CN115380112B - 两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用 - Google Patents

两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。所述嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞对靶细胞产生更为强劲的杀伤力。

Description

两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用
技术领域
本申请属于细胞治疗领域，具体的涉及一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor-engineered T celltherapy，CART)是近些年发展起来的一种行之有效的过继性细胞免疫治疗，该方法通过对自体来源的T细胞进行基因工程改造，使效应性T淋巴细胞产生针对肿瘤细胞的靶向细胞毒作用，以达到清除体内肿瘤细胞的目的。
CART治疗对于复发难治的急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的疗效取得了显著的临床疗效，并得到了业界公认。CART的靶向性取决于通过基因工程技术对T细胞进行的改造方式，使之表达可以识别自身肿瘤细胞相关抗原(Tumor associated antigen，TAA)的特异性单链抗体(scFv)，后者由TAA特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成，VL和VH之间由柔软的铰链区组成。除了在T细胞表面表达针对肿瘤细胞的特异性单链抗体外，在T细胞内同时表达可协同激活T细胞的共刺激分子，如CD28、4-1BB以及OX4等，从而一方面依靠特异性单链抗体识别肿瘤细胞，另一方面通过上述共刺激分子与CD3ζ协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。
国内外研究发现，通过CD19和CD22的CART联合或者序贯细胞治疗，有助于降低可能的细胞因子风暴水平，进一步提高疾病的远期疗效，也有助于对一次治疗失败的患者提供再次治疗机会。为进一步提高CART治疗的疗效，通过联合两个或多个不同靶点构建CART细胞，有助于治疗肿瘤。
发明内容
本申请提供了一种通过两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用。本申请所述的两个或多个靶点联合治疗人类肿瘤等疾病的嵌合抗原受体基因工程载体、相关免疫细胞及其应用可以具备选自下组的至少一个有益效果：1)能够对靶细胞产生更为强劲的杀伤力；2)降低可能的抗原逃逸引起的疾病复发风险；3)能够使各独立嵌合抗原受体蛋白的表达水平接近1∶1；4)能够在很大程度上提高病毒载体与人类基因组的重组效率，获得高转染效率的免疫细胞；5)能够显著提高临床疗效。
一方面，本申请提供了一种表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点的核酸序列和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFRVIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的核酸分子中所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其表达2种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含2对不同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其表达3种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含4对各不相同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：77中所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了一种质粒，其包含所述的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的质粒，其包括病毒质粒。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸分子，和/或所述的质粒。
在某些实施方式中，所述的细胞，其包括选自下组的细胞：T细胞和NK细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞，其表达至少2中不同的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的核酸分子、所述的质粒和/或所述的细胞在准备嵌合抗原受体中的应用。
另一方面，本申请提供了一种制备嵌合抗原受体的方法，其包括以下的步骤：
(1)提供一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列，以及至少1对的LoxP位点和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列；
(2)使所述核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触；
(3)分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述接触包括加入所述对应的LoxP位点识别酶。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述接触包括表达编码所述对应的LoxP位点识别酶的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子位于载体上。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子与步骤(1)所述的核酸分子位于不同的载体上。
在某些实施方式中，所述的方法中步骤(1)所述的核酸分子包含所述编码识别酶的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法中所述LoxP位点选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP 3171。
在某些实施方式中，所述的方法中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码启动子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法中所述启动子选自下组：EF1α、CMV、MSCV和UbC。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含至少一个编码引导肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述引导肽包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的方法，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的方法中所述铰链区包含源自选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在某些实施方式中，所述的方法中所述跨膜区包含源自选自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。
在某些实施方式中，所述的方法中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。
在某些实施方式中，所述的方法中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述骨架载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶选自下组：CRE和Brec1。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述的方法中编码所述识别酶的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在某些实施方式中，所述剪切肽选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法中所述编码剪切肽的核酸序列位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在某些实施方式中，所述的方法，其表达2种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含2对不同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法中第一对所述LoxP位点之间包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法中第二对所述LoxP位点之间包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，其之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其表达3种嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含4对各不相同的LoxP位点。
在某些实施方式中，所述的方法，其中所述第一对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第二对所述LoxP位点之间包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第三对所述LoxP位点之间包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其中第四对所述LoxP位点之间包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法，其包含SEQ ID NO：75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-B显示的是本申请所述嵌合抗原受体基因工程载体(I-1～III-6)的结构示意图。
图2显示的是本申请所述嵌合抗原受体基因工程载体(IV-1～IV-9)的结构示意图。
图3显示的是本申请所述嵌合抗原受体结构在CRE的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体结构示意图。
图4显示的是本申请所述嵌合抗原受体结构在CRE的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体结构杀伤靶细胞示意图。
图5显示的是本申请所述CD19/CD22双靶向载体结构图。
图6显示的是本申请所述GD2/B7H3双靶向载体结构图。
图7显示的是本申请所述CD19/CD22/CD20三靶向载体结构图。
图8A显示的是本申请所述CD19/CD22双靶向载体的构建示意图；图8B显示的是本申请所述CD22/CD19双靶向载体的构建示意图。
图9A-G显示的是本申请所述单靶点和双靶点慢病毒载体包装病毒对人T淋巴细胞的转染。
图10显示的是本申请所述CD19和CD22双靶向特异性CART细胞的体外细胞杀伤实验。
图11显示的是本申请所述一例骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22双靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图12显示的是本申请所述一例多次复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22/CD20三靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图13显示的是本申请所述一例骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者，经CD19/CD22双靶点CART输注前后微量残留病(MRD)检测结果。
图14显示的是本申请所述一例伯基特淋巴瘤患者接受CD19/CD22/CD20三靶点CART后的治疗情况。
图15显示的是本申请所述两例急性淋巴细胞巴细胞睾丸复发患者的CD19/CD22双靶点CART治疗情况。
图16显示的是本申请所述一例神经母细胞瘤患者接受了基于GD2/B7H3的双靶点CART治疗结果。
图17显示的是本申请所述入组患者的无复发生存率(Relapse-free survival，RFS)和总生存率(Overall survival，OS)；图17A显示的是单一靶点CD19-CART的治疗疗效；图17B显示的是双靶点CD19/CD22-CART的治疗疗效；图17C显示的是双靶点CD19/CD22-CART的治疗疗效；图17D显示的是不同构建体的临床疗效比较。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子”通常是指能够表达包含至少两个细胞外抗原结合结构域的重组多肽构建体的重组核酸序列。在一些实施方案中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含至少一个编码第一抗原结合结构域的核酸序列，编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点的核酸序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中第一抗原结合结构域和与第一抗原结合结构域不同的第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。一方面，抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD19、CD22和CD20。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含启动子核酸序列和引导肽核酸序列。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含非抗原结合功能的结构域的核酸序列，其中所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAP)的核酸分子包含共刺激结构域，其中共刺激结构域可以是4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含胞内信号传导结构域，其中胞内信号传导结构域可以是CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。一方面，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子包含剪切肽，其中剪切肽可以是P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。
在本申请中，术语“一种制备嵌合抗原受体的方法”通常是指两个或多个靶点的嵌合抗原受体(CAR)在LoxP位点识别酶的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体的方法。一方面，这一方法需要一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点，每一对LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中第一抗原结合结构域和与第一抗原结合结构域不同的第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列。一方面，核酸分子需要与对应的LoxP位点识别酶接触。一方面，在制备过程中，需要分别去除每一对LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。在本申请中，两个或多个靶点的嵌合抗原受体(CAR)在LoxP位点识别酶的作用下被重组成两个或者多个单一完整的嵌合抗原受体，杀伤肿瘤细胞(如图4所示)。
在本申请中，术语“CD3ζ”通常是指来自分化簇3(CD3)ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，也写作CD3zeta。在一些实施方案中，CD3ζ可以作为CAR的胞内信号传导结构域，与4-1BB协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。例如，所述CD3ζ可以包含SEQ ID NO：73所示的核酸序列。例如，所述CD3ζ可以包含SEQ ID NO：82所示的核酸序列。
在本申请中，术语“特异性单链抗体(scFv)”通常是指通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。见，例如Bird等人，Science，242：423-426(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)。在一些实施方案中，scFv的重链可变区和轻链可变区可以来自CD19、CD20或CD22。
在本申请中，术语“CD19抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD19的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P15391。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD19。
在本申请中，术语“CD22抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD22的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P20273。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD22。
在本申请中，术语“CD20抗原”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD20的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P11836。本申请中，表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子的抗原结合结构域靶向的抗原可以是CD20。
在本申请中，术语“4-1BB”通常是指T细胞协同刺激分子。在一些实施方案中，4-1BB在CART结构中作为胞内信号共刺激分子，与CD3ζ协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。在一些实施方案中，所述4-1BB可以包含SEQ ID NO：72所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述4-1BB可以包含SEQ ID NO：81所示的核酸序列。
发明详述
核酸分子
一方面，本申请提供了一种表达至少2种嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点的核酸序列和/或剪切肽序列，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列(如图1和图2所示)。
在本申请中，所述核酸分子可以表达至少2种嵌合抗原受体，所述核酸分子可以包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和剪切肽序列。在某些实施方式中，所述剪切肽的序列位于所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
本申请所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点可以选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP3171。例如，所述的LoxP位点可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16。
本申请所述的核酸分子，其中所述的抗原结合结构域可以特异性结合肿瘤抗原。例如，所述的抗原结合结构域可以包含选自下组任一项肿瘤抗原或其组合：A33、B7H3、BCMA、CA125、CD1、CD10、CD102、CD11a、CD11b、CD123、CD13、CD133、CD134、CD137、CD138、CD14、CD15、CD19、CD2、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD3、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD5、CD56、CD58、CD65、CD66c、CD7、CD70、CD73、CD74、CD8、CD80、CD81、CD86、CD9、CD94、CD97、CD99、CEA、CEACAM6、CLL1、CS1、DLL1、DLL3、EGFR、EGFRVIII、ERBB2、FGF19、GD2、GD3、HER3、IL3Ra、NCAM、NG2、NKG2A、NTBA、PD-1、PDL-1、PSGL1、PSMA、ROR1和VEGF。例如，所述的抗原结合结构域可以包含选自下组任一项肿瘤抗原或其组合：CD19、CD22、CD20、GD2、B7H3、CD7、CD5、CD33、CD123、CLL1、ROR1和CD38。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：70所示的核酸序列。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO：71所示的核酸序列。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO：80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO：74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO：21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO：23所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码引导肽的核酸序列的5’端可以与所述编码启动子的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码引导肽的核酸序列的3’端可以与编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5’端连接。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述启动子的核酸序列的5’端可以与所述HIV包装载体的核酸序列的3’端连接，或者，所述编码启动子的核酸序列的3’端可以与所述编码引导肽的核酸序列的5’端连接。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列可以位于编码所述抗原结合结构域的核酸序列的下游，或者，可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列可以位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的上游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码WPRE的核酸序列可以位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。例如，所述编码WPRE的核酸序列可以是如SEQID NO：23所示的序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码骨架载体的核酸序列可以位于所述编码启动子的核酸序列的上游。例如，所述编码骨架载体的核酸序列可以是如SEQ ID NO：21所示的序列。
在本申请中，其中所述5’LTR序列可以位于核酸分子的5’端。
在本申请中，其中所述3’LTR序列可以位于核酸分子的3’端。
