CN118064467A - 两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。所述嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞对靶细胞产生更为强劲的杀伤力。
Description
本申请是申请日为2021年11月02日、申请号为CN2021800294484、发明名称为“两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用”的中国专利的分案申请。
技术领域
本申请属于细胞治疗领域，具体的涉及一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor-engineered T celltherapy,CART)是近些年发展起来的一种行之有效的过继性细胞免疫治疗，该方法通过对自体来源的T细胞进行基因工程改造，使效应性T淋巴细胞产生针对肿瘤细胞的靶向细胞毒作用，以达到清除体内肿瘤细胞的目的。
CART治疗对于复发难治的急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的疗效取得了显著的临床疗效，并得到了业界公认。CART的靶向性取决于通过基因工程技术对T细胞进行的改造方式，使之表达可以识别自身肿瘤细胞相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)的特异性单链抗体(scFv)，后者由TAA特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成，VL和VH之间由柔软的铰链区组成。除了在T细胞表面表达针对肿瘤细胞的特异性单链抗体外，在T细胞内同时表达可协同激活T细胞的共刺激分子，如CD28、4-1BB以及OX4等，从而一方面依靠特异性单链抗体识别肿瘤细胞，另一方面通过上述共刺激分子与CD3ζ协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。
国内外研究发现，通过CD19和CD22的CART联合或者序贯细胞治疗，有助于降低可能的细胞因子风暴水平，进一步提高疾病的远期疗效，也有助于对一次治疗失败的患者提供再次治疗机会。为进一步提高CART治疗的疗效，通过联合两个或多个不同靶点构建CART细胞，有助于治疗肿瘤。
发明内容
本申请提供了一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。本申请所述的两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用可以具备选自下组的至少一个有益效果：1)能够对靶细胞产生更为强劲的杀伤力；2)降低可能的抗原逃逸引起的疾病复发风险；3)能够使各独立嵌合抗原受体蛋白的表达水平接近1:1；4)能够在很大程度上提高病毒载体与人类基因组的重组效率，获得高转染效率的免疫细胞；5)能够显著提高临床疗效。
一方面，本申请提供了一种表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点的核酸序列和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFR VIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其表达2种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含2对不同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其表达3种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含4对各不相同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：77中所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了一种质粒，其包含所述的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的质粒，其包括病毒质粒。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸分子，和/或所述的质粒。
在某些实施方式中，所述的细胞，其包括选自下组的细胞：T细胞和NK细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞，其表达至少2中不同的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子、所述的质粒和/或所述的细胞在准备嵌合抗原受体中的应用。
另一方面，本申请提供了一种制备嵌合抗原受体的方法，其包括以下的步骤：
(1)提供一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列；
(2)使所述核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触；
(3)分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述接触包括加入所述对应的LoxP位点识别酶。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述接触包括表达编码所述对应的LoxP位点识别酶的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子位于载体上。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子与步骤(1)所述的核酸分子位于不同的载体上。
在某些实施方式中，所述的方法中步骤(1)所述的核酸分子包含所述编码识别酶的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法中所述LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
在某些实施方式中，所述的方法中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码启动子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的方法，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的方法中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在某些实施方式中，所述的方法中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
在某些实施方式中，所述的方法中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
在某些实施方式中，所述的方法中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述骨架载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其表达2种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含2对不同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，其之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其表达3种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含4对各不相同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含SEQ ID NO：75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-B显示的是本申请所述嵌合抗原受体基因工程载体(I-1～III-6)的结构示意图。
图2显示的是本申请所述嵌合抗原受体基因工程载体(IV-1～IV-9)的结构示意图。
图3显示的是本申请所述嵌合抗原受体结构在CRE的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体结构示意图。
图4显示的是本申请所述嵌合抗原受体结构在CRE的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体结构杀伤靶细胞示意图。
图5显示的是本申请所述CD19/CD22双靶向载体结构图。
图6显示的是本申请所述GD2/B7H3双靶向载体结构图。
图7显示的是本申请所述CD19/CD22/CD20三靶向载体结构图。
图8A显示的是本申请所述CD19/CD22双靶向载体的构建示意图；图8B显示的是本申请所述CD22/CD19双靶向载体的构建示意图。
图9A-G显示的是本申请所述单靶点和双靶点慢病毒载体包装病毒对人T淋巴细胞的转染。
图10显示的是本申请所述CD19和CD22双靶向特异性CART细胞的体外细胞杀伤实验。
图11显示的是本申请所述一例骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22双靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图12显示的是本申请所述一例多次复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22/CD20三靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图13显示的是本申请所述一例骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22双靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图14显示的是本申请所述一例伯基特淋巴瘤患者接受CD19/CD22/CD20三靶点CART后的治疗情况。
