KR20210005184A - 유전자 치료 방법 - Google Patents

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dna
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마커스 그롬프
아미타 티야보온차이
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오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티
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Abstract

유전자 및/또는 세포 편집을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

유전자 치료 방법
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 2018년 4월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/664,930 및 2018년 4월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 62/664,932에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 국립 보건원에서 수여하는 R01 DK048252-21 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 포멧 사본(파일명: SEQLIST.txt; 기록 날짜: 2019년 4월 29일; 파일 크기: 116 KB).
발명의 분야
본 발명은 유전자 및/또는 세포 치료법 분야에 관한 것이다. 구체적으로는, 성공적으로 변형된 세포를 선택함으로써 치료 유전자 및/또는 세포 치료를 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
본 발명이 속하는 업계의 최신 기술을 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문서가 인용된다. 각각의 이러한 인용은 전체가 설명된 것과 같이 본원에 참조로 포함된다.
사이토크롬 p450(CYP) 단백질을 발현하는 세포에 영향을 미치는 많은 유전적 및 후천적 장애는 유전자 및/또는 세포 치료를 받을 수 있다. 개념적으로, 유전자 편집에 의한 질병 유발 돌연변이의 수정은 유전자 및/또는 세포 치료를 달성하는 가장 우아하고 안전한 방법이다. 현재, 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터가 지배적인 유전자 치료 플랫폼이다. 유전자 편집 응용을 위해, rAAV 벡터는 상동성 재조합을 통해 치료 페이로드를 관심 게놈 좌위에 통합하도록 디자인된다. 그러나, 생체 내 상동성 재조합에 의한 정확한 유전자 편집은 효율성이 떨어지며, 일반적으로 치료용량 이하 및 비영구적 유전자 편집을 초래한다. 실제로, rAAV 벡터는 대부분 에피솜 상태로 남아 있으며 세포 분열로 손실된다. 더욱이, 아데노 관련 바이러스의 무작위 통합은 동물과 인간 모두에서 간암과 연관되어 간세포뿐만 아니라 다른 임의의 조직에 해를 끼칠 위험이 있음을 나타낸다.
rAAV 전략의 한계를 해결하는 최근의 한 가지 방법은 돌연변이(들)를 직접 수복하는 것이다. 그러나, 현재 사용 가능한 방법에 의한 생체 내 유전자 수복도 효율성이 떨어진다. 또 다른 접근법은 발현된 유전자의 염색체 좌위로 세포 프로모터의 하류에서 자체 프로모터가 없는 치료용 트랜스진을 통합하는 것이다. 그러나, 이 방법도 효율성이 낮은 것으로 입증되었다.
이러한 방법의 낮은 효율성은 원하는 유전자 편집 이벤트를 갖는 세포의 선택적 증폭에 의해 극복될 수 있다. 예를 들어, 알부민 좌위를 적절하게 표적화하는 인간 인자 9를 발현하는 간세포는, 티로신 이화 효소 4-OH-페닐피루베이트 디옥시게나제(HHPD)를 녹다운하기 위해 인트론 내의 마이크로RNA에 내포된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용하여, 푸마릴아세토아세테이트 가수 분해 효소의 소분자 억제제인, 4-[(2-카르복시에틸)-히드록시포스피닐]-3-옥소부트리레이트(CEHPOBA)에 대한 약물 유도 독성에 대한 내성을 부여함으로써 선택될 수 있다(Nygaard, et al. (2016) Sci. Transl. Med., 8(342):342ra79). 그러나, CEHPOBA의 사용과, 선택을 위한 티로신 이화 경로의 이용은 생체 내에서 제한적으로 응용된다.
앞서 말한 관점에서, 우수한 유전자 및/또는 세포 치료 방법이 필요하다는 것이 분명하다.
본 발명에 따르면, 세포 집단을 증식 및/또는 확장하는 방법이 제공된다. 세포 또는 대상체에서 관심 핵산(예, 트랜스진)을 발현하는 방법이 또한 제공된다(예, 개선된 세포 및/또는 유전자 치료 방법). 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제(예, 녹아웃 또는 녹다운)하는 단계 및 세포에 프로드러그(프로톡신)를 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 프로드러그로 선택하기 전에 관심 핵산(예, 트랜스진)을 세포에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 투여된 프로드러그(프로톡신)는 미처리된 세포에서 독소로 대사되지만 처리된 세포에서는 독소로 대사되지 않아, 원하는 세포 집단의 증식 및/또는 확장, 및/또는 관심 핵산의 발현(예, 트랜스진)을 허용한다. 방법의 단계는 생체 내 및/또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1, 및/또는 CYPOR을 억제하는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로드러그(프로톡신)를 투여하는 단계는 프로드러그(프로톡신)를 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제하는 단계는 억제 핵산 분자를 세포에 투여하고/하거나 CRISPR과 같은 유전자 편집 도구를 사용하여 수행할 수 있다.
도 1은 비활성 프로드러그(프로톡신)의 대사를 독성 대사산물로 불활성화함으로써 약물 선택을 달성하는 원리를 보여주는 일반적인 개략도를 제공한다. 세포의 정상적인 상태는 왼쪽에 표시되어 있으며, 여기서 프로드러그(프로톡신)는 독성 대사산물로 대사된다. CYP 효소, 사이토크롬 P450 리덕타제(CYPOR 또는 POR) 또는 베타-카테닌(Ctnnb1)의 녹다운 또는 녹아웃은 세포를 보호하고 증식을 허용한다.
도 2는 pX330-Cypor을 주사하고 아세트아미노펜으로 처리한 마우스에서 시간 경과에 따른 간 손상의 지표인 혈중 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준의 그래프를 제공한다.
도 3은 미처리(상단 이미지)된 또는 아세트아미노펜 처리(하단 이미지)된 pX330-Cypor 형질도입 마우스의 간 샘플의 CYPOR 면역조직화학 이미지를 제공한다. 파선은 CYPOR 눌(null) 결절을 나타낸다.
도 4는 대조군 플라스미드(pX330), 아세트아미노펜 선택이 없는 pX330-Cypor, 아세트아미노펜이 주사된 pX330-Cypor 및 아세트아미노펜이 식이된 pX330-Cypor이 주사된 마우스에서 삽입-결실(indel)의 백분율 그래프를 제공한다.
도 5는 비처리(왼쪽 이미지)된 또는 아세트아미노펜 처리(오른쪽 이미지)된 Cyp1A2/2E1 CRISPR 녹아웃 플라스미드가 주사된 마우스의 간 샘플의 면역조직화학 이미지를 제공한다. 화살표는 Cyp2E1 눌 결절을 나타낸다.
도 6은 대조군 shRNA(상단 패널) 또는 Cypor shRNA(하단 패널)를 보유하고 아세트아미노펜으로 처리된 GFP 트랜스포존이 형질도입된 마우스의 간 샘플의 CYPOR 면역조직화학 및 형광 이미징을 제공한다.
도 7은 자기 절단 가이드 RNA의 개략도를 제공한다. 해머헤드 리보자임은 서열번호 521이다. HDV 리보자임은 서열번호 522이다. 성숙 gRNA는 서열번호 523이다.
도 8은 Cypor에 대한 루시퍼라제 및 자기 절단 가이드 RNA를 포함하는 벡터를 주사하고, 이유시 cas9를 주사한 후, 8주 동안 아세트아미노펜을 주사한 신생체 마우스의 간 루시퍼라제 이미지를 제공한다. 라이브 루시퍼라제 이미징은 기준선에서, 그리고 5회, 11회 및 16회 용량 후에 동일한 마우스에서 수행되었다.
도 9는 신생체로서 식염수 또는 AAV GRCyporF9를 주사하고 이유시 Cas9의 단회 용량을 투여받은 마우스의 혈액에서의 인간 인자 IX 수준의 그래프를 제공한다. 그 후 마우스를 처리하지 않거나 매주 2회 아세트아미노펜으로 처리하였다. 인간 인자 IX 수준은 아세트아미노펜의 0, 3, 9 및 15회 용량 후 측정되었다.
도 10은 AAV GRCyporF9를 주사하고 아세트아미노펜으로 처리한 성체 마우스의 혈액에서의 인간 인자 IX 수준의 그래프를 제공한다. 인간 인자 IX 수준은 0, 2, 7, 13 및 19회 용량 후 측정되었다.
도 11은 아세트아미노펜 처리 후 GRCyporF9 처리된 마우스의 조직 샘플의 CYPOR(상단 패널) 및 인간 인자 IX(하단 패널) 면역조직화학의 이미지를 제공한다. 상단 패널에서, CYPOR 음성 조직은 점선과 화살표로 표시된다. 하단 패널에서, 인간 인자 IX에 양성체 마우스 간세포는 점선과 화살표로 표시된다.