在本申请中，其中所述编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列之间。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码第一抗原结合结构域的核酸序列的上游，且可以位于编码所述启动子的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中编码所述识别酶的核酸序列可以位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码识别酶的核酸序列的3’端和/或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列的3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码剪切肽的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码引导肽的核酸序列的5’端或3’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列的3’端或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述编码LoxP位点的核酸序列可以位于所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列的3’端或5’端。
在本申请中，所述的核酸分子可以表达2种嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含2对不同的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。在本申请中，可以通过使所述的核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触，分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，可以通过所述对应的LoxP位点识别酶分别接触识别上述编码LoxP位点1的核酸序列和上述编码LoxP位点2的核酸序列，分别去除两个LoxP位点1和两个LoxP位点2之间的序列，使得上述核酸分子重组成能够表达两个单一且完整的、分别携带第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的嵌合抗原受体结构的表达分子(如图3所示)。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第一抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33：所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第一对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第一抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第一抗原可以是GD2，靶向GD2的抗原结合结构域可包含轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向GD2的抗原结合结构域的轻链可变区的核酸序列可以如SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48所示；所述靶向GD2的抗原结合结构域的重链可变区的核酸序列可以如SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：53所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是CD20，靶向CD20的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD20的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58；所述靶向CD20的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第二对所述LoxP位点之间可以包含所述编码第二抗原结合结构域的核酸序列。例如，所述的第二抗原可以是B7H3，靶向B7H3的抗原结合结构域可以包括轻链可变区和重链可变区。
例如，所述靶向B7H3的抗原结合结构域的轻链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO：47所示；所述靶向B7H3的抗原结合结构域的重链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO：52所示。
例如，所述靶向B7H3的抗原结合结构域的轻链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO：54所示；所述靶向B7H3的抗原结合结构域的重链可变区核酸序列可以如SEQ ID NO：55所示。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。在本申请中，可以通过剪切肽序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，所述的第一抗原可以选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。例如，所述的第二抗原可以选自下组：CD19、CD22、CD20、GD2和B7H3。
例如，所述的第一抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区；所述的第二抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68和SEQ ID NO：69。例如，所述核酸分子可以编码如本申请附图1中III-5所示的结构。例如，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：83所示的核酸序列。例如，所述附图1中III-5所示的结构可以包含SEQ ID NO：83所示的核酸序列。
例如，所述的第一抗原可以是CD22，靶向CD22的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区；所述的第二抗原可以是CD19，靶向CD19的抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。例如，所述核酸分子可以编码如本申请附图1中III-6所示的结构。例如，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：84所示的核酸序列。例如，所述附图1中III-6所示的结构可以包含SEQ ID NO：84所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述的LoxP位点可以选自下组：野生型LoxP、LoxP2722、LoxP511、LoxP5271和LoxP3171。例如，所述的LoxP位点可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：1。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：70所示的核酸序列。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO：71所示的核酸序列。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO：80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB。例如，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO：72或SEQ IDNO：81所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ。例如，所述胞内信号传导域可以包含SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：82所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO：74所示。
在本申请中，所述的核酸分子中所述剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO：21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO：23所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含至少1对序列反向互补的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述1对序列反向互补的LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列；或者，所述1对序列反向互补的LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列的反向互补序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、起始密码子ATG、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、终止密码子、终止密码子、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、终止密码子、终止密码子、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、编码LoxP位点1的反向互补核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、PolyA序列、PolyA反向互补序列、编码非抗原结合功能的结构域的反向互补核酸序列、编码第二抗原结合结构域的反向互补核酸序列、编码引导肽的反向互补核酸序列、启动子反向互补核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第一抗原可以是CD19，编码第一抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述的靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQID NO：32和SEQ ID NO：33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第二抗原可以是CD22，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述的靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQID NO：64和SEQ ID NO：65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：78。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO 71或SEQ ID NO：80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO：74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO：21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO：23所示。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向CD19的嵌合抗原受体和靶向CD22的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向GD2的嵌合抗原受体和靶向B7H3的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达2种嵌合抗原受体的核酸分子可以包含SEQ ID NO：75、76、83和84中任一项所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以表达3种嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含4对各不相同的LoxP位点。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第一对所述LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列和编码第二抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第二对LoxP位点之间可以包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中第三对所述LoxP位点之间可以包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列和编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述第四对LoxP位点之间可以包含编码第三抗原结合结构域的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码识别酶的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。
在本申请中，所述的核酸分子从5’端到3’端可以包括5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点3的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码LoxP位点1的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第三抗原结合结构域的核酸序列、编码LoxP位点2的核酸序列、编码LoxP位点4的核酸序列、编码非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、3’LTR。在本申请中，可以通过使所述的核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触，分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。例如，可以通过所述对应的LoxP位点识别酶分别接触识别上述编码LoxP位点1的核酸序列、上述编码LoxP位点2和上述编码LoxP位点3的核酸序列，分别去除两个LoxP位点1、两个LoxP位点2和两个上述编码LoxP位点3之间的序列，使得上述核酸分子重组成能够表达三个单一且完整的、分别携带第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的嵌合抗原受体结构的表达分子。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第一抗原可以是CD22，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD22的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：65；所述靶向CD22的抗原结合结构域的重链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第二抗原可以是CD20，编码第二抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。所述靶向CD20的抗原结合结构域的轻链可变区可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58；所述靶向CD20的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61。
例如，所述的核酸分子，其中所述的第三抗原可以是CD19，编码第一抗原结构域的核酸序列可以包括轻链可变区和重链可变区。例如，所述靶向CD19的抗原结合结构域的轻链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32和SEQ ID NO：33；所述靶向CD19的抗原结合结构域的重链可变区可包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含启动子的核酸序列。例如，所述启动子可以是EF1α、CMV、MSCV和UbC。例如，所述的启动子序列可以包含如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子可以包含至少一个编码引导肽的核酸序列。例如，所述的引导肽序列可以包含选自下组任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：78。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述引导肽可以包括源自选自下组蛋白的引导肽部分：CD8、CD33和CD45。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码嵌合抗原受体的非抗原结合功能的结构域的核酸序列。例如，所述非抗原结合功能的结构域可以包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述铰链区可以包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述跨膜区可以包含源自下组蛋白的跨膜区：CD8、CD28和CD19。例如，所述跨膜区可以包含如SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：80所示的核酸序列。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域：4-1BB、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1和ICOS。例如，所述的共刺激结构域可以来自4-1BB，核酸序列如SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：81所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcεRIγ和ZAP70。例如，所述的胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ，核酸序列如SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：82所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列，其中所述识别酶可以选自下组：CRE和Brec1。例如，所述的编码特异性识别LoxP位点的识别酶的核酸序列可以来自CRE，序列如SEQ ID NO：74所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括至少一个编码剪切肽的核酸序列，其中剪切肽可以选自下组：P2A、T2A、F2A、E2A、BmCPV2A和BmIFV2A。例如，剪切肽可以来自P2A和T2A，序列可以包含选自下组任一项所示的核酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括编码骨架载体的核酸序列。例如，其中所述的骨架载体可以包括HIV包装载体，序列如SEQ ID NO：21所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括5’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包括3’LTR序列，序列如SEQ ID NO：22所示。
在本申请中，所述的核酸分子，其可以包含编码WPRE的核酸序列，序列如SEQ IDNO：23所示。
在本申请中，所述可以表达3种嵌合抗原受体的核酸分子可以表达靶向CD19的嵌合抗原受体、靶向CD22的嵌合抗原受体和靶向CD20的嵌合抗原受体。
在本申请中，所述可以表达3种嵌合抗原受体的核酸分子可以包含SEQ ID NO：77所示的核酸序列。
质粒、宿主细胞和制备方法
另一方面，本申请提供了一种或多种质粒，其可以包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种质粒中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述质粒中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该质粒的标记基因。此外，所述质粒还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。例如，所述质粒可以是病毒质粒。
另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种质粒。在本申请中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或质粒。在本申请中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或质粒。例如，可将本申请所述的质粒引入所述宿主细胞中，例如T细胞，NK细胞，或者其他免疫细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。在本申请中，所述的细胞，其至少可以表达2种不同的嵌合抗原受体。
另一方面，本申请了提供了一种制备嵌合抗原受体的方法，其可以包括以下的步骤：
(1)提供一种核酸分子，其包括编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列和至少1对LoxP位点，每一对所述LoxP位点可以被对应的LoxP位点识别酶识别，其中所述第一抗原结合结构域和与所述第一抗原结合结构域不同的所述第二抗原结合结构域分别参与组成第一嵌合抗原受体和与第二嵌合抗原受体，其中至少1对所述LoxP位点之间包含至少一个编码所述抗原结合结构域的核酸序列；
(2)使所述核酸分子与所述对应的LoxP位点识别酶接触；
(3)分别去除每一对所述LoxP位点之间的序列，形成仅包含1个编码所述抗原结合结构域核酸分子的表达分子，其可以表达嵌合抗原受体。
在本申请中，所述的方法，其中所述接触可以包括加入所述对应的LoxP位点识别酶。
在本申请中，所述的方法，其中所述接触可以包括表达编码所述对应的LoxP位点识别酶的核酸分子。
在本申请中，所述的方法，其中所述编码识别酶的核酸分子可以位于载体上。
在本申请中，其中所述编码识别酶的核酸分子与步骤(1)所述的核酸分子可以位于不同的载体上。
在本申请中，所述的方法，其中步骤(1)所述的核酸分子可以包含所述编码识别酶的核酸分子。
在本申请中，所述的方法，其可以包含SEQ ID NO.75-77和83-84中任一项所示的核苷酸序列。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的核酸分子、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1构建嵌合抗原受体基因工程载体
1.首先，在表达载体的限制性核酸内切酶位点NotI和HindIII之间插入RRE序列，在元件EF1a启动子和CD8a之间插入cPPT序列，在CD3ζ和LoxP之间插入WPRE，在每个scFv片段5’端添加蛋白标签(tag)。
2.除了一般的表达载体组件，以CD19和CD22为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的元件组成如下：
I-1：引导肽序列CD8a、LoxP位点1、CD19-scFv序列、LoxP位点2、P2A序列、CRE蛋白序列、T2A序列、LoxP位点1、CD22-scFv序列、LoxP位点2、铰链区、跨膜区、共刺激分子4-1BB、效应器分子CD3ζ，所述元件组成的全部序列如SEQ ID NO：70所示。