图15显示的是本申请所述两例急性淋巴细胞巴细胞睾丸复发患者的CD19/CD22双靶点CART治疗情况。
图16显示的是本申请所述一例神经母细胞瘤患者接受了基于GD2/B7H3的双靶点CART治疗结果。
图17显示的是本申请所述入组患者的无复发生存率(Relapse-free survival,RFS)和总生存率(Overall survival,OS)；图17A显示的是单一靶点CD19-CART的治疗疗效；图17B显示的是双靶点CD19/CD22-CART的治疗疗效；图17C显示的是双靶点CD19/CD22-CART的治疗疗效；图17D显示的是不同构建体的临床疗效比较。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子”通常是指能够表达包含至少两个细胞外抗原结合结构域的重组多肽构建体的重组核酸序列。在一些实施方案中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含至少一个编码第一抗原结合结构域的核酸序列，编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点的核酸序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中第一抗原结合结构域和与第一抗原结合结构域不同的第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。一方面，抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD19、CD22和CD20。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含启动子核酸序列和引导肽核酸序列。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含共刺激结构域，其中共刺激结构域可以是4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含胞内信号传导结构域，其中胞内信号传导结构域可以是CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含剪切肽，其中剪切肽可以是P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在本申请中，术语“一种制备嵌合抗原受体的方法”通常是指两个或多个靶点的嵌合抗原受体(CAR)在LoxP位点识别酶的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体的方法。一方面，这一方法需要一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点，每一对LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中第一抗原结合结构域和与第一抗原结合结构域不同的第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。一方面，核酸分子需要与对应的LoxP位点识别酶接触。一方面，在制备过程中，需要分别去除每一对LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。在本申请中，两个或多个靶点的嵌合抗原受体(CAR)在LoxP位点识别酶的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体，杀伤肿瘤细胞(如图4所示)。
在本申请中，术语“CD3ζ”通常是指来自分化簇3(CD3)ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，也写作CD3zeta。在一些实施方案中，CD3ζ可以作为CAR的胞内信号传导结构域,与4-1BB协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。例如，所述CD3ζ可以包含SEQ ID NO:73所示的核酸序列。例如，所述CD3ζ可以包含SEQ ID NO:82所示的核酸序列。
在本申请中，术语“特异性单链抗体(scFv)”通常是指通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。见，例如Bird等人，Science，242：423-426(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)。在一些实施方案中，scFv的重链可变区和轻链可变区可以来自CD19、CD20或CD22。
在本申请中，术语“CD19抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD19的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P15391。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD19。
在本申请中，术语“CD22抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD22的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P20273。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD22。
在本申请中，术语“CD20抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD20的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P11836。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD20。
在本申请中，术语“4-1BB”通常是指T细胞协同刺激分子。在一些实施方案中，4-1BB在CART结构中作为胞内信号共刺激分子，与CD3ζ协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。在一些实施方案中，所述4-1BB可以包含SEQ ID NO:72所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述4-1BB可以包含SEQ ID NO:81所示的核酸序列。
发明详述
核酸分子
一方面，本申请提供了一种表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点的核酸序列和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列(如图1和图2所示)。
在本申请中，所述核酸分子可以表达至少2种嵌合抗原受体，所述核酸分子可以包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和剪切肽序列。在某些实施方式中，所述剪切肽的序列位于所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
本申请所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点可以选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP3171。例如，所述的LoxP位点可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16。
本申请所述的核酸分子，其中所述的抗原结合结构域可以特异性结合肿瘤抗原。例如，所述的抗原结合结构域可以包含选自下组任一项肿瘤抗原或其组合：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFR VIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。例如，所述的抗原结合结构域可以包含选自下组任一项肿瘤抗原或其组合：CD19、CD22、CD20、GD2、B7H3、CD7、CD5、CD33、CD123、CLL1、ROR1和CD38。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:70所示的核酸序列。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:71所示的核酸序列。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO:74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO:21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO:23所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端可以与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端可以与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述启动子的核酸序列的5’端可以与所述HIV包装载体的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码启动子的核酸序列的3’端可以与所述编码引导肽的核酸序列的5’端连接。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列可以位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列可以位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的上游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码WPRE的核酸序列可以位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。例如，所述编码WPRE的核酸序列可以是如
