KR20210031898A - 전염병을 치료하기 위한 공동수용체 시스템 - Google Patents

전염병을 치료하기 위한 공동수용체 시스템 Download PDF

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루 천
수 우
리리 천
순 류
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난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
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Abstract

키메라 수용체(CR), 키메라 공동수용체(CCOR) 및/또는 공동수용체(COR)를 포함하는 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공된다.

Description

전염병을 치료하기 위한 공동수용체 시스템
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 13일자로 출원된 PCT/CN2018/095650, 2019년 5월 16일자로 출원된 PCT/CN2019/087259에 대한 우선권 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 분야
본 발명은 전염병, 예컨대, HIV를 치료하는 데 유용한 하나 이상의 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포(예컨대, T 세포)에 관한 것이다.
T-세포 매개 면역은 항원(Ag)-특이적 T 림프구를 발달시켜 바이러스, 박테리아, 기생충 감염 또는 악성 세포를 제거하는 적응 과정이다.
Ag에 노출되면, 미경험(naive) T 세포가 활성화된 이펙터 T 세포로 성숙할 것이다. 이 과정은 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 Ag의 제시를 통해 일어난다. 구체적으로, Ag(즉, 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 악성 세포) 유래의 항원성 펩타이드는 APC의 표면에 위치한 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 일부로서 T 세포에 제시된다. T 세포의 표면에서 발견되는 T 세포 수용체(TCR)는 MHC에 결합하고 결합된 펩타이드를 인식하는 역할을 한다. 이러한 과정은 신호 전달을 촉발하여 T 세포 활성화 및 하류 면역 반응을 초래한다.
TCR에 추가적으로, T 세포는 기능적 특성화에 역할을 하는 마커 및 다른 세포 표면 수용체를 보유한다. 예를 들어, CD8을 보이는 T 세포(CD8+ T 세포, 또한 세포독성 또는 살해 T 세포라고도 알려짐)는 악성이거나, 바이러스에 감염되었거나, 다른 손상 징후를 보이는 세포를 표적화하고 파괴하는 역할을 한다. CD4를 보이는 T 세포(CD4+ T 세포, 또는 헬퍼 T 세포)는 일반적으로 다른 면역 세포의 기능을 돕는 것으로 특징지어진다. Th1, Th2, 및 Th17을 포함하여, 헬퍼 T 세포의 몇 가지 추가 하위집합이 있다. CD8+ 및 CD4+ T 세포는 항원 반응 및 T 세포 매개 면역에서 필수적인 역할을 하지만, 면역계에서의 유일한 T 세포는 아니며: 조절 T 세포(Treg) 및 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함한 다양한 다른 부류가 존재한다.
CD4+ T 세포는 아마도 면역계에서 가장 중요한 조정 역할을 하며, T 세포 매개 면역 및 B 세포 매개, 또는 체액성 면역 둘 다에서 중심적인 역할을 한다. T 세포 매개 면역에서, 이들은 CD8+ T 세포의 활성화 및 성숙에서 역할을 한다. B 세포 매개 면역에서, 이들은 B 세포를 자극하여 증식시키고 B 세포 항체 종류 변환을 유도하는 역할을 한다.
CD4+ T 세포가 수행하는 중심 역할은 아마도 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 여파로 가장 잘 설명된다. 상기 바이러스는 레트로바이러스이며, 이는 상기 바이러스가 숙주 세포에 들어가면 상기 바이러스의 RNA 게놈으로부터 DNA를 생성할 수 있게 하는 역전사 효소와 함께 유전 정보를 RNA로서 전달한다는 것을 의미한다. 그 다음 DNA는 감염된 숙주 세포에 통합될 수 있으며, 이 때 바이러스 유전자가 전사되고 감염된 세포에 의해 더 많은 바이러스 입자가 생성되고 방출된다.
HIV는 우선적으로 CD4+ T 세포를 표적으로 하며; 결과적으로, 면역계의 주요 조정 세포의 개체수가 감소함에 따라, 감염된 환자의 면역계는 점점 더 손상된다. 사실, HIV의 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)으로의 진행은 환자의 CD4+ T 세포 수로 표시된다. 바이러스에 의한 CD4+ T 세포의 이러한 표적화는 또한 감염된 환자가 기회감염성 병원균을 포함한, 다양한 병원균에 대한 생산적인 면역 반응을 성공적으로 수행할 수 없게 만드는 것이다.
HIV에 대한 첫번째 치료제인 지도부딘(ZDV) 또는 아지도타이미딘(AZT)이 1987년 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았다. 이 약물은 뉴클레오사이드 역전사효소 저해제(NRTI)로 분류되었다. 시간이 경과함에 따라, 바이러스 돌연변이로 인해 상기 약물이 감염을 계속 억제할 수 없게 되면서, 약물의 초기 성공률이 하락하였다. 이후 초기 항바이러스 요법(ART)을 대체하기 위해 고활성 항레트로바이러스 요법(HAART)이 도입되었다.
1990년대 중반까지, 연구자와 임상의는 NRTI와 프로테아제 저해제를 둘 다 포함하는 병용 치료의 이익을 관찰하였다. 병용 요법은 오늘날에도 계속 사용되고 있으며, 환자가 이용할 수 있는 다수의 병용 요법이 있다. 일반적으로, 병용 요법은 2가지 NRTI와, 비-뉴클레오사이드 역전사효소 저해제(NNRIT), 프로테아제 저해제, 또는 인테그라제 저해제로 이루어진다. 요컨대, 현재 병용 요법의 일부로 사용되는 6가지 부류의 약물, 즉 진입 저해제, 뉴클레오사이드 역전사효소 저해제, 뉴클레오타이드 역전사효소 저해제, 비-뉴클레오사이드 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제, 및 인테그라제 저해제가 있다.
다양한 약리학적 부류의 약물을 이용하여 바이러스를 표적화하는 것은 바이러스 내성을 방지하고, 감염된 환자에서 상당한 효능을 나타내었지만, 완전한 효능을 보장하기 위해서 환자의 높은 수준의 처방 준수를 필요로 한다. 사실, 처방 비준수는 약물-내성 균주의 출현을 초래할 수 있으며, 이는 환자의 질환 및 후속 합병증을 둘 다 효과적으로 관리하고 치료하는 데 추가의 어려움을 야기한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
일 양태에서 본 출원은 키메라 수용체(chimeric receptor: CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, 및 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR); 및 키메라 공동수용체(chimeric co-receptor: CCOR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인, CCOR 막관통 도메인, 및 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 공동수용체(CCOR)를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 공동수용체(COR)를 더 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, 및 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 CR을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 COR을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 CD4 결합 모이어티, CCR5 결합 모이어티, 및 항-HIV 항체 모이어티(예컨대, 광범위 중화 황체("bNAb") 모이어티) 중 적어도 2가지를 포함한다. 일부 실시형태에서, CR은 CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티를 포함하는 탠덤 CR이다. 일부 실시형태에서, CR은 CD4 결합 모이어티 및 항-HIV 항체 모이어티(예컨대, bNAb 모이어티)를 포함하는 탠덤 CR이다. 일부 실시형태에서, CR은 CCR5 결합 모이어티 및 항-HIV 항체 모이어티(예컨대, bNAb 모이어티)를 포함하는 탠덤 CR이다. CD4 모이어티, CCR5 모이어티 및/또는 bNAb 모이어티는 직접 또는 링커를 통해 서로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 CR을 인코딩하는 제1 핵산(여기서, CR은 CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, 및 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함함), 및 CCOR을 인코딩하는 제2 핵산(여기서, CCOR은 CCOR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인, CCOR 막관통 도메인, 및 세포내 CCOR 공동자극 신호전달 도메인을 포함함)을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 이상의 COR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산(들)을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 CR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공하며, 여기서 CR은 CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, 및 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 이상의 COR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산(들)을 더 포함한다.
상기 실시형태 중 일부 또는 그 이상에 따른 일부 실시형태에서, CR은 세포내 CR 공동자극 도메인을 더 포함한다. 다른 실시형태에서, CR은 세포내 공동자극 도메인을 포함하지 않는다.
상기 실시형태 중 하나 이상에 따른 일부 실시형태에서, CR을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터 하에 있다. 다른 실시형태에서, CR을 인코딩하는 핵산은 구성적으로 발현된다.
상기 실시형태 중 임의의 하나 이상에 따른 일부 실시형태에서, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터 하에 있다. 다른 실시형태에서, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 구성적으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 면역 세포의 활성화시 유도성이다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있다. 다른 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 벡터 상에 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR-인코딩 핵산은 제1 핵산과 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR-인코딩 핵산은 제2 핵산과 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR-인코딩 핵산 및 제1 핵산 또는 제2 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이다. 다른 실시형태에서, CR 표적 항원은 CD4이고, CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR은 CXCR5, α4β7 및 CXCR9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR 중 적어도 하나는 CXCR5이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 COR 중 적어도 하나는 α4β7이다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 COR 중 적어도 하나는 CCR9이다. 또한 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 COR은 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함한다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포 내에서 CCR5의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, CCR5 유전자는 CRISPR/Cas9, TALEN ZFN, siRNA, 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용함으로써 비활성화된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fc(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fc, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CCOR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시형태 중 하나 이상에 따른 일부 실시형태에서, CR 또는 CCOR 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB(CD137), CD27, OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, CD83, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상의 공동자극 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 호산구, 대식세포, 림프구 세포, 및 비만 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 및 자연 살해 T 세포로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 상기 실시형태 중 임의의 것의 조작된 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 2가지 상이한 유형의 조작된 면역 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 상기 기재된 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 전염병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 전염병은 HIV 및 HTLV의 군으로부터 선택되는 바이러스에 의한 간염이다. 일부 실시형태에서, 전염병은 HIV이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 면역 세포 집단을 제공하는 단계 및 면역 세포 집단 내로 CR을 인코딩하는 제1 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 조작된 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, CCOR을 인코딩하는 제2 핵산이 면역 세포 집단 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 세포에 동시에 도입된다. 다른 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 세포 내로 순차적으로 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 COR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 면역 세포 집단 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산이 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입된다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포를 제조하는 방법은 세포에서 CCR5 유전자를 비활성화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CCR5 유전자는 CRISPR/Cas9, TALEN ZFN, siRNA, 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 비활성화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 집단은 개체의 말초 혈액으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 집단은 CD4+ 세포에 대해 추가로 풍부화된다. 다른 실시형태에서, 면역 세포 집단은 CD8+ 세포에 대해 추가로 풍부화된다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다.
도 1A 및 도 1B는 항-CCR5/CXCR4 및 항-CD4를 포함하여 상이한 항원-결합 도메인을 가지는 몇몇 예시적인 수용체 분자의 개략도.
도 2A 및 도 2B는 예시적인 일반 항원(도 2B) 및 특정 항원(HIV)(도 2A) 표적화 작제물과 CXCR5 발현의 개략도.
도 3A 및 도 3B는 예시적인 일반 항원(도 3B) 및 특정 항원(HIV)(도 3A) 표적화 작제물과 CCR9 및 α4β7의 개략도.
도 4는 예시적인 HIV 표적화 작제물과 CCR5 유전자 넉아웃의 개략도.
도 5는 HIV 표적화 작제물과, CCR9 및 α4β7과, CXCR5와, CCR5 유전자 넉아웃의 개략도.
도 6A 및 도 6B는 탠덤으로 연결된 항-CD4 또는 항-CCR5 또는 항-CXCR4 scFv 또는 sdAb(도 6A) 또는 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 6B)를 함유하는 예시적인 CAR 작제물의 개략도. 도 6C는 HIV를 인식하는 광범위 중화 항체에 일렬로 연결된 항-CD4 또는 항-CCR5 scFv 또는 sdAb를 함유하는 예시적인 CAR 작제물의 개략도.
도 7은 상이한 scFv 서열을 보유하는 CAR-T의 시험관내 스크리닝 결과. 도 7A는 14가지 항-CCR5 CAR-T의 상대적 표적-사멸 효과를 나타낸다. 도 7B는 16가지 항-CD4 CAR-T의 상대적 표적-사멸 효과를 나타낸다. 도 7C는 8가지 항-CXCR4 세포의 상대적 표적-사멸 효과를 나타낸다.
도 8A 내지 도 8E는 다양한 작제물의 CAR 발현. 8A: 형질도입되지 않은 T 세포와 비교한 항-CD4-CART 번호 13 세포에서의 CAR 발현; 도 8B: 형질도입되지 않은 T 세포와 비교한 항-CCR5-CAR T 번호 13 세포에서의 CAR 발현; 도 8C: CXCR5를 발현하는 항-CD4-CAR T 세포에서의 CAR 발현. 도 8D: CXCR5를 발현하는 항-CCR5-CAR T 세포에서의 CAR 발현; 도 8E: 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR T 세포, 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR-CXCR5 T 세포, 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR-CXCR5-C34 T 세포에서의 CAR 발현.
도 9는 시험관내에서 항-CD4 CART 번호 13 세포의 증식. 5×105개 세포를 제0일에 CAR 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 후 제4일, 제6일, 및 제10일에 세포를 계수하였다.
도 10A 내지 도 10F는 표적 세포에 대한 다양한 CAR-T 세포의 세포독성 효과. CFSE 표지화 팬(pan) T 세포를 표적 세포로 사용하였다. 도 10A: 항-CD4 CART 번호 13 세포; 도 10B: 항-CCR5 CART 번호 13 세포; 도 10C: CXCR5를 발현하는 항-CD4 CART 세포; 도 10D: CXCR5를 발현하는 항-CCR5CAR T 세포; 도 10e: 항-CD4-항-CCR5 탠덤 CART 세포; 도 10F: 항-CD4-항-CCR5 탠덤 CAR T 세포와 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR-CXCR5-C34 T 세포 간의 비교.
도 11은 항-CD4 CAR T 번호 13 세포에 의한 사이토카인의 발현. 이펙터 항-CD4 CAR T 번호 13 세포를 표적 세포와 2:1 및 0.5:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. 세포 배양물로부터 상청액을 수집하고 상청액 중 사이토카인 수준을 균질 시간 분해 형광(HTRF) 분석에 의해 검출하였다.
도 12A 및 도 12B는 항-CD4 또는 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 12A), 또는 일렬로 연결된 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 12B)를 함유하는 예시적인 eTCR의 개략도. 도 12C는 CD4 번호 13 CAR-T, CD4 eTCR, CD4 eTCR 번호 11의 상대적인 표적 세포 사멸 능력을 나타낸다. 도 12D는 몇몇 CCR5 eTCR 세포의 상대적인 표적 세포 사멸 능력을 나타낸다.
도 13은 eTCR T 세포 특성화의 결과. 도 13A는 항-CD4 eTCR-T 및 항-CCR5 eTCR-T 세포에서 형질도입된 유전자 발현의 검출을 나타낸다. 도 13B는 항-CD4 eTCR-T T 세포에 의한 사이토카인의 발현을 나타낸다. 이펙터 항-CD4 eTCR T 세포를 표적 세포와 2:1 및 0.5:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. 세포 배양물로부터 상청액을 수집하고 상청액 중 사이토카인 수준을 HTRF 분석에 의해 검출하였다. 도 13C는 시험관내에서 항-CD4 eTCR-T 세포의 확장을 나타낸다. 5×105개 세포를 제0일에 eTCR 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 후 제4일, 제6일, 및 제10일에 세포를 계수하였다.
도 14A 및 도 14B. 항-CD4 및 항-CCR5 eTCR-T 세포의 세포독성 효과. 항-CD4 eTCR T 세포, 항-CCR5 eTCR T 세포 또는 대조군 UnT 세포를 CFSE 표지화 1차 T 세포와 2:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. CFSE+ 세포에서 CD4+%(A) 또는 CCR5+%(B)를 유세포 분석에 의해 기록하였다.
도 15A 내지 도 15D는 항-CD4 또는 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 15A 및 도 15C), 또는 일렬로 연결된 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 15B 및 도 15D)를 함유하는 예시적인 CAR 또는 eTCR의 개략도. CAR T 세포 또는 eTCR T 세포는 CXCR5를 추가로 발현한다.
도 16A 및 도 16B는 CD4-CART-CXCR5 세포 및 CCR5-CART-CXCR5 세포에서 CXCR5의 발현.
도 17A 내지 도 17D는 항-CD4 또는 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 17A 및 도 17C), 또는 일렬로 연결된 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 17B 및 도 17D)를 함유하는 예시적인 CAR 또는 eTCR의 개략도. CAR T 세포 또는 eTCR T 세포는 CXCR5 및 광범위 중화 항체를 추가로 발현한다.
도 18A 및 도 18B는 바이러스 부하 제어에 대한 항-CD4 CAR T 세포의 효과. 도 18A: 항-CD4 CAR T 번호 13 세포를 바이러스가 없는 표적 세포 또는 HIV 슈도바이러스 감염 표적 세포와 1:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. 항-CD19 CAR-T(서열번호 77)를 대조군 CAR-T로 사용하였다. 남은 양의 표적 세포를 실시간 PCR에 의해 검출하였다. 도 18B: 항-CD4 CAR T 번호 13 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 EGFP+ 슈도-감염 표적 세포와 표시된 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. EGFP+ 표적 세포를 유세포 분석에 의해 검출하였다.
도 19는 유인원/인간 면역결핍 바이러스(SHIV) 감염의 제어에 대한 CAR-T 효과. 히말라야 원숭이(Rhesus macaque) CD4+ T 세포를 원숭이 말초 혈액으로부터 정제하고 4일 동안 항-CD3/CD28 비드로 활성화한 후 SHIVSF162P3으로 접종하였다. SHIV 감염된 세포를 표적 세포로 사용하였으며, 3일 동안 항-CD4 CART 번호 13, 항-CCR5 CART 번호 13 및 탠덤 항-CD4/항-CCR5 CAR-T 세포와 공동배양하였다. 도 19A는 세포내 염색에 의한 바이러스 p27 항원의 존재를 나타낸다. 도 19B는 세포 배양 상청액의 바이러스 RNA 수준 및 게놈 DNA의 통합 DNA 수준을 나타낸다.
도 20A 및 도 20B는 용량 의존적 방식으로 항-CD4 CAR T 번호 13 세포가 사멸 T 세포 림프종 세포주(SupT1 및 HH)를 사멸시킨 것을 도시한 도면.
도 21A 및 도 21B는 항-CD4 CAR T 번호 13 세포의 생체 내 효능. CDX 마우스를 3개의 그룹으로 분리하였으며: 그룹 1 마우스는 HBSS를 받았고, 그룹 2 마우스는 대조군 unT 세포를 받았으며, 그룹 3 마우스는 항-CD4 CAR T 번호 13 처리를 받았다. 도 21A는 종양 부피를 나타낸다. 도 21B는 처리 후 마우스 체중을 나타낸다.
도 22A는 T 세포 표면 상의 분할 신호 CAR 작제물의 발현. ssCCR5CD4 CAR T 세포에서, 항-CCR5 모이어티를 HA 태그 및 CD3ζ 세포내 도메인과 연결하고, 항-CD4 모이어티를 Myc 태그 및 세포내 공동자극 도메인과 연결하였다. ssCD4CCR5 CAR T 세포에서, 항-CD4 모이어티를 HA 태그 및 CD3ζ 세포내 도메인에 연결하고, 항-CCR5 모이어티를 Myc 태그 및 세포내 공동자극 도메인에 연결하였다. 2개의 모이어티를 P2A에 의해 연결하였다. UNT는 형질도입되지 않은 T 세포를 나타낸다. Myc 태그의 발현을 분할 신호 CAR 시스템의 발현에 대한 대표로서 이 도면에 나타내었다. 도 22B는 작제물의 세포독성 효과를 나타낸다. CAR T 세포 또는 UNT 세포를 CFSE 표지화 표적 세포와 0.5:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다.
도 23A 내지 도 23C는 CAR T 요법의 생체 내 효과. 도 23A는 항-CCR5 CAR T 번호 13 세포로 처리한 HIS 마우스에서 상이한 시점에서의 CCR5+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 23B는 탠덤 항-CD4 항-CCR5 CAR T 세포로 처리한 HIS 마우스에서 CCR5+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 23C는 탠덤 항-CD4 항-CCR5 CAR T 세포로 처리한 HIS 마우스에서 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다.
본 출원은 CCR5(또는 CXCR4) 및 CD4 중 어느 하나로부터 선택되는 CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체("CR")를 발현하는 면역 세포(예컨대, T 세포) 및 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 세포내 CR 신호전달 도메인을 제공한다. 일부 실시형태에서, CR이 공동자극 도메인을 함유하지 않는 경우, CR은 키메라 공동 수용체("CCOR") 공동자극 도메인을 함유하고 CCR5(또는 CXCR4) 또는 CD4(CCOR 표적 항원) 중 다른 하나를 특이적으로 인식하는 키메라 공동수용체("CCOR")와 함께 공동발현될 수 있다. 따라서 CCOR은 CCOR 표적 항원의 결합 시 필요한 공동자극을 제공하여, 면역 세포가 CR 표적 항원 및 CCOR 표적 항원이 둘 다 존재하고 면역 세포에 의해 인식될 때에만 활성화되는 것을 보장한다. 면역 세포는 하나 이상의 공동수용체("COR"), 예를 들어 여포(CXCR5 수용체), 및 내장(α4β7 수용체 또는 CCR9 수용체)와 같은 원하는 위치로 면역 세포의 이동을 촉진시키는 공동수용체를 추가로 발현할 수 있다. 추가적으로, 면역 세포는 추가로 변형되어 CCR5 수용체의 발현을 감소시키거나 넉아웃시켜, 바이러스 감염에 대한 면역 세포(예컨대, CD4+ 면역 세포)의 내성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 CR 및 CCOR을 포함하는 면역 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, CR 및 COR을 포함하는 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CR, CCOR, 및 하나 이상의 COR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 추가로 변형되어 CCR5의 발현을 감소시키거나 넉아웃시킨다.
또한, 면역 세포에서 CR, CCOR 및/또는 COR을 발현하는 핵산 시스템이 제공된다.
또한 치료 목적을 위해 조작된 면역 세포를 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라, 이와 같은 방법에 유용한 키트 및 제조 물품이 제공된다.
정의
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며 구체적으로 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단클론성 항체(전장 단클론성 항체를 포함함), 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포괄한다.
용어 "천연 항체", "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 바와 같이 항체 단편이 아니라 실질적으로 온전한 형태의 항체를 말하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가지는 항체를 지칭한다. 천연 항체는 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄에 따라 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)을 가지고, 그 다음에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린의 다른 부분, 즉 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인(총칭하여, CH) 및 경쇄의 CHL(또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역(HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, FR 영역은 루프 연결을 형성하는 3개의 HVR로 연결되는 베타-시트 구성을 채택하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 사슬에서 HVR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
임의의 포유동물 종 유래의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 항체의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파("κ") 및 람다("λ")라 불리는 2가지 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 IgG "아이소타입" 또는 "하위부류"는 면역글로불린의 불변 영역의 화학적 및 항원적 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 하위부류 중 임의의 것을 의미한다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체(면역글로불린)는 상이한 부류에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 항체의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 바와 같이 항체 단편이 아니라 실질적으로 온전한 형태의 항체를 말하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가지는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 이들 단편은 각각 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편(이의 명칭은 용이하게 결정화하는 능력을 반영함)을 가진다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 2-사슬 Fv 종은 단단한 비-공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv(scFv) 종에서, 2-사슬 Fv 종에서와 유사하게 경쇄 및 중쇄가 "이량체" 구조로 회합될 수 있도록 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이 배열에서 각각의 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6개의 HVR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 추가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함한다. scFv에 대한 검토를 위하여, 예를 들어 문헌[
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, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer Berlin Heidelberg, 1994. 269-315]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 항체 단편을 말하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 가능하게 하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 형성하게 한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 자세히 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만 보통 항체에서 발견되는 경쇄가 없는 기능적 항체를 지칭한다. 낙타과 동물(예컨대, 낙타, 라마, 또는 알파카)은 HCAb를 생성하는 것으로 알려져 있다.
