞与CFSE标记的原代T细胞以2:1比率共培养24小时。通过流式细胞术记录CFSE+细胞中的CD4+％(A)或CCR5+％(B)。
图15A-15D示出含有抗CD4或抗CCR5 scFv或sdAb(图15A和15C)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图15B和15D)的示例性CAR或eTCR的示意性图示。CAR T细胞或eTCR T细胞进一步表达CXCR5。
图16A和16B示出CD4-CART-CXCR5细胞和CCR5-CART-CXCR5细胞上的CXCR5的表达。
图17A-D示出含有抗CD4或抗CCR5 scFv或sdAb(图17A和17C)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图17B和17D)的示例性CAR或eTCR的示意性图示。CAR T细胞或eTCRT细胞进一步表达CXCR5和广泛中和抗体。
图18A和18B示出抗CD4 CAR T细胞对控制病毒载量的效应。图18A：将13号抗CD4CAR T细胞与无病毒靶细胞或HIV假病毒感染的靶细胞以1:1比率共培养24小时。使用抗CD19 CAR-T(SEQ ID NO.77)细胞作为对照CAR-T。通过实时PCR检测靶细胞的剩余量。图18B：将13号抗CD4 CAR T细胞或未转导的T细胞与EGFP+假感染的靶细胞以所指示比率共培养24小时。通过流式细胞术检测EGFP+靶细胞。
图19示出CAR-T对控制猿猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)感染的效应。从猴外周血纯化恒河猴CD4+T细胞并用抗CD3/CD28珠粒活化4天，然后将其用SHIVSF162P3激发。使用SHIV感染的细胞作为靶细胞并与13号抗CD4 CART、13号抗CCR5 CART和串联抗CD4/抗CCR5 CAR-T细胞共培养3天。图19A示出通过细胞内染色的病毒p27抗原的存在。图19B示出细胞培养物上清液中的病毒RNA水平和基因组DNA中的整合DNA水平。
图20A和20B示出13号抗CD4 CAR T细胞以剂量依赖性方式杀死T细胞淋巴瘤细胞系(SupT1和HH)。
图21A和21B示出13号抗CD4 CAR T细胞的体内功效。将CDX小鼠分成3组：使第1组小鼠接受HBSS，使第2组小鼠接受对照unT细胞，并且使第3组小鼠接受13号抗CD4 CAR T处理。图21A示出肿瘤体积。图21B示出处理后的小鼠体重。
图22A示出T细胞表面上分离信号CAR构建体的表达。在ssCCR5CD4 CAR T细胞中，抗CCR5部分连接至HA标签和CD3ζ细胞内结构域，并且抗CD4部分连接Myc标签和细胞内共刺激结构域。在ssCD4CCR5 CAR T细胞中，抗CD4部分连接至HA标签和CD3ζ细胞内结构域，并且抗CCR5部分连接Myc标签和细胞内共刺激结构域。所述两部分通过P2A连接。UNT代表未转导的T细胞。Myc标签的表达在此图中显示为分离信号CAR系统表达的代表。图22B示出构建体的细胞毒性效应。将CAR T细胞或UNT细胞与CFSE标记的靶细胞以0.5:1比率共培养24小时。
图23A-23C示出CAR T疗法的体内效应。图23A示出在用13号抗CCR5 CAR T细胞处理的HIS小鼠中在不同时间点CCR5+细胞的百分比。图23B示出在用串联抗CD4抗CCR5 CAR T细胞处理的HIS小鼠中CCR5+细胞的百分比。图23C示出在用串联抗CD4抗CCR5 CAR T细胞处理的HIS小鼠中CD4+细胞的百分比。
具体实施方式
本申请提供免疫细胞(如T细胞)，所述免疫细胞表达嵌合受体(“CR”)，所述嵌合受体特异性地识别选自CCR5(或CXCR4)和CD4中任一者的CR靶抗原，和能够活化免疫细胞的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，当CR不含共刺激结构域时，CR可与含有CCOR共刺激结构域并且特异性地识别CCR5(或CXCR4)或CD4(CCOR靶抗原)中的另一者的嵌合共受体(“CCOR”)共表达。因此，CCOR提供结合CCOR靶抗原时所需的共刺激，从而确保免疫细胞仅在CR靶抗原和CCOR靶抗原两者存在并且由免疫细胞识别时活化。免疫细胞可进一步表达一种或多种共受体(“COR”)，例如促进免疫细胞迁移至所需位置、如滤泡(CXCR5受体)和肠(α4β7受体或CCR9受体)的共受体。另外，免疫细胞可进一步经修饰以减少或敲除CCR5受体的表达，由此增加免疫细胞(如CD4+免疫细胞)对病毒感染的抗性。
因此，本发明在一个方面中提供包含CR和CCOR的免疫细胞。在另一方面中，提供包含CR和COR的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含CR、CCOR和一种或多种COR。在一些实施方案中，免疫细胞进一步经修饰以减少或敲除CCR5的表达。
还提供表达免疫细胞中的CR、CCOR和/或COR的核酸系统。
还提供制备和使用工程化的免疫细胞用于治疗目的的方法以及可用于此类方法的药盒和制品。
定义
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出所需生物活性即可。
术语“天然抗体”、“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用并且是指实质上完整形式的抗体，而非如下文所定义的抗体片段。所述术语尤其指具有含Fc区的重链的抗体。天然抗体通常为约150,000道尔顿(Dalton)的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量有所变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，其后为许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，并且在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”是指相对于免疫球蛋白的另一部分，即含有抗原结合位点的可变结构域，免疫球蛋白分子的具有更保守氨基酸序列的部分。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。所述结构域通常为抗体的最可变部分并且含有抗原结合位点。
术语“可变”是指可变结构域的某些部分的序列在抗体之间差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在抗体的可变结构域中。其集中在轻链与重链可变结构域中称为超变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β折叠构型，由三个HVR连接，其形成连接β折叠结构并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。每条链中的HVR通过FR区紧密结合在一起，并与另一条链的HVR一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配给两种明显不同类型(称为κ(“κ”)和λ(“λ”))中的一者。
如本文使用的术语IgG“同种型”或“子类”意指由免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征定义的任一免疫球蛋白子类。
取决于抗体重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可分配给不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干类可进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的，并总体描述于例如Abbas等人,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。抗体可为较大融合分子的一部分，所述较大融合分子通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用来指呈实质上完整形式的抗体，而非如下文所定义的抗体片段。所述术语尤其指具有含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区域。在一些实施方案中，本文所述的抗体片段为抗原结合片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点)和残余“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”为含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用以界定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总之，六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性HVR的Fv的一半)具有识别并结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。
Fab片段含有重链和轻链可变结构域并且也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中为Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初以成对Fab'片段的形式产生，其间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也为已知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含介于VH与VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies.Springer Berlin Heidelberg,1994.269-315。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而不能使同一链上的两个结构域配对的接头，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可为二价或双特异性的。双抗体更全面描述于例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指功能性抗体，其包含重链，但缺乏抗体中常见的轻链。已知骆驼科动物(如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。在一些情况下，单结构域抗体由骆驼科HCAb工程化而成，并且此类sdAb在本文中称为“纳米抗体”或“VHH”。骆驼科sdAb为已知最小的抗原结合抗体片段之一(例如，参见Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从实质上同源的抗体群体获得的抗体，例如，除了可能的突变(例如，可能以少量存在的天然存在的突变)之外，构成所述群体的个别抗体为相同的。因此，修饰词“单克隆”指示抗体的特征为非离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过包括从多个多肽序列选择单个靶结合多肽序列的过程获得。例如，选择过程可为从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的汇集物)选择独特的克隆。应理解，可进一步改变所选靶结合序列，例如以提高对靶标的亲和力，使靶结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也为本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体制剂除了其特异性之外，其优势在于其通常不会被其他免疫球蛋白污染。
修饰词“单克隆”指示抗体的特征为从实质上同源的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein,Nature 256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma 14(3):253-260(1995)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人,MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(例如，参见美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(例如，参见Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))和用于在动物中产生人或人样抗体的技术，所述动物具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因(例如，参见WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合抗体”，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，以及所述抗体的片段，只要其表现出所需生物活性即可(例如，参见美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
Figure BDA0002850850190000181
抗体，其中抗体的抗原结合区域源自通过例如用目标抗原对猕猴进行免疫产生的抗体。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式为含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基被来自非人物种(供体抗体)HVR的具有所需特异性、亲和力和/或能力的残基替代，所述非人物种为例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个可变结构域、通常为两个可变结构域，其中所有或实质上所有的超变环都对应于非人免疫球蛋白的那些超变环，并且所有或实质上所有的FR都为人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”为具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用如本文所公开的制备人抗体的任一技术制备的抗体。人抗体的这一定义具体排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991)。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991)中所述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可通过向转基因动物施用抗原来制备，所述转基因动物已经修饰以响应于抗原激发产生所述抗体，但其内源基因座已禁用，例如免疫的异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)。
如本文所用，术语“结合”、“特异性地结合至”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其决定了在包括生物分子在内的异质分子群体存在下靶标的存在。例如，结合或特异性地结合至靶标(其可为表位)的抗体为以比结合至其他靶标更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合此靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定(RIA)测量的抗体与靶标结合的约10％。在某些实施方案中，特异性地结合至靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性地结合至蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中为保守的。在另一实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指遗传工程化的受体，其将一种或多种抗原特异性移植至细胞如T细胞上。CAR也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，CAR包含对肿瘤抗原具有特异性的抗体的细胞外可变结构域，以及T细胞或其他受体的细胞内信号传导结构域，如一个或多个共刺激结构域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。
如本文所用的“T细胞受体”或“TCR”是指内源性或重组T细胞受体，其包含细胞外抗原结合结构域，所述结构域结合至在MHC分子中结合的特异性抗原肽。在一些实施方案中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施方案中，TCR特异性地结合肿瘤抗原。
术语“重组”是指以下生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然环境中去除，(2)不与在自然界中发现所述基因的多核苷酸的全部或一部分相关联，(3)可操作地连接至在自然界中不连接的多核苷酸，或者(4)在自然界中不存在。术语“重组”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
术语“表达”是指将核酸翻译成蛋白质。蛋白质可在细胞内表达并保留，成为细胞表面膜的组分，或者分泌至细胞外基质或培养基中。
术语“宿主细胞”是指可支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可为原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞。
如本文使用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞为已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。
术语“体内”是指获得细胞的生物体内部。“离体”或“体外”是指获得细胞的生物体外部。
术语“细胞”包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用与表达CD3的细胞相关的“”活化是指已经充分刺激以诱导CD3信号传导途径下游效应子功能的可检测增加的细胞状态，包括但不限于细胞增殖和细胞因子产生。
当提及蛋白质的一部分时，术语“结构域”意图包括构成蛋白质的一种或多种多肽的结构和/或功能相关部分。例如，二聚体受体的跨膜结构域可指受体的每个多肽链的跨越膜的部分。结构域也可指单个多肽链的相关部分。例如，单体受体的跨膜结构域可指受体的单个多肽链的跨越膜的部分。结构域也可仅包括多肽的单个部分。
如本文所用的术语“分离的核酸”意图指基因组、cDNA或合成来源或它们的一些组合的核酸，由于其来源，“分离的核酸”(1)不与在自然界中发现“分离的核酸”的多核苷酸的全部或一部分相关联，(2)可操作地连接至在自然界中不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分出现。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，只要编码蛋白质的核苷酸序列可在某种型式中含有一个或多个内含子即可。
术语“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列为连续的，并且在必要时在同一个阅读框中连接两个蛋白质编码区。
术语“诱导型启动子”是指其活性可通过添加或去除一个或多个特定信号来调控的启动子。例如，诱导型启动子可在一组特定条件下、例如在活化启动子和/或减轻启动子抑制的诱导剂或条件的存在下活化可操作地连接的核酸的转录。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”为获得有益或所需结果、包括临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：减轻由疾病引起的一种或多种症状，降低疾病的程度，稳定疾病(例如，防止或延迟疾病的恶化)，防止或延迟疾病的扩散(例如转移)，防止或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高或改善生活质量，增加体重增加和/或延长存活时间。“治疗”还涵盖减少疾病的病理后果(如癌症中的肿瘤体积)。本发明的方法考虑治疗的这些方面中的任一者或多者。
术语“治疗有效量”是指如本文所公开的组合物的有效“治疗”个体的疾病或病症的量。在感染性疾病的情况下，治疗有效量的组合物包含可改善患者疾患的组合物。
如本文所用，“药学上可接受”或“药理学上相容”意指并非在生物学上或其他方面不合意的材料，例如所述材料可并入施用至患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物的任一其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药品管理局编制的非活性成分指南中。
用于治疗目的的“受试者”或“个体”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。
应理解，本文所述的本发明实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
本文提及的“约”值或参数包括(并描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所使用，提及“非”值或参数通常意指并描述“不同于”值或参数。例如，所述方法不用于治疗X型癌症意指所述方法用于治疗除X型以外的类型的癌症。
除非上下文另有明确指示，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个/种”、“或”和“所述”包括多个指代物。
共受体系统
在一些实施方案中，本发明提供包含嵌合受体(CR)的工程化的免疫细胞，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(“CR”)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。
在一些情况下，仅经由CR信号传导结构域产生的信号不足以完全活化免疫细胞并且也需要二级或共刺激信号。因此，在一些实施方案中，免疫细胞活化由两类不同的细胞内信号传导序列介导：经由CR起始抗原依赖性初级活化的序列(例如细胞内CR信号传导结构域的信号传导序列)和提供二级或共刺激信号的序列(在本文中称为“共刺激信号传导序列”)。共刺激信号传导序列可存在于CR中；换言之，CR可还包含CR共刺激结构域。
在一些实施方案中，共刺激信号传导序列由共受体提供。具体而言，在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；和b)嵌合共受体(CCOR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR靶抗原结合结构域；ii)CCR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，其中CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且CCOR靶抗原为CD4，或其中CR靶抗原为CD4，并且CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的第一核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及b)编码嵌合共受体(CCOR)的第二核酸，其中所述CCOR包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR靶抗原结合结构域；ii)CCR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，其中CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且CCOR靶抗原为CD4，或其中CR靶抗原为CD4，并且CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，CR和CCOR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，CR不包含共刺激结构域。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。用于破坏基因表达的细胞的修饰包括本领域已知的任何所述技术，包括例如RNA干扰(例如siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如基于CRISPR或TALEN的基因敲除)等。
在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以进一步包含一种或多种共受体。因此，例如，在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组；和b)共受体(COR)，所述共受体选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；iii)细胞内CR共刺激结构域；和iv)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组；以及b)共受体(COR)，所述共受体选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞包含α4β7和CCR9两者。在一些实施方案中，免疫细胞包含CXCR5、α4β7和CCR9中的全部。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；iii)细胞内CR共刺激结构域；和iv)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CXCR5的核酸、编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，CR和COR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；iii)细胞内CR共刺激结构域；和iv)细胞内CR信号传导结构域，其中CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，CD4结合部分和CCR5结合部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为抗CCR5部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为抗CCR5部分的C末端。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CXCR5的核酸、编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，CR和COR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和广泛中和抗体(“bNAb”)部分(如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和广泛中和抗体(“bNAb”)部分(如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；iii)细胞内CR共刺激结构域；和iv)细胞内CR信号传导结构域，以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，CD4结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CXCR5的核酸、编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，CR和COR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和广泛中和抗体(“bNAb”)部分(如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和广泛中和抗体(“bNAb”)部分(如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域；iii)细胞内CR共刺激结构域；和iv)细胞内CR信号传导结构域，以及b)编码共受体(COR)的核酸，其中所述COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，CCR5结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CXCR5的核酸、编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，CR和COR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，免疫细胞经工程化以表达本文所述的CR、CCOR和一种或多种COR。因此，例如，在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；b)嵌合共受体(CCOR)，所述嵌合共受体包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR靶抗原结合结构域；ii)CCR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，以及c)共受体(COR)，其中CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且CCOR靶抗原为CD4，或其中CR靶抗原为CD4，并且CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞包含α4β7和CCR9两者。在一些实施方案中，免疫细胞包含CXCR5、α4β7和CCR9中的全部。在一些实施方案中，CR不包含CR细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的第一核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域；和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及b)编码嵌合共受体(CCOR)的第二核酸，其中所述CCOR包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR靶抗原结合结构域；ii)CCR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，以及c)编码共受体(COR)的第三核酸；其中CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且CCOR靶抗原为CD4，或其中CR靶抗原为CD4，并且CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。在一些实施方案中，COR选自由CXCR5、α4β7、CCR9或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CXCR5的核酸、编码α4β7的核酸和编码CCR9的核酸。在一些实施方案中，CR、CCOR和COR由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，CR不包含CR细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的CCR5的表达。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的一个或两个内源性TCR亚单位的表达。