발명의 상세한 설명
유전자 및/또는 세포 치료법으로 관찰된 장애물은 하기를 사용하여 극복할 수 있다: (1) CYP 효소의 대사 활성에 필요한 임의의 유전자 좌위를 이용 및/또는 파괴하도록 디자인된 방법으로서, 약물 유도 독성을 통한 내성 세포 집단의 선택적 증폭 및/또는 확장이 생체 내에서 광범위하게 적용되는 독소에 의해 영향을 받는 것인 방법, (2) 특정 부위에서 변형이 발생하는 경우에만 선택적 증폭 및/또는 세포 확장이 일어나도록, 원하는 변형을 시스(cis)에서 선택 가능한 유전자 파괴로 연결하도록 디자인된 부위 특이적 유전자 편집 방법, (3) 특정 부위에서 변형이 발생하는 경우에만 선택적 증폭 및/또는 세포 확장이 일어나도록, DNA를 절단하는 엔도뉴클레아제 효소 또는 유전자 발현을 활성화하는 프로모터의 사용이 필요하지 않은 원하는 변형 및 선택 가능한 유전자 파괴를 실시하도록 디자인된 부위 특이적 유전자 편집 방법, (4) 부위에 관계없이 통합이 일어나는 경우에만 선택적 증폭 및/또는 세포 확장이 일어나도록, 자체 내인성 프로모터를 갖는 무작위로 통합된 벡터를 사용하여 원하는 변형 및 유전자 파괴를 실시하도록 디자인된 부위 중립 유전자 편집 방법, (5) CYP 효소의 대사 활성에 필요한 유전자 좌위를 녹다운, 녹아웃, 또는 그렇지 않으면 파괴하는 방법으로서, 유전자 편집 이벤트 또는 변형 없이 원하는 세포 집단의 선택적 증폭 및/또는 확장이 일어나는 것인 방법, 또는 (6) 임의의 (1) 내지 (5) 중 임의의 조합. 본 발명은 상기를 달성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 고효율의, 세포 및/또는 조직 특이적이고, 임상적으로 효과적이며, 더 영구적인 유전자 편집 및/또는 치료를 달성하기 위한 사이토크롬 p450 효소(CYP) 시스템의 활용을 포함한다. 본 발명은 편집할 세포에서 기존의 유전적 단점을 요구하지 않는다. 오히려, 일부 실시양태에서, 본 발명은 적절하게 편집된 세포에 약물 유도 독성에 대한 유리한 내성을 부여함으로써 편집되지 않은 세포에서의 단점을 생성한다. 이 유리한 내성은 (1) CYP 효소를 코딩하는 하나 이상의 CYP 유전자, (2) 사이토크롬 p450 리덕타제(CYPOR 또는 POR) 유전자, (3) CTNNB1(베타-카테닌) 유전자, (4) CYP 효소의 대사 활성에 필요한 임의의 유전자 좌위, 또는 (5) 임의의 (1) 내지 (4) 중 임의의 조합을 녹다운, 녹아웃 또는 그렇지 않으면 파괴함으로써 세포에 부여될 수 있다. 더욱이, 유리한 내성은 또한 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 직접 손상, 파괴 또는 그렇지 않으면 불활성화함으로써 부여될 수 있다. 적절한 독소(예, 프로드러그 또는 프로톡신)를 투여하면, 유리한 내성을 가진 세포(즉, CYP 활성 감소로 인해 독소를 대사하고 활성화하는 능력이 부족함)는 편집되지 않은 세포보다 우선적으로 증식한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 세포 집단을 증식 및/또는 확장하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제(예, 녹아웃 또는 녹다운)하는 단계, 및 세포에 프로드러그(프로톡신)를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여된 프로드러그(프로톡신)가 미처리된 세포(예, CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR이 억제되지 않은 세포)에서는 독소로 대사되지만 처리된 세포(예, CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR이 억제된 세포)에서는 독소로 대사되지 않는다. 방법의 단계는 생체 외 방법(예를 들어, 대상체로부터의 세포(자가 세포)가 시험관 내에서 처리된 다음 대상체에게 다시 투여되는 경우)을 포함하여 생체 내 및/또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제하는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로드러그(프로톡신) 투여 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다(예를 들어, 프로드러그(프로톡신)는 일반적으로 세포를 포함하는 대상체에게 투여되거나 세포에 직접 투여될 수 있음).
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 세포에서 관심 핵산(예, 트랜스진)을 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제(예를 들어, 녹아웃 또는 녹다운)하는 단계, 관심 핵산(예, 트랜스진)을 세포에 도입하는 단계, 및 세포에 프로드러그(프로톡신)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여된 프로드러그(프로톡신)가 미처리된 세포(예, CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR이 억제되지 않은 세포)에서는 독소로 대사되지만 처리된 세포(예, CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR이 억제된 세포)에서는 독소로 대사되지 않는다. 방법의 단계는 생체 외 방법(예를 들어, 대상체로부터의 세포(자가 세포)가 시험관 내에서 처리된 다음 대상체에게 다시 투여되는 경우)을 포함하여 생체 내 및/또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제하고/하거나 관심 핵산(예, 트랜스진)을 도입하는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR의 억제, 및 관심 핵산(예, 트랜스진)의 도입은 동시에 또는 시스로 수행되어 두 이벤트가 동일한 유리한 내성 세포 내에서 발생하도록 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로드러그(프로톡신)를 투여하는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다(예를 들어, 프로드러그(프로톡신)는 일반적으로 세포를 포함하는 대상체에게 투여되거나 세포에 직접 투여될 수 있음).
도 1은 비활성 프로드러그의 대사를 독성 대사산물로 불활성화하여 약물 선택을 달성하는 원리를 보여주는 일반적인 개략도를 제공한다. 세포의 정상 상태는 왼쪽에 표시된다. 대사 효소는 정상 세포에서 발현되어, 대사 전환 후 독성을 유발한다. 대사 활성을 담당하는 유전자(들)가 녹다운(예, siRNA 또는 shRNA)되거나 녹아웃(예, 표적화된 뉴클레아제(예, CRISPR))되는 경우, 독성 전구체 투여 후 독성 대사산물이 생성되지 않는다. 녹다운 또는 녹아웃 세포는 보호되고 증식할 수 있는 반면, 효소 양성 세포는 사멸된다. 도 1에서 볼 수 있듯이, CYP 효소, 사이토크롬 P450 리덕타제(CYPOR 또는 POR) 또는 베타-카테닌(Ctnnb1)의 녹다운 또는 녹아웃은 아세트아미노펜과 같은 프로드러그(프로톡신)의 독성 대사산물로의 전환을 방지할 수 있다. 특히, POR은 NADPH의 전자를 모든 CYP 효소에 제공하므로, 활성에 필수적이다. POR이 없으면, 모든 CYP 효소가 불활성화된다. 유사하게, Ctnnb1은 Cyp1A2, 2E1 및 3A4를 포함하여 구역 3 간세포에서 발현되는 유전자의 전사에 필수적이다. 적어도 이러한 CYP 효소는 Ctnnb1 억제 세포에는 없다.
본 발명의 방법의 세포는 임의의 세포 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CYP 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포는 간세포이다.
세포에서 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR의 억제(예, 녹아웃 또는 녹다운)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제는 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR의 억제제를 세포에 투여함으로써 달성된다. 이러한 억제제는 표적 유전자 및/또는 단백질의 활성을 감소(예를 들어, 기질 상호 작용을 억제 또는 감소)시키고/시키거나 표적 유전자 및/또는 단백질의 발현을 감소시키는 화합물이다. 억제제의 예는, 비제한적으로, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 소분자 및 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 억제제는 핵산 기반 억제제이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 억제 핵산 분자, 예컨대 안티센스, siRNA 또는 shRNA 분자 (또는 억제 핵산 분자를 코딩하는 핵산 분자)이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 원하는 유전자의 CRISPR 기반 표적화(예를 들어, 원하는 유전자를 표적화하는 가이드 RNA 사용)와 같은 유전자 편집 억제제이다.
CYP 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며 임의의 사이토크롬 p450 유전자를 포함한다. CYP 유전자의 예는 Nelson, D.R.(Human Genomics (2009) 4:59-65; 본원에 참고로 포함됨)에서 제공된다. CYP 유전자의 예는, 비제한적으로, 사이토크롬 p450 유전자 패밀리 1 내지 51을 포함한다. CYP 유전자의 예는, 비제한적으로, CYP1A(예, CYP1A1, CYP1A2), CYP1B(예, CYP1B1), CYP2A(예, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13), CYP2B(예, CYP2B6), CYP2C(예, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19), CYP2D(예, CYP2D6), CYP2E(예, CYP2E1), CYP2F(예, CYP2F1), CYP2J(예, CYP2J2), CYP2R(예, CYP2R1), CYP2S(예, CYP2S1), CYP2U(예, CYP2U1), CYP2W(예, CYP2W1), CYP3A(예, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43), CYP4A(예, CYP4A11, CYP4A22), CYP4B(예, CYP4B1), CYP4F(예, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22), CYP4V(예, CYP4V2), CYP4X(예, CYP4X1), CYP4Z(예, CYP4Z1), CYP5A(예, CYP5A1) CYP7A(예, CYP7A1), CYP7B(예, CYP7B1), CYP8B(예, CYP8B1), CYP11A(예, CYP11A1), CYP11B(예, CYP11B1, CYP11B2), CYP17A(예, CYP17A1), CYP 19A(예, CYP19A1), CYP20(예, CYP20A1), CYP21A(예, CYP21A2), CYP24A(예, CYP24A1), CYP26A(예, CYP26A1), CYP26B(예, CYP26B1), CYP26C(예, CYP26C1), CYP27A(예, CYP27A1), CYP27B(예, CYP27B1), CYP27C(예, CYP27C1), CYP39A(예, CYP39A1), CYP46A(예, CYP46A1), 및 CYP51A(예, CYP51A1)를 포함한다. 특정 실시양태에서, CYP 유전자는 CYP1, CYP2 또는 CYP3으로부터 선택된 서브 패밀리로부터의 것이다.
사이토크롬 P450 리덕타제(CYPOR 또는 POR; 본 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용됨)는 FAD 및 FMN 결합 도메인을 갖는 소포체 막 옥시도리덕타제 단백질로서, NADPH에서 모든 사이토크롬 p450 효소에 직접 전자를 제공할 수 있다(Iyanagi, et al., (2012) Arch. Biochem. Biophys., 528:72-89). 인간에서, 사이토크롬 P450 리덕타제 유전자는 하기 좌위에서 발견된다: 염색체 7, q-아암, 영역 1, 밴드 1, 서브밴드 23(7q11.23)(예를 들어, GenBank 수탁 번호 NC_000007.14 참조). 인간 POR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 예는 예를 들어 Gen Bank Gene ID : 5447 및 GenBank 수탁 번호 NM_000941.3 및 NP_000932.3에서 찾을 수 있다.
카테닌 베타-1(CTNNB1; β-카테닌이라고도 함)은 세포-세포 부착 및 유전자 전사의 조절 및 조정에 관여하는 이중 기능 단백질이다. 인간 Ctnnb1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 예는, 예를 들어 Gen Bank Gene ID: 1499 및 GenBank 수탁 번호 NM_001098209.1 및 NP_001091679.1에서 찾을 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 세포의 게놈은 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 불활성화/억제하도록 편집될 수 있다. 세포의 게놈은, 비제한적으로, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR) 및 메가뉴클레아제와 같은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 편집될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR이 사용된다. 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)/Cas9(예, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)) 기술 및 유전자 편집은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Shi et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33(6):661-7; Sander et al. (2014) Nature Biotech., 32:347-355; Jinek et al. (2012) Science, 337:816-821; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Ran et al. (2013) Nature Protocols 8:2281-2308; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:9275-9282; Nishimasu et al. (2014) Cell 156(5):935-49; Swarts et al. (2012) PLoS One, 7:e35888; Sternberg et al. (2014) Nature 507(7490):62-7; addgene.org/crispr/guide 참조). RNA 가이드된 CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA 분자(gRNA)와 함께 Cas9를 발현하는 것을 포함한다. gRNA를 생성하기 위한 가이드라인 및 컴퓨터 지원 방법이 이용 가능하다(예를 들어, CRISPR Design Tool (crispr.mit.edu); Hsu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:827-832; addgene.org/CRISPR; 및 CRISPR gRNA Design tool - DNA2.0 (dna20.com/eCommerce/startCas9) 참조). 동시발현되면, gRNA는 Cas9를 특정 게놈 표적 서열에 결합하고 동원하여 이중 가닥 DNA(dsDNA) 절단을 매개한다. 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 2개)가 투여되어 표적 DNA 내에서 다중 절단을 만들 수 있다. 이중 가닥 절단은 삽입 및/또는 결실을 생성하는 비상동성 말단 봉합(NHEJ) 경로에 의해 수복될 수 있으며, 또는 공여자 템플릿의 존재 하에 대체 돌연변이에 대한 상동성 지정 수복(HDR) 경로에 의해 수복될 수 있다(Overballe-Petersen et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:19860-19865; Gong et al. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol., 12:304-312). CRISPR은 Cas9를 사용하는 것으로 본원에 설명되지만, Cas9 변이체 및 상동체와 같은 다른 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 다른 예로는, 비제한적으로, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9, Cas9 D10A, 고 충실도 Cas9(Kleinstiver et al. (2016) Nature, 529:490-495; Slaymaker et al. (2016) Science, 351:84-88), Cas9 니카아제(Ran et al. (2013) Cell, 154:1380-1389), PAM 특이성이 변경된 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(예, SpCas9_VQR, SpCas9_EQR, 및 SpCas9_VRER; Kleinstiver et al. (2015) Nature, 523:481-485), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9, cas12a(Cpf1)(Rusk, N., Nat. Methods (2019) 16(3):215), 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus)의 CRISPR/Cpf1 시스템, 및 라크노스피라세아(Lachnospiraceae)의 CRISPR/Cpf1 시스템을 포함한다.