SEQ ID NO:23所示的序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码骨架载体的核酸序列可以位于所述编码启动子的核酸序列的上游。例如，所述编码骨架载体的核酸序列可以是如SEQ ID NO:21所示的序列。
在本申请中，其中所述5’LTR序列可以位于核酸分子的5’端。
在本申请中，其中所述3’LTR序列可以位于核酸分子的3’端。
在本申请中，其中所述编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且可以位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的5’端或3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列的3’端或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列的3’端或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子可以表达2种嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含2对不同的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。在本申请中，可以通过使所述的核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触，分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，可以通过所述对应的LoxP位点识别酶分别接触识别上述编码LoxP位点1的核酸序列和上述编码LoxP位点2的核酸序列，分别去除两个LoxP位点1和两个LoxP位点2之间的序列，使得上述核酸分子重组成能够表达两个单一且完整的、分别携带第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的嵌合抗原受体结构的表达分子(如图3所示)。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第一抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：
SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第一抗原可以是GD2，靶向GD2的抗原结合结构域可包含轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向GD2的抗原结合结构域的轻链可变区的核酸序列可以如SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48所示；所述靶向GD2的抗原结合结构域的重链可变区的核酸序列可以如SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:53所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是CD20，靶向CD20的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD20的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；所述靶向CD20的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是B7H3，靶向B7H3的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向B7H3的抗原结合结构域的轻链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO:47所示；所述靶向B7H3的抗原结合结构域的重链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO:52所示。
例如，所述靶向B7H3的抗原结合结构域的轻链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO:54所示；所述靶向B7H3的抗原结合结构域的重链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO:55所示。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’
LTR。在本申请中，可以通过剪切肽序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，所述的第一抗原可以选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。例如，所述的第二抗原可以选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。
例如，所述的第一抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区；所述的第二抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68和SEQ ID NO:69。例如，所述核酸分子可以编码如本申请附图1中Ⅲ-5所示的结构。例如，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:83所示的核酸序列。例如，所述附图1中Ⅲ-5所示的结构可以包含SEQ ID NO:83所示的核酸序列。
例如，所述的第一抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区；所述的第二抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43。例如，所述核酸分子可以编码如本申请附图1中Ⅲ-6所示的结构。例如，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:84所示的核酸序列。例如，所述附图1中Ⅲ-6所示的结构可以包含SEQ ID NO:84所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点可以选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP3171。例如，所述的LoxP位点可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:1。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:70所示的核酸序列。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:71所示的核酸序列。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB。例如，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:72或SEQ IDNO:81所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ。例如，所述胞内信号传导域可以包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:82所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO:74所示。