용어 "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 일부 경우에, 단일 도메인 항체는 낙타과 HCAb로부터 조작되고, 이와 같은 sdAb는 본 명세서에서 "나노바디" 또는 "VHHs"로 지칭된다. 낙타과 sdAb는 알려진 가장 작은 항원-결합 항체 단편 중 하나이다(예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993)]; [Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995)]; [Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하며, 예를 들어 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 이와 같은 단클론성 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩타이드 서열은 복수의 폴리펩타이드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩타이드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대, 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화성을 개선시키기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양에서 이의 생성을 개선시키기 위해, 생체 내에서 이의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해 등등, 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 단클론성 항체라는 것이 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와 대조적으로, 단클론성 항체 제조의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대한 것이다. 이러한 특이성에 추가적으로, 단클론성 항체 제조는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법(예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술(예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자 또는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 가지는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하는 기술(예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함하여, 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 단클론성 항체는 구체적으로, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하거나 특정 종으로부터 유래된 항체에서 해당하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하거나 또 다른 종으로부터 유래된 항체뿐만 아니라 이와 같은 항체의 단편에서 해당하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어 관심 항원으로 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkey)를 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된 PRIMATTZED® 항체를 포함한다.
비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 실시형태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR 유래의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 가지는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 전부를 실질적으로 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부 사항은, 예를 들어 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여, 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991). 또한, 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법이 이용 가능하다. 또한 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 접종에 반응하여 이와 같은 항체를 생성하도록 변형되었지만, 이의 내인성 유전자좌가 무능화된 유전자이식 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술과 관련하여 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체와 관련하여 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합한다", "~에 특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적이다"는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대, 표적과 항체 사이의 결합을 말하며, 이는 생물학적 분자를 포함하여 이질적인 분자 집단의 존재 하에 표적의 존재의 결정인자이다. 예를 들어, 표적(이는 에피토프일 수 있음)에 결합하거나 이에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합성을 가지고 더 용이하게, 및/또는 더 긴 기간 동안 이러한 표적에 결합하는 항체이다. 일 실시형태에서, 비관련 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역측정법(RIA)에 의해 측정될 때, 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하 또는 0.1nM 이하의 해리 상수(Kd)를 가진다. 특정 실시형태에서, 항체는 상이한 종 유래의 단백질 중에서 보존되는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 이를 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은, T 세포와 같은 세포에 하나 이상의 항원 특이성을 이식하는 유전적으로 조작된 수용체를 지칭한다. CAR은 또한 "인공 T-세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체", 또는 "키메라 면역 수용체"로도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 종양 항원에 특이적인 항체의 세포외 가변 도메인, 및 T 세포 또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. "CAR-T"는 CAR을 발현하는 T 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 MHC 분자에서 결합된 특정 항원 펩타이드에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 내인성 또는 재조합 T 세포 수용체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, TCR은 TCRα 폴리펩타이드 사슬 및 TCRβ 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
용어 "재조합"은 (1) 천연 발생 환경에서 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부와 연관되지 않거나, (3) 자연에서 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 생체분자, 예를 들어 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드 유사체, 또는 이종성 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드 유사체뿐만 아니라, 이와 같은 핵산에 의해 인코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다.
용어 "발현하다"는 핵산을 단백질로 번역하는 것을 지칭한다. 단백질은 발현되어 세포내에 남아있거나, 세포 표면 막의 구성요소가 되거나, 세포외 기질 또는 배지로 분비될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지원할 수 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대, 대장균(이.콜라이(E.coli)), 또는 진핵 세포, 예컨대, 효모, 곤충 세포, 양서류 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 것이다.
용어 "생체 내"는 세포가 수득되는 유기체의 체내를 지칭한다. "생체 외" 또는 "시험관내"는 세포가 수득되는 유기체의 체외를 의미한다.
용어 "세포"는 1차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
CD3을 발현하는 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "활성화"는 세포 증식 및 사이토카인 생성을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 CD3 신호전달 경로의 하류 이펙터 기능의 검출가능한 증가를 유도하도록 충분히 자극된 세포의 상태를 지칭한다.
단백질의 일부를 말할 때 용어 "도메인"은 단백질을 구성하는 하나 이상의 폴리펩타이드의 구조적 및/또는 기능적 관련 부분을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 이량체 수용체의 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 수용체의 각각의 폴리펩타이드 사슬의 부분을 말할 수 있다. 도메인은 또한 단일 폴리펩타이드 사슬의 관련 부분을 말할 수 있다. 예를 들어, 단량체 수용체의 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 수용체의 단일 폴리펩타이드 사슬의 부분을 말할 수 있다. 도메인은 또한 폴리펩타이드의 단일 부분만을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 핵산"은 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 핵산 또는 이들의 일부 조합을 의미하는 것으로 의도되며, 그 기원으로 인해 "단리된 핵산"은 (1) "단리된 핵산"이 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 연관되지 않거나, (2) 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결되거나, (3) 더 큰 서열의 부분으로서 자연에서 발생하지 않는다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로 축퇴 형태이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 어구 "단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 형태에서 인트론(들)을 함유할 수 있을 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결한다.
용어 "유도성 프로모터"는 하나 이상의 특정 신호를 추가하거나 제거함으로써 활성이 조절될 수 있는 프로모터를 지칭한다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 특정 조건 세트 하에서, 예를 들어 프로모터를 활성화시키고/시키거나 프로모터의 저해를 완화하는 조건 또는 유도제의 존재 하에 작동적으로 연결된 핵산의 전사를 활성화시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하여, 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도 감소, 질환의 안정화(예를 들어, 질환의 악화의 방지 또는 지연), 질환의 확산(예를 들어, 전이)의 방지 또는 지연, 질환의 재발의 방지 또는 지연, 질환의 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선, 질환의 (부분적 또는 전체적) 완화의 제공, 질환의 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약제 용량의 감소, 질환 진행의 지연, 삶의 질의 증가 또는 개선, 체중 증가, 및/또는 생존 연장. 또한 "치료"는 질환의 병리학적 결과(예를 들어, 암에서 종양 부피)의 감소를 포함한다. 본 발명의 방법은 이러한 치료 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
용어 "치료적 유효량"은 개체에서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 양을 지칭한다. 전염병의 경우에, 환자의 상태를 개선할 수 있는 조성물을 포함하는 조성물의 치료적 유효량.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 양립가능한"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어 상기 물질은 어떠한 상당한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 조성물에 함유되는 조성물의 다른 구성요소 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 독성 및 제조 테스트의 필수 표준을 충족시키고/시키거나 미국 식품의약국이 준비한 비활성 성분 가이드(Inactive Ingredient Guide)에 포함되어 있다.
치료의 목적을 위한 "대상체" 또는 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물을 포함한 포유동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 소 등으로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태는 실시형태로 "이루어진" 및/또는 실시형태로 "실질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 값 또는 파라미터의 "약"에 대한 언급은 해당 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 변형을 포함한다(그리고 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아님"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 파라미터 "이외"를 의미하고 기재한다. 예를 들어, 방법이 X 유형의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 상기 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "또는" 및 "the")는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다.
공동수용체 시스템
일부 실시형태에서 본 발명은 i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공하며, 여기서 CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체("CR")를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되며, 여기서 CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 상황 하에서, CR 신호전달 도메인을 통해 생성된 신호만으로는 면역 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 면역 세포 활성화는 2가지 별개 부류의 세포내 신호전달 서열, 즉 CR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것(예컨대, 세포내 CR 신호전달 도메인의 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하는 것(본 명세서에서 "공동자극 신호전달 서열"로 지칭됨)에 의해 매개된다. 공동자극 신호전달 서열은 CR에 존재할 수 있으며; 즉, CR은 CR 공동자극 도메인을 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 공동자극 신호전달 서열은 공동수용체에 의해 제공된다. 구체적으로, 일부 실시형태에서, a) i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR); 및 b) i) 키메라 공동수용체(CCOR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 표적 항원 결합 도메인; ii) CCR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 공동수용체(CCOR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되며, 여기서 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 제1 핵산으로, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 제1 핵산; 및 b) 키메라 공동수용체(CCOR)를 인코딩하는 제2 핵산으로, CCOR은 i) CCOR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 표적 항원 결합 도메인; ii) CCR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되며, 여기서 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, CR 및 CCOR은 핵산으로부터 발현되고, 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, CR은 공동자극 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 유전자 발현을 파괴하기 위한 세포의 변형은, 예를 들어 RNA 간섭(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA), 유전자 편집(예를 들어, CRISPR- 또는 TALEN-기반 유전자 넉아웃) 등을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 이와 같은 기법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 이상의 공동수용체를 더 포함하도록 변형된다. 따라서, 예를 들어 일부 실시형태에서, a) i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하되, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메라 수용체(CR); 및 b) CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동수용체(COR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 공동자극 도메인; 및 iv) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하되, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메라 수용체(CR); 및 b) CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동수용체(COR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5, α4β7 및 CCR9를 전부 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 공동자극 도메인; 및 iv) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5를 인코딩하는 핵산, α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 및 COR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 공동자극 도메인; 및 iv) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하되, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 항-CCR5 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 항-CCR5 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5를 인코딩하는 핵산, α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 및 COR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 광범위 중화 항체("bNAb") 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 광범위 중화 항체("bNAb") 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 공동자극 도메인; 및 iv) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5를 인코딩하는 핵산, α4β7을 인코딩하는 핵산, 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 및 COR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 광범위 중화 항체("bNAb") 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 광범위 중화 항체("bNAb") 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; iii) 세포내 CR 공동자극 도메인; 및 iv) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산; 및 b) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 핵산으로, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5를 인코딩하는 핵산, α4β7을 인코딩하는 핵산, 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 및 COR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 본 명세서에 기재된 CR, CCOR, 및 하나 이상의 COR을 발현하도록 조작된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, a) i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR); b) i) 키메라 공동수용체(CCOR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 표적 항원 결합 도메인; ii) CCR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 공동수용체(CCOR); 및 c) 공동수용체(COR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되며, 여기서 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5, α4β7 및 CCR9를 전부 포함한다. 일부 실시형태에서, CR은 CR 세포내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 제1 핵산으로, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 제1 핵산; b) 키메라 공동수용체(CCOR)를 인코딩하는 제2 핵산으로, CCOR은 i) CCOR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 표적 항원 결합 도메인; ii) CCR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 제2 핵산, 및 c) 공동수용체(COR)를 인코딩하는 제3 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되며; 여기서 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이다. 일부 실시형태에서, COR은 CXCR5, α4β7, CCR9, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 α4β7을 인코딩하는 핵산 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR5를 인코딩하는 핵산, α4β7을 인코딩하는 핵산, 및 CCR9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR, CCOR 및 COR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국재화된다. 일부 실시형태에서, CR은 CR 세포내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 서브유닛의 하나 또는 둘 다의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
일부 실시형태에서, CR을 인코딩하는 핵산 서열, CCOR을 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 실시형태에서, CR, CCOR, 및 COR 핵산 서열은 각각 상이한 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 일부 또는 전부는 동일한 벡터에 함유된다. 벡터는, 예를 들어 포유동물 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 벡터는 면역 세포의 숙주 게놈 내로 통합된다. 일부 실시형태에서, CR, CCOR 및/또는 COR 핵산 서열은 각각 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 동일한 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 상이한 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 일부 또는 전부는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터의 일부 또는 전부는 유도성이다. 예를 들어, CCOR 및 COR 핵산은 면역 세포의 활성화시 유도성인 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터의 일부 또는 전부는 구성적이다.
상기 실시형태 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 호산구, 대식세포, 림프구 세포, 및 비만 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 및 자연 살해 T 세포로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD4 발현에 대해 풍부화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD8 발현에 대해 풍부화된다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 1차 면역 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 면역 활성을 가지도록 인공적을 유도된 세포(예를 들어, iPS 세포)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD4+ 면역 세포(또는 CD4 발현에 대해 풍부화된 면역 세포)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD8+ 면역 세포(또는 CD8 발현에 대해 풍부화된 면역 세포)로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, CR, CCOR, 및 COR을 인코딩하는 핵산 중 2개 이상이 단일 프로모터의 제어 하에 있을 때, 핵산은 내부 리보솜 유입점(IRES) 및 자가-절단 2A 펩타이드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 통해 연결될 수 있다.
키메라 수용체(CR) 작제물
본 명세서에 기재된 CR은 CR 표적 항원, CR 막관통 도메인, 및 세포내 CR 신호전달 도메인을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 CR 막관통 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 예를 들어, CR은 N-말단에서 C-말단으로, CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, 및 CR 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드일 수 있다. CR 항원 결합 도메인, CR 막관통 도메인, CR 세포내 도메인은 서로 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 CR 막관통 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 비-공유적으로 결합된다. 이는, 예를 들어 하나는 CR 항원 결합 도메인에 융합되고(예를 들어, CR 항체 결합 도메인의 C-말단에 융합됨), 다른 하나는 CR 막관통 도메인에 융합되는(예를 들어, CR 막관통 도메인의 N-말단에 융합됨) 결합 쌍의 2개 구성원을 사용함으로써 달성될 수 있다. 2개의 구성요소는 결합 쌍의 2개의 구성원의 상호작용을 통해 합쳐진다. 예를 들어, CR은, i) CR 항원 결합 도메인 및 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 ii) 결합 쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 구성원 및 제2 구성원은 서로 비-공유적으로 결합한다. 결합 쌍의 제1 구성원은 CR 항원 결합 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 유사하게, 결합 쌍의 제2 구성원은 CR 막관통 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 적합한 결합 쌍은 류신 지퍼, 비오틴/스트렙트아비딘, MIC 리간드/iNKG2D 등을 포함하지만 이들 제한되는 것은 아니다. 문헌[Cell 173, 1426-1438, Oncoimmunology. 2018; 7(1): e1368604], US10259858B2를 참조한다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 일렬로 연결된 CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 일렬로 연결된 CD4 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 일렬로 연결된 CCR5 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티, CCR5 결합 모이어티 및/또는 bNAb 모이어티는 scFv 또는 sdAb로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 세포내 CR 신호전달 도메인은, CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질에서 발견되는 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 기능적 1차 면역 세포 신호전달 서열을 포함한다. "기능적" 1차 면역 세포 신호전달 서열은 적절한 수용체에 작동 가능하게 커플링될 때 면역 세포 활성화 신호를 형질도입할 수 있는 서열이다. 1차 면역 세포 신호전달 서열의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있는 "비-기능적" 1차 면역 세포 신호전달 서열은 면역 세포 활성화 신호를 형질도입할 수 없다. 본 명세서에 기재된 CCOR에는 기능적 1차 면역 세포 신호전달 서열이 없다. 일부 실시형태에서, CCOR에는 임의의 1차 면역 세포 신호전달 서열이 없다.
일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 하나 이상의 막관통 도메인을 포함한다.
CR 항원 결합 도메인은 CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티 또는 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 a) 다른 분자에 대한 결합 친화성의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화성; 또는 b) 다른 분자에의 결합에 대한 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 또는 그 이하 중 어느 하나 이하)인 Kd로 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 결합 친화성은 당업계에 알려진 방법, 예컨대, ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사선면역침강 분석(RIA)에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 비아코어 인스트루먼츠(Biacore instruments)를 이용하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 또는 예를 들어 사피딘 인스트루먼츠(Sapidyne instruments)를 이용하는 운동역학 배제 분석(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 다중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 디아바디(Db), 단일 사슬 디아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체, 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 완전 인간, 인간 항체 프레임워크 영역을 가지는 반-합성, 또는 인간화된 것이다.
일부 실시형태에서 항체 모이어티는 하나 이상의 항체 모이어티(예컨대, 단클론성 항체) 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이와 같은 서열의 특정 변이체로부터 유래된 특정 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 서열의 아미노산 치환은 표적 항원에 결합하는 항원-결합 도메인의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 표적 항원 결합 친화성을 실질적으로 개선시키거나 일부 다른 특성, 예컨대, 표적 항원의 관련 항체와의 특이성 및/또는 교차-반응성에 영향을 미치는 변경도 또한 고려된다.
일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 약 0.1pM 내지 약 500nM(예컨대, 약 0.1pM, 1.0pM, 10pM, 50pM, 100pM, 500pM, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 또는 500nM 중 어느 하나로서 이들 값 사이의 임의의 값을 포함함)의 Kd로 CR 표적 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 단독으로 발현되거나 CCOR 없이 COR과 공동발현될 때, CR은 세포내 CR 공동자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 세포내 CR 공동자극 도메인은, 예를 들어 CD28, 4-1BB(CD137), CD27, OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, CD83, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 공동자극 분자의 세포내 도메인의 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 CR 공동자극 도메인은 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 CCOR 공동자극 도메인은 CD28의 단편 및 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 CCOR과 공동발현될 때, CR은 기능적 공동자극 도메인을 포함하지 않는다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체(CR) 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체(CR) 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5) 또는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5)을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체(CR) 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5) 또는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5)을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 키메라 수용체(CR) 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 키메라 수용체(CR) 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산으로, CR은 i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5) 또는 하나 이상의 COR(예컨대, CXCR5)을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CR은 키메라 항원 수용체("CAR")이다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CD4 CAR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CD4 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CD4 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CCR5 CAR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CCR5 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CCR5 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 CAR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 결합-모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 결합 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 일렬의 항-CD4 bNAb CAR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CD4 bNAb CAR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CD4 bNAb CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는, VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074, N6, VRC07, VRC07-523, eCD4-IG, 10E8, 10E8v4, PG9, PGDM 1400, PGT151, CAP256.25, 35O22, 8ANC195 등을 포함하여, 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 일렬의 항-CCR5 bNAb CAR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CCR5 bNAb CAR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 힌지 서열(예컨대, CD8로부터 유래된 힌지 서열); iii) CR 막관통 도메인(예컨대, CD8 막관통 도메인), iv) 세포내 공동자극 도메인(예컨대, 4-1BB 또는 CD28로부터 유래된 공동자극 도메인); 및 v) 세포내 CR 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항-CCR5 bNAb CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는, VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074, N6, VRC07, VRC07-523, eCD4-IG, 10E8, 10E8v4, PG9, PGDM 1400, PGT151, CAP256.25, 35O22, 8ANC195 등을 포함하여, 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CR은 키메라 TCR 수용체("cTCR")이다. cTCR은 전형적으로 TCR 서브유닛의 전장 또는 일부, 예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ에 (직접 또는 간접적으로) 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 융합 폴리펩타이드는 다른 TCR 서브유닛과 함께 기능적 TCR 복합체에 통합될 수 있고 TCR 복합체에 항원 특이성을 부여한다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인은 CD3ε 서브유닛의 전장 또는 일부("eTCR"로 지칭됨)에 융합된다. cTCR의 세포내 CR 신호전달 도메인은 TCR 서브유닛의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래될 수 있다. CR 막관통 도메인은 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 CR 신호전달 도메인 및 CR 막관통 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 CR 신호전달 도메인 및 CR 막관통 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 결합 도메인 및 TCR 서브유닛(또는 이의 일부)은 링커(예컨대, GS 링커)를 통해 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, cTCR은 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 세포외 도메인을 더 포함하며, 상기 세포외 도메인은 세포내 CR 신호전달 도메인 및/또는 CR 막관통 도메인이 유래된 TCR 단위와 동일하거나 상이할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CD4 cTCR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CD4 cTCR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CD4 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CD4 cTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)일 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, cTCR은 전장 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CCR5 cTCR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CCR5 cTCR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5를 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-CCR5 항체 모이어티, 예컨대, scFv 또는 sdAb); ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 항-CCR5 cTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, cTCR은 전장 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 cTCR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 cTCR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 항-CCR5 cTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)일 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, cTCR은 전장 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 CCR5 결합 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 CCR5 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 bNAb cTCR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 bNAb cTCR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, i) CD4 결합 모이어티(예컨대, 항-CD4 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CD4 bNAb cTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CR 항원 도메인은 도메인 1을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, CR 항원 도메인은 CD4의 도메인 1을 특이적으로 인식하는 항-CD4 항체(예를 들어, scFv 또는 sdAb)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, cTCR은 전장 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CD4 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는, VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074, N6, VRC07, VRC07-523, eCD4-IG, 10E8, 10E8v4, PG9, PGDM 1400, PGT151, CAP256.25, 35O22, 8ANC195 등을 포함하여, 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CCR5 bNAb cTCR이 제공된다. 일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CCR5 bNAb cTCR을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, i) CCR5 결합 모이어티(예컨대, 항-CCR5 항체 모이어티, 예를 들어 scFv 또는 sdAb) 및 bNAb 모이어티(예컨대, scFv 또는 sdAb)를 포함하는 CR 항원 결합 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인; ii) 선택적인 링커(예컨대, GS 링커); iii) TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인; iii) TCR 서브유닛으로부터 유래된 CR 막관통 도메인, 및 iv) TCR 서브유닛으로부터 유래된 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 일렬의 항-CCR5 bNAb cTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CR 막관통 도메인, 세포내 CR 신호전달 도메인, 및 TCR 서브유닛 또는 이의 일부의 선택적인 세포외 도메인은 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, cTCR은 전장 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티 및 bNAb 모이어티는 일렬로 연결된다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 N-말단이다. 일부 실시형태에서, CCR5 결합 모이어티는 bNAb 모이어티에 대한 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는, VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074, N6, VRC07, VRC07-523, eCD4-IG, 10E8, 10E8v4, PG9, PGDM 1400, PGT151, CAP256.25, 35O22, 8ANC195 등을 포함하여, 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 bNAb를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
키메라 공동자극 수용체(CCOR)
본 명세서에 기재된 키메라 공동자극 수용체(CCOR)는 CCOR 표적 항원에 특이적으로 결합하고 표적 결합시 기능적으로 발현되는 표면에서 면역 세포를 자극할 수 있게 한다. CCOR은 표적-결합 특이성, 막관통 도메인, 및 면역 세포를 자극할 수 있는 CCOR 공동자극 도메인을 제공하는 CCOR 항원 결합 도메인을 포함한다. CCOR에는 기능적 1차 면역 세포 신호전달 서열이 없다. 일부 실시형태에서, CCOR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열이 없다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포에서 CCOR의 발현은 유도성이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 발현은 CR을 통한 신호전달시 유도성이다.
본 발명의 CCOR에서 사용하기 위한 공동자극 면역 세포 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체(TCR)의 공동수용체의 세포질 서열(이는 CR과 함께 작용하여 CR 참여 후 신호 전달을 개시할 수 있음)뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 가지는 이들 서열 및 임의의 합성 서열의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
세포내 CCOR 공동자극 도메인은, 예를 들어 CD28, 4-1BB(CD137), CD27, OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, CD83, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하여, 공동자극 분자의 세포내 도메인의 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 CCOR 공동자극 도메인은 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 CCOR 공동자극 도메인은 CD28의 단편 및 4-1BB의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, CCOR 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 하나 이상의 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CCOR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 a) 다른 분자에 대한 결합 친화성의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화성; 또는 b) 다른 분자에의 결합에 대한 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 또는 그 이하 중 어느 하나 이하)인 Kd로 CCOR 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 결합 친화성은 당업계에 알려진 방법, 예컨대, ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사선면역침강 분석(RIA)에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 비아코어 인스트루먼츠를 이용하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 또는 예를 들어 사피딘 인스트루먼츠를 이용하는 운동역학 배제 분석(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 다중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 디아바디(Db), 단일 사슬 디아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체, 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 완전 인간, 인간 항체 프레임워크 영역을 가지는 반-합성, 또는 인간화된 것이다.
일부 실시형태에서 항체 모이어티는 하나 이상의 항체 모이어티(예컨대, 단클론성 항체) 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이와 같은 서열의 특정 변이체로부터 유래된 특정 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 서열의 아미노산 치환은 표적 항원에 결합하는 항원-결합 도메인의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 표적 항원 결합 친화성을 실질적으로 개선시키거나 일부 다른 특성, 예컨대, 표적 항원의 관련 항체와의 특이성 및/또는 교차-반응성에 영향을 미치는 변경도 또한 고려된다.