CRISPR/Cas9 복합체의 결합 특이성은 두 가지 상이한 요소에 따라 다르다. 첫째, 표적화된 게놈 DNA(genDNA) 서열과 gRNA의 상보적 인식 서열 사이의 결합 상보성(예를 들어, 약 18-22개의 뉴클레오티드, 특히 약 20개의 뉴클레오티드). 둘째, genDNA/gRNA 상보적 영역에 병치된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 존재(Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hsu et al. (2013) Nat. Biotech., 31:827-832; Sternberg et al. (2014) Nature 507:62-67). 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 PAM 모티프는 완전히 특성화되었으며, NGG 또는 NAG이다(Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hsu et al. (2013) Nat. Biotech., 31:827-832). 다른 Cas9 단백질의 다른 PAM도 알려져 있다(예, addgene.org/crispr/guide/ #pam-table 참조). 일반적으로, PAM 서열은 게놈 서열에서 DNA 표적 서열의 3'이다.
가이드 RNA는 별도의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 RNA는 표적 서열(crRNA)에 특이적으로 혼성화할 수 있고 또 다른 RNA(트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA))는 crRNA와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 바람직하게는, 가이드 RNA는 표적 서열(crRNA; 상보적 서열) 및 Cas9에 의해 인식되는 서열(예를 들어, tracrRNA 서열; 스캐폴드 서열)과 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하는 단일 분자(sgRNA)이다. gRNA 스캐폴드 서열의 예는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 5'-GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU (서열번호 517)). 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화하다"는 핵산 분자가 표적 서열에 100% 상보적이어야 함을 의미하지 않는다. 오히려, 서열은 표적 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상보적일 수 있다(예를 들어, gRNA와 게놈 DNA 사이의 상보성). 상보성이 클수록 게놈의 다른 부위에서 원치 않는 절단 이벤트의 가능성이 줄어든다. 특정 실시양태에서, 상보성 영역(예를 들어, 가이드 RNA와 표적 서열 사이)은 적어도 약 10개, 적어도 약 12개, 적어도 약 15개, 적어도 약 17개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 상보성 영역(예를 들어, 가이드 RNA와 표적 서열 사이)은 약 15개 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 15개 내지 약 23개의 뉴클레오티드, 약 16개 내지 약 23개의 뉴클레오티드, 약 17개 내지 약 21개의 뉴클레오티드, 약 18개 내지 약 22개의 뉴클레오티드, 또는 약 20개의 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열번호 34 내지 516 중 하나에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 표적으로 하거나 상기 서열(예, RNA 버전)을 포함한다. 서열은 PAM과 반대되는 서열의 말단(예를 들어, 5' 말단)에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 연장되거나 단축될 수 있다. 서열이 확장되면, 추가된 뉴클레오티드가 게놈 서열과 상응해야 한다.
일부 실시양태에서, gRNA는 자기 절단 가이드 RNA(scgRNA)이다. 자기 절단 gRNA는 단일 가이드 RNA의 5' 및 3' 말단에 리보자임을 포함한다. scgRNA가 발현되면, 자기 절단 리보자임은 세포 내에서 gRNA를 방출하여 Cas9와 함께 작용한다. 일부 실시양태에서, scgRNA는 gRNA의 5'에 해머헤드 리보자임을 포함하고 gRNA의 3' 말단에 델타 간염 바이러스 리보자임을 포함한다. 일부 실시양태에서, scgRNA는 pol2 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, scgRNA는 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, scgRNA는 알부민 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 Cas9(예를 들어, Cas9를 코딩하는 단백질 및/또는 핵산 분자) 및 적어도 하나의 gRNA(예를 들어, gRNA를 코딩하는 핵산 분자)를 세포 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9는 에스. 피오게네스 Cas9이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 PAM은 5'UTR, 3'UTR, 프로모터 또는 인트론(예를 들어, 제1 인트론)에 있다. 본 발명의 핵산은 연속적으로(전 또는 후) 및/또는 동일 시간에(동시에) 투여될 수 있다. 핵산 분자는 동일한 조성물 또는 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 단일 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 플라스미드)로 전달된다.
상기에 언급된 바와 같이, 억제 핵산 분자, 예컨대 안티센스, siRNA 또는 shRNA 분자 (또는 억제 핵산 분자를 코딩하는 핵산 분자)는 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1, 및/또는 CYPOR을 불활성화/억제하는 데 사용될 수 있다. 억제 핵산 분자(예를 들어, shRNA)가 세포 또는 대상체에게 전달될 때, 억제 핵산 분자는 직접 투여될 수 있거나 발현 벡터가 사용될 수 있다. 억제 핵산 분자(예를 들어, shRNA)에 대한 예시적인 표적 서열은, 비제한적으로, 서열번호 2 내지 33 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, shRNA는 마이크로 RNA에 내포된다.
핵산 분자를 세포(대상체 포함)에 투여하는 단계는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 (예를 들어, 바이러스 벡터가 사용되는 경우) 감염에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 주사, 형질감염, 전기천공, 생물학적 입자 전달 시스템(예를 들어, 유전자 총), 초음파 천공(예를 들어, 세포 투과성을 증가시키기 위한 세포 초음파 처리), 자기 감염(예를 들어, 핵산을 포함하는 입자를 표적 세포로 가져오기 위한 자기장의 사용), 유체 역학적 전달, 리포플렉스 전달, 폴리머좀 전달, 폴리플렉스 전달, 덴드리머 전달, 나노입자 전달(예, 무기 나노입자)에 의해 및/또는 세포 침투 펩티드 사용을 통해 세포에 전달된다.
본 발명의 핵산 분자는 벡터(예를 들어, 플라스미드, 트랜스포손, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 렌티바이러스) 등) 내에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 핵산 서열은 강력한 프로모터, 구성적 프로모터, 조직 또는 세포 특이적 프로모터(예를 들어, 간세포 특이적 프로모터) 및/또는 조절된 프로모터를 포함하는 벡터 내의 적절한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 프로모터의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, RNA 폴리머라제 II 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 RNA 폴리머라제 III 프로모터(예를 들어, U6 및 H1; 예를 들어, Myslinski et al. (2001) Nucl. Acids Res., 29:2502-09 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원하는 핵산 서열은 내인성 프로모터(예를 들어, 세포 내 프로모터)로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 통합 벡터이다. 추가 실시양태에서, 통합 벡터는 DNA를 절단하기 위한 엔도뉴클레아제 효소 또는 유전자 발현을 활성화하기 위한 프로모터의 사용을 필요로 하지 않는다(예를 들어, GeneRide™ 기술(LogicBio Therapeutics, 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)을 이용함). GeneRide™는 DNA를 절단하기 위한 엔도뉴클레아제 효소 또는 유전자 발현을 활성화하기 위한 프로모터의 사용이 필요하지 않은 유전 물질의 부위 특이적 전달을 가능하게 하는 상동성 재조합을 사용하는 유전자 편집 전략이다. 추가 실시양태에서, 방법은 통합이 무작위로 발생하도록 자신의 내인성 프로모터와 함께 무작위 통합 벡터를 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 비통합 벡터를 사용한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 특히 rAAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 DNA 벡터이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 합성 올리고뉴클레오티드 벡터를 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 거품성 바이러스, 온코바이러스 및/또는 렌티바이러스에 기초한 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 아데노바이러스를 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 AAV를 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터의 외피 단백질 유사형을 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 복제 적격 벡터 및 시스 및 트랜스 작용 요소를 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 단순포진 바이러스를 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 세포에 투여되는 프로드러그(프로톡신)는 CYP 활성 또는 CYP 활성에 의존하는 활성에 의해 대사되는 화합물(예를 들어, 소분자)이다. 세포에 투여될 프로드러그(프로톡신)의 독성은 독소 대사산물이 편집된 세포에서 유리한 내성이 달성될 수 있도록 충분히 독성이 있는지 여부를 결정하기 위해 세포에서 테스트될 수 있다. 일부 실시양태에서, 독소의 치사율이 측정될 수 있으며, 여기서 미처리된 세포에 세포 사멸 또는 아폽토시스를 유발하는 독소는 편집된 세포에서 유리한 내성이 달성될 수 있도록 충분히 독성이다. 일부 실시양태에서, 세포 내의 바이오마커는 독소가 충분히 독성인지를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, 간세포와 관련하여, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 트랜스아미나제(AST), 알칼리성 포스파타제(ALP), 또는 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT)를 비제한적으로 포함하는 특정 간 효소의 상승된 수준이 검출되면 독소가 충분히 독성이 있는 것으로 결정될 수 있다. 이들 간 효소 중 하나 이상의 발현 증가는 간독성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 여기서 적어도 경도 내지 중등도의 간독성의 존재는 필요한 독성을 입증한다. 더욱이, 경도 내지 중등도 간독성을 달성하기 위한 용량 가이드라인은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Jaeschke, H. (2015) Dig. Dis., 33:464-471; Arafa, et al. (2018) Toxicol. Appl. Pharmacol., 346:37-44; Calvo, et al. (2017) Invest New Drugs, 36(3):476-486; Fashe et al. (2015) Chem. Res. Toxicol., 28:702-710; Huttunen et al. (2008) Curr. Med. Chem., 15:2346-2365; Maruyama et al. (1995) Dig. Dis. Sci., 40:2602-2607; McEneny-King et al. (2017) Bioorg. Med. Chem. Lett., 27:2443-2449 참조).