在一些实施方案中，提供核酸，所述核酸包含编码CR的核酸序列、编码CCOR的核酸序列和/或编码COR的核酸序列。在一些实施方案中，CR、CCOR和COR核酸序列各自含于不同载体中。在一些实施方案中，一些或所有核酸序列含于同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)组成的组。在一些实施方案中，将一种或多种载体整合至免疫细胞的宿主基因组中。在一些实施方案中，CR、CCOR和/或COR核酸序列各自处于不同启动子的控制下。在一些实施方案中，启动子具有相同序列。在一些实施方案中，启动子具有不同序列。在一些实施方案中，一些或所有核酸序列处于单个启动子的控制下。在一些实施方案中，一些或所有启动子为诱导型的。例如，CCOR和COR核酸可处于可在免疫细胞活化时诱导的启动子的控制下。在一些实施方案中，一些或所有启动子为组成型的。
在根据任一上述实施方案的一些实施方案中，工程化的免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴样细胞和肥大细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞选自细胞毒性T细胞、辅助T细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞富集CD4表达。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞富集CD8表达。
在一些实施方案中，工程化的免疫细胞源自原代免疫细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞源自经人工诱导以具有免疫活性的细胞(例如iPS细胞)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞源自CD4+免疫细胞(或富集CD4表达的免疫细胞)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞源自CD8+免疫细胞(或富集CD8表达的免疫细胞)。
在一些实施方案中，当编码CR、CCOR和COR的核酸中的两者或更多者处于单个启动子的控制下时，所述核酸可经由选自由以下组成的组的接头连接：内部核糖体进入位点(IRES)和编码自裂解2A肽(如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸。
嵌合受体(CR)构建体
本文所述的CR包含特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和细胞内CR信号传导结构域。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域直接或间接融合至CR跨膜结构域。例如，CR可为从N末端至C末端包含以下的单个多肽：CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和CR细胞内信号传导结构域。CR抗原结合结构域、CR跨膜结构域和CR细胞内结构域可彼此直接融合或经由接头序列间接融合。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域非共价结合至包含CR跨膜结构域的多肽。这可通过例如使用结合对的两个成员来实现，所述两个成员一个融合至CR抗原结合结构域(例如，融合至CR抗体结合结构域的C末端)，另一个融合至CR跨膜结构域(例如，融合至CR跨膜结构域的N末端)。两种组分经由结合对的两个成员的相互作用而结合在一起。例如，CR可包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含：i)包含CR抗原结合结构域和结合对的第一成员的第一多肽；和ii)包含结合对的第二成员的第二多肽，其中第一成员和第二成员彼此非共价结合。结合对的第一成员可直接或间接融合至CR抗原结合结构域。类似地，结合对的第二成员可直接或间接融合至CR跨膜结构域。合适的结合对包括但不限于亮氨酸拉链、生物素/链霉亲和素、MIC配体/iNKG2D等。参见Cell 173,1426-1438,Oncoimmunology.2018；7(1):e1368604,US10259858B2。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域。例如，在一些实施方案中，CR抗原结合结构域包含串联连接的CD4结合部分和CCR5结合部分。在一些实施方案中，CR抗原结合结构域包含串联连接的CD4结合部分和bNAb部分。在一些实施方案中，CR抗原结合结构域包含串联连接的CCR5结合部分和bNAb部分。在一些实施方案中，CD4结合部分、CCR5结合部分和/或bNAb部分选自由scFv或sdAb组成的组。
在一些实施方案中，细胞内CR信号传导结构域包含功能性初级免疫细胞信号传导序列，其包括但不限于在选自由以下组成的组的蛋白质中发现的序列：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。“功能性”初级免疫细胞信号传导序列为当可操作地偶联至合适受体时能够转导免疫细胞活化信号的序列。“非功能性”初级免疫细胞信号传导序列可包含初级免疫细胞信号传导序列的片段或变体，不能转导免疫细胞活化信号。本文所述的CCOR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，CCOR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
在一些实施方案中，CR跨膜结构域包含一个或多个源自例如以下的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
CR抗原结合结构域可为特异性地识别CR靶抗原的抗体部分或配体。在一些实施方案中，CR抗原结合结构域特异性地结合至靶抗原并且a)亲和力为其对其他分子的结合亲和力的至少约10倍(包括例如至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1000倍或更大中的任一者)；或b)Kd不大于其与其他分子结合的Kd的约1/10(如不大于约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)。结合亲和力可通过本领域已知的方法来测定，如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)。Kd可通过本领域已知的方法来测定，如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)测定，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排斥测定(KinExA)。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CR靶抗原的肽配体。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域为抗体部分。在一些实施方案中，抗体部分为单特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为多特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为双特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和性重靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体或异源缀合物抗体。在一些实施方案中，抗体部分为scFv。在一些实施方案中，抗体部分为单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体部分为全人的、与人抗体框架区半合成的或人源化的。
在一些实施方案中，抗体部分包含源自一个或多个抗体部分(如单克隆抗体)的特异性CDR序列或此类序列的包含一个或多个氨基酸取代的某些变体。在一些实施方案中，变体序列中的氨基酸取代实质上不会降低抗原结合结构域结合靶抗原的能力。也考虑了显著提高靶抗原结合亲和力或影响一些其他性质的改变，如与靶抗原的相关变体的特异性和/或交叉反应性。
在一些实施方案中，CR抗原结合结构域结合CR靶抗原并且Kd介于约0.1pM至约500nM之间(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，例如，当单独表达或与没有CCOR的COR共表达时，CR可进一步包含细胞内CR共刺激结构域。细胞内CR共刺激结构域可为包括例如以下的共刺激分子的细胞内结构域的一部分：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、OX40、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、CD83以及与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，细胞内CR共刺激结构域包含4-1BB的片段。在一些实施方案中，细胞内CCOR共刺激结构域包含CD28的片段和4-1BB的片段。在一些实施方案中，例如当与CCOR共表达时，CR不包含功能性共刺激结构域。
因此，例如，在一些实施方案中，提供嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CD4的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CD4的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CD4的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞还包含一种或多种COR(如CXCR5)或编码一种或多种COR(如CXCR5)的核酸。在一些实施方案中，所述工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CCR5的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CCR5的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CCR5的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含一种或多种COR(如CXCR5)或编码一种或多种COR(如CXCR5)的核酸。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，CD4结合部分和CCR5结合部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5部分的C末端。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含一种或多种COR(如CXCR5)或编码一种或多种COR(如CXCR5)的核酸。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，本文所述的CR为嵌合抗原受体(“CAR”)。因此，例如，在一些实施方案中，提供抗CD4 CAR，所述抗CD4 CAR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CD4 CAR，所述抗CD4 CAR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CD4 CAR的核酸，所述抗CD4 CAR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(例如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可为特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供抗CCR5 CAR，所述抗CCR5 CAR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CCR5 CAR，所述抗CCR5 CAR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CCR5 CAR的核酸，所述抗CCR5CAR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供串联抗CD4抗CCR5 CAR，所述串联抗CD4抗CCR5 CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含串联抗CD4抗CCR5 CAR，所述串联抗CD4抗CCR5 CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码串联抗CD4抗CCR5CAR的核酸，所述串联抗CD4抗CCR5 CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，CD4结合部分和CCR5结合部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5结合部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5结合部分的C末端。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可包含特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供串联抗CD4 bNAb CAR，所述串联抗CD4 bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CD4 bNAb CAR，所述抗CD4bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CD4 bNAb CAR的核酸，所述抗CD4 bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，CD4结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可包含特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸，所述bNAb包括VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074、N6、VRC07、VRC07-523、eCD4-IG、10E8、10E8v4、PG9、PGDM 1400、PGT151、CAP256.25、35O22、8ANC195等。
在一些实施方案中，提供串联抗CCR5 bNAb CAR，所述串联抗CCR5 bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CCR5bNAb CAR，所述抗CCR5 bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CCR5 bNAb CAR的核酸，所述抗CCR5 bNAb CAR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的铰链序列(如源自CD8的铰链序列)；iii)CR跨膜结构域(如CD8跨膜结构域)，iv)细胞内共刺激结构域(如源自4-1BB或CD28的共刺激结构域)；和v)细胞内CR信号传导结构域(如源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，CCR5结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸，所述bNAb包括VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074、N6、VRC07、VRC07-523、eCD4-IG、10E8、10E8v4、PG9、PGDM 1400、PGT151、CAP256.25、35O22、8ANC195等。
在一些实施方案中，本文所述的CR为嵌合TCR受体(“cTCR”)。cTCR通常包含融合(直接或间接)至TCR亚单位(如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ)的全长或一部分的CR抗原结合结构域。融合多肽可与其他TCR亚单位一起并入功能性TCR复合物中并且赋予TCR复合物抗原特异性。在一些实施方案中，CR抗原结合结构域融合至CD3ε亚单位的全长或一部分(称为“eTCR”)。cTCR的细胞内CR信号传导结构域可源自TCR亚单位的细胞内信号传导结构域。CR跨膜结构域源自TCR亚单位。在一些实施方案中，细胞内CR信号传导结构域和CR跨膜结构域源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，细胞内CR信号传导结构域和CR跨膜结构域源自CD3ε。在一些实施方案中，CR抗原结合结构域和TCR亚单位(或其一部分)可经由接头(如GS接头)融合。在一些实施方案中，cTCR还包含TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分，其可与细胞内CR信号传导结构域和/或CR跨膜结构域所源自的TCR单位相同或不同。
因此，例如，在一些实施方案中，提供抗CD4 cTCR，所述抗CD4 cTCR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CD4 cTCR，所述抗CD4 cTCR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CD4 cTCR的核酸，所述抗CD4 cTCR包含：i)特异性地识别CD4(例如抗CD4抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可为特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，TCR亚单位选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供抗CCR5 cTCR，所述抗CCR5 cTCR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含抗CCR5 cTCR，所述抗CCR5 cTCR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码抗CCR5 cTCR的核酸，所述抗CCR5 cTCR包含：i)特异性地识别CCR5(例如抗CCR5抗体部分，如scFv或sdAb)的CR抗原结合结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，TCR亚单位选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供串联抗CD4抗CCR5 cTCR，所述串联抗CD4抗CCR5 cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含串联抗CD4抗CCR5 cTCR，所述串联抗CD4抗CCR5cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码串联抗CD4抗CCR5 cTCR的核酸，所述串联抗CD4抗CCR5 cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可为特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，TCR亚单位选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。在一些实施方案中，CD4结合部分和CCR5结合部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为CCR5部分的C末端。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸。
在一些实施方案中，提供串联抗CD4 bNAb cTCR，所述串联抗CD4 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含串联抗CD4 bNAb cTCR，所述串联抗CD4 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码串联抗CD4 bNAbcTCR的核酸，所述串联抗CD4 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CD4结合部分(如抗CD4抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，CR抗原结构域特异性地识别结构域1。例如，CR抗原结构域可包含特异性地识别CD4的结构域1的抗CD4抗体(例如scFv或sdAb)。在一些实施方案中，TCR亚单位选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。在一些实施方案中，CD4结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CD4结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸，包括VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074、N6、VRC07、VRC07-523、eCD4-IG、10E8、10E8v4、PG9、PGDM 1400、PGT151、CAP256.25、35O22、8ANC195等。
在一些实施方案中，提供串联抗CCR5 bNAb cTCR，所述串联抗CCR5 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含串联抗CCR5 bNAb cTCR，所述串联抗CCR5 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码串联抗CCR5 bNAb cTCR的核酸，所述串联抗CCR5 bNAb cTCR包含：i)CR抗原结合结构域，所述CR抗原结合结构域包含CCR5结合部分(如抗CCR5抗体部分，例如scFv或sdAb)和bNAb部分(如scFv或sdAb)；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域；ii)任选的接头(如GS接头)；iii)任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分；iii)源自TCR亚单位的CR跨膜结构域，和iv)源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域。在一些实施方案中，TCR亚单位选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自同一TCR亚单位。在一些实施方案中，CR跨膜结构域、细胞内CR信号传导结构域和任选的TCR亚单位的细胞外结构域或其一部分源自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。在一些实施方案中，CCR5结合部分和bNAb部分为串联连接的。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的N末端。在一些实施方案中，CCR5结合部分为bNAb部分的C末端。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含广泛中和抗体(bNAb)或编码bNAb的核酸，包括VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074、N6、VRC07、VRC07-523、eCD4-IG、10E8、10E8v4、PG9、PGDM 1400、PGT151、CAP256.25、35O22、8ANC195等。
嵌合共刺激受体(CCOR)
本文所述的嵌合共刺激受体(CCOR)特异性地结合至CCOR靶抗原并且允许刺激在靶结合时在表面上功能性表达所述嵌合共刺激受体的免疫细胞。CCOR包含提供靶结合特异性的CCOR抗原结合结构域、跨膜结构域和允许刺激免疫细胞的CCOR共刺激结构域。CCOR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，CCOR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，CCOR在工程化的免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞的表达可在通过CR信号传导时诱导。
用于本发明CCOR的共刺激免疫细胞信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的共受体的细胞质序列，其可与CR协同作用，在CR接合后起始信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
细胞内CCOR共刺激结构域可为共刺激分子的细胞内结构域的一部分，包括例如CD28、4-1BB(CD137)、CD27、OX40、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、CD83和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，细胞内CCOR共刺激结构域包含4-1BB的片段。在一些实施方案中，细胞内CCOR共刺激结构域包含CD28的片段和4-1BB的片段。
在一些实施方案中，CCOR跨膜结构域包含一个或多个源自例如以下的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在一些实施方案中，CCOR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CCOR靶抗原的肽配体。在一些实施方案中，CCOR抗原结合结构域特异性地结合至CCOR靶抗原并且a)亲和力为其对其他分子的结合亲和力的至少约10倍(包括例如至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1000倍或更大中的任一者)；或b)Kd不大于其与其他分子结合的Kd的约1/10(例如不大于约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)。结合亲和力可通过本领域已知的方法来测定，如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)。Kd可通过本领域已知的方法来测定，如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)测定，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排斥测定(KinExA)。
在一些实施方案中，CCOR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CR靶抗原的肽配体。
在一些实施方案中，CCOR抗原结合结构域为抗体部分。在一些实施方案中，抗体部分为单特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为多特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为双特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和性重靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体或异源缀合物抗体。在一些实施方案中，抗体部分为scFv。在一些实施方案中，抗体部分为单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体部分为全人的、与人抗体框架区半合成的或人源化的。
在一些实施方案中，抗体部分包含源自一个或多个抗体部分(如单克隆抗体)的特异性CDR序列或此类序列的包含一个或多个氨基酸取代的某些变体。在一些实施方案中，变体序列中的氨基酸取代实质上不会降低抗原结合结构域结合靶抗原的能力。也考虑了显著提高靶抗原结合亲和力或影响一些其他性质的改变，如与靶抗原相关变体的特异性和/或交叉反应性。
在一些实施方案中，CCOR抗原结合结构域结合CCOR靶抗原并且Kd介于约0.1pM至约500nM之间(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。
CR和CCOR抗原结合结构域
本文所述的CR和CCOR特异性地识别选自由CD4、CCR5和CXCR4组成的组的靶抗原。如上文所论述，当CR特异性地识别CD4时，CCOR将特异性地识别CCR5或CXCR4。或者，当CR特异性地识别CCR5或CXCR4时，CCOR将特异性地识别CD4。靶抗原和抗原结合结构域更详细论述于下文部分中，其通常适用于CR抗原结合结构域(和CR靶抗原)与CCOR抗原结合结构域(和CCOR靶抗原)。
在一些实施方案中，靶抗原为CCR5。CCR5为具有七个跨膜结构域的G蛋白偶联受体，所述受体属于整合膜蛋白的β趋化因子受体家族。CCR5包含352个氨基酸，并且为大约41千道尔顿(kDa)。
CCR5主要在免疫系统的细胞(包括T细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞)上表达，但其也在内皮细胞、上皮细胞、血管平滑肌和成纤维细胞中表达。此外，其在中枢神经系统中发现的小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞上表达。(参见Barmania,F.和Pepper,MS.Applied&Translational Genomics(2013)2(2013):3-16。)
CCR5在大多数HIV-I原代分离物上表达并且对感染的建立和维持至关重要。早期疾病中的HIV-1分离物倾向于使用CCR5作为与CD4的共受体进入CD4+T细胞中。与未感染的对照相比，已显示在感染HIV的个体中，CCR5在CD4+T细胞上上调(参见Ostrowski,MA等人,J.Immunol.(1998)161(6):3195-3201)。存在可测量的量的个体间CCR5表面表达可变性。
在一些实施方案中，靶抗原为CCR5的细胞外结构域变体。在其他实施方案中，靶抗原为CCR5的跨膜结构域变体。在其他实施方案中，靶抗原为CCR5的细胞外结构域和跨膜结构域变体(关于若干CCR5变体和所得HIV感染性的分析，参见Zack Howard,OM等人J.Biol.Chem.(1999)274(23):16228-16234。)
在一些实施方案中，抗原结合结构域为识别CCR5的配体、其能够识别CCR5的片段。识别CCR5的配体包括但不限于MIP-1α、MIP-1β和RANTES。在一些实施方案中，抗原结合结构域为MIP-1α，也称为CCL3。MIP-1α为参与急性炎症期间的多形核白细胞的募集和活化的细胞因子。在一些实施方案中，抗原结合结构域为MIP-1β，也称为CCL4。MIP-1β为包括自然杀伤细胞和单核细胞在内的许多免疫细胞的化学引诱剂。MIP1-β由免疫系统的多种细胞(包括单核细胞、T细胞、B细胞以及还有成纤维细胞和内皮细胞和上皮细胞)产生。在一些实施方案中，抗原结合结构域为配体RANTES，也称为CCL5。RANTES将白细胞募集至炎症位点，并用作免疫系统中各种细胞(包括T细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的化学引诱剂。在其他实施方案中，抗原结合结构域为结合至CCR5的另一配体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为识别CCR5的抗体部分，如本文所述的任一抗体部分。示例性抗CCR5抗体可参见WO2006103100，其以引用的方式明确并入本文中。
在一些实施方案中，靶抗原为CXCR4。CXCR4(也称为4型C-X-C趋化因子受体)为α趋化因子受体，其结合配体SDF-1并经由若干种不同途径传递细胞内信号，从而导致钙增加和/或cAMP水平降低。其主要在免疫细胞(包括CD4+T细胞)上表达，但也在中枢神经系统的细胞上表达。CXCR4为具有七个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体，并且包含352个氨基酸。