其中，引导肽序列CD8a(如SEQ ID NO：11所示)、LoxP位点1(如SEQ ID NO：13所示)、CD19-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：30所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：40)、LoxP位点2(如SEQ ID NO：14所示)、P2A序列(如SEQ ID NO：17所示)、CRE蛋白序列(如SEQ IDNO：74所示)、T2A序列(如SEQ ID NO：18所示)、CD22-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：65所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：69)、铰链区(如SEQ ID NO：70所示)、跨膜区(如SEQ ID NO：71所示)、共刺激分子4-1BB(如SEQ ID NO：72所示)、效应器分子CD3ζ(如SEQ ID NO：73所示)由基因合成的方法得到。
除了一般的表达载体组件，以GD2和B7H3为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的元件组成，简言之，将I-1中的CD19-scFv和/或CD22-scFv序列替换为GD2-scFv(scFv中VL如SEQ ID NO：48所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：53)和/或B7H3-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：47所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：52)即可。
除了一般的表达载体组件，以CD19、CD22和CD20为靶点的嵌合抗原受体基因工程载体主要的序列组成如下：
II-1：引导肽序列CD8a、LoxP位点1、LoxP位点3、CD22-scFv序列、LoxP位点2、P2A序列、CRE蛋白序列、T2A序列、LoxP位点3、CD20-scFv序列、LoxP位点4、LoxP位点1、CD19-scFv、LoxP位点2、LoxP位点4、铰链区、跨膜区、共刺激分子4-1BB、效应器分子CD3ζ，所述元件组成的全部序列如SEQ ID NO：72所示。
其中，引导肽序列CD8a(如SEQ ID NO：11所示)、LoxP位点1(如SEQ ID NO：13所示)、LoxP位点3(如SEQ ID NO：15所示)、CD22-scFv序列(scFv中VL如SEQ ID NO：65所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：69)、LoxP位点2(如SEQ ID NO：14所示)、P2A序列(如SEQ ID NO：17所示)、CRE蛋白序列(如SEQ ID NO：74所示)、T2A序列(如SEQ ID NO：18所示)、CD20-scFv序列(如SEQ ID NO：56-61所示)、LoxP位点4(如SEQ ID NO：16所示)、CD19-scFv(scFv中VL如SEQ ID NO：30所示以及scFv中VH如SEQ ID NO：40)、铰链区(如SEQ ID NO：70所示)、跨膜区(如SEQ ID NO：71所示)、共刺激分子4-1BB(如SEQ ID NO：72所示)、效应器分子CD3ζ(如SEQ ID NO：73所示)由基因合成的方法得到。
3.通过设计合适的酶切位点，用所选的限制性核酸内切酶BamH1和Spe1分别双酶切I-1、II-1、表达载体，将酶切后的I-1和表达载体相连，酶切后的II-1和表达载体相连，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，阳性克隆接种后过夜。
4.细菌抽提质粒。
5.酶切鉴定和送测序，最后表达载体与I-1酶切连接后得到的是嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22 duoCARTNew19CRE22-CARv3(如图5所示)(对应核酸序列SEQ ID NO：75)，表达载体酶切连接后得到嵌合抗原受体基因工程载体GD2-B7H3 duoCART(如图6所示)，表达载体与II-1酶切连接后得到的是嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22-CD20triCART(如图7所示)。III-5结构对应的嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22duoCART(III-5)(如图8A所示)(对应核酸序列SEQ ID NO：83)；III-6结构对应的嵌合抗原受体基因工程载体CD22-CD19 duoCART(III-6)(如图8B所示)(对应核酸序列SEQ ID NO：84)。
实施例2制备带有嵌合抗原受体基因工程载体的病毒
1.分别将嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22 duoCARTNew19CRE22-CARv3、GD2-B7H3 duoCART、CD19-CD22-CD20 triCART和病毒包装质粒按照摩尔比1∶1∶1进行转染，质量总量6ug/10cm Dish，慢病毒转染293T细胞72h和96h后收集培养上清并进行病毒浓缩。
2.通过实时定量PCR方法，按慢病毒的1ul：2ul：4ul：8ul：16ul：32ul的浓度梯度转染1x106个293T细胞进行病毒滴度的确定，最后分别得到带有嵌合抗原受体基因工程载体CD19-CD22duoCART New 19CRE22-CAR v3、GD2-B 7H3 duoCART、CD 19-CD22-CD20 triCART的病毒。病毒的MOI值分别为：1)CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3：2～3；2)GD2-B7H3 duoCART：2～3；3)CD19-CD22-CD20 triCART：5～10。
实施例3病毒转染免疫细胞
1.收集人外周血T淋巴细胞，进行上述病毒的转染，之后采用荧光标记抗体通过流式细胞检测技术对转染效率进行检测。其中，CD19-CART采用的荧光标记抗体为APC，CD22-CART采用的荧光标记抗体为FITC，CD20-CART采用的荧光标记为PE。
2.嵌合抗原受体基因工程载体制备的病毒，经体外转染后一般转染效率在20％以上，绝大部分在40～70％之间，如图8所示。图8中，采用单靶点和双靶点慢病毒载体包装的病毒对人T淋巴细胞进行了转染，图中A为单靶点CD19-CART的转染效率；图中B为单靶点CD22-CART的转染效率；图中C为双靶点CD19/CD22-CART中CD19-CART的转染效率；图中D为双靶点CD19/CD22-CART中CD22-CART的转染效率；图中E为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD19-CART的转染效率；图中F为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD22-CART的转染效率的转染效率；图中G为三靶点CD19/CD22/CD20-CART载体中CD20-CART的转染效率的转染效率。从图中可以看出，双靶点和三靶点来源病毒和单靶点病毒相比，在转染效率方面无显著差异。
3.转染后，得到的CART细胞分别为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART(对应CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3)和tri-CD19-CD22-CD20-CART。
实施例4检测CART细胞对靶细胞的杀伤作用
1.以Single-CD19-CART：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1∶5，Single-CD22-CART：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1：5，dual-CD19-CD22-CART细胞：CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株＝1：5的比例，将三种CART细胞分别与CD19、CD22和/或CD20阳性白血病细胞株混合和共孵育，作为试验组；同时采用无关序列制备载体包装获得的病毒转染后的T淋巴细胞作为对照组。
2.在孵育0小时、24小时和48小时后通过流式细胞技术进行体外杀伤检测，比较不同孵育时间下，Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞对白血病细胞-REH的杀伤作用，并与无关序列制备载体包装获得的病毒转染后的T淋巴细胞进行比较。三组细胞对白血病细胞-REH的杀伤作用的结果如图10所示。其中第一行依次为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞与白血病细胞-REH共孵育0小时的图，可以看到共孵育体系中白血病细胞的比例分别为74.8％(对照组)、72.9％(Single-CD19-CART组)、800％(Single-CD22-CART组)和789％(dual-CD19-CD22-CART组)。第二行依次为Single-CD19-CART、Single-CD22-CART、dual-CD19-CD22-CART细胞与白血病细胞-REH共孵育24小时的图，可以看到共孵育体系中白血病细胞的比例分别为649％(对照组)、2.14％(Single-CD19-CART组)、16.2％(Single-CD22-CART组)和10.1％(dual-CD19-CD22-CART组)。可以看出，与对照组相比，dual-CD19-CD22-CART细胞在24小时共孵育后，对靶细胞的杀伤作用大大增强。
实施例5 CART细胞的获得及扩增
1.通过采集人外周血0.5～2ml/Kg，磁珠分选获得CD3阳性T淋巴细胞或者CD56阳性NK细胞。
2.加入CD3/CD28免疫磁珠进行刺激激活和病毒转染，继续给予CD3/CD28免疫磁珠、白介素-7和白介素-15进行体外扩增，一般7～8天可以扩增100倍以上。
3.根据体内负荷进行调整，dual-CD19-CD22-CART、tri-CD19-CD22-CD20-CART、dual-GD2-B7H3-CART细胞数量分别达到2×105/Kg～2×107/Kg经洗涤回输人体。
实施例6 dual-CD19-CD22-CART治疗骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例骨髓移植后复发的急性淋巴细胞白血病患者，经dual-CD19-CD22-CART输注前后微量残留病检测结果，如图11所示，图中A为dual-CD19-CD22-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞高表达CD66c和CD123，低表达CD81)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C和D为dual-CD19-CD22-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病细胞消失9个月，仍然处于完全缓解状态。
实施例7 tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗多次复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例多次复发的急性淋巴细胞白血病患者，经tri-CD19-CD22-CD20-CART输注前后微量残留病检测结果，如图12所示，图中A为tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞低表达CD45)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C、D和E为tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病持续消失。
实施例8 dual-CD19-CD22-CART治疗骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者
一例骨髓和中枢均复发的急性淋巴细胞白血病患者，经dual-CD19-CD22-CART输注前后微量残留病检测结果，如图13所示，图中A为dual-CD19-CD22-CART治疗前微量残留病检测结果(该患者的白血病细胞低表达CD38和CD81)，箭头指向的为白血病细胞；图中B、C、D、E和F为dual-CD19-CD22-CART治疗后微量残留病的检测结果，可见白血病细胞消失14个月，仍然处于完全缓解状态。
实施例9 tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗伯基特淋巴瘤患者
一例伯基特淋巴瘤患者接受tri-CD19-CD22-CD20-CART治疗后的情况，如图14所示。图A为治疗前后肿瘤变化情况，可见治疗前患者的膀胱(图中标记为a)和直肠(图中标记为b)间一个6.6cm大小的肿瘤，在治疗后完全消失；图B为连续观察一年的肿瘤变化情况，在1个多月的时候肿瘤基本上消失，没有再复发；图C为治疗中患者C反应蛋白、细胞因子(主要是白介素-6)以及乳酸脱氢酶等的变化情况。
实施例10 dual-CD19-CD22-CART治疗急性淋巴细胞睾丸复发患者
两例急性淋巴细胞睾丸复发患者的dual-CD19-CD22-CART治疗情况，如图15所示，图中上下两列分别为两例急性淋巴细胞睾丸复发患者接受dual-CD19-CD22-CART治疗的情况，可见在第0天注射后，患者白血病浸润的睾丸逐渐缩小到正常大小。并经病理活检，dual-CD19-CD22-CART治疗后未见到白血病细胞。
实施例11 dual-GD2-B7H3-CART治疗神经母细胞瘤患者
一例神经母细胞瘤患者接受dual-GD2-B7H3-CART治疗后的情况，如图16所示，图中A是治疗前后骨髓涂片低倍镜结果，可见治疗18天后骨髓中肿瘤细胞明显减少；B是治疗前后骨髓涂片高倍镜结果，可见治疗18天后骨髓中肿瘤细胞明显减少；C和D为治疗前后流式细胞检测结果，骨髓中的肿瘤细胞从治疗前的60％降低到1.2％。
实施例12临床治疗患者的疾病缓解率、无事件生存率和总生存率
1.从2017年3月到2019年8月，先后有47例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者接受CD19单靶点CART治疗，平均观察时间为23.8月，最长观察时间为55.5个月。接受Single-CD19-CART治疗后微量残留病转阴率为97.9％(47/48)，29例患者原发病复发，1例患者发生第二肿瘤(Single-CD19-CART治疗前为MLL-AF4阳性混合系白血病复发)，疾病的复发率38.2％(21/55)。29例原发病复发患者中，CD19阳性复发者19例，CD19阴性复发者10例，总2年的无事件生存率为34.0％，3年的总生存率为59.6％，见图17A所示。
2.从2019年9月到2020年10月，先后有81例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病患者接受CD19-CD22 duoCART New19CRE22-CAR v3治疗，平均观察时间为16.4个月，最长观察时间为25.9个月。1例患者发生CRES死亡，没有做原发病评估。其他接受CART治疗的患者，微量残留病转阴率为98.8％(80/81)，22例患者原发病复发，其中1例患者复发后白血病表型未知，1例患者CD19-/CD22-复发，4例患者CD19-/CD22+复发，14例患者CD19+/CD22+复发。疾病的复发率为27.2％，且主要为CD19+的复发。总的1年的无事件生存率为71.4％，1年的总生存率为863％，见图17B所示。分析表明，CD19-CD22双靶点的CART治疗疗效远高于单一CD19靶点，P值具有显著的统计学意义。
3.从2020年11月到2021年11月，先后有132例复发难治的儿童急性淋巴细胞白血病患者接受CD19-CD22 duoCART(III-5)和CD22-CD19 duoCART(III-6)的CART治疗，平均观察时间为53个月，最长观察时间为11.6个月。无患者发生CRS或者CRES死亡，微量残留病转阴率为100.0％(132/132)，8例患者原发病复发，其中5例患者CD19-/CD22+复发，3例患者CD19+/CD22+复发。疾病的复发率为6.1％，CD19+复发率大大降低。6个月的无事件生存率为89.7％，6个月的总生存率为96.7％，见图17C所示。分析表明，CD19-CD22 duoCART(III-5)和CD22-CD19 duoCART(III-6)的CART治疗疗效进一步优于CD19-CD22 duoCARTNew19CRE22-CAR v3，P值具有显著的统计学意义。
分析针对CD19单靶点和针对CD19和CD22的两个双靶点的构建而言，CD19-CD22duoCART(III-5)和CD22-CDl9 duoCART(III-6)(两者主要是CDl9和CD22的ScFv前后顺序的问题，体内外均无无显著差异)的疗效最好，见图17D所示。
序列表
<110> 上海医药集团生物治疗技术有限公司
<120> 两个或多个靶点嵌合抗原受体基因工程载体及其应用
<130> 0130-PA-010CN
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1172
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EF1α
<400> 1
gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg 60
tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg 120
tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg 180
ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg 240
gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca 300
cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt 360
cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 420
gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 480
agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata 540
gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg 600
gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 660
caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 720
cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 780
gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc 840
gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 900
ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 960
cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 1020
cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 1080
tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 1140
aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1172
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-1
<400> 2
atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60
ggtgcagtct cc 72
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-2
<400> 3
atgaccatgt atttgtggct taaactcttg gcatttggct ttgcctttct ggacacagaa 60
gtatttgtga caggg 75
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-3
<400> 4
atgctgtttt tgctacttcc attgttagct gttctcccag gtgatggcaa tgca 54
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-4
<400> 5
atgctgtttc tgcagtttct gctgctagct cttcttctcc caggtggtga c 51
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-5
<400> 6
atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60
tcctgcctcg ga 72
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-6
<400> 7
atgcggccgc ggctgtggct cctcttggcc gcgcagctga cagttctcca tggcaactca 60
gtc 63
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-7
<400> 8
atgctgctgc tgccatttca actgttagct gttctctttc ctggtggtaa c 51
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-8
<400> 9
atggccgggc ctccgaggct cctgctgctg cccctgcttc tggcgctggc tcgcggcctg 60
cctggggccc tggct 75
<210> 10
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-9
<400> 10
atgaaccggg gagtcccttt taggcacttg cttctggtgc tgcaactggc gctcctccca 60
gcagccactc aggga 75
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-10
<400> 11
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagc 60
cg 62
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LoxP野生型
<400> 12
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LoxP2722
<400> 13
ataacttcgt ataggatacc ttatacgaag ttat 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LoxP511
<400> 14
ataacttcgt atagtataca ttatacgaag ttat 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LoxP5271
<400> 15
ataacttcgt atagtaaaca ttatacgaag ttat 34