간독성은 약물 유도 간손상 네트워크(DILIN)에서 개발한 5점 척도를 사용하여 등급을 매길 수 있다(예, Fontana, et al. (2009) Drug Safety, 32:55-68 참조). 경도 간독성 (또는 1+)은 다음과 같이 정의된다: 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제 수준 또는 둘 다, 하지만 총 혈청 빌리루빈은 < 2.5 mg/dL 미만이고 응고병증이 감지된다(INR < 1.5). 중등도 간독성 (또는 2+)은 다음과 같이 정의된다: 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제 수준 또는 둘 다, 그리고 2.5 mg/dL 이상의 총 혈청 빌리루빈 수준 또는 고 빌리루빈혈증이 없는 응고병증(IND ≥ 1.5). 중등도 내지 중증의 간독성 (또는 3+)은 다음과 같이 정의된다: 증가된 혈청 아미노트랜스퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제 수준 및 ≥ 2.5 mg/dL의 총 혈청 빌리루빈 수준 및 약물 유도 간 손상으로 인한 입원 (또는 기존 입원의 연장). 중증 간독성 (또는 4+)은 다음과 같이 정의된다: 증가된 혈청 아미노트랜스퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제 수준 및 ≥ 2.5 mg/dL의 혈청 빌리루빈 및 하기 중 적어도 하나: (a) 연장된 황달 및 3개월이 넘는 증상, (b) 간 부전의 징후(INR ≥ 1.5, 복수, 뇌병증) 또는 (c) 약물 유도 간 손상과 관련이 있다고 여겨지는 기타 장기 부전.
상기 설명된 바와 같이, 프로드러그(프로톡신)는 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간에게 프로드러그(프로톡신)의 유효 용량을 투여하는 방법을 제공하며, 여기서 경증 내지 중등도의 간독성을 나타내는 혈액으로부터의 상승되거나 비정상적인 간 기능 테스트는 선택된 또는 편집된 세포를 증폭하기에 충분한 용량을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 성체에서 선택적 독성을 유도하기에 충분한 아세트아미노펜의 투여량은 (1) 연속일로 6 g/일 아세트아미노펜, 또는 (2) 단일 용량으로서의 10 g 초과의 아세트아미노펜이다.
본원에 사용된 바와 같이, CYP 의존성 독소는 독성이 CYP 효소, Cypor(POR) 단백질 또는 둘 다를 포함하는 사이토크롬 p450 대사에 의한 활성화에 의존하는 프로드러그(프로톡신)를 의미한다. 많은 CYP 의존성 독소는 사이토크롬 p450 대사에 의해 대사적으로 활성화된다(일반적으로, Jaeschke, H. (2015) Dig. Dis., 33:464-471; Huttunen et al. (2008) Curr. Med. Chem., 15:2346-2365 참조). 종종 모 화합물은 비활성이고 무독성이지만(예, 프로드러그), Cyp 매개 효소 전환에 의해 생성된 대사산물(들)은 독성, 특히 간독성이다. 예를 들어, 아세트아미노펜은 3개의 POR 의존성 CYP 효소(CYP1A2, CYP2E1 및 CYP3A4)에 의해 간독성 화합물 N-아세틸-p-벤조퀴논 이민(NAPQI)으로 대사된다. 일부 실시양태에서, Cyp 의존성 독소는 유전자 변형된 간세포 또는 다른 변형된 세포의 생체 내 선택에 사용되며, 여기서 독성 대사산물을 생성하는 것을 담당하는 Cyp 활성은 불활성화되었다. CYP 의존성 독소의 예는 하기 표 1에 제공된다.
Figure pct00001
일 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP2E1, CYP1A2, CYPA4 또는 CYP2D6 중 임의의 것에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 아세트아미노펜(APAP)을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP3A4에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 레트로신을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는 탄그레틴을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP2B6, CYP2C9 또는 CYP3A4 중 임의의 것에 의해 촉진되는 히드록실화에 의해 활성 약물 포스포라미드 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 시클로포스파미드를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 이포스파미드 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 이포스파미드를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 트로포스파미드 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 트로포스파미드를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 PMEA-트리포스페이트로 전환되는 프로드러그로서 프라데포비르를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 araC-트리포스페이트로 전환되는 프로드러그로서 MB07133을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 MB07344로 전환되는 프로드러그로서 MB07811을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화에 의해 활성 약물 부파르바쿠온 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 부파르바쿠온 히드록시이민을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화에 의해 활성 약물 나부메톤으로 전환되는 프로드러그로서 나부메톤 히드록시이민을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, O-탈메틸화 환원에 의해 활성 약물 푸라미딘(DB75) 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 DB289를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 환원에 의해 활성 약물 Ro 48-3888 머스타드로 전환되는 프로드러그로서 시브라피반을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 환원에 의해 활성 약물 멜라가트탄으로 전환되는 프로드러그로서 시멜라가트란을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 환원에 의해 활성 약물 구아나벤즈로 전환되는 프로드러그로서 구아녹사벤즈를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 환원에 의해 활성 약물 AQ4로 전환되는 프로드러그로서 AQ4N을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 MTIC로 전환되는 프로드러그로서 다카르바진("DTIC")을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화에 의해 활성 약물 5-FU로 전환되는 프로드러그로서 테가푸르를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화 또는 에폭시화에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 4-이포메아놀을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 고리화에 의해 활성 약물 PNU-159682로 전환되는 프로드러그로서 DDMX("PNU-152243")를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP3A4에 의해 촉진되는 히드록실화에 의해 활성 약물 4-히드록시-타목시펜으로 전환되는 프로드러그로서 타목시펜을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, N-탈메틸화에 의해 활성 약물 N-데스메틸-타목시펜으로 전환되는 프로드러그로서 타목시펜을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 히드록실화 또는 N-탈메틸화에 의해 활성 약물 엔독시펜으로 전환되는 프로드러그로서 타목시펜을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP3A4에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 케토코나졸을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP2D6에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 트라마돌을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP1A2에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 타크린을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP3A4에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 라시오카르핀을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP3A4에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 센키르킨을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP1A1, CYP1A2 또는 CYP2C8 중 임의의 것에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 다스카르바진을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, CYP2A6, CYP1A2 또는 CYP2C8 중 임의의 것에 의해 활성 약물로 전환되는 프로드러그로서 테가푸르를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화에 의해 활성 약물 R-130964로 전환되는 프로드러그으로서 클로피도그렐을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화 또는 에폭시화에 의해 활성 약물 PYRRO/NO로 전환되는 프로드러그로서 V-PYRRO/NO를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, CYP 의존성 독소는, 산화 또는 에폭시화에 의해 활성 약물 PROLI/NO로 전환되는 프로드러그로서 V-PROLI/NO를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포 집단을 선택적으로 증폭 및/또는 확장하는 방법으로서,
a) i) gRNA(예, scgRNA)로서, 여기서 gRNA 서열은 cas9 뉴클레아제와 결합하여 CYP 효소(들), Cypor 유전자 또는 Ctnnb1 유전자를 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 그렇지 않으면 방해하도록 디자인된 활성 부위 뉴클레아제를 생성하는 것;
ii) 폴리머라제 II 프로모터(예, 세포 및/또는 조직 특이적 프로모터);
iii) 트랜스진(선택적);
iv) 원하는 수용자 세포 좌위로의 상동성 통합을 촉진, 증진 또는 그렇지 않으면 가능하도록 디자인된 세포 및/또는 조직 특이적 상동성 아암 서열
을 포함하는 공여자 분자를 투여하는 단계;
b) cas9 뉴클레아제(예, Cas9를 코딩하는 단백질 또는 핵산)를 투여하는 단계로서, 여기서 cas9 뉴클레아제는 gRNA와 결합하여 CYP 효소(들), Cypor 유전자 또는 Ctnnb1 유전자를 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 그렇지 않으면 방해하도록 디자인된 활성 부위 뉴클레아제를 생성하는 것인 단계; 및
c) 프로드러그(프로톡신)(예, CYP 의존성 독소)를 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
scgRNA 공여자 분자는 (cas9에 결합할 수 있는) 기능적 gRNA의 발현을 허용한다. scgRNA의 발현은 특정 세포 및/또는 조직 유형(예, 원하는 유전자 편집 이벤트를 겪은 것)으로 제한될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포유류 세포에 의해 사용되는 세포 유형 특이적 프로모터는 RNA 폴리머라제 II(Pol2) 프로모터를 사용한다. 이러한 프로모터에 의해 구동되는 전사가 cas9 gRNA의 적절한 처리를 허용하지 않는다는 것도 당업계에 알려져 있다. 내포된 Pol2 프로모터 서열을 갖는 DNA 공여자 분자의 상동성 재조합을 겪은 수용자 세포만이, DNA 공여자 분자가 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는 임의의 트랜스진 및 gRNA를 포함하는 DNA 공여자 분자 서열을 전사한다는 것이 또한 당업계에 공지되어 있다. 반대로, 상기 상동성 DNA 공여자 분자의 무작위 통합은 기능적 gsRNA 또는 트랜스진 발현을 생성하지 않을 것이라는 것이 당업계에 알려져 있다. gRNA 서열의 상류 및 하류 모두에 내포된 상동성 아암을 사용하여 gRNA 서열을 DNA 공여자 분자에 내포시킴으로써, 세포 및/또는 조직 특이적 상동성 재조합 및 DNA 공여자 분자의 수용자 세포 게놈으로의 통합이 촉진된다. 또한, 하나 이상의 리보자임 서열이 gRNA 서열의 상류에 내포되고("왼쪽 리보자임") 하나 이상의 리보자임 서열이 gRNA 서열의 하류에 내포되는("오른쪽 리보자임") 것으로서 DNA 공여자 분자에 gRNA 서열을 내포시킴으로써, gRNA 서열을 포함하는 스플라이싱되지 않은 Pol2 RNA 전사체는 왼쪽 리보자임과 오른쪽 리보자임에 의한 결합 절단에 의해 적절하게 처리된다. 따라서, 특정 세포 및/또는 조직 유형을 표적으로 하는 트랜스진 및 기능성 gRNA의 비무작위 동시적 동시발현은 scgRNA 분자에 의해 가능해진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, gRNA 서열은 트랜스진의 인트론에 내포된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터가 사용된다. 다른 실시양태에서, pX330 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에서, 상동성 통합은 GeneRide™ 기술을 사용하여 촉진되며, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트 모두 자체 프로모터가 결여되어 있으며; 표적 좌위로의 상동성 재조합 후 트랜스진 및 CYP 독소 선택 카세트 모두 세포 프로모터에 의해 발현되고; 표적 통합만 선택된다. 추가 실시양태에서, 통합은 무작위 통합 벡터를 사용하여 촉진된다. 일부 실시양태에서, 상동성 통합은 무작위 통합 벡터를 사용하여 촉진되며, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트는 모두 자체 프로모터(들)를 갖고; 세포 염색체로의 무작위 통합 후, 트랜스진 및 CYP 독소 선택 카세트가 모두 발현되고; 모든 염색체 통합이 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 서열은 cas9 뉴클레아제와 조합되도록 디자인되어, 개별 CYP 효소를 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 그렇지 않으면 방해하는 활성 부위 특이적 뉴클레아제를 생성한다. 일부 실시양태에서, gRNA 서열은 cas9 뉴클레아제와 조합되도록 디자인되어, CYP 효소의 발현에 필요한 전사 인자 Ctnnb1(베타-카테닌)을 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 그렇지 않으면 방해하는 활성 부위 특이적 뉴클레아제를 생성한다.