CXCR4为HIV分离物可用来感染CD4+T细胞的若干种趋化因子受体之一。HIV的T细胞嗜性分离物可感染在表面上表达CXCR4的CD4+T细胞。CXCR4为HIV进入T细胞中的共受体并且已证明某些鼠类抗CXCR4抗体能够抑制HIV分离物进入T细胞中(参见Hou,T.等人(1998)J.Immunol.160:180-188；Carnec,X.等人(2005)J.Virol.79:1930-1938)。CXCR4可用作病毒进入细胞中的受体，并且针对CXCR4的抗体已用于抑制使用CXCR4作为受体的此类病毒的细胞进入。参见WO2008060367和WO2011098762。
与未感染的对照相比，CXCR4在感染HIV的个体中在CD4+和CD8+T细胞以及CD14+单核细胞上下调(参见Ostrowski,MA等人,J.Immunol.(1998)161(6):3195-3201)。随着疾病进展，HIV-1分离物使用CXCR4作为与CD4的共受体进入细胞；CXCR4不像CCR5那样在感染早期用作共受体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为CXCR4配体，如基质细胞源性因子1(SDF-1或CXCL12)，或其识别CXCR4的片段。SDF-1对淋巴细胞有强烈的趋化性，其在许多组织(包括但不限于胸腺、脾脏和骨髓)中表达。在一些实施方案中，抗原结合结构域为SDF-1的七种同种型之一。在一些实施方案中，抗原结合结构域为MIF、泛素或其片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为识别CXCR4的抗体部分，例如本文所述的任一抗体部分。示例性抗CXCR4抗体可参见WO2008060367和WO2011098762，其以引用的方式明确并入本文中。
在一些实施方案中，靶抗原为CD4，也称为分化簇4。CD4为发现于免疫细胞、尤其CD4+或辅助T细胞的表面上的糖蛋白。CD4为免疫球蛋白超家族的成员。CD4包含四个细胞外免疫球蛋白结构域(D1至D4)。D1和D3显示与免疫球蛋白可变结构域相似，而D2和D4显示与免疫球蛋白恒定结构域相似。
CD4为HIV-1进入和感染所需的重要细胞表面分子。HIV-1进入由病毒包膜(Env)糖蛋白gp120与T细胞受体CD4的结构域1(D1)的相互作用触发。随着HIV感染的进展，更多数量的CD4+T细胞由病毒靶向和破坏，从而导致免疫系统日益受损；因此，CD4+T细胞计数用作个体中HIV/AIDS的进展和阶段的代表。此外，HIV基因产物Env、Vpu和Nef在HIV感染过程中参与CD4的下调(参见Tanaka,M.等人,Virology(2003)311(2):316-325)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性地结合CD4 D1或CD4 D2/D3并且a)亲和力为其对其他分子的结合亲和力的至少约10(包括例如至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1000倍或更大中的任一者)；或b)Kd不大于其与其他分子结合的Kd的约1/10(如不大于约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)。结合亲和力可通过本领域已知的方法来测定，如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)。Kd可通过本领域已知的方法来测定，如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)测定，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排斥测定(KinExA)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CD4的肽配体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为抗体部分。在一些实施方案中，抗体部分为单特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为多特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为双特异性的。在一些实施方案中，抗体部分为串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双亲和性重靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体或异源缀合物抗体。在一些实施方案中，抗体部分为scFv。在一些实施方案中，抗体部分为单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体部分为全人的、与人抗体框架区半合成的或人源化的。
抗体部分在一些实施方案中包含源自一个或多个抗体部分(如本文所公开的任一特异性抗体)的特异性CDR序列或此类序列的包含一种或多种氨基酸取代的某些变体。在一些实施方案中，变体序列中的氨基酸取代实质上不会降低抗原结合结构域结合靶抗原的能力。也考虑了显著提高靶抗原结合亲和力或影响一些其他性质的改变，如与靶抗原的相关变体的特异性和/或交叉反应性。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至CD4 D1或D2/3并且Kd介于约0.1pM至约500nM之间(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至CD4的D1中的表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至在以下区域中的任一者或多者内的表位：CD4的氨基酸26-125、26-46、46-66、66-86、86-106、106-125，其中氨基酸编号是根据SEQ ID NO.1。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至在以下区域中的任一者或多者内的表位：SEQ ID NO.1的氨基酸26-125、26-46、46-66、66-86、86-106、106-125。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至CD4的D1，介于约0.1pM至约500nM之间(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，CD4为人CD4。在一些实施方案中，抗原结合结构域源自扎木单抗(zanolimumab)，例如如WO1997013852中所公开。在一些实施方案中，抗原结合结构域与扎木单抗竞争结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至与扎木单抗相同或重叠的表位。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至CD4的D2或D3表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至在以下区域中的任一者或多者内的表位：CD4的氨基酸126-317、126-203、204-317、126-146、146-166、166-186、186-206、206-226、226-246、246-266、266-286、286-306和306-317，其中氨基酸编号是根据SEQ ID NO.1。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至在以下区域中的任一者或多者内的表位：SEQ ID NO.1的氨基酸126-317、126-203、204-317、126-146、146-166、166-186、186-206、206-226、226-246、246-266、266-286、286-306和306-317。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至CD4的D2或D3并且kd介于约0.1pM至约500nM之间(如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，CD4为人CD4。在一些实施方案中，抗原结合结构域源自伊巴利珠单抗(ibalizumab)或曲加利珠单抗(tregalizumab)，例如如US20130195881和WO2004083247中所公开。在一些实施方案中，抗原结合结构域与伊巴利珠单抗或曲加利珠单抗竞争结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至与伊巴利珠单抗或曲加利珠单抗相同或重叠的表位。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为CD4的配体或其能够结合CD4的片段。在一些实施方案中，CD4的配体为IL-16，一种调节T细胞活化且抑制HIV复制的多效细胞因子。在其他实施方案中，CD4的配体为II类主要组织相容性复合物(II类MHC)。II类MHC分子通常发现于免疫系统的抗原呈递细胞上，包括B细胞、树突细胞、抗原呈递细胞、单核吞噬细胞和胸腺上皮细胞。在一些实施方案中，II类MHC配体呈递致病肽以呈递给CD4，随后呈递给免疫系统。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为包膜糖蛋白gp120或其片段。由HIV env基因编码的天然gp120为在HIV病毒包膜上发现的120kDa糖蛋白，其在HIV与靶细胞的连接中起重要作用。gp120结合至靶细胞CD4和趋化因子受体家族成员，包括CCR5，以便靶细胞高效感染HIV。已显示gp120和CD4的复合物特异性地与CCR5相互作用，并抑制天然CCR5配体如MIP-1α和MIP-1β的结合(Wu,L.,等人(1996)Nature 384:179-183)。
在一些实施方案中，当抗原结合结构域为gp120时，工程化的免疫细胞不包含CCOR。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞中的CR包含CR共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域为不结合CD4、CCR5和CXCR4中的一者或多者的经修饰的gp120。例如，在一些实施方案中，抗原结合结构域为结合至CD4而非CCR5或CXCR4的经修饰的gp120。在一些实施方案中，抗原结合结构域为结合至CCR5而非CD4或CXCR4的经修饰的gp120。在一些实施方案中，抗原结合结构域为结合至CXCR4而非CCR5或CD4的经修饰的gp120。
共受体(“COR”)
在一些实施方案中，工程化的免疫细胞还包含一种或多种共受体(“COR”)。
在一些实施方案中，COR促进免疫细胞迁移至滤泡。在一些实施方案中，COR促进免疫细胞迁移至肠。在一些实施方案中，COR促进免疫细胞迁移至皮肤。
在一些实施方案中，COR为CXCR5。在一些实施方案中，COR为CCR9。在一些实施方案中，COR为α4β7(也称为整合素α4β7)。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞包含两个或更多个选自由CXCR5、α4β7和CCR9组成的组的受体。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞包含α4β7和CCR9两者。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞包含CXCR5、α4β7和CCR9。
CCR9(也称为9型C-C趋化因子受体(CCR9))为β趋化因子受体家族的成员并且响应于其结合配体CCL25而介导趋化作用。CCR9经预测为结构类似于G蛋白偶联受体的七跨膜结构域蛋白。CCR9在胸腺和小肠的T细胞上表达，并在调控T淋巴细胞的发育和迁移中发挥作用(Uehara,S.,等人(2002)J.Immunol.168(6):2811-2819)。已显示CCR9/CCL25将免疫细胞引导至小肠(Pabst,O.,等人(2004).J.Exp.Med.199(3):411)。因此，在免疫细胞中共表达CCR9可将工程化的免疫细胞引导至肠。在一些实施方案中，使用CCR9的剪接变体。
α4β7或淋巴细胞派尔斑粘附分子(LPAM)为在淋巴细胞上表达并且负责T细胞归巢至肠相关淋巴样组织中的整合素(Petrovic,A.等人(2004)Blood 103(4):1542-1547)。α4β7为异二聚体，包含CD49d(ITGA4的蛋白质产物，ITGA4为编码α4整合素亚单位的基因)和ITGB7(ITGB4的蛋白质产物，ITGB4为编码β7整合素亚单位的基因)。在一些实施方案中，α4的剪接变体并入α4β7异二聚体中。在一些实施方案中，β7的剪接变体并入α4β7异二聚体中。在其他实施方案中，α4的剪接变体和β7的剪接变体并入异二聚体中。α4β7单独或与CCR9组合的共表达可将工程化的免疫细胞引导至肠。
尽管α4β7和CCR9两者均有归巢至肠的功能，但其不一定为共调控的。维生素A代谢物视黄酸在诱导CCR9和α4β7的表达中起作用。然而，α4β7表达可经由其他方式诱导，而CCR9表达需要视黄酸。此外，结肠嗜性T细胞仅表达α4β7，而不表达CCR9，从而表明两种受体并不总为共表达或共调控的。(参见Takeuchi,H.,等人J.Immunol.(2010)185(9):5289-5299。)
在一些实施方案中，CCR9和α4β7用作靶向肠的COR。
在一些实施方案中，免疫细胞表达CXCR5，也称为5型C-X-C趋化因子受体。CXCR5为含有七个跨膜结构域的G蛋白偶联受体，其属于CXC趋化因子受体家族。CXCR5及其配体趋化因子CXCL13在将淋巴细胞运输至次级淋巴样组织(包括淋巴结和脾)内的滤泡中发挥中心作用。(Bürkle,A.等人(2007)Blood 110:3316-3325。)特别地，CXCR5使得T细胞能够响应于CXCL13迁移至淋巴结B细胞区(Schaerli,P.等人(2000)J.Exp.Med.192(11):1553-1562。)当在免疫细胞中表达时，CXCR5可用作将工程化的免疫细胞靶向滤泡的COR。在一些实施方案中，使用CXCR5的剪接变体。
一般而言，上述任一COR的非天然变体可包含/表达在工程化的免疫细胞中。例如，这些变体可含有一个或多个突变，但仍然保持相应天然受体的一些或多个功能。例如，在一些实施方案中，COR为天然存在的CCR9、α4β或CXCR5的变体，其中所述变体具有与天然CCR9、α4β或CXCR5至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，COR为天然存在的CCR9、α4β或CXCR5的变体，其中与天然的CCR9、α4β或CXCR5相比，所述变体包含不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个中的任一者的氨基酸取代。
在一些实施方案中，COR为趋化因子受体。在一些实施方案中，COR为整合素。在一些实施方案中，COR选自由以下组成的组：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、XCR1、ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、CCRL2。
在一些实施方案中，COR在工程化的免疫细胞所来源的免疫细胞中不正常表达。在一些实施方案中，COR在工程化的免疫细胞所来源的免疫细胞中少量表达。
抗HIV抗体
在一些实施方案中，本文所述的工程化的免疫细胞进一步表达(并分泌)抗HIV抗体，如广泛中和抗体(“bNAb”)。在一些实施方案中，当CR为串联CR时，CR抗原结合结构域可包含抗HIV抗体部分(如bNAb部分)。bNAb结合至HIV包膜蛋白并且阻断病毒与宿主细胞受体的结合。本文所述的bNAb部分是指保留广泛中和抗体活性和/或结合特异性的抗体或其片段。在一些实施方案中，bNAb部分为scFv。在一些实施方案中，bNAb部分为sdAb。
bNAb最初在精英控制者中发现，其感染了HIV，但不用服用抗逆转录病毒药物即可自然控制病毒感染。bNAb为中和多种HIV病毒株的中和抗体。bNAb靶向病毒的保守表位，即使病毒经历突变。在一些实施方案中，本文所述的工程化的免疫细胞可分泌广泛中和抗体来阻断新宿主细胞的HIV感染。
在一些实施方案中，bNAb特异性地识别gp41、V1V2聚糖、聚糖外结构域、V3聚糖或CD4结合位点的MPER上的病毒表位。bNAb阻断病毒包膜糖蛋白与CD4的相互作用。Mascola和Haynes,Immunol.Rev.2013年7月；254(1):225-44。合适的bNAb包括但不限于VRC01、PGT-121、3BNC117、10-1074、N6、VRC07、VRC07-523、eCD4-IG、10E8、10E8v4、PG9、PGDM 1400、PGT151、CAP256.25、35O22、8ANC195。Science Translational Medicine 2015年12月23日:第7卷,第319期,第319页ra206；PLoS Pathog.2013；9(5):e1003342；Nature.2015年6月25日；522(7557):487-91；Nat Med.2017年2月；23(2):185-191；Nature Immunology第19卷，第1179-1188页(2018)。其他合适的广泛中和抗体可参见例如Cohen等人,CurrentOpin.HIV AIDS,2018年7月；13(4):366-373；Mascola和Haynes,Immunol.Rev.2013年7月；254(1):225-44。
核酸
本文还提供编码本文所述的CR、CCOR和/或COR的核酸(或一组核酸)以及包含所述一种或多种核酸的载体。
CR、CCOR和/或COR的表达可通过将核酸插入合适的表达载体中来实现，使得核酸可操作地连接至5’和/或3’调控元件，包括例如启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)。载体可适合于在宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控所需核酸序列的表达的启动子。
核酸可克隆至许多类型的载体中。例如，核酸可克隆至包括但不限于以下的载体中：质体、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定目标载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术为本领域中众所周知。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一种或多种选择性标记物。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可使用本领域已知的技术将所选基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可在体内或离体分离重组病毒并将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统为本领域已知。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体为本领域已知。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体为实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体比源自肿瘤逆转录病毒如鼠类白血病病毒的载体具有的额外优势在于，它们可转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有免疫原性低的额外优势。
额外启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域中，但最近显示许多启动子也显示含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间之间隔通常具有柔性，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可增加至50bp。
合适启动子的一个实例为立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的大量表达。合适启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒启动子以及人基因启动子，如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体也可含有选择性标记基因或报告基因或两者，以有利于从寻求经由病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面中，选择性标记可携带在单独的一段DNA上，并用于共转染程序中。选择性标记和报告基因均可侧接有适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染细胞和评估调控序列的功能。一般而言，报告基因为不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达并且编码的多肽的表达由一些容易检测到的性质(例如酶活性)显现的基因。在将DNA引入受体细胞中后，在合适的时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。合适的表达系统为众所周知的，并且可使用已知技术制备或在商业上获得。一般而言，具有显示报告基因的最高表达水平的最小5′侧接区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可连接至报告基因，并用于评估剂调节启动子驱动转录的能力。
确认哺乳动物细胞中异源核酸存在的示例性方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，例如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如通过例如免疫学方法(如ELISA和蛋白质印迹)检测特定肽的存在或不存在。
确认哺乳动物细胞中异源核酸存在的示例性方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，例如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如通过例如免疫学方法(如ELISA和蛋白质印迹)检测特定肽的存在或不存在。
在一些实施方案中，一个或多个核酸序列中的每一者含于单独载体中。在一些实施方案中，至少一些核酸序列含于同一载体中。在一些实施方案中，所有核酸序列都含于同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)组成的组。
例如，在一些实施方案中，核酸包含编码CR多肽链的第一核酸序列、任选的编码CCOR多肽链的第二核酸、任选的编码COR多肽链的第三核酸和任选的编码bNAb多肽的第四核酸。在一些实施方案中，第一核酸序列含于第一载体中，第二核酸序列含于第二载体中，第三核酸序列含于第三载体中，和/或第四核酸序列含于第四载体中。在一些实施方案中，第一和第二核酸序列含于第一载体中，并且第三核酸序列和/或第四核酸序列含于第二载体中。在一些实施方案中，第一和第三核酸序列含于第一载体中，并且第二核酸序列和/或第四核酸序列含于第二载体中。在一些实施方案中，第二和第三核酸序列含于第一载体中，并且第一核酸序列和/或第四核酸序列含于第二载体中。在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选第四核酸序列含于同一载体中。在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选第四核酸可经由选自由以下组成的组的接头彼此连接：内部核糖体进入位点(IRES)和编码自裂解2A肽(例如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸。
在一些实施方案中，第一核酸序列处于第一启动子的控制下，第二核酸序列处于第二启动子的控制下，第三核酸序列处于第三启动子的控制下，和/或第四核酸序列处于第四启动子的控制下。在一些实施方案中，第一、第二、第三和/或第四启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选的第四启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选的第四核酸序列中的一些或全部在多顺反子载体中的单个启动子的控制下以单个转录物表达。在一些实施方案中，一种或多种启动子为诱导型的。在一些实施方案中，第三和/或第四核酸序列可操作地连接至诱导型启动子。
在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选的第四核酸序列中的一些或全部在免疫细胞(如T细胞)中具有相似(如实质上或大致相同)的表达水平。在一些实施方案中，第一、第二、第三和任选的第四核酸序列中的一些在免疫细胞(如T细胞)中的表达水平相差至少约2倍(如至少约2倍、3倍、4倍、5倍或更大中的任一者)。表达可在mRNA或蛋白质水平下确定。可通过使用各种众所周知的方法(包括RNA印迹、定量RT-PCR、微阵列分析等)测量从核酸转录的mRNA的量来确定mRNA表达的水平。蛋白质表达的水平可通过已知方法测量，包括免疫细胞化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、发光测定、质谱、高效液相色谱、高压液相色谱-串联质谱等。
在细胞(如免疫细胞)中引入和表达基因的方法为本领域已知。在表达载体的上下文中，载体可通过本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物手段转移至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域中众所周知。在一些实施方案中，通过磷酸钙转染将多核苷酸引入宿主细胞中。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体、尤其逆转录病毒载体已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。
用于将多核苷酸引入宿主细胞(如免疫细胞)中的化学方式包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统为脂质体(例如人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物为脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面中，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可囊封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接至脂质体，包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式含于脂质中，含有胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物并不限于溶液中的任何特定结构。例如，其可以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质为脂肪物质，所述脂肪物质可为天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的一类化合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本发明抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如通过例如免疫学方式(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定在本发明范围内的剂。
抗体部分
本文所述的多种构建体(如CR抗原结合结构域或CCOR抗原结合结构域)包含抗体部分。在一些实施方案中，抗体部分包含单克隆抗体的VH和VL结构域或其变体。在一些实施方案中，抗体部分还包含单克隆抗体的CH1和CL结构域或其变体。单克隆抗体可例如使用杂交瘤方法，如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)和Sergeeva等人,Blood,117(16):4262-4272所述的方法制备。
在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对仓鼠、小鼠或其他合适的宿主动物进行免疫以引发产生或能够产生将特异性地结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。免疫剂可包括目标蛋白质的多肽或融合蛋白，或包含至少两种分子的复合物，如包含肽和MHC蛋白的复合物。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常为转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，其防止HGPRT缺陷细胞的生长。
在一些实施方案中，永生化细胞系高效融合，支持所选抗体产生细胞对抗体的稳定高水平表达，并且对培养基如HAT培养基敏感。在一些实施方案中，永生化细胞系为鼠类骨髓瘤系，其可从例如Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California和American Type Culture Collection,Manassas,Virginia获得。还已描述人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体。Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)第51-63页。
然后可测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。此类技术和测定为本领域已知。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定。
在鉴定所需杂交瘤细胞后，可通过限制性稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法生长。Goding，同上。用于此目的的适合培养基包括例如达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物体内以腹水形式生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水分离或纯化，所述纯化程序为例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
在一些实施方案中，抗体部分包含选自抗体部分文库(如呈现scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。克隆可通过筛选具有一种或多种所需活性的抗体片段的组合文库来鉴定。例如，本领域已知多种方法来生成噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编辑,Human Press,Totowa,N.J.,2001)并且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods inMolecular Biology248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因谱，并在噬菌体文库中随机重组，然后可筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可(例如，从人)克隆原初谱以向各种无任何免疫的非自体抗原以及还有自体抗原提供单一抗体源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，也可通过以下方式以合成方式制得原初文库：克隆来自干细胞的未重排V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