일부 실시형태에서, CCOR 항원 결합 도메인은 약 0.1pM 내지 약 500nM(예컨대, 약 0.1pM, 1.0pM, 10pM, 50pM, 100pM, 500pM, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 또는 500nM 중 어느 하나로서 이들 값 사이의 임의의 값을 포함함)의 Kd로 CCOR 표적 항원에 결합한다.
CR 및 CCOR 항원-결합 도메인
본 명세서에 기재된 CR 및 CCOR은 CD4, CCR5, 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 항원을 특이적으로 인식한다. 상기에서 논의된 바와 같이, CR이 CD4를 특이적으로 인식할 때, CCOR은 CCR5 또는 CXCR4를 특이적으로 인식할 것이다. 대안적으로, CR이 CCR5 또는 CXCR4를 특이적으로 인식할 때, CCOR은 CD4를 특이적으로 인식할 것이다. 표적 항원 및 항원 결합 도메인은 하기 섹션에서 보다 상세히 논의되며, 이는 일반적으로 CR 항원 결합 도메인(및 CR 표적 항원)과 CCOR 항원 결합 도메인(및 CCOR 표적 항원) 둘 다에 적용 가능하다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 CCR5이다. CCR5는 내재성 막 단백질의 베타 케모카인 수용체 패밀리에 속하는 7개의 막관통 도메인을 가지는 G 단백질-결합 수용체이다. CCR5는 352개의 아미노산으로 구성되고 대략 41 킬로달톤(kDa)이다.
CCR5는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 및 호산구를 포함하는 면역계의 세포에서 주로 발현되지만, 또한 내피, 상피, 혈관평활근 및 섬유아세포에서도 발현된다. 또한, 이는 중추신경계에서 발견되는 미세아교세포, 뉴런, 및 성상세포에서 발현된다(문헌[Barmania, F. and Pepper, MS. Applied & Translational Genomics (2013) 2(2013):3-16] 참조).
CCR5는 대부분의 HIV-I 1차 분리주에서 발현되며, 감염의 확립 및 유지에 중요하다. 초기 질환의 HIV-1 분리주는 CD4+ T 세포로의 진입을 위해 CD4와 공동수용체로서 CCR5를 사용하는 경향이 있다. CCR5는 감염되지 않은 대조군과 비교하여 HIV-감염 개체의 CD4+ T 세포에서 상향조절되는 것으로 나타났다(문헌[Ostrowski, MA, et al. J. Immunol. (1998) 161(6):3195-3201] 참조). 측정가능한 양의 개체간 CCR5 표면 발현 가변성이 존재한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 CCR5의 세포외 도메인 변이체이다. 다른 실시형태에서, 표적 항원은 CCR5의 막관통 도메인 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 항원은 CCR5의 세포외 도메인 및 막관통 도메인 변이체이다(여러 CCR5 변이체 및 생성된 HIV 감염성의 분석을 위해, 문헌[Zack Howard, OM, et al. J. Biol. Chem. (1999) 274(23):16228-16234] 참조).
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCR5를 인식하는 리간드, CCR5를 인식할 수 있는 이의 단편이다. CCR5를 인식하는 리간드는 MIP-lα, MIP-lβ 및 RANTES를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCL3으로도 알려진 MIP-1α이다. MIP-1α는 급성 염증 동안 다형핵 백혈구의 동원 및 활성화에 관여하는 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCL4로도 알려진 MIP-1β이다. MIP-1β는 자연 살해 세포 및 단핵구를 포함하여 많은 면역 세포에 대한 화학유인제이다. MIP1-β는 단핵구, T 세포, B 세포를 포함한 면역계의 다양한 세포, 및 또한 섬유아세포 및 내피 및 상피 세포에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCL5로도 알려진 RANTES의 리간드이다. RANTES는 면역 부위로 백혈구를 동원하고, T 세포, 호염기구, 및 호산구를 포함한 면역계에서 다양한 세포에 대한 화학유인제로서 작용한다. 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCR5에 결합하는 또 다른 리간드이다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은, 본 명세서에 기재된 항체 모이어티 중 임의의 것과 같은 CCR5를 인식하는 항체 모이어티이다. 예시적인 항-CCR5 항체는 WO2006103100에서 찾을 수 있으며, 이는 구체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 CXCR4이다. C-X-C 케모카인 수용체 유형 4로도 알려진 CXCR4는 리간드 SDF-1에 결합하고 여러가지 상이한 경로를 통해 세포내 신호를 전달하여 칼슘의 증가 및/또는 cAMP 수준의 감소를 초래하는 알파-케모카인 수용체이다. 이는 CD4+ T 세포를 포함하여 면역 세포에서 주로 발현되지만, 또한 중추신경계의 세포에서도 발현된다. CXCR4는 7개의 막관통 나선이 있는 G 단백질-결합 수용체이며, 352개의 아미노산으로 구성된다.
CXCR4는 HIV 분리주가 CD4+ T 세포를 감염시키는 데 사용할 수 있는 여러가지 케모카인 수용체 중 하나이다. HIV의 T 세포 친화성(tropic) 분리주는 표면에서 CXCR4를 발현하는 CD4+ T 세포를 감염시킬 수 있다. CXCR4는 T 세포로의 HIV 진입을 위한 공동수용체이며, 특정 뮤린 항-CXCR4 항체는 T 세포로의 HIV 분리주의 진입을 저해할 수 있는 것으로 입증되었다(문헌[Hou, T. et al. (1998) J. Immunol. 160:180-188]; [Carnec, X. et al. (2005) J. Virol. 79:1930-1938] 참조). CXCR4는 세포로의 진입을 위해 바이러스에 의해 수용체로서 사용될 수 있으며, CXCR4에 대한 항체는 수용체로서 CXCR4를 사용하는 이와 같은 바이러스의 세포 진입을 저해하는 데 사용되었다. WO2008060367 및 WO2011098762를 참조한다.
CXCR4는 감염되지 않은 대조군과 비교하여 HIV-감염 개체에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 CD14+ 단핵구에서 하향조절된다(문헌[Ostrowski, MA, et al. J. Immunol. (1998) 161(6):3195-3201] 참조). HIV-1 분리주는 질환이 진행함에 따라 세포 진입을 위하여 CD4와 공동수용체로서 CXCR4를 사용하며; CXCR4는 CCR5의 경우와 같이 감염 초기에 공동수용체로서 사용되지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CXCR4 리간드, 예컨대, 기질 세포-유래 인자 1(SDF-1, 또는 CXCL12), 또는 CXCR4를 인식하는 이의 단편이다. SDF-1은 림프구에 대해 강력한 화학주성이며, 흉선, 비장 및 골수를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 다수의 조직에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 SDF-1의 7가지 동형 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 MIF, 유비퀴틴, 또는 이들의 단편이다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은, 본 명세서에 기재된 항체 모이어티 중 임의의 것과 같은 CXCR4를 인식하는 항체 모이어티이다. 예시적인 항-CXCR4 항체는 WO2008060367 및 WO2011098762에서 찾을 수 있으며, 이는 구체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 또한 분화 클러스터 4로도 알려진 CD4이다. CD4는 면역 세포, 특히 CD4+ T 세포, 또는 헬퍼 T 세포의 표면에서 발견되는 당단백질이다. CD4는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이다. CD4는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인(D1 내지 D4)으로 구성된다. D1 및 D3은 면역글로불린 가변 도메인과 유사성을 나타내는 반면, D2 및 D4는 면역글로불린 불변 도메인과 유사성을 나타낸다.
CD4는 HIV-1 진입 및 감염에 필요한 중요한 세포-표면 분자이다. HIV-1 진입은 T-세포 수용체 CD4의 도메인 1(D1)과 바이러스 외피(Env) 당단백질 gp120의 상호작용에 의해 촉발된다. HIV 감염이 진행함에 따라, 더 많은 수의 CD4+ T 세포가 바이러스에 의해 표적화되고 파괴되어 면역계가 점점 더 손상되고; 따라서 CD4+ T 세포 수는 개체에서 HIV/AIDS의 진행 및 단계에 대한 프록시로서 사용된다. 또한, HIV 유전자 산물인 Env, Vpu 및 Nef는 HIV 감염 동안 CD4의 하향조절에 관여한다(문헌[Tanaka, M., et al. Virology (2003) 311(2):316-325] 참조).
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 a) 다른 분자에 대한 결합 친화성의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화성; 또는 b) 다른 분자에의 결합에 대한 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 또는 그 이하 중 어느 하나 이하)인 Kd로 CD4 D1 또는 CD4 D2/D3에 특이적으로 결합한다. 결합 친화성은 당업계에 알려진 방법, 예컨대, ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사선면역침강 분석(RIA)에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 비아코어 인스트루먼츠를 이용하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 또는 예를 들어 사피딘 인스트루먼츠를 이용하는 운동역학 배제 분석(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CD4에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 다중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 디아바디(Db), 단일 사슬 디아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체, 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 완전 인간, 인간 항체 프레임워크 영역을 가지는 반-합성, 또는 인간화된 것이다.
일부 실시형태에서 항체 모이어티는 하나 이상의 항체 모이어티(예컨대, 본 명세서에 개시된 특이적 항체 중 임의의 것) 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이와 같은 서열의 특정 변이체로부터 유래된 특정 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 서열의 아미노산 치환은 표적 항원에 결합하는 항원-결합 도메인의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 표적 항원 결합 친화성을 실질적으로 개선시키거나 일부 다른 특성, 예컨대, 표적 항원의 관련 항체와의 특이성 및/또는 교차-반응성에 영향을 미치는 변경도 또한 고려된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 약 0.1pM 내지 약 500nM(예컨대, 약 0.1pM, 1.0pM, 10pM, 50pM, 100pM, 500pM, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 또는 500nM 중 어느 하나로서 이들 값 사이의 임의의 값을 포함함)의 Kd로 CD4 D1 또는 D2/3에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CD4의 D1에서 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 다음 영역 중 임의의 하나 이상에 속하는 에피토프에 결합한다: CD4의 아미노산 26 내지 125, 26 내지 46, 46 내지 66, 66 내지 86, 86 내지 106, 106 내지 125(여기서, 아미노산 번호매김은 서열번호 1에 따름). 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 다음 영역 중 임의의 하나 이상에 속하는 에피토프에 결합한다: 서열번호 1의 아미노산 26 내지 125, 26 내지 46, 46 내지 66, 66 내지 86, 86 내지 106, 106 내지 125. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 약 0.1pM 내지 약 500nM(예컨대, 약 0.1pM, 1.0pM, 10pM, 50pM, 100pM, 500pM, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 또는 500nM 중 어느 하나로서 이들 값 사이의 임의의 값을 포함함)으로 CD4의 D1에 결합한다. 일부 실시형태에서, CD4는 인간 CD4이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은, 예를 들어 WO1997013852에 개시된 바와 같은 자놀리무밥으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 자놀리무맙에 대한 결합에 대하여 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 자놀리무밥과 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CD4의 D2 또는 D3에서 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 다음 영역 중 임의의 하나 이상에 속하는 에피토프에 결합한다: CD4의 아미노산 126 내지 317, 126 내지 203, 204 내지 317, 126 내지 146, 146 내지 166, 166 내지 186, 186 내지 206, 206 내지 226, 226 내지 246, 246 내지 266, 266 내지 286, 286 내지 306, 및 306 내지 317(여기서, 아미노산 번호매김은 서열번호 1에 따름). 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 다음 영역 중 임의의 하나 이상에 속하는 에피토프에 결합한다: 서열번호 1의 아미노산 126 내지 317, 126 내지 203, 204 내지 317, 126 내지 146, 146 내지 166, 166 내지 186, 186 내지 206, 206 내지 226, 226 내지 246, 246 내지 266, 266 내지 286, 286 내지 306, 및 306 내지 317. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 약 0.1pM 내지 약 500nM(예컨대, 약 0.1pM, 1.0pM, 10pM, 50pM, 100pM, 500pM, 1nM, 10nM, 50nM, 100nM, 또는 500nM 중 어느 하나로서 이들 값 사이의 임의의 값을 포함함)의 kd로 CD4의 D2 또는 D3에 결합한다. 일부 실시형태에서, CD4는 인간 CD4이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은, 예를 들어 US20130195881 및 WO2004083247에 개시된 바와 같은 이발리주맙 또는 트레갈리주맙으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 이발리주맙 또는 트레갈리주맙에 대한 결합에 대하여 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 이발리주맙 또는 트레갈리주맙과 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CD4에 대한 리간드, 또는 CD4에 결합할 수 있는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, CD4에 대한 리간드는 T 세포 활성화를 조절하고 HIV 복제를 저해하는 다면발현성 사이토카인인 IL-16이다. 다른 실시형태에서, CD4에 대한 리간드는 II형 주요 조직적합성 복합체(MHC II형)이다. MHC II형 분자는 전형적으로 B 세포, 수지상 세포, 항원 제시 세포, 단핵식세포, 및 흉선 상피 세포를 포함하여, 면역계의 항원 제시 세포에서 발견된다. 일부 실시형태에서, MHC II형 리간드는 면역계에 대한 후속 제시를 위해 CD4에 제시하기 위한 병원성 펩타이드를 제시한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 외피 당단백질 gp120 또는 이의 단편이다. HIV env 유전자에 의해 인코딩되는 천연 gp120은 표적 세포에 대한 HIV의 부착에서 필수적인 역할을 하는 HIV 바이러스 외피에서 발견되는 120 kDa의 당단백질이다. gp120은 표적 세포의 효율적인 HIV 감염이 되도록 CCR5를 포함하여 케모카인 수용체 패밀리의 구성원 및 표적 세포 CD4에 결합한다. gp120 및 CD4의 복합체는 CCR5와 특이적으로 상호작용하여 MIP-1α 및 MIP-1β와 같은 자연 CCR5 리간드의 결합을 저해하는 것으로 나타났다(Wu, L., et al. (1996) Nature 384: 179-183).
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인이 gp120일 때, 조작된 면역 세포는 CCOR을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 CR은 CR 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CD4, CCR5, 및 CXCR4 중 하나 이상에 결합하지 않는 변형된 gp120이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CD4에 결합하지만 CCR5 또는 CXCR4에 결합하지 않는 변형된 gp120이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CCR5에 결합하지만 CD4 또는 CXCR4에 결합하지 않는 변형된 gp120이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 CXCR4에 결합하지만 CCR5 또는 CD4에 결합하지 않는 변형된 gp120이다.
공동수용체("COR")
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 공동수용체("COR")를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, COR은 면역 세포의 여포로의 이동을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, COR은 면역 세포의 장으로의 이동을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, COR은 면역 세포의 피부로의 이동을 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, COR은 CXCR5이다. 일부 실시형태에서, COR은 CCR9이다. 일부 실시형태에서, COR은 α4β7(또한 인테그린 α4β7이라고 지칭됨). 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CXCR5, α4β7, 및 CCR9로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CXCR5, α4β7, 및 CCR9를 전부 포함한다.
C-C 케모카인 수용체 유형 9(CCR9)로도 알려진 CCR9는 베타 케모카인 수용체 패밀리의 구성원이며 이의 결합 리간드인 CCL25에 반응하여 화학주성을 매개한다. CCR9는 G 단백질-결합 수용체와 구조가 유사한 7개의 막관통 도메인 단백질인 것으로 예측된다. CCR9는 흉선 및 소장의 T 세포에서 발현되며, T 림프구의 발달 및 이동을 조절하는 역할을 한다(Uehara, S., et al. (2002) J. Immunol. 168(6):2811-2819). CCR9/CCL25는 면역 세포를 소장으로 유도하는 것으로 나타났다(Pabst, O., et al. (2004). J. Exp. Med. 199(3):411). 따라서 면역 세포에서 CCR9를 공동발현하면 조작된 면역 세포를 장으로 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, CCR9의 스플라이싱 변이체가 사용된다.
α4β7, 또는 림프구 페이어판 부착 분자(lymphocyte Peyer patch adhesion molecule; LPAM)는 림프구에서 발현되고 장-연관 림프 조직으로 T-세포의 귀소를 담당하는 인테그린이다(Petrovic, A. et al. (2004) Blood 103(4):1542-1547). α4β7은 CD49d(α4 인테그린 서브유닛을 인코딩하는 유전자인 ITGA4의 단백질 산물) 및 ITGB7(β7 인테그린 서브유닛을 인코딩하는 유전자인 ITGB4의 단백질 산물)로 구성된 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, α4의 스플라이싱 변이체는 α4β7 이종이량체 내로 통합된다. 일부 실시형태에서, β7의 스플라이싱 변이체는 α4β7 이종이량체 내로 통합된다. 다른 실시형태에서, α4의 스플라이싱 변이체 및 β7의 스플라이싱 변이체는 이종이량체 내로 통합된다. α4β7 단독으로 또는 CCR9와 함께 공동발현은 조작된 면역 세포를 장으로 유도할 수 있다.
α4β7 및 CCR9는 둘 다 장으로의 귀소에 작용하지만, 이들이 반드시 공동조절되는 것은 아니다. 비타민 A 대사산물인 레티노산은 CCR9 및 α4β7 둘 다의 발현 유도에서 역할을 한다. 그러나 α4β7 발현은 다른 수단을 통해 유도될 수 있는 반면, CCR9 발현은 레티노산을 필요로 한다. 또한, 결장-친화성 T-세포는 α4β7만 발현하고 CCR9는 발현하지 않으며, 이는 2가지 수용체가 항상 공동발현되거나 공동조절되는 것이 아님을 나타낸다(문헌[Takeuchi, H., et al. J. Immunol. (2010) 185(9):5289-5299] 참조).
일부 실시형태에서, CCR9 및 α4β7은 장에 대한 표적화를 위한 COR로서 기능한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는, C-X-C 케모카인 수용체 유형 5로도 알려진 CXCR5를 발현한다. CXCR5는 CXC 케모카인 수용체 패밀리에 속하는 7개의 막관통 도메인을 함유하는 G 단백질-결합 수용체이다. CXCR5 및 이의 리간드인 케모카인 CXCL13은 림프절 및 비장을 포함한 2차 림프 조직 내의 여포로 림프구를 거래하는 데 중심적인 역할을 한다(
Figure pct00002
, A. et al. (2007) Blood 110:3316-3325). 구체적으로, CXCR5는 CXCL13에 반응하여 T 세포가 림프절 B 세포 구역으로 이동할 수 있게 한다(Schaerli, P. et al. (2000) J. Exp. Med. 192(11):1553-1562). 면역 세포에서 발현될 때, CXCR5는 조작된 면역 세포를 여포에 대하여 표적화하는 COR로서 기능할 수 있다. 일부 실시형태에서, CXCR5의 스플라이싱 변이체가 사용된다.
일반적으로, 상기 논의된 COR 중 임의의 것의 비-자연 발생 변이체는 조작된 면역 세포에서 포함/발현될 수 있다. 이들 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 상응하는 천연 수용체의 일부 또는 그 이상의 기능을 유지할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 COR은 자연 발생 CCR9, α4β, 또는 CXCR5의 변이체이며, 여기서 변이체는 자연 CCR9, α4β 또는 CXCR5와 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나로 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, COR은 자연 발생 CCR9, α4β, 또는 CXCR5의 변이체이며, 여기서 변이체는 천연 CCR9, α4β, 또는 CXCR5와 비교하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 어느 하나 이하의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, COR은 케모카인 수용체이다. 일부 실시형태에서, COR은 인테그린이다. 일부 실시형태에서, COR은 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, XCR1, ACKR1, ACKR2, ACKR3, ACKR4, CCRL2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, COR은 조작된 면역 세포가 유래된 면역 세포에서 정상적으로 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, COR은 조작된 면역 세포가 유래된 면역 세포에서 낮은 수준으로 발현된다.
항-HIV 항체
일부 실시형태에서 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포는 항-HIV 항체, 예컨대, 광범위 중화 항체("bNAb")를 추가로 발현(및 분비)한다. 일부 실시형태에서, CR이 탠덤 CR일 때, CR 항원 결합 도메인은 항-HIV 항체 모이어티(예컨대, bNAb 모이어티)를 포함할 수 있다. bNAb는 HIV 외피 단백질에 결합하고 숙주 세포 수용체 결합하는 바이러스를 차단한다. 본 명세서에 기재된 bNAb 모이어티는 광범위 중화 항체 활성 및/또는 결합 특이성을 보유하는 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 일부 실시형태에서, bNAb 모이어티는 scFv이다. 일부 실시형태에서, bNAb 모이어티는 sdAb이다.
bNAb는 HIV에 감염되었지만 항레트로바이러스 약을 복용하지 않고 바이러스 감염을 자연적으로 제어할 수 있는 엘리트 컨트롤러(elite controller)에서 처음 발견되었다. bNAb는 다수의 HIV 바이러스 균주를 중화시키는 중화 항체이다. bNAb는, 바이러스가 돌연변이를 겪더라도, 바이러스의 보존된 에피토프를 표적화한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포는 광범위 중화 항체를 분비하여 새로운 숙주 세포의 HIV 감염을 차단할 수 있다.
일부 실시형태에서, bNAb는 gp41, V1V2 글리칸, 글리칸의 외부도메인, V3 글리칸, 또는 CD4 결합 부위의 MPER 상의 바이러스 에피토프를 특이적으로 인식한다. bNAb는 바이러스 외피 당단백질과 CD4의 상호작용을 차단한다. Mascola and Haynes, Immunol. Rev. 2013 July; 254(1):225-44. 적합한 bNAb는 VRC01, PGT-121, 3BNC117, 10-1074, N6, VRC07, VRC07-523, eCD4-IG, 10E8, 10E8v4, PG9, PGDM 1400, PGT151, CAP256.25, 35O22, 8ANC195를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. Science Translational Medicine 23 Dec 2015: Vol. 7, Issue 319, pp. 319ra206; PLoS Pathog. 2013;9(5):e1003342; Nature. 2015 Jun 25;522(7557):487-91; Nat Med. 2017 Feb;23(2):185-191; Nature Immunologyvolume 19, pages1179-1188 (2018). 다른 적합한 광범위 중화 항체를, 예를 들어 문헌[Cohen et al., Current Opin. HIV AIDS, 2018 Jul; 13(4):366-373]; [Mascola and Haynes, Immunol. Rev. 2013 July; 254(1):225-44]에서 찾을 수 있다.
핵산
본 명세서에 기재된 CR, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)뿐만 아니라, 상기 핵산(들)을 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다.
CR, CCOR 및/또는 COR의 발현은, 핵산이, 예를 들어 프로모터(예를 들어, 림프구-특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하여 5' 및/또는 3' 조절 요소에 작동 가능하게 연결되도록, 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 및 발현 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.
핵산은 다수 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커를 함유한다.
포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 당업계에 알려진 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그 다음 재조합 바이러스는 단리되고 생체 내 또는 생체 외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 증식을 가능하게 하므로, 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는, 비-증식 세포, 예컨대, 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서, 종양-레트로바이러스(onco-retrovirus), 예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비하여 추가적인 장점을 가진다. 렌티바이러스 벡터는 또한 면역원성이 낮다는 추가적인 장점을 가진다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시 빈도를 조절한다. 전형적으로, 상기 요소는 시작 부위 상류의 30 내지 110 bp 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 최근 시작 부위 하류에 또한 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 유연적이므로, 프로모터 기능은 요소가 반전되거나 같은 간격으로 이동될 때 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다.