일 측면에서, 본 개시 내용은 하기를 코딩하는 scgRNA 공여자 분자 서열 (및 그의 모든 보존적으로 변형된 변이체)을 제공한다: (a) 서열번호 1의 잔기 1 내지 45, 및 4,406 내지 4,550에 제시된 연쇄동일서열(concatemer) 형성을 보조하기 위한 상응하는 역 말단 반복("ITR"), (b) 서열번호 1의 잔기 212 내지 1,516 및 2,978 내지 3,012에 제시된 상응하는 마우스 알부민 상동성 아암, (c) 서열번호 1의 잔기 1,517 내지 1,582에 제시된 RNA 폴리머라제 II 프로모터 서열, (d) 서열번호 1의 잔기 1,589 내지 2,971에 제시된 인간 인자 IX 서열의 예, (e) 서열번호 1의 잔기 3,026 내지 3,068에 제시된 해머헤드 리보자임 서열의 예, (f) 서열번호 1의 잔기 3,067 내지 3,088에 제시된 인간 POR 유전자에 상보적인 DNA 표적화 세그먼트를 포함하는 gRNA의 예, 및 (g) 서열번호 1의 잔기 3,089 내지 3,236에 제시된 델타 간염 바이러스 리보자임의 예. 일부 실시양태에서, Cypor Human Factor 9 GeneRide™는 플라스미드에 rAAV 벡터로 포함된다. 일 실시양태에서, 요소 (e) 및 (g)는 스플라이싱되지 않은 Pol2 프로모터 생성 RNA 전사체를 절단하여 적절하게 처리된 gRNA를 방출한다. 비제한적인 예에서, 요소 (e) 서열의 3' 말단은, 간격없이 요소 (f)의 5' 말단으로부터 바로 상류(5')에 최적으로 위치하고, 요소 (g)의 5' 말단은, 간격없이 요소 (f)의 3' 말단으로부터 바로 하류(3')에 최적으로 위치한다. 일부 실시양태에서, 요소 (e) 및 (g)는 각각 요소 (f)로부터 바로 상류 및 하류에 위치하지 않지만, 각각 요소 (f)로부터, 요소 (e)의 경우에는 상류에서 100개 이상의 염기쌍(예를 들어, 50개 이상, 70개 이상, 또는 100개 이상의 염기쌍)만큼, 그리고 요소 (g)의 경우에는 하류에서 100개 이상의 염기쌍(예를 들어, 50개 이상, 70개 이상 또는 100개 이상의 염기쌍)만큼 떨어져 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소 (f)는 서열번호 34 내지 516 중 하나에 제시된 바와 같은 인간 POR 유전자에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 집단을 선택적으로 증폭 및/또는 확장하는 방법으로서,
a) i) 폴리머라제 III 프로모터(예, U6 프로모터 서열);
ii) gRNA로서, 여기서 gRNA 서열은 cas9 뉴클레아제와 결합하여, CYP 효소(들) 또는 Cypor 유전자를 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 방해하도록 디자인된 활성 부위 뉴클레아제를 생성하는 것;
iii) 프로모터;
iv) SpCAS9 서열로서, 여기서 cas9 뉴클레아제는 요소 (b)의 gsRNA와 결합하여 CYP 효소(들), Cypor 유전자 또는 Ctnnb1을 절단, 녹다운, 녹아웃 및/또는 방해하도록 디자인된 활성 부위 뉴클레아제를 생성하는 것
을 포함하는 공여자 분자를 투여하는 단계; 및
b) 프로드러그(프로톡신)(예, CYP 의존성 독소)를 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 요소 ii)의 gRNA는 서열번호 34-516 중 하나에 제시된 바와 같은 인간 POR 유전자에 상보적인 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, pX330 플라스미드 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에서, 상동성 통합은 GeneRide™ 기술을 사용하여 촉진되며, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트 모두 자체 프로모터가 결여되어 있고; 표적 좌위로의 상동성 재조합 후, 트랜스진 및 CYP 독소 선택 카세트 모두 세포 프로모터에 의해 발현되고; 표적화된 통합만 선택된다. 추가 실시양태에서, 상동성 통합은 무작위 통합 벡터를 사용하여 촉진되고, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트는 모두 자체 프로모터(들)를 갖고; 세포 염색체로의 무작위 통합 후, 트랜스진 및 Cypor 선택 카세트 모두 발현되고; 모든 염색체 통합이 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 집단을 선택적으로 증폭 및/또는 확장하는 방법으로서,
a) i) 폴리머라제 III 프로모터(예, U6 프로모터 서열);
ii) 렌티바이러스 구성체, shRNAmir 백본으로서, 여기서 마이크로RNA에 내포된 shRNA는 Cypor 유전자에 상동성인 서열을 포함하는 것
을 포함하는 공여자 분자를 투여하는 단계; 및
b) 프로드러그(프로톡신)(예, CYP 의존성 독소)를 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 요소 ii)의 shRNA는 서열번호 2-33 중 하나에 제시된 바와 같은 인간 POR 유전자에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터가 사용된다. 다른 실시양태에서, pX330 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에서, 상동성 통합은 GeneRide™ 기술을 사용하여 촉진되며, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트 모두 자체 프로모터가 결여되어 있고; 표적 좌위로의 상동성 재조합 후, 트랜스진 및 CYP 독소 선택 카세트 모두 세포 프로모터에 의해 발현되고; 표적 통합만이 선택된다. 추가 실시양태에서, 통합은 무작위 통합 벡터를 사용하여 촉진된다. 일부 실시양태에서, 상동성 통합은 무작위 통합 벡터를 사용하여 촉진되며, 여기서 트랜스진 및 선택 카세트 모두 자체 프로모터(들)를 갖고; 세포 염색체로의 무작위 통합 후, 트랜스진 및 CYP 독소 선택 카세트 모두 발현되고; 모든 염색체 통합이 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 mRNA 기반 공여자 분자를 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, RNA 분자는 gRNA 및 Cas9를 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료, 억제 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은, 트랜스진이 치료할 질환 또는 장애에 대해 치료적인(예를 들어, 치료 단백질을 코딩하는) 본 발명의 방법을 수행하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 프로드러그(프로톡신)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 유전자 편집 세포가 생체 내에서 성장할 수 있는 모든 시스템에서 사용할 수 있다. 표적 조직의 예로는, 비제한적으로, 간(예, 간세포 및/또는 담관), 조혈계(예, 줄기 세포, T 세포 및/또는 전구 세포), 피부(예, 진피 및/또는 모공 줄기 세포), 신장(예, 관상피), 장(예, 줄기 세포), 폐 및 췌장이 포함된다.
일부 실시양태에서, 치료할 질환 또는 장애는 간 질환이다. 간 질환의 예로는, 비제한적으로, 간경변, 섬유증, 간세포 암종(HCC) 및 간 감염이 포함된다. 일부 실시양태에서, 치료할 질환 또는 장애는 크리글러-나자르 증후군(1형 및 2형), 가족성 고콜레스테롤혈증, 단풍당밀뇨증, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 페닐케톤뇨증, 티로신혈증, VIII형 점액다당류증, 알파-1 항트립신(AAT) 결핍, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 결핍, 윌슨병, 글리코겐 저장 질환, 폰 기르케병, 폼페병, 고빌리루빈 혈증, 급성 간헐성 포르피린증(AIP) 및 시트룰린 혈증 1형을 포함하는 유전적 간 장애의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료할 질병 또는 장애는 혈우병 A, 혈우병 B 및 옥살산증의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료할 질환 또는 장애는 B형 간염 또는 C형 간염이다. 일부 실시양태에서, 치료할 질환 또는 장애는 간종, 담관암, 간의 전이성 종양 및 간외 종양의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료할 질환 또는 장애는 급성 간부전, 동종 이식 거부 및 이종 이식 거부의 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 성분은 일반적으로 약학 제제로서 대상체에게 투여된다. 본원에 사용된 용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간 또는 동물 대상체를 지칭한다. 본 발명의 성분은 지시된 질환 또는 장애의 치료를 위해 의사의 가이드 하에 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 성분을 포함하는 약학 제제는 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 술폭시드(DMSO), 오일, 세제, 현탁제 또는 이들의 적합한 혼합물과 같은 허용가능한 매질(예, 약학적으로 허용가능한 담체)과 투여를 위해 편리하게 조제될 수 있다. 선택된 매질에서 작용제의 농도는 다양할 수 있고 매질은 약학 제제의 원하는 투여 경로에 기초하여 선택될 수 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 투여할 작용제와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 약학 제제에서의 사용이 고려된다.
적합한 약학 제제의 선택은 선택된 투여 방법에 따라 달라진다. 예를 들어, 본 발명의 성분은 임의의 원하는 조직(예를 들어, 간) 또는 주변 영역에 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 이 경우, 약학 제제는 혈액 또는 표적 조직에 적합한 매질에 분산된 성분을 포함한다.
예를 들어, 치료법은 비경구로, 혈류에 주사로(예를 들어, 정맥 내), 경구로, 또는 피하, 근육내 또는 복강내 주사로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료법은 직접 주사로(예를 들어, 치료할 조직 내로) 또는 경구로 투여된다. 주사를 위한 약학 제제는 당업계에 공지되어 있다. 치료법을 실시하기 위한 방법으로 주사를 선택한 경우, 충분한 양의 분자가 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 발휘할 수 있도록 조치를 취해야 한다.