抗体部分可使用噬菌体展示来制备，以筛选对靶抗原(如CD4、CCR5或CXCR4多肽)具有特异性的抗体的文库。所述文库可为人scFv噬菌体展示文库，其具有至少1×109(如至少约1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011中的任一者)独特的人抗体片段的多样性。在一些实施方案中，文库为从健康供体的人PMBC和脾提取的DNA构建的原初人文库，涵盖所有人重链和轻链亚家族。在一些实施方案中，文库为从患有各种疾病的患者(如自身免疫性疾病患者、癌症患者和感染性疾病患者)分离的PBMC中提取的DNA构建的原初人文库。在一些实施方案中，文库为半合成的人文库，其中重链CDR3为完全随机的，所有氨基酸(除了半胱氨酸)同样可能存在于任何给定的位置(例如，参见Hoet,R.M.等人,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施方案中，半合成人文库的重链CDR3具有约5至约24个(如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个中的任一者)氨基酸的长度。在一些实施方案中，文库为完全合成的噬菌体展示文库。在一些实施方案中，文库为非人噬菌体展示文库。
以高亲和力结合至靶抗原的噬菌体克隆可通过噬菌体与靶抗原的反复结合来选择，所述靶抗原结合至固体支持物(例如，用于溶液淘选的珠粒或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)，随后除去未结合的噬菌体并洗脱特异性结合的噬菌体。在溶液淘选的实例中，靶抗原可生物素化以固定至固体支持物上。将生物素化的靶抗原与噬菌体文库和固体支持物如链霉亲和素缀合的Dynabeads M-280混合，然后分离靶抗原-噬菌体-珠粒复合物。然后洗脱结合的噬菌体克隆并用于感染合适的宿主细胞，如大肠杆菌XL1-Blue，以用于表达和纯化。在细胞淘选的实例中，将表达CD4、CCR5或CXCR4的细胞与噬菌体文库混合，之后收集细胞，洗脱结合的克隆并用于感染合适的宿主细胞以进行表达和纯化。淘选可用溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(如约2轮、3轮、4轮、5轮、6轮或更多轮中的任一者)，以富集特异性地结合至靶抗原的噬菌体克隆。可通过本领域已知的任何方法(包括例如ELISA和FACS)测试富集的噬菌体克隆与靶抗原的特异性结合。
人和人源化抗体部分
本文所述的抗体部分可为人或人源化的。非人(例如鼠类)抗体部分的人源化形式为通常含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体部分包括人免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(受体抗体)，其中来自接受体CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应非人残基替代。人源化抗体部分也可包含既不存在于接受体抗体部分也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。一般而言，人源化抗体部分可包含实质上所有的至少一个可变结构域，通常为两个可变结构域，其中所有或实质上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的区域，并且所有或实质上所有的FR区域为人免疫球蛋白共有序列的区域。例如，参见Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
通常，人源化抗体部分具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。根据一些实施方案，人源化基本上可按照Winter和同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体部分的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体部分为抗体部分(美国专利号4,816,567)，其中实质上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体部分通常为人抗体部分，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代。
作为人源化的替代方案，可生成人抗体部分。例如，现在有可能产生转基因动物(例如小鼠)，所述转基因动物能够在免疫时，在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整人抗体谱。例如，已描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移至这种种系突变小鼠中，将导致在抗原激发时产生人抗体。例如，参见Jakobovits等人,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year inImmunol.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669；5,545,807；和WO97/17852。或者，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。在激发时，观察到人抗体产生在所有方面都与人中所见非常相似，包括基因重排、组装和抗体谱。这种方法描述于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，以及Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
人抗体也可通过体外活化B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的多种技术、包括噬菌体展示文库来生成。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
另外的变体
在一些实施方案中，考虑本文提供的抗原结合结构域的氨基酸序列变体。例如，可能需要提高抗原结合结构域的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗原结合结构域的氨基酸序列变体可通过将适当的修饰引入编码抗原结合结构域的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这种修饰包括例如抗原结合结构域的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。缺失、插入和取代的任何组合都可获得最终构建体，条件为最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗原结合结构域变体。取代诱变的目标位点包括抗体部分的HVR和FR。可将氨基酸取代引入目标抗原结合结构域中，并筛选产物的所需活性，例如保留/改善抗原结合或降低免疫原性。
保守取代显示于下表4中。本文所论述的变体CORS也可含有此类保守取代。
表4：保守取代
Figure BDA0002850850190000691
氨基酸可根据常见的侧链性质分为不同的类别：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链取向的残基：Gly、Pro；
f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要将这些类别中的一个的成员替换为另一类别。
示例性取代变体为亲和成熟抗体部分，其可方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术生成。简言之，使一个或多个CDR残基突变，将变体抗体部分展示在噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。可在HVR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体部分亲和力。此类改变可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基)(例如，参见Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或特异性决定残基(SDR)中进行，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和自二级文库再选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,(2001)。)
在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一者，将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定任何具有所需亲和力的抗体部分变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。具体而言通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR中，只要此类改变不会显著降低抗体部分结合抗原的能力即可。例如，在HVR中可进行不会显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可能在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个HVR没有改变，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴定可被靶向以诱变的抗原结合结构域的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述。在此方法中，鉴定了残基或一组靶残基(例如带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)并使其被中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗原结合结构域与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。或者或另外，可确定抗原-抗原结合结构域复合物的晶体结构，以鉴定抗原结合结构域与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为取代候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括带有N末端甲硫氨酰残基的抗原结合结构域。抗原结合结构域的其他插入变体包括将抗原结合结构域的N或C末端融合至酶(例如，对于ADEPT)或多肽，其延长抗原结合结构域的血清半衰期。
核酸的表达
本文所述的异源核酸可瞬时或稳定地并入免疫细胞中。在一些实施方案中，异源核酸在工程化的免疫细胞中瞬时表达。例如，异源核酸可以包含异源基因表达盒的染色体外阵列存在于工程化的免疫细胞的核中。可使用本领域已知的任何转染或转导方法(包括病毒或非病毒方法)将异源核酸引入工程化的哺乳动物中。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，如使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，如电穿孔、细胞挤压、声穿孔、光学转染、刺穿、原生质体融合、流体动力递送或转座子；基于粒子的方法，如使用基因枪、磁转染或磁辅助转染、粒子轰击；和混合方法，如核转染。在一些实施方案中，异源核酸为DNA。在一些实施方案中，异源核酸为RNA。在一些实施方案中，异源核酸为线性的。在一些实施方案中，异源核酸为环状的。
在一些实施方案中，异源核酸存在于工程化的免疫细胞的基因组中。例如，异源核酸可通过本领域已知的任何方法整合至免疫细胞的基因组中，所述方法包括但不限于病毒介导的整合、随机整合、同源重组方法和定点整合方法，如使用位点特异性重组酶或整合酶、转座酶、转录活化因子样效应物核酸酶
Figure BDA0002850850190000721
CRISPR/Cas9和锌指核酸酶。在一些实施方案中，异源核酸整合在工程化的免疫细胞基因组的特定设计的基因座中。在一些实施方案中，异源核酸整合在工程化的免疫细胞基因组的整合热点中。在一些实施方案中，异源核酸整合在工程化的免疫细胞基因组的随机基因座中。在异源核酸的多个拷贝存在于单个工程化的免疫细胞中的情况下，异源核酸可整合在工程化的免疫细胞基因组的多个基因座中。
本文所述的异源核酸(例如编码CR、CCOR和COR的核酸)可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，启动子为内源性启动子。例如，可使用本领域已知的任何方法(如CRISPR/Cas9方法)将核酸(例如编码CR、CCOR或COR的核酸)敲入内源性启动子下游的工程化的免疫细胞的基因组中。在一些实施方案中，内源性启动子为丰富蛋白质如β-肌动蛋白的启动子。在一些实施方案中，内源性启动子为诱导型启动子，例如可由工程化的免疫细胞的内源活化信号诱导。在一些实施方案中，其中工程化的免疫细胞为T细胞，启动子为T细胞活化依赖性启动子(如IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。
在一些实施方案中，启动子为异源启动子。
在一些实施方案中，异源核酸(例如编码CR、CCOR或COR的核酸)可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，异源核酸(例如编码CR、CCOR或COR的核酸)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子可操作地连接至编码CR的核酸，并且诱导型启动子可操作地连接至编码CCOR或COR的核酸。在一些实施方案中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码CR的核酸，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码CCOR的核酸，或反之亦然。在一些实施方案中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码CR的核酸，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码COR的核酸，或反之亦然。在一些实施方案中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码CCOR的核酸，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码COR的核酸，或反之亦然。在一些实施方案中，第一诱导型启动子可由第一诱导条件诱导，并且第二诱导型启动子可由第二诱导条件诱导。在一些实施方案中，第一诱导条件与第二诱导条件相同。在一些实施方案中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子同时诱导。在一些实施方案中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子依序诱导，例如，第一诱导型启动子在第二诱导型启动子之前诱导，或第一诱导型启动子在第二诱导型启动子之后诱导。
组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型地表达。本文设想的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)和与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。此类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中得到广泛比较。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在原代人T细胞中驱动嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，hEF1α启动子不仅诱导最高的转基因表达水平，而且在CD4和CD8人T细胞中也得到最佳维持(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，异源核酸中的启动子为hEF1α启动子。
诱导型启动子可由一种或多种条件诱导，如物理条件、工程化的免疫细胞的微环境或工程化的免疫细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或它们的组合。在一些实施方案中，诱导条件并不诱导内源性基因在工程化的免疫细胞中和/或接受药物组合物的受试者中的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐照(如电离辐射、光)、温度(如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化的免疫细胞的活化状态。
在一些实施方案中，启动子可由诱导物诱导。在一些实施方案中，诱导物为小分子，如化学化合物。在一些实施方案中，小分子选自由以下组成的组：强力霉素(doxycycline)、四环素(tetracycline)、醇、金属或类固醇。化学诱导的启动子已经得到了最广泛的探索。此类启动子包括其转录活性受小分子化学物质(如强力霉素、四环素、醇、类固醇、金属和其他化合物)存在与否调控的启动子。强力霉素诱导系统为目前最成熟的系统，所述系统具有四环素反向控制的反式活化剂(rtTA)和四环素应答性元件启动子(TRE)。WO9429442描述四环素应答性启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO9601313公开四环素调控的转录调节剂。此外，Tet技术(如Tet-on系统)已描述于例如TetSystems.com网站上。在本申请中，可使用任一已知的化学调控启动子来驱动治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方案中，诱导物为多肽，如生长因子、激素或细胞表面受体的配体，例如特异性结合肿瘤抗原的多肽。在一些实施方案中，多肽由工程化的免疫细胞表达。在一些实施方案中，多肽由异源核酸中的核酸编码。许多多肽诱导物也为本领域已知，并且它们可能适用于本发明中。例如，基于蜕皮激素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关属于采用类固醇受体来源的反式活化剂的基因开关(WO9637609和WO9738117等)。
在一些实施方案中，诱导物包含小分子组分和一种或多种多肽两者。例如，依赖于多肽二聚化的诱导型启动子为本领域已知，并且可能适用于本发明。第一小分子CID系统开发于1993年，其使用FK1012(药物FK506的衍生物)来诱导FKBP的同二聚化。通过采用类似的策略，Wu等人通过使用雷帕霉素类似物/FKPB-FRB*(Rapalog/FKPB-FRB*)和赤霉素/GID1-GAI(Gibberelline/GID1-GAI)二聚化依赖性基因开关，成功地使CAR-T细胞经由接通开关方式可滴定(C.-Y.Wu等人,Science 350,aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Coumermycin/GyrB-GyrB)(Nature 383(6596):178-81)和HaXS/Snap标签-Halo标签(Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
在一些实施方案中，启动子为光诱导型启动子，并且诱导条件为光。用于调控哺乳动物细胞中的基因表达的光诱导型启动子在本领域中也为众所周知的(例如，参见Science332,1565-1568(2011)；Nat.Methods 9,266-269(2012)；Nature 500:472-476(2013)；Nature Neuroscience 18:1202-1212(2015))。此类基因调控系统可根据其对(1)DNA结合或(2)对DNA结合蛋白的转录活化结构域的募集的调控大致分为两类。例如，在哺乳动物细胞中开发并测试了基于黑视蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，所述系统响应于蓝光(480nm)触发细胞内钙增加，其导致钙调神经磷酸酶介导的NFAT动员。最近，Motta-Mena等人描述新型诱导型基因表达系统，所述系统由天然存在的EL222转录因子开发而来，可对人细胞系和斑马鱼胚胎中的转录起始进行大量蓝光敏感控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。此外，利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的红光诱导的光受体光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子6(PIF6)的相互作用进行红光触发的基因表达调控。此外，也开发出紫外线B(UVB)诱导型基因表达系统并证明在哺乳动物细胞中的靶基因转录中高度有效(Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第4版,CRCPress,2015年1月20日的第25章)。可使用本文所述的任一光诱导型启动子来驱动本发明中治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方案中，启动子为由光诱导型分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导物上的光可裂解的光笼化基团使诱导物保持无活性，除非光笼化基团通过辐照或其他方式去除。所述光诱导型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已开发出笼状蜕皮激素、与lac操纵子一起使用的笼状IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼状丰加霉素(toyocamycin)、与Tet-on系统一起使用的笼状强力霉素和用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼状雷帕霉素类似物(例如，参见Curr Opin Chem Biol.16(3-4):292-299(2012))。
在一些实施方案中，启动子为辐射诱导型启动子，并且诱导条件为辐射，如电离辐射。辐射诱导型启动子也在本领域已知用来控制转基因表达。基因表达的改变发生在辐照细胞时。例如，称为“立即早期基因”的一组基因可对电离辐射迅速作出反应。示例性立即早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其启动子区域中包含辐射反应序列。已在Erg-1启动子中发现共有序列CC(A/T)6GG，并称为血清反应元件或称为CArG元件。辐射诱导启动子和转基因的组合已经深入研究并证明为高效的，并且具有治疗益处。例如，参见Cancer Biol Ther.6(7):1005-12(2007)和Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第4版,CRCPress,2015年1月20日的第25章。任一立即早期基因启动子或任一包含血清应答组件的启动子或可用作辐射诱导型启动子以驱动本发明治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方案中，启动子为热诱导型启动子，并且诱导条件为热。驱动转基因表达的热诱导型启动子也已在本领域中得到广泛研究。热休克或应激蛋白(HSP)(包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等)在保护热或其他物理和化学应力下的细胞方面发挥重要作用。在临床前研究中已经尝试了若干种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子以及生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。人hsp70B基因的启动子于1985年首次描述，其似乎为最高效的热诱导型启动子之一。Huang等人报告，在引入hsp70B-EGFP、hsp70B-TNFα和hsp70B-IL12编码序列后，肿瘤细胞在热处理时表达极高的转基因表达，而在没有热处理的情况下，未检测到转基因的表达。并且在体内IL12转基因加热处理的小鼠组中肿瘤生长显著延迟(Cancer Res.60:3435(2000))。另一组科学家将HSV-tk自杀基因与hsp70B启动子相连，并在患有小鼠乳癌的裸鼠中测试所述系统。与没有热处理的对照相比，已向肿瘤施用hsp70B-HSVtk编码序列并且经热处理的小鼠显示肿瘤消退和显著存活率(Hum.GeneTher.11:2453(2000))。本领域已知的另外热诱导型启动子可参见例如Gene and CellTherapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第4版CRC Press,2015年1月20日的第25章。可使用本文论述的任一热诱导型启动子来驱动本发明治疗性蛋白质的表达。
在一些实施方案中，启动子可由氧化还原状态诱导。可由氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和缺氧诱导型启动子。例如，Post DE等人开发了缺氧诱导型因子(HIF)应答性启动子，所述启动子特异性且强有力地诱导HIF活性肿瘤细胞中的转基因表达(Gene Ther.8:1801-1807(2001)；Cancer Res.67:6872-6881(2007))。
在一些实施方案中，启动子可由工程化的免疫细胞的生理状态(如内源性活化信号)诱导。在一些实施方案中，其中工程化的免疫细胞为T细胞，启动子为T细胞活化依赖性启动子，其可由工程化的T细胞的内源性活化信号诱导。在一些实施方案中，工程化的T细胞由诱导物如PMA、离子霉素(ionomycin)或植物凝集素活化。在一些实施方案中，工程化的T细胞经由内源性T细胞受体或工程化的受体(如重组TCR或CAR)识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原而活化。在一些实施方案中，工程化的T细胞通过阻断免疫检查点、如通过工程化的T细胞或第二工程化的免疫细胞表达的免疫调节剂而活化。在一些实施方案中，T细胞活化依赖性启动子为IL-2启动子。在一些实施方案中，T细胞活化依赖性启动子为NFAT启动子。在一些实施方案中，T细胞活化依赖性启动子为NFκB启动子。
不受限于任何理论或假设，由IL-2启动子的基因转录起始的IL-2表达为T细胞活化的主要活性。佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)或离子霉素或植物凝集素对人T细胞的非特异性刺激导致受刺激的T细胞分泌IL-2。在遗传工程化的T细胞中针对活化诱导的转基因表达对IL-2启动子进行了探索(Virology Journal 3:97(2006))。发现IL-2启动子在人T细胞系中在PMA/PHA-P活化存在下能高效地起始报告基因表达。T细胞受体刺激起始细胞内反应级联，从而导致细胞溶质钙浓度增加，并导致NFAT和NFκB两者的核翻译。活化T细胞的核因子成员(NFAT)为介导T淋巴细胞免疫应答的Ca2+依赖性转录因子。已显示NFAT对活化T细胞中诱导型白细胞介素-2(IL-2)的表达至关重要(Mol Cell Biol.15(11):6299-310(1995)；Nature Reviews Immunology 5:472-484(2005))。发现，在人T细胞系中在PMA/PHA-P活化存在下，NFAT启动子能够高效地起始报告基因表达。也可使用包括核因子κB(NFκB)在内的其他途径经由T细胞活化来控制转基因表达。
免疫细胞
可用于本发明的示例性免疫细胞包括但不限于树突细胞(包括不成熟树突细胞和成熟树突细胞)、T淋巴细胞(如初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T细胞、Treg细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γδT细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞和它们的组合。免疫细胞亚群可通过本领域已知的一种或多种细胞表面标记物(例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在与否来定义。在药物组合物包含多种工程化的哺乳动物免疫细胞的情况下，工程化的哺乳动物免疫细胞可为特定的免疫细胞类型亚群、免疫细胞类型的亚群的组合或两种或更多种免疫细胞类型的组合。在一些实施方案中，免疫细胞存在于同质细胞群体中。在一些实施方案中，免疫细胞存在于在免疫细胞中增强的异质细胞群体中。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞不为淋巴细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞适用于适应性免疫疗法。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为PBMC。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为源自PBMC的免疫细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为CD4+T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为CD8+T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为B细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为NK细胞。
工程化的免疫细胞的制备
通过将一种或多种核酸(包括例如慢病毒载体)、如编码CR、CCOR和/或COR的核酸引入免疫细胞中，可生成表达本文所述的各种构建体(如CR、CCOR和/或COR)的免疫细胞。在一些实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术在本领域中为众所周知的并且描述于例如Sambrook等人(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中。
已开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可将异源核酸插入载体中并使用本领域已知的技术包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并在体外或离体递送至工程化的免疫细胞。许多逆转录病毒系统为本领域已知。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体为本领域已知。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。例如，可用本领域已知的方案包装携带免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂)编码序列的自失活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自失活慢病毒载体。所得慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导哺乳动物细胞(如原代人T细胞)。
在一些实施方案中，引入异源核酸后，转导或转染的哺乳动物细胞离体增殖。在一些实施方案中，培养转导或转染的哺乳动物细胞以增殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一者。在一些实施方案中，将转导或转染的哺乳动物细胞培养不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一者。在一些实施方案中，进一步评估或筛选转导或转染的哺乳动物细胞以选择工程化的免疫细胞。
将一种或多种核酸引入免疫细胞中可使用本领域已知的技术来完成。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞(如工程化的T细胞)能够在体内复制，从而导致长期持续性，这可导致与靶抗原表达相关的疾病(如病毒感染)的持续控制。
