CN116970083A - 结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段以及抗Trop2CAR和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段、编码所述结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及抗Trop2CAR、包含所述抗Trop2CAR的T细胞、NK细胞和巨噬细胞、CIK及其它免疫效应细胞。本发明还公开了用于产生抗体或抗原结合片段的方法，以及上述物质在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备抗Trop2阳性表达的肿瘤药物中的应用。

Description

结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段以及抗Trop2CAR和 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段以及抗Trop2 CAR和应用。

背景技术

在全球，恶性肿瘤是疾病相关死亡的主要原因，也是提高人类预期寿命的主要障碍。美国国家癌症中心提供了2020年全球癌症负担的最新信息，2020年，全球有约1930万新发癌症病例(1810万不包括非黑色素瘤皮肤癌)和近1000万癌症死亡病例(990万不包括非黑色素瘤皮肤癌)，预计2040年全球癌症负担将达到2840万例，比2020年增加47％。恶性肿瘤对人类生命健康是一个极大的威胁，对大多数恶性肿瘤患者，复发率居高不下，5年生存率始终处于较低水平。目前治疗恶性肿瘤的主要方法包括：手术切除、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗，而传统治疗方式如手术切除、化疗、放疗等手段通常只对早期肿瘤患者有效，且副作用大；小分子抑制剂类靶向药物仅对特定驱动基因突变的患者有显著治疗效果，如吉非替尼仅适用于EGFR突变的肺癌患者，而没有 EGFR突变的患者无法从中获益；近年来大热的癌症免疫疗法，如PDL1、PD1、CTLA4 等单克隆抗体类免疫检查点抑制剂，显著提高了黑色素瘤患者的5年生存率，但对于较为恶性的实体肿瘤如胰腺癌、肺癌等治疗效果仍不显著。因此迫切需要研发新的治疗手段，提高恶性实体瘤治疗的安全性和有效性。

CAR-T疗法是一种治疗恶性肿瘤的新兴精准靶向治疗，它通过基因工程的技术改造 T细胞，在T细胞表面表达包括scFv单链抗体、共刺激域等元件的嵌合抗原受体(CAR)，使其能够识别特定肿瘤抗原，从而有效杀伤抗原阳性的肿瘤细胞。已有的CAR-T治疗的成功应用主要集中于血液系统肿瘤领域包括急性B淋巴细胞白血病、大B细胞非霍奇金淋巴瘤和复发难治的CD19阳性恶性淋巴瘤。但是，CART疗法目前在实体瘤领域鲜有突破。主要是由于CART治疗实体瘤目前主要面临这来自三个方面的挑战：第一是肿瘤抗原的选择，大部分实体瘤治疗的靶点比如Her2、Mesothelin、Muc-1、GPC3、CEA等，都是肿瘤相关抗原(TAAs)，抗原蛋白相对于正常组织高表达，正常组织上可能表达了水平的抗原，其潜在的脱靶毒性大大限制了CART疗法在临床上应用于实体肿瘤，因此选择一个具有良好表达谱的抗原对CART的治疗至关重要。第二是免疫抑制的肿瘤微环境，实体肿瘤微环境中存在许多抑制性因素，比如TAM肿瘤相关巨噬细胞，Treg细胞及其分泌的IL-10等负调节细胞因子会促进肿瘤的侵袭和迁移，此外肿瘤细胞会高表达 CD47、PDL1，抑制免疫细胞。第三是CART细胞在肿瘤部位的浸润，实体肿瘤致密的细胞外基质导致CART细胞难以进入肿瘤发挥功能。第四是CART细胞的在体内维持时间较短。CART在实体瘤治疗领域的难题亟待解决。

根据肿瘤抗原特异性分类，可将肿瘤抗原分为肿瘤相关抗原TAA和肿瘤特异抗原TSA。肿瘤特异抗原(Tumorspecificantigen，TSA)“只”表达于肿瘤细胞，而不存在于任何处于不同发育阶段的正常细胞，是癌细胞基因突变累积产生的抗原(如Kras突变)，高度个体特异性；肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen，TAA)少量存在于正常细胞，高表达于肿瘤细胞(CD19、CD20、CD38、Her2)。

在这里，本发明研究一个特异性过表达于肿瘤组织而在正常组织低表达的肿瘤相关抗原Trop2，TROP2属于TACSTD家族，最先是被单克隆抗体GA733-1所鉴别而分离到的一种膜抗原，因此又被称为GA733-1。Trop2是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、表面标志物1(M1S1)。一般用小写字母+首字母大写表示蛋白或多肽(比如Trop2)，用大写字母表示基因或核苷酸片段(比如TROP2)。TROP2在多种恶性肿瘤中过表达，是一种与恶性肿瘤发生、侵袭和转移有关的癌基因，在大部分正常组织中的表达量较低，在多种恶性肿瘤中过表达。

目前以Trop2为靶点开展研究的企业有Immunomedics和第一三共研究进展较快。第一三共研发产品抗体偶联药物(ADC)Ds-1062，用于治疗非小细胞肺癌已经进入了I期临床实验，D_S-1062还在2020年7月与阿斯利康达成高达60亿美元的全球开发和商业化许可协议；Immunomedics的抗体偶联药物Trodelvy于2020年4月获批上市用于治疗三阴性乳腺癌，对于晚期NSCLC患者也有较好疗效，总体生存期提高到了9.5个月；国内云顶新耀2019年与Immunomedics公司达成独家许可协议，获得了其上市产品抗体偶联药物IMMU-132在大中华区、韩国及一些东南亚国家和地区的开发、注册和商业化权益，交易金额高达8.35亿美元；2020年4月，云顶新耀获得了IMMU-132的中国临床试验申请批准，并计划启动多个实体瘤适应症的临床研发项目。2021年复宏汉霖获Chiome独家许可研究、开发、生产及商业化针对人体TROP2靶点的抗体，逾1亿美元布局TROP-2 单抗。科伦药业ADC药物SKB-264，2019年获批开展临床，用于治疗实体瘤，已进入临床II期；百奥泰生物科技BAT8003，进入临床I期，治疗胃癌及乳腺癌；多禧生物的 DAC-002目前已获批进入临床试验阶段。目前以Trop2为靶点的药物多为抗体偶联药物。

Immunomedics以Trop2为靶点的ADC药物Trodelvy-Sacituzumab govitecan(IMMU-132)于2020年4月获批上市用于治疗三阴性乳腺癌，是全球首个获批的靶向人滋养层细胞表面抗原2(Trop2)的抗体偶联药物。2020年3月，IMMU132更新了针对三阴乳腺癌的临床数据：作为三线治疗方案，IMMU132的无进展生存率高达33.3％，疾病控制率高达45％，74％的患者至少出现过一次肿瘤缩小。IMMU132不仅对乳腺癌有惊人的疗效，也提高了肺癌患者的总体缓解率。2017年8月，Rebecca Suk Heist等人报导了 IMMU-132治疗44例非小细胞肺癌患者的临床实验结果，ORR率为19％，临床获益率 (complete response+partialresponse+stable disease≥4months)为43％，PFS为5.2months； 2017年5月，JhanelleE.Gray等人报道了IMMU-132治疗50例小细胞肺癌患者的临床实验结果，ORR率为14％，临床获益率(complete response+partial response+stable disease≥ 4months)为34％，PFS为3.7个月。IMMU-132对非小细胞肺癌NSCLC显示出较好的临床效果。

如上所述，靶向Trop2的ADC药物已有不少进入临床研究或者已经上市，然而对于靶向Trop2的嵌合抗原受体(CAR)修饰免疫细胞方面的研究还处于摸索阶段，其原因在于采用CAR-T治疗实体瘤存在前面所述的3个方面的挑战。

发明内容

为了解决CART治疗实体瘤的第一个难题，找到具有广泛表达谱的肿瘤相关抗原，本发明提供了一种结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，其包含：

a1)包含SEQ ID NO.3的VH CDR1、SEQ ID NO.4的VH CDR2和SEQ ID NO.5的 VHCDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.6的VL CDR1、SEQ ID NO.7的VL CDR2和 SEQ ID NO.8的VL CDR3的轻链可变区；或

a2)包含SEQ ID NO.9的VH CDR1、SEQ ID NO.10的VH CDR2和SEQ ID NO.11 的VHCDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.12的VL CDR1、SEQ ID NO.13的VL CDR2 和SEQ IDNO.14的VL CDR3的轻链可变区；或

a3)包含SEQ ID NO.15的VH CDR1、SEQ ID NO.16的VH CDR2和SEQ ID NO.11 的VHCDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.12的VL CDR1、SEQ ID NO.13的VL CDR2 和SEQ IDNO.14的VL CDR3的轻链可变区；

所述结合Trop2的抗体是多克隆抗体或抗Trop2单克隆抗体；

所述Trop2抗原结合片段是：

b1)单链Fv；或

b2)二硫键连接的Fv；或

b3)Fab片段；或

b4)F(ab’)片段；或

b5)一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；或

b6)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；或

b7)由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段。SEQ ID NO.7的序列为 LysAla Ser，虽然不足4个氨基酸残基，但是依然录入在序列表中。

在一些实施方案中，包含：包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段是单链抗体。

在一些实施方案中，所述结合Trop2的抗体是人源抗体、鼠源抗体或驼源抗体。

在一些实施方案中，所述结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段是全人源抗体或全人源抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过(G4S)3连接子连接。

在一些实施方案中，所述结合Trop2的抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述结合Trop2的抗体的重链恒定区CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述结合Trop2的抗体的重链恒定区CH2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述结合Trop2的抗体的重链恒定区CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