본 발명의 화합물을 활성 성분으로서 약학 담체와 밀접하게 혼합하여 함유하는 약학 조성물은 통상적인 약학 배합 기술에 따라 제조될 수 있다. 담체는 투여를 위해 원하는 제제의 형태, 예를 들어 정맥내, 경구 또는 비경구에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여 형태의 제제에서, 예를 들어, 경구 액체 제제(예를 들어, 현탁액, 엘릭시르 및 용액 등)의 경우, 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향료, 방부제, 착색제 등; 또는 경구 고체 제제(예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제 등)의 경우, 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체와 같은 통상적인 약학 매질 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 주사가능한 현탁액이 제조될 수 있으며, 이 경우 적절한 액체 담체, 현탁제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 조제될 수 있다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료 중인 환자에게 적합한 약학 제제의 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 각 투여량은 선택된 약학 담체와 관련하여 원하는 효과를 생성하도록 계산된 활성 성분의 양을 포함해야 한다. 적절한 투여량 단위를 결정하기 위한 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다. 투여량 단위는 환자의 체중에 따라 비례적으로 증가 또는 감소할 수 있다. 특정 병리학적 상태의 완화를 위한 적절한 농도는 당업계에 알려진 바와 같이 투여 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 방법의 효능을 모니터링하기 위해 본 발명의 조성물(들)을 투여한 후 대상체에서 질환 또는 장애를 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, gRNA를 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 pol2 프로모터(예를 들어, 조직 또는 세포 특이적 pol2 프로모터)의 제어 하에 자기 절단 가이드 RNA(scgRNA)를 발현하는 단계를 포함한다. 자기 절단 gRNA는 단일 가이드 RNA의 5' 및 3' 말단에 리보자임을 포함한다. scgRNA가 발현되면, 자기 절단 리보자임은 세포 내에서 gRNA를 방출하여 Cas9와 함께 작용한다. 일부 실시양태에서, scgRNA는 gRNA의 5'에 해머헤드 리보자임을 포함하고 gRNA의 3' 말단에 델타 간염 바이러스 리보자임을 포함한다. scgRNA의 발현은 모든 유전자 편집 이벤트(예, 상동성 재조합)와 함께 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, scgRNA는 (예를 들어, 세포에서 하나 이상의 CYP 효소, CTNNB1 및/또는 CYPOR을 억제하기 위해) 본원에 기재된 유전자 편집과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, scgRNA는 (예를 들어, 특히 푸마릴아세토아세테이트 가수 분해 효소(Fah-/-) 배경에서 페닐피루베이트 디옥시게나제(Hpd) 또는 호모겐티식산 디옥시게나제(Hgd)를 억제하기 위해) 실시예 3에 기재된 유전자 편집과 함께 사용된다. pol2 프로모터(예를 들어, 조직 또는 세포 특이적 pol2 프로모터)의 제어 하에 scgRNA를 포함하는 벡터도 본 발명에 포함된다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 하기 정의가 제공된다.
단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 모든 언급은 문맥이 달리 명시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
"약학적으로 허용가능한"은 동물, 특히 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의한 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 승인을 나타낸다.
"담체"는 예를 들어 희석제, 보조제, 방부제(예, 티머솔, 벤질 알콜), 항산화제(예, 아스코르브산, 나트륨 메타바이술파이트), 가용화제(예, Tween® 80, 폴리소르베이트 80), 유화제, 완충제(예, 트리스 HCl, 아세테이트, 포스페이트), 항균제, 증량 물질(예, 락토스, 만니톨), 부형제, 보조제 또는 본 발명의 활성제가 함께 투여되는 비히클을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 특히 주사 용액의 경우 담체로 사용된다. 적합한 약학 담체는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Rowe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Pr에 기술된다.
본원에 사용된 용어 "치료하다"는 환자의 병태(예를 들어, 하나 이상의 증상에서)의 개선, 병태 진행의 지연 등을 포함하여 질환을 앓고 있는 환자에게 이익을 주는 임의의 유형의 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다"는 병태가 발병할 위험이 있는 대상체의 예방적 치료를 의미하며, 그 결과 대상체가 병태를 발전시킬 확률이 감소된다.
화합물 또는 약학 조성물의 "치료적 유효량"은 특정 장애 또는 질환 및/또는 이의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 데 효과적인 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 동물, 특히 포유동물, 특히 인간을 지칭한다.
용어 "단리된"은 생산 동안 존재하는 다른 성분으로부터의 화합물의 분리를 의미한다. "단리된"은, 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 근본적인 활성을 실질적으로 방해하지 않고, 예를 들어 불완전한 정제 또는 안정화제의 첨가로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 리보- 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드, 바람직하게는 3개 초과로 구성된 핵산 분자를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 인자와 올리고뉴클레오티드의 특정 적용 및 사용에 따라 달라진다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 지칭하고, 단일 가닥인 경우, 선형 또는 환형 형태의 상보적 서열 분자를 지칭한다. 핵산 분자를 논의함에 있어서, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 일반적인 관례에 따라 본원에 기술될 수 있다. 본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리된 핵산"이 때때로 사용된다. 이 용어는 DNA에 적용될 때 그것이 기원한 유기체의 자연 발생 게놈에서 즉시 인접한 서열과 분리된 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA에 통합되는 DNA 분자를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 핵산 서열이, 예를 들어 발현 및/또는 복제될 수 있는 숙주 세포로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자(예를 들어, RNA 또는 DNA)를 지칭한다. 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있으며 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입 또는 임의의 다른 모드의 세포 침투를 통해 외인성 물질을 수용자 세포로 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서의 발현에 필요한 작동 가능하게 연결된 조절 영역(예, 프로모터, 인핸서, 번역 시작 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결자 등)에 필요한 유전자 또는 핵산 서열을 포함하는 특수 벡터이다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열의 발현에 영향을 미치도록 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 있는 DNA 분자에 배치되는 것을 의미한다. 이 동일한 정의는 발현 벡터에서 코딩 서열 및 전사 제어 요소(예, 프로모터, 인핸서 및 종결 요소)의 배열에 때때로 적용된다.
본원에 사용된 용어 "소분자"는 비교적 낮은 분자량(예를 들어, 4,000 미만, 2,000 미만, 특히 1 kDa 또는 800 Da 미만)을 갖는 물질 또는 화합물을 지칭한다. 일반적으로, 소분자는 유기적이지만, 단백질, 폴리펩티드, 아미노산 또는 핵산이 아니다.
용어 "작은 간섭 RNA(siRNA)"는 짧은(전형적으로, 30개 미만의 뉴클레오티드 길이, 특히 12-30개 또는 20-25개의 뉴클레오티드 길이) 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 일반적으로, siRNA는 siRNA가 표적화되는 유전자의 발현을 조절한다. siRNA 분자를 확인하고 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc). 짧은 헤어핀 RNA 분자(shRNA)는 일반적으로 작은 루프 서열(예, 6-15개의 뉴클레오티드, 특히 7-10개의 뉴클레오티드)에 의해 분리된 짧은 상보적 서열(예, siRNA)로 구성되며, 여기서 서열 중 하나는 유전자 표적에 상보적이다. shRNA 분자는 일반적으로 엔도뉴클레아제에 의해 세포 내에서 siRNA로 처리된다. siRNA 분자에 대한 예시적인 변형은 미국 출원 공개 번호 20050032733에서 제공된다. 예를 들어, siRNA 및 shRNA 분자는 뉴클레아제 내성 변형으로 변형될 수 있다(예, 포스포로티오에이트, 잠금 핵산(LNA), 2'-O-메틸 변형, 또는 모르폴리노 결합). siRNA 또는 shRNA 분자의 발현을 위한 발현 벡터는 구성적이거나 조절될 수 있는 강력한 프로모터를 사용할 수 있다.
"안티센스 핵산 분자" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 선택된 서열(예를 들어, 번역 개시 부위 및/또는 스플라이스 부위)에 표적화(상보적)되는 핵산 분자(예, 단일 가닥 분자)를 포함하여 관심 단백질의 발현을 억제한다. 이러한 안티센스 분자는 전형적으로 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 더욱 특히 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드이며, 종종 mRNA 분자의 번역 시작 부위에 걸쳐 있다. 역 배향으로 표적 핵산 분자의 전체 서열을 포함하는 안티센스 구성체도 생성될 수 있다. 임의의 공지된 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표준 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 내성 변형을 포함하도록 전술 한 바와 같이 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "하류"는 참조 좌위와 관련하여 3' 말단에 더 가까이 위치한 유전적 좌위 또는 서열 위치를 의미하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 서열은 5' 말단으로 시작하여 3' 말단에서 끝날 때까지 "5'에서 3'"으로 이어진다.
본원에 사용된 "공여자 분자"는 외인성 분자를 의미하며, 여기서 상기 분자는 수용자 세포에 영향을 미치도록 디자인된다.
본원에 사용된 "내포된"은 더 큰 합성 올리고뉴클레오티드 내에 특정한 원하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하여 단일 분자를 형성하는 것을 의미하며, 여기서 상기 분자는 내포된 서열의 추가 활성 또는 목적을 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다.
본원에 사용된 "상동성 아암"은 수용자 세포 게놈으로의 공여자 분자의 상동성 통합을 증진, 촉진 및 가능하도록 디자인된 원하는 유전자 좌위에 상동성을 갖는 표적 서열을 의미한다.
본원에 사용된 "통합 벡터"는 수용자 세포 염색체 또는 게놈에 통합된 공여자 분자, 트랜스진 또는 기타 외인성 DNA 또는 RNA를 전달하는 벡터를 의미한다.
본원에서 사용되는 "녹아웃"은 유기체의 유전자가 작동하지 않게 만드는 기술을 의미한다.
본원에서 사용되는 "녹다운"은 유기체의 유전자 발현을 감소시키는 기술을 의미한다.
본원에서 사용되는 "프로드러그"는 생물학적 시스템에 투여될 때 자발적인 화학 반응(들), 효소 촉매 화학 반응(들), 광분해 및/또는 대사 화학 반응(들)의 결과로 약물 물질, 즉 활성 성분을 생성하는 임의의 화합물을 의미한다. 따라서, 프로드러그는 치료 또는 독성 활성을 갖는 화합물의 공유 변형된 유사체 또는 잠재 형태(예를 들어, 프로톡신)이다.
"링커"는 2개 이상의 화합물을 공유적으로 결합하는 원자 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 링커는 화합물의 임의의 합성 가능한 위치에 연결될 수 있지만, 바람직하게는 화합물의 원하는 활성의 차단을 방지하는 방식으로 연결될 수 있다. 링커는 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 1 내지 약 50개의 원자, 1 내지 약 10개의 원자, 또는 약 1 내지 약 5개의 원자를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "shRNAmir"는 마이크로RNA 내포 shRNA 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "비통합 벡터"는 공여자 분자, 트랜스진, 또는 다른 외인성 DNA 또는 RNA를 전달하는 벡터를 의미하며, 여기서 상기 공여자 분자는 에피솜으로 남아 있고/있거나 수용자 세포 염색체 또는 게놈에 통합되지 않는다.
