CN112135640A - 基因疗法的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于基因和/或细胞编辑的组合物和方法。
Description
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年4月30日提交的美国临时专利申请号62/664,930和2018年4月30日提交的美国临时专利申请号62/664,932的优先权。前述申请通过引用并入本文。
本发明是在美国国立卫生研究院授予的R01 DK048252-21政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。
以电子方式提交的文本文件说明书
在此以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：SEQLIST.txt；记录日期：2019年4月29日；档案大小：116KB)。
技术领域
本发明涉及基因和/或细胞疗法领域。具体地，公开了通过选择成功修饰的细胞用于治疗性基因和/或细胞疗法的组合物和方法。
背景技术
在整个说明书中引用了数个出版物和专利文件，以记载与本发明有关的现有技术。这些引用中的每一个都通过全文引用并入本文。
影响表达细胞色素p450(CYP)蛋白的细胞的许多遗传性和获得性疾病都适合基因和/或细胞疗法。从概念上讲，通过基因编辑纠正致病突变是实现基因和/或细胞疗法的最简洁和安全的方法。目前，重组腺相关病毒载体是主要的基因疗法平台。对于基因编辑应用，rAAV载体被设计为通过同源重组将治疗有效载荷整合到目标基因组位点中。但是，通过体内同源重组的精确基因编辑的效率很低，通常会导致亚治疗和无常的基因编辑。事实上，rAAV载体大部分是保持游离的并随着细胞分裂而丢失。此外，在动物和人类中，腺相关病毒的随机整合都与肝癌有关，这表明了不仅损害肝细胞，而且损害任何其他组织的风险。
目前解决rAAV策略局限性的一种方法是直接修复突变。然而，以目前可用的方法进行的体内基因修复的效率也很低。另一种方法是将细胞启动子下游缺乏自身启动子的治疗性转基因整合到表达基因的染色体基因座中。然而，这种方法也被证明效率低下。
这些方法的低效率可以通过选择性放大带有所需基因编辑事件的细胞来克服。例如，通过在内含子内使用嵌入微小RNA(microRNA)中的短发夹RNA(shRNA)来敲落酪氨酸分解代谢酶4-OH-苯丙酮酸双加氧酶(HHPD)，可以通过对4-[(2-羧乙基)-羟基氧膦基]-3-氧代丁酸酯(CEHPOBA)——一种富马酰乙酰乙酸酯水解酶的小分子抑制剂——赋予药物诱导的毒性抗性来选择表达正确靶向白蛋白基因座的人因子9的肝细胞(Nygaard等人(2016)Sci.Transl.Med.,8(342):342ra79)。然而，使用CEHPOBA和利用酪氨酸分解代谢途径进行选择在体内的应用有限。
鉴于上述情况，很明显需要基因和/或细胞疗法的优良方法。
发明内容
根据本发明，提供了繁殖和/或扩增细胞群的方法。还提供了在细胞或受试者中表达目的核酸(例如，转基因)的方法(例如，改进的细胞和/或基因疗法方法)。在一些实施方案中，所述方法包括抑制(例如，敲除或敲落)细胞中的一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR，并对所述细胞施用前药(原毒素)。所述方法可以进一步包括在用前药选择之前对所述细胞施用目的核酸(例如，转基因)。所施用的前药(原毒素)在未处理的细胞中代谢成毒素，但在处理的细胞中不代谢成毒素，从而允许繁殖和/或扩增所需的细胞群和/或表达目的核酸(例如转基因)。所述方法的步骤可以在体内和/或体外进行。在某些实施方案中，抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的步骤可以在体外或体内进行。在某些实施方案中，通过将前药(原毒素)施用于受试者来进行施用前药(原毒素)的步骤。抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的步骤可以通过向细胞施用抑制性核酸分子和/或利用基因编辑工具(如CRISPR)来进行。
附图说明
图1提供了总体示意图，其示出了通过失活惰性前药(原毒素)成为毒性代谢物的代谢来实现药物选择的原理。细胞的正常状态如左图所示，其中前药(原毒素)被代谢成毒性代谢物。CYP酶、细胞色素P450还原酶(CYPOR或POR)或β-连环蛋白(Ctnnb1)的敲落或敲除保护细胞并使其增殖。
图2提供了在注射pX330-Cypor并用对乙酰氨基酚处理的小鼠中随着时间推移的血液丙氨酸转氨酶(ALT)水平——一种肝损伤的指标——的图。
图3提供了未经处理(上部组图)或用对乙酰氨基酚处理(下部组图)的以pX330-Cypor转导的小鼠肝脏样品的CYPOR免疫组织化学图像。虚线表示无CYPOR的结节。
图4提供了以下小鼠中插入缺失(indel)的百分比图：注射以对照质粒(pX330)、未经对乙酰氨基酚选择的pX330-Cypor、注射对乙酰氨基酚的pX330-Cypor和具有对乙酰氨基酚饮食的pX330-Cypor。