在本申请中，所述的核酸分子中所述剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO:21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO:23所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，所述1对序列反向互补的LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、起始密码子ATG、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、终止密码子、终止密码子、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、终止密码子、终止密码子、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、PolyA序列、PolyA反向互补序列、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、启动子反向互补核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第一抗原可以是CD19，编码第一抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述的靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32和SEQ ID NO:33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第二抗原可以是CD22，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述的靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64和SEQ ID NO:65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO:74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO:21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO:23所示。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向CD19的嵌合抗原受体和靶向CD22的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向GD2的嵌合抗原受体和靶向B7H3的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以包含SEQ ID NO:75、76、83和84中任一项所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以表达3种嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含4对各不相同的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第一对所述LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第二对LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第三对所述LoxP位点之间可以包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第四对LoxP位点之间可以包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。在本申请中，可以通过使所述的核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触，分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，可以通过所述对应的LoxP位点识别酶分别接触识别上述编码LoxP位点1的核酸序列、上述编码LoxP位点2和上述编码LoxP位点3的核酸序列，分别去除两个LoxP位点1、两个LoxP位点2和两个上述编码LoxP位点3之间的序列，使得上述核酸分子重组成能够表达三个单一且完整的、分别携带第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的嵌合抗原受体结构的表达分子。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第一抗原可以是CD22，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64和SEQ ID NO:65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第二抗原可以是CD20，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。所述靶向CD20的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；所述靶向CD20的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第三抗原可以是CD19，编码第一抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:78。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO:74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO:21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO:22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO:23所示。
在本申请中，所述可以表达3种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向CD19的嵌合抗原受体、靶向CD22的嵌合抗原受体和靶向CD20的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达3种嵌合抗原受体的核酸分子可以包含SEQ ID NO:77所示的核酸序列。
质粒、宿主细胞和制备方法
另一方面，本申请提供了一种或多种质粒，其可以包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种质粒中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述质粒中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该质粒的标记基因。此外，所述质粒还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。例如，所述质粒可以是病毒质粒。
另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种质粒。在本申请中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或质粒。在本申请中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或质粒。例如，可将本申请所述的质粒引入所述宿主细胞中，例如T细胞，NK细胞，或者其他免疫细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。在本申请中，所述的细胞，其至少可以表达2种不同的嵌合抗原受体。
另一方面，本申请了提供了一种制备嵌合抗原受体的方法，其可以包括以下的步骤：
(1)提供一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列；
(2)使所述核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触；
(3)分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的方法，其中所述接触可以包括加入所述对应的LoxP位点识别酶。
在本申请中，所述的方法，其中所述接触可以包括表达编码所述对应的LoxP位点识别酶的核酸分子。
在本申请中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子可以位于载体上。
在本申请中，其中所述编码识别酶的核酸分子与步骤(1)所述的核酸分子可以位于不同的载体上。
在本申请中，所述的方法，其中步骤(1)所述的核酸分子可以包含所述编码识别酶的核酸分子。
在本申请中，所述的方法，其可以包含SEQ ID NO.75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
本申请还包括以下的实施方式(一)：
1.表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点的核酸序列和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。
2.根据实施方式1所述的核酸分子，其中所述LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
4.根据实施方式3所述的核酸分子，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFR VIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列。
6.根据实施方式5所述的核酸分子，其中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的核酸分子，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
8.根据实施方式7所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
9.根据实施方式7-8中任一项所述的核酸分子，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
11.根据实施方式10所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