在一些实施方案中，所述结合Trop2的抗体的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述结合Trop2的抗体的轻链恒定区CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

第二方面，本发明还提供相关的核酸，其编码前面所述的结合Trop2的抗体或Trop2 抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述核酸包含编码重链可变区包含的核苷酸序列SEQ IDNO.21 和编码轻链可变区包含的核苷酸序列SEQ ID NO.22。

第三方面，本发明还提供相关的载体，其包含前面所述的核酸。

在一些实施方案中，所述载体为重组慢病毒载体；所述重组慢病毒载体含有Trop2scFv的核苷酸序列；所述抗Trop2 scFv为前面所述的Trop2抗原结合片段；所述Trop2 抗原结合片段为单链Fv。

第四方面，本发明还提供相关的宿主细胞，其包含前面所述的核酸或者所述前面的载体。

第五方面，本发明还提供用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其培养前面所述的宿主细胞并从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。

第六方面，本发明还提供一种抗Trop2 CAR，包含抗Trop2 scFv；所述抗Trop2scFv 为根据权利要求1所述的Trop2抗原结合片段；所述Trop2抗原结合片段为单链Fv。

在一些实施方案中，所述抗Trop2 CAR的结构为CD8 leader-抗Trop2 scFv-CD8Hinge-CD8 TM-共刺激结构域-胞内信号肽，包括依次串联的CD8 leader膜受体信号肽、抗Trop2 scFv、CD8 Hinge嵌合受体铰链区、CD8 TM嵌合受体跨膜区、共刺激结构域和胞内信号肽。

在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括但不限于选自CD28、OX40和4-1BB中的一种或多种。进一步地，所述胞内信号肽为CD3ζ。

在一些实施方案中，所述CAR结构包括但不局限于CD8 leader-抗Trop2 scFv-CD8Hinge-CD8 TM-共刺激结构域-胞内信号肽结构。

第七方面，本发明还提供相关的抗Trop2 CAR-T或抗Trop2 CAR-NK或抗Trop2CAR-M，其上修饰了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为前面所述的抗Trop2 CAR。

在一些实施方案中，所述抗Trop2 CAR-T中的T细胞包括但不限于αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、MAIT细胞、CIK细胞中的一种或多种。

第八方面，本发明还提供根据前面所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，或根据前面所述的核酸，或根据前面所述的载体，或根据前面所述的宿主细胞，或根据前面所述的抗Trop2 CAR，或根据前面所述的抗Trop2 CAR-T或抗Trop2 CAR-NK或抗 Trop2CAR-M在制备抗肿瘤药物中的应用。

在一些实施方案中，所述肿瘤能表达Trop2。

在一些实施方案中，所述肿瘤为Trop2阳性表达的实体瘤。

在一些实施方案中，所述肿瘤能表达Trop2；所述肿瘤包括但不限于胰腺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和口腔鳞状细胞癌中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌，所述肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌。

如本文所用，术语“结合Trop2的抗体”除非在具体实施时特别指明为某一来源的抗体外，应理解为可以是其他来源的抗体，比如可以是人抗体、人源化抗体、鼠源化抗体、或其他来源的抗体。

如本文所用，术语“抗Trop2 CAR-T”中的T细胞除非在具体实施时特别指明为某一类的T细胞外，应理解为是广义上的T细胞，即包括但不限于αβT细胞和/或γδT 细胞，还包括一些非典型T细胞，例如自然杀伤T(NKT)细胞、粘膜相关不变T(MucosalAssociatedInvariant T,MAIT)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK) 等。这些非典型T细胞也作为T淋巴细胞的效应类型。T细胞的来源也不限于外周血，包括脐带血、干细胞、IPSC、细胞系等分化诱导转化而来的细胞，及其T细胞分化而成的其他的细胞类型。αβT和γδT细胞是根据TCR类型不同对典型T细胞的分类。

如本文所用，术语“宿主细胞”应从广义上来理解，可以是原核细胞或真核细胞；可以是本领域已知的任何适宜宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。

如本文所用，术语“全人源抗体”，其恒定区及可变区均来自于人类(鼠源成分0％，100％人源)。全人源抗体可通过噬菌体、酵母、核糖体等展示技术，及单细胞PCR全人源单克隆抗体技术等获得。本文具体实施方式中的抗Trop2抗体是通过噬菌体展示技术从全人源scFv抗体库筛选得到的全人源抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”或“IgG”由重链和轻链组成，轻链由轻链的可变区(VL)和轻链的恒定区(CL)组成；重链由重链的可变区(VH)、重链的恒定区1(CH1)结构域组成、重链的恒定区2(CH2)、重链的恒定区3(CH3)组成，可与抗原特异性结合。是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变区”或“variable region”或“V区”，氨基酸的组成和序列多变，重链和轻链可变区均包括3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和4个框架区 (FR1、FR2、FR3、FR4)。

如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”，CDR区高度可变，参与抗原结合部位的组成。

如本文所用，术语“恒定区”或“constant region”或“C区”，恒定区，氨基酸组成和顺序相对稳定，重链链和轻链的恒定区分别称为CH和CL。

如本文所用，术语“抗体重链”，由重链的可变区(VH)、重链的恒定区1(CH1) 结构域组成、重链的恒定区2(CH2)、重链的恒定区3(CH3)结构域组成，可与抗原结合。

如本文所用，术语“抗体轻链”，由轻链的可变区(VH)、轻链的恒定区(CL)组成结构域组成，可与抗原结合。根据免疫球蛋白轻链C区抗原特异性的不同，可分为κ或λ型。决定Ig型的抗原特异性差异决定于轻链的恒定区CL的氨基酸组成、排列和空间构型的不同，分为κ或λ两型。本发明中的抗Trop2单克隆抗体轻链为κ型。

如本文所用，术语“单链可变片段”(single-chain fragment variable，scFv)由轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH)以及linker组成，可与抗原结合。

如本文所用，术语“Fc区”(fragment crystallizable，Fc)由IgG恒定区CH2、CH3结构域及铰链区组成。

本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“医治”可以互换使用。术语“治疗”包括控制疾病、病症、病况的进展和相关症状，优选减少疾病、病症、病况或减轻疾病、病症、病况的一种或多种症状的影响。此术语包括治愈疾病或完全消除症状。此术语包括症状得到缓解。此术语还包括但不限于非治愈性的姑息性治疗。术语“治疗”包括给受试者施用治疗有效量的包含本发明的重组蛋白或融合蛋白的药物组合物，以预防或延迟、减轻或缓解疾病、病症、病况的进展或疾病、病症、病况的一种或多种症状的影响。

如本文所用，术语“NCG小鼠”(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc em26Il2rg em26/Gpt，品系类型KnoCL out，品系编号T001475，背景NOD/ShiltJGpt)，缺失成熟T、B、NK细胞，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义；受制于动物模型的缺乏，目前 CAR治疗领域大部分采用免疫缺陷的小鼠进行体内实验。

本发明通过对多个实体瘤癌细胞系的流式鉴定，发现Trop2在多个恶性实体瘤细胞系中过表达，可作为治疗实体瘤的新靶点。本发明公开的结合Trop2的抗体、抗Trop2scFv 以及其他Trop2抗原结合片段能够与Trop2特异性结合发挥细胞杀死作用。

相比于靶向Trop2的ADC药物，本发明采用抗Trop2 CAR修饰免疫细胞的优点在于：T细胞作为活药，接收抗原刺激后该细胞可以在体内扩增，因此其持久性、持续作用时间更长；CART细胞接收靶细胞刺激后可以释放颗粒酶、穿孔素、IFN-γ等各种促凋亡细胞因子，因此其抗肿瘤效果更佳；T细胞表面有多种趋化因子受体如CCR2、CCR4等可以对肿瘤组织有相应的趋化作用，因此靶向性更好；此外采用人自身的T细胞对其进行基因工程改造后再回去给原供者，机体不会产生免疫排斥反应，若体内无抗原刺激，CART 细胞不会行使功能，而ADC药物偶联了高活性的细胞毒性药物，若在非肿瘤部位释放毒性药物，可能会产生严重的毒副作用，因此抗Trop2 CAR修饰免疫细胞其安全性相对较高；且相比于CART细胞，ADC药物体内半衰期短，患者易复发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是通过噬菌体酶联免疫吸附法(Phage ELISA)筛选抗Trop2噬菌体抗体，图1为OD450读数结果。

图2是纯化后T3单克隆抗体SDS-PAGE电泳图，2个泳道分别为：M-Marker,T3- 抗Trop2单克隆抗体。

图3是酶联免疫吸附测定法(ELISA)鉴定Trop2抗体与抗原的亲和力。其中，NC 为阴性对照，是不与Trop2-His抗原结合的无关抗体。

图4是流式鉴定抗体与细胞表面抗原的结合。其中，T3:是T3单克隆抗体与待检测细胞共孵育。Blank:是不加任何抗体的待检测细胞，作为空白对照。

图5是一个具体实施方式中抗Trop2 CAR-T细胞及抗CD19 CAR-T细胞的CAR的结构示意图。a为抗Trop2 CAR；b为抗CD19 CAR。

图6是D7和D17 CAR-T细胞的转导效率，转导效率检测使用FITC-Protein L检测。坐标中的SSC-H表示侧向散射通道；CAR-FITC-H表示FITC通道。