본원에 사용되는 "합성 올리고뉴클레오티드"는 인간이 만들고 기존의 천연 공급원으로부터 단리되지 않은 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 "표적 서열"은 "표적 부위" 또는 "표적 서열"을 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은, 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우, 벡터의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 본원에 상호 교환적으로 사용된다. 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 일반적으로 세포에 존재하는 생리학적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건(예를 들어, 무세포 시스템의 조건)은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조). 가이드 RNA에 상보적이며 그와 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보적 가닥"으로 지칭되고 "상보적 가닥"에 상보적인 (이에 따라 가이드 RNA에 상보적이지 않은) 표적 DNA의 가닥은 "비상보적 가닥" 또는 "비-상보적 가닥"으로 지칭된다. "부위 지정 변형 폴리펩티드" 또는 "RNA 결합 부위 지정 폴리펩티드" 또는 "RNA 결합 부위 지정 변형 폴리펩티드" 또는 "부위 지정 폴리펩티드"란, RNA에 결합하고 특정 DNA 서열에 표적화되는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에 기술된 부위 지정 변형 폴리펩티드는 결합되는 RNA 분자에 의해 특정 DNA 서열에 표적화된다. RNA 분자는 표적 DNA 내의 표적 서열에 결합하거나, 혼성화하거나 또는 상보적인 서열을 포함하여, 결합된 폴리펩티드를 표적 DNA 내의 특정 위치(표적 서열)에 표적화한다.
본원에 사용된 "트랜스진"은 수용자 세포에 도입될 때 수용자 세포의 표현형을 변경할 가능성이 있는 비천연 유전 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "상류"는 참조 좌위와 관련하여 5' 말단에 더 가깝게 위치한 유전적 좌위 또는 서열 위치를 의미하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 서열은 5' 말단으로 시작하여 3' 말단에서 끝날 때까지 "5'에서 3'"으로 이어진다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하기 위해 제공된다. 실시예는 예시적인 것이며 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
플라스미드 구성: CRISPR 인식 부위는 서열 5'-TCGTGGGGGTCCTGACCTAC-3'(서열번호 518)을 갖는 온라인 디자인 도구(www.crispr.mit.edu에서 이용 가능)를 사용하여 마우스 Cypor 유전자의 엑손 1 내에서 확인되었다. 이 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 BbsI로 절단한 pX330(Addgene cat. 42230; 미국 매사추세츠주 워터타운 소재)에 결찰시켰다. pX330은 인간 코돈 최적화된 SpCas9 및 키메라 가이드 RNA 발현 플라스미드이다(Cong, et al. Science (2013) 339(6121):819-23). 간단히 말해서, 플라스미드는 U6 프로모터의 제어 하에 있는 gRNA 및 CBh 프로모터(혼성 닭 베타 액틴 프로모터)의 제어 하에 있는 SpCas9를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-CACCGTCGTGGGGGTCCTGACCTAC-3'(서열번호 519) 및 5'-AAACGTAGGTCAGGACCCCCACGAC-3'(서열번호 520)이었다. 생성된 플라스미드(pX330-Cypor)는 Guide-It™ 돌연변이 검출 키트(Takara Bio USA, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 사용하여 표적 서열을 절단하도록 검증되었다.
동물 절차: 7-9주령의 수컷 129/sv 마우스에게 유체역학적 꼬리 정맥 주사로 식염수에 희석된 pX330-Cypor 플라스미드 40 ㎍을 투여했다. 3주 후, 마우스를 2개의 코호트로 나누었다: 4마리의 마우스에게 IP 주사로 매주 2회 아세트아미노펜(APAP, 식염수 1 ㎖ 당 13 mg) 주사를 제공하였으며, 총 16회 주사하였다. 3마리의 마우스는 대조군으로 잔존시키고 APAP를 투여하지 않았다. 최종 6개의 APAP 용량에 대해, 주사하기 16시간 전에 마우스를 금식시켰다. 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 수준은 ALT 시약 키트(BKKits.com에서 이용 가능, BQ 004A-CR)를 사용하여 복재 정맥 천자로 채취한 10 ㎕의 혈액에서 APAP 주사 후 6-20 시간째에 측정되었다. 최종 APAP 주사 2주 후 마우스를 희생시키고 간을 수확하였다.
면역형광: 간 절편을 파라포름알데히드에 5시간 동안 고정하고, 30% 수크로스에서 밤새 동결보호하고, 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 내포시켰다. 7개의 마이크로 절편을 PBS로 세척하고, 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에 12분 동안 투과시키고, 30분 동안 0.3 M 글리신으로 차단하고, 4℃에서 밤새 1차 항체와 인큐베이션했다(Abcam ab180597(영국 캠브리지 소재); 10% 정상 염소 혈청이 있는 PBS에서 1:200). PBS에서 3 x 5분 세척한 후, 절편을 2차 항체(Goat anti-Rabbit Alexa Fluor® 555, Invitrogen cat. A27039(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), 1/2000 희석) 중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 절편을 DAPI Fluoromount-G®(Southern Biotech, Inc., 미국 앨라배마주 버밍엄 소재)에 마운팅하고 Zeiss 공초점 현미경을 사용하여 시각화했다.
결과
도 2에서 볼 수 있듯이, 혈액 ALT 수준으로 측정한 간 손상은 pX330-Cypor이 주입된 마우스에서 시간이 지남에 따라 감소했다. 처리된 마우스는 약 10주 후에 APAP 내성이 있었다. CYPOR 면역조직화학 결과는 도 3에 제공된다. APAP 주사를 맞은 pX330-Cypor 처리 마우스에서, 큰 CYPOR 음성 결절이 있는 분포가 존재하여, Cypor-눌(null) 간세포의 클론 확장을 나타낸다(하단 이미지, 점선은 Cypor 눌 결절을 나타냄). 큰 CYPOR 음성 결절은 APAP로 처리되지 않은 마우스에는 존재하지 않는다(상단 이미지).
도 4는 대조군 플라스미드(pX330), APAP 선택이 없는 pX330-Cypor, APAP 주사 pX330-Cypor 및 APAP 식이 pX330-Cypor이 주사된 마우스(왼쪽에서 오른쪽)에서 Cypor 삽입-결실의 수를 도시한다. APAP 처리된 마우스의 삽입-결실 빈도는 주사 또는 식이에 의해 APAP를 받은 마우스에서 유의하게 더 높았으며(p < 0.01), 이에 의해 Cypor 녹아웃된 간세포의 선택을 보여준다.
상기 이외에도, 마우스에 Cyp1A2/2E1 CRISPR 녹아웃 플라스미드를 주사하고 APAP로 처리했다. 도 5에서 볼 수 있듯이, Cyp1A2/2E1 CRISPR 녹아웃 플라스미드가 주사된 마우스의 APAP 선택 간은 APAP 처리가 없는 마우스(왼쪽 이미지)와 비교하여 Cyp2E1 음성 결절(오른쪽 이미지, 점선은 Cyp2E1 눌 결절을 나타냄)을 나타냈다. APAP 투여로 Cyp1A2 및 Cyp2E1 삽입-결실의 빈도가 1 내지 약 12%(간세포의 약 17%)로 증가했다. 이것은 Cyp1A2 및 Cyp2E1의 녹아웃이 Cypor 숙련 간에서도 APAP 내성을 달성하기에 충분하다는 것을 보여준다.
실시예 2
슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 shRNA에 의한 CYPOR 녹다운을 테스트하는 데 사용되었다. 간단히 말해서, 마우스에 두 개의 분리된 플라스미드를 주사했다. 하나의 플라스미드에는 CMV 프로모터의 제어 하에 슬리핑 뷰티 트랜스포사제가 포함되었다. 두 번째 플라스미드에는 GFP 발현 카세트 및 U6 구동 Cypor shRNA를 포함하는 트랜스포존 카세트가 포함되었다. 처리 후, 주사된 마우스는 3개월의 APAP 선택에 노출되었다.
도 6은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템 및 APAP로 처리한 실험에서 마우스의 간에서 CYPOR 면역조직화학 및 GFP 형광을 제공한다. 상단 패널은 음성 대조군(shRNA와 관련없음)의 결과를 보여준다. 드물게 GFP+ 세포를 볼 수 있지만, 결절은 형성되지 않았다. 하단 패널은 GFP-Cypor shRNA 트랜스포존이 주사된 APAP 처리된 마우스의 이미지를 보여준다. GFP 발현의 큰 합류 영역은 Cypor 음성 영역에서 볼 수 있다. 이것은 트랜스포존 양성 간세포의 확장에 대한 명확한 증거를 제공한다.
실시예 3
자기 절단 가이드 RNA도 테스트되었다. 자기 절단 가이드 RNA는 가이드 RNA가 pol II 프로모터로부터 유도될 수 있도록 가이드 RNA의 아무 쪽에 리보자임을 포함한다. 예를 들어, 해머헤드(HH) 리보자임은 가이드 RNA의 5'에 있을 수 있고 델타 간염 바이러스(HDV) 리보자임은 가이드 RNA의 3' 말단에 있을 수 있다. 도 7은 자기 절단 가이드 RNA의 개략도를 제공한다.
한 실험에서, 해머헤드형 리보자임과 델타 간염 바이러스형 리보자임이 인접한 가이드 RNA를 포함하는 scgRNA가 사용되었다. 이러한 실험에 사용된 표적화 벡터는 바이오마커로서 인간 인자 IX와 뮤린 알부민 좌위에 대한 상동성 아암 사이의 scgRNA를 포함한다. 알부민 유전자는 세포형 특이적 유전자 좌위의 예로서 선택되었다. 벡터는 4-OH 페닐피루베이트 디옥시게나제(Hpd)의 엑손 3, Hpd의 엑손 4 또는 호모겐티스산 디옥시게나제(Hgd)의 엑손 4를 표적으로 하는 scgRNA를 포함하도록 디자인되었다. 요약하면, 벡터는 왼쪽 상동성 아암(알부민)-p2A(2A 펩티드)-인간 인자 IX 유전자-상동성 영역(알부민)-HH 리보자임-gRNA-HDV 리보자임-오른쪽 상동성 아암(알부민)의 순서로 포함되었다. 상동성 아암은 표적화된 통합(상동성 재조합)을 허용하고 scgRNA는 인트론 내에 내포되었다. 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 8이 이들 벡터로부터 생성되었다. 신생체 푸마릴아세토아세테이트 가수 분해 효소 녹아웃(Fah-/-) 마우스에게 3개의 gRNA 중 1개를 포함하는 scgRNA Gene Ride 벡터를 포함하는 rAAV8이 제공된 후 약 4주 후 작은 간 특이적 프로모터에 의해 구동되는 SpCas9를 포함하는 rAAV8이 제공되었다. 마우스를 2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸벤조일)-1,3-시클로헥산디온(NTBC)에서 순환시켜 표적화 벡터의 정확한 통합을 갖는 간세포를 선택하여 선택가능한 유전자를 파괴할 수 있는 gRNA를 발현시켰다. Fah-/- 마우스에서 Hpd 또는 Hgd의 손실은 간세포에서 선택적 성장 이점을 부여한다. 순환하는 인간 인자 IX의 수준은 5, 9, 14 및 18주령에 평가되었다. 5주 및 9주에서, 모든 마우스는 낮은 수준의 인간 인자 IX를 나타냈다. 14주에, Hpd의 엑손 3에 대한 gRNA가 있는 scgRNA 벡터를 받은 마우스는 hF9 수준이 증가하기 시작했다. 이러한 수준은 18주령까지 유의하게 증가하여 올바르게 표적화된 간세포에 대한 선택을 보여준다. 또한, Hpd 또는 Hgd의 엑손 4를 표적으로 하는 gRNA를 가진 scgRNA 벡터를 받은 마우스는 18주령까지 높은 수준의 hF9를 나타냈다. 이 발견은 자기 절단 리보자임이 실제로 pol 2 프로모터로부터 기능적 gRNA를 생성할 수 있고 생체 내에서 간에서 선택 가능한 유전자 편집 이벤트를 생성하는 데 사용될 수 있음을 분명히 보여준다.