12.根据实施方式10-11中任一项所述的核酸分子，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。
13.根据实施方式10-12中任一项所述的核酸分子，其中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
14.根据实施方式10-13中任一项所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
15.根据实施方式10-14中任一项所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
17.根据实施方式1-16中任一项所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
18.根据实施方式17所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体。
19.根据实施方式17-18中任一项所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的核酸分子，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的核酸分子，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的核酸分子，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
23.根据实施方式22所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
24.根据实施方式22-23中任一项所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
25.根据实施方式22-24中任一项所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的核酸分子，其中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
27.根据实施方式26中所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
28.根据实施方式26-27中任一项所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
29.根据实施方式26-28中任一项所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
30.根据实施方式1-29中任一项所述的核酸分子，其表达2种嵌合抗原受体。
31.根据实施方式30所述的核酸分子，其包含2对不同的LoxP位点。
32.根据实施方式31所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
33.根据实施方式31-32中任一项所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
34.根据实施方式1-33中任一项所述的核酸分子，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
35.根据实施方式34所述的核酸分子，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
36.根据实施方式1-29中任一项所述的核酸分子，其表达3种嵌合抗原受体。
37.根据实施方式36所述的核酸分子，其包含4对各不相同的LoxP位点。
38.根据实施方式37所述的核酸分子，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
39.根据实施方式37-38中任一项所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
40.根据实施方式37-39中任一项所述的核酸分子，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
41.根据实施方式37-40中任一项所述的核酸分子，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
42.根据实施方式1-41中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
43.质粒，其包含实施方式1-42中任一项所述的核酸分子。
44.根据实施方式43所述的质粒，其包括病毒质粒。
45.细胞，其包含实施方式1-42中任一项所述的核酸分子，和/或实施方式43-44中任一项所述的质粒。
46.根据实施方式45所述的细胞，其包括选自下组的细胞：T细胞和NK细胞。
47.根据实施方式45-46中任一项所述的细胞，其表达至少2种不同的嵌合抗原受体。
48.实施方式1-42中任一项所述的核酸分子、实施方式43-44中任一项所述的质粒和/或实施方式45-47中任一项所述的细胞在准备嵌合抗原受体中的应用。
49.一种制备嵌合抗原受体的方法，其包括以下的步骤：
(1)提供一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点和/或剪切肽序列，
每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，
其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，
其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列；
(2)使所述核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触；
(3)分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。
50.根据实施方式49所述的方法，其中所述接触包括加入所述对应的LoxP位点识别酶。
51.根据实施方式49中任一项所述的方法，其中所述接触包括表达编码所述对应的LoxP位点识别酶的核酸分子。
52.根据实施方式51所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子位于载体上。
53.根据实施方式52所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子与步骤(1)所述的核酸分子位于不同的载体上。
54.根据实施方式49-53中任一项所述的方法，其中步骤(1)所述的核酸分子包含所述编码识别酶的核酸分子。
55.根据实施方式49-54中任一项所述的方法，其中所述LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
56.根据实施方式49-55中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
57.根据实施方式56所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。
58.根据实施方式49-57中任一项所述的方法，其包含编码启动子的核酸序列。
59.根据实施方式58所述的方法，其中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
60.根据实施方式49-59中任一项所述的方法，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
61.根据实施方式60所述的方法，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
62.根据实施方式60-61中任一项所述的方法，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
63.根据实施方式49-62中任一项所述的方法，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
64.根据实施方式63所述的方法，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
65.根据实施方式63-64中任一项所述的方法，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
66.根据实施方式63-65中任一项所述的方法，其中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
67.根据实施方式63-66中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
68.根据实施方式63-67中任一项所述的方法，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
69.根据实施方式49-68中任一项所述的方法，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
70.根据实施方式49-69中任一项所述的方法，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
71.根据实施方式70所述的方法，其中所述骨架载体包括病毒载体。
72.根据实施方式70-71中任一项所述的方法，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
73.根据实施方式49-72中任一项所述的方法，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