图7是抗Trop2 CAR-T细胞在体外对不同实体瘤细胞系的LDH杀伤情况。

图8是抗Trop2 CAR-T细胞在体外与不同实体瘤细胞系共孵育细胞因子释放水平。其中，T-Blank指空白抗Trop2 CAR-T细胞，不加靶细胞组；T-A549指抗Trop2 CAR-T 与A549(Trop2表达阴性)细胞共孵育；T-MDA-MB-231指抗Trop2 CAR-T与 MDA-MB-231(Trop2表达阳性)细胞共孵育；T-Bxpc3指抗Trop2 CAR-T与Bxpc3(Trop2 表达阳性性)细胞共孵育；C-Blank指空白抗CD19 CAR-T细胞，不加靶细胞组；C-A549 指抗CD19 CAR-T与A549(Trop2表达阴性)细胞共孵育；C-MDA-MB-231指抗CD19 CAR-T与MDA-MB-231(Trop2表达阳性)细胞共孵育；C-Bxpc3指抗CD19 CAR-T与 Bxpc3(Trop2表达阳性性)细胞共孵育。共孵育比例为效应细胞：靶细胞＝5：1。共孵育24h 后检测取上清，通过流式细胞仪使用CBA试剂盒检测上清中细胞因子含量。

图9是抗Trop2 CAR-T细胞在体内特异性杀伤MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞，显著抑制肿瘤生长。其中，a为肿瘤体积曲线，b为小鼠体重变化曲线。

图10是抗Trop2 CAR-T细胞在体内特异性杀伤H1975肺癌细胞，显著抑制肿瘤生长。其中，a为肿瘤体积曲线，b为小鼠体重变化曲线。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

本发明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列信息见附表说明

附表说明

表1噬菌体展示筛选得到的T3阳性克隆的轻链、重链可变区氨基酸序列

序列名称	编号
		T3-VH	SEQ ID NO.1
T3-VL	SEQ ID NO.2

表2 T3单克隆重链、轻链可变区CDR区(互补决定区)氨基酸序列

表3 T3单克隆抗体恒定区氨基酸序列

序列名称	编号
		T3-CH1	SEQ ID NO.17
T3-CH2	SEQ ID NO.18
		T3-CH3	SEQ ID NO.19
T3-CL	SEQ ID NO.20

表4 T3克隆重链、轻链可变区核苷酸序列

序列名称	编号
		T3-VH	SEQ ID NO.21
T3-VL	SEQ ID NO.22

表5重链、轻链表达载体核苷酸序列

序列名称	编号
		重链载体PUT-VH全序列	SEQ ID NO.23
轻链载体PUT-VL全序列	SEQ ID NO.24

表6抗Trop2 CAR氨基酸序列

序列名称	编号
		CD8 leader	SEQ ID NO.25
T3抗Trop2 scFv	SEQ ID NO.26
		CD8 Hinge	SEQ ID NO.27
CD8 TM跨膜区	SEQ ID NO.28
		41BB共刺激域	SEQ ID NO.29
CD3ζ	SEQ ID NO.30

表7抗Trop2 CAR核苷酸序列

实施例1抗Trop2噬菌体抗体的筛选

噬菌体抗体库是用PCR技术从健康人B淋巴细胞中扩增出抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，把scFv段表达在噬菌体表面，构建形成的噬菌体抗体库。本发明全人源scFv噬菌体抗体库，来自上海优卡迪生物医药公司，使用噬菌体展示技术对全人源 scFv抗体库进行抗Trop2抗体的筛选；带有His标签的人滋养层细胞表面抗原2(Trop2) 胞外段蛋白即Human TROP-2/TACSTD2 Protein，His Tag，来自ACRO(货号TR2-H5223)，用于抗Trop2特异性抗体的筛选；大肠杆菌Tg1(E.coli Tg1，来自厂商Lucigen，货号 60502-2)；胰酶(trypsin，货号与规格T1426-250mg)，来自Sigma-Aldrich；M13KO7 Helper Phage(M13KO7辅助噬菌体)，来自NEB，货号N0315S；Mouse Anti-M13 antibody(HRP)，来自NBbiolab，货号S004H-250ul；TMB来自eBioscience；96孔ELISA板来自Costar 公司(货号3590)。

2×YT培养基配方：胰蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L；烧杯中放部分双蒸水，将上述比例蛋白胨、酵母粉、氯化钠称量好倒入，搅拌至重复溶解，清澈。将称好的琼脂粉放入锥形瓶，倒入培养液，封口膜封口后用高压灭菌器121摄氏度灭菌20分钟。待冷却至55摄氏度以下加入相应抗生素。

2×YTA琼脂培养平板：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠8g/L，琼脂粉15g/L。固体培养基倒平板,烧杯中放部分双蒸水，将上述比例蛋白胨、酵母粉、氯化钠称量好倒入，搅拌至重复溶解，清澈。将称好的琼脂粉放入锥形瓶，倒入培养液，封口膜封口，高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌冷却至55℃左右(手背耐受)再加入抗生素，以免温度过高使抗生素失活。按1：1000比例加氨苄，如400ml培养基加400μl氨苄。温度太高会导致抗生素活性下降或失活，绝大多数抗生素不耐高温。倒平板时，避免气泡，并使多个平皿叠在一起，以免平皿盖太冷，凝结过多的水滴。待琼脂完全凝固后倒置，先在室温下放置一天，以避免过早放在4℃下保存(过早于37℃培养后，常有水滴使细菌菌落融合。)置于超净台过夜后收入冰箱，注意冰箱无菌。

氨苄青霉素配制(Ampicillin，来自生工生物，货号A610028-0025)：100mg/ml，100mg 氨苄青霉素溶于1m无菌水中，0.22um微孔滤膜过滤灭菌，贮存于4℃备用。

PEG/NaCl溶液配制：20％PEG8000，2.5M Nacl stoCL，具体配方为：NaCl 73.1g，PEG8000(来自生工生物，A100159-0500)100g，双蒸水500ml，配制好之后高压蒸汽灭菌，100kPa，121℃，20min，混匀。

噬菌体展示技术(phage display technology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。本发明使用噬菌体展示技术进行抗Trop2抗体的固相筛选。

筛选步骤为：包被10μg/ml的Trop2-His蛋白(0.2ug/ul)在96孔ELISA板上，封口膜封板，4℃过夜。除去ELISA板上的抗原溶液，用PBS洗涤3次后(用枪吸出，倒出可能有污染)，加入MPBS室温封闭1小时后吸出，同时用100ulMPBS(2％脱脂牛奶)封闭100ul噬菌体抗体库，室温下封闭1小时；将封闭好的噬菌体库200ul加入含抗原的孔中，室温下孵育1小时。除去噬菌体溶液，用PBST(0.1％Tween)洗涤ELSIA板14次，然后用PBS洗2次；加入250μltrypsin(100ul+900ul 1xPBS)室温下放置15分钟后吸出洗脱液，转移到1.5mlEP管，再加250ul胰酶消化15min，第二次消化的时候要吹匀，吸取干净，消化下来的体积一共500ul，转移到EP管。取10ul洗脱下来的phage用2YT 进行10倍梯度稀释，10^2、10^4、10^6、10^7、10^8、10^9倍稀释，10^7、10^8、10^9 稀释后的phage取100ul加200ul OD600＝0.5的TG1，检测滴度。另取250ul洗脱下来的 phage侵染3ml OD600＝0.5的TG1大肠杆菌，加Helper phage后混匀，37℃水浴30min，按10^2、10^4、10^5倍梯度稀释菌液，取200ul涂75mm2YTA板,检测output的滴度。剩余菌液3500rpm离心5min，弃去部分上清后涂150mm 2YT板(要扩增phage),标记 Output 10^2、10^4、10^5 37℃培养箱培养过夜。剩余洗脱的噬菌体保存于4℃。刮板，用2YTA培养基刮板，取约150ul刮板菌加到25ml 2YT Amp 2％glucose培养基中，220r 摇30min到达对数生长期。剩余刮板菌用50％甘油保菌，冻在-20℃冰箱。摇30min到对数期后加100ul Helper phage(1x1012 pfu/ml)，加辅助噬菌体后37℃水浴30min，然后 37℃220r，摇1h。3500rpm,10min，换2YT卡纳氨苄双抗培养基50ml，置于125ml锥形瓶，30℃，220r培养过夜。将125ml锥形瓶里的50ml培养基分成两个离心管离心，25ml 一管，8000g，10min，保留上清液。按离心后上清体积的1/3或1/4加PEG-NaCl，沉淀噬菌体，充分混匀后，冰上静置1h。10000rpm，4℃，离心10min,mark笔圈出离心后的白色沉淀，弃去上清，注意沉淀易漂不能倒出，再离心10000rpm，离心1min，400ul 1 ×PBS重悬沉淀，冲洗干净后，转移至1.5ml EP管，12000g,离心5min,沉淀为其他杂质弃去，两管上清合并转移到1.5ml EP管，此为第1轮筛选得到的input，200ul用于下一轮筛选，剩余Input储存于4℃冰箱。重复以上筛选步骤，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”，富集筛选，然后进行phage ELISA筛选鉴定阳性单克隆。