적합한 프로모터의 일 예는 급초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터(이들로 제한되는 것은 아님)와 같은 인간 유전자 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유하여 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염되고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 마커는 DNA의 별도 조각 상에서 운반되고 공동형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 마커 및 리포터 유전자 둘 다 적절한 조절 서열이 측접하여 숙주 세포에서 발현을 가능하게 할 수 있다. 유용한 선별 마커는, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 예컨대, 네오(neo) 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 수준의 리포터 유전자의 발현을 나타내는 최소한의 5' 측접 영역을 가지는 작제물은 프로모터로서 확인된다. 이와 같은 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
포유동물 세포에서 이종성 핵산의 존재를 확인하는 예시적인 방법은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 분석, 예컨대, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 방법(예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한, 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출과 같은 생화학적 분석을 포함한다.
포유동물 세포에서 이종성 핵산의 존재를 확인하는 예시적인 방법은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 분석, 예컨대, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 방법(예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한, 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출과 같은 생화학적 분석을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열 각각은 별도의 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 중 적어도 일부는 동일한 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 전부는 동일한 벡터에 함유된다. 벡터는, 예를 들어 포유동물 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 핵산은 CR 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산, 선택적으로 CCOR 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제2 핵산, 선택적으로 COR 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제3 핵산, 및 선택적으로 bNAb 폴리펩타이드를 인코딩하는 제4 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 벡터에 함유되고/되거나, 제2 핵산은 제2 벡터에 함유되고/되거나, 제3 핵산은 제3 벡터에 함유되고/되거나, 제4 핵산은 제4 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 제1 벡터에 함유되고, 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열은 제2 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터에 함유되고, 제2 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열은 제2 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 제2 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터에 함유되고, 제1 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열은 제2 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 핵산 서열은 동일한 벡터에 함유된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 핵산은 내부 리보솜 유입점(IRES) 및 자가-절단 2A 펩타이드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 통해 서로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있고/있거나, 제2 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있고/있거나, 제3 핵산 서열은 제3 프로모터의 제어 하에 있고/있거나, 제4 핵산 서열은 제4 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 프로모터 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 프로모터 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 다중시스트론성 벡터에서 단일 프로모터의 제어 하에 단일 전사체로서 발현된다. 일부 실시형태에서, 프로모터 중 하나 이상은 유도성이다. 일부 실시형태에서, 제3 및/또는 제4 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 면역 세포(예컨대, T 세포)에서 유사한(예컨대, 실질적으로 또는 거의 동일한) 발현 수준을 가진다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 핵산 서열 중 일부는 면역 세포(예컨대, T 세포)에서 적어도 약 2배(예컨대, 적어도 약 2, 3, 4, 5배 또는 그 이상 중 어느 하나)만큼 상이한 발현 수준을 가진다. 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 결정될 수 있다. mRNA 발현의 수준은, 노던 블롯팅, 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이 분석 등을 포함하여 다양한 잘 알려진 방법을 사용하여 핵산으로부터 전사된 mRNA의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 발현의 수준은 면역세포화학 염색, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯 분석, 발광 분석, 질량 분석법, 고성능 액체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 등을 포함하여 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.
유전자를 세포(예컨대, 면역 세포) 내로 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙틴, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것은 인산칼슘 형질감염에 의해 수행된다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용하는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 1, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
숙주 세포(예컨대, 면역 세포) 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 지질-기반 시스템, 예를 들어 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함한다. 시험관내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로 (시험관내, 생체 외 또는 생체 내에서) 핵산을 도입하기 위해 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유되거나 미셀과 복합체화되거나, 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 이중층 구조에 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이는 또한 단순히 용액 중에 산재되어, 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예컨대, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 숙주 세포 내로 외인성 핵산을 도입하거나 그렇지 않으면 세포를 본 발명의 저해제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이와 같은 분석은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석, 예컨대, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본 명세서에 기재된 분석에 의한, 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출과 같은 "생화학적 분석"을 포함한다.
항체 모이어티
본 명세서에 기재된 다양한 작제물(예컨대, CR 항원 결합 도메인 또는 CCOR 항원 결합 도메인)은 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단클론성 항체 유래의 VH 및 VL 도메인, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 단클론성 항체 유래의 CH1 및 CL 도메인, 또는 이들의 변이체를 더 포함한다. 단클론성 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법, 예컨대, 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] 및 [Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272]에 기재된 것을 사용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 햄스터, 마우스, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화제는 관심 단백질의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질, 또는 적어도 2개의 분자를 포함하는 복합체, 예컨대, 펩타이드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 말초 혈액 림프구("PBL")는 인간 기원의 세포가 필요한 경우 사용되며, 비장 세포 또는 림프절 세포는 비-인간 포유동물 공급원이 필요한 경우 사용된다. 그 다음 림프구는 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하여 무한증식 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 무한증식 세포주는 보통 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 보통, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 무한증식 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정적인 고수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 일부 실시형태에서, 무한증식 세포주는 뮤린 골수종 주이며, 이는, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 입수할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주는 또한 인간 단클론성 항체의 생성에 대해 설명된 바 있다. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63.
그 다음 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 폴리펩타이드에 대한 단클론성 항체의 존재에 대하여 분석될 수 있다. 하이브리도메 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대, 방사면역측정법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 기법 및 분석은 당업계에 알려져 있다. 단클론성 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌[Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 분석(Scatchard analysis)에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 상기한 Goding. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수 액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 항체 모이어티 라이브러리(예컨대, scFv 또는 Fab 단편을 제시하는 파지 라이브러리)로부터 선택되는 클론 유래의 서열을 포함한다. 클론은 원하는 활성 또는 활성들을 가지는 항체 단편에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특징을 가지는 항체에 대한 이와 같은 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 이와 같은 방법은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 그 다음 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 부위에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-사슬 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 표시한다. 면역화 공급원 유래의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 미경험 레퍼토리가 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝되어 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 미경험 라이브러리는 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 수행하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는, 예를 들어 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허 공개 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호를 포함한다.
항체 모이어티는 파지 디스플레이를 사용하여 제조되어 표적 항원(예컨대, CD4, CCR5, 또는 CXCR4 폴리펩타이드)에 특이적인 항체에 대한 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 라이브러리는 적어도 1×109가지(예컨대, 적어도 약 1×109, 2.5×109, 5×109, 7.5×109, 1×1010, 2.5×1010, 5×1010, 7.5×1010, 또는 1×1011가지 중 어느 하나) 고유한 인간 항체 단편의 다양성을 가지는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 모든 인간 중쇄 및 경쇄 서브패밀리를 포함하는 건강한 공여자 유래의 인간 PMBC 및 비장으로부터 추출된 DNA로부터 구축된 미경험 인간 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 다양한 질환을 가지는 환자, 예컨대, 자가면역 질환 환자, 암 환자, 및 전염병 환자로부터 단리된 PBMC로부터 추출된 DNA로부터 구축된 미경험 인간 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 반-합성 인간 라이브러리이고, 여기서 중쇄 CDR3은 임의의 주어진 위치에서 동등하게 존재할 가능성이 있는 모든 아미노산(시스테인 제외)으로, 완전하게 무작위된다(예를 들어, 문헌[Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005] 참조). 일부 실시형태에서, 반-합성 인간 라이브러리의 중쇄 CDR3은 약 5 내지 약 24개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 중 어느 하나)의 아미노산 길이를 가진다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 완전-합성 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 비-인간 파지 디스플레이 라이브러리이다.
높은 친화성으로 표적 항원에 결합하는 파지 클론은 표적 항원에 대한 파지의 반복적 결합에 의해 선택될 수 있으며, 이는 고체 지지체(예컨대, 용액 패닝용 비드 또는 세포 패닝용 포유동물 세포)에 결합된 다음, 비-결합 파지의 제거 및 특이적으로 결합된 파지의 용리가 이어진다. 용액 패닝의 예에서, 표적 항원은 고체 지지체에 대한 고정화를 위해 비오틴화될 수 있다. 비오틴화 표적 항원을 파지 라이브러리 및 고체 지지체, 예컨대, 스트렙트아비딘-접합체 다이나비드(Dynabead) M-280과 혼합한 다음, 표적 항원-파지-비드 복합체를 단리한다. 그 다음 결합된 파지 클론을 용리하고 발현 및 정제에 적절한 숙주 세포, 예컨대, 이. 콜라이 XL1-블루(Blue)를 감염시키는 데 사용한다. 세포 패닝의 예에서, CD4, CCR5, 또는 CXCR4를 발현하는 세포를 파지 라이브러리와 혼합하고, 그 후 세포를 수집하고 결합된 클론을 용리하여 발현 및정제에 적절한 숙주 세포를 감염시키는 데 사용한다. 패닝은 용액 패닝, 세포 패닝, 또는 이 둘 다의 조합으로 다수회(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상 중 어느 하나) 라운드 동안 수행되어, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 풍부화할 수 있다. 풍부화된 파지 클론은, 예를 들어 ELISA 및 FACS를 포함하여 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 표적 항원에 대한 특이적 결합에 대해 테스트될 수 있다.
인간 및 인간화 항체 모이어티
본 명세서에 기재된 항체 모이어티는 인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체 모이어티의 인간화 형태는 전형적으로 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체 모이어티는 인간 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 단편(수용자 항체)을 포함하며, 여기서 수용체의 CDR 유래의 잔기는 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가지는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR 유래의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체 모이어티는 수용자 항체 모이어티에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]; [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 비-인간인 공급원으로부터 인간화 항체 모이어티로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 일부 실시형태에 따르면, 인간화는 인간 항체 모이어티의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 윈터(Winter) 및 동료의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 이와 같은 "인간화" 항체 모이어티는 항체 모이어티(미국 특허 제4,816,567호)이며, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화 항체 모이어티는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체 모이어티이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체 모이어티가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시 내인성 면역글로불린 생성의 부재시 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자이식 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 이제 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 저해를 초래한다고 설명되었다. 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 이와 같은 생식선 돌연변이 마우스로의 전달은 항원 접종시 인간 항체의 생성을 초래할 것이다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)], 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호; 제5,545,807호; 및 WO 97/17852를 참조한다. 대안적으로, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 유전자이식 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 접종시, 인간 항체 생성은 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 면에 있어서 인간에서 보여지는 것과 매우 유사한 것으로 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 5,661,016호와, 문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용함으로써 생성될 수 있다. 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 콜(Cole)외 다수 및 보어너(Boerner)외 다수의 기법이 또한 인간 단클론성 항체의 제조에 이용 가능하다. 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].
추가적인 변이체
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항원-결합 도메인의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항원-결합 도메인의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항원-결합 도메인의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을 항원-결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내로 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 변형은, 예를 들어 항원-결합 도메인의 아미노산 서열내의 결실 및/또는 상기 아미노산 서열로의 삽입 및/또는 상기 아미노산 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 가진다면, 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 항원-결합 도메인 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 항체 모이어티의 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 관심 항원-결합 도메인 내로 도입될 수 있으며, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 항원 결합의 유지/개선 또는 면역원성 감소에 대하여 스크리닝될 수 있다.
보존적 치환이 하기 표 4에 표시되어 있다. 본 명세서에서 논의된 변이체 CORS는 또한 이와 같은 보존적 치환을 함유할 수 있다.
Figure pct00003
아미노산은 일반적인 측쇄 특성에 따라 상이한 부류로 그룹화될 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
예시적인 치환 변이체는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 돌연변이 기법을 사용하여, 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙 항체 모이어티이다. 간략하게, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체 모이어티가 파지 상에서 표시되며, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다. 변경(예를 들어, 치환)이 HVR에서 이루어져서, 예를 들어 항체 모이어티 친화성을 개선시킬 수 있다. 이와 같은 변경은 결합 친화성에 대해 테스트되는 생성된 변이체 VH 또는 VL을 이용하여, HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 특이성 결정 잔기(SDR)에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화성 성숙은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되었다.
친화성 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 실수유발(error-prone) PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지향(oligonucleotide-directed) 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 그 다음 2차 라이브러리가 형성된다. 그 다음 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 가지는 임의의 항체 모이어티 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지향 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 구체적으로 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 실시형태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체 모이어티의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이와 같은 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시형태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항원-결합 도메인의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 의해 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹(예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기)이 확인되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항원-결합 도메인과 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 추가 치환이 아미노산 위치에 도입되어 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항원-항원-결합 도메인 복합체의 결정 구조를 결정하여 항원-결합 도메인과 항원 사이의 접촉점을 확인할 수 있다. 이와 같은 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 스크리닝하여 변이체가 원하는 특성을 함유하는지 여부를 결정할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 가지는 항원-결합 도메인을 포함한다. 항원-결합 도메인의 다른 삽입 변이체는 항원-결합 도메인의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드 또는 효소(예를 들어, ADEPT에 대함)에 대한 항원-결합 도메인의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
핵산의 발현
본 명세서에 기재된 이종성 핵산은 면역 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포에서 일시적으로 발현된다. 예를 들어, 이종성 핵산은 이종성 유전자 발현 카세트를 포함하는 염색체외 어레이에서 조작된 면역 세포의 핵에 존재할 수 있다. 이종성 핵산은, 바이러스 또는 비-바이러스 방법을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 형질감염 또는 형질도입 방법을 사용하여 조작된 포유동물 내로 도입될 수 있다. 예시적인 비-바이러스 형질감염 방법은 키메라-기반 형질감염, 예컨대, 인산칼슘, 덴드리머, 리포좀, 또는 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민)의 사용; 비-화학적 방법, 예컨대, 전기천공, 세포 압착, 초음파천공, 광학 형질감염, 임페일펙션(impalefection), 원형질체 융합, 유체역학적 전달, 또는 트랜스포존; 입자-기반 방법, 예컨대, 유전자총, 마그네토펙션(magnectofection) 또는 자석 보조(magnet assisted) 형질감염, 입자 충격의 사용; 및 하이브리드 방법, 예컨대, 뉴클레오펙션(nucleofection)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 RNA이다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 선형이다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 원형이다.
일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포의 게놈에 존재한다. 예를 들어, 이종성 핵산은, 예컨대, 부위-특이적 재조합효소 또는 인테그라제, 트랜스포사제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN®), CRISPR/Cas9, 및 아연-핑거 뉴클레아제를 사용하여, 바이러스-매개 통합, 무작위 통합, 상동성 재조합 방법, 및 부위-지향 통합 방법을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 면역 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포 게놈의 특이적으로 설계된 유전자좌에 통합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포 게놈의 통합 핫스팟에 통합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포 게놈의 무작위 유전자좌에 통합된다. 이종성 핵산의 다수 복제물이 단일의 조작된 면역 세포에 존재하는 경우, 이종성 핵산은 조작된 면역 세포 게놈의 복수의 유전자좌에 통합될 수 있다.
본 명세서에 기재된 이종성 핵산(예를 들어, CR, CCOR, 및 COR을 인코딩하는 핵산)은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 내인성 프로모터이다. 예를 들어, 핵산(예를 들어, CR, CCOR, 및 COR을 인코딩하는 핵산)은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대, CRISPR/Cas9 방법을 사용하여 내인성 프로모터의 하류에서 조작된 면역 세포의 게놈에 녹인(knocked-in)될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 프로모터는 풍부한 단백질, 예컨대, 베타-액틴에 대한 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 내인성 프로모터는, 예를 들어 조작된 면역 세포의 내인성 활성화 신호에 의해 유도 가능한, 유도성 프로모터이다. 조작된 면역 세포가 T 세포인 일부 실시형태에서, 프로모터는 T 세포 활성화-의존성 프로모터(예컨대, IL-2 프로모터, NFAT 프로모터, 또는 NFκB 프로모터)이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 이종성 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 이종성 핵산(예를 들어, CR, CCOR, 또는 COR을 인코딩하는 핵산)은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산(예를 들어, CR, CCOR, 또는 COR을 인코딩하는 핵산)은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 구성적 프로모터는 CR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 유도성 프로모터는 CCOR 또는 COR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터는 CR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 제2 유도성 프로모터는 CCOR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되거나, 그 반대이다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터는 CR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 제2 유도성 프로모터는 COR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되거나, 그 반대이다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터는 CCOR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 제2 유도성 프로모터는 COR을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되거나, 그 반대이다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터는 제1 유도 조건에 의해 유도 가능하고, 제2 유도성 프로모터는 제2 유도 조건에 의해 유도 가능하다. 일부 실시형태에서, 제1 유도 조건은 제2 유도 조건과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터 및 제2 유도성 프로모터는 동시에 유도된다. 일부 실시형태에서, 제1 유도성 프로모터 및 제2 유도성 프로모터는 순차적으로 유도되고, 예를 들어 제1 유도성 프로모터는 제2 유도성 프로모터 전에 유도되거나, 제1 유도성 프로모터는 제2 유도성 프로모터 후에 유도된다.
구성적 프로모터는 이종성 유전자(또한 이식유전자라고 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현될 수 있게 한다. 본 명세서에서 고려되는 예시적인 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 인간 신장 인자-1알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포르포글리세로키나제 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이식유전자 발현을 구동하는 것에 대한 이와 같은 구성적 프로모터의 효율성은 수많은 연구에서 널리 비교되었다. 예를 들어, 마이클 C. 밀론(Michael C. Milone)외 다수는 1차 인간 T 세포에서 키메라 항원 수용체 발현을 구동시키는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율성을 비교하였고, hEF1α 프로모터가 가장 높은 수준의 이식유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 내렸다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시형태에서, 이종성 핵산의 프로모터는 hEF1α 프로모터이다.
유도성 프로모터는 하나 이상의 조건, 예컨대, 물리적 조건, 조작된 면역 세포의 미세환경, 또는 조작된 면역 세포의 생리적 상태, 유도제(즉, 유도 작용제), 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 조작된 면역 세포, 및/또는 약제학적 조성물을 받은 대상체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 유도제, 조사(예컨대, 전리 방사선, 빛), 온도(예컨대, 열), 산화환원 상태, 종양 환경, 및 조작된 면역 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도제에 의해 유도 가능하다. 일부 실시형태에서, 유도제는 소분자, 예컨대, 화학적 화합물이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 독시사이클린, 테트라사이클린, 알코올, 금속, 또는 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 화학적으로 유도된 프로모터가 가장 널리 연구되었다. 이와 같은 프로모터는 전사 활성이 소분자 화학물질, 예컨대, 독시사이클린, 테트라사이클린, 알코올, 스테로이드, 금속 및 다른 화합물의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 프로모터를 포함한다. 역 테트라사이클린-제어 트랜스작용인자(rtTA) 및 테트라사이클린-반응성 요소 프로모터(TRE)를 가지는 독시사이클린-유도성 시스템은 현재 가장 발달된 시스템이다. WO9429442는 테트라사이클린 반응성 프로모터에 의한 진핵 세포에서 유전자 발현의 엄격한 제어를 기재한다. WO9601313은 테트라사이클린-조절 전사 조절제를 개시한다. 추가적으로, 테트(Tet) 기술, 예컨대, 테트-온(Tet-on) 시스템은, 예를 들어 테트시스템즈 닷 컴(TetSystems.com)의 웹사이트에 기재되어 있다. 알려진 임의의 화학적 조절 프로모터가 본 출원에서 치료 단백질의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유도제는 폴리펩타이드, 예컨대, 성장 인자, 호르몬, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드, 예를 들어 종양 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 조작된 면역 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이종성 핵산에서 핵산에 의해 인코딩된다. 다수의 폴리펩타이드 유도제가 또한 당업계에 알려져 있으며, 이는 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 프로게스테론 수용체-기반 유전자 스위치, 및 에스트로겐 수용체 기반 유전자 스위치는 스테로이드 수용체 유래 트랜스작용인자를 이용하는 유전자 스위치에 속한다(WO9637609 및 WO9738117 등).
일부 실시형태에서, 유도제는 소분자 구성요소 및 하나 이상의 폴리펩타이드를 둘 다 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 이량체화에 의존하는 유도성 프로모터가 당업계에 알려져 있으며, 이는 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 1993년에 개발된 최초의 소분자 CID 시스템은 약물 FK506의 유도체인 FK1012를 사용하여 FKBP의 동종이량체화를 유도하였다. 유사한 전략을 이용함으로써, 우(Wu)외 다수는 라팔로그(Rapalog)/FKPB-FRB* 및 지베렐린/GID1-GAI 이량체화 의존성 유전자 스위치를 사용함으로써 온-스위치 방식을 통해 성공적으로 CAR-T 세포를 적정가능하게 만든다(C.-Y. Wu et al., Science 350, aab4077 (2015)). 다른 이량체화 의존성 스위치 시스템은 쿠메르마이신/GyrB-GyrB(Nature 383 (6596): 178-81), 및 HaXS/스냅(Snap)-태그-할로태그(HaloTag)(Chemistry and Biology 20 (4): 549-57)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 광-유도성 프로모터이고, 유도 조건은 빛이다. 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 광 유도성 프로모터는 또한 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Science 332, 1565-1568 (2011)]; [Nat. Methods 9, 266-269 (2012)]; [Nature 500: 472-476 (2013)]; [Nature Neuroscience 18:1202-1212 (2015)] 참조). 이와 같은 유전자 조절 시스템은 (1) DNA 결합 또는 (2) DNA 결합 단백질에 대한 전사 활성화 도메인의 동원에 대한 규정을 기반으로 한 2가지 카테고리로 대략적으로 나뉠 수 있다. 예를 들어, 청색광(480 nm)에 반응하여 NFAT의 칼시뉴린-매개 동원을 초래하는 세포내 칼슘 증가를 촉발시키는 멜라놉신을 기반으로 한 합성 포유동물 청색광 제어 전사 시스템이 개발되었고 포유동물 세포에서 테스트되었다. 보다 최근에, 모타-메타(Motta-Mena)외 다수는 인간 세포주와 제브라피쉬 배아에서 전사 개시에 대한 높은 수준의 청색광-민감성 제어를 부여하는 자연 발생 EL222 전사 인자로부터 개발된 새로운 유도성 유전자 발현 시스템을 설명하였다(Nat. Chem. Biol. 10(3):196-202 (2014)). 추가적으로, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 광수용체 피토크롬 B(PhyB)와 피토크롬-상호작용 인자 6(PIF6)의 적색광 유도된 상호작용은 적색광 촉발 유전자 발현 조절을 위해 이용되었다. 또한, 자외선 B(UVB)-유도성 유전자 발현 시스템이 또한 개발되어 포유동물 세포에서 표적 유전자 전사에 효과적인 것으로 입증되었다(Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th,2015). 본 명세서에 기재된 임의의 광-유도성 프로모터는 본 발명에서 치료 단백질의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 광-유도성 분자와 빛의 조합에 의해 유도되는 광-유도성 프로모터이다. 예를 들어, 화학 유도제 상의 광-절단가능 광케이징된(photocaged) 기는 광케이징된 기가 조사를 통해 또는 다른 수단에 의해 제거되지 않는 한 유도제를 비활성 상태로 유지한다. 이와 같은 광-유도성 분자는 소분자 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, 케이징된 엑디손, 락(lac) 오페론과 함께 사용하기 위한 케이징된 IPTG, 리보자임-매개 유전자 발현을 위한 케이징된 토요카마이신, 테트-온 시스템과 함께 사용하기 위한 케이징된 독시사이클린, 및 광 매개 FKBP/FRB 이량체화를 위한 케이징된 라팔로그가 개발되었다(예를 들어, 문헌[Curr Opin Chem Biol. 16(3-4): 292-299 (2012)] 참조).