在一些实施方案中，本发明涉及施用本文所述的工程化的免疫细胞来治疗患有感染性疾病如HIV或有患感染性疾病如HIV风险的患者。在一些实施方案中，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体PBMC，使用本文所述和本领域已知的方法活化和扩增T细胞，然后将其输注回至患者中。
在一些实施方案中，提供本文所述的工程化的免疫细胞用于治疗HIV。所述细胞可经历稳健的体内扩增，并且可建立在血液和骨髓中长时间高水平持续的靶抗原特异性记忆细胞。在一些实施方案中，输注至患者中的工程化的免疫细胞可消除病毒感染的细胞。在一些实施方案中，输注至患者中的工程化的免疫细胞可消除病毒感染的细胞。
在免疫细胞扩增和遗传修饰之前，从受试者获得免疫细胞的来源。免疫细胞可从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的一些实施方案中，可使用本领域中可获得的任何数量的免疫细胞系。在本发明的一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(如FICOLLTM分离)从手术者收集的血液单位中获得免疫细胞。在一些实施方案中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞，以去除血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，用于后续加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。如本领域技术人员容易理解，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过使用半自动“流过”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器、BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明书进行。在洗涤后，可将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其他有或无缓冲液的盐水溶液中。或者，可去除单采血液成分术样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在一些实施方案中，通过溶解红细胞和耗尽单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离免疫细胞(如T细胞)。可通过正性或负性选择技术进一步分离特定T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一些实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合珠粒(如
Figure BDA0002850850190000811
M-450CD3/CD28 T)一起孵育足以正性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施方案中，时间段为约30分钟。在一些实施方案中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施方案中，时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，时间段为10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段为24小时。在与其他细胞类型相比T细胞更少的任何情况下，可使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合至CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率，可在培养开始时或过程中的其他时间点优先选择保留或淘汰的T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养开始时或在其他所需时间点优先选择保留或淘汰的T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。在一些实施方案中，可能希望进行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未经选择的”细胞。“未经选择的”细胞也可经历其他轮选择。
通过负性选择富集T细胞群体可利用针对负性选择细胞特有的表面标记物的抗体的组合来实现。一种方法为经由使用针对负选择细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，可能希望富集或正性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控性T细胞。或者，在一些实施方案中，通过抗CD25缀合珠粒或其他类似的选择方法耗尽T调控性细胞。
为了通过正性或负性选择分离所需细胞群体，可改变细胞的浓度和表面(例如颗粒，如珠粒)。在一些实施方案中，可能希望显著减少珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于约1亿细胞/ml。在一些实施方案中，使用约1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约1.25亿或约1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或者从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)捕获。此类细胞群体可具有治疗价值并且可能期望获得。例如，使用高浓度的细胞可更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
无论在对免疫细胞进行遗传修饰以表达核酸(如CR、CCOR和/或COR所期望的核酸)之前抑或之后，免疫细胞都可活化和扩增。
在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞(如T细胞)通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体而言，T细胞群体可例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触、或者通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓虫素)结合钙离子载体接触来刺激。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,
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France)可使用本领域中公知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。
遗传修饰
在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为经修饰以阻断或减少CCR5的表达的免疫细胞(如T细胞)。用于破坏基因表达的细胞的修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如RNA干扰(例如siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如，基于CRISPR或TALEN的基因敲除)等。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统生成工程化的具有减少的CCR5表达的免疫细胞(如T细胞)。关于基因编辑的CRISPR/Cas系统的综述，参见例如Jian W和MarraffiniLA,Annu.Rev.Microbiol.69,2015；Hsu PD等人,Cell,157(6):1262-1278,2014；和O’Connell MR等人,Nature 516:263-266,2014。在一些实施方案中，使用基于TALEN的基因组编辑生成T细胞的一个或两个内源性TCR链的表达减少的工程化的免疫细胞(如工程化的T细胞)。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9基因编辑使CCR5基因(或TCR基因)失活。CRISPR/Cas9涉及两个主要特征：短导向RNA(gRNA)和CRISPR相关的核酸内切酶或Cas蛋白。Cas蛋白能够结合至gRNA，所述gRNA含有工程化的间隔区，所述工程化的间隔区定向靶向并随后敲除目标基因。一旦靶向，Cas蛋白即裂解DNA靶序列，从而导致基因敲除。
在一些实施方案中，使用基于转录活化因子样效应物核酸酶
Figure BDA0002850850190000841
的基因组编辑使CCR5基因(或TCR基因)失活。基于
Figure BDA0002850850190000842
的基因组编辑涉及限制酶的使用，所述限制酶可经工程化以靶向特定的DNA区域。转录活化因子样效应子(TALE)DNA结合结构域融合至DNA裂解结构域。TALE负责将核酸酶靶向目标序列，并且裂解结构域(核酸酶)负责裂解DNA，使得去除DNA的所述区段并随后敲除基因。
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)基因组编辑方法使CCR5基因(或TCR基因)失活。锌指核酸酶为人工限制酶，其包含锌指DNA结合结构域和DNA裂解结构域。ZFN DNA结合结构域可经工程化以靶向特定的DNA区域。DNA裂解结构域负责裂解目标DNA序列，使得去除DNA的所述区段并随后敲除基因。
在一些实施方案中，通过使用小干扰RNA(siRNA)降低CCR5基因(或TCR基因)的表达。siRNA分子为20-25个核苷酸长的寡核苷酸双链体，其与目标基因的信使RNA(mRNA)转录物互补。siRNA靶向这些mRNA以破坏。通过靶向，siRNA防止mRNA转录物被翻译，从而防止细胞产生蛋白质。
在一些实施方案中，通过使用反义寡核苷酸来降低CCR5基因(或TCR基因)的表达。靶向mRNA的反义寡核苷酸在本领域中通常为已知的，并且通常用于下调基因表达。参见Watts,J.和Corey,D(2012)J.Pathol.226(2):365-379。)
工程化的免疫细胞的富集
在一些实施方案中，提供根据本文所述的任一工程化的免疫细胞富集工程化的免疫细胞的异质细胞群体的方法。
特异性地结合至靶抗原和靶配体的工程化的免疫细胞(如工程化的T细胞)的特定亚群可通过正性选择技术富集。例如，在一些实施方案中，通过与靶抗原缀合珠粒和/或靶配体缀合珠粒一起孵育足以正性选择所需工程化的免疫细胞的时间段来富集工程化的免疫细胞(如工程化的T细胞)。在一些实施方案中，时间段为约30分钟。在一些实施方案中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施方案中，时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，时间段为10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段为24小时。为了分离异质细胞群题中少量存在的工程化的免疫细胞，使用较长的孵育时间(如24小时)可增加细胞产量。在与其他细胞类型相比工程化的免疫细胞更少的任何情况下，可使用更长的孵育时间来分离工程化的免疫细胞。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。
为了通过正性选择分离所需的工程化的免疫细胞群体，可改变细胞的浓度和表面(例如颗粒，如珠粒)。在一些实施方案中，可能希望显著减少珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于约1亿细胞/ml。在一些实施方案中，使用约1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约1.25亿或约1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能弱表达CR、CCOR和/或COR的工程化的免疫细胞。
在本文所述的任何此类实施方案中的一些中，富集导致工程化的免疫细胞的消耗最小或实质上没有消耗。例如，在一些实施方案中，富集导致少于约50％(如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的工程化的免疫细胞消耗。免疫细胞消耗可通过本领域已知的任何方法、包括本文所述的任何方法来确定。
在本文所述的任何此类实施方案中的一些中，富集导致工程化的免疫细胞的最小终末分化或实质上没有终末分化。例如，在一些实施方案中，富集导致少于约50％(如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的工程化的免疫细胞终末分化。免疫细胞分化可通过本领域已知的任何方法，包括本文所述的任何方法来确定。
在本文所述的任何此类实施方案中的一些中，富集导致工程化的免疫细胞上的CR、CCOR和/或COR的最小内化或实质上没有内化。例如，在一些实施方案中，富集导致工程化的免疫细胞上少于约50％(如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的CR、CCOR和/或COR内化。工程化的免疫细胞上的CR、CCOR或COR的内化可通过本领域已知的任何方式，包括本文所述的任何方式来确定。
在本文所述的任何此类实施方案中的一些中，富集导致工程化的免疫细胞的增殖增加。例如，在一些实施方案中，富集导致富集后工程化的免疫细胞的数量增加至少约10％(如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多中的任一者)。
因此，在一些实施方案中，提供富集表达特异性地结合至CR靶抗原的CR和/或特异性地结合至CCOR靶配体的CCOR的工程化的免疫细胞的异质细胞群体的方法，所述方法包括：a)将异质细胞群体与包含靶抗原或含于其中的一个或多个表位的第一分子和/或包含靶配体或含于其中的一个或多个表位的第二分子接触，以形成包含结合至第一分子的工程化的免疫细胞的复合物和/或包含结合至第二分子的工程化的免疫细胞的复合物；和b)从异质细胞群体分离复合物，从而生成富集工程化的免疫细胞的细胞群体。在一些实施方案中，将第一和/或第二分子单独地固定至固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物为微粒(如珠粒)。在一些实施方案中，固体支持物为表面(如孔的底部)。在一些实施方案中，第一和/或第二分子单独地用标签标记。在一些实施方案中，标签为荧光分子、亲和标签或磁性标签。在一些实施方案中，所述方法还包含从第一和/或第二分子洗脱工程化的免疫细胞并回收洗脱液。
在一些实施方案中，免疫细胞或工程化的免疫细胞例如通过使用负性富集来富集CD4+和/或CD8+细胞，由此使用涉及物理(柱)与磁性(MACS磁珠)纯化步骤的两步纯化方法来纯化细胞混合物(Gunzer,M.等人(2001)J.Immunol.Methods 258(1-2):55-63)。在其他实施方案中，可通过使用专门设计用于富集CD4+或CD8+细胞的T细胞富集柱使细胞群体富集CD4+和/或CD8+细胞。在其他实施方案中，可通过使用市售药盒使细胞群体富集CD4+细胞。在一些实施方案中，市售药盒为EasySepTM人CD4+T细胞富集药盒(StemcellTechnologiesTM)。在其他实施方案中，市售药盒为MagniSort小鼠CD4+T细胞富集药盒(Thermo Fisher Scientific)。在其他实施方案中，市售富集药盒为本领域技术人员已知的药盒。
药物组合物
本文还提供包含本文所述的工程化的免疫细胞(如T细胞)的工程化的免疫细胞组合物(如药物组合物，在本文中也称为制剂)。
组合物可包含同质细胞群体，所述同质细胞群体包含相同细胞类型的工程化的免疫细胞并且表达相同CR和/或CCOR；或异质细胞群体，所述异质细胞群体包含多个工程化的免疫细胞群体，所述多个工程化的免疫细胞群体包含不同细胞类型的工程化的免疫细胞，表达不同CR、不同CCOR和/或不同COR。所述组合物可还包含并非工程化的免疫细胞的细胞。
因此，在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞组合物，所述工程化的免疫细胞组合物包含相同细胞类型的工程化的免疫细胞(如工程化的T细胞)的同源细胞群体并且表达相同CR、CCOR和/或COR。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞和抑制T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞组合物为药物组合物。
在一些实施方案中，提供工程化的免疫细胞组合物，所述免疫细胞组合物包含含有多个工程化的免疫细胞群体的异质细胞群体，所述多个工程化的免疫细胞群体包含不同细胞类型的工程化的免疫细胞，表达不同CR、不同CCOR和/或不同COR。
在一些实施方案中，所述药物组合物适于施用至个体，如人个体。在一些实施方案中，所述药物组合物适于注射。在一些实施方案中，所述药物组合物适于输注。在一些实施方案中，所述药物组合物实质上不含细胞培养基。在一些实施方案中，所述药物组合物实质上不含内毒素或过敏蛋白。在一些实施方案中，“实质上不含”是少于药物组合物的总体积或总重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更小中的任一者。在一些实施方案中，所述药物组合物不含支原体(mycoplasma)、微生物剂和/或感染性疾病病原。
本申请人的药物组合物可包含任何数量的工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物包含工程化的免疫细胞的单一拷贝。在一些实施方案中，所述药物组合物包含工程化的免疫细胞的至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108或更多中的任一者的拷贝。在一些实施方案中，所述药物组合物包含单一类型的工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种类型的工程化的免疫细胞，其中不同类型的工程化的免疫细胞的细胞来源、细胞类型、表达的治疗性蛋白质、免疫调节剂和/或启动子等不同。
在制备组合物期间的不同阶段，冷冻保存细胞可为必要或有益的。术语“冷冻(frozen/freezing)”和“冷冻保存(cryopreserved/cryopreservin g)”可互换使用。冷冻包括冷冻干燥。
在特定实施方案中，细胞可从培养基收获，并以治疗有效量洗涤并且浓缩至载体中。示例性载体包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、Nonnosol-R(Abbott Labs)、Plasma-Lyte A(R)(BaxterLaboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇和它们的组合。
在特定实施方案中，载体可补充有人血清白蛋白(HSA)或其他人血清组分或胎牛血清。在特定实施方案中，用于输注的载体包括含有5％HSA或右旋糖的缓冲盐水。另外的等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更多元糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇或甘露醇。
载体可包括缓冲剂，如柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围可为增积剂至有助于防止细胞粘附至容器壁的添加剂。典型稳定剂可包括多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌氨酸醇、半乳糖醇、甘油和环醇，如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质，如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖，和多糖，如葡聚糖。
在必要或有益的情况下，组合物可包括局部麻醉剂如利多卡因(lidocaine)，以减轻注射部位的疼痛。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六甲铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
组合物内细胞的治疗有效量可大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。
在本文所公开的组合物和制剂中，细胞的体积通常为1升或更小、500ml或更小、250ml或更小或100ml或更小。因此，所施用细胞的密度通常大于104个细胞/ml、107个细胞/ml或108个细胞/ml。
本文还提供核酸组合物(如药物组合物，在本文中也称为制剂)，所述核酸组合物包含本文所述的编码CR、CCOR和/或COR的核酸中的任一者。在一些实施方案中，所述核酸组合物为药物组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物还包含等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂和/或防腐剂中的任一者；和/或水性媒介物，如纯化水、水性糖溶液、缓冲溶液、生理盐水、水性聚合物溶液或不含RNA酶的水。可根据核酸组合物的使用形式适当选择此类待添加的添加剂和水性媒介物的量。
本文所公开的组合物和制剂可通过例如注射、输注、灌注或灌洗来制备以供施用。所述组合物和制剂可进一步配制用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊泡内和/或皮下注射。
待用于体内施用的制剂必须无菌。这容易地通过例如无菌过滤膜过滤来实现。
赋形剂
本发明的药物组合物可用于治疗目的。因此，不同于包含工程化的免疫细胞的其他组合物，例如表达免疫调节剂或其他治疗性蛋白质的生产细胞，本发明的药物组合物包含适于施用至个体的药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂可包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包含自体血清。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包含人血清。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为无毒、生物相容、非免疫原性、生物可降解的，并且可避免宿主的防御机制识别。赋形剂也可含有助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂等。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂增强工程化的免疫细胞或免疫调节剂或其分泌的其他治疗性蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂减少由工程化的免疫细胞分泌的免疫调节剂或其他治疗性蛋白质的聚集。最终形式可为无菌的，并且也可能够容易地穿过注射装置，如空心针。通过适当选择赋形剂，可实现并保持适当的粘度。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为具有约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中任一者的pH范围。在一些实施方案中，也可通过添加合适的张力调节剂如甘油来使药物组合物与血液等渗。
在一些实施方案中，所述药物组合物适于施用至人。在一些实施方案中，所述药物组合物适于通过胃肠外施用施用至人。适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有使制剂与预期接受体的血液相容的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中，并且在即将使用前可储存在仅需要添加本文所述的无菌液体赋形剂、治疗方法、施用方法和给药方案(即水)的条件下以供注射。在一些实施方案中，所述药物组合物含于单一使用小瓶(如单一使用密封小瓶)中。在一些实施方案中，所述药物组合物含于多次使用性小瓶中。在一些实施方案中，所述药物组合物散装含于容器中。在一些实施方案中，所述药物组合物经冷冻保存。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肿瘤部位的局部施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肿瘤内注射。
在一些实施方案中，所述药物组合物必须满足施用至个体的某些标准。例如，美国食品和药品管理局发布设定基于细胞的免疫治疗产品标准的监管指南，包括21CFR 610和21CFR 610.13。评估药物组合物的外观、属性、纯度、安全性和/或效力的方法为本领域已知。在一些实施方案中，所述药物组合物实质上不含能够产生过敏效应的外来蛋白质，如除工程化的哺乳动物免疫细胞外用于细胞培养的动物源蛋白质。在一些实施方案中，“实质上不含”是少于药物组合物总体积或总重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一者。在一些实施方案中，药物组合物在GMP级车间中制备。在一些实施方案中，药物组合物包含少于约5EU/kg体重/hr的内毒素用于胃肠外施用。在一些实施方案中，药物组合物中至少约70％的工程化的免疫细胞为活的以用于静脉内施用。在一些实施方案中，当使用如美国药典(United States Pharmacopoeia，USP)中所述的14天直接接种测试方法进行评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施方案中，在施用药物组合物之前，应在最终收获前约48-72小时(或与培养物的最后一次再进料同时进行)采集包含工程化的免疫细胞与药学上可接受的赋形剂的样品进行无菌测试。在一些实施方案中，药物组合物无支原体污染。在一些实施方案中，药物组合物不含可检测到的微生物剂。在一些实施方案中，药物组合物不含感染性疾病病原，如I型HIV、II型HIV、HBV、HCV、I型人嗜T淋巴细胞病毒；和II型人嗜T淋巴细胞病毒。
使用工程化的免疫细胞的治疗方法
本申请进一步提供施用工程化的免疫细胞来治疗疾病的方法，所述疾病包括但不限于感染性疾病、EBV阳性T细胞淋巴增生性病症、T细胞前淋巴细胞性白血病、EBV阳性T细胞淋巴增生性病症、成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样肉芽肿/塞扎里综合征(sezarysyndrome)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性病症、外周T细胞淋巴瘤(未另行说明)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤以及自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体PBMC，并且使用本文所述和本领域已知的方法活化并扩增T细胞，然后将其输注回至患者中。
所述细胞可经历稳健的体内扩增，并且可建立在血液和骨髓中长时间大量持续的CD4特异性记忆细胞。在一些实施方案中，输注至患者中的工程化的免疫细胞可耗尽癌细胞或病毒感染的细胞。在一些实施方案中，输注至患者中的工程化的免疫细胞可消除癌细胞或病毒感染的细胞。病毒感染治疗可通过例如病毒载量、存活持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。
在一些实施方案中，可将本发明的工程化的免疫细胞施用至个体(例如哺乳动物，如人)来治疗癌症，例如CD4+T细胞淋巴瘤或T细胞白血病。因此，在一些实施方案中，本申请提供治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物(如药物组合物)，所述组合物包含根据本文所述任一实施方案的工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，癌症为T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法还包括向所述个体施用第二抗癌剂。合适的抗癌剂包括但不限于CD70靶向药物、TRBC1、CD30靶向药物、CD37靶向药物、CCR4靶向药物、CHOP(环磷酰胺、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和泼尼松(prednisone))、CHOEP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、依托泊苷和泼尼松)、EPOCH(依托泊苷、长春新碱、阿霉素、环磷酰胺和泼尼松)、超CVAD(环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和地塞米松(dexamethasone))、HDAC抑制剂、CD52抗体贝利司他(Belinostat)、苯达莫斯汀(Bendamustine)、BL-8040、硼替佐米(Bortezomib)、CPI-613、莫加珠单抗(Mogamulizumab)、奈拉滨(Nelarabine)、纳武单抗(Nivolumab)、罗米地辛(Romidepsin)和鲁索替尼(Ruxolitinib)。在一些实施方案中，第二剂为免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA4抗体、抗PD1抗体或抗PD-L1抗体)。在一些实施方案中，第二抗癌剂与工程化的免疫细胞同时施用。在一些实施方案中，第二抗癌剂的施用与工程化的免疫细胞的施用依序(例如，之前或之后)进行。在一些实施方案中，本发明的工程化的免疫细胞组合物与第二、第三或第四剂(包括例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用，以治疗涉及靶抗原表达的疾病或病症。
也可将本发明的工程化的免疫细胞施用至个体(例如哺乳动物，如人)来治疗感染性疾病，例如HIV。因此，在一些实施方案中，本申请提供治疗个体感染性疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含根据本文所述任一实施方案的工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，病毒感染由选自例如人T细胞白血病病毒(HTLV)和HIV(人免疫缺陷病毒)的病毒引起。
在一些实施方案中，提供治疗HIV的方法，所述方法包括施用本文所述的任一工程化的免疫细胞。HIV有两种亚型：HIV-1和HIV-2。HIV-1为全球大流行的原因，并且为具有高毒力和高传染性的病毒。然而，HIV-2仅在西非流行，既没有HIV-1那么致命，也没有HIV-1那么具有传染性。HIV-1与HIV-2感染之间的毒力和传染性差异可能源于HIV-2感染中针对病毒蛋白的更强免疫应答，从而导致受侵袭个体的更高效控制(Leligdowicz,A.等人(2007)J.Clin.Invest.117(10):3067-3074)。这也可能为HIV-1在全球传播和HIV-2有限地理流行的控制性原因。
尽管HIV-2感染比HIV-1感染得到更好的控制，但受HIV-2侵袭的个体仍然受益于治疗。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞用于治疗HIV-1感染。在其他实施方案中，工程化的免疫细胞用于治疗HIV-2感染。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞用于治疗HIV-1和HIV-2感染。
在一些实施方案中，本文所述的治疗感染性疾病的方法还包含向个体施用第二抗感染剂。合适的抗感染剂包括但不限于抗逆转录病毒药物、广泛中和抗体、toll样受体激动剂、潜伏再活化剂、CCR5拮抗剂、免疫刺激剂(例如TLR配体)、疫苗、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂和融合抑制剂。在一些实施方案中，第二抗感染剂与工程化的免疫细胞同时施用。在一些实施方案中，第二抗感染剂的施用与工程化的免疫细胞的施用依序(例如，之前或之后)进行。