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LoxP3171
<400> 16
ataacttcgt atagtatata ttatacgaag ttat 34
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪切肽-1
<400> 17
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪切肽-2
<400> 18
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪切肽-3
<400> 19
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 20
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪切肽-4
<400> 20
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 21
<211> 9688
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV包装载体
<400> 21
ttggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 60
acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca 120
ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc 180
aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg 240
gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga 300
gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360
gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga 420
tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg 480
agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 540
ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 600
cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa 660
gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg 720
gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag 780
aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg 840
gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 900
gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc 960
tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga 1020
tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac 1080
accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag 1140
caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 1200
attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 1260
gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 1320
cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 1380
acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 1440
acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 1500
tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 1560
catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 1620
ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat 1680
acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga 1740
attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat 1800
aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact 1860
ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc 1920
aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag 1980
agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgatgtcgac gataagcttt 2040
gcaaagatgg ataaagtttt aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt 2100
cttgaaagga gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 2160
agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg 2220
cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 2280
agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc 2340
cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg 2400
cccttgcgtg ccttgaatta cttccactgg ctgcagtacg tgattcttga tcccgagctt 2460
cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg ccttgcgctt aaggagcccc ttcgcctcgt 2520
gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg ggccgccgcg tgcgaatctg gtggcacctt 2580
cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct ctagccattt aaaatttttg atgacctgct 2640
gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt gtaaatgcgg gccaagatct gcacactggt 2700
atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac ggggcccgtg cgtcccagcg cacatgttcg 2760
gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg agaatcggac gggggtagtc tcaagctggc 2820
cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg ccgtgtatcg ccccgccctg ggcggcaagg 2880
ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg gaaagatggc cgcttcccgg ccctgctgca 2940
gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg ggagagcggg cgggtgagtc acccacacaa 3000
aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc gcttcatgtg actccacgga gtaccgggcg 3060
ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt aggttggggg 3120
gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga agttaggcca 3180
gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg atcttggttc 3240
attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt gtcgtgagga 3300
atttcgacat ttaaatttaa ttaatctcga cggtatcggt taacttttaa aagaaaaggg 3360
gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa 3420
actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttccgatcac gagactagcc 3480
tcgaggttta aactacggga tccactagtc atatgataat caacctctgg attacaaaat 3540
ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 3600
tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 3660
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 3720
cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 3780
tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 3840
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 3900
gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 3960
gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 4020
cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 4080
gatctccctt tgggccgcct ccccgcatcg gtacgtatgg ccaggtacct ttaagaccaa 4140
tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 4200
ggctaattca ctcccaacga agacaagatg ggatcaattc accatgggaa taacttcgta 4260
tagcatacat tatacgaagt tatgctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac 4320
cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa 4380
agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag 4440
agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagcatcta gaattaattc 4500
cgtgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat acataaggtt atgtattaat 4560
tgtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg tgtagcatct ggcttactga 4620
agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt cggtttggtt ggacgaacct 4680
tctgagtttc tggtaacgcc gtcccgcacc cggaaatggt cagcgaacca atcagcaggg 4740
tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag 4800
gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact 4860
tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac 4920
tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca 4980
acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgaatggtgc 5040
actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 5100
cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 5160
accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga 5220
cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 5280
tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 5340
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 5400
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 5460
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 5520
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 5580
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 5640
tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 5700
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 5760
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 5820
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 5880
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 5940
gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 6000
gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 6060
gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 6120
gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 6180
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 6240
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 6300
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 6360
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 6420
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 6480
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 6540
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 6600
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 6660
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 6720
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 6780
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 6840
cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 6900
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 6960
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 7020
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 7080
tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 7140
accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 7200
gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 7260
attcattaat gcagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 7320
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 7380
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 7440
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 7500
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 7560
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 7620
gacacaagac aggcttgcga gatatgtttg agaataccac tttatcccgc gtcagggaga 7680
ggcagtgcgt aaaaagacgc ggactcatgt gaaatactgg tttttagtgc gccagatctc 7740
tataatctcg cgcaacctat tttcccctcg aacacttttt aagccgtaga taaacaggct 7800
gggacacttc acatgagcga aaaatacatc gtcacctggg acatgttgca gatccatgca 7860
cgtaaactcg caagccgact gatgccttct gaacaatgga aaggcattat tgccgtaagc 7920
cgtggcggtc tgtaccgggt gcgttactgg cgcgtgaact gggtattcgt catgtcgata 7980
ccgtttgtat ttccagctac gatcacgaca accagcgcga gcttaaagtg ctgaaacgcg 8040
cagaaggcga tggcgaaggc ttcatcgtta ttgatgacct ggtggatacc ggtggtactg 8100
cggttgcgat tcgtgaaatg tatccaaaag cgcactttgt caccatcttc gcaaaaccgg 8160
ctggtcgtcc gctggttgat gactatgttg ttgatatccc gcaagatacc tggattgaac 8220
agccgtggga tatgggcgtc gtattcgtcc cgccaatctc cggtcgctaa tcttttcaac 8280
gcctggcact gccgggcgtt gttcttttta acttcaggcg ggttacaata gtttccagta 8340
agtattctgg aggctgcatc catgacacag gcaaacctga gcgaaaccct gttcaaaccc 8400
cgctttaaac atcctgaaac ctcgacgcta gtccgccgct ttaatcacgg cgcacaaccg 8460
cctgtgcagt cggcccttga tggtaaaacc atccctcact ggtatcgcat gattaaccgt 8520
ctgatgtgga tctggcgcgg cattgaccca cgcgaaatcc tcgacgtcca ggcacgtatt 8580
gtgatgagcg atgccgaacg taccgacgat gatttatacg atacggtgat tggctaccgt 8640
ggcggcaact ggatttatga gtgggccccg gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg 8700
tgtgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt 8760
tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac 8820
ctatggaact gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg 8880
ctcagaagaa atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attctactcc 8940
tccaaaaaag aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt 9000
tttgagtcat gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa 9060
ggaaaaagct gcactgctat acaagaaaat tatggaaaaa tattctgtaa cctttataag 9120
taggcataac agttataatc ataacatact gttttttctt actccacaca ggcatagagt 9180
gtctgctatt aataactatg ctcaaaaatt gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg 9240