일부 실시형태에서, 프로모터는 방사선-유도성 프로모터이고, 유도 조건은 방사선, 예컨대, 전리 방사선이다. 방사선 유도성 프로모터는 또한 이식유전자 발현을 제어하기 위해 당업계에 알려져 있다. 유전자 발현의 변경은 세포의 조사시 일어난다. 예를 들어, "급초기 유전자"로 알려진 유전자 그룹은 전리 방사선에 즉시 반응할 수 있다. 예시적인 급초기 유전자는 Erg-1, p21/WAF-1, GADD45알파, t-PA, c-Fos, c-Jun, NF-카파B, 및 AP1을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 급초기 유전자는 프로모터 영역에 방사선 반응 서열을 포함한다. 컨센서스 서열인 CC(A/T)6GG는 Erg-1 프로모터에서 발견되었으며, 이는 혈청 반응 요소로 지칭되거나 CArG 요소인 것으로 알려져 있다. 방사선 유도 프로모터와 이식유전자의 조합은 집중적으로 연구되어 왔으며, 치료 이익으로 효율적임이 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Cancer Biol Ther. 6(7):1005-12 (2007)] 및 [Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th, 2015]을 참조한다. 임의의 급초기 유전자 프로모터 또는 혈청 반응 요소를 포함하는 임의의 프로모터는 본 발명의 치료 단백질의 발현을 구동하는 데 방사선 유도성 프로모터로서 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 열 유도성 프로모터이고, 유도 조건은 열이다. 이식유전자 발현을 구동하는 열 유도성 프로모터는 또한 당업계에서 널리 연구되어 왔다. Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, Hsp10 등을 포함한 열 충격 또는 스트레스 단백질(HSP)은 열 또는 다른 물리적 및 화학적 스트레스 하에서 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 한다. 열-충격 단백질(HSP) 프로모터 및 성장 저지 및 DNA 손상(GADD) 153 프로모터를 포함한 몇몇 열 유도성 프로모터가 전임상 연구에서 시도되었다. 1985년에 처음 기재된 인간 hsp70B 유전자의 프로모터는 가장 고도로 효율적인 열 유도성 프로모터 중 하나인 것으로 보인다. 후앙(Huang)외 다수는 hsp70B-EGFP, hsp70B-TNF알파 및 hsp70B-IL12 코딩 서열의 도입 후, 종양 세포가 열 처리시 매우 높은 이식유전자 발현을 나타낸 반면, 열처리의 부재시 이식유전자의 발현은 검출되지 않았다고 보고하였다. 그리고 생체 내에서 IL12 이식유전자와 열처리된 마우스 그룹에서 종양 성장이 상당히 지연되었다(Cancer Res. 60:3435 (2000)). 또 다른 과학자 그룹은 HSV-tk 자살 유전자를 hsp70B 프로모터에 연결하고 마우스 유방암을 보유하는 누드 마우스에서 시스템을 테스트하였다. 종양에 hsp70B-HSVtk 코딩 서열을 투여받고 열 처리된 마우스는 열처리하지 않은 대조군과 비교하여 종양 퇴행 및 상당한 생존율을 나타내었다(Hum. Gene Ther. 11:2453 (2000)). 당업계에 알려진 추가적인 열 유도성 프로모터는, 예를 들어 문헌[Chapter 25 of Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20th, 2015]에서 찾아볼 수 있다. 본 명세서에서 논의된 임의의 열-유도성 프로모터는 본 발명의 치료 단백질의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 산화환원 상태에 의해 유도 가능하다. 산화환원 상태에 의해 유도 가능한 예시적인 프로모터는 유도성 프로모터 및 저산소증 유도성 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 포스트 드(Post DE)외 다수는 저산소증-유도 인자(HIF)-활성 종양 세포에서 이식유전자 발현을 특이적이고 강하게 유도하는 HIF 반응성 프로모터를 개발하였다(Gene Ther. 8: 1801-1807 (2001); Cancer Res. 67: 6872-6881 (2007)).
일부 실시형태에서, 프로모터는 조작된 면역 세포의 생리학적 상태, 예컨대, 내인성 활성 신호에 의해 유도 가능하다. 조작된 면역 세포가 T 세포인 일부 실시형태에서, 프로모터는 T 세포 활성화-의존성 프로모터이며, 이는 조작된 T 세포의 내인성 활성화 신호에 의해 유도 가능하다. 일부 실시형태에서, 조작된 T 세포는 유도제, 예컨대, PMA, 이오노마이신, 또는 피토헤마글루티닌에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체, 또는 조작된 수용체(예컨대, 재조합 TCR, 또는 CAR)를 통해 종양 세포 상에서 종양 항원의 인식에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 T 세포는 면역 관문의 차단에 의해, 예컨대, 조작된 T 세포 또는 제2 조작된 면역 세포에 의해 발현되는 면역조절제에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화-의존성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화-의존성 프로모터는 NFAT 프로모터이다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화-의존성 프로모터는 NFκB 프로모터이다.
어떠한 이론이나 가설에 구속되지 않으면서, IL-2 프로모터로부터 유전자 전사에 의해 개시되는 IL-2 발현은 T 세포 활성화의 주요 활성이다. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 이오노마이신, 또는 피토헤마글루티닌에 의한 인간 T 세포의 비특이적 자극은 자극된 T 세포로부터 IL-2 분비를 초래한다. IL-2 프로모터는 유전적으로 조작된 T-세포에서 활성화-유도된 이식유전자 발현에 대해 조사되었다(Virology Journal 3:97 (2006)). 본 발명자들은 IL-2 프로모터가 인간 T 세포주에서 PMA/PHA-P 활성화의 존재하에 리포터 유전자 발현을 개시하는 데 효율적이라는 것을 발견하였다. T 세포 수용체 자극은 세포내 반응의 캐스케이드를 개시하여 세포질 칼슘 농도의 증가를 야기하고 NFAT 및 NFκB 둘 다의 핵 번역을 초래한다. 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 구성원은 T 림프구에서 면역 반응을 매개하는 Ca2+ 의존성 전사 인자이다. NFAT는 활성화된 T 세포에서 유도성 인터류킨-2(IL-2) 발현에 중요한 것으로 나타났다(Mol Cell Biol. 15(11):6299-310 (1995); Nature Reviews Immunology 5:472-484 (2005)). 본 발명자들은 NFAT 프로모터가 인간 T 세포주에서 PMA/PHA-P 활성화의 존재하에 리포터 유전자 발현을 개시하는 데 효율적이라는 것을 발견하였다. 핵 인자 카파 B(NFκB)를 포함한 다른 경로가 또한 T 세포 활성화를 통해 이식유전자 발현을 제어하는 데 이용될 수 있다.
면역 세포
본 발명에 유용한 예시적인 면역 세포는 수지상 세포(미성숙 수지상 세포 및 성숙 수지상 세포를 포함함), T 림프구(예컨대, 미경험 T 세포, 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해 T 세포, Treg 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 및 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포, γδT 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 과립구, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 면역 세포의 하위집단은 당업계에 알려진 하나 이상의 세포 표면 마커(예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33 등)의 존재 또는 부재에 의해 정의될 수 있다. 약제학적 조성물이 복수의 조작된 포유동물 면역 세포를 포함하는 경우, 조작된 포유동물 면역 세포는 면역 세포 유형의 특정 하위집단, 면역 세포 유형의 하위집단의 조합, 또는 둘 이상의 면역 세포 유형의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 동종성 세포 집단에 존재한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포에서 증강된 이종성 세포 집단에 존재한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 림프구이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 림프구가 아니다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 입양 면역요법에 적합하다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 PBMC이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 PBMC로부터 유래된 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 NK 세포이다.
조작된 면역 세포의 제조
본 명세서에 기재된 다양한 작제물(예컨대, CR, COOR, 및/또는 COR)을 발현하는 면역 세포는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 예컨대, CR, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산을 면역 세포 내에 도입함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 단순 헤스페스 바이러스 벡터, 및 이들의 유도체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종성 핵산은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 벡터 내로 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그 다음 재조합 바이러스는 단리되어 시험관내 또는 생체 외에서 조작된 면역 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레스토바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 면역조절제(예컨대, 면역관문 저해제) 코딩 서열을 보유하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 키메라 항원 수용체를 보유하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터가 당업계에 알려진 프로토콜을 이용하여 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 포유동물 세포(예컨대, 1차 인간 T 세포)를 형질도입하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 포유동물 세포는 이종성 핵산의 도입 후 생체 외에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 포유동물 세포는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 또는 14일 중 어느 하나 동안 배양되어 증식한다. 일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 포유동물 세포는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 또는 14일 중 어느 하나 이하 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 형질도입 또는 형질감염된 포유동물 세포는 추가로 평가 또는 스크리닝되어 조작된 면역 세포를 선택한다.
면역 세포로의 하나 이상의 핵산의 도입은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포(예컨대, 조작된 T 세포)는 생체 내에서 복제되어 표적 항원의 발현과 연관된 질환(예컨대, 바이러스 감염)의 지속된 제어로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 전염병, 예컨대, HIV를 가지거나 발병할 위험이 있는 환자의 치료를 위해 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 자가 림프구 주입이 치료에 사용된다. 자가 PBMC가 치료를 필요로 하는 환자로부터 수집되고 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 방법을 사용하여 T 세포가 활성화되고 확장된 다음 환자에게 다시 주입된다.
일부 실시형태에서, HIV를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포가 제공된다. 세포는 강력한 생체 내 확장을 겪을 수 있고 혈액과 골수에서 오랜 시간 동안 높은 수준으로 유지되는 표적 항원-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자에게 주입된 조작된 면역 세포는 바이러스-감염 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자에게 주입된 조작된 면역 세포는 바이러스-감염 세포를 제거할 수 있다.
면역 세포의 확장 및 유전적 변형 이전에, 면역 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. 면역 세포는, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하여, 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 당업계에서 이용 가능한 다수의 면역 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 당업자에게 알려진 다수의 기법, 예컨대, 피콜(FICOLL)(상표) 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체의 순환 혈액 유래의 세포는 분리반출법에 의해 수득된다. 분리반출 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 일부 실시형태에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척액에는 칼슘이 없고 마그네슘이 없을 수 있거나 모든 2가 양이온은 아니지만 많은 양이 없을 수 있다. 당업자는 세척 단계가 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대, 제조자의 지침에 따라 반자동 "통과(flow-through)" 원심분리기(예를 들어, 코브(Cobe) 2991 세포 처리기, 백스터 사이토메이트(Baxter CytoMate), 또는 헤모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 사용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대, 무-Ca2+, 무-Mg2+ PBS, 플라스마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출 샘플의 바람직하지 않은 구성요소를 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포(예컨대, T 세포)는 적혈구를 용해하고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)(상표) 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심성 세포분리(counterflow centrifugal elutriation)에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(즉, 3×28)-접합체 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션함으로써 단리된다. 일부 실시형태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시형태에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상(이들 값 사이의 모든 범위를 포함함)의 범위이다. 일부 실시형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형과 비교하여 적은 수의 T 세포가 있는 임의의 상황에서 T 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축하거나 연장함으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시에 있어서 또는 이에 대해 또는 과정 동안 다른 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시에 있어서 또는 이에 대해 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명의 맥락에서 다수 라운드의 선택이 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 활성화 및 확장 과정에서 선택 절차를 수행하고 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포도 또한 추가 라운드의 선택을 거칠 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화시키기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD 14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포에 대하여 풍부화시키거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리시키기 위해, 세포 및 표면(예를 들어 비드와 같은 입자)의 농도가 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 약 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 10억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1억개 세포/㎖ 초과가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만개 세포/㎖ 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개 세포/㎖ 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1억 2500만 또는 약 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원, 예컨대, CD28-음성 T 세포, 또는 다수의 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등) 유래의 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 보다 효율적인 포획이 가능하게 한다. 이와 같은 세포 집단은 치료 가치를 가질 수 있으며 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 세포 농도의 사용은 일반적으로 CD28 발현이 보다 약한 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
핵산(예컨대, 바람직한 CR, CCOR 및/또는 COR의 핵산)을 발현하기 위한 면역 세포의 유전적 변형 이전 또는 후와 상관없이, 면역 세포는 활성화되고 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예컨대, T 세포)는 이에 부착된 표면과, CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면에서 공동자극 분자를 자극하는 리간드의 접촉에 의해 확장된다. 구체적으로, T 세포집단은, 예컨대, 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공동자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송(Besancon) 소재)을 포함하며, 이는 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법으로 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
유전적 변형
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CCR5의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 면역 세포(예컨대, T 세포)이다. 유전자 발현을 파괴하기 위한 세포의 변형은, 예를 들어 RNA 간섭(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA), 유전자 편집(예를 들어, CRISPR- 또는 TALEN-기반 유전자 넉아웃) 등을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 이와 같은 기법을 포함한다.
일부 실시형태에서, CCR5의 발현이 감소된 조작된 면역 세포(예컨대, T 세포)는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 생성된다. 유전자 편집의 CRISPR/Cas 시스템에 대한 검토는, 예를 들어 문헌[Jian W & Marraffini LA, Annu. Rev. Microbiol. 69, 2015]; [Hsu PD et al., Cell, 157(6):1262-1278, 2014]; 및 [O'Connell MR et al., Nature 516: 263-266, 2014]을 참조한다. 일부 실시형태에서, T 세포의 내인성 TCR 사슬 중 하나 또는 둘 다의 발현이 감소된 조작된 면역 세포(예컨대, 조작된 T 세포)는 TALEN-기반 게놈 편집을 사용하여 생성된다.
일부 실시형태에서, CCR5 유전자(또는 TCR 유전자)는 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 비활성화된다. CRISPR/Cas9는 2가지 주요 특성, 즉 짧은 가이드 RNA(gRN) 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 또는 Cas 단백질을 포함한다. Cas 단백질은 gRNA에 결합할 수 있으며, 상기 gRNA는 관심 유전자에 대한 표적화 유도, 및 상기 유전자의 후속 넉아웃을 가능하게 하는 조작된 스페이서를 함유한다. 일단 표적화되면, Cas 단백질은 DNA 표적 서열을 절단하여, 유전자의 넉아웃을 초래한다.
일부 실시형태에서, CCR5 유전자(또는 TCR 유전자)는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN®)-기반 게놈 편집을 사용하여 비활성화된다. TALEN®-기반 게놈 편짐은 DNA의 특정 영역을 표적화하기 위해 조작될 수 있는 제한 효소의 사용을 포함한다. 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) DNA-결합 도메인은 DNA 절단 도메인에 융합된다. TALE는 관심 서열에 대하여 뉴클레아제를 표적화하는 역할을 하고, 절단 도메인(뉴클레아제)은 DNA를 절단하는 역할을 하여, 해당 DNA 절편의 제거 및 후속적인 유전자 넉아웃을 초래한다.
일부 실시형태에서, CCR5 유전자(또는 TCR 유전자)는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 게놈 편집 방법을 사용하여 비활성화된다. 아연 핑거 뉴클레아제는 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 DNA-절단 도메인으로 구성된 인공적 제한 효소이다. ZFN DNA-결합 도메인은 DNA의 특정 영역을 표적화하기 위해 조작될 수 있다. DNA-절단 도메인은 관심 DNA 서열을 절단하는 역할을 하여, 해당 DNA 절편의 제거 및 후속적인 유전자 넉아웃을 초래한다.
일부 실시형태에서, CCR5 유전자(또는 TCR 유전자)의 발현은 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용함으로써 감소된다. siRNA 분자는 관심 유전자 유래의 메신저 RNA(mRNA) 전사체에 상보적인 20 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스이다. siRNA는 파괴를 위해 이러한 mRNA를 표적화한다. 표적화를 통해, siRNA는 mRNA 전사체가 번역이 되는 것을 방지하고, 이에 의해 세포에 의해 단백질이 생성되는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, CCR5 유전자(또는 TCR 유전자)의 발현은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 감소된다. mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 유전자 발현을 하향조절하기 위해 일상적으로 사용된다. 문헌[Watts, J. and Corey, D (2012) J. Pathol. 226(2):365-379]을 참조한다.
조작된 면역 세포의 풍부화
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조작된 면역 세포에 따른 조작된 면역 세포에 대하여 이종성 세포 집단을 풍부화시키는 방법이 제공된다.
표적 항원에 특이적으로 결합하고 리간드를 표적화하는 조작된 면역 세포(예컨대, 조작된 T 세포)의 특정 하위집단이 양성 선택 기법에 의해 풍부화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포(예컨대, 조작된 T 세포)는 원하는 조작된 면역 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 표적 항원-접합체 비드 및/또는 표적 리간드-접합체 비드와 함께 인큐베이션함으로써 풍부화된다. 일부 실시형태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시형태에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상(이들 값 사이의 모든 범위를 포함함)의 범위이다. 일부 실시형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 이종성 세포 집단에서 낮은 수준으로 존재하는 조작된 면역 세포의 단리를 위해, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대, 24시간을 사용하면 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형과 비교하여 적은 수의 조작된 면역 세포가 있는 임의의 상황에서 조작된 면역 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명의 맥락에서 다수 라운드의 선택이 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
양성 선택에 의해 원하는 조작된 면역 세포 집단을 단리시키기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 약 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 10억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1억개 세포/㎖ 초과가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만개 세포/㎖ 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개 세포/㎖ 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약 1억 2500만 또는 약 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CR, CCOR 및/또는 COR을 약하게 발현할 수 있는 조작된 면역 세포의 보다 효율적인 포획이 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 임의의 이와 같은 실시형태 중 일부에서, 풍부화는 조작된 면역 세포의 고갈을 최소화하거나 실질적으로 일어나지 않게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 풍부화는 조작된 면역 세포의 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 중 어느 하나 미만)이 고갈되는 것을 초래한다. 면역 세포 고갈은 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 이와 같은 실시형태 중 일부에서, 풍부화는 조작된 면역 세포의 말단 분화를 최소화하거나 실질적으로 일어나지 않게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 풍부화는 조작된 면역 세포의 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 중 어느 하나 미만)이 말단 분화되는 것을 초래한다. 면역 세포 분화는 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 이와 같은 실시형태 중 일부에서, 풍부화는 조작된 면역 세포에서 CR, CCOR 및/또는 COR의 내재화를 최소화하거나 실질적으로 일어나지 않게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 풍부화는 조작된 면역 세포에서 CR, CCOR 및/또는 COR의 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 중 어느 하나 미만)이 내재화되는 것을 초래한다. 조작된 면역 세포에서 CR, CCOR 및/또는 COR의 내재화는 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 이와 같은 실시형태 중 일부에서, 풍부화는 조작된 면역 세포의 증식 증가를 초래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 풍부화는 풍부화 후 조작된 면역 세포 수에서 적어도 약 10%(예컨대, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% 또는 그 이상 중 어느 하나)의 증가를 초래한다.
따라서, 일부 실시형태에서, a) 이종성 세포 집단을 표적 항원 또는 이에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 제1 분자 및/또는 표적 리간드 또는 이에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 제2 분자와 접촉시켜 제1 분자에 결합된 조작된 면역 세포를 포함하는 복합체 및/또는 제2 분자에 결합된 조작된 면역 세포를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및 b) 이종성 세포 집단으로부터 복합체를 분리하여, 조작된 면역 세포에 대하여 풍부화된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, CR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 CR 및/또는 CCOR 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CCOR을 발현하는 조작된 면역 세포에 대하여 이종성 세포 집단을 풍부화시키기는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 분자는 고체 지지체에 개별적으로 고정화된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 미립자(예컨대, 비드)이다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 표면(예컨대, 웰의 바닥)이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 분자는 태그로 개별적으로 표지화된다. 일부 실시형태에서, 태그는 형광 분자, 친화성 태그, 또는 자기 태그이다. 일부 실시형태에서, 방법은 제1 및/또는 제2 분자로부터 조작된 면역 세포를 용리시키는 단계 및 용리액을 회수하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포 또는 조작된 면역 세포는, 예를 들어 음성 풍부화의 사용을 통해 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포에 대하여 풍부화되며, 이에 의해 세포 혼합물은 물리적(컬럼) 및 자기(MACS 자기 비드) 정제 단계를 둘 다 포함하는 2 단계 정제 방법을 사용하여 정제된다(Gunzer, M. et al. (2001) J. Immunol. Methods 258(1-2):55-63). 다른 실시형태에서, 세포 집단은 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 풍부화를 위해 특별히 설계된 T 세포 풍부화 컬럼의 사용을 통해 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포에 대하여 풍부화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포 집단은 상업적으로 입수가능한 키트의 사용을 통해 CD4+ 세포에 대하여 풍부화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상업적으로 입수가능한 키트는 이지셉(EasySep)(상표) 인간 CD4+ T 세포 풍부화 키트(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies)(상표))이다. 다른 실시형태에서, 상업적으로 입수가능한 키트는 마그니소트 마우스(MagniSort Mouse) CD4+ T 세포 풍부화 키트(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))이다. 또 다른 실시형태에서, 상업적으로 입수가능한 풍부화 키트는 당업자에게 알려진 것이다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조작된 면역 세포 조성물(예컨대, 약제학적 조성물, 또한 본 명세서에서 제형으로 지칭됨)이 제공된다.
조성물은 동일한 세포 유형의 조작된 면역 세포를 포함하고 동일한 CR 및/또는 CCOR을 발현하는 동종성 세포 집단, 또는 상이한 세포 유형의 조작된 면역 세포를 포함하고, 상이한 CR, 상이한 CCOR 및/또는 상이한 COR을 발현하는 복수의 조작된 면역 세포 집단을 포함하는 이종성 세포 집단을 포함할 수 있다. 조성물은 조작된 면역 세포가 아닌 세포를 더 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 동일한 세포 유형의 조작된 면역 세포(예컨대, 조작된 T 세포)의 동종성 세포 집단을 포함하고 동일한 CR, CCOR 및/또는 COR을 발현하는 조작된 면역 세포 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
일부 실시형태에서, 상이한 세포 유형의 조작된 면역 세포를 포함하고, 상이한 CR, 상이한 CCOR, 및/또는 상이한 COR을 발현하는 복수의 조작된 면역 세포 집단을 포함하는 이종성 세포 집단을 포함하는 조작된 면역 세포 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 개체, 예컨대, 인간 개체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사에 적합하다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주입에 적합하다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 세포 배양 배지가 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 내독소 또는 알레르기성 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, "실질적으로 없는"은 약제학적 조성물의 총 부피 또는 중량의 약 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm 또는 그 이하 중 어느 하나 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 마이코플라스마, 종균제 및/또는 전염성 질환 작용제가 없다.
본 출원인의 약제학적 조성물은 다수의 조작된 면역 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조작된 면역 세포의 단일 복제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조작된 면역 세포의 적어도 약 1, 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108개 또는 그 이상 중 어느 하나의 복제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단일 유형의 조작된 면역 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 2개 유형의 조작된 면역 세포를 포함하며, 여기서 상이한 유형의 조작된 면역 세포는 세포 공급원, 세포 유형, 발현된 치료 단백질, 면역조절제, 및/또는 프로모터 등이 상이하다.
조성물의 제조 동안 다양한 시점에서, 세포를 동결보존하는 것이 필요하거나 유익할 수 있다. 용어 "냉동(frozen/freezing)" 및 "동결보존(cryopreserved/cryopreserving)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 냉동은 냉동건조를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포는 배양 배지로부터 수확되고, 세척된 다음 치료적 유효량으로 담체 내로 농축될 수 있다. 예시적인 담체는 식염수, 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 행크스 용액, 링거 용액, Nonnosol-R(Abbott Labs사), Plasma-Lyte A(R)(Baxter Laboratories, Inc., 미국 일리노이주 모턴 그로브 소재), 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 담체는 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 인간 혈청 구성요소 또는 소태아 혈청으로 보충될 수 있다. 특정 실시형태에서, 주입용 담체는 5% HSA 또는 덱스트로스가 있는 완청 식염수를 포함한다. 추가적인 등장화제는 3가 이상의 당 알코올을 포함하는 다가 당 알코올, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨, 또는 만니톨을 포함한다.
담체는 완충제, 예컨대, 시트레이트 완충액, 석시네이트 완충액, 타트레이트 완충액, 푸마레이트 완충액, 글루코네이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 락테이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액, 및/또는 트라이메틸아민 염을 포함할 수 있다.
안정화제는 증량제에서 용기 벽에 대한 세포 부착을 방지하는 데 도움이 되는 첨가제에 이르기까지 기능 범위가 다양할 수 있는 광범위한 카테고리의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 및 트레오닌; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 및 사이클리톨, 예컨대, 이노시톨; PEG; 아미노산 중합체; 황-함유 환원제, 예컨대, 유레아, 글루타티온, 싸이옥트산, 소듐 티오글라이콜레이트, 티오글리세롤, 알파-모노티오글리세롤, 및 소듐 티오설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(즉, 10개 미만의 잔기); 단백질, 예컨대, HSA, 소혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 예컨대, 자일로스, 만노스, 프럭토스 및 글루코스; 이당류, 예컨대, 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류, 예컨대, 라피노스, 및 다당류, 예컨대, 덱스트란을 포함할 수 있다.