图5提供了未经处理(左图)或用对乙酰氨基酚处理(右图)的注射了Cyp1A2/2E1CRISPR敲除质粒的小鼠肝脏样品的免疫组织化学图像。箭头指示了无Cyp2E1的结节。
图6提供了用GFP转座子转导的小鼠肝脏样品的CYPOR免疫组织化学和荧光成像，所述转座子带有对照shRNA(上部组图)或Cypor shRNA(下部组图)，并用对乙酰氨基酚处理。
图7提供了自裂解指导RNA的示意图。锤头状核酶是SEQ ID NO：521。HDV核酶是SEQID NO：522。成熟的gRNA是SEQ ID NO：523。
图8提供了新生小鼠肝脏的荧光素酶图像，所述新生小鼠注射了包含荧光素酶和针对Cypor的自裂解指导RNA的载体，并在断奶时注射了cas9，随后注射对乙酰氨基酚8周。在基线和5、11和16剂后，对同一只小鼠进行了实时荧光素酶成像。
图9提供了小鼠血液中人因子IX水平的图，所述小鼠在新生儿时被注射生理盐水或AAV GRCyporF9并在断奶时被给予单剂量的Cas9。然后对小鼠不进行处理或每周两次用对乙酰氨基酚处理。在0、3、9和15剂对乙酰氨基酚后测量人因子IX水平。
图10提供了注射有AAV GRCyporF9并用对乙酰氨基酚处理的成年小鼠血液中人因子IX水平的图。在0、2、7、13和19剂后确定人因子IX的水平。
图11提供了对乙酰氨基酚处理后来自GRCyporF9处理的小鼠的组织样品的CYPOR(上部组图)和人因子IX(下部组图)的免疫组织化学图像。在上部组图中，CYPOR阴性组织由虚线和箭头指示。在下部组图中，用虚线和箭头指示了对人因子IX呈阳性的小鼠肝细胞。
具体实施方式
通过使用以下方法可以克服基因和/或细胞疗法中观察到的阻碍：(1)设计用于利用和/或破坏CYP酶代谢活性所需的任何基因位点的方法，其中通过药物诱导的毒性的抗性细胞群的选择性放大和/或扩增在体内的广泛应用受毒素影响，(2)位点特异性基因编辑方法，其被设计用于将所需修饰与顺式选择性基因破坏联系起来，使得仅当修饰发生在特定位点时才发生选择性放大和/或细胞放大，(3)位点特异性基因编辑方法，其被设计用于实现所需的修饰和可选择的基因破坏，所述方法不需要核酸内切酶切割DNA或使用启动子激活基因表达，使得仅当修饰发生在特定位点时才发生选择性放大和/或细胞放大，(4)位点中性基因编辑方法，其被设计为使用随机整合载体及其自身的内源启动子实现所需的修饰和基因破坏，使得仅在整合发生时才发生选择性放大和/或细胞放大(不受位点影响)，(5)敲落、敲除或以其他方式破坏CYP酶代谢活性所需的基因位点的方法，其中在没有基因编辑事件或修饰的情况下发生所需细胞群体的选择性放大和/或扩增，或(6)(1)-(5)中任意一项的任意组合。本发明提供了实现上述目的的方法。
本发明涉及利用细胞色素p450酶(CYP)系统实现高效、细胞和/或组织特异性、临床有效、更高持久性的基因编辑和/或疗法。本发明不需要在待编辑的细胞中预先存在遗传缺陷。相反，在一些实施方案中，本发明通过将对药物诱导的毒性的有利抗性赋予正确编辑的细胞，在未编辑的细胞中产生了缺陷。这种有利的抗性可以通过敲落、敲除或以其他方式破坏以下基因来赋予细胞：(1)编码CYP酶的一个或多个CYP基因；(2)细胞色素p450还原酶(CYPOR或POR)基因；(3)CTNNB1(β-连环蛋白)基因；(4)CYP酶代谢活性所需的任何基因位点，或(5)(1)-(4)中任意一项的任意组合。此外，也可以通过直接将一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR失活、破坏或以其他方式失活来赋予有利的抗性。在施用适当的毒素(例如，前药或原毒素)后，具有有利抗性(即，由于CYP活性降低而缺乏代谢和激活毒素的能力)的细胞将优先于那些未被编辑的细胞繁殖。
根据本发明的一个方面，提供了繁殖和/或扩增细胞群的方法。在一些实施方案中，所述方法包括抑制(例如，敲除或敲落)细胞中一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR，并将前药(原毒素)施用于细胞，其中施用的前药(原毒素)在未处理的细胞(例如，其中CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR未被抑制的细胞)中被代谢成毒素，但在处理的细胞(例如，其中CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR被抑制的细胞)中未被代谢成毒素。所述方法的步骤可以在体内和/或体外进行，包括离体方法(例如，其中来自受试者的细胞(自体细胞)在体外进行处理，然后再施用于受试者)。在某些实施方案中，抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的步骤可以在体外或体内进行。在某些实施方案中，施用前药(原毒素)的步骤可以在体外或体内进行(例如，通常可以将前药(原毒素)施用于包含所述细胞的受试者或直接施用于所述细胞)。