ggttaataag gaatatttga tgtatagtgc cttgactaga gatcataatc agccatacca 9300
catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 9360
ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 9420
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 9480
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat caactggata actcaagcta 9540
accaaaatca tcccaaactt cccaccccat accctattac cactgccaat tacctagtgg 9600
tttcatttac tctaaacctg tgattcctct gaattatttt cattttaaag aaattgtatt 9660
tgttaaatat gtactacaaa cttagtag 9688
<210> 22
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 5’LTR序列或3’LTR序列
<400> 22
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
a 181
<210> 23
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WPRE的核酸序列
<400> 23
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgca 588
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1907）
<400> 24
gacatccagc tgacccagtc tccatcatct ctgagcgcat ctgttggaga tagggtcact 60
atcacttgta aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
cagcagattc cagggaaagc acctaaattg ttgatctacg atgcttcgaa tctagtttct 180
ggtatccctc ctcgattctc tggcagcgga tctgggacag attacacttt caccatcagc 240
tctcttcaac cagaagacat tgcaacatat cactgtcagc aaagtactga agatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctacagatc aaacgt 336
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1902）
<400> 25
gacattgtgc tgacgcagtc tccaacctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatca 180
ggggtccctg ccaggtttag tggtagtggg tctgggacgg acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatag tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgg 336
<210> 26
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1903）
<400> 26
gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180
gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaa 333
<210> 27
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1904）
<400> 27
gacattcaga tgacccagtc ttctgcctac ctgtctgtat ctctaggagg cagggtcacc 60
attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca acataaacca 120
ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccactt tggaaactgg ggttccttca 180
agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240
gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tcttggaata ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaag 309
<210> 28
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1905）
<400> 28
gacgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg 120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagggtttc caaccgattt 180
tctggggtcc tagacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgcc tccaagttac acatgtccct 300
cccacgttcg gtgctgggac caag 324
<210> 29
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1906）
<400> 29
gacatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180
ggcatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga agatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctggagatc aaacgt 336
<210> 30
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1901）
<400> 30
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac a 321
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1908）
<400> 31
gatgttggga tgacccagac tccactcact ttgtcggtca ccattggaca accagcctct 60
ttctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120
ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatcc atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240
ggcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caaactagaa ataaaa 336
<210> 32
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1909）
<400> 32
gacattgtgc tgacgcagtc tccaacctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggtagtggg tctgggacgg acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatag tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VL（1914）
<400> 33
gatatacaga tgacgcagac aacgtcaagt ctttccgcca gcttgggaga ccgagtgact 60
atatcttgta gagcaagcca ggatatttct aagtatctta actggtacca acaaaagccc 120
gatggaacgg ttaagctgct tatataccat accagtagac tccactccgg cgtaccatca 180
cggttttctg gcagtggctc cgggaccgac tattctttga cgatctctaa tctcgaacaa 240
gaggatattg caacatactt ttgtcagcaa ggcaatacct tgccatatac gtttgggggc 300
gggacaaaac ttgagataac c 321
<210> 34
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1907）
<400> 34
caggtccaac tgcagcaatc aggggctgaa gtcaagaaac ctgggtcatc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggcta cgctttcagt agctactgga tgaactgggt gaggcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaagt tcaaggggcg cgccactatt actgccgacg aatccactaa tacagcctac 240
atggaactca gcagcctacg atctgaggac acagcgttct attcttgtgc aagacgggag 300
actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 35
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1902）
<400> 35
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaaag catctggcta cgcattcagt agctcttgga tgaactgggt gatacagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180
aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac ctctgtggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcagga 300
tttattacta cggttttaga ctttgactac tggggccacg gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 36
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1903）
<400> 36
caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300
actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cc 372
<210> 37
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1904）
<400> 37
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgtaagg cttctggcta tgcattcagt agctactggg tgaactggat gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggacag atttaccctg gagatggtga tactaattac 180
aatggaaagt tcaagggtcg agccacagtg actgcagaca aatcctccag cacatcctac 240
atgcagttca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatctatt 300
actacggtgg taggctgtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 38
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1905）
<400> 38
gaggttcagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat gttaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggcct 300
tattactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 39
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1906）
<400> 39
caggtccaac tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggtta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgccgacg aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctacg atctgaggac tctgcggtct attcttgtgc aagacgggag 300
actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 40
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1901）
<400> 40
gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60
acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120
ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180
tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300
tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 41
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1908）
<400> 41
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat tttaatcctt acaatgatgg tactgattac 180
tatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggacc 300
tattactacg gtagtagcta cccctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360
tcctca 366
<210> 42
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1909）
<400> 42
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agctcttgga tgaactgggt gatacagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180
aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac ctctgtggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcagga 300
tttattacta cggttttaga ctttgactac tggggccacg gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 43
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19 VH（1914）
<400> 43
gaggttaagc ttcaggaatc cggaccaggt ttggttgccc ccagccaatc tctcagcgtt 60
acatgcacgg tttcaggcgt cagtctcccc gattacggtg taagttggat tcggcaacct 120
ccgcgaaagg gtctggaatg gctgggggtt atttggggga gtgagacaac ttattacaac 180
tctgcactta agagtcggct taccatcatc aaggataatt caaaatcaca agtattcctg 240
aagatgaact cattgcaaac agatgataca gctatatact attgtgccaa gcattactat 300
tatggtggtt cttatgcaat ggattactgg gggcaaggca cgtcagtgac agtgagttca 360
<210> 44
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD 1418VL
<400> 44
gacgtggtga tgacccagac ccccctgtcc ctgcccgtga cccccggcga gcccgcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagtcttgta caccgtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgattc acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaagtac acatgttcct 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD TP5F11mVL
<400> 45
gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtggcagctc aagtataagt tacatgcact ggtaccagca gaagcctgtc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgta 240
gatgctgcca cttattactg ccatcagcgg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
acacagttgg aaataaaacg g 321
<210> 46
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD TPGK8mVL
<400> 46
gagctcaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 60
tgccgggcaa gtcagagcat tagcaagtat ttaaattggt atcagcagaa accagggaaa 120
gcccctaagc tcctgatcta tgctgcatcc agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc 180
agtggcagta gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat 240
tttgcaactt actactgtca acagagttac agtaccccgt ggacgttcgg ccaagagacc 300
aaggtggaaa tcaaa 315
<210> 47
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 8H9modified VL
<400> 47
caggtcaaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtagaac ctggggcttc agtgaaattg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca aactatgata taaactgggt gaggcagagg 120
cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtag tactcaatac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagacagact 300
acggctacct ggtttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagat 357
<210> 48
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD 2βVL
<400> 48
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gatctagtca gagtcttgta caccgtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgattc acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaagtac acatgttcct 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 49
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD 1418VH
<400> 49
gaggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtggagaagc ccggcgcctc cgtgaagatc 60
tcctgcaagg cctccggctc ctccttcacc ggctacaaca tgaactgggt gcgccagaac 120
atcggcaagt ccctggagtg gatcggcgcc atcgacccct actacggcgg cacctcctac 180
aaccagaagt tcaagggccg cgccaccctg accgtggaca agtccacctc caccgcctac 240
atgcacctga agtccctgcg ctccgaggac accgccgtgt actactgcgt gtccggcatg 300
gagtactggg gccagggcac ctccgtgacc gtgtcctcc 339
<210> 50
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD TP5F11mVH
<400> 50
caggtgaaac tgcagcagtc aggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata caaattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactaactac 180
aagcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagagatact 300