필요하거나 유익한 경우, 조성물은 국소 마취제, 예컨대, 리도카인을 포함하여 주사 부위의 통증을 완화시킬 수 있다.
예시적인 방부제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜탄올을 포함한다.
조성물 내 치료적 유효량의 세포는 102개 초과의 세포, 103개 초과의 세포, 104개 초과의 세포, 105개 초과의 세포, 106개 초과의 세포, 107개 초과의 세포, 108개 초과의 세포, 109개 초과의 세포, 1010개 초과의 세포, 또는 1011개 초과의 세포일 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 제형에서, 세포는 부피가 일반적으로 1ℓ 이하, 500㎖ 이하, 250㎖ 이하 또는 100㎖ 이하이다. 따라서, 투여된 세포의 밀도는 전형적으로 104개 세포/㎖, 107개 세포/㎖ 또는 108개 세포/㎖ 초과이다.
또한 본 명세서에 기재된 CR, CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산 중 임의의 것을 포함하는 핵산 조성물(예컨대, 약제학적 조성물, 또한 본 명세서에서 제형으로 지칭됨)이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 핵산 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 핵산 조성물은 등장화제, 부형제, 희석제, 점증제, 안정화제, 완충액, 및/또는 방부제; 및/또는 수성 비히클, 예컨대, 정제수, 수성 당 용액, 완충 용액, 생리 식염수, 수성 중합체 용액, 또는 무-RNase 물 중 임의의 것을 더 포함한다. 첨가되는 이와 같은 첨가제 및 수성 비히클의 양은 핵산 조성물의 사용 형태에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 제형은, 예를 들어 주사, 주입, 관류, 또는 세척에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물 및 제형은 골수, 정맥내, 피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복강내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국부, 척추강내, 종양내, 근육내, 방광내, 및/또는 피하 주사용으로 추가로 제형화될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
부형제
본 발명의 약제학적 조성물은 치료 목적에 유용하다. 따라서, 조작된 면역 세포, 예컨대, 면역조절제 또는 다른 치료 단백질을 발현하는 생산 세포를 포함하는 다른 조성물과 달리, 본 발명의 약제학적 조성물은 개체에게 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 완충액, 예컨대, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 산화방지제; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 자가 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인간 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비-독성, 생체적합성, 비-면역원성, 생분해성이고, 숙주의 방어 메커니즘에 의한 인식을 피할 수 있다. 부형제는 또한 아쥬반트, 예컨대, 보존 안정화제, 습윤제, 유화제 등을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 조작된 면역 세포 또는 이의 분비된 면역조절제 또는 다른 치료 단백질의 안정성을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 조작된 면역 세포에 의해 분비된 면역조절제 또는 다른 치료 단백질의 응집을 감소시킨다. 최종 형태는 멸균될 수 있으며, 또한 주사 장치, 예컨대, 중공 바늘을 통해 용이하게 통과할 수 있다. 적절한 점도는 적절한 부형제의 선택에 의해 달성되고 유지될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 6.5 내지 약 7.0의 pH 범위를 포함하여, 약 4.5 내지 약 9.0의 범위로 pH를 가지도록 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 또한 적합한 긴장성 변형제, 예컨대, 글리세롤의 첨가에 의해 혈액과 등장성이 되도록 만들어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인간에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여에 의해 인간에게 투여하기에 적합하다. 비경구 투여에 적합한 제형은 산화방지제, 완충액, 정균제, 및 제형을 의도한 수용자의 혈액과 혼화성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 점증제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단일-용량 또는 다회-용량 밀폐 용기, 예컨대, 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 치료 방법, 투여 방법, 및 사용 직전에 주사를 위한 본 명세서에 기재된 투약 요법에서 멸균 액체 부형제(즉, 물)의 추가만을 필요로 하는 상태로 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 일회용 바이알, 예컨대, 일회용 밀폐 바이알에 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다회용 바이알에 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 용기에 대량으로 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결보존된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 종양 부위로의 국소 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 종양내 주사용으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 개체에게 투여하기 위한 특정 표준을 만족해야 한다. 예를 들어, 미국 식품의약국은 21 CFR 610 및 21 CFR 610.13을 포함하여, 세포-기반 면역치료 제품에 대한 표준을 설정하는 규제 지침을 공표하였다. 약제학적 조성물의 외관, 동일성, 순도, 안전성, 및/또는 효능을 평가하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 알레르기 효과를 나타낼 수 있는 관련없는 단백질, 예컨대, 조작된 포유동물 면역 세포이외에 세포 배양에서 사용되는 동물 공급원의 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, "실질적으로 없는"은 약제학적 조성물의 총 부피 또는 중량의 약 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm 또는 그 이하 중 어느 하나 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 GMP-수준 작업장에서 제조된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위해 약 5 EU/㎏ 체중/hr 미만의 내독소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중 조작된 면역 세포의 적어도 약 70%가 정맥내 투여를 위해 살아 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 미국 약전(USP)에 기재된 바와 같은 14일 직접 접종 테스트 방법을 사용하여 평가될 때 "성장 없음" 결과를 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여 전에, 조작된 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 둘 다 포함하는 샘플은 대략적으로 최종 수확 약 48 내지 72시간 전에 (또는 배양물의 마지막 재공급과 동시에) 멸균 테스트를 위해 취해져야 한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 마이코플라스마 오염이 없다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 검출가능한 종균제가 없다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물에는 전염성 질환 작용제, 예컨대, HIV 유형 I, HIV 유형 II, HBV, HCV, 인간 T-림프친화 바이러스, 유형 I; 및 인간 T-림프친화 바이러스, 유형 II가 없다.
조작된 면역 세포를 사용하는 치료 방법
본 출원은, 전염병, EBV 양성 T 세포 림프증식성 장애, T-세포 전림프구성 백혈병, EBV-양성 T 세포 림프증식성 장애, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 균상식육종/세자리 증후군, 원발성 피부 CD30-양성 T-세포 림프증식성 장애, 말초 T-세포 림프종(달리 명시되지 않음), 혈관면역모구 T-세포 림프종, 및 역형성 큰세포 림프종, 및 자가면역 질환을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 질환을 치료하기 위해 조작된 면역 세포를 투여하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 자가 림프구 주입이 치료에 사용된다. 자가 PBMC는 치료를 필요로 하는 환자로부터 수집되고 T 세포는 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 다음 환자에게 다시 주입된다.
세포는 강력한 생체 내 확장을 겪을 수 있고, 혈액 및 골수에서 장기간 동안 높은 수준으로 지속되는 CD4-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자에게 주입된 조작된 면역 세포는 암 또는 바이러스-감염 세포를 고갈시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자에게 주입된 조작된 면역 세포는 암 또는 바이러스-감염 세포를 제거할 수 있다. 바이러스 감염 치료는, 예를 들어 바이러스 부하, 생존 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서 본 발명의 조작된 면역 세포는 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간)에게 투여되어 암, 예를 들어 CD4+ T 세포 림프종 또는 T-세포 백혈병을 치료할 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서 본 출원은 본 명세서에 기재된 실시형태 중 임의의 하나에 따른 조작된 면역 세포를 포함하는 유효량의 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 암은 T 세포 림프종이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 암을 치료하는 방법은 제2 항암제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 적합한 항암제는 CD70 표적화 약물, TRBC1, CD30 표적화 약물, CD37 표적화 약물, CCR4 표적화 약물, CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOEP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 에토포사이드 및 프레드니손), EPOCH(에토포사이드, 빈크리스틴, 독소루비신, 사이클로포스파미드 및 프레드니손), 하이퍼(Hyper)-CVAD(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 및 덱사메타손), HDAC 저해제, CD52 항체 벨리노스타트(Belinostat), 벤다무스틴(Bendamustine), BL-8040, 보르테조밉(Bortezomib), CPI-613, 모가물리주맙(Mogamulizumab), 넬라라빈(Nelarabine), 니볼루맙(Nivolumab), 로미뎁신(Romidepsin) 및 룩소리티닙(Ruxolitinib)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 제2 작용제는 면역관문 저해제(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체)이다. 일부 실시형태에서, 제2 항암제는 조작된 면역 세포와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 항암제는 조작된 면역 세포의 투여와 순차적으로(예를 들어, 조작된 면역 세포의 투여 이전 또는 이후에) 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 면역 세포 조성물은 제2, 제3, 또는 제4 작용제(예를 들어, 항신생물제, 성장 저해제, 세포독성제, 또는 화학요법제를 포함함)와 조합하여 투여되어 표적 항원 발현을 수반하는 질환 또는 장애를 치료한다.
본 발명의 조작된 면역 세포는 또한 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간)에게 투여되어 전염병, 예를 들어 HIV를 치료할 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서 본 출원은 본 명세서에 기재된 실시형태 중 임의의 하나에 따른 조작된 면역 세포를 포함하는 유효량의 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 전염병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 감염은, 예를 들어 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV) 및 HIV(인간 면역결핍 바이러스)로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기된다.
일부 실시형태에서, HIV를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 본 명세서에 기재된 임의의 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다. HIV에는 2가지 하위유형, 즉 HIV-1 및 HIV-2가 있다. HIV-1은 세계적 유행병의 원인이며, 높은 독성과 높은 감염성을 둘 다 가진 바이러스이다. 그러나 HIV-2는 서아프리카에서만 만연하며, HIV-1만큼 독성이 있지도 않고 전염성도 없다. HIV-1 및 HIV-2 감염 사이의 독성 및 감염성의 차이는 HIV-2 감염에서 바이러스 단백질에 대하여 증가하는 더 강한 면역 반응이 발병한 개체에서 더 효율적인 제어를 유도하는 것으로 지지될 수 있다(Leligdowicz, A. et al. (2007) J. Clin. Invest. 117(10):3067-3074). 이는 또한 HIV-1의 세계적 확산과 HIV-2의 제한된 지리적 유병률에 대한 지배적인 이유일 수 있다.
HIV-2 감염이 HIV-1 감염보다 더 잘 제어되지만, HIV-2-발명 개체는 여전히 치료 이익을 얻는다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 HIV-1 감염을 치료하는 데 사용된다. 다른 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 HIV-2 감염을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 HIV-1 및 HIV-2 감염을 치료하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 전염병을 치료하는 방법은 개체에게 제2 항-감염제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 적합한 항-감염제는 항-레트로바이러스 약물, 광범위 중화 항체, 톨(toll)-유사 수용체 효현제, 잠복 재활성화제, CCR5 길항제, 면역 자극제(예를 들어, TLR 리간드), 백신, 뉴클레오사이드 역전사효소 저해제, 뉴클레오타이드 역전사효소 저해제, 비-뉴클레오사이드 역전사효소 저해제, HIV 프로테아제 저해제, 및 융합 저해제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 제2 항-감염제는 조작된 면역 세포와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 항-감염제는 조작된 면역 세포의 투여와 순차적으로(예를 들어, 조작된 면역 세포의 투여 이전 또는 이후에) 투여된다.
일부 실시형태에서, 개체는 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 일부 실시형태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 개체는 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험 동물 등이다. 일부 실시형태에서, 개체는 약 60세 미만(예를 들어, 약 50, 40, 30, 25, 20, 15, 또는 10세 중 어느 하나 미만을 포함함)이다. 일부 실시형태에서, 개체는 약 60세 초과(예를 들어, 70, 80, 90, 또는 100세 중 어느 하나 초과를 포함함)이다. 일부 실시형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애(예컨대, 암 또는 바이러스 감염) 중 하나 이상으로 진단되거나 환경적 또는 유전적으로 이에 대한 경향이 있다. 일부 실시형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 위험 인자를 가진다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 체중 ㎏ 당 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109개 세포 중 어느 하나의 투약량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 체중 ㎏ 당 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 104 내지 약 109, 약 104 내지 약 106, 약 106 내지 약 108, 또는 약 105 내지 약 107개 세포 중 어느 하나의 투약량으로 투여된다.
하나 초과 유형의 조작된 면역 세포가 투여되는 일부 실시형태에서, 상이한 유형의 조작된 면역 세포가, 예컨대, 단일 조성물로 동시에, 또는 임의의 적합한 순서로 순차적으로 개체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1회 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다수 회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상 중 어느 하나) 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회, 5개월에 1회, 6개월에 1회, 7개월에 1회, 8개월에 1회, 9개월에 1회, 또는 1년에 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여 사이의 간격은 약 1주 내지 2주, 2주 내지 1개월, 2주 내지 2개월, 1개월 내지 2개월, 1개월 내지 3개월, 3개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 중 어느 하나이다. 특정 환자에 대한 최적의 투약량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대하여 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
제조 물품 및 키트
본 발명의 일부 실시형태에서, 감염병, 예컨대, 바이러스 감염(예를 들어, HIV에 의한 감염)의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 면역 세포의 표면에 본 발명의 CR 및 CCOR을 제시하는 면역 세포이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조작된 면역 세포 조성물을 환자에게 투여하기 위한 설명서를 더 포함할 것이다. 본 명세서에 기재된 조합 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
포장 삽입물은 이와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투약량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 포장 삽입물은 조성물이 표적 항원-양성 바이러스 감염(예를 들어, HIV에 의한 감염)을 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다.
추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충액, 예컨대, 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 항원-양성 질환 또는 장애의 치료를 위해, 선택적으로 제조 물품과 조합하여, 다양한 목적에 유용한 키트가 또한 제공된다. 본 발명의 키트는 조작된 면역 세포 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기(또는 단위 투약 형태 및/또는 제조 물품)를 포함하고, 일부 실시형태에서 또 다른 작용제(예컨대, 본 명세서에 기재된 작용제) 및/또는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것과 함께 사용하기 위한 설명서를 더 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 기록된 설명서이지만, 기계 판독가능 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 있는 설명서)도 또한 허용 가능하다.
예시적인 실시형태
실시형태 1. a) i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR); 및 b) i) 키메라 공동수용체(CCOR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인; ii) CCOR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 공동수용체(CCOR)를 포함하는 조작된 면역 세포이되, CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 2. i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포이되, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 3. i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하는 조작된 면역 세포이되, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4, 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되고, CCR5, CXCR4, 또는 CD4는 광범위 중화 항체와 일렬인, 조작된 면역 세포.
실시형태 4. 실시형태 3에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117 또는 10-1074인, 조작된 면역 세포.
실시형태 5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공동수용체("COR")를 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 6. a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 제1 핵산으로, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 제1 핵산; 및 b) 키메라 공동수용체(CCOR)를 인코딩하는 제2 핵산으로, CCOR은 i) CCOR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인; ii) CCOR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포이되; CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 7. 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포이되, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 8. 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포이되, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고, CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되며, CCR5, CXCR4, 또는 CD4는 광범위 중화 항체와 일렬인, 조작된 면역 세포.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074인, 조작된 면역 세포.
실시형태 10. 실시형태 6 내지 9에 있어서, 하나 이상의 공동수용체("COR")를 인코딩하는 하나 이상의 핵산(들)을 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 키메라 항원 수용체("CAR")인, 조작된 면역 세포.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, 상기 CR 막관통은 CD8α로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 14. 실시형태 11에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 또는 CD66d로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는 항-CD4 면역 세포 수용체.
실시형태 16. 실시형태 11 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 세포내 CR 공동자극 도메인을 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 17. 실시형태 16에 있어서, 상기 세포내 CR 공동자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD40, PD-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, DAP10, DAP12, CD83, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 분자로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 상기 세포내 CR 공동자극 신호전달 도메인은 4-1-BB의 세포질 도메인을 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 19. 실시형태 11 내지 18 중 어느 하나에 있어서, CR 항원 결합 도메인의 C-말단과 CR 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 CR 힌지 도메인을 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 20. 실시형태 19에 있어서, 상기 CR 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 21. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 세포내 공동자극 도메인을 포함하지 않는, 조작된 면역 세포.
실시형태 22. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 키메라 T 세포 수용체("cTCR")인, 조작된 면역 세포.
실시형태 23. 실시형태 22에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR 서브유닛의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 24. 실시형태 23에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인은 CD3ε의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 25. 실시형태 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR 서브유닛의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 26. 실시형태 25에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ε의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 27. 실시형태 22 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인 및 세포내 CR 신호전달 도메인은 동일하거나 상이한 TCR 서브유닛(들)으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 28. 실시형태 22 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 TCR 서브유닛의 세포외 도메인의 일부를 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 29. 실시형태 22 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR은 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 30. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터 하에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 31. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR을 인코딩하는 핵산은 구성적으로 발현되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 32. 실시형태 6 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터 하에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 33. 실시형태 6 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 구성적으로 발현되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 34. 32에 있어서, 상기 CCOR 및/또는 COR을 인코딩하는 핵산은 면역 세포의 활성화시 유도성인, 조작된 면역 세포.
실시형태 35. 실시형태 6 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 37. 실시형태 6 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 벡터 상에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 38. 실시형태 10 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 COR-인코딩 핵산은 제1 핵산과 동일한 벡터 상에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 39. 실시형태 10 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 COR 인코딩 핵산은 제2 핵산과 동일한 벡터 상에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 상기 하나 이상의 COR 인코딩 핵산 및 제1 핵산 또는 제2 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있는, 조작된 면역 세포.
실시형태 41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 표적 항원 CD4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 42. 실시형태 1, 5, 6 및 10 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 CCOR 표적 항원은 CD4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 43. 실시형태 1, 5, 6 및 10 내지 40 및 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 44. 실시형태 1, 5, 6 및 10 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 표적 항원은 CD4이고 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
실시형태 45. 실시형태 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 항원 결합 도메인 또는 CCOR 항원 결합 도메인은 CD4의 도메인 1(CD4 D1)을 특이적으로 인식하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 46. 실시형태 5 및 10 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 CXCR5, α4β7, 및 CCR9로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 47. 실시형태 46에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 CXCR5인, 조작된 면역 세포.
실시형태 48. 실시형태 46 또는 47에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 α4β7인, 조작된 면역 세포.
실시형태 49. 실시형태 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 CCR9인, 조작된 면역 세포.
실시형태 50. 실시형태 46 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함하는, 조작된 면역 세포.
실시형태 51. 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 세포 내에서 CCR5의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 52. 실시형태 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 항-HIV 항체를 발현하도록 변형되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 53. 실시형태 52에 있어서, 상기 항-HIV 항체는 광범위 중화 항체인, 조작된 면역 세포.
실시형태 54. 실시형태 53에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117 10-1074인, 조작된 면역 세포.
실시형태 55. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 CR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fc(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 56. 실시형태 55에 있어서, 상기 CR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb인, 조작된 면역 세포.
실시형태 57. 실시형태 1, 5, 6, 및 10 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 CCOR 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fc(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 CCOR 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 58. 실시형태 57에 있어서, 상기 CCOR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb인, 조작된 면역 세포.
실시형태 59. 실시형태 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 CCOR 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB(CD137), CD27, OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, CD83, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상의 공동자극 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 60. 실시형태 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 세포, γδT 세포 및 자연 살해 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포인, 조작된 면역 세포.
실시형태 62. 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나의 조작된 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
실시형태 63. 실시형태 62에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나에 따른 조작된 면역 세포의 적어도 2가지 상이한 유형을 포함하는 약제학적 조성물.
실시형태 64. 유효량의 실시형태 62 또는 63의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 전염병을 치료하는, 방법.
실시형태 65. 실시형태 64에 있어서, 상기 전염병은 HIV 및 HTLV로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의한 감염인, 방법.
실시형태 66. 실시형태 65에 있어서, 상기 전염병은 HIV인, 방법.
실시형태 67. 실시형태 64 내지 66에 있어서, 개체에게 제2 항-감염제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 상기 감염제는 항-레트로바이러스 약물, 광범위 중화 항체, 톨-유사 수용체 효현제, 잠복 재활성화제, CCR5 길항제, 면역 자극제, 및 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 69. 유효량의 실시형태 62 또는 63의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 상기 암은 T 세포 림프종인, 방법.
실시형태 71. 실시형태 69 또는 70에 있어서, 개체에게 제2 항암제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 72. 실시형태 71에 있어서, 상기 제2 항암제는 CD70 표적화 약물, TRBC1, CD30 표적화 약물, CD37 표적화 약물 및 CCR4 표적화 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 73. 실시형태 64 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
실시형태 74. a) 면역 세포 집단을 제공하는 단계; b) 상기 면역 세포 집단 내로 CR을 인코딩하는 제1 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나의 조작된 면역 세포를 제조하는, 방법.
실시형태 75. 실시형태 74에 있어서, c) 상기 면역 세포 집단 내로 CCOR을 인코딩하는 제2 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 76. 실시형태 75에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 세포 내로 동시에 도입되는, 방법.
실시형태 77. 실시형태 75에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 세포 내로 순차적으로 도입되는, 방법.
실시형태 78. 실시형태 74 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 집단 내로 하나 이상의 COR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 79. 실시형태 74 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 핵산, 제2 핵산, 및/또는 COR 인코딩 핵산은 세포 내로 바이러스 벡터를 통해 도입되는, 방법.
실시형태 80. 실시형태 74 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포 집단 내로 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 HIV 융합 저해 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 81. 실시형태 74 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 CCR5 유전자를 비활성화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 82. 실시형태 81에 있어서, 상기 CCR5 유전자는 CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN, siRNA, 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 비활성화되는, 방법.
실시형태 83. 실시형태 74 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 개체의 말초 혈액으로부터 상기 면역 세포 집단을 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, 상기 면역 세포 집단은 CD4+ 세포에 대해 추가로 풍부화되는, 방법.
실시형태 85. 실시형태 83 또는 84에 있어서, 상기 면역 세포 집단은 CD8+ 세포에 대해 추가로 풍부화되는, 방법.
당업자는 여러 실시형태가 본 발명의 범주 및 사상 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 이제 본 발명은 하기 비-제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명될 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 어떠한 방법으로도 그 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 1차 T 세포 및 다른 포유동물 세포에서 CR 및 CCOR의 발현
구성적 프로모터 hEF1α, 독시사이클린 유도성 프로모터(예컨대, 테트온), NFAT-의존성 유도성 프로모터, 또는 열 유도성 프로모터(예컨대, 인간 열 충격 단백질 70 프로모터, HSP70p)에 의해 구동되는 CR, CCOR, 및 선택적으로 COR을 인코딩하는 핵산을 가지는 렌티바이러스 벡터를 설계하고 제조한다. 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여자 유래의 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리에 의해 준비한다. 인간 1차 T 세포를 자기 비드 단리를 사용하여 PBMC로부터 정제한다. 인간 T 세포를 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입하고 며칠 동안 생체 외에서 확장시킨다. 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수용체의 발현을 검출할 수 있다. 형질도입된 T 세포의 생물활성을 시험관내 표적 세포의 사멸 및 다른 시험관내 분석 및 생체 내 동물 모델을 통해 평가할 수 있다.
실시예 2. 재료 및 방법
세포. DMEM+10% FBS 중에 293T 세포를 유지하였다. 동결보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 헤마케어(Hemacare)에서 구입하였다. T 세포를 T 세포 단리 키트(밀테니(Miltenyi))에 의해 PBMC로부터 단리하고, T 세포 활성화/확장 키트(밀테니)에 의해 활성화시켰다. T 세포를 AIM-V 배지 + 5% 소태아 혈청(FBS) + 300 IU/㎖ IL-2 중에 유지하였다.