根据本发明的另一方面，提供了在细胞中表达目的核酸(例如转基因)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括抑制(例如，敲除或敲落)细胞中一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR，将目的核酸(例如转基因)导入细胞，并将前药(原毒素)施用于细胞，其中施用的前药(原毒素)在未处理的细胞(例如，其中CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR未被抑制的细胞)中被代谢成毒素，但在处理的细胞(例如，其中CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR被抑制的细胞)中未被代谢成毒素。所述方法的步骤可以在体内和/或体外进行，包括离体方法(例如，其中来自受试者的细胞(自体细胞)在体外进行处理，然后再施用于受试者)。在某些实施方案中，抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR和/或引入目的核酸(例如，转基因)的步骤可以在体外或体内进行。抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR和引入目的核酸(例如转基因)可以同时或以顺式方式进行，使得两种事件都发生在相同的有利的抗性细胞内。在某些实施方案中，施用前药(原毒素)的步骤可以在体外或体内进行(例如，通常可以将前药(原毒素)施用于包含所述细胞的受试者或直接施用于所述细胞)。
图1提供了总体示意图，其示出了通过失活惰性前药成为毒性代谢物的代谢来实现药物选择的原理。细胞的正常状态显示在左侧。代谢酶在正常细胞中表达，导致代谢转换后的毒性。如果负责代谢活性的基因被敲落(例如siRNA或shRNA)或被敲除(例如靶向核酸酶(例如CRISPR))，则在施用有毒前体后不会产生毒性代谢物。敲落或敲除细胞受到保护并可以增殖，而酶阳性细胞死亡。如图1所示，CYP酶、细胞色素P450还原酶(CYPOR或POR)或β-连环蛋白(Ctnnb1)的敲落或敲除可以防止前药(原毒素)如对乙酰氨基酚转化为其毒性代谢物。值得注意的是，POR将来自NADPH的电子供给所有CYP酶，因此，对于其活性至关重要。在没有POR的情况下，所有CYP酶均无活性。同样，Ctnnb1对于在区域3肝细胞中表达的基因(包括Cyp1A2、2E1和3A4)的转录是必不可少的。至少这些CYP酶在Ctnnb1抑制的细胞中是不存在的。
本发明方法的细胞可以是任何细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞具有CYP活性。在一些实施方案中，所述细胞是肝细胞。
细胞中一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的抑制(例如敲除或敲落)可以通过本领域已知的任何方法进行。在特定的实施方案中，通过向细胞施用一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的抑制剂来实现抑制。这种抑制剂是降低靶基因和/或蛋白质活性(例如，抑制或减少底物相互作用)和/或降低靶基因和/或蛋白质表达的化合物。抑制剂的实例包括但不限于蛋白质、多肽、肽、抗体、小分子以及核酸分子。优选地，所述抑制剂是基于核酸的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是抑制性核酸分子，例如反义、siRNA或shRNA分子(或编码所述抑制性核酸分子的核酸分子)。在一些实施方案中，所述抑制剂是编辑抑制剂的基因，例如基于靶向所需基因的CRISPR(例如，具有靶向所需基因的指导RNA)。
CYP基因是本领域众所周知的，并且包括任何细胞色素p450基因。CYP基因的实例在Nelson，D.R.(Human Genomics(2009)4：59-65；通过引用并入本文)中提供。CYP基因的实例包括但不限于细胞色素p450基因家族1至51。CYP基因的实例包括但不限于CYP1A(例如CYP1A1、CYP1A2)、CYP1B(例如CYP1B1)、CYP2A(例如CYP2A6、CYP2A7、CYP2A13)、CYP2B(例如CYP2B6)、CYP2C(例如CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19)、CYP2D(例如CYP2D6)、CYP2E(例如CYP2E1)、CYP2F(例如CYP2F1)、CYP2J(例如CYP2J2)、CYP2R(例如CYP2R1)、CYP2S(例如CYP2S1)、CYP2U(例如CYP2U1)、CYP2W(例如CYP2W1)、CYP3A(例如CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43)、CYP4A(例如CYP4A11、CYP4A22)、CYP4B(例如CYP4B1)、CYP4F(例如CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22)、CYP4V(例如CYP4V2)、CYP4X(例如CYP4X1)、CYP4Z(例如CYP4Z1)、CYP5A(例如CYP5A1)CYP7A(例如CYP7A1)、CYP7B(例如CYP7B1)、CYP8B(例如CYP8B1)、CYP11A(例如CYP11A1)、CYP11B(例如CYP11B1、CYP11B2)、CYP17A(例如CYP17A1)、CYP 