acggtcccgt ttgcttactg ggtccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 51
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD TPGK8mVH
<400> 51
gaggtgcagc tgctcgagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggcttggg gaactcgatc atattgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcacaatg tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgag tgccgcggac tcggccgtgt attactgtgc gagacatcac 300
gacccaatac ttggactcga tgcttttgat atctggggcc aagggacaac ggtcaccgtc 360
tcttca 366
<210> 52
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 8H9modified VH
<400> 52
gacatcgagc tcactcagtc tccaaccacc ctgtctgtga ctccaggaga tcaagtctct 60
ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtacca acaaaaatca 120
catgagtctc cacaacttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240
gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgctcac gttcggtgct 300
gggaccgaac tggagctgga acaggcggcc 330
<210> 53
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD 2βVH
<400> 53
gaggtccaac tgctgcagtc tggacctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgatgata 60
tcctgcaagg cttctggttc ctcattcact ggctacaaca tgaactgggt gaggcagaac 120
attggaaaga gccttgaatg gattggagct attgatcctt actatggtgg aactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcag ggccacattg actgtagaca aatcgtccag cacagcctac 240
atgcacctca agagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgt aagcggaatg 300
gagtactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctca 339
<210> 54
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B7H3 VL
<400> 54
caggtcaaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaaattg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca aactatgata taaactgggt gaggcagagg 120
cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtag tactcaatac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagacagact 300
acggctacct ggtttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagat 357
<210> 55
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B7H3 VH
<400> 55
gacatcgagc tcactcagtc tccaaccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60
ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtacca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240
gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acaggcggcc 330
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VL（2001）
<400> 56
cagatcgtgc tgtcccagag ccccgccata ctttctgcta gtccaggcga aaaggttacc 60
atgacttgta gggcctcaag ctccgtctca tacattcact ggtttcagca aaaacccggg 120
agtagcccta agccatggat ctatgctacc tccaatctcg cctctggcgt gcctgtacgg 180
ttctcggggt caggtagcgg caccagctac agtctgacta tctctcgcgt ggaggctgaa 240
gacgcagcga catattactg ccaacagtgg acctccaacc cgcccacatt cggcggcgga 300
acgaaattgg agattaagag a 321
<210> 57
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VL（2002）
<400> 57
agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca acaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 60
gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tggactggta ccagcagaag 120
ccaggttcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 240
gctgaggatg ctgccactta ttactgccag cagtggatta gtaacccacc cacgttcggt 300
gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catc 354
<210> 58
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VL（2003）
<400> 58
gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact ggttccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacttcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 59
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VH（2001）
<400> 59
caggtgcaac tgcagcaacc cggcgccgag ttggttaagc ccggcgcttc tgtcaagatg 60
tcatgtaaag cctcgggcta cacttttaca tcctataata tgcactgggt gaagcagacc 120
cctggacggg gtctggaatg gattggcgct atctacccag gaaacggcga tacttcttac 180
aaccagaagt tcaaaggtaa agccacgctc accgcggaca agtcatccag cacagcatat 240
atgcagctta gctcgctgac tagtgaggac agcgcagtgt attactgcgc aagatccaca 300
tactatggcg gtgattggta cttcaatgta tggggggccg ggaccacggt gaccgtcagt 360
gca 363
<210> 60
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VH（2002）
<400> 60
caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc agttacaatg tgcactgggt aaagcagaca 120
cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggcga tacttccttc 180
aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagtctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgaat 300
tactacggta gtagctacgt ttggttcttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 61
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20 VH（2003）
<400> 61
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaaacagaca 120
cctggtcggg gcctggaatg gattggagct atttatcccg gaaatggtga tacttcctac 180
aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgact 300
tactacggcg gtgactggta cttcgatgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 62
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VL（2201）
<400> 62
gacatccagc tgactcagtc cccttcctct ctttcagcga gcgtgggcga tcgggttaca 60
atgagttgca agtcgtccca atccgtgcta tactctgcta accacaagaa ttacttggcc 120
tggtatcagc agaaaccggg gaaagccccc aagctcctga tttattgggc aagtactaga 180
gagtcaggcg taccatctcg cttctctggt agtggcagcg gaaccgactt tacgttcaca 240
ataagcagcc tccaacccga agatattgcc acctattatt gtcatcagta cctgagctct 300
tggacttttg ggggaggcac gaaagtccaa atcaagagga ccgtggctgc gccttcc 357
<210> 63
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VL（2202）
<400> 63
gacatccaga tgacacagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gaccatctgg tcctacctga actggtatca gcagcggcct 120
ggcaaggccc ccaacctgct gatctatgcc gccagctcac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattttccg gcagaggcag cggcaccgac ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacagca tcccccagac cttcggccag 300
gggaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 64
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VL（2203）
<400> 64
gatatccaga tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 65
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VL（2204）
<400> 65
gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60
atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120
tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180
tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 339
<210> 66
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VH（2201）
<400> 66
caggtgcagc ttgtccagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctgggagcag tgttaaggtg 60
agctgtaagg cttctgggta cacttttacc tcctattggt tgcactgggt ccggcaggca 120
cccggccaag ggctggagtg gattggatat atcaacccgc gcaacgatta caccgagtac 180
aatcagaatt tcaaagacaa ggccactata acggctgatg aatcgactaa cacggcgtat 240
atggagcttt cttccctgag gtccgaagac acagcatttt acttctgcgc ccggagggat 300
atcacaactt tttattgggg ccaaggaaca accgtcacag tgagtagcgc tagtaccaaa 360
ggcccatctg tgttcccttt ggctcccagc agcaaatcta caagcggagg tacggcagcc 420
ttaggctgct tggtcaagga ttacttccct gagccagtta ccgtgtcttg gaactccggt 480
gcgcttacct ctggggtaca cacatttccc 510
<210> 67
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VH（2202）
<400> 67
caggtgcagc tgcagcagtc tggccctggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60
acctgtgcca tcagcggcga tagcgtgtcc agcaatagcg ccgcctggaa ctggatcaga 120
cagagcccta gcagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggtac 180
aacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa cagcgtgacc cccgaggata ccgccgtgta ctactgcgcc 300
agagaagtga ccggcgacct ggaagatgcc ttcgacatct ggggccaggg cacaatggtc 360
accgtgtcta gc 372
<210> 68
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VH（2203）
<400> 68
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat 180
ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatagt 300
ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360
gtctctgca 369
<210> 69
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22 VH（2204）
<400> 69
gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120
cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat 180
aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc 300
tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 70
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区
<400> 70
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta c 141
<210> 71
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 跨膜区
<400> 71
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 72
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB
<400> 72
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 73
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 73
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 74
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRE
<400> 74
atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60
gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120
acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180
cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240
cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300
cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcgtatc 360
cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480
ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540
agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600
aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 660
gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 780
ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 900
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 960
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 1020
gatggcgat 1029
<210> 75
<211> 3603
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19/CD22 duoCAR New19CRE22-CAR v3
<400> 75
ggatccacac gtgccaccat ggccttacca gtgaccgcct tgctcctgcc gctggccttg 60
ctgctccacg ccgccaggcc gataacttcg tataggatac cttatacgaa gttatcggag 120
caaaaactta tctctgaaga ggacctcgac atccagatga cacagactac atcctccctg 180
tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa 240
tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat ggaactgtta aactcctgat ctaccataca 300
tcaagattac actcaggagt cccatcaagg ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat 360
tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa gatattgcca cttacttttg ccaacagggt 420
aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg accaagctgg agatcacagg tggcggtggc 480
tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tctgaggtga aactgcagga gtcaggacct 540
ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 600
cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 660
gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 720
atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 780
acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 840
tggggccaag gaacctcagt caccgtctcc tcagaattca taacttcgta tagtatacat 900
tatacgaagt tatccggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac 960
gtggaggaga accctggacc tatgtccaat ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca 1020
ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat 1080
cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg 1140
gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat 1200
tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc 1260
cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt 1320
tcactggtta tgcggcgtat ccgaaaagaa aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag 1380
gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat 1440
cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt ctggggattg cttataacac cctgttacgt 1500
atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg 1560
ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt 1620
agcctggggg taactaaact ggtcgagcga tggatttccg tctctggtgt agctgatgat 1680
ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc 1740
agccagctat caactcgcgc cctggaaggg atttttgaag caactcatcg attgatttac 1800
ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc 1860
ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt 1920
ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac tatatccgta acctggatag tgaaacaggg 1980
gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta 2040
acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga cctataactt cgtataggat accttatacg 2100
aagttatcgt acccatacga cgtcccagac tacgctacgc gtgatgttgt ggtgactcaa 2160
actccactct ccctgcctgt cagctttgga gatcaagttt ctatctcttg caggtctagt 2220
cagagtcttg caaacagtta tgggaacacc tttttgtctt ggtacctgca caagcctggc 2280
cagtctccac agctcctcat ctatgggatt tccaacagat tttctggggt gccagacagg 2340
ttcactggca gtggttcagg gacagatttc acactcaaga tcagcacaat aaagcctgag 2400
gacttgggaa tgtattactg cttacaaggt acacatcagc cgtacacgtt cggagggggg 2460
accaagctgg aaataaaacg tggcggtggc ggttctggtg gcggtggctc gggcggtggt 2520
ggctcggagg tccaactgca gcagtctggg actgtactgg caaggcctgg ggcttccgtg 2580
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacagg tttaccaact actggattca ctgggtaaaa 2640
cagaggcctg ggcagggtct agaatggatt ggtggtatta atcctggaaa taattatact 2700
acgtataaga ggaacttgaa gggcaaggcc acactgactg cagtcacatc cgccagcact 2760
gcctacatgg acctcagcag cctgacaagt gaggactctg cggtctatta ctgtacaaga 2820
gagggctatg gtaactacgg ggcctggttt gcttactggg gccaggggac tctggtcacc 2880
gtctcctcac ccgggataac ttcgtatagt atacattata cgaagttatg caccacgacg 2940
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 3000
ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 3060
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 3120
gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 3180
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 3240
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 3300
tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 3360
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 3420
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 3480
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 3540
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 3600
taa 3603
<210> 76
<211> 3585
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GD2/B7H3 duoCAR
<400> 76
ggatccacac gtgccaccat ggccttacca gtgaccgcct tgctcctgcc gctggccttg 60
ctgctccacg ccgccaggcc gataacttcg tataggatac cttatacgaa gttatcggag 120
caaaaactta tctctgaaga ggacctccag gtcaaactgc agcagtctgg ggctgaactg 180
gtagaacctg gggcttcagt gaaattgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcacaaac 240
tatgatataa actgggtgag gcagaggcct gaacagggac ttgagtggat tggatggatt 300
tttcctggag atggtagtac tcaatacaat gagaagttca agggcaaggc cacactgact 360
acagacacat cctccagcac agcctacatg cagctcagca ggctgacatc tgaggactct 420
gctgtctatt tctgtgcaag acagactacg gctacctggt ttgcttactg gggccaaggg 480
accacggtca ccgtctcctc agatggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 540
ggcggatctg acatcgagct cactcagtct ccaaccaccc tgtctgtgac tccaggagat 600
caagtctctc tttcctgcag ggccagccag agtattagcg actacttaca ctggtaccaa 660
caaaaatcac atgagtctcc acaacttctc atcaaatatg cttcccaatc catctctggg 720
atcccctcca ggttcagtgg cagtggatca gggtcagatt tcactctcag tatcaacagt 780
gtggaacctg aagatgttgg agtgtattac tgtcaaaatg gtcacagctt tccgctcacg 840
ttcggtgctg ggaccgaact ggagctggaa caggcggccg aattcataac ttcgtatagt 900
atacattata cgaagttatc cggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 960
ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tccaatttac tgaccgtaca ccaaaatttg 1020
cctgcattac cggtcgatgc aacgagtgat gaggttcgca agaacctgat ggacatgttc 1080
agggatcgcc aggcgttttc tgagcatacc tggaaaatgc ttctgtccgt ttgccggtcg 1140
tgggcggcat ggtgcaagtt gaataaccgg aaatggtttc ccgcagaacc tgaagatgtt 1200
cgcgattatc ttctatatct tcaggcgcgc ggtctggcag taaaaactat ccagcaacat 1260
ttgggccagc taaacatgct tcatcgtcgg tccgggctgc cacgaccaag tgacagcaat 1320
gctgtttcac tggttatgcg gcgtatccga aaagaaaacg ttgatgccgg tgaacgtgca 1380
aaacaggctc tagcgttcga acgcactgat ttcgaccagg ttcgttcact catggaaaat 1440
agcgatcgct gccaggatat acgtaatctg gcatttctgg ggattgctta taacaccctg 1500
ttacgtatag ccgaaattgc caggatcagg gttaaagata tctcacgtac tgacggtggg 1560
agaatgttaa tccatattgg cagaacgaaa acgctggtta gcaccgcagg tgtagagaag 1620
gcacttagcc tgggggtaac taaactggtc gagcgatgga tttccgtctc tggtgtagct 1680
gatgatccga ataactacct gttttgccgg gtcagaaaaa atggtgttgc cgcgccatct 1740
gccaccagcc agctatcaac tcgcgccctg gaagggattt ttgaagcaac tcatcgattg 1800
atttacggcg ctaaggatga ctctggtcag agatacctgg cctggtctgg acacagtgcc 1860
cgtgtcggag ccgcgcgaga tatggcccgc gctggagttt caataccgga gatcatgcaa 1920
gctggtggct ggaccaatgt aaatattgtc atgaactata tccgtaacct ggatagtgaa 1980
acaggggcaa tggtgcgcct gctggaagat ggcgatggaa gcggagaggg cagaggaagt 2040
ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cctggaccta taacttcgta taggatacct 2100
tatacgaagt tatcgtaccc atacgacgtc ccagactacg ctacgcgtga aatagtgatg 2160
acgcagtctc cagccaccct gtctgtgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcaga 2220
tctagtcaga gtcttgtaca ccgtaatgga aacacctatt tacattggta cctgcagaag 2280
ccaggccagt ctccaaagct cctgattcac aaagtttcca accgattttc tggggtccca 2340
gacaggttca gtggcagtgg atcagggaca gatttcacac tcaagatcag cagagtggag 2400
gctgaggatc tgggagttta tttctgttct caaagtacac atgttcctcc gctcacgttc 2460
ggtgctggga ccaagctgga gctgaaaggc ggtggcggtt ctggtggcgg tggctcgggc 2520
ggtggtggct cggaggtcca actgctgcag tctggacctg agctggagaa gcctggcgct 2580
tcagtgatga tatcctgcaa ggcttctggt tcctcattca ctggctacaa catgaactgg 2640
gtgaggcaga acattggaaa gagccttgaa tggattggag ctattgatcc ttactatggt 2700
ggaactagct acaaccagaa gttcaagggc agggccacat tgactgtaga caaatcgtcc 2760
agcacagcct acatgcacct caagagcctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt 2820
gtaagcggaa tggagtactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc acccgggata 2880
acttcgtata gtatacatta tacgaagtta tgcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2940
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 3000
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 3060
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 3120
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 3180
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 3240
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 3300
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 3360
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 3420
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 3480
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 3540
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 3585
<210> 77
<211> 4482
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19/CD22/CD20 triCAR
<400> 77
ggatccacac gtgccaccat ggccttacca gtgaccgcct tgctcctgcc gctggccttg 60
ctgctccacg ccgccaggcc gataacttcg tataggatac cttatacgaa gttatcaata 120
acttcgtata gtaaacatta tacgaagtta tccgagcaaa aacttatctc tgaagaggac 180
ctcgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 240
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 300
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 360
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 420
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 480
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 540
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 600
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 660
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 720
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 780
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 840
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 900
gtctcctcag aattcataac ttcgtatagt atacattata cgaagttatc cggaagcgga 960
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg 1020
tccaatttac tgaccgtaca ccaaaatttg cctgcattac cggtcgatgc aacgagtgat 1080
gaggttcgca agaacctgat ggacatgttc agggatcgcc aggcgttttc tgagcatacc 1140
tggaaaatgc ttctgtccgt ttgccggtcg tgggcggcat ggtgcaagtt gaataaccgg 1200
aaatggtttc ccgcagaacc tgaagatgtt cgcgattatc ttctatatct tcaggcgcgc 1260
ggtctggcag taaaaactat ccagcaacat ttgggccagc taaacatgct tcatcgtcgg 1320
tccgggctgc cacgaccaag tgacagcaat gctgtttcac tggttatgcg gcgtatccga 1380
aaagaaaacg ttgatgccgg tgaacgtgca aaacaggctc tagcgttcga acgcactgat 1440
ttcgaccagg ttcgttcact catggaaaat agcgatcgct gccaggatat acgtaatctg 1500
gcatttctgg ggattgctta taacaccctg ttacgtatag ccgaaattgc caggatcagg 1560
gttaaagata tctcacgtac tgacggtggg agaatgttaa tccatattgg cagaacgaaa 1620
acgctggtta gcaccgcagg tgtagagaag gcacttagcc tgggggtaac taaactggtc 1680
gagcgatgga tttccgtctc tggtgtagct gatgatccga ataactacct gttttgccgg 1740
gtcagaaaaa atggtgttgc cgcgccatct gccaccagcc agctatcaac tcgcgccctg 1800
gaagggattt ttgaagcaac tcatcgattg atttacggcg ctaaggatga ctctggtcag 1860
agatacctgg cctggtctgg acacagtgcc cgtgtcggag ccgcgcgaga tatggcccgc 1920
gctggagttt caataccgga gatcatgcaa gctggtggct ggaccaatgt aaatattgtc 1980
atgaactata tccgtaacct ggatagtgaa acaggggcaa tggtgcgcct gctggaagat 2040
ggcgatggaa gcggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 2100
cctggaccta taacttcgta tagtaaacat tatacgaagt tatacgcgtc ccagatcgtg 2160
ctgtcccaga gccccgccat actttctgct agtccaggcg aaaaggttac catgacttgt 2220
agggcctcaa gctccgtctc atacattcac tggtttcagc aaaaacccgg gagtagccct 2280
aagccatgga tctatgctac ctccaatctc gcctctggcg tgcctgtacg gttctcgggg 2340
tcaggtagcg gcaccagcta cagtctgact atctctcgcg tggaggctga agacgcagcg 2400
acatattact gccaacagtg gacctccaac ccgcccacat tcggcggcgg aacgaaattg 2460
gagattaaga gaggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcag 2520
gtgcaactgc agcaacccgg cgccgagttg gttaagcccg gcgcttctgt caagatgtca 2580
tgtaaagcct cgggctacac ttttacatcc tataatatgc actgggtgaa gcagacccct 2640
ggacggggtc tggaatggat tggcgctatc tacccaggaa acggcgatac ttcttacaac 2700
cagaagttca aaggtaaagc cacgctcacc gcggacaagt catccagcac agcatatatg 2760
cagcttagct cgctgacaag tgaggacagc gcagtgtatt actgcgcaag atccacatac 2820
tatggcggtg attggtactt caatgtatgg ggggccggga ccacggtgac cgtcagtgca 2880
agatctataa cttcgtatag tatatattat acgaagttat ccataacttc gtataggata 2940
ccttatacga agttatccta cccatacgac gtcccagact acgctgatgt tgtggtgact 3000
caaactccac tctccctgcc tgtcagcttt ggagatcaag tttctatctc ttgcaggtct 3060
agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac acctttttgt cttggtacct gcacaagcct 3120