Phage ELISA(噬菌体ELISA)步骤：第4轮筛选得到的Output噬菌体抗体库，经梯度稀释后，侵染200ul对数期Ecoli.Tg1，涂2YTA平板(Amp浓度100mg/ml)，37℃培养过夜。2块96深孔板，每孔加300ul 2YTGA(1％Glucose，100mg/ml氨苄青霉素)，配制60ml 2YTAG，从最后一轮筛选的平板上随机挑92个克隆加到深孔板中，余2个TG1 对照2个2YTA对照，排枪吹打，37℃摇3.5-4h。用96孔细胞培养板保菌，从96深孔板中取100ul菌加100ul 50％甘油保菌，存于-20℃。取50ul Helper phage加到3.3ml 2YT 无抗培养基混匀，然后一块深孔板每孔加30ul加了helper phage的培养基,伸到液面下，加完混匀。37℃培养箱放置30分钟。37℃220转1小时。深孔板每个孔补400ul 2YT AMP+KANA+培养基(氨苄卡纳双抗)，每孔终体积600ul，30℃220r培养过夜。抗原包被，一块96孔ELISA包被抗原Trop2-His，一块96孔ELISA板包被抗原牛血清白蛋白(BSA，用于检测非特异性结合)，1ug/ml，4℃过夜。ELISA鉴定：第二天取出培养phage的96 深孔板静置，静置，菌体沉淀，取上清。将包被抗原4℃过夜的96孔ELISA板，每孔使用200ul 2％脱脂牛奶封闭，1h，PBST洗3次。ELISA板牛奶封闭期间，取Phage上清 120ul加120ul 2％脱脂牛奶，使用稀释板封闭phage上清，封闭结束后对应加上清作为一抗，深孔板与96孔ELISA板所加上清一一对应，100ul/孔，孵育1.5h，PBST洗6次。加anti M13-HRP(抗M13噬菌体)使用2％脱脂牛奶按1:5000稀释，100ul/孔，孵育1h。 TMB100ul/孔，显色10分钟。2M H2SO4 100ul/孔，终止显色，酶标仪读数OD450nm，阴性标准为OD450<0.2。挑选Phage ELISA结果显示的阳性克隆，送生工生物有限公司进行测序，鉴定阳性克隆序列的多样性。

酶联免疫吸附法筛选抗Trop2噬菌体抗体鉴定得到5个阳性克隆(图1)，分别为：抗Trop2阳性克隆1(T1)、抗Trop2阳性克隆2(T2)、抗Trop2阳性克隆3(T3)、抗 Trop2阳性克隆4(T4)、抗Trop2阳性克隆5(T5)。这5个阳性克隆与Trop2抗原均显示特异性结合，其中T3的结合活性较强，T3单克隆的重链可变区VH、轻链可变区VL 氨基酸序列见表1(T3-VH SEQ IDNO.1和T3-VL SEQ ID NO.2)，T3单克隆的重链可变区VH、轻链可变区VL的核苷酸序列见表4(T3-VH SEQ ID NO.21和T3-VL SEQ ID NO.22)。本发明中选择结合活性较高的T3单克隆进行后续实验。

实施例2抗Trop2抗体的鉴定

Trop2抗原来源同实施例1，质粒DNA小抽试剂盒来自康宁；大肠杆菌Top10感受态来自天根生化科技有限公司；HRP标记anti-Fc抗体来自Bethyl；TMB来自eBioscience；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒来自碧云天；Protein A蛋白纯化预装柱来自Yeasen(翌圣)。

DMEM来自Gibco；Mouse anti-human IgG-Fc(HRP)来自Bethyl；PE anti-human Fcantibody来自Biolegend；BxPC-3胰腺癌细胞系、MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系、 H1975非小细胞肺癌细胞系来自上海中科院；重链表达载体PUT-VH和轻链表达载体 PUT-VL来自优卡迪，核苷酸序列见表5(如SEQ ID NO.23所示重链载体PUT-VH全序列，如SEQ ID NO.24所示轻链载体PUT-VL全序列)。

将阳性T3单克隆scFv段的重链可变区VH段构建至重链表达载体PUT-VH(核苷酸序列见表5)得到T3 VH重链质粒；将T3单克隆中scFv的轻链可变区VL段构建至轻链表达载体PUT-VL(核苷酸序列见表5)得到T3 VL轻链质粒。将T3 VH质粒和 T3 VL质粒分别通过钙转化转入E.coli.Top10(TOP10大肠杆菌)中，挑单克隆扩大培养后进行质粒抽提。将抽提的质粒(T3 VH质粒和T3 VL质粒按1:1加入)使用氯化钙转染法共转染293T细胞，收集上清，过Protein A蛋白纯化柱进行纯化。鉴定单克隆抗体主要须鉴定单克隆抗体的分子量及其与抗原在蛋白水平和细胞水平的结合活性。通过 SDS-PAGE判断单克隆抗体的分子量是否正确，通过ELISA和流式检测抗原抗体的结合。

SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤：1)、准备凝胶；a)洗板：擦洗二块玻璃板，再用酒精将板擦干。b)配板：二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。加去离子水检测是否有漏液。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置 (浓缩胶)。c)灌胶，使用PAGE凝胶快速制备试剂盒制备制胶流程1.5mm胶：1.取等体积下层胶溶液和下层胶缓冲液，各4mL，混匀；2.向步骤1的混合溶液中加入80μL 的改良型促凝剂(硫酸铵)，混匀；3.将步骤2的混合溶液全部注入制胶玻璃板中，跟画线位置不要相差太远，留出浓缩胶的空间即可，等几分钟5min后加适量水，加2ml水把分离胶往下压，水和胶之间有折线出现说明已经凝固；4.倒去上层水，滤纸吸干；5.取等体积上层胶溶液和彩色上层胶缓冲液各1mL，混匀；使用前请摇匀。6.向步骤5的混合溶液中加入20μL的改良型促凝剂，混匀；7.将步骤6的混合溶液注入制胶玻璃板中。 8.待上层胶凝固后(10至15min)，拔去梳齿即可用于电泳。9)上样电泳：10ul蛋白按1:1加10ul 2×loading buffer，100℃沸水浴10min,12000离心1min，SDS-PAGE凝胶中共上样20ul，在浓缩胶90v的电压跑。到分离胶用120v电压跑,电泳时间约2h。2)、考马斯亮蓝染色30min，开始脱色：a.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。b.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色 1小时。c.倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。d.加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。脱色液配方为：40％乙醇，10％乙酸，50％蒸馏水。e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。蛋白条带在脱色1-2小时后出现。f.完成脱色后，把凝胶保存在水中，用于后续拍照。

ELISA鉴定抗体与Trop2抗原亲和力步骤：1)以1ug/ml的浓度包被Trop2-His抗原于96孔ELISA板，封口膜封板，4℃过夜。2)ELISA板包被抗原过夜后,0.05％PBST洗一次，脱脂奶粉封闭1h,期间稀释一抗。3)将一抗使用2％脱脂牛奶进行3.3倍梯度稀释, 起始浓度为5ug/ml，共计12个一抗浓度。4)ELISA板封闭结束后，加一抗，100ul/孔，一抗加完孵育1小时。5)0.05％PBST洗6次。6)使用2％脱脂牛奶按1：1000比例加二抗Mouse anti-human IgG-Fc(HRP)，100ul/孔，孵育1h。7)0.05％PBST洗6次。8)100ul/ 孔TMB显色加100ul，显色10分钟，颜色过深可终止。9)硫酸(2M)每孔100ul，终止显色反应。10)酶标仪进行光度测量(450nm)。

流式检测筛选所得T3抗Trop2单克隆抗体的与细胞表面Trop2结合,检测步骤：1.用预冷的1×PBS稀释抗体至终浓度5ug/ml，终体积200ul。2.消化待检细胞，用培养基将待检测细胞的密度调为1×10⁶cells/ml，每管加入1ml细胞悬液(视细胞量而定)，4℃离心弃上清。3.用1mL预冷的1XPBS，1500rpm 5min洗涤一次。4.各加200uL稀释好的一抗(T3单克隆抗体)重悬细胞，置于冰上60min。5.离心弃上清，用1mL预冷的1× PBS，1200rpm 5min洗涤一次。6.用预冷的含5％BSA的1×PBS按稀释二抗，每管加1ul 二抗anti-Fc(PE)重悬细胞，置于冰上30min。8.用1mL预冷的1XPBS，1500rpm 5min洗涤一次。9.用200ul预冷1XPBS重悬细胞，上机检测。

经AKTA过ProteinA纯化柱纯化得到的上清液通过SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE电泳结果(图2)显示，上清液中T3单克隆抗体重链及轻链分子量大小与预期相符(图 2)。将T3单克隆抗体进行梯度稀释后，ELISA检测抗体与Trop2抗原的结合，结果如图 3所示，显示筛选得到的抗体以高活性特异性结合Trop2抗原(图3)，NC为阴性抗体对照，阴性抗体为抗人CD7抗体，来自优卡迪，抗体编号为PUT644，可通过专利 CN113603778A记载的方法获得。

再经流式鉴定抗体与细胞表面Trop2抗原的结合，图4中Blank组为不加抗体的空白细胞，T3组显示T3单克隆抗体与细胞的结合情况。显示Trop2抗体与3个实体瘤细胞系：三阴性乳腺癌MDA-MB-231、非小细胞肺癌、H1975胰腺癌Bxpc3均具有较强的结合，结合强度可以通过中位荧光强度MFI(Median fluorescence intensity)表征，Flowjo 分析所得每组的MFI分别为：H1975与T3结合的MFI为65580(621)，MDA-MB-231 与T3结合的MFI为3150(938)，Bxpc3与T3结合的MFI为174408(557)，括号中的数值为相应Blank空白细胞对应的MFI。

胰腺癌Bxpc3、三阴性乳腺癌MDA-MB-231、非小细胞肺癌H1975均具有较强的结合(图4)，显示本发明筛选到的Trop2抗体可结合细胞表面表达的Trop2抗原，且具有较高的结合强度。

越来越多的研究人员关注于抗体的制备，目前杂交瘤抗体技术已经较为完善，也有很多的鼠源单克隆抗体药物已经应用于临床，但是鼠源单克隆抗体药物存在免疫原性，这大大的局限了发展前景。本发明筛选所得到的抗体是通过噬菌体展示技术筛选所得的全人源抗体，与传统的通过免疫动物所得的抗体相比，全人源抗体具有较低的免疫原性，是未来主要的发展方向。