19A(例如CYP19A1)、CYP20(例如CYP20A1)、CYP21A(例如CYP21A2)、CYP24A(例如CYP24A1)、CYP26A(例如CYP26A1)、CYP26B(例如CYP26B1)、CYP26C(例如CYP26C1)、CYP27A(例如CYP27A1)、CYP27B(例如CYP27B1)、CYP27C(例如CYP27C1)、CYP39A(例如CYP39A1)、CYP46A(例如CYP46A1)、以及CYP51A(例如CYP51A1)。在特定的实施方案中，所述CYP基因来自选自CYP1、CYP2或CYP3的亚家族。
细胞色素P450还原酶(CYPOR或POR该术语在本文中可互换使用)是一种内质网膜氧化还原酶蛋白，其具有FAD和FMN结合结构域，这使其能够直接从NADPH向所有细胞色素p450酶提供电子(Iyanagi等人,(2012)Arch.Biochem.Biophys.,528:72-89)。在人类中，细胞色素P450还原酶基因位于如下基因座:7号染色体，q臂，1区，1带，子带23(7q11.23)(参见，例如，GenBank登记号NC_000007.14)。人POR的核苷酸和氨基酸序列的实例可以在例如Gen Bank Gene ID：5447以及GenBank登记号NM_000941.3和NP_000932.3中找到。
连环蛋白β-1(CTNNB1；也称为β-连环蛋白)是一种双功能蛋白质，其涉及细胞-细胞粘附和基因转录的调节和协调。人Ctnnb1的核苷酸和氨基酸序列的实例可以在例如GenBank Gene ID：1499以及GenBank登记号NM_001098209.1和NP_001091679.1中找到。
如上所述，可以编辑细胞的基因组以失活/抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR。可以使用本领域已知的任何方法来编辑细胞的基因组，例如但不限于：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和兆核酸酶(meganuclease)。在一些实施方案中，使用CRISPR。成簇的、规律间隔的、短回文重复序列(CRISPR)/Cas9(例如，来自产脓链球菌)技术和基因编辑在本领域中是众所周知的(参见，例如Shi等人(2015)Nat.Biotechnol.,33(6):661-7；Sander等人(2014)NatureBiotech.,32:347-355；Jinek等人(2012)Science,337:816-821；Cong等人(2013)Science339:819-823；Ran等人(2013)Nature Protocols 8:2281-2308；Mali等人(2013)Science339:823-826；Sapranauskas等人(2011)Nucleic Acids Res.39:9275-9282；Nishimasu等人(2014)Cell 156(5):935-49；Swarts等人(2012)PLoS One,7:e35888；Sternberg等人(2014)Nature 507(7490):62-7；addgene.org/crispr/guide)。RNA指导的CRISPR/Cas9体系涉及与指导RNA分子(gRNA)一起表达Cas9。提供了用于生成gRNA的指南和计算机辅助方法(参见，例如，CRISPR Design Tool(crispr.mit.edu)；Hsu等人(2013)Nat.Biotechnol.31:827-832；addgene.org/CRISPR；以及CRISPR gRNA Design tool-DNA2.0(dna20.com/eCommerce/startCas9))。当共表达时，gRNA将Cas9结合并募集到特定的基因组靶序列，在那里它介导双链DNA(dsDNA)断裂。可以施用一个以上的gRNA(例如2个)以在靶DNA中进行多个断裂。双链断裂可以通过产生插入和/或缺失的非同源末端接合(NHEJ)途径修复，或者在供体模板存在的情况下，通过置换突变的同源定向修复(HDR)途径进行修复(Overballe-Petersen等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.,110:19860-19865；Gong等人(2005)Nat.Struct.Mol.Biol.,12:304-312)。虽然CRISPR在本文中被描述为利用Cas9，但是也可以使用其他核酸酶，例如Cas9变体和同源物。