在一些实施方案中，个体为哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施方案中，个体为人。在一些实施方案中，个体为临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施方案中，个体小于约60岁(包括例如小于约50岁、40岁、30岁、25岁、20岁、15岁或10岁中的任一者)。在一些实施方案中，个体大于约60岁(包括例如大于约70岁、80岁、90岁或100岁中的任一者)。在一些实施方案中，个体被诊断为患有本文所述的一种或多种疾病或病症(如癌症或病毒感染)，或者在环境或遗传上易患所述疾病或病症。在一些实施方案中，个体具有与本文所述的一种或多种疾病或病症相关的一种或多种风险因素。
在一些实施方案中，所述药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109个细胞/kg体重中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，所述药物组合物以下列中的任一者的剂量施用：约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约104至约109、约104至约106、约106至约108或约105至约107个细胞/kg体重。
在一些实施方案中，其中施用多于一种类型的工程化的免疫细胞，不同类型的工程化的免疫细胞可例如以单一组合物的形式同时施用个体，或者以任何合适的顺序依序施用。
在一些实施方案中，所述药物组合物施用一次。在一些实施方案中，所述药物组合物施用多次(如2次、3次、4次、5次、6次或更多次中的任一者)。在一些实施方案中，所述药物组合物以下列频率施用：每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至1年中的任一者。本领域技术人员可通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
制品和药盒
在本发明的一些实施方案中，提供含有可用于治疗感染性疾病如病毒感染(例如，HIV感染)的材料的制品。制品可包含容器和插容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述疾病或病症的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可为静脉内注射溶液袋或具有可经皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂为免疫细胞，在其表面上呈递本发明的CR和CCOR。标签或包装插页表明所述组合物用于治疗特定疾患。标签或包装插页还将包含用于向患者施用工程化的免疫细胞组合物的说明书。也考虑了包含本文所述的组合疗法的制品和药盒。
包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告的信息。在其他实施方案中，包装插页表明所述组合物用于治疗靶抗原阳性病毒感染(例如HIV感染)。
此外，制品可还包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可进一步包括从商业和使用者角度来看合意的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供可用于各种目的、例如用于治疗本文所述的靶抗原阳性疾病或病症的药盒，其任选地与制品组合。本发明的药盒包括一个或多个包含工程化的免疫细胞组合物(或单位剂型和/或制品)的容器，并且在一些实施方案中还包含另一剂(如本文所述的剂)和/或根据本文所述的任一方法使用的说明书。药盒还可包含适合治疗的个体选择的描述。本发明药盒中供应的说明书通常为标签或包装插页(例如药盒中包括的纸张)上的书面说明书，但机器可读的说明书(例如磁性或光学储存磁盘上携带的说明书)也为可接受的。
示例性实施方案
实施方案1.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域；和b)嵌合共受体(CCOR)，所述嵌合共受体包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域；ii)CCOR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4，或其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
实施方案2.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。
实施方案3.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组，其中所述CCR5、CXCR4或CD4与广泛中和抗体串联。
实施方案4.如实施方案3的工程化的免疫细胞，所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117或10-1074。
实施方案5.如实施方案1-4中任一项的工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞还包含一种或多种共受体(“COR”)。
实施方案6.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：a)编码嵌合受体(CR)的第一核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域；和b)编码嵌合共受体(CCOR)的第二核酸，其中所述CCOR包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域；ii)CCOR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激信号传导结构域；其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4，或其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
实施方案7.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。
实施方案8.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组，并且其中所述CCR5、CXCR4或CD4与广泛中和抗体串联。
实施方案9.如实施方案8的工程化的免疫细胞，所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074。
实施方案10.如实施方案6-9的工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞还包含编码一种或多种共受体(“COR”)的一种或多种核酸。
实施方案11.如实施方案1-10中任一者的工程化的免疫细胞，其中CR为嵌合抗原受体(“CAR”)。
实施方案12.如实施方案11的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域源自选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。
实施方案13.如实施方案12的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜源自CD8α。
实施方案14.如实施方案11的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。
实施方案15.如实施方案14的抗CD4免疫细胞受体，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自CD3ζ。
实施方案16.如实施方案11-15中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR还包含细胞内CR共刺激结构域。
实施方案17.如实施方案16的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR共刺激信号传导结构域源自选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体和它们的组合。
实施方案18.如实施方案17的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR共刺激信号传导结构域包含4-1-BB的细胞质结构域。
实施方案19.如实施方案11-18中任一项的工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞还包含位于所述CR抗原结合结构域的C末端与所述CR跨膜结构域的N末端之间的CR铰链结构域。
实施方案20.如实施方案19的工程化的免疫细胞，其中所述CR铰链结构域源自CD8α。
实施方案21.如实施方案1-10中任一者的工程化的免疫细胞，其中所述CR不包含细胞内共刺激结构域。
实施方案22.如实施方案1-10中任一者的工程化的免疫细胞，其中所述CR为嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
实施方案23.如实施方案22的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域源自选自由以下组成的组的TCR亚单位的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
实施方案24.如实施方案23的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域源自CD3ε的跨膜结构域。
实施方案25.如实施方案22-24中任一项的工程化的免疫细胞，其中源自TCR亚单位的细胞内CR信号传导结构域的细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
实施方案26.如实施方案25的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自CD3ε的细胞内信号传导结构域。
实施方案27.如实施方案22-26中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域和所述细胞内CR信号传导结构域源自相同或不同的TCR亚单位。
实施方案28.如实施方案22-27中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR还包含TCR亚单位的细胞外结构域的一部分。
实施方案29.如实施方案22-28中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR包含融合至CD3ε的N末端的CR抗原结合结构域。
实施方案30.如实施方案6-29中任一项的工程化的免疫细胞，其中编码CR所述的核酸处于诱导型启动子下。
实施方案31.如实施方案6-29中任一项的工程化的免疫细胞，其中编码所述CR的核酸为组成型表达。
实施方案32.如实施方案6-31中任一项的工程化的免疫细胞，其中编码所述CCOR和/或COR的核酸处于诱导型启动子下。
实施方案33.如实施方案6-31中任一者的工程化的免疫细胞，其中编码所述CCOR和/或COR的核酸为组成型表达。
实施方案34.如32的工程化的免疫细胞，其中编码所述CCOR和/或COR的核酸可在免疫细胞活化时诱导。
实施方案35.如实施方案6-34中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体上。
实施方案36.如实施方案35的工程化的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸处于同一启动子控制下。
实施方案37.如实施方案6-31中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸在不同载体上。
实施方案38.如实施方案10-37中任一项的工程化的免疫细胞，其中一种或多种COR编码核酸与所述第一核酸在同一载体上。
实施方案39.如实施方案10-38中任一项的工程化的免疫细胞，其中一种或多种COR编码核酸与所述第二核酸在同一载体上。
实施方案40.如实施方案38或39的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR编码核酸和所述第一核酸或所述第二核酸处于同一启动子控制下。
实施方案41.如实施方案1-40中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CD4。
实施方案42.如实施方案1、5、6和10-40中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR靶抗原为CD4。
实施方案43.如实施方案1、5、6和10-40和42中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4。
实施方案44.如实施方案1、5、6和10-41中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
实施方案45.如实施方案41-44的工程化的免疫细胞，其中所述CR抗原结合结构域或所述CCOR抗原结合结构域特异性地识别CD4的结构域1(CD4 D1)。
实施方案46.如实施方案5和10-45中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR选自由CXCR5、α4β7和CCR9组成的组。
实施方案47.如实施方案46的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR为CXCR5。
实施方案48.如实施方案46或47的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR为α4β7。
实施方案49.如实施方案46-48中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR为CCR9。
实施方案50.如实施方案46-49中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR包含α4β7和CCR9两者。
实施方案51.如实施方案1-50中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞经修饰以减少或消除细胞内CCR5的表达。
实施方案52.如实施方案1-51中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞经修饰以表达抗HIV抗体。
实施方案53.如实施方案52的工程化的免疫细胞，其中所述抗HIV抗体为广泛中和抗体。
实施方案54.如实施方案53的工程化的免疫细胞，其中所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117 10-1074。
实施方案55.如实施方案1-54中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CR靶抗原的肽配体。
实施方案56.如实施方案55的工程化的免疫细胞，其中所述CR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
实施方案57.如实施方案1、5、6和10-56中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体(sdAb)和特异性地结合至CCOR靶抗原的肽配体。
实施方案58.如实施方案57的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
实施方案59.如实施方案1-58中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR共刺激结构域选自由以下组成的组：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、OX40、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、CD83和与CD83特异性结合的配体中的一者或多者的共刺激结构域。
实施方案60.如实施方案1-59中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤细胞、γδT细胞和自然杀伤T细胞。
实施方案61.如实施方案60的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞为细胞毒性T细胞。
实施方案62.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案1-61中任一项的工程化的免疫细胞和药学上可接受的载体。
实施方案63.如实施方案62的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少两种不同类型的根据实施方案1-61中任一项的工程化的免疫细胞。
实施方案64.一种治疗个体的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如实施方案62或63的药物组合物。
实施方案65.如实施方案64的方法，其中所述感染性疾病为选自由HIV和HTLV组成的组的病毒感染。
实施方案66.如实施方案65的方法，其中所述感染性疾病为HIV。
实施方案67.如实施方案64-66的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二抗感染剂。
实施方案68.如实施方案67的方法，其中所述感染剂选自由以下组成的组：抗逆转录病毒药物、广泛中和抗体、toll样受体激动剂、潜伏再活化剂、CCR5拮抗剂、免疫刺激剂和疫苗。
实施方案69.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如实施方案62或63的药物组合物。
实施方案70.如实施方案69的方法，其中所述癌症为T细胞淋巴瘤。
实施方案71.如实施方案69或70的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二抗癌剂。
实施方案72.如实施方案71的方法，其中所述第二抗癌剂选自由以下组成的组：CD70靶向药物、TRBC1、CD30靶向药物、CD37靶向药物和CCR4靶向药物。
实施方案73.如实施方案64-72中任一项的方法，其中所述个体为人。
实施方案74.一种制造如实施方案1-61中任一项的工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括：a)提供免疫细胞群体；b)将编码所述CR的第一核酸引入所述免疫细胞群体中。
实施方案75.如实施方案74的方法，所述方法还包括：c)将编码所述CCOR的第二核酸引入所述免疫细胞群体中。
实施方案76.如实施方案75的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸同时引入细胞中。
实施方案77.如实施方案75的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸依序引入细胞中。
实施方案78.如实施方案74-77中任一项的方法，所述方法还包括将编码一种或多种COR的一种或多种核酸引入所述免疫细胞群体中。
实施方案79.如实施方案74-78中任一项的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述COR编码核酸经由病毒载体引入细胞中。
实施方案80.如实施方案74-79中任一项的方法，所述方法还包括将编码广泛中和抗体(bNAb)或HIV融合抑制肽的核酸引入免疫细胞群体中。
实施方案81.如实施方案74-80中任一项的方法，所述方法还包括使所述细胞中的CCR5基因失活。
实施方案82.如实施方案81的方法，其中通过使用选自由以下组成的组的方法使所述CCR5基因失活：CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN、siRNA和反义RNA。
实施方案83.如实施方案74-82中任一项的方法，所述方法还包括从个体的外周血获得免疫细胞群体。
实施方案84.如实施方案83的方法，其中所述免疫细胞群体进一步富集CD4+细胞。
实施方案85.如实施方案83或84的方法，其中所述免疫细胞群体进一步富集CD8+细胞。
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内，若干个实施方案为可能的。现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明本发明，但当然不应理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：CR和CCOR在原代T细胞和其他哺乳动物细胞中的表达
设计并制备了携带编码由组成型启动子hEF1α、强力霉素诱导型启动子(如TetOn)、NFAT依赖性诱导型启动子或热诱导型启动子(如人热休克蛋白70启动子HSP70p)驱动的CR、CCOR和任选的COR的核酸的慢病毒载体。通过来自健康供体的外周血的密度梯度离心制备原代人外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠分离从PBMC纯化人原代T细胞。用慢病毒载体转导人T细胞，并离体扩增几天。可使用本领域已知的方法检测受体的表达。转导的T细胞的生物活性可通过体外靶细胞杀伤和其他体外分测定以及体内动物模型来评估。
实施例2.材料和方法
细胞。将293T细胞维持在DMEM+10％FBS中。冷冻保存的人外周血单核细胞(PBMC)购自Hemacare。通过T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PBMC分离T细胞，并通过T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi)活化。将T细胞维持在AIM-V培养基+5％胎牛血清(FBS)+300IU/ml IL-2中。
质体和慢病毒产生。嵌合抗原受体(CAR)基因或eTCR基因在pLVX载体中由EF1α启动子控制。通过Genscript合成基因并克隆至载体中。用CAR或eTCR转移质体、第2代慢病毒包装质粒和VSV-G包膜编码质粒转染293T细胞。通过10％聚乙烯亚胺(PEI)试剂将质粒转染至293T细胞中。在转染后48小时和72小时收获病毒上清液。通过0.45μm无菌过滤器过滤上清液以去除细胞碎片。通过PEG法浓缩病毒，等分，并储存在-80℃中。
CAR-T构建。通过Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从PBMC富集pan T细胞，并通过T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi Biotech)活化48小时。将活化的T细胞在8μg/ml聚凝胺存在下与慢病毒一起孵育，并在室温下以1000g旋转接种1小时。使细胞在AIM-V培养基+5％胎牛血清(FBS)+300IU/ml重组人IL-2中扩增。通过流式细胞术测定转导效率为转导后4天的CAR+或eTCR+百分比。
细胞毒性测定。在室温下用PBS中的2.5μM CFSE将靶细胞标记5分钟，然后通过添加1/10体积的FBS终止反应。将细胞洗涤两次并重悬浮于培养基中。将效应细胞和靶细胞以所需的效应物:靶标比率(E:T比率)共培养24小时。通过流式细胞术检查CFSE标记的靶细胞的杀死。
SHIV感染测定。将CD4 T细胞纯化并在体外活化4天，然后用SHIVSF162P3病毒感染。在感染后第12天使用所述细胞作为靶细胞。使用UNT细胞、抗CD4 CAR-T细胞、抗CCR5CAR-T细胞和串联抗CD4/抗CCR5细胞作为效应细胞。将效应细胞和靶细胞以0.5:1和2:1的比率共培养72小时。通过p27细胞内染色检测病毒阳性细胞率。
流式细胞术。抗人CD3、CD4、CD8、CCR5和p27单克隆抗体购自Biolegend和BDBioscience。山羊抗人IgG、F(ab')2多克隆抗体购自Jackson ImmunoResearch。将细胞重悬浮于DPBS+2％FBS+1mM EDTA中进行流式染色。在BD FACSCelesta流式细胞仪中收集数据，并通过Flowjo软件(TreeStar)进行分析。
HTRF测定。将靶细胞与效应细胞共培养24小时。收获细胞培养基，并且通过HTRF测定(Cisbio)检测IFNγ浓度。按照制造商的方案进行测定。简言之，将16μl样品与4μl预先混合的抗IFNγ抗体在测定板中混合。将板在室温下黑暗孵育过夜。通过PheraStar微板读数器检测信号。
QPCR测定。用HIV假病毒感染靶T细胞，所述HIV假病毒也表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。将靶细胞与效应细胞以1:1的比率共培养24小时。收获细胞并收集基因组DNA用于QPCR。通过检测细胞基因组DNA中的EGFP拷贝来检测整合的DNA拷贝。
对淋巴瘤小鼠模型的CAR-T处理。通过皮下注射向NCG小鼠植入HH皮肤T细胞淋巴瘤细胞。当肿瘤大小达到120mm3时，将小鼠分成3组进行处理。将对照UNT细胞和CAR-T细胞重悬于HBSS缓冲液中。通过尾静脉注射向小鼠接种细胞。一组小鼠接受400μl HBSS作为对照。一组小鼠接受2500万个UNT细胞并且最后一组小鼠接受500万个CAR+抗CD4 CAR-T细胞。观察小鼠，记录肿瘤大小和体重，直至实验结束。当肿瘤大小达到2000mm3时处死小鼠。
人源化小鼠模型中的CAR-T体内测试。向新生NCG小鼠移植人造血干细胞，用人免疫细胞重建所述小鼠，并将其命名为HIS小鼠。用抗CD4、抗CCR5或串联抗CD4/抗CCR5 CAR-T细胞处理HIS小鼠。并且在实验期间测试CD4+/CCR5+细胞的存在。
实施例3.CAR T细胞的评估
此实例描述本申请中例示的各种CAR构建体的评估。
嵌合抗原受体(CAR)表达载体的构建。
图6A和6B示出含有抗CD4或抗CCR5或抗CXCR4 scFv或sdAb(图6A)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图6B)的CAR构建体的示意性图示。CAR由抗原识别结构域、铰链、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域4-1BB和CD3ζ细胞内结构域组成。抗原识别结构域可为scFv、sdAb、通过接头连接的两个串联scFv或通过接头连接的两个串联sdAb。scFv或sdAb可识别人CD4或人CCR5或人CXCR4中的任一者。接头可为(GGGGS)n，其中n可为2至5的任一数字。本文所展示的铰链为人CD8的细胞外结构域(SEQ ID NO.2)的一部分。跨膜结构域来自人CD8跨膜结构域(SEQ ID NO.3)。细胞内结构域来自人4-1BB细胞内区域(SEQ ID NO.4)和CD3ζ信号传导转导结构域(SEQ ID NO.5)。用于本实施例中的CAR构建体具有以下序列：
抗CD4 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(抗CD4 CAR)：SEQ ID NO.11，编号49-64。
抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(抗CCR5 CAR)：SEQ ID NO.12，编号35-48。
抗CXCR4 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(抗CXCR4 CAR)：SEQ ID NO.65-72。
抗CD4 scFv-抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(串联抗CD4-抗CCR5CAR)：SEQ ID NO.13
抗CD4 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(具有CXCR5的抗CD4 CAR)：SEQ ID NO.14
抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(具有CXCR5的抗CCR5CAR)：SEQ ID NO.15
抗CD4 scFv-抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(具有CXCR5的串联抗CD4-抗CCR5 CAR)：SEQ ID NO.16
抗CD4 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(具有CXCR5和VRC01的抗CD4 CAR)：SEQ ID NO.17
抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(具有CXCR5和VRC01的抗CCR5 CAR)：SEQ ID NO.18
抗CD4 scFv-抗CCR5 scFv-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(串联抗CD4-具有CXCR5和VRC01的抗CCR5 CAR)：SEQ ID NO.19
CAR细胞构建和表型分型。
从人外周单核细胞(PBMC)分离的T细胞生成CAR-T细胞。使来自PBMC的T细胞在体外富集并活化，然后用编码CAR基因的慢病毒转导。CD8+T细胞通过分泌细胞毒性因子、穿孔素和颗粒酶B活化后具有靶细胞杀死功能。CD8 T细胞的细胞毒性功能对于适应性免疫系统清除感染细胞和监督内在异常细胞转化至关重要。靶细胞杀死功能也为人工工程化的CAR-T细胞最重要的功能。为检查工程化的CAR-T细胞的细胞毒性功能，将CAR-T细胞与pan T细胞以所需比率共培养。其CAR-T细胞命名为效应细胞(E)，而pan T细胞命名为靶细胞(T)。用CFSE标记靶细胞以区别于效应细胞。将靶细胞和效应细胞共培养24小时，然后收获用于流式细胞术。记录CFSE标记的靶细胞百分比以反映细胞毒性效应。使用未转导的T细胞(UNT)作为CAR-T细胞的阴性对照。在CAR-T转导后的一周，在初始筛选期间测试其关键功能，即靶细胞杀死能力。图7示出抗CCR5 CAR-T、抗CD4 CAR-T和抗CXCR4 CAR-T细胞的定量筛选结果。在14种抗CCR5 CAR-T中，13号靶杀死效应最佳。在16种抗CD4 CAR-T中，13号为最有效的一种。在8种抗CXCR4 CAR-T中，5号靶杀死效应最佳。13号抗CD4 CAR-T更名为CD4 CAR-T(SEQ ID NO.11)，并且scFv序列用于以下所有抗CD4设计中。13号抗CCR5 CAR-T更名为抗CCR5 CAR-T(SEQ ID NO.12)，并且其scFv序列用于复合物设计中。
尽管CAR的结构彼此相似，但并非所有的嵌合抗原受体都可同等地转导至T细胞。通过流式细胞术使用山羊抗人IgG、F(ab')2抗体检测CAR+T细胞的百分比。图8A-8E示出转导后4天的CAR+％细胞。
将CAR-T细胞于AIM-V培养基+5％FBS+300IU/ml IL-2中培养。当汇合时将细胞转移至较大孔。供应新鲜的完全培养基来支持细胞扩增。在转导后第0天、第4天、第6天和第10天记录细胞数量和活力。13号抗CD4 CAR-T的扩增显示于图9中。
CAR-T细胞毒性测定
图10A、10B和10E描绘CAR-T细胞的细胞毒性效应的流式细胞术结果。如图10A所示，在与对照UNT细胞共培养的靶细胞中有58％的CD4+T细胞，但当靶细胞与13号抗CD4CAR-T细胞共培养时，CD4+群体减少至0％，从而表明13号抗CD4 CAR-T对其靶有强杀死效应。在图10B中，当靶细胞与UNT共培养时，CCR5+群体为约15％，但当靶细胞与13号抗CCR5CAR-T细胞共培养时，群体减少至小于1％，从而表明13号抗CCR5 CAR-T细胞非常有效。图10E示出串联抗CD4/抗CCR5-CART的效应。串联CART细胞不仅消除CD4单阳性细胞和CCR5单阳性细胞，并且也高效地消除CD4/CCR5双阳性群体。
CAR-T细胞因子谱分析
除穿孔素和颗粒酶B外，CD8+T细胞在活化时也分泌细胞因子IFNγ和TNFα。这些促炎性细胞因子为重要的CD8+T细胞功能指标，但其也可能在适应性T细胞疗法的副作用细胞因子释放综合征中发挥作用。通过体外HTRF测定检测IFNγ的产生。收集转导后第6天的上清液并测量细胞因子水平。图11示出13号抗CD4 CAR-T细胞产生这些细胞因子。
实施例4.eTCR T细胞的评估