알부민 좌위는 Cypor에 대한 자기 절단 가이드 RNA를 통합하는 GeneRide™ 벡터에 의해 표적화되었다. 초기 실험에서는 트랜스진 루시퍼라제를 사용했다. 요약하면, 벡터는 왼쪽 상동성 아암-p2A(2A 펩티드)-루시퍼라제 유전자-상동성 영역-HH 리보자임-gRNA-HDV 리보자임-오른쪽 상동성 아암의 순서로 포함되었다. 표적 좌위(알부민)로의 상동성 재조합 후 트랜스진과 자기 절단 가이드 RNA가 발현된다.
신생체 마우스에게 이 벡터를 주사하고 이유시 cas9를 투여한 후 8주 동안 APAP를 주사했다. 라이브 루시퍼라제 이미징은 기준선과 5, 11 및 16회 용량 후에 동일한 마우스에서 수행되었다. 루시퍼라제 발현은 각 용량에 따라 증가하여 50x 증가했다(도 8 참조). 수확시, Cypor 염색은 큰 음의 영역을 나타내었고 삽입-결실 빈도는 21%였다.
추가 실험에서, 인간 인자 IX는 루시퍼라제 대신 상기 벡터에서 트랜스진으로 발현되었다. 벡터의 이름은 GRCyporF9이다. 신생체는 신생체로서 AAV GRCyporF9를 주사하고 이유시 Cas9의 단일 용량을 제공받았다. 그런 다음 매주 2회 APAP를 주사했다. 도 9는 APAP의 0, 3, 9 및 15회 용량 후 혈액에서 인간 인자 IX 수준을 보여준다. APAP 주사에 대한 반응으로 인간 인자 IX 수준이 분명하게 증가했다. APAP를 받지 않은 GRCyporF9 주사 마우스는 증가를 보이지 않았으며 식염수 대조군도 음성이었다.
AAV GRCyporF9는 또한 Cas9와 함께 성체 마우스에 주사되었다. 마우스는 이후에 APAP의 다중 용량을 받았다. 0, 2, 7, 13 및 19회 용량 후의 인간 인자 IX 수준은 명확한 APAP 의존적 증가와 함께 도 10에 도시된다. 19회 용량 후 마우스를 희생시키고 간세포에서 Cypor 삽입-결실 빈도를 측정하였다. 모든 APAP 선택된 마우스는 상당한 선택을 나타내는 약 20%의 삽입-결실 빈도를 가졌다.
도 11은 APAP 선택 후 GRCyporF9 처리된 마우스에서 CYPOR(상단 패널) 및 인간 인자 IX(하단 패널) 면역조직화학을 보여준다. 3마리의 마우스가 표시된다. 모든 APAP 처리된 마우스는 중앙 정맥 주변의 광범위한 Cypor 음성 영역을 나타냈다(중간 패널의 점선과 화살표). 동일한 동물은 동일한 분포 패턴에서 넓은 영역의 인간 인자 IX 양성 마우스 간세포를 나타냈다(가운데 패널의 점선과 화살표). 이러한 데이터는 선택된 Cypor 음성 간세포가 치료용 트랜스진을 발현함을 보여준다.
본 발명의 바람직한 특정 실시양태가 상기 설명되고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명은 그러한 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 하기 청구범위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Grompe, Markus <120> Methods of Gene Therapy <130> 3422-P06657WO00 <150> 62/664,930 <151> 2018-04-30 <150> 62/664,932 <151> 2018-04-30 <160> 523 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7889 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor human factor 9 gene ride <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtaaag atctgatatc 180 atcgatcgcg atgcattaat taagcggccg ctgtacatag gaggttcgaa ccctgctgaa 240 gggagaggtt ccaatactac aaaatgtagc gggatattgt catcaccttt ggggacatgt 300 catcatggtc cccagacaga gttacaaaac tcatccccta cacagcacta tgtctctggt 360 actgtttgtt ctacagatgt caacaacaga ggcccagcca tctcctattg cttggcttgt 420 cagtctttct agcctcccca ttattaattt caaatggggc aggtgttagg agggcaaaaa 480 tccacatatt aagtgcaaag cctttcagga gatttcctga aactagacaa aacccgtgtg 540 actggcatcg attattctat ttgatctagc tagtcctagc aaagtgacaa ctgctactcc 600 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Cypor CRISPR target sequences <400> 183 gaagggtgcc accccggtgc cgg 23 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 184 gcccaccgct acgggatgcg agg 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 185 gggtgagcgc accgtccctg tgg 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 186 cgacgtccag gtcggcaccc agg 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 187 tgcgctcacc cagctcaacg tgg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 188 caaggctggc cgcatcaaca agg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 189 gttttctgca tggccaccta cgg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 190 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agagttgggg tggacctgtg ggg 23 <210> 323 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 323 gcacatctgt gcggtggttg tgg 23 <210> 324 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 324 gccgctactc cctggacgtg tgg 23 <210> 325 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 325 ggccatgttc cgtgcatccc tgg 23 <210> 326 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 326 gttctccccg gcaggctcct tgg 23 <210> 327 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 327 actcctctgc agtccccgtc tgg 23 <210> 328 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 328 gagacagacg tggatctctc tgg 23 <210> 329 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 329 gagcctgccg gggagaacgg cgg 23 <210> 330 <211> 23 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Cypor CRISPR target sequences <400> 491 cgggaatggg tgcttcttgt tgg 23 <210> 492 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 492 ctcctctgca gggaagagac agg 23 <210> 493 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 493 gctgggtggt ggaggcccgg agg 23 <210> 494 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 494 agcaccccct cttcctgccc agg 23 <210> 495 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 495 cgtctgtggg tgagtgagtg ggg 23 <210> 496 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 496 atcaaagggg ctgggtgggg agg 23 <210> 497 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 497 tgcctgcgtg gcaggggccg ggg 23 <210> 498 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 498 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Cypor CRISPR target sequences <400> 513 gggagaaggc cacgttgagc tgg 23 <210> 514 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 514 agctgggccg aggagaggag agg 23 <210> 515 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 515 cttctttttt ctttctgaag agg 23 <210> 516 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cypor CRISPR target sequences <400> 516 caccccggcc cctgccacgc agg 23 <210> 517 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 517 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 518 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 518 tcgtgggggt cctgacctac 20 <210> 519 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 519 caccgtcgtg ggggtcctga cctac 25 <210> 520 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 520 aaacgtaggt 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Claims (28)

  1. 대상체에서 세포의 집단을 선택적으로 증폭 및/또는 확장하는 방법으로서,
    a) 세포에서 사이토크롬 p450(CYP) 효소, 사이토크롬 p450 리덕타제(POR) 및/또는 베타-카테닌(CTNNB1)을 억제하는 단계; 및
    b) 단계 a)에 의해 생성된 세포를 갖는 대상체에게 프로톡신을 투여하는 단계
    를 포함하고, 상기 프로톡신은 단계 a)에 의해 생성된 세포에서 독성 대사산물로 전환되지 않아서 상기 대상체 내에서 세포의 증폭 및/또는 확장을 허용하는 것인, 대상체에서 세포의 집단을 선택적으로 증폭 및/또는 확장하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b) 전에 트랜스진을 세포에 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 간세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 a)를 시험관 내에서 수행하고 단계 b) 전에 세포를 대상체에게 투여하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 a)를 생체 내에서 수행하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 a)는 억제 핵산 분자 또는 상기 억제 핵산 분자를 코딩하는 핵산 분자를 세포 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 억제 핵산 분자는 CYP 효소, POR, 또는 CTNNB1에 대해 특이적인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 억제 핵산 분자는 shRNA인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 단계 a)는 억제 핵산 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 트랜스진을 포함하는 벡터를 상기 세포 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 벡터는 통합 벡터인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 통합 벡터는 프로모터가 없는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 a)는 유전자 편집에 의해 CYP 효소, POR 및/또는 CTNNB1을 불활성화시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 a)는 Cas9 및 CYP 효소, POR, 또는 CTNNB1 유전자에 특이적인 가이드 RNA(gRNA) 또는 상기 gRNA를 코딩하는 핵산 분자를 세포 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 gRNA 서열은 상기 Cas9와 결합하여 상기 CYP 효소, POR 또는 CTNNB1 유전자의 절단을 유도하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 gRNA는 자기 절단 가이드 RNA(scgRNA)이고, 상기 scgRNA는 5' 및 3' 말단 양측에 자기 절단 리보자임이 인접한 gRNA를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 scgRNA는 RNA 폴리머라제 II 프로모터로부터 발현되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 단계 a)는 gRNA를 코딩하는 핵산 분자 및 트랜스진을 포함하는 벡터를 상기 세포 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 통합 벡터인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 통합 벡터는 프로모터가 없는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 프로톡신은 대상체에서 경도 간독성을 유발하기에 충분한 양으로 투여하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 프로톡신은 대상체에서 중등도 간독성을 유발하기에 충분한 양으로 투여하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 프로톡신은 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파테이트 트랜스아미나제, 알칼리성 포스파타제 및 감마-글루타밀 트랜스펩티다제를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 간 효소의 대상체의 수준을 상승시키기에 충분한 양으로 투여하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 프로톡신은 아세트아미노펜, 레트로신, 시클로포스파미드, 타목시펜, 케토코나졸, 트라마돌, 타크린, 라시오카르핀, 센키르킨, 다카르바진, 메톡시모르폴리닐 독소루비신(PNU 152243), 이포스파미드, 트로포스파미드, 프라데포비르, MB07133, 부파르바쿠온 히드록실아민, 나부메톤 히드록시이민, DB289, 푸라미딘, 시브라피빈, 시멜라가트란, 구아녹사벤즈, AQ4N, 4-이포메아놀, 클로피도그렐, V-PYRRO/NO, V-PROLI/NO 및 테가푸르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 프로톡신은 아세트아미노펜인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 아세트아미노펜은 연속일로 1일당 6 g의 용량으로 대상체에게 투여하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 아세트아미노펜은 10 g의 단일 용량으로 대상체에게 투여하는 것인 방법.
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