74.根据实施方式49-73中任一项所述的方法，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
75.根据实施方式49-74中任一项所述的方法，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
76.根据实施方式75所述的方法，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
77.根据实施方式75-76中任一项所述的方法，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
78.根据实施方式75-77中任一项所述的方法，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
79.根据实施方式49-78中任一项所述的方法，其包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
80.根据实施方式79中所述的方法，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
81.根据实施方式79-80中任一项所述的方法，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
82.根据实施方式79-81中任一项所述的方法，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
83.根据实施方式49-82中任一项所述的方法，其表达2种嵌合抗原受体。
84.根据实施方式83所述的方法，其包含2对不同的LoxP位点。
85.根据实施方式84所述的方法，其中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
86.根据实施方式84-85中任一项所述的方法，其中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
87.根据实施方式49-86中任一项所述的方法，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
88.根据实施方式87所述的方法，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，其之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
89.根据实施方式49-82中任一项所述的方法，其表达3种嵌合抗原受体。
90.根据实施方式89所述的方法，其包含4对各不相同的LoxP位点。
91.根据实施方式90所述的方法，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
92.根据实施方式90-91中任一项所述的方法，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
93.根据实施方式90-92中任一项所述的方法，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
94.根据实施方式90-93中任一项所述的方法，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
95.根据实施方式49-94中任一项所述的方法，其包含SEQ ID NO：75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
本申请还包括以下的实施方式(二)：
1.表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1个剪切肽序列，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体。
2.根据实施方式1所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
3.根据实施方式2所述的核酸分子，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFR VIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。
4.根据实施方式1所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列。
5.根据实施方式4所述的核酸分子，其中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
6.根据实施方式1所述的核酸分子，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
7.根据实施方式6所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
8.根据实施方式6-7中任一项所述的核酸分子，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
9.根据实施方式1所述的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
10.根据实施方式9所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
11.根据实施方式9-10中任一项所述的核酸分子，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
12.根据实施方式9-10中任一项所述的核酸分子，其中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
13.根据实施方式9-10中任一项所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
14.根据实施方式9-10中任一项所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
15.根据实施方式1所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
16.根据实施方式1所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
17.根据实施方式16所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体或者HIV包装载体。
18.根据实施方式1所述的核酸分子，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
19.根据实施方式1所述的核酸分子，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
20.根据实施方式1所述的核酸分子，其中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
21.根据实施方式20所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
22.根据实施方式20所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
23.根据实施方式1所述的核酸分子，其表达2种嵌合抗原受体。
24.根据实施方式1所述的核酸分子，其表达3种嵌合抗原受体。
25.根据实施方式1所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：83-84中任一项所示的核苷酸序列。
26.质粒，其包含实施方式1-25中任一项所述的核酸分子。
27.根据实施方式26所述的质粒，其包括病毒质粒。
28.细胞，其包含实施方式1-25中任一项所述的核酸分子，和/或实施方式26-27中任一项所述的质粒。
29.根据实施方式28所述的细胞，其包括选自下组的细胞：T细胞和NK细胞。
30.根据实施方式28-29中任一项所述的细胞，其表达至少2种不同的嵌合抗原受体。
31.实施方式1-25中任一项所述的核酸分子、实施方式26-27中任一项所述的质粒和/或实施方式28-30中任一项所述的细胞在准备嵌合抗原受体中的应用。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的核酸分子、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1构建嵌合抗原受体基因工程载体
1.首先，在表达载体的限制性核酸内切酶位点NotI和HindIII之间插入RRE序列，在元件EF1a启动子和CD8a之间插入cPPT序列，在CD3ζ和LoxP之间插入WPRE，在每个scFv片段5’端添加蛋白标签(tag)。
2.除了一般的表达载体组件，以CD19和CD22为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的元件组成如下：
I-1：引导肽序列CD8a、LoxP位点1、CD19-scFv序列、LoxP位点2、P2A序列、CRE蛋白序列、T2A序列、LoxP位点1、CD22-scFv序列、LoxP位点2、铰链区、跨膜区、共刺激分子4-1BB、效应器分子CD3ζ，所述元件组成的全部序列如SEQ ID NO：70所示。