此实施例描述本申请中例示的各种嵌合TCR构建体的评估。
抗CD4-eTCR和抗CCR5-eTCR表达载体的构建
T细胞受体α和β链与CD3ε/δ/γ/ζ链形成复合物。TCR识别MHC呈递的抗原，使得CD3ζ链磷酸化并且随后信号转导至细胞内的下游途径以活化T细胞。天然T细胞活化依赖于TCR-MHC相互作用，因此为MHC依赖性的。本文所述的这种嵌合TCR修饰TCR复合物以MHC非依赖性方式活化T细胞。修饰在CD3ε上，所述CD3ε的全称为T细胞表面糖蛋白CD3ε链(SEQ IDNO.6)。CD3ε序列可在公共数据库如Uniprot和NCBI基因库中获得。SEQ ID NO.6中所列示的序列来自Uniprot ID P07766。因此，这种嵌合TCR命名为eTCR。
eTCR基因由慢病毒载体表达并且由EF1α启动子控制。CD3ε信号肽序列(SEQ IDNO.7)之后为抗原识别序列。在抗原识别序列与CD3ε序列(SEQ ID NO.8)之间添加接头(G4S)3序列。在Genscript中将DNA序列优化并且从头合成并通过Gateway克隆克隆至pLVX慢病毒载体中。用于本实施例中的eTCR构建体具有以下序列：
抗CD4-CD3ε(抗CD4 eTCR)：SEQ ID NO.20,73
抗CCR5-CD3ε(抗CCR5 eTCR)：SEQ ID NO.21,74-76
抗CD4-CD3ε-P2A-CXCR5(具有CXCR5的抗CD4 eTCR)：SEQ ID NO.22
抗CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5(具有CXCR5的抗CCR5 eTCR)：SEQ ID NO.23
抗CD4-抗CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5(具有CXCR5的串联抗CD4-抗CCR5 eTCR)：SEQ IDNO.24
抗CD4-抗CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(具有CXCR5和VRC01的串联抗CD4-抗CCR5 eTCR)：SEQ ID NO.25
图12A和图12B示出含有抗CD4或抗CCR5 scFv或sdAb(图12A)或串联连接的抗CD4和抗CCR5 scFv或sdAb(图12B)的示例性eTCR的示意性图示。scFv、sdAb、两个串联scFv或两个串联sdAb通过(G4S)3接头连接至CD3ε链。
靶细胞杀死效应经评估为是否进一步开发eTCR设计的关键决定因素。为检查工程化的eTCR-T细胞的靶细胞杀死效应，将eTCR-T细胞与pan T细胞以所需比率共培养。其eTCR-T细胞命名为效应细胞(E)，而pan T细胞命名为靶细胞(T)。用CFSE标记靶细胞以区别于效应细胞。将靶细胞和效应细胞共培养24小时，然后收获用于流式细胞术。记录CFSE标记的靶细胞百分比以反映细胞毒性效应。使用未转导的T细胞(UNT)作为eTCR-T细胞的阴性对照。图12C定量比较13号CD4 CAR-T、CD4 eTCR、11号CD4 eTCR的靶细胞杀死效应。11号CD4eTCR具有来自伊巴利珠单抗抗体序列的抗原结合区域。11号CD4 eTCR的靶细胞杀死能力不如CD4 eTCR。
图12D示出三种筛选的抗CCR5 eTCR构建体的结果。在三种抗CCR5构建体中，CCR5eTCR具有最佳的靶细胞杀死效应并得到进一步研究。
eTCR-T细胞表型分型
与CAR-T细胞一样，eTCR细胞通过用eTCR编码慢病毒转导活化T细胞来生成。并非所有T细胞都可以相同效率转导。通过流式细胞术使用山羊抗人IgG、F(ab')2抗体检测eTCR+T细胞的百分比。图13A示出在转导后4天的eTCR+％细胞。
eTCR-T细胞扩增
将eTCR-T细胞于AIM-V培养基+5％FBS+300IU/ml IL-2中培养。当汇合时使细胞扩增至更大的孔中并供应新鲜的完全培养基，以确保细胞始终处于理想培养条件下。在转导后第0天、第4天、第6天和第10天记录细胞数量和活力。eTCR-T细胞的扩增显示于图13C中。
eTCR-T细胞毒性
图14示出eTCR-T介导的靶细胞杀死的代表性流式细胞术结果。图14A描绘抗CD4eTCR T细胞的细胞毒性效应的流式细胞术结果，抗CD4 eTCR-T细胞可完全耗尽靶细胞中的CD4+群体。如图14B所示，抗CCR5 eTCR-T细胞也杀死了大部分CCR5+群体。
eTCR-T细胞因子谱分析
通过体外HTRF测定检测IFNγ的产生。将eTCR-T细胞与靶pan T细胞以2:1和0.5:1的比率共培养24小时并收集上清液。图13B示出抗CD4 eTCR-T细胞产生IFNγ细胞因子。使用UNT细胞作为对照。eTCR-T细胞分泌的IFNγ细胞因子仅略高于UNT对照细胞。
实施例5.CXCR5表达T细胞
淋巴结为重要的次级淋巴样器官。B细胞在外周血中循环并且进入淋巴结B细胞滤泡供其成熟，其中在生发中心树突细胞和滤泡T辅助细胞的帮助下，其经历同种型转换和亲和成熟过程。B细胞、树突细胞和滤泡T细胞表达CXCR5，所述CXCR5为CXCL13的受体。CXCL13在生发中心处于高层级，由生发中心基质细胞和树突细胞产生。在B细胞滤泡中CD8+T细胞通常非常罕见。免疫组织学染色显示大量HIV病毒隐藏在滤泡内，这表明生发中心为主要的HIV储库。据报告，精英HIV控制者上的生发中心中的CD8+T细胞增多。这些CD8+T细胞共表达CXCR5并且表达大量细胞毒性效应因子并有助于病毒控制。本申请的某些实施方案包括在CAR-T细胞或eTCR-T细胞上共表达CXCR5。
图15示出具有CAR或eTCR的工程化的T细胞，并且也表达CXCR5。CXCR5通过P2A接头连接至CAR或eTCR基因。抗原识别区域可为抗CD4、抗CCR5或串联抗CD4/抗CCR5。其可能为scFv或sdAb。抗CXCR5抗体用于检测CXCR5表达。
本实验中使用的CAR和eTCR构建体与上述相同。CXCR5具有以下序列：SEQ IDNO.9。图16A描绘CXCR5在转导的抗CD4 CAR-T细胞上的表达，并且图16B描绘CXCR5在抗CCR5CAR-T细胞上的表达。如所述图所示，90％以上的CAR+细胞也表达大量CXCR5。
如图10C和图10D所示，表达CXCR5的CAR-T细胞可如同没有CXCR5的那些CAR-T细胞一样高效地消除其靶细胞。使用共表达CXCR5的CAR-T细胞作为效应细胞，并与CFSE标记的pan T细胞一起培养24小时。在图10C中，当靶细胞与UNT对照细胞一起培养时，CD4+T细胞占63.8％，当靶细胞与共表达CXCR5的抗CD4CAR-T细胞共培养时，所述群体下降至1.46％。如图10D所示，在UNT样品中，CCR5+％为21.2％，而在抗CCR5 CAR-CXCR5样品中，所述百分比减少至0.609％。
图10F描述抗CD4/抗CCR5串联CAR-CXCR5-C34 T细胞的细胞毒性效应。抗CD4/抗CCR5串联CAR-CXCR5-C34 T细胞有效地消除CD4/CCR5双阳性群体，并保留一些CD4或CCR5单阳性群体，这将增加一些疾病环境下的安全性。
实施例6.表达广泛中和抗体的T细胞
在感染HIV的群体中，一小部分人无需服用抗逆转录病毒药物即能自然控制病毒感染。研究发现，其可生成针对病毒感染的稳健抗体反应。这些抗体为广泛中和抗体，因为其识别HIV糖蛋白GP160中相对保守的区域，并能中和HIV的各种亚型。广泛中和抗体已在SHIV感染的恒河猴中进行了测试，并且可控制病毒载量，平均持续21周。本申请的某些实施方案包括在CAR-T细胞或eTCR-T细胞中共表达广泛中和抗体。CAR-T细胞和eTCR-T细胞可分泌广泛中和抗体以阻断新宿主细胞感染HIV。
图17描绘表达抗CD4或抗CCR5或串联抗CD4/抗CCR5 CAR或eTCR、趋化因子受体CXCR5以及还有广泛中和抗体(bNAb)的工程化的T细胞。将编码序列克隆至pLVX慢病毒载体中。嵌合基因转录由EF1α启动子控制。在CAR或eTCR序列之后添加P2A序列。在P2A序列后面添加人CXCR5序列。通过另一P2A将带有人IL2信号肽(SEQ ID NO.34)的bNAb连接至CXCR5。
本实验中使用的CAR和eTCR构建体以及CXCR5与上述相同。VRC01具有以下序列：SEQ ID NO.10。用编码His标签标记的VRC01(VRC01-6His)的CAR-T慢病毒转导T细胞。在转导后第8天收获培养物上清液。通过ELISA使用抗His标签抗体检测上清液中的VRC01浓度。在上清液中检测到的浓度为约40ng/ml。
实施例7.CAR T细胞的功能应用
抗CD4 CAR-T细胞杀死CD4+T细胞，所述CD4+T细胞为HIV感染的主要宿主细胞。为了说明这些细胞是否能消除病毒，在体外用HIV假病毒感染CD4+T细胞。将CAR-T细胞与感染的细胞一起共培养。如图18A所示，与靶向B细胞标记物CD19(SEQ ID NO.77)的对照CAR-T相比，CAR-T细胞显著降低了病毒载量。使用无病毒感染的细胞作为检测对照。在图18B中，用编码EGFP的HIV假病毒感染T细胞，经假病毒成功感染的任何细胞都变成EGFP+。使用这些细胞作为靶细胞，并与13号抗CD4 CAR-T细胞或UNT细胞一起共培养。使用不同的E:T比率。将所述细胞共培养24小时并且收获所述细胞，通过流式细胞术检测EGFP百分比。EGFP+比率随着E:T比率的增加而下降。当E:T比率达到1:1和以上时，假病毒+细胞的百分比降至接近0。在图19A中，将CAR-T构建体与SHIV感染的CD4+靶细胞一起孵育。通过细胞内染色检测病毒蛋白p27。使用两个不同的效应物与靶标比率0.5:1和2:1。如通过p27阳性率所指示成功感染SHIV的细胞在1.3％至1.6％之间。在所有用CAR-T细胞治疗的样品中，p27阳性率下降至等于或小于0.207％，其接近或低于流式染色同种型对照。图19B示出病毒RNA和整合DNA的减少。在细胞培养物上清液中，与用UNT细胞处理的样品相比，用CAR-T细胞处理的样品中的病毒效价急剧下降。整合DNA水平下降至几乎检测不到的程度，由于PCR过程检测到一些背景噪声。所有这些数据显示，CAR-T在体外清除SHIV感染方面非常高效。
为了测试本文所述的CAR构建体的体内功效，使用具有人免疫系统的小鼠。小鼠在此将称为HIS小鼠。HIS小鼠从NOD CRISPR Prkdc IL2Rγ小鼠(NCG小鼠)生成，所述小鼠免疫功能严重受损，并且T细胞和B细胞形成有缺陷。向新生NCG小鼠移植人造血干细胞并重命名为HIS小鼠。人造血细胞在小鼠中发育成T细胞和B细胞，并填充小鼠中的免疫生态位。所述HIS小鼠用作CAR-T细胞的体内测试模型。在体内模型中测试两种CAR-T细胞，CCR5 CAR-T(抗CCR5 CAR)(图23A)和串联CD4CCR5 CAR-T(抗CD4-抗CCR5 CAR)(图23B和23C)。将UNT细胞注射至单独的接受体小鼠组中作为对照。如图23A所指示，在UNT细胞治疗的小鼠中，在向小鼠接种UNT细胞后，CCR5+细胞增加，而在抗CCR5 CAR-T治疗的小鼠中，CCR5+％在观察期间持续减少。在观察期结束时，活细胞群体中的CCR5+％接近0。如图23B和图23C所示，用串联CD4CCR5 CAR-T治疗另一组HIS小鼠。在CAR-T细胞治疗后在小鼠外周血中CCR5+群体显著减少。CCR5+群体几乎完全从外周活细胞群体中耗尽。在串联CD4CCR5 CAR-T组中，CD4+群体也减少至原始群体的一半。CD4+群体在活细胞中的百分比在CAR-T治疗前为约3％，在观察期结束时降至1％。这些数据表明，抗CCR5 CAR-T在体内消灭外周血中的CCR5+细胞方面非常高效。CD4+群体减少至一半并且仍在下降，从而表明除了在消除CCR5+细胞方面具有高效率之外，串联CD4CCR5 CAR-T在减少CD4+群体方面也为有效的。
抗CD4 CAR-T细胞的另一应用可为CD4+T细胞淋巴瘤/白血病疗法。如图20所示，将不同剂量的CAR-T细胞与Sup-T1和HH T成淋巴细胞一起共培养，所述Sup-T1和HH T成淋巴细胞为CD4+。CAR-T细胞显示对所述肿瘤细胞有强细胞毒性，而UNT对照细胞对肿瘤细胞活力无效应。将HH细胞皮下植入至NCG小鼠中以生成细胞来源的异种移植(CDX)小鼠模型。向HH CDX小鼠中体内接种CAR-T细胞显示CAR-T细胞可显著降低小鼠肿瘤负荷，如图21所示。接受CAR-T疗法的小鼠在CAR-T接种后第12天没有肿瘤。如图21A所示，在小鼠满足处死标准之前，使肿瘤在对照汉克氏平衡盐溶液(HBSS)缓冲液或UNT细胞治疗的小鼠中连续生长。经CAR-T处理的小鼠中的肿瘤在处理后迅速缩小，并且小鼠存活了整个观察期。在图21B中，经CAR-T处理的小鼠体重比经HBSS或UNT处理的小鼠略低，这可能由于肿瘤负荷较小所致。大约在第20天，由于疾病进展，将经HBSS和UNT处理的小鼠处死，因此此后没有体重记录。
实施例8.分离CAR系统
分离CAR-T细胞的构建
本文所述的分离CAR系统含有两种组分。一种蛋白质由细胞外抗原识别结构域、铰链、CD8跨膜结构域和CD28细胞内共刺激结构域组成。分离信号CAR的另一蛋白由第二抗原识别结构域、铰链、CD8跨膜结构域和细胞内CD3ζ信号转导结构域组成。一种组分的细胞外抗原识别结构域可为抗CD4 scFv或sdAb，并且另一组分的细胞外抗原识别结构域可为抗CCR5或抗CXCR4 scFv或sdAb(图1)。在本实施例中，两种蛋白质的编码序列利用中间的P2A序列相连。整个编码序列处于pLVX慢病毒质粒中的EF1α启动子的控制下。用CAR构建体成功转导的T细胞将协同表达两种蛋白质。T细胞也可表达归巢受体。归巢受体之一可为CXCR5(图2)，其与CXCL13趋化因子相互作用，并对细胞归巢至次级淋巴样器官中的B细胞滤泡起重要作用。归巢受体也可为上调的α4β7，这有助于细胞归巢至肠(图3)。
分离信号CAR的体外效应
图22示出示例性分离信号CAR-T的体外效应。本实验采用了四种设计。在ssCD4CCR5 CAR-T中，抗CD4与CD3ζ信号传导结构域相连，抗CCR5与共刺激结构域相连，而在ssCCR5CD4中，抗CCR5部分含有CD3ζ信号传导结构域，并且抗CD4与共刺激结构域相连。
构建体具有以下序列：
ssCD4CCR5 CAR-T：SEQ ID NO.26
抗CD4-CD8铰链-CD8 TM-CD3ζ：SEQ ID NO.27
抗CCR5-CD8铰链-CD8 TM-4-1-BB：SEQ ID NO.28
ssCCR5CD4 CAR-T：SEQ ID NO.29
抗CCR5-CD8铰链-CD8 TM-CD3ζ：SEQ ID NO.30
抗CD4-CD8铰链-CD8 TM-4-1-BB：SEQ ID NO.31
ssCD4CCR5-CXCR5：SEQ ID NO.78
ssCCR5CD4-CXCR5：SEQ ID NO.79
所述两个部分通过中间的P2A连接，并且第一部分具有Myc标签。通过流式细胞术检测Myc表达，如图22A所示，以代表分离信号CAR的表达。为了测试其功能，使用CFSE标记的pan T细胞作为靶细胞，并与CAR-T细胞以E:T＝0.5:1共孵育。流式细胞术结果显示于图23B中。在对照UNT样品中，CD4+群体为42.2％，CCR5+群体为9.29％，并且CD4+CCR5+群体为6.64％。SsCD4CCR5 CAR-T和ssCCR5CD4 CAR-T杀死大部分CD4+CCR5+双阳性群体，剩余CD4+CCR5+群体不到1％。在ssCCR5CD4 CAR-T样品中，留下10.4％的CD4单阳性细胞和6.77％的CCR5单阳性细胞。在ssCD4CCR5 CAR-T样品中，剩余的CCR5+细胞为7.89％。在将CXCR5添加至ssCCR5CD4 CAR和ssCD4CCR5 CAR中的情况下，大部分CCR5+细胞得以保留，并且约一半CD4+单阳性细胞在与CAR-T细胞共培养后仍然存活。这些数据表明，当CD4与CCR5皆存在于同一细胞上时，分离CAR效果最好。SsCCR5CD4、ssCCR5CD4-CXCR5和ssCD4CCR5-CXCR5 CAR-T细胞在杀死CD4单阳性细胞或CCR5单阳性细胞方面并非高效，其可使许多那些单阳性细胞不受伤害。嗜CCR5 HIV感染需要CD4和CCR5在同一细胞上表达。分离CAR可消除HIV靶细胞，但使一些CD4或CCR5单阳性细胞不受伤害，所述细胞对HIV感染不太敏感。
根据本发明实施方案的示例性构建体的序列：
Figure BDA0002850850190001221
Figure BDA0002850850190001231
Figure BDA0002850850190001241
Figure BDA0002850850190001251
Figure BDA0002850850190001261
Figure BDA0002850850190001271
Figure BDA0002850850190001281
Figure BDA0002850850190001291
Figure BDA0002850850190001301
Figure BDA0002850850190001311
Figure BDA0002850850190001321
Figure BDA0002850850190001331
Figure BDA0002850850190001341
Figure BDA0002850850190001351
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Figure BDA0002850850190001371
Figure BDA0002850850190001381
Figure BDA0002850850190001391
Figure BDA0002850850190001401
Figure BDA0002850850190001411
序列表
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<120> 用于治疗感染性疾病的共受体系统
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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1355 1360 1365
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Trp Gly Pro Asp Tyr Asn
1370 1375 1380
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser Gly Asp Phe Gly Val Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 抗CCR5 eTCR
<400> 21
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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850
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 具有CXCR5的抗CCR5 eTCR
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<223> 具有CXCR5的串联抗CD4-抗CCR5 eTCR
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
260 265 270
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
275 280 285
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290 295 300
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755 760 765
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770 775 780
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805 810 815
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<210> 25
<211> 1400
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 具有CXCR5和VRC01的串联抗CD4-抗CCR5 eTCR
<400> 25
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1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
35 40 45
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn
65 70 75 80
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Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
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115 120 125
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
165 170 175
Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala
180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
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210 215 220
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Asn Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
275 280 285
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr Gly
290 295 300
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325 330 335
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
340 345 350
Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
355 360 365
Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met Asp
370 375 380
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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625 630 635 640
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900 905 910
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1400
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 分离信号抗CD4-抗CCR5 CAR
<400> 26
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515 520 525
Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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565 570 575
Leu Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
580 585 590
Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala
595 600 605
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
610 615 620
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
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Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp
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<223> 抗CD4-CD8铰链-CD8 TM-CD3ζ
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Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
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Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 抗CCR5-CD8铰链-CD8 TM-4-1-BB
<400> 28
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Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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275 280 285
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
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<210> 29
<211> 898
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 分离信号抗CCR5-抗CD4 CAR
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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245 250 255
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
260 265 270
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275 280 285
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe
340 345 350
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
355 360 365
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
370 375 380
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
385 390 395 400
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
405 410 415
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
420 425 430
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
435 440 445
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
500 505 510
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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565 570 575
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
580 585 590
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
595 600 605
Arg Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
610 615 620
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
625 630 635 640
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp
645 650 655
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu
660 665 670
Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
675 680 685
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
690 695 700
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
740 745 750
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
770 775 780
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
785 790 795 800
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg
805 810 815
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
820 825 830
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
835 840 845
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
850 855 860
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Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
165 170 175
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180 185 190
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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625 630 635 640
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 串联抗CD4-VRC01 CAR
<400> 33
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1 5 10 15
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Asn Leu Glu Ser Gly Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
530 535 540
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
545 550 555 560
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
565 570 575
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
580 585 590
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
595 600 605