单链可变片段(scFv)由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过肽链连接在一起组成，肿瘤特异性的scFv的产生以及其亲和力是CAR-T细胞治疗安全有效性的基础。目前构建scFv主要有杂交瘤细系和噬菌体展示两种技术，对应抗体种类为100％鼠源抗体到100％人源抗体。鼠源抗体，其鼠源单抗指恒定区和可变区序列均来自小鼠基因的单克隆抗体，其鼠源成分达到100％；鼠源单抗制备仰赖于杂交瘤技术。即将小鼠暴露于特定抗原之下，随后筛选并提取其体内产生抗体的B淋巴细胞；而后将该类细胞与不能产生抗体的小鼠骨髓瘤细胞融合，继而筛选出不会凋亡，能无限增殖，亦能分泌特定抗体的鼠杂交融合细胞；鼠源抗体主要有两个优点，1)做为第一代单抗，基础研究、制备技术已较为完善透彻，成本相对较低；2)杂交瘤技术的成熟使得鼠源抗体可以保证不同批次的质量完全相同，且更加易于复制。但也具有很大的局限性，一方面，鼠源单抗具有较强的免疫原性，易引发HAMA反应(即鼠源抗体本身被人体免疫系统视为抗原，引起不必要的免疫反应)，轻则加速抗体被人体内被清除、缩短半衰期进而影响疗效，重则引发严重免疫疾病；另一方面，鼠源抗体的恒定区与人类恒定区序列不同，引发的后继免疫反应因而更弱。上述两方面缺点导致鼠源抗体现已基本在临床应用中被淘汰，但仍由于其低廉成本而广泛运用于实验室环境中。也一并促使了后继第二，第三代人源化单抗的出现。

人源抗体可根据人源比例和部位不同可进一步细分为三大类。人鼠嵌合单抗的恒定区来自人类，可变区来自小鼠(鼠源成分～30％)；人源化单抗的恒定区来自人类，可变区为人鼠序列结合(鼠源成分～10％)；全人源单抗的恒定区及可变区均来自于人类(鼠源成分0％)。人源抗体与鼠源抗体相比，人源抗体总体更优。主要体现在1)全人源抗体有效地减弱了人抗鼠抗体反应，降低免疫原性的同时也降低了毒副作用；2)其不易被免疫系统自识别的特性极大地延长了体内留存时间。

本发明通过噬菌体展示技术筛选所得单链可变片段scFv为100％人源抗体，鼠源成分0％。人源抗体、鼠源抗体特点及优劣势在CAR-T疗法中进一步放大，人源抗体在CART细胞免疫治疗应用中的优势主要体现在一下三个方面：

第一，人源抗体疗效更为稳健：目前临床试验中构建CAR的胞外scFv多为鼠源性单抗，但CAR结构中鼠源scFv特定结合抗原的免疫表位引起的HLA抗原T细胞介导的免疫反应，一方面会阻碍CAR与靶抗原之间的相互作用以抑制CAR-T细胞的功能，一方面也会影响细胞的活化、扩增、甚至导致CAR-T细胞在患者体内的失活；而人源化scFv 可通过降低CAR的免疫原性发挥疗效稳定性更高。

第二，人源抗体可有效延长复发时间：经CAR-T治疗后，CAR-T的耗尽、肿瘤微环境的改变等因素都可能导致疾病复发，鼠源抗体高免疫原性激发的HAMA会缩短其在人体内的半衰期，从而可能会缩短疾病复发时间。

第三，鼠源抗体二次治疗效果减弱：以CD19为靶点的肿瘤，首次采用鼠源CAR-T 治疗并复发后，再次使用鼠源CAR-T疗效减弱，高免疫原性可能会引发体内产生抗鼠源抗原抗体，表现为耐药性，此时二次治疗采用人源化、全人源CAR-T可得到有效缓解。

下面的实施例将从CAR及CAR-T方面，证明采用本发明筛选到的Trop2抗体制备的嵌合抗原受体(抗Trop2 CAR)以及修饰有该嵌合抗原受体的T细胞(抗Trop2 CAR-T) 的制备过程，对不同靶细胞的LDH杀伤和细胞因子释放作用，以及通过动物体内实验证明抗Trop2 CAR-T在体内特异性杀伤非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌细胞异种移植肿瘤作用。然而这并不意味着本发明筛选到的Trop2抗体只能用于制备嵌合抗原受体以及修饰有该嵌合抗原受体的T细胞，其本身作为结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，以及编码它的核酸，含有该核酸的载体，以及含有该核酸或载体的宿主细胞，都具有非常大的生物学价值。限于篇幅，这里重点例举了CAR及CAR-T方面的研究数据。

实施例3抗Trop2 CAR的构建及慢病毒的包装

慢病毒骨架质粒载体为PSB1819，来自优卡迪；pPac-R、pPac-GP和pEnv-G均来自优卡迪；DMEM培养基来自Gibco；TOP10感受态来自天根生物有限公司。

将实施例1筛选得到的抗Trop2阳性克隆3的scFv段通过无缝克隆进慢病毒骨架质粒载体PSB1819(来自优卡迪)中得到目的质粒，转化TOP10大肠杆菌，测序鉴定后扩大培养，进行质粒中抽，质粒抽提结束后，使用目的质粒以及慢病毒包装质粒pPac-R(来自优卡迪)、慢病毒包装质粒pPac-GP(来自优卡迪)和慢病毒包装质粒pEnv-G(来自优卡迪)对293T细胞进行转染。

用10cm培养皿对待转染的293T细胞进行铺板，待细胞密度达到70％左右，进行慢病毒包装，步骤如下：取出293T细胞观察细胞状态，共计10皿293T细胞，若细胞状态良好，细胞汇合度80％-90％之间，则弃去培养基重新缓慢加入4％DMEM完全培养基9 mL。在15mL离心管中加入2500ul CaCl2、3种包装质粒(80ug pPac-R、100g pPac-GP、 60g pEnv-G)和220ug目的质粒Trop2 CAR，随即补加细菌内毒素检查用水至5000ul，加入5000ul HBS，添加完毕后持续震荡20s左右。培养箱中取出293T细胞，每皿细胞加入混合的转染试剂1mL，轻轻摇晃混合均匀，放置培养箱中。转染6h后弃去培养上清，加入10mL 4％DMEM完全培养基。转染24h后继续补加10mL 4％DMEM完全培养基。在培养的24小时、48小时以及72小时收集病毒上清于4℃进行保存，待病毒上清收集完毕，使用0.45um滤器对病毒上清进行过滤，滤去细胞的残渣之后加入聚乙二醇 8000(PEG8000)对病毒进行浓缩，4℃孵育12小时，之后离心3000rpm，15分钟，离心后弃去上清，并加入适量的无菌PBS溶解病毒沉淀，将溶解的病毒进行分装并保存于 -80℃冰箱，得到重组慢病毒载体。该重组慢病毒载体含有抗Trop2 CAR的编码核酸片段。

抗Trop2 CAR-T细胞及抗CD19 CAR-T细胞的CAR的构建如图5。抗Trop2 CAR 的编码片段为CD8 leader-抗Trop2 scFv-CD8 Hinge-CD8 TM-41BB共刺激结构域-CD3ζ胞内信号肽的编码片段，表6和表7示出了各片段分别的氨基酸序列和核苷酸序列。其中，抗Trop2scFv由于是来自T3克隆，故在表6和7中表示为T3抗Trop2 scFv。

实施例4抗Trop2 CAR-T细胞的制备及表征

CD4/CD8磁珠，CD3抗体，CD28抗体均来自美天旎；IL-2来自Peprotech；A-IMV 培养基来自Gibco；FITC-Protein L蛋白来自Biolegend。

使用CD4和CD8磁珠从人外周血单个核细胞中分离CD4⁺CD8⁺T细胞，放入包被有 CD3抗体CD28抗体的T25瓶中激活24h，T细胞完全激活后按MOI＝120加入实施例2 制备好的重组慢病毒载体，感染48h后，PBS洗2次，更换新的完全培养基重悬，然后使用流式细胞仪通过FITC-Protein L蛋白检测慢病毒转染T细胞的转染效率。Protein L 是一种免疫球蛋白结合蛋白，可与免疫球蛋白轻链特异性结合。

抗Trop2 CAR-T细胞及抗CD19 CAR-T细胞的CAR的构建如图5。慢病毒转染T 细胞后，分别在第7天(D7)和第17天(D17)与ProteinL-FITC共孵育后通过流式细胞仪检测感染效率，感染效率均在40％以上(图6)。其中，T细胞激活当天为第0天(D0)，激活24h后进行转染，加慢病毒转染T细胞当天为第1天(D1)。

实施例5抗Trop2 CAR-T细胞对不同靶细胞的LDH杀伤及细胞因子释放检测

LDH杀伤试剂盒来源：CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega，货号REF：G1782；A-IMV培养基来自Gibco；A549(Trop2阴性)来自上海中国科学院细胞库；过表达CD19的髓系白血病细胞株K562-CD19(来自上海优卡迪)。

乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测效应细胞(这里为抗Trop2 CAR-T细胞)对靶细胞的杀伤效率。按照试剂盒说明书进行LDH杀伤检测：1)收集靶细胞的悬液：贴壁细胞弃去培养上清每皿使用10ml生理盐水浸润皿底后弃去生理盐水，每皿细胞加入1ml胰酶消化细胞，视细胞系特性决定消化时间，显微镜下观察细胞不贴壁，悬浮且形态变圆，加入3mL完全培养基终止消化。1500rpm离心5min，弃去上清，分别加入5mL PBS 重悬，1500rpm离心5min，弃上清。2)靶细胞铺板：用1mL AIM-V杀伤培养基 (AIM-V+4％FBS)分别重悬靶细胞。使用血球计数板法计数。96孔板每孔加入靶细胞 1x104孔，根据所需细胞量，使用杀伤培养基配制靶细胞悬液，配好后将靶细胞铺于96 孔细胞培养板中，250g，离心5分钟，放入37℃二氧化碳培养箱培养2h，促进靶细胞贴壁。3)收集效应细胞悬液，将T细胞混合均匀，使用血球计数板法计数。根据杀伤所需效应细胞用量，取效应细胞，1500rpm离心5min，用1mL AIM-V杀伤培养基 (AIM-V+4％FBS)分别重悬效应细胞，台盼蓝染色计数。4)96孔板每孔已经加入靶细胞1x10⁴，设置E:T(效应细胞：靶细胞)为2.5:1时，效应细胞每孔加入2.5x10⁴；E:T＝5： 1时，效应细胞5x10⁴/孔；E:T＝10：1时，效应细胞1x10⁵/孔，体积均为50ul/孔。按照体系计算配制E:T＝10：1时，效应细胞1x10⁵/孔，准备1倍体积的细胞量，使用杀伤培养基进行2倍梯度稀释，配制E:T＝5：1和E:T＝2.5：1的效应细胞悬液。5)靶细胞贴壁2h，效应细胞悬液配制结束后铺板，需设置效应细胞空白组、靶细胞空白组、靶细胞最大裂解组、培养基空白组(计算杀伤效率必须设置这些组别)。铺板结束后，用封口膜封住96孔板放离心机中，250g，升3降1离心5min，撕去封口膜放入37℃恒温培养箱中孵育24h。6)LDH杀伤检测前45min向靶细胞最大裂解孔中各加入10μL裂解液，放入37℃恒温培养箱中继续孵育。7)Substrate底物从-20℃取出后待温度降至室温，轻轻颠倒摇晃使Substrate底物溶解。8)取出96孔板用封口膜封住后放置离心机中，250G，升3降1离心5min。每孔取上清50μL至新的96孔板，后每孔加入50μL底物，避光孵育10-15min。使用酶标仪在490nm处检测吸光度。9)杀伤效率计算公式：细胞毒性％＝实验组杀伤/最大杀伤x100％＝(实验孔-效应细胞空白孔-靶细胞空白孔+培养基背景孔) /(靶细胞最大裂解孔-培养基体积校正孔-靶细胞孔+培养基背景孔)x100％。

检测细胞因子步骤：效应T细胞与靶细胞共孵育后，收集上清于1.5mL EP管中进行细胞因子检测。a样本处理：细胞悬液1500rpm离心3min后收集上清于新的1.5mL EP 管中。b标准品准备：加入2mL标准品稀释液稀释标准品冻干粉，室温静置15min。接着2倍梯度稀释标准品(最高浓度至空白稀释液共10个梯度)。c在新的EP管中加入50 μL标准品或者样本，接着加入50μL磁珠以及50μL检测抗体，涡旋仪混合均匀，室温孵育3h。d加入Wash Buffer洗涤两遍后弃去上清加入200μL Wash Buffer重悬上机检测细胞因子IL-2/IL-4/IL-6/IL-10/IFN—γ/TNF。

LDH杀伤结果显示抗CD19 CAR-T细胞只能杀伤表达CD19的K562细胞，不能杀伤其他5个细胞。相比对照组抗CD19 CAR-T细胞，抗Trop2 CAR-T细胞对4个高表达 Trop2的实体瘤细胞系，胰腺癌细胞株Bxpc3，膀胱癌细胞株T24,非小细胞肺癌细胞株PC-9、H1975均有较高的特异性杀伤，且具有明显的剂量依赖性，CAR-T细胞量越高杀伤水平越高，而对Trop2阴性细胞株——Trop2阴性非小细胞肺癌细胞株A549、过表达 CD19的髓系白血病细胞株K562-CD19均没有杀伤(图7)。

此外，检测抗Trop2 CAR-T细胞在体外与不同实体瘤细胞系共孵育后释放的细胞因子，结果显示：

相比对照组抗CD19 CAR-T细胞，抗Trop2 CAR-T细胞与高表达Trop2的实体瘤细胞系(胰腺癌细胞Bxpc3和三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231)共孵育24h后，会释放大量的IFN-r、TNF-α以及IL-2。而Trop2阴性细胞系A549细胞因子处于较低水平(图 8)。

以上体外结果证明抗Trop2 CAR-T细胞在体外可以被Trop2阳性的靶细胞刺激活化，并产生一系列与免疫活化相关的细胞因子，同时也可以发生特异性的增殖，对靶细胞完成良好的杀伤效应。于是接下来为了探究抗Trop2 CAR-T细胞在体内是否也可以发挥类似的杀瘤功能。我们进行了小鼠体内实验进行验证。我们通过构建人胰腺癌小鼠模型，来探究抗Trop2 CAR-T细胞在体内抗肿瘤的效应功能。

实施例6抗Trop2 CAR-T细胞动物体内实验

成瘤细胞准备：MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞株)、H1975(非小细胞肺癌细胞株)来自上海中国科学院细胞库；

动物准备：于接种前1周订购6周龄体重20-25g的雌性NCG小鼠(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc em26Il2rg em26/Gpt，来自江苏集萃药康生物科技有限公司，品系类型KnoCL out，品系编号T001475，背景NOD/ShiltJGpt)。动物饲养及实验操作严格按照SPF级标准进行。动物实验获得华东师范大学伦理委员会同意，且严格遵照动物研究委员会工作指南执行。饲养于无特定病原体(specified-pathogen-free，SPF)环境，26℃室温，无菌饲料及无菌水饲养。小鼠适应环境7天后再开始进行相关实验。

NCG小鼠皮下移植瘤建模及体内实验步骤：1)处理收集贴壁靶细胞：取细胞汇合度80％-90％的Bxpc3，每T75瓶加3ml胰酶，消化6-8分钟，每瓶加6ml RPMI1640完全培养基终止消化，1500rpm，升9降9，离心5min，弃上清，然后用RPMI1640基础培养基重悬混匀后1500rpm，升9降9，离心5min，弃上清，重复清洗1次。2)接种：冲洗2遍后，台盼蓝染色计数，测定细胞活率(95％以上)，用基础培养基调细胞密度为 5.0×10⁷/ml，使用75％酒精消毒NCG小鼠前肢腋下处皮肤，混匀细胞悬液后，胰岛素针皮下注射100ul的细胞悬液，而后缓慢拔出针头，继续SPF级别饲养。3)小鼠分组：小鼠肿瘤达100mm³后进行随机分组。定期给小鼠更换垫料，观察小鼠一般情况及摄食活动能力，每两天测量1次小鼠的体重及肿瘤体积。4)CAR-T细胞准备：使用AIMV完全培养基(5％FBS+1000IU/ml IL-2)，在37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中培养，每隔2天观察细胞生长状况，显微镜拍照、计数、补液，T细胞在体外扩大培养至回输所需细胞量，回输前检测无菌、支原体、CAR转导效率。CAR-T细胞处理：取待回输的CAR-T 细胞，1500rpm，升9降9，离心5min，弃上清，AIMV基础培养基冲洗两次后台盼蓝染色计数，测定细胞活率，然后用基础培养基调T细胞密度至1.0×10⁸/ml，用于回输。5) CAR-T细胞回输：小鼠肿瘤体积达100mm³开始回输CAR-T细胞，CAR-T细胞回输方案为，1×10⁷细胞量/次，共回输4次，每4天进行一次CAR-T回输(图10)。回输操作：使用75％酒精消毒NCG小鼠尾部，混匀细胞悬液后，使用胰岛素针经小鼠尾静脉注射100ul的CAR-T细胞悬液，而后缓慢拔出针头，伤口消毒止血20s，继续SPF级别饲养。

三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的抗Trop2 CAR-T细胞动物体内实验方法具体是：通过尾静脉给6周龄NCG小鼠注射了5×10⁶个靶细胞MDA-MB-231，靶细胞接种5天后肿瘤体积约100mm³，对荷瘤小鼠进行随机每组6只，分为了三组。对实验小鼠进行了4 次CAR-T细胞回输治疗(1×10⁷/只/次)，中间间隔3天。

肺癌细胞系H1975的抗Trop2 CAR-T细胞动物体内实验方法具体是：通过尾静脉给6-8周龄NCG小鼠注射了5×10⁶个靶细胞H1975，接种靶细胞9天后肿瘤体积约100mm³，对荷瘤小鼠进行随机每组5只，分为了三组。对实验小鼠进行了4次CAR-T细胞回输治疗(1×10⁷/只/次)，中间间隔3天。

在治疗过程中，我们对小鼠肿瘤大小、体重、活跃状态进行了持续的观察与记录，并对小鼠肿瘤大小进行了统计，实验结果表明抗Trop2 CAR-T细胞组对比抗CD19 CAR-T 细胞组以及不治疗组，可以显著抑制肿瘤的生长。图9是抗Trop2 CAR-T细胞在体内特异性杀伤MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞，显著抑制肿瘤生长。其中，a为肿瘤体积曲线，b为小鼠体重变化曲线。相比与对照组和CD19 CART治疗组小鼠，接受抗Trop2 CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤体积明显缩小，说明抗Trop2 CAR-T细胞可以显著抑制 MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植物肿瘤生长。图10是抗Trop2 CAR-T细胞在体内特异性杀伤H1975肺癌细胞，显著抑制肿瘤生长。其中，a为肿瘤体积曲线，b为小鼠体重变化曲线。相比与对照组和CD19 CART治疗组小鼠，接受抗Trop2 CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤体积明显缩小，说明抗Trop2 CAR-T细胞可以显著抑制H1975肺癌异种移植物肿瘤生长，接受抗Trop2 CAR-T细胞治疗的小鼠体重无明显下降，说明抗Trop2 CAR-T 细胞在小鼠体内耐受。