其中，引导肽序列CD8a(如SEQ ID NO：11所示)、LoxP位点1(如SEQ ID NO：13所示)、CD19-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：30所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：40)、LoxP位点2(如SEQ ID NO：14所示)、P2A序列(如SEQ ID NO：17所示)、CRE蛋白序列(如SEQ IDNO：74所示)、T2A序列(如SEQ ID NO：18所示)、CD22-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：65所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：69)、铰链区(如SEQ ID NO：70所示)、跨膜区(如SEQ ID NO：71所示)、共刺激分子4-1BB(如SEQ ID NO：72所示)、效应器分子CD3ζ(如SEQ ID NO：73所示)由基因合成的方法得到。
除了一般的表达载体组件，以GD2和B7H3为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的元件组成，简言之，将I-1中的CD19-scFv和/或CD22-scFv序列替换为GD2-scFv(scFv中VL如SEQ ID NO：48所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：53)和/或B7H3-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：47所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：52)即可。
除了一般的表达载体组件，以CD19、CD22和CD20为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的序列组成如下：
II-1：引导肽序列CD8a、LoxP位点1、LoxP位点3、CD22-scFv序列、LoxP位点2、P2A序列、CRE蛋白序列、T2A序列、LoxP位点3、CD20-scFv序列、LoxP位点4、LoxP位点1、CD19-scFv、LoxP位点2、LoxP位点4、铰链区、跨膜区、共刺激分子4-1BB、效应器分子CD3ζ，所述元件组成的全部序列如SEQ ID NO：72所示。
其中，引导肽序列CD8a(如SEQ ID NO：11所示)、LoxP位点1(如SEQ ID NO：13所示)、LoxP位点3(如SEQ ID NO：15所示)、CD22-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：65所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：69)、LoxP位点2(如SEQ ID NO：14所示)、P2A序列(如SEQ ID NO：17所示)、CRE蛋白序列(如SEQ ID NO：74所示)、T2A序列(如SEQ ID NO：18所示)、CD20-scFv序列(如SEQ ID NO：56-61所示)、LoxP位点4(如SEQ ID NO：16所示)、CD19-scFv(scFv中VL如SEQ ID NO：30所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：40)、铰链区(如SEQ ID NO：70所示)、跨膜区(如SEQ ID NO：71所示)、共刺激分子4-1BB(如SEQ ID NO：72所示)、效应器分子CD3ζ(如SEQ ID NO：73所示)由基因合成的方法得到。
3.通过设计合适的酶切位点，用所选的限制性核酸内切酶BamH1和Spe1分别双酶切I-1、II-1、表达载体，将酶切后的I-1和表达载体相连，酶切后的II-1和表达载体相连，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，阳性克隆接种后过夜。
4.细菌抽提质粒。
5.酶切鉴定和送测序，最后表达载体与I-1酶切连接后得到的是嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3(如图5所示)(对应核酸序列SEQ IDNO:75)，表达载体酶切连接后得到嵌合抗原受体基因工程载体GD2-B7H3 duoCART(如图6所示)，表达载体与II-1酶切连接后得到的是嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22-CD20triCART(如图7所示)。Ⅲ-5结构对应的嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22duoCART(Ⅲ-5)(如图8A所示)(对应核酸序列SEQ ID NO:83)；Ⅲ-6结构对应的嵌合抗原受体基因工程载体CD22-CD19 duoCART(Ⅲ-6)(如图8B所示)(对应核酸序列SEQ ID NO:84)。
实施例2制备带有嵌合抗原受体基因工程载体的病毒
1.分别将嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3、GD2-B7H3 duoCART、CD19-CD22-CD20 triCART和病毒包装质粒按照摩尔比1:1:1进行转染，质量总量6ug/10cm Dish，慢病毒转染293T细胞72h和96h后收集培养上清并进行病毒浓缩。
2.通过实时定量PCR方法，按慢病毒的1ul:2ul:4ul:8ul:16ul:32ul的浓度梯度转染1x106个293T细胞进行病毒滴度的确定，最后分别得到带有嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22duoCART New19CRE22-CAR v3、GD2-B7H3 duoCART、CD19-CD22-CD20 triCART的病毒。病毒的MOI值分别为：1)CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3：2～3；2)GD2-B7H3duoCART：2～3；3)CD19-CD22-CD20 triCART：5～10。
实施例3病毒转染免疫细胞
1.收集人外周血T淋巴细胞，进行上述病毒的转染，之后采用荧光标记抗体通过流式细胞检测技术对转染效率进行检测。其中，CD19-CART采用的荧光标记抗体为APC，CD22-CART采用的荧光标记抗体为FITC，CD20-CART采用的荧光标记为PE。
2.嵌合抗原受体基因工程载体制备的病毒，经体外转染后一般转染效率在20％以上，绝大部分在40～70％之间，如图8所示。图8中，采用单靶点和双靶点慢病毒载体包装的病毒对人T淋巴细胞进行了转染，图中A为单靶点CD19-CART的转染效率；图中B为单靶点CD22-CART的转染效率；图中C为双靶点CD19/CD22-CART中CD19-CART的转染效率；图中D为双靶点CD19/CD22-CART中CD22-CART的转染效率；图中E为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD19-CART的转染效率；图中F为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD22-CART的转染效率的转染效率；图中G为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD20-CART的转染效率的转染效率。从图中可以看出，双靶点和三靶点来源病毒和单靶点病毒相比，在转染效率方面无显著差异。
3.转染后，得到的CART细胞分别为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART(对应CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3)和tri-CD19-CD22-CD20-CART。
实施例4检测CART细胞对靶细胞的杀伤作用
1.以Single-CD19-CART：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1:5，Single-CD22-CART：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1：5，dual-CD19-CD22-CART细胞：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1：5的比例，将三种CART细胞分别与CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株混合和共孵育，作为试验组；同时采用无关序列制备载体包装获得的病毒转染后的T淋巴细胞作为对照组。
2.在孵育0小时、24小时和48小时后通过流式细胞技术进行体外杀伤检测，比较不同孵育时间下，Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞对白血病细胞-REH的杀伤作用，并与无关序列制备载体包装获得的病毒转染后的T淋巴细胞进行比较。三组细胞对白血病细胞-REH的杀伤作用的结果如图10所示。其中第一行依次为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞与白血病细胞-REH共孵育0小时的图，可以看到共孵育体系中白血病细胞的比例分别为74.8％(对照组)、72.9％(Single-CD19-CART组)、80.0％(Single-CD22-CART组)和78.9％(dual-CD19-CD22-CART组)。第二行依次为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞与白血病细胞-REH共孵育24小时的图，可以看到共孵育体系中白血病细胞的比例分别为64.9％(对照组)、2.14％(Single-CD19-CART组)、16.2％(Single-CD22-CART组)和10.1％(dual-CD19-CD22-CART组)。可以看出，与对照组相比，dual-CD19-CD22-CART细胞在24小时共孵育后，对靶细胞的杀伤作用大大增强。