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
610 615 620
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
625 630 635 640
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
645 650 655
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
660 665 670
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
675 680 685
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
690 695 700
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
705 710 715 720
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725 730
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
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1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 35
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 1号CCR5 CAR-T
<400> 35
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1 5 10 15
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Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Ser Ile Asn Trp Asn Asp Asp Lys
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115 120 125
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130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Met Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp
180 185 190
Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Val Leu
195 200 205
Val Ile Tyr Gly Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr
225 230 235 240
Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Thr Ser
245 250 255
Thr Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
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Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
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Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
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435 440 445
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<210> 36
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 2号CCR5 CAR-T
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Asp Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro
50 55 60
Val Leu Val Ile Tyr Gly Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
130 135 140
Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu
145 150 155 160
Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Val
165 170 175
Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Ala Ser Ile Asn Trp Asn Asp Asp Lys Cys Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Pro Lys Asn Gln Val Val Leu
210 215 220
Ala Met Ser Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys Ala
225 230 235 240
Leu Asp Met Pro Pro His Asp Ser Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ala Ser
245 250 255
Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 37
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 3号CCR5 CAR-T
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Ile Gly His Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu
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65 70 75 80
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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<220>
<223> 3号CD4 CAR-T
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<220>
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245 250 255
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275 280 285
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1220 1225 1230
His Cys Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys
1235 1240 1245
Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe Pro Gly Trp Arg Arg Ser
1265 1270 1275
Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
1280 1285 1290
<210> 79
<211> 1292
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> ssCCR5CD4-CXCR5
<400> 79
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln
20 25 30
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr Gly
50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
65 70 75 80
Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
100 105 110
Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
115 120 125
Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met Asp
130 135 140
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
165 170 175
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
195 200 205
Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
210 215 220
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
225 230 235 240
Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr
245 250 255
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
290 295 300
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
305 310 315 320
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
325 330 335
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe
340 345 350
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
355 360 365
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
370 375 380
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
385 390 395 400
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
405 410 415
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
420 425 430
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
435 440 445
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala
450 455 460
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
465 470 475 480
Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu
485 490 495
Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
500 505 510
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
515 520 525
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
530 535 540
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
545 550 555 560
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
565 570 575
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
580 585 590
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
595 600 605
Arg Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
610 615 620
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
625 630 635 640
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp
645 650 655
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu
660 665 670
Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
675 680 685
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
690 695 700
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
705 710 715 720
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
725 730 735
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
740 745 750
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
755 760 765
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
770 775 780
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
785 790 795 800
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg
805 810 815
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
820 825 830
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
835 840 845
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
850 855 860
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
865 870 875 880
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
885 890 895
Glu Leu Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
900 905 910
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915 920 925
Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu
930 935 940
Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala
945 950 955 960
Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val
965 970 975
Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val
980 985 990
Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr
995 1000 1005
Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile
1010 1015 1020
Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly
1025 1030 1035
Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe
1040 1045 1050
Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr
1055 1060 1065
Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu
1070 1075 1080
Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val Gly Phe
1085 1090 1095
Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln Gly
1100 1105 1110
His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn
1115 1120 1125
Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His
1130 1135 1140
Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr
1145 1150 1155
Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln
1160 1165 1170
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1175 1180 1185
Phe Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr
1190 1195 1200
Leu Ala Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly
1205 1210 1215
Ser Leu Pro Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala
1220 1225 1230
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1235 1240 1245
Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe Pro Gly Trp Arg Arg Ser
1265 1270 1275
Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
1280 1285 1290

Claims (58)

1.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：
a)嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及
b)嵌合共受体(CCOR)，所述嵌合共受体包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域；ii)CCOR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激结构域，
其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4，或
其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
2.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：
嵌合受体(CR)，所述嵌合受体包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，
其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。
3.如权利要求1或2所述的工程化的免疫细胞，其中所述CCR5、所述CXCR4或所述CD4与广泛中和抗体串联。
4.如权利要求3所述的工程化的免疫细胞，所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117或10-1074。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞还包含一种或多种共受体(“COR”)。
6.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：
a)编码嵌合受体(CR)的第一核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域；以及
b)编码嵌合共受体(CCOR)的第二核酸，其中所述CCOR包含：i)特异性地识别CCOR靶抗原的CCOR抗原结合结构域；ii)CCOR跨膜结构域；和iii)细胞内CCOR共刺激信号传导结构域；
其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4，或
其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
7.一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞包含：
编码嵌合受体(CR)的核酸，其中所述CR包含：i)特异性地识别CR靶抗原的CR抗原结合结构域；ii)CR跨膜结构域，和iii)细胞内CR信号传导结构域，
其中所述CR靶抗原选自由CCR5、CXCR4和CD4组成的组。
8.如权利要求6或权利要求7所述的工程化的免疫细胞，其中所述CCR5、所述CXCR4或所述CD4与广泛中和抗体串联。
9.如权利要求8所述的工程化的免疫细胞，所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117、10-1074。
10.如权利要求6-9所述的工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞还包含编码一种或多种共受体(“COR”)的一种或多种核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR为嵌合抗原受体(“CAR”)。
12.如权利要求11所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜源自CD8α。
13.如权利要求11所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自CD3ζ。
14.如权利要求11-13中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR还包含细胞内CR共刺激结构域。
15.如权利要求14所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR共刺激信号传导结构域包含4-1-BB的细胞质结构域。
16.如权利要求1-10中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR不包含细胞内共刺激结构域。
17.如权利要求1-10中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR为嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
18.如权利要求17所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域源自选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ组成的组的TCR亚单位的跨膜结构域。
19.如权利要求18所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域源自CD3ε的跨膜结构域。
20.如权利要求17-19中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ组成的组的TCR亚单位的细胞内信号传导结构域。
21.如权利要求20所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞内CR信号传导结构域源自CD3ε的细胞内信号传导结构域。
22.如权利要求17-21中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR跨膜结构域和所述细胞内CR信号传导结构域源自相同或不同的TCR亚单位。
23.如权利要求17-22中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR还包含TCR亚单位的细胞外结构域的一部分。
24.如权利要求17-23中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR包含融合至CD3ε的N末端的所述CR抗原结合结构域。
25.如权利要求1-24中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CD4。
26.如权利要求1、5、6和10-25中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR靶抗原为CD4。
27.如权利要求1、5、6和10-24以及26中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CCR5或CXCR4，并且所述CCOR靶抗原为CD4。
28.如权利要求1、5、6和10-25中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR靶抗原为CD4，并且所述CCOR靶抗原为CCR5或CXCR4。
29.如权利要求25-28所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR抗原结合结构域或所述CCOR抗原结合结构域特异性地识别CD4的结构域1(CD4 D1)。
30.如权利要求5和10-29中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR选自由CXCR5、α4β7和CCR9组成的组。
31.如权利要求30所述的工程化的免疫细胞，其中所述一种或多种COR包含α4β7和CCR9两者。
32.如权利要求1-31中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞经修饰以减少或消除所述细胞内CCR5的表达。
33.如权利要求1-32中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞经修饰以表达抗HIV抗体。
34.如权利要求33所述的工程化的免疫细胞，其中所述抗HIV抗体为广泛中和抗体。
35.如权利要求34所述的工程化的免疫细胞，其中所述广泛中和抗体为VRC01、PGT121、3BNC117 10-1074。
36.如权利要求1-35中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
37.如权利要求1-36中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述CCOR抗原结合结构域为scFv或sdAb。
38.如权利要求1-37中任一项所述的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤细胞、γδT细胞和自然杀伤T细胞。
39.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-37中任一项所述的工程化的免疫细胞和药学上可接受的载体。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少两种不同类型的根据权利要求1-38中任一项所述的工程化的免疫细胞。
41.一种治疗个体的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求39或40所述的药物组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述感染性疾病为由选自由HIV和HTLV组成的组的病毒感染。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述感染性疾病为HIV。
44.如权利要求41-43所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二抗感染剂。
45.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求39或40所述的药物组合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述癌症为T细胞淋巴瘤。
47.如权利要求45或46所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二抗癌剂。
48.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述个体为人。
49.一种制备如权利要求1-38中任一项所述的工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括：
a)提供免疫细胞群体；
b)将编码所述CR的第一核酸引入所述免疫细胞群体中。
50.如权利要求49所述的方法，所述方法还包括：
c)将编码所述CCOR的第二核酸引入所述免疫细胞群体中。
51.如权利要求50所述的方法，所述方法还包括将编码一种或多种COR的一种或多种核酸引入所述免疫细胞群体中。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述COR编码核酸经由病毒载体引入所述细胞中。
53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，所述方法还包括将编码广泛中和抗体(bNAb)或HIV融合抑制肽的核酸引入所述免疫细胞群体中。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞中的CCR5基因失活。
55.如权利要求54所述的方法，其中通过使用选自由以下组成的组的方法使所述CCR5基因失活：CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN、siRNA和反义RNA。
56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，所述方法还包括从个体的外周血获得所述免疫细胞群体。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫细胞群体进一步富集CD4+细胞。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述免疫细胞群体进一步富集CD8+细胞。
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