在肺癌细胞系H1975、三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的小鼠模型上达到了显著的抗肿瘤效果(图9和10)。

NCG小鼠动物模型体内结果表明抗Trop2 CAR-T细胞在体内能够特异性杀伤非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌细胞异种移植肿瘤。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110> 上海优卡迪生物医药科技有限公司

<120> 结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段以及抗Trop2 CAR和应用

<130> WHYY-NP-21-101030

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys

100 105

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Ser Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 6

Gln Ser Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 7

Lys Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 8

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 9

Ser Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 10

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 11

Glu Gln Ser Ser Ser Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 13

Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 14

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 16

Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 17

<211> 118

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu

115

<210> 18

<211> 105

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 18

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

1 5 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

20 25 30

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

50 55 60

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

65 70 75 80

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 19

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtccagc ccggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgaag actctggatt caccttcagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctacagatga acagcctgag aggcgaggac acggctgttt attactgtgc gagggaacag 300

tctagcagtg gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacgtgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccacca 180

aggttcagcg gcagtggatc tggggcagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt atccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggaggtcaa a 321

<210> 23

<211> 8251

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60

gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120

ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180

tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240

ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300

gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780

gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaagatctct 1200

agaagctggg taccttgtgc ccgggcgcca ccatggagtt tgggctgagc tggctttttc 1260

ttgtcgcgat tcttaagggt gtccagtgcg agacgactcc tcgacgagga agcttgacat 1320

ccagatgacc cagagccctt ccagcctgag cgctagcgtg ggagacaggg tgaccatcac 1380

ctgcagggct agccaggatg tgagcaccgc cgtggcctgg tatcagcaga agcctggcaa 1440

ggcccccaag ctgctgatct acagcgccag cttcctgtac agcggagtgc ccagcagatt 1500

cagcggcagc ggaagcggca ccgatttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga 1560

cttcgctacc tactactgcc agcagtacct gtaccacccc gccacctttg gccagggcac 1620

caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga 1680

tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag 1740

agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag 1800

tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag 1860

caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag 1920

ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtatc caaacggagg agcgtctccg 1980

cttcgaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 2040

gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 2100

ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 2160

gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 2220

acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 2280

aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 2340

cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 2400

aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 2460

acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 2520

gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 2580

agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 2640

aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 2700

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 2760

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 2820

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 2880

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 2940

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gagcggccgc tcgaggccgg caaggccgga 3000

tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 3060

aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 3120

caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 3180

gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatcc 3240

ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggat 3300

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 3360

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgaggtcga ctctagagga tcgatccccg 3420

ccccggacga actaaacctg actacgacat ctctgcccct tcttcgcggg gcagtgcatg 3480

taatcccttc agttggttgg tacaacttgc caactgggcc ctgttccaca tgtgacacgg 3540

ggggggacca aacacaaagg ggttctctga ctgtagttga catccttata aatggatgtg 3600

cacatttgcc aacactgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc 3660

aacacaacat tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga 3720

catgtacctc ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg 3780

gcctgtgtag ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg 3840

cccccttgtt aaccctaaac gggtagcata tgcttcccgg gtagtagtat atactatcca 3900

gactaaccct aattcaatag catatgttac ccaacgggaa gcatatgcta tcgaattagg 3960

gttagtaaaa gggtcctaag gaacagcgat atctcccacc ccatgagctg tcacggtttt 4020

atttacatgg ggtcaggatt ccacgagggt agtgaaccat tttagtcaca agggcagtgg 4080

ctgaagatca aggagcgggc agtgaactct cctgaatctt cgcctgcttc ttcattctcc 4140

ttcgtttagc taatagaata actgctgagt tgtgaacagt aaggtgtatg tgaggtgctc 4200

gaaaacaagg tttcaggtga cgcccccaga ataaaatttg gacggggggt tcagtggtgg 4260

cattgtgcta tgacaccaat ataaccctca caaacccctt gggcaataaa tactagtgta 4320

ggaatgaaac attctgaata tctttaacaa tagaaatcca tggggtgggg acaagccgta 4380

aagactggat gtccatctca cacgaattta tggctatggg caacacataa tcctagtgca 4440

atatgatact ggggttatta agatgtgtcc caggcaggga ccaagacagg tgaaccatgt 4500

tgttacactc tatttgtaac aaggggaaag agagtggacg ccgacagcag cggactccac 4560

tggttgtctc taacaccccc gaaaattaaa cggggctcca cgccaatggg gcccataaac 4620

aaagacaagt ggccactctt ttttttgaaa ttgtggagtg ggggcacgcg tcagccccca 4680

cacgccgccc tgcggttttg gactgtaaaa taagggtgta ataacttggc tgattgtaac 4740

cccgctaacc actgcggtca aaccacttgc ccacaaaacc actaatggca ccccggggaa 4800

tacctgcata agtaggtggg cgggccaaga taggggcgcg attgctgcga tctggaggac 4860

aaattacaca cacttgcgcc tgagcgccaa gcacagggtt gttggtcctc atattcacga 4920

ggtcgctgag agcacggtgg gctaatgttg ccatgggtag catatactac ccaaatatct 4980

ggatagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct 5040

gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct 5100

gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct 5160

gggtagtata tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatccta atagagatta 5220

gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata tactacccaa atatctggat 5280

agcatatgct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt 5340

agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt 5400

agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt 5460

agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct gtatccgggt 5520

agcatatgct atcctcatgc atatacagtc agcatatgat acccagtagt agagtgggag 5580

tgctatcctt tgcatatgcc gccacctccc aagggggcgt gaattttcgc tgcttgtcct 5640

tttcctgctg cttatcgatg ataagctgtc aaacatgaga attcttgaag acgaaagggc 5700

ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 5760

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 5820

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 5880

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 5940

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 6000

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 6060

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 6120

gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 6180

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 6240

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 6300

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 6360

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 6420

accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 6480

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 6540

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 6600

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 6660

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 6720

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 6780

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 6840

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 6900

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 6960

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 7020

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 7080

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 7140

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 7200

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 7260

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 7320

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 7380

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 7440

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 7500

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 7560

gctcacatga agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa 7620

cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg ccatccagcc 7680

tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg gccccgagat gcgccgcgtg 7740

cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc 7800

acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg 7860

tgccgccctg cttcatcccc gtggcccgtt gctcgcgttt gctggcggtg tcactggccc 7920

cgtgggttag ggacggggtc ccccatgggg aatggtttat ggttcgtggg ggttattatt 7980

ttgggcgttg cgtggggtca ggtccacgac tggactgagc agacagaccc atggtttttg 8040

gatggcctgg gcatggaccg catgtactgg cgcgacacga acaccgggcg tctgtggctg 8100

ccaaacaccc ccgaccccca aaaaccaccg cgcggatttc tggcgtgcca agctagtcga 8160

ccaattctca tgtttgacag cttatcatcg cagatccggg caacgttgtt gccattgctg 8220

caggcgcaga actggtaggt atggaagatc t 8251

<210> 24

<211> 7930

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60

gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120

ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180

tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240

ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300

gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780

gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaagatctct 1200

agaagctggg taccttgtgc ccgggcgcca ccatggacat gcgcgtgccc gcccagctgc 1260

tgggcctgct gctgctgtgg ttccccggct cgcgatgcga gacgactcct cgacgaggaa 1320

gcttatgcct ccaccaaggg acccagcgtg tttcccctgg ccccctgttc cagatccacc 1380

tccgaaagca cagccgctct cggctgcctg gtcaaggatt acttccctga gcccgtgaca 1440

gtctcctgga atagcggcgc tctgacctcc ggcgtgcata ccttccctgc tgtgctgcaa 1500

tcctccggac tgtacagcct gagcagcgtg gtcaccgtgc cttcctccag cctgggaacc 1560

aaaacctaca catgcaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaagtgga caagagggtg 1620

gagtccaagt acggaccccc ttgtcctccc tgccctgctc ctgaagccgc tggaggacct 1680

agcgtgttcc tgtttccccc caagcccaag gacaccctca tgatctccag gacccccgag 1740

gtgacctgtg tcgtggtgga cgtgagccaa gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac 1800

gtggatggcg tcgaggtcca taacgccaag accaagccta gggaggagca gttcaacagc 1860

acctacagag tggtgagcgt cctgaccgtg ctccaccaag actggctgaa cggcaaggaa 1920

tacaagtgca aggtctccaa caagggactc ccttcctcca tcgagaagac catcagcaag 1980

gccaagggcc agcccagaga accccaagtc tacacactgc cccccagcca agaggaaatg 2040

accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacattgct 2100

gtcgaatggg agagcaacgg ccaacccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctc 2160

gacagcgacg gctccttctt cctctacagc aggctgacag tggacaagtc caggtggcaa 2220

gagggcaatg tcttcagctg tagcgtcatg cacgaggccc tccacaacca ctacacccag 2280

aagagcctgt ccctctccct gggctgacca aacggaggag cgtctcccgt acggtggctg 2340

caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg 2400

ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata 2460

acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca 2520

cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct 2580

acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg 2640

gagagtgttg agcggccgct cgaggccggc aaggccggat ccagacatga taagatacat 2700

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 2760

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 2820

caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 2880

gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga ttatgatccg gctgcctcgc gcgtttcggt 2940

gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggata cggtcacagc ttgtctgtaa 3000

gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 3060

ggcgcagcca tgaggtcgac tctagaggat cgatccccgc cccggacgaa ctaaacctga 3120

ctacgacatc tctgcccctt cttcgcgggg cagtgcatgt aatcccttca gttggttggt 3180

acaacttgcc aactgggccc tgttccacat gtgacacggg gggggaccaa acacaaaggg 3240

gttctctgac tgtagttgac atccttataa atggatgtgc acatttgcca acactgagtg 3300

gctttcatcc tggagcagac tttgcagtct gtggactgca acacaacatt gcctttatgt 3360

gtaactcttg gctgaagctc ttacaccaat gctgggggac atgtacctcc caggggccca 3420

ggaagactac gggaggctac accaacgtca atcagagggg cctgtgtagc taccgataag 3480

cggaccctca agagggcatt agcaatagtg tttataaggc ccccttgtta accctaaacg 3540

ggtagcatat gcttcccggg tagtagtata tactatccag actaacccta attcaatagc 3600

atatgttacc caacgggaag catatgctat cgaattaggg ttagtaaaag ggtcctaagg 3660

aacagcgata tctcccaccc catgagctgt cacggtttta tttacatggg gtcaggattc 3720

cacgagggta gtgaaccatt ttagtcacaa gggcagtggc tgaagatcaa ggagcgggca 3780

gtgaactctc ctgaatcttc gcctgcttct tcattctcct tcgtttagct aatagaataa 3840

ctgctgagtt gtgaacagta aggtgtatgt gaggtgctcg aaaacaaggt ttcaggtgac 3900

gcccccagaa taaaatttgg acggggggtt cagtggtggc attgtgctat gacaccaata 3960

taaccctcac aaaccccttg ggcaataaat actagtgtag gaatgaaaca ttctgaatat 4020

ctttaacaat agaaatccat ggggtgggga caagccgtaa agactggatg tccatctcac 4080

acgaatttat ggctatgggc aacacataat cctagtgcaa tatgatactg gggttattaa 4140

gatgtgtccc aggcagggac caagacaggt gaaccatgtt gttacactct atttgtaaca 4200

aggggaaaga gagtggacgc cgacagcagc ggactccact ggttgtctct aacacccccg 4260

aaaattaaac ggggctccac gccaatgggg cccataaaca aagacaagtg gccactcttt 4320

tttttgaaat tgtggagtgg gggcacgcgt cagcccccac acgccgccct gcggttttgg 4380

actgtaaaat aagggtgtaa taacttggct gattgtaacc ccgctaacca ctgcggtcaa 4440

accacttgcc cacaaaacca ctaatggcac cccggggaat acctgcataa gtaggtgggc 4500

gggccaagat aggggcgcga ttgctgcgat ctggaggaca aattacacac acttgcgcct 4560

gagcgccaag cacagggttg ttggtcctca tattcacgag gtcgctgaga gcacggtggg 4620

ctaatgttgc catgggtagc atatactacc caaatatctg gatagcatat gctatcctaa 4680

tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 4740

tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa 4800

tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa 4860

tctgtatccg ggtagcatat gctatcctaa tagagattag ggtagtatat gctatcctaa 4920

tttatatctg ggtagcatat actacccaaa tatctggata gcatatgcta tcctaatcta 4980

tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta tatctgggta gcataggcta tcctaatcta 5040

tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta tatctgggta gtatatgcta tcctaattta 5100

tatctgggta gcataggcta tcctaatcta tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta 5160

tatctgggta gtatatgcta tcctaatctg tatccgggta gcatatgcta tcctcatgca 5220

tatacagtca gcatatgata cccagtagta gagtgggagt gctatccttt gcatatgccg 5280

ccacctccca agggggcgtg aattttcgct gcttgtcctt ttcctgctgc ttatcgatga 5340

taagctgtca aacatgagaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 5400

taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 5460

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5520

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5580

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5640

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5700

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5760

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc 5820

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5880

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5940

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 6000

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 6060

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg 6120

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 6180

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 6240

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 6300

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 6360

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 6420

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6480

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6540

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6600

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6660

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6720

agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6780

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6840

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6900

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6960

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 7020

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 7080

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 7140

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 7200

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgaa gctgtccctg 7260

atggtcgtca tctacctgcc tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc 7320

ggaagcgaga agaatcataa tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa 7380

gacgtagccc agcgcgtcgg ccccgagatg cgccgcgtgc ggctgctgga gatggcggac 7440

gcgatggata tgttctgcca agggttggtt tgcgcattca cagttctccg caagaattga 7500

ttggctccaa ttcttggagt ggtgaatccg ttagcgaggt gccgccctgc ttcatccccg 7560

tggcccgttg ctcgcgtttg ctggcggtgt cactggcccc gtgggttagg gacggggtcc 7620

cccatgggga atggtttatg gttcgtgggg gttattattt tgggcgttgc gtggggtcag 7680

gtccacgact ggactgagca gacagaccca tggtttttgg atggcctggg catggaccgc 7740

atgtactggc gcgacacgaa caccgggcgt ctgtggctgc caaacacccc cgacccccaa 7800

aaaccaccgc gcggatttct ggcgtgccaa gctagtcgac caattctcat gtttgacagc 7860

ttatcatcgc agatccgggc aacgttgttg ccattgctgc aggcgcagaa ctggtaggta 7920

tggaagatct 7930

<210> 25

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 25

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 26

<211> 240

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Glu Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser

165 170 175

Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gln Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

<210> 27

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 27

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 28

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 28

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 29

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 29

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 30

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 31

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 31

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 32

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 32

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacgtgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccacca 180

aggttcagcg gcagtggatc tggggcagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt atccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggaggtcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgcagctggt gcagtctggg ggaggcttgg tccagcccgg ggggtccctg 420

agactctcct gtgaagactc tggattcacc ttcagtagct attggatgag ctgggtccgc 480

caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata 540

tactacgcag actcagtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca 600

ctgtatctac agatgaacag cctgagaggc gaggacacgg ctgtttatta ctgtgcgagg 660

gaacagtcta gcagtggctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 720

<210> 33

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 33

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 34

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 34

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 35

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 35

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 36

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 36

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (14)

1.一种结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，其特征在于，包含：

a1)包含SEQ ID NO.3的VH CDR1、SEQ ID NO.4的VH CDR2和SEQ ID NO.5的VH CDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.6的VL CDR1、SEQ ID NO.7的VL CDR2和SEQ ID NO.8的VLCDR3的轻链可变区；或

a2)包含SEQ ID NO.9的VH CDR1、SEQ ID NO.10的VH CDR2和SEQ ID NO.11的VH CDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.12的VL CDR1、SEQ ID NO.13的VL CDR2和SEQ ID NO.14的VL CDR3的轻链可变区；或

a3)包含SEQ ID NO.15的VH CDR1、SEQ ID NO.16的VH CDR2和SEQ ID NO.11的VH CDR3的重链可变区；包含SEQ ID NO.12的VL CDR1、SEQ ID NO.13的VL CDR2和SEQ ID NO.14的VL CDR3的轻链可变区；

所述结合Trop2的抗体是多克隆抗体或抗Trop2单克隆抗体；

所述Trop2抗原结合片段是：

b1)单链Fv；或

b2)二硫键连接的Fv；或

b3)Fab片段；或

b4)F(ab’)片段；或

b5)一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；或

b6)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；或

b7)由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段。

2.根据权利要求1所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，其特征在于，包含：包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的轻链可变区。

3.根据权利要求1所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，其特征在于，所述结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段是全人源抗体或全人源抗原结合片段。

4.根据权利要求1所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，其特征在于，所述结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段是单链抗体。

5.核酸，其特征在于，编码根据权利要求1-4任一项所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段。

6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，包含编码重链可变区包含的核苷酸序列SEQ ID NO.21和编码轻链可变区包含的核苷酸序列SEQ ID NO.22。

7.载体，其特征在于，包含根据权利要求5或6任一项所述的核酸。

8.宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求5或6任一项所述的核酸或者根据权利要求7所述的载体。

9.用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，培养根据权利要求8所述的宿主细胞并从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。

10.一种抗Trop2 CAR，其特征在于，包含抗Trop2 scFv；所述抗Trop2 scFv为根据权利要求1所述的Trop2抗原结合片段；所述Trop2抗原结合片段为单链Fv。

11.根据权利要求10所述的抗Trop2 CAR，其特征在于，所述抗Trop2 CAR的结构为CD8leader-抗Trop2 scFv-CD8 Hinge-CD8 TM-共刺激结构域-胞内信号肽，包括依次串联的CD8 leader膜受体信号肽、抗Trop2 scFv、CD8 Hinge嵌合受体铰链区、CD8 TM嵌合受体跨膜区、共刺激结构域和胞内信号肽；所述抗Trop2 scFv为根据权利要求1所述的Trop2抗原结合片段；所述Trop2抗原结合片段为单链Fv。

12.抗Trop2 CAR-T或抗Trop2 CAR-NK或抗Trop2 CAR-M，其特征在于，其上修饰有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为根据权利要求10所述的抗Trop2 CAR。

13.根据权利要1所述的结合Trop2的抗体或Trop2抗原结合片段，或根据权利要求5所述的核酸，或根据权利要求7所述的载体，或根据权利要求8所述的宿主细胞，或根据权利要求10所述的抗Trop2 CAR，或根据权利要求12所述的抗Trop2 CAR-T或抗Trop2 CAR-NK或抗Trop2 CAR-M在制备抗肿瘤药物中的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤能表达Trop2。