ggccagtctc cacagctcct catctatggg atttccaaca gattttctgg ggtgccagac 3180
aggttcactg gcagtggttc agggacagat ttcacactca agatcagcac aataaagcct 3240
gaggacttgg gaatgtatta ctgcttacaa ggtacacatc agccgtacac gttcggaggg 3300
gggaccaagc tggaaataaa acgtggcggt ggcggttctg gtggcggtgg ctcgggcggt 3360
ggtggctcgg aggtccaact gcagcagtct gggactgtac tggcaaggcc tggggcttcc 3420
gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac aggtttacca actactggat tcactgggta 3480
aaacagaggc ctgggcaggg tctagaatgg attggtggta ttaatcctgg aaataattat 3540
actacgtata agaggaactt gaagggcaag gccacactga ctgcagtcac atccgccagc 3600
actgcctaca tggacctcag cagcctgaca agtgaggact ctgcggtcta ttactgtaca 3660
agagagggct atggtaacta cggggcctgg tttgcttact ggggccaggg gactctggtc 3720
accgtctcct caaagcttat aacttcgtat agtatacatt atacgaagtt atccataact 3780
tcgtatagta tatattatac gaagttatcc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 3840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 3900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 3960
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 4020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 4080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 4140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 4200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 4260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 4320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 4380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 4440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 4482
<210> 78
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a-11
<400> 78
atggcactac ctgtcacggc gttactgctc cccttggcgt tactcctgca tgcggcgaga 60
ccc 63
<210> 79
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链区（2）
<400> 79
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 80
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 跨膜区（2）
<400> 80
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gagg 84
<210> 81
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB（2）
<400> 81
aagagaggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag acccgtgcag 60
accacacagg aggaggacgg ctgcagctgt aggttcccag aggaggagga gggaggatgc 120
gagctg 126
<210> 82
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ （2）
<400> 82
cgcgtgaagt ttagccggtc cgccgatgca cctgcataca agcagggaca gaaccagctg 60
tataacgagc tgaatctggg ccggagagag gagtatgacg tgctggataa gaggagggga 120
cgcgaccccg agatgggagg caagcctcgg agaaagaacc cacaggaggg cctgtacaat 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tattctgaga tcggcatgaa gggagagagg 240
cgccggggca agggacacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac aaaggacacc 300
tatgatgccc tgcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 83
<211> 3018
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19/CD22 duoCAR
<400> 83
ggatccgcca ccatggcact acctgtcacg gcgttactgc tccccttggc gttactcctg 60
catgcggcga gacccgacat ccagatgaca cagactacat cctccctgtc tgcctctctg 120
ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagtaaata tttaaattgg 180
tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct accatacatc aagattacac 240
tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc tctcaccatt 300
agcaacctgg agcaagaaga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg 360
tacacgttcg gaggggggac caagctggag atcacaggcg gtggcggttc tggtggcggt 420
ggctcgggcg gtggtggctc ggaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggccaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag 840
aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 900
cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 960
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggaagagagg caggaagaag 1020
ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg agacccgtgc agaccacaca ggaggaggac 1080
ggctgcagct gtaggttccc agaggaggag gagggaggat gcgagctgcg cgtgaagttt 1140
agccggtccg ccgatgcacc tgcatacaag cagggacaga accagctgta taacgagctg 1200
aatctgggcc ggagagagga gtatgacgtg ctggataaga ggaggggacg cgaccccgag 1260
atgggaggca agcctcggag aaagaaccca caggagggcc tgtacaatga gctgcagaag 1320
gacaagatgg ccgaggccta ttctgagatc ggcatgaagg gagagaggcg ccggggcaag 1380
ggacacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacaa aggacaccta tgatgccctg 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgcgaattc ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 1500
aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg ccttaccagt gaccgccttg 1560
ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc gccaggccgg atgttgtggt gactcaaact 1620
ccactctccc tgcctgtcag ctttggagat caagtttcta tctcttgcag gtctagtcag 1680
agtcttgcaa acagttatgg gaacaccttt ttgtcttggt acctgcacaa gcctggccag 1740
tctccacagc tcctcatcta tgggatttcc aacagatttt ctggggtgcc agacaggttc 1800
actggcagtg gttcagggac agatttcaca ctcaagatca gcacaataaa gcctgaggac 1860
ttgggaatgt attactgctt acaaggtaca catcagccgt acacgttcgg aggggggacc 1920
aagctggaaa taaaacgtgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 1980
tctgaggtcc aactgcagca gtctgggact gtactggcaa ggcctggggc ttccgtgaag 2040
atgtcctgca aggcttctgg ctacaggttt accaactact ggattcactg ggtaaaacag 2100
aggcctgggc agggtctaga atggattggt ggtattaatc ctggaaataa ttatactacg 2160
tataagagga acttgaaggg caaggccaca ctgactgcag tcacatccgc cagcactgcc 2220
tacatggacc tcagcagcct gacaagtgag gactctgcgg tctattactg tacaagagag 2280
ggctatggta actacggggc ctggtttgct tactggggcc aggggactct ggtcaccgtc 2340
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 2400
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 2460
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 2520
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 2580
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 2640
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 2700
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 2760
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 2820
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 2880
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 2940
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 3000
gccctgcccc ctcgctaa 3018
<210> 84
<211> 3018
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22/CD19 duoCAR
<400> 84
ggatccgcca ccatggcact acctgtcacg gcgttactgc tccccttggc gttactcctg 60
catgcggcga gacccgatgt tgtggtgact caaactccac tctccctgcc tgtcagcttt 120
ggagatcaag tttctatctc ttgcaggtct agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180
acctttttgt cttggtacct gcacaagcct ggccagtctc cacagctcct catctatggg 240
atttccaaca gattttctgg ggtgccagac aggttcactg gcagtggttc agggacagat 300
ttcacactca agatcagcac aataaagcct gaggacttgg gaatgtatta ctgcttacaa 360
ggtacacatc agccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgtggcggt 420
ggcggttctg gtggcggtgg ctcgggcggt ggtggctcgg aggtccaact gcagcagtct 480
gggactgtac tggcaaggcc tggggcttcc gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac 540
aggtttacca actactggat tcactgggta aaacagaggc ctgggcaggg tctagaatgg 600
attggtggta ttaatcctgg aaataattat actacgtata agaggaactt gaagggcaag 660
gccacactga ctgcagtcac atccgccagc actgcctaca tggacctcag cagcctgaca 720
agtgaggact ctgcggtcta ttactgtaca agagagggct atggtaacta cggggcctgg 780
tttgcttact ggggccaggg gactctggtc accgtctcct caattgaagt tatgtatcct 840
cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac 900
ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt 960
ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1020
aggaagagag gcaggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gagacccgtg 1080
cagaccacac aggaggagga cggctgcagc tgtaggttcc cagaggagga ggagggagga 1140
tgcgagctgc gcgtgaagtt tagccggtcc gccgatgcac ctgcatacaa gcagggacag 1200
aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc cggagagagg agtatgacgt gctggataag 1260
aggaggggac gcgaccccga gatgggaggc aagcctcgga gaaagaaccc acaggagggc 1320
ctgtacaatg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct attctgagat cggcatgaag 1380
ggagagaggc gccggggcaa gggacacgat ggcctgtacc agggcctgag caccgccaca 1440
aaggacacct atgatgccct gcacatgcag gccctgcccc ctcgcgaatt cggaagcgga 1500
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg 1560
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 1620
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 1680
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 1740
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 1800
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 1860
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 1920
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 1980
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 2040
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 2100
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 2160
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 2220
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 2280
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 2340
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 2400
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 2460
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 2520
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 2580
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 2640
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 2700
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 2760
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 2820
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 2880
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 2940
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 3000
gccctgcccc ctcgctaa 3018

Claims (15)

1.核酸分子，其表达两种嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸分子包含编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第一非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列以及编码第二非抗原结合功能的结构域的核酸序列，
其中，所述非抗原结合功能的结构域包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含编码启动子的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含编码WPRE的核酸序列，所述编码WPRE的核酸序列位于编码所述非抗原结合功能的结构域的核酸序列的下游。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括编码骨架载体的核酸序列，所述编码骨架载体的核酸序列位于所述编码启动子的核酸序列的上游。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括病毒载体。
6.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述骨架载体包括HIV包装载体。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括5’LTR序列，所述5’LTR序列位于核酸分子的5’端。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括3’LTR序列，所述3’LTR序列位于核酸分子的3’端。
9.根据权利要求1所述的核酸分子，其从5’端到3’端为5’LTR、HIV包装载体、编码启动子的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第一抗原结合结构域的核酸序列、编码第一非抗原结合功能的结构域的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码引导肽的核酸序列、编码第二抗原结合结构域的核酸序列、编码第二非抗原结合功能的结构域的核酸序列、WPRE、以及3’LTR。
10.质粒，其包含权利要求1-9中任一项所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的质粒，其为病毒质粒。
12.细胞，其包含权利要求1-9中任一项所述的核酸分子，和/或权利要求10-11中任一项所述的质粒。
13.根据权利要求12所述的细胞，其包括选自下组的细胞：T细胞和NK细胞。
14.根据权利要求13所述的细胞，其表达2种不同的嵌合抗原受体。
15.权利要求1-9中任一项所述的核酸分子、或权利要求10-11中任一项所述的质粒在制备嵌合抗原受体中的应用。
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