플라스미드 및 렌티바이러스 생성. 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자 또는 eTCR 유전자를 pLVX 벡터에서 EF1α 프로모터에 의해 제어하였다. 진스크립트(Genscript)에 의해 유전자를 합성하고 벡터 내로 클로닝하였다. CAR 또는 eTCR 전달 플라스미드, 2세대 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G 외피 코딩 플라스미드를 이용하여 293T 세포를 형질감염시켰다. 10% 폴리에틸렌이민(PEI) 시약에 의해 플라스미드를 293T 세포 내로 형질감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 및 72시간에 바이러스 상청액을 수확하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과하여 세포 잔사를 제거하였다. PEG 방법에 의해 바이러스를 농축시키고, 분취한 다음, -80℃에서 보관하였다.
CAR-T 구축. 팬 T 세포를 팬 T 세포 단리 키트(밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech))에 의해 PBMC로부터 풍부화시키고 T 세포 활성화/확장 키트(밀테니 바이오테크)에 의해 48시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(Polybrene)의 존재 하에 렌티바이러스와 함께 인큐베이션하고, 실온에서 1000 g로 1시간 동안 회전접종하였다(spinoculated). 세포를 AIM-V 배지 + 5% 소태아 혈청(FBS) + 300 IU/㎖ 재조합 인간 IL-2 중에서 확장시켰다. 형질도입 4일 후 CAR+ 또는 eTCR+ 백분율로서 유세포 분석에 의해 형질도입 효율을 결정하였다.
세포독성 분석. 표적 세포를 PBS 중에서 5분 동안 실온에서 2.5 μM CFSE를 이용하여 표지화한 후 1/10 부피의 FBS를 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 세포를 2회 세척하고 배양 배지에 재현탁시켰다. 이펙터 세포 및 표적 세포를 원하는 이펙터:표적 비율(E:T 비율)로 24시간 동안 공동 배양하였다. CFSE 표지화 표적 세포의 사멸을 유세포 분석에 의해 조사하였다.
SHIV 감염 분석. CD4 T 세포를 시험관내에서 4일 동안 정제하고 활성화시킨 후 SHIVSF162P3 바이러스로 감염시켰다. 상기 세포를 감염 후 제12일에 표적 세포로 사용하였다. UNT 세포, 항-CD4 CAR-T 세포, 항-CCR5 CAR-T 세포 및 탠덤 항-CD4/항-CCR5 세포를 이펙터 세포로 사용하였다. 이펙터 및 표적 세포를 0.5:1 및 2:1 비율로 72시간 동안 공동배양하였다. 바이러스 양성 세포 비율을 p27 세포내 염색에 의해 검출하였다.
유세포 분석. 항-인간 CD3, CD4, CD8, CCR5 및 p27 단클론성 항체를 바이오레전드(Biolegend) 및 BD 바이오사이언스(BD Bioscience)에서 구입하였다. 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 다클론성 항체를 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)에서 구입하였다. 세포를 유동 염색(flow staining)을 위해 DPBS + 2% FBS + 1 mM EDTA 중에 재현탁시켰다. BD FACS첼레스타(BD FACSCelesta) 유세포 분석기에서 데이터를 수집하고 플로우조(Flowjo) 소프트웨어(트리스타(TreeStar))에 의해 분석하였다.
HTRF 분석. 표적 세포를 이펙터 세포와 24시간 동안 공동배양하였다. 세포 배양 배지를 수확하고 HTRF 분석(Cisbio)에 의해 IFNγ 농도를 검출하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다. 간략하게, 16㎕의 샘플을 분석 플레이트에서 4㎕의 미리 혼합한 항-IFNγ 항체와 혼합하였다. 플레이트를 실온 암실에서 밤새 인큐베이션하였다. PheraStar 마이크로플레이트 판독기에 의해 신호를 검출하였다.
QPCR 분석. 표적 T 세포를 또한 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 HIV 슈도바이러스로 감염시켰다. 표적 세포를 이펙터 세포와 1:1 비율로 24시간 동안 공동배양하였다. 세포를 수확하고 게놈 DNA를 QPCR을 위해 수집하였다. 세포 게놈 DNA에서 EGFP 복제물을 검출함으로써 통합된 DNA 복제물을 검출하였다.
림프종 마우스 모델에 대한 CAR-T 처리. NCG 마우스에 피하 주사에 의해 HH 피부 T 세포 림프종 세포를 이식하였다. 종양 크기가 120㎣에 이를 때 처리를 위해 마우스를 3개 그룹으로 분리하였다. 대조군 UNT 세포 및 CAR-T 세포를 HBSS 완충액에 재현탁하였다. 꼬리-정맥 주사에 의해 세포를 마우스에 접종하였다. 한 그룹의 마우스는 대조군으로서 400㎕ HBSS를 받았다. 마우스의 한 그룹은 2,500만개의 UNT 세포를 받았고, 마지막 그룹의 마우스는 500만개의 CAR+ 항-CD4 CAR-T 세포를 받았다. 마우스를 관찰하고, 종양 크기 및 체중을 실험 종료시까지 기록하였다. 종양 크기가 2000㎣에 이를 때 마우스를 희생시켰다.
인간화 마우스 모델에서 CAR-T 생체 내 테스트. 신생아 NCG 마우스에 인간 조혈 줄기세포를 이식하여 마우스를 인간 면역 세포로 재구성하고, HIS 마우스로 명명하였다. HIS 마우스를 항-CD4, 항-CCR5 또는 탠덤 항-CD4/항-CCR5 CAR-T 세포로 처리하였다. 그리고 CD4+/CCR5+ 세포의 존재를 실험 동안 테스트하였다.
실시예 3. CAR T 세포의 평가
이 실시예는 본 출원에 예시된 다양한 CAR 작제물의 평가를 기재한다.
키메라 항원 수용체(CAR) 발현 벡터의 구축.
도 6A 및 도 6B는 일렬로 연결된 항-CD4 또는 항-CCR5 또는 항-CXCR4 scFv 또는 sdAb(도 6A) 또는 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 6B)를 함유하는 CAR 작제물의 개략도를 나타낸다. CAR은 항원 인식 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인 4-1BB 및 CD3ζ 세포내 도메인으로 구성된다. 항원 인식 도메인은 scFv, sdAb, 링커에 의해 연결된 2개의 탠덤 scFv, 또는 링커에 의해 연결된 2개의 탠덤 sdAb일 수 있다. scFv 또는 sdAb는 인간 CD4 또는 인간 CCR5 또는 인간 CXCR4 중 임의의 것을 인식할 수 있다. 링커는 (GGGGS)n일 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 5의 임의의 수일 수 있다. 여기서 표시된 힌지는 인간 CD8의 세포외 도메인(서열번호 2)의 일부이다. 막관통 도메인은 인간 CD8 막관통 도메인(서열번호 3)에서 유래한다. 세포내 도메인은 인간 4-1BB 세포내 영역(서열번호 4) 및 CD3ζ 신호전달 형질도입 도메인(서열번호 5)에서 유래한다. 본 실시예에서 사용된 CAR 작제물은 다음 서열을 가진다:
항-CD4 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(항-CD4 CAR): 서열번호 11, 서열번호 49 내지 64.
항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(항-CCR5 CAR): 서열번호 12, 서열번호 35 내지 48.
항-CXCR4 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(항-CXCR4 CAR): 서열번호 65 내지 72.
항-CD4 scFv-항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(탠덤 항-CD4-항-CCR5 CAR): 서열번호 13
항-CD4 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 항-CD4 CAR): 서열번호 14
항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 항-CCR5 CAR): 서열번호 15
항-CD4 scFv-항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 탠덤 항-CD4-항-CXCR5 CAR): 서열번호 16
항-CD4 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(CXCR5 및 VRC01을 갖는 항-CD4 CAR): 서열번호 17
항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(CXCR5 및 VRC01을 갖는 항-CCR5 CAR): 서열번호 18
항-CD4 scFv-항-CCR5 scFv-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(CXCR5 및 VRC01을 갖는 탠덤 항-CD4-항-CCR5 CAR): 서열번호 19
CAR 세포 구축 및 표현형.
인간 말초 단핵 세포(PBMC)로부터 단리한 T 세포로부터 CAR-T 세포를 생성하였다. PBMC 유래의 T 세포를 시험관내에서 풍부화시키고 활성화시킨 후 CAR 유전자를 인코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 형질도입하였다. CD8+ T 세포는 세포독성 인자, 퍼포린 및 그랜자임 B를 분비함으로써 활성화 시 표적 세포-사멸 기능을 가진다. CD8 T 세포의 세포독성 기능은 적응 면역계가 감염된 세포를 제거하고 본질적인 이상 세포 형질전환을 감시하는 데 중요하다. 표적 세포 사멸 기능은 또한 인공적으로 조작된 CAR-T 세포의 가장 중요한 기능이다. 조작된 CAR-T 세포의 세포독성 기능을 조사하기 위하여, CAR-T 세포를 팬 T 세포와 원하는 비율로 공동배양하였다. 이의 CAR-T 세포를 이펙터 세포(E)로 명명하는 한편, 팬 T 세포를 표적 세포(T)로 명명하였다. 이펙터 세포와 구별되도록 표적 세포를 CFSE로 표지화하였다. 표적 및 이펙터 세포를 24시간 동안 공동배양한 후 유세포 분석을 위해 수확하였다. CFSE-표지화 표적 세포 백분율을 기록하여 세포독성 효과를 반영하였다. 형질도입되지 않은 T 세포(UNT) 세포를 CAR-T 세포에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. CAR-T 형질도입 1주 후, 상기 세포의 핵심 기능, 즉 표적 세포 사멸 능력을 초기 스크리닝 동안 테스트하였다. 도 7은 항-CCR5 CAR-T, 항-CD4 CAR-T 및 항-CXCR4 CAR-T 세포의 정량적 스크리닝 결과를 나타낸다. 14가지 항-CCR5 CAR-T 중에서, 번호 13이 가장 우수한 표적 사멸 효과를 가졌다. 16가지 항-CD4 CAR-T 중에서, 번호 13이 가장 효율적인 것이었다. 8가지 항-CXCR4 CAR-T 중에서, 번호 5가 가장 우수한 표적 사멸 효과를 가졌다. 항-CD4 CAR-T 번호 13을 CD4 CAR-T(서열번호 11)로 개명하였고 scFv 서열을 다음의 모든 항-CD4 설계에서 사용하였다. 항-CCR5 CAR-T 번호 13을 항-CCR5 CAR-T(서열번호 12)로 개명하였고, 이의 scFv 서열을 복합체 설계에서 사용하였다.
CAR 구조가 서로 유사하였지만, 모든 키메라 항원 수용체가 T 세포와 동일하게 형질도입될 수 있는 것은 아니었다. 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 항체를 유세포 분석에 의한 CAR+ T 세포의 백분율을 검출하는 데 사용하였다. 도 8A 내지 8E는 형질도입 4일 후 CAR+% 세포를 나타낸다.
CAR-T 세포를 AIM-V 배지 + 5% FBS + 300 IU/㎖ IL-2 중에서 배양하였다. 세포가 융합하는 경우 세포를 더 큰 웰로 옮겼다. 신선한 완전 배지를 보충하여 세포 확장을 지원하였다. 세포 수 및 생존력을 형질도입 후 제0일, 제4일, 제6일 및 제10일에 기록하였다. 항-CD4 CAR-T 번호 13의 확장이 도 9에 도시되어 있다.
CAR-T 세포독성 분석
도 10A, 도 10B 및 도 10E는 CAR-T 세포의 세포독성 효과에 대한 유세포 분석 결과를 도시한다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 대조군 UNT 세포와 공동배양한 표적 세포에서 58%의 CD4+ T 세포가 있었지만, 표적 세포를 항-CD4 CAR-T 번호 13과 공동배양하였을 때 CD4+ 집단은 0%로 감소하였으며, 이는 표적에 대한 항-CD4 CAR-T 번호 13의 강력한 사멸 효과를 시사한다. 도 10B에서, 표적 세포를 UNT와 공동배양하였을 때 CCR5+ 집단은 약 15%였지만, 표적 세포를 항-CCR5 CAR-T 번호 13 세포와 공동배양하였을 때 집단은 1% 미만으로 감소하였으며, 이는 항-CCR5 CAR-T 번호 13 세포가 매우 효과적임을 시사한다. 도 10E는 탠덤 항-CD4/항-CCR5-CART의 효과를 나타낸다. 탠덤 CART 세포는 CD4 단일 양성 세포와 CCR5 단일 양성 세포를 제거하였을 뿐만 아니라, CD4/CCR5 이중 양성 집단도 효율적으로 제거하였다.
CAR-T 사이토카인 프로파일링
퍼포린 및 그랜자임 B 이외에, 활성화시 CD8+ T 세포는 또한 사이토카인 IFNγ 및 TNFα를 분비한다. 이러한 전염증성 사이토카인은 중요한 CD8+ T 세포 기능 지표이지만, 이는 또한 입양 T 세포 요법, 사이토카인 방출 증후군의 부작용에서도 역할을 할 수 있다. 시험관내 HTRF 분석에 의해 IFNγ의 생성을 검출하였다. 형질도입 후 제6일에 상청액을 수집하고 사이토카인 수준을 측정하였다. 도 11은 항-CD4 CAR-T 번호 13 세포에 의한 이들 사이토카인의 생성을 나타낸다.
실시예 4. eTCR T 세포의 평가
이 실시예는 본 출원에서 예시된 다양한 키메라 TCR 작제물의 평가를 기재한다.
항-CD4-eTCR 및 항-CCR5-eTCR 발현 벡터의 구축
T 세포 수용체 α 및 β 사슬은 CD3 ε/δ/γ/ζ 사슬과 복합체를 형성한다. TCR은 MHC에 의해 제시된 항원을 인식하여, CD3 ζ 사슬의 인산화를 야기하고 후속적으로 세포 내부의 하류 경로로 신호를 전달하여 T 세포를 활성화시킨다. 자연 T 세포 활성화는 TCR-MHC 상호작용에 의존하므로, MHC 의존성이다. 본 명세서에 기재된 이러한 키메라 TCR은 TCR 복합체를 변형시켜 MHC-독립적 방식으로 T 세포를 활성화시켰다. 변형은 CD3ε에 있으며, 이의 전체 명칭은 T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬(서열번호 6)이다. CD3ε 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대, Uniprot 및 NCBI Genebank에서 입수가능하다. 서열번호 6에 열거된 서열은 Uniprot ID P07766으로부터의 것이다. 이 키메라 TCR은 본 명세서에서 eTCR로 명명된다.
eTCR 유전자는 렌티바이러스 벡터에 의해 발현되고 EF1α 프로모터에 의해 제어된다. CD3ε 신호 펩타이드 서열(서열번호 7) 다음에 항원 인식 서열이 온다. 링커 (G4S)3 서열을 항원 인식 서열과 CD3ε 서열 사이에 추가하였다(서열번호 8). DNA 서열을 최적화하고 진스크립트에서 새로 합성한 다음 게이트웨이 클로닝(Gateway Cloning)에 의해 pLVX 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 본 실시예에서 사용된 eTCR 작제물은 다음 서열을 가진다:
항-CD4-CD3ε(항-CD4 eTCR): 서열번호 20, 73
항-CCR5-CD3ε(항-CCR5 eTCR): 서열번호 21, 74 내지 76
항-CD4-CD3ε-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 항-CD4 eTCR): 서열번호 22
항-CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 항-CCR5 eTCR): 서열번호 23
항-CD4-항-CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5(CXCR5를 갖는 탠덤 항CD4-항-CCR5 eTCR): 서열번호 24
항-CD4-항-CCR5-CD3ε-P2A-CXCR5-P2A-VRC01(CXCR5 및 VRC01을 갖는 탠덤 항CD4-항CCR5 eTCR): 서열번호 25
도 12A 및 도 12B는 항-CD4 또는 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 12A), 또는 일렬로 연결된 항-CD4 및 항-CCR5 scFv 또는 sdAb(도 12B)를 함유하는 예시적인 eTCR의 개략도를 나타낸다. scFv, sdAb, 2개의 탠덤 scFv 또는 2개의 탠덤 sdAb는 (G4S)3 링커에 의해 CD3ε 사슬에 연결된다.
eTCR 설계를 추가로 개발할지 여부에 대한 주요 결정자로서 표적 세포 사멸 효과를 평가하였다. 조작된 eTCR-T 세포의 표적 세포 사멸 효과를 조사하기 위하여, eTCR-T 세포를 팬 T 세포와 원하는 비율로 공동배양하였다. 이의 eTCR-T 세포를 이펙터 세포(E)로 명명하는 한편, 팬 T 세포를 표적 세포(T)로 명명하였다. 이펙터 세포와 구별되도록 표적 세포를 CFSE로 표지화하였다. 표적 및 이펙터 세포를 24시간 동안 공동배양한 후 유세포 분석을 위해 수확하였다. CFSE-표지화 표적 세포 백분율을 기록하여 세포독성 효과를 반영하였다. 형질도입되지 않은 T 세포(UNT) 세포를 eTCR-T 세포에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 도 12C는 CD4 CAR-T 번호 13, CD4 eTCR, CD4 eTCR 번호 11의 표적 세포 사멸 효과를 정량적으로 비교하였다. CD4 eTCR 번호 11은 이발리주맙 항체 서열 유래의 항원 결합 영역을 가진다. CD4 eTCR 번호 11의 표적 세포 사멸 능력은 CD4 eTCR보다 덜 최적이다.
도 12D는 3가지 스크리닝된 항-CCR5 eTCR 작제물의 결과를 나타내었다. 3가지 항-CCR5 작제물 중에서, CCR5 eTCR이 가장 우수한 표적 세포 사멸 효과를 가졌으며 이를 추가로 연구하였다.
eTCR-T 세포 표현형
CAR-T 세포와 같이, eTCR을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 활성화된 T 세포를 형질도입함으로써 eTCR 세포를 생성하였다. 모든 T 세포가 동일한 효율로 형질도입될 수 있는 것은 아니다. 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 항체를 유세포 분석에 의한 eTCR+ T 세포의 백분율을 검출하는 데 사용하였다. 도 13A는 형질도입 4일 후 eTCR+% 세포를 나타낸다.
eTCR-T 세포 확장
eTCR-T 세포를 AIM-V 배지 + 5% FBS + 300 IU/㎖ IL-2 중에서 배양하였다. 세포가 융합하는 경우 세포를 더 큰 웰로 확장시키고 신선한 완전 배지를 보충하여 세포가 항상 이상적인 배양 조건에 있는 것을 확실하게 하였다. 세포 수 및 생존력을 형질도입 후 제0일, 제4일, 제6일 및 제10일에 기록하였다. eTCR-T 세포의 확장이 도 13C에 도시되어 있다.
eTCR-T 세포독성
도 14는 eTCR-T 매개 표적 세포 사멸의 대표적인 유세포 분석 결과를 나타낸다. 도 14A는 항-CD4 eTCR-T 세포가 표적 세포에서 CD4+ 집단을 완전히 고갈시킬 수 있는 항-CD4 eTCR T 세포의 세포독성 효과의 유세포 분석 결과를 도시한다. 항-CCR5 eTCR-T 세포는 또한 도 14B에 나타낸 바와 같이 CCR5+ 집단의 대부분을 사멸시켰다.
eTCR-T 사이토카인 프로파일링
시험관내 HTRF 분석에 의해 IFNγ의 생성을 검출하였다. eTCR-T 세포를 표적 팬 T 세포와 2:1 및 0.5:1 비율로 24시간 동안 공동배양하고 상청액을 수집하였다. 도 13B는 항-CD4 eTCR-T 세포에 의한 IFNγ 사이토카인의 생성을 나타낸다. UNT 세포를 대조군으로 사용하였다. eTCR-T 세포에 의해 분비된 IFNγ 사이토카인은 UNT 대조군 세포보다 단지 약간 더 높았다.
실시예 5. CXCR5-발현 T 세포
림프절은 중요한 2차 림프 기관이다. B 세포는 말초 혈액에서 순환하고 성숙을 위해 림프절 B 세포 여포로 들어가며, 여기서 배중심 수지상 세포 및 여포 T 헬퍼 세포의 도움으로 아이소타입 변환 및 친화성 성숙 과정을 거친다. B 세포, 수지상 세포 및 여포 T 세포는, CXCL13에 대한 수용체인 CXCR5를 발현한다. CXCL13은 배중심 기질 세포와 수지상 세포에 의해 생성되는 배중심에 높은 수준으로 있다. CD8+ T 세포는 보통 B 세포 여포에서 매우 드물다. 면역조직학 염색으로 여포 내부에 높은 수준의 HIV 바이러스가 숨어있는 것으로 나타났으며, 이는 배중심이 주요 HIV 저장소임을 시사한다. 엘리트 HIV 컨트롤러의 배중심에서 CD8+ T 세포가 증가한 것으로 보고되었다. 이러한 CD8+ T 세포는 CXCR5와 공동발현하고 높은 수준의 세포독성 이펙터 인자를 발현하며 바이러스 제어에 기여한다. 본 출원의 특정 실시형태는 CAR-T 세포 또는 eTCR-T 세포 상에서 CXCR5를 공동발현하는 것을 포함한다.
도 15는 CAR 또는 eTCR을 가지고 또한 CXCR5를 발현하는 조작된 T 세포를 예시한다. P2A 링커에 의해 CXCR5를 CAR 또는 eTCR 유전자에 연결하였다. 항원 인식 영역은 항-CD4, 항-CCR5 또는 탠덤 항-CD4/항-CCR5일 수 있다. 이는 scFv 또는 sdAb일 수 있다. 항-CXCR5 항체를 CXCR5 발현을 검출하는 데 사용하였다.
이 실험에서 사용된 CAR 및 eTCR 작제물은 상기와 동일하다. CXCR5는 다음 서열을 가진다: 서열번호 9. 도 16A는 형질도입된 항-CD4 CAR-T 세포에서 CXCR5의 발현을 도시하고, 도 16B는 항-CCR5 CAR-T 세포에서 CXCR5의 발현을 도시한다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, CAR+ 세포의 90% 초과는 또한 높은 수준의 CXCR5를 발현한다.
CXCR5를 발현하는 CAR-T 세포는 도 10C 및 도 10D에 나타낸 바와 같이 CXCR5가 없는 CAR-T 세포만큼 효율적으로 표적 세포를 제거할 수 있다. CXCR5를 공동발현하는 CAR-T를 이펙터 세포로 사용하였고 CFSE 표지화 팬 T 세포와 함께 24시간 동안 배양하였다. 도 10C에서, 표적 세포를 UNT 대조군 세포와 함께 배양할 때 63.8% CD4+ T 세포가 있었고, 표적 세포를 CXCR5를 공동발현하는 항-CD4 CAR-T 세포와 공동배양할 때 집단은 1.46%로 떨어졌다. 도 10D에 나타낸 바와 같이, UNT 샘플에서 CCR5+%는 21.2%인 반면, 항-CCR5 CAR-CXCR5 샘플에서 백분율은 0.609%로 감소하였다.
도 10F는 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR-CXCR5-C34 T 세포의 세포독성 효과를 기재한다. 항-CD4/항-CCR5 탠덤 CAR-CXCR5-C34 T 세포는 CD4/CCR5 이중 양성 집단을 효율적으로 제거하였고 CD4 또는 CCR5 단일 양성 집단의 일부를 남겼으며, 이는 일부 질환 상황에서 안정성을 증가시킬 것이다.
실시예 6. 광범위 중화 항체-발현 T 세포
HIV 감염 집단 중에서, 소수의 사람은 항-레트로바이러스 약을 복용하지 않고 자연적으로 바이러스 감염을 제어할 수 있다. 연구는 이들이 바이러스 감염에 대한 강력한 항체 반응을 생성할 수 있음을 밝혔다. 이들 항체는 HIV 당단백질 GP160에서 비교적 보존된 영역을 인식하고 HIV의 다양한 하위유형을 중화시킬 수 있으므로, 이들 항체는 광범위 중화 항체였다. 광범위 중화 항체는 SHIV에 감염된 히말라야 원숭이에서 테스트되었으며, 중앙값 21주 동안 바이러스 부하를 제어할 수 있다. 본 출원의 특정 실시형태는 CAR-T 세포 또는 eTCR-T 세포에서 광범위 중화 항체를 공동발현하는 것을 포함한다. CAR-T 세포 및 eTCR-T 세포는 광범위 중화 항체를 분비하여 새로운 숙주 세포의 HIV 감염을 차단할 수 있다.