实施例5CART细胞的获得及扩增
1.通过采集人外周血0.5～2ml/Kg，磁珠分选获得CD3阳性T淋巴细胞或者CD56阳性NK细胞。
2.加入CD3/CD28免疫磁珠进行刺激激活和病毒转染，继续给予CD3/CD28免疫磁珠、白介素-7和白介素-15进行体外扩增，一般7～8天可以扩增100倍以上。
3.根据体内负荷进行调整，dual-CD19-CD22-CART、tri-CD19-CD22-CD20-CART、dual-GD2-B7H3-CART细胞数量分别达到2×105/Kg～2×107/Kg经洗涤回输人体。
实施例6dual-CD19-CD22-CART治疗骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者，经dual-CD19-CD22-CART输注前后微量残留病检测结果，如图11所示，图中A为dual-CD19-CD22-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞高表达CD66c和CD123，低表达CD81)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C和D为dual-CD19-CD22-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病细胞消失9个月，仍然处于完全缓解状态。
实施例7tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗多次复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例多次复发的急性淋巴细胞白血病患者，经tri-CD19-CD22-CD20-CART输注前后微量残留病检测结果，如图12所示，图中A为tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞低表达CD45)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C、D和E为tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病持续消失。
实施例8dual-CD19-CD22-CART治疗骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者，经dual-CD19-CD22-CART输注前后微量残留病检测结果，如图13所示，图中A为dual-CD19-CD22-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞低表达CD38和CD81)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C、D、E和F为dual-CD19-CD22-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病细胞消失14个月，仍然处于完全缓解状态。
实施例9tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗伯基特淋巴瘤患者
一例伯基特淋巴瘤患者接受tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗后的情况，如图14所示。图A为治疗前后肿瘤变化情况，可见治疗前患者的膀胱(图中标记为a)和直肠(图中标记为b)间一个6.6cm大小的肿瘤，在治疗后完全消失；图B为连续观察一年的肿瘤变化情况，在1个多月的时候肿瘤基本上消失，没有再复发；图C为治疗中患者C反应蛋白、细胞因子(主要是白介素-6)以及乳酸脱氢酶等的变化情况。
实施例10dual-CD19-CD22-CART治疗急性淋巴细胞睾丸复发患者
两例急性淋巴细胞睾丸复发患者的dual-CD19-CD22-CART治疗情况，如图15所示，图中上下两列分别为两例急性淋巴细胞睾丸复发患者接受dual-CD19-CD22-CART治疗的情况，可见在第0天注射后，患者白血病浸润的睾丸逐渐缩小到正常大小。并经病理活检，dual-CD19-CD22-CART治疗后未见到白血病细胞。
实施例11dual-GD2-B7H3-CART治疗神经母细胞瘤患者
一例神经母细胞瘤患者接受dual-GD2-B7H3-CART治疗后的情况，如图16所示，图中A是治疗前后骨髓涂片低倍镜结果，可见治疗18天后骨髓中肿瘤细胞明显减少；B是治疗前后骨髓涂片高倍镜结果，可见治疗18天后骨髓中肿瘤细胞明显减少；C和D为治疗前后流式细胞检测结果，骨髓中的肿瘤细胞从治疗前的60％降低到1.2％。
实施例12临床治疗患者的疾病缓解率、无事件生存率和总生存率
1.从2017年3月到2019年8月，先后有47例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者接受CD19单靶点CART治疗，平均观察时间为23.8月，最长观察时间为55.5个月。接受Single-CD19-CART治疗后微量残留病转阴率为97.9％(47/48)，29例患者原发病复发，1例患者发生第二肿瘤(Single-CD19-CART治疗前为MLL-AF4阳性混合系白血病复发)，疾病的复发率38.2％(21/55)。29例原发病复发患者中，CD19阳性复发者19例，CD19阴性复发者10例，总2年的无事件生存率为34.0％，3年的总生存率为59.6％，见图17A所示。
2.从2019年9月到2020年10月，先后有81例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病患者接受CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3治疗，平均观察时间为16.4个月，最长观察时间为25.9个月。1例患者发生CRES死亡，没有做原发病评估。其他接受CART治疗的患者，微量残留病转阴率为98.8％(80/81)，22例患者原发病复发，其中1例患者复发后白血病表型未知，1例患者CD19-/CD22-复发，4例患者CD19-/CD22+复发，14例患者CD19+/CD22+复发。疾病的复发率为27.2％，且主要为CD19+的复发。总的1年的无事件生存率为71.4％，1年的总生存率为86.3％，见图17B所示。分析表明，CD19-CD22双靶点的CART治疗疗效远高于单一CD19靶点，P值具有显著的统计学意义。
3.从2020年11月到2021年11月，先后有132例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病患者接受CD19-CD22 duoCART(Ⅲ-5)和CD22-CD19 duoCART(Ⅲ-6)的CART治疗，平均观察时间为5.3个月，最长观察时间为11.6个月。无患者发生CRS或者CRES死亡，微量残留病转阴率为100.0％(132/132)，8例患者原发病复发，其中5例患者CD19-/CD22+复发，3例患者CD19+/CD22+复发。疾病的复发率为6.1％，CD19+复发率大大降低。6个月的无事件生存率为89.7％，6个月的总生存率为96.7％，见图17C所示。分析表明，CD19-CD22duoCART(Ⅲ-5)和CD22-CD19 duoCART(Ⅲ-6)的CART治疗疗效进一步优于CD19-CD22duoCART New19CRE22-CAR v3，P值具有显著的统计学意义。
分析针对CD19单靶点和针对CD19和CD22的两个双靶点的构建而言，CD19-CD22duoCART(Ⅲ-5)和CD22-CD19 duoCART(Ⅲ-6)(两者主要是CD19和CD22的ScFv前后顺序的问题，体内外均无无显著差异)的疗效最好，见图17D所示。
Claims (10)
1.表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1个剪切肽序列，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自下组：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFR VIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列，所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列，所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接，所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域，编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB，所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19，所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、
CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS，所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体或者HIV包装载体。
10.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
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