도 17은 항-CD4 또는 항-CCR5 또는 탠덤 항-CD4/항-CCR5 CAR 또는 eTCR, 케모카인 수용체 CXCR5 및 또한 광범위 중화 항체(bNAb)를 발현하는 조작된 T 세포를 도시한다. pLVX 렌티바이러스 벡터 내로 코딩 서열을 클로닝하였다. EF1α 프로모터에 의해 키메라 유전자 전사를 제어하였다. P2A 서열을 CAR 또는 eTCR 서열 뒤에 추가하였다. 인간 CXCR5 서열을 P2A 서열 뒤에 추가하였다. 인간 IL2 신호 펩타이드(서열번호 34)를 가지는 bNAb를 또 다른 P2A에 의해 CXCR5에 연결하였다.
본 실험에 사용된 CXCR5뿐만 아니라 CAR 및 eTCR 작제물은 상기한 바와 동일하다. VRC01은 다음 서열을 가진다: 서열번호 10. His 태그 표지화 VRC01(VRC01-6His)을 인코딩하는 CAR-T 렌티바이러스를 이용하여 T 세포를 형질도입하였다. 배양 상청액을 형질도입 후 제8일에 수확하였다. 상청액 중 VRC01 농도를 항-His 태그 항체를 사용하여 ELISA에 의해 검출하였다. 검출된 농도는 상청액에서 약 40 ng/㎖이었다.
실시예 7. CAR T 세포의 기능적 적용
항-CD4 CAR-T 세포는, HIV 감염에 대한 주요 숙주 세포인 CD4+ T 세포를 사멸시킨다. 이들 세포가 바이러스를 제거할 수 있는지 여부를 설명하기 위해, CD4+ T 세포를 시험관내에서 HIV 슈도바이러스로 감염시켰다. CAR-T 세포를 감염된 세포와 공동배양하였다. 도 18A에 나타낸 바와 같이, CAR-T 세포는 B 세포 마커 CD19(서열번호 77)를 표적화하는 대조군 CAR-T와 비교하여 바이러스 부하를 크게 감소시켰다. 바이러스 감염이 없는 세포를 검출 대조군으로 사용하였다. 도 18B에서, HIV 슈도바이러스로 성공적으로 감염된 임의의 세포가 EGFP+가 되는 HIV 슈도바이러스를 인코딩하는 EGFP로 T 세포를 감염시켰다. 이러한 세포를 표적 세포로 사용하였고 항-CD4 CAR-T 번호 13 세포 또는 UNT 세포와 공동배양하였다. 상이한 E:T 비율을 사용하였다. 세포를 24시간 동안 공동배양하였고 유세포 분석에 의해 EGFP 백분율을 검출하기 위해 세포를 수확하였다. E:T 비율이 증가함에 따라 EGFP+ 비율은 감소하였다. E:T 비율이 1:1 이상에 도달할 때 슈도바이러스+ 세포의 백분율은 거의 0으로 떨어졌다. 도 19A에서 CAR-T 작제물을 SHIV 감염된 CD4+ 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 바이러스 단백질 p27을 세포내 염색에 의해 검출하였다. 2가지 상이한 이펙터 대 표적 비율, 즉 0.5:1 및 2:1을 사용하였다. p27 양성에 의해 나타낸 바와 같이 SHIV로 성공적으로 감염된 세포는 1.3% 내지 1.6%였다. CAR-T 세포로 처리된 모든 샘플에서, p27 양성은, 유동 염색 아이소타입 대조군에 가깝거나 그보다 더 낮은 0.207% 이하로 떨어졌다. 도 19B는 바이러스 RNA 및 통합된 DNA의 감소를 나타낸다. 세포 배양 상청액에서, 바이러스 역가는 UNT 세포로 처리한 샘플과 비교하여 CAR-T 세포로 처리한 샘플에서 급격하게 떨어졌다. 통합된 DNA 수준은 PCR 과정으로 인해 검출된 일부 배경 노이즈인 거의 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌다. 이들 모든 데이터는 본 발명자의 CAR-T가 시험관내에서 SHIV 감염을 제거하는 데 매우 효율적이라는 것을 나타내었다.
본 명세서에 기재된 CAR 작제물의 생체 내 효능을 테스트하기 위해, 인간 면역계를 가지는 마우스를 사용하였다. 이에 의하여 상기 마우스를 HIS 마우스로 지칭할 것이다. 심각하게 면역손상되고 T 및 B 세포 형성이 결핍된 NOD CRISPR Prkdc IL2Rγ 마우스(NCG 마우스)로부터 HIS 마우스를 생성하였다. 신생아 NCG 마우스에 인간 조혈 줄기세포를 이식하였고 HIS 마우스로 개명하였다. 인간 조혈 세포는 마우스에서 T 및 B 세포로 발전하여 마우스에서 면역학적 틈새를 채운다. 이들 HIS 마우스는 CAR-T 세포에 대한 생체 내 테스트 모델로 사용되었다. 2가지 CAR-T 세포를 시험관내 모델인 CCR5 CAR-T(항-CCR5 CAR)(도 23A) 및 탠덤 CD4CCR5 CAR-T(항-CD4-항-CCR5 CAR)(도 23B 및 도 23C)에서 테스트하였다. UNT 세포를 대조군으로서 수용자 마우스의 별개의 그룹으로 주사하였다. 도 23A에 나타낸 바와 같이, UNT 세포 처리 마우스에서, 마우스를 UNT 세포로 접종한 후 CCR5+ 세포가 증가한 반면, 항-CCR5 CAR-T 처리 마우스에서는 관찰 기간 동안 CCR5+%가 계속 감소하였다. 관찰 기간의 종료시, 살아있는 세포 집단에서 CCR5+%는 0에 가까웠다. HIS 마우스의 또 다른 그룹은 도 23B 및 도 23C에 나타낸 바와 같이 탠덤 CD4CCR5 CAR-T로 처리하였다. CCR5+ 집단은 CAR-T 세포 처리 후 마우스 말초 혈액에서 극적으로 감소하였다. CCR5+ 집단은 말초의 살이있는 세포 집단으로부터 완전히 고갈되었다. CD4+ 집단은 또한 탠덤 CD4CCR5 CAR-T 그룹에서 원래 집단의 절반으로 감소하였다. 살아있는 세포에서 CD4+ 집단의 백분율은 CAR-T 처리 전에 약 3%였고, 관찰 기간의 종료시 1%로 감소하였다. 이들 데이터는 생체 내에서 항-CCR5 CAR-T가 말초 혈액으로부터 CCR5+ 세포를 박멸하는 데 있어서 매우 효율적이라는 것을 나타내었다. CD4+ 집단은 절반으로 감소하였고 여전히 감소하고 있었는데, 이는 CCR5+ 세포를 제거하는 것에 대한 큰 효율성 외에도, 탠덤 CD4CCR5 CAR-T는 또한 CD4+ 집단을 감소시키는 데 효과적이라는 것을 시사한다.
항-CD4 CAR-T 세포의 또 다른 적용은 CD4+ T 세포 림프종/백혈병 치료를 위한 것일 수 있다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 상이한 투약량의 CAR-T 세포를 CD4+인 Sup-T1 및 HH T 림프아구 세포와 공동배양하였다. CAR-T 세포는 이들 종양 세포에 대하여 큰 세포독성을 나타낸 반면, UNT 대조군 세포는 종양 세포 생존력에 영향을 미치지 않았다. HH 세포를 NCG 마우스 내로 피하 이식하여 세포-유래 이종이식(CDX) 마우스 모델을 생성하였다. CAR-T 세포의 HH CDX 마우스 내로의 생체 내 접종은 CAR-T 세포가 도 21에 나타낸 바와 같이 마우스 종양 부담을 현저하게 감소시킬 수 있음을 나타내었다. CAR-T 요법을 받은 마우스는 CAR-T 접종 후 제12일에 종양이 없었다. 도 21A에 나타낸 바와 같이, 종양은 희생 기준을 충족하기 전에 행크 균형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution; HBSS) 완충액 또는 UNT 세포 처리 마우스에서 지속적으로 성장하였다. CAR-T 처리 마우스의 종양은 처리 후 빠르게 줄어들었고 마우스는 전체 관찰 기간 동안 생존하였다. 도 21B에서, CAR-T 처리 마우스는 아마도 더 적은 종양 부담으로 인해 HBSS 또는 UNT 처리 마우스보다 체중이 약간 덜 나갔다. 제20일쯤 질환 진행으로 인해 HBSS 또는 UNT 처리 마우스를 희생시켰으므로, 그 이후 체중 기록은 없었다.
실시예 8. 분할 CAR 시스템
분할 CAR-T 세포의 구축
본 명세서에 기재된 분할 CAR 시스템은 2가지 구성요소를 함유한다. 한가지 단백질은 세포외 항원-인식 도메인, 힌지, CD8 막관통 도메인 및 CD28 세포내 공동자극 도메인으로 구성된다. 분할 신호 CAR의 다른 단백질은 제2 항원-인식 도메인, 힌지, CD8 막관통 도메인 및 세포내 CD3제타 신호 전달 도메인으로 구성된다. 세포외 항원 인식 도메인은 하나의 구성요소에 있어서 항-CD4 scFv 또는 sdAb이고, 다른 구성요소에 있어서 항-CCR5 또는 항-CXCR4 scFv 또는 sdAb일 수 있다(도 1). 본 실시예에서, 2가지 단백질에 대한 코딩 서열을 중간에 P2A 서열과 연결하였다. 전체 코딩 서열은 pLVX 렌티바이러스 플라스미드에서 EF1α 프로모터의 제어 하에 있었다. CAR 작제물로 성공적으로 형질도입된 T 세포는 2가지 단백질을 상승적으로 발현할 것이다. T 세포는 또한 귀소 수용체를 발현할 수 있다. 귀소 수용체 중 하나는 CXCR5일 수 있으며(도 2), 이는 CXCL13 케모카인과 상호작용하고 2차 림프 기관에서 B 세포 여포로의 세포 귀소에 중요한 역할을 한다. 귀소 수용체는 또한 세포가 장으로 귀소하는 것을 돕는 상향조절된 α4β7일 수 있다(도 3).
분할 신호 CAR의 시험관내 효과
도 22는 예시적인 분할 신호 CAR-T의 시험관내 효과를 나타낸다. 이 실험에서 4가지 설계를 사용하였다. ssCD4CCR5 CAR-T에서, 항-CD4를 CD3ζ 신호전달 도메인과 연결하고 항-CCR5를 공동자극 도메인과 연결한 한편, ssCCR5CD4에서 항-CCR5 부분은 CD3제타 신호전달 도메인을 함유하고 항-CD4는 공동자극 도메인과 연결된다.
작제물은 다음 서열을 가진다:
ssCD4CCR5 CAR-T: 서열번호 26
항-CD4-CD8 힌지-CD8 TM-CD3ζ: 서열번호 27
항-CCR5-CD8 힌지-CD8 TM-4-1-BB: 서열번호 28
ssCCR5CD4 CAR-T: 서열번호 29
항-CCR5-CD8 힌지-CD8 TM-CD3ζ: 서열번호 30
항-CD4-CD8 힌지-CD8 TM-4-1-BB: 서열번호 31
ssCD4CCR5-CXCR5: 서열번호 78
ssCCR5CD4-CXCR5: 서열번호 79
2개의 모이어티를 중간에 P2A로 연결하였고, 제1 모이어티는 Myc 태그를 가졌다. Myc 발현을 도 22A에 나타낸 바와 같이 유세포 분석에 의해 검출하여 분할 신호 CAR의 발현을 나타내었다. 이들 기능을 테스트하기 위해, CFSE 표지화 팬 T 세포를 표적 세포로 사용하고 CAR-T 세포와 E:T=0.5:1로 공동인큐베이션하였다. 유세포 분석 결과는 도 23B에 도시되어 있다. 대조군 UNT 샘플에서, CD4+ 집단은 42.2%이고, CCR5+ 집단은 9.29%이며, CD4+CCR5+ 집단은 6.64%였다. ssCD4CCR5 CAR-T 및 ssCCR5CD4 CAR-T는 남아있는 CD4+CCR5+ 집단이 1% 미만인 CD4+CCR5+ 이중 양성 집단의 대부분을 사멸시켰다. ssCCR5CD4 CAR-T 샘플에서, CD4 단일 양성의 10.4% 및 CCR5 단일 양성 세포의 6.77%가 남아있었다. ssCD4CCR5 CAR-T 샘플에서 남아있는 CCR5+ 세포는 7.89%였다. ssCCR5CD4 CAR 및 ssCD4CCR5 CAR에 CXCR5의 첨가로, CAR-T 세포와 공동배양 후에도 CCR5+ 세포의 대부분을 유지하였고, CD4+ 단일 양성 세포의 약 절반이 살아 남았다. 이러한 데이터는 CD4 및 CCR5가 둘 다 동일한 세포에 존재할 때 분할 CAR이 가장 잘 작동함을 시사한다. ssCCR5CD4, ssCCR5CD4-CXCR5 및 ssCD4CCR5-CXCR5 CAR-T 세포는 다수의 CD4 단일 양성 또는 CCR5 단일 양성 세포를 남길 수 있으므로 이러한 단일 양성 세포를 사멸시키는 데 효율적이지 않았다. CCR5-친화성 HIV 감염은 동일한 세포에서 CD4 및 CCR5 둘 다의 발현을 필요로 한다. 분할 CAR은 HIV 표적 세포를 제거하지만, HIV 감염에 덜 취약한 CD4 또는 CCR5 단일 양성 세포 중 일부는 남길 수 있다.
본 발명의 실시형태에 따른 예시적인 작제물의 서열:
Figure pct00004
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Figure pct00012
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Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
SEQUENCE LISTING <110> Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. <120> CO-RECEPTOR SYSTEMS FOR TREATING INFECTIOUS DISEASES <130> WO/2020/011247 <140> PCT/CN2019/095738 <141> 2019-07-12 <150> PCT/CN2018/095650 <151> 2018-07-13 <150> PCT/CN2019/087259 <151> 2019-05-16 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr 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Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys 785 790 795 800 Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp 805 810 815 Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu 820 825 830 Cys Gln Leu Phe Pro Gly Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu 835 840 845 Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 850 855 <210> 77 <211> 486 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Anti-CD19 CAR <400> 77 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 100 105 110 Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly 165 170 175 Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 195 200 205 Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 210 215 220 Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 225 230 235 240 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 78 <211> 1292 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> ssCD4CCR5-CXCR5 <400> 78 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30 Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr 35 40 45 Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 50 55 60 Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 65 70 75 80 Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 85 90 95 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 100 105 110 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 120 125 Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala 180 185 190 Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr Phe 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 260 265 270 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 275 280 285 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 290 295 300 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 305 310 315 320 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val 325 330 335 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn 340 345 350 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 355 360 365 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 370 375 380 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 385 390 395 400 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 405 410 415 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 420 425 430 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser 435 440 445 Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu 450 455 460 Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu 465 470 475 480 Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 485 490 495 Tyr Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 500 505 510 Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser 515 520 525 Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 530 535 540 Trp Val Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp 545 550 555 560 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 565 570 575 Leu Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 580 585 590 Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala 595 600 605 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly 610 615 620 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 625 630 635 640 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 645 650 655 Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr Leu Asn 660 665 670 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp 675 680 685 Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 690 695 700 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe 725 730 735 Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro 740 745 750 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 755 760 765 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 770 775 780 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 785 790 795 800 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg 805 810 815 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 820 825 830 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 835 840 845 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 850 855 860 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 865 870 875 880 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 885 890 895 Glu Leu Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly 900 905 910 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu 915 920 925 Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu 930 935 940 Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala 945 950 955 960 Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val 965 970 975 Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val 980 985 990 Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr 995 1000 1005 Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile 1010 1015 1020 Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly 1025 1030 1035 Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe 1040 1045 1050 Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr 1055 1060 1065 Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu 1070 1075 1080 Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val Gly Phe 1085 1090 1095 Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln Gly 1100 1105 1110 His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn 1115 1120 1125 Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His 1130 1135 1140 Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr 1145 1150 1155 Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln 1160 1165 1170 Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe 1175 1180 1185 Phe Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr 1190 1195 1200 Leu Ala Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly 1205 1210 1215 Ser Leu Pro Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala 1220 1225 1230 His Cys Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys 1235 1240 1245 Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr 1250 1255 1260 Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe Pro Gly Trp Arg Arg Ser 1265 1270 1275 Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 1280 1285 1290 <210> 79 <211> 1292 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> ssCCR5CD4-CXCR5 <400> 79 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 35 40 45 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 65 70 75 80 Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 85 90 95 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 100 105 110 Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 115 120 125 Arg Gly Arg Asn Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Met Asp 130 135 140 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 165 170 175 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 180 185 190 Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 195 200 205 Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn 210 215 220 Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 225 230 235 240 Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr 245 250 255 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 275 280 285 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 290 295 300 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 305 310 315 320 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 325 330 335 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe 340 345 350 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu 355 360 365 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 370 375 380 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 385 390 395 400 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 405 410 415 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 420 425 430 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 435 440 445 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala 450 455 460 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 465 470 475 480 Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu 485 490 495 Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 500 505 510 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 515 520 525 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 530 535 540 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 545 550 555 560 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 565 570 575 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 580 585 590 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 595 600 605 Arg Val Ile Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 610 615 620 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 625 630 635 640 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp 645 650 655 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu 660 665 670 Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 675 680 685 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 690 695 700 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 705 710 715 720 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 725 730 735 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro 740 745 750 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 755 760 765 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 770 775 780 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 785 790 795 800 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg 805 810 815 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 820 825 830 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 835 840 845 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 850 855 860 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 865 870 875 880 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 885 890 895 Glu Leu Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly 900 905 910 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu 915 920 925 Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu 930 935 940 Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala 945 950 955 960 Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val 965 970 975 Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val 980 985 990 Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr 995 1000 1005 Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile 1010 1015 1020 Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly 1025 1030 1035 Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe 1040 1045 1050 Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr 1055 1060 1065 Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu 1070 1075 1080 Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val Gly Phe 1085 1090 1095 Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln Gly 1100 1105 1110 His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn 1115 1120 1125 Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His 1130 1135 1140 Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr 1145 1150 1155 Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln 1160 1165 1170 Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe 1175 1180 1185 Phe Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr 1190 1195 1200 Leu Ala Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly 1205 1210 1215 Ser Leu Pro Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala 1220 1225 1230 His Cys Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys 1235 1240 1245 Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr 1250 1255 1260 Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe Pro Gly Trp Arg Arg Ser 1265 1270 1275 Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 1280 1285 1290

Claims (58)

  1. 조작된 면역 세포로서,
    a) i) 키메라 수용체(chimeric receptor: CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인, ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR); 및
    b) i) 키메라 공동수용체(chimeric co-receptor: CCOR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인; ii) CCOR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 공동수용체(CCOR)
    를 포함하되,
    상기 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 상기 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, 또는
    상기 CR 표적 항원은 CD4이고 상기 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
  2. 조작된 면역 세포로서,
    i) 키메라 수용체(CR) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체(CR)를 포함하되,
    상기 CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CCR5, CXCR4, 또는 CD4는 광범위 중화 항체와 일렬인, 조작된 면역 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117 또는 10-1074인, 조작된 면역 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공동수용체("COR")를 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
  6. 조작된 면역 세포로서,
    a) 키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 제1 핵산으로서, CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하는, 제1 핵산; 및
    b) 키메라 공동수용체(CCOR)를 인코딩하는 제2 핵산으로서, CCOR은 i) CCOR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CCOR 항원 결합 도메인; ii) CCOR 막관통 도메인; 및 iii) 세포내 CCOR 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는, 제2 핵산
    을 포함하되;
    상기 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 상기 CCOR 표적 항원은 CD4이거나, 또는
    상기 CR 표적 항원은 CD4이고 상기 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
  7. 조작된 면역 세포로서,
    키메라 수용체(CR)를 인코딩하는 핵산을 포함하되, 상기 CR은 i) CR 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CR 항원 결합 도메인; ii) CR 막관통 도메인, 및 iii) 세포내 CR 신호전달 도메인을 포함하고,
    상기 CR 표적 항원은 CCR5, CXCR4 및 CD4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 CCR5, CXCR4 또는 CD4는 광범위 중화 항체와 일렬인, 조작된 면역 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117, 10-1074인, 조작된 면역 세포.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공동수용체("COR")를 인코딩하는 하나 이상의 핵산(들)을 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 키메라 항원 수용체("CAR")인, 조작된 면역 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CR 막관통은 CD8α로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 세포내 CR 공동자극 도메인을 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포내 CR 공동자극 신호전달 도메인은 4-1-BB의 세포질 도메인을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 세포내 공동자극 도메인을 포함하지 않는, 조작된 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 키메라 T 세포 수용체("cTCR")인, 조작된 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR 서브유닛의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인은 CD3ε의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR 서브유닛의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포내 CR 신호전달 도메인은 CD3ε의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 막관통 도메인 및 세포내 CR 신호전달 도메인은 동일하거나 상이한 TCR 서브유닛(들)으로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 TCR 서브유닛의 세포외 도메인의 일부를 더 포함하는, 조작된 면역 세포.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR은 CD3ε의 N-말단에 융합된 CR 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 표적 항원은 CD4인, 조작된 면역 세포.
  26. 제1항, 제5항, 제6항 및 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCOR 표적 항원은 CD4인, 조작된 면역 세포.
  27. 제1항, 제5항, 제6항, 제10항 내지 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4이고 CCOR 표적 항원은 CD4인, 조작된 면역 세포.
  28. 제1항, 제5항, 제6항, 및 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 표적 항원은 CD4이고 상기 CCOR 표적 항원은 CCR5 또는 CXCR4인, 조작된 면역 세포.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 항원 결합 도메인 또는 CCOR 항원 결합 도메인은 CD4의 도메인 1(CD4 D1)을 특이적으로 인식하는, 조작된 면역 세포.
  30. 제5항 및 제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 CXCR5, α4β7, 및 CCR9로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 COR은 α4β7 및 CCR9를 둘 다 포함하는, 조작된 면역 세포.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 상기 세포 내에서 CCR5의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형되는, 조작된 면역 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 항-HIV 항체를 발현하도록 변형되는, 조작된 면역 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항-HIV 항체는 광범위 중화 항체인, 조작된 면역 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 광범위 중화 항체는 VRC01, PGT121, 3BNC117 10-1074인, 조작된 면역 세포.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb인, 조작된 면역 세포.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCOR 항원 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb인, 조작된 면역 세포.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 세포, γδT 세포 및 자연 살해 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포의 적어도 2가지 상이한 유형을 포함하는, 약제학적 조성물.
  41. 유효량의 제39항 또는 제40항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 전염병을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 전염병은 HIV 및 HTLV로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의한 감염인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 전염병은 HIV인, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 제2 항-감염제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  45. 유효량의 제39항 또는 제40항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 암은 T 세포 림프종인, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 개체에게 제2 항암제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
  49. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 면역 세포 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 면역 세포 집단 내로 CR을 인코딩하는 제1 핵산을 도입하는 단계
    를 포함하는, 조작된 면역 세포를 제조하는 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    c) 상기 면역 세포 집단 내로 CCOR을 인코딩하는 제2 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 면역 세포 집단 내로 하나 이상의 COR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산, 제2 핵산, 및/또는 COR 인코딩 핵산은 세포 내로 바이러스 벡터를 통해 도입되는, 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포 집단 내로 광범위 중화 항체(bNAb) 또는 HIV 융합 저해 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서 CCR5 유전자를 비활성화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 CCR5 유전자는 CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN, siRNA, 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 말초 혈액으로부터 상기 면역 세포 집단을 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포 집단은 CD4+ 세포에 대해 더 풍부화되는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 면역 세포 집단은 CD8+ 세포에 대해 더 풍부화되는, 방법.
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