其他实例包括但不限于产脓链球菌Cas9、Cas9 D10A、高保真Cas9(Kleinstiver等人(2016)Nature,529:490-495；Slaymaker等人(2016)Science,351:84-88)、Cas9切口酶(Ran等人(2013)Cell,154:1380-1389)、具有改变的PAM特异性的产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(例如SpCas9_VQR、SpCas9_EQR和SpCas9_VRER；Kleinstiver等人(2015)Nature,523:481-485)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9、cas12a(Cpf)(Rusk,N.,Nat.Methods(2019)16(3):215)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)的CRISPR/Cpf1体系，以及毛螺菌(Lachnospiraceae)的CRISPR/Cpf1体系。
CRISPR/Cas9复合物的结合特异性取决于两个不同的元件。首先是靶基因组DNA(genDNA)序列与gRNA的互补识别序列(例如约18-22个核苷酸，特别是约20个核苷酸)之间的结合互补性。其次是与genDNA/gRNA互补区并列的前间区序列邻近基序(PAM)的存在(Jinek等人(2012)Science337:816-821；Hsu等人(2013)Nat.Biotech.,31:827-832；Sternberg等人(2014)Nature 507:62-67)。产脓链球菌Cas9的PAM基序已经被充分表征，并且是NGG或NAG(Jinek等人(2012)Science 337:816-821；Hsu等人(2013)Nat.Biotech.,31:827-832)。其他Cas9蛋白的其他PAM也是已知的(参见，例如，addgene.org/crispr/guide/#PAM-table)。通常，PAM序列是基因组序列中DNA靶序列的3′端。
所述指导RNA可以包含分开的核酸分子。例如，一种RNA可以与靶序列(crRNA)特异性杂交，而另一种RNA(反式激活crRNA(tracrRNA))与crRNA特异性杂交。优选地，所述指导RNA是单分子(sgRNA)，其包含与靶序列(crRNA；互补序列)特异性杂交的序列和被Cas9识别的序列(例如tracrRNA序列；骨架序列)。gRNA骨架序列的实例是本领域众所周知的(例如5′-GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGU CGGUGCUUUU(SEQ ID NO:517))。如本文所用，术语“特异性杂交”并不意味着核酸分子需要与靶序列100％互补。相反，所述序列可以与靶序列至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％互补(例如，gRNA和基因组DNA之间的互补)。较高互补性降低在基因组其他位点处发生不希望的切割事件的可能性。在特定的实施方案中，所述互补区(例如，在指导RNA和靶序列之间)是至少约10个、至少约12个、至少约15个、至少约17个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个或更多个核苷酸。在特定的实施方案中，所述互补区(例如，在指导RNA和靶序列之间)为约15至约25个核苷酸、约15至约23个核苷酸、约16至约23个核苷酸、约17至约21个核苷酸、约18至约22个核苷酸或约20个核苷酸。在特定的实施方案中，所述指导RNA靶向或包含与SEQ ID NO：34至516之一具有至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同源性或同一性的序列(例如RNA版本)。所述序列可以在与PAM相对的序列末端(例如，在5′末端)延长或缩短1、2、3、4或5个核苷酸。当序列被扩增时，添加的核苷酸应该对应于基因组序列。
在一些实施方案中，所述gRNA是一种自切割指导RNA(scgRNA)。自切割gRNA在单个指导RNA的5′和3′末端包含核酶。在表达scgRNA时，自切割的核酶会释放细胞内的gRNA以与Cas9相互作用。在一些实施方案中，所述scgRNA在gRNA的5′端包含锤头状核酶，并在gRNA的3′端包含丁型肝炎病毒核酶。在一些实施方案中，所述scgRNA受pol2启动子控制。在一些实施方案中，所述scgRNA受组织特异性启动子的控制。在一些实施方案中，所述scgRNA受白蛋白启动子控制。
在一些实施方案中，所述方法包括向细胞或受试者施用至少一种Cas9(例如，蛋白质和/或编码Cas9的核酸分子)和至少一种gRNA(例如，编码gRNA的核酸分子)。在特定的实施方案中，所述Cas9是产脓链球菌Cas9。在特定的实施方案中，被靶向的PAM位于5′UTR、3′UTR、启动子或内含子(例如，第一内含子)中。本发明的核酸可以顺次(之前或之后)和/或在同一时间(同时)施用。可以在相同的组合物或分开的组合物中施用所述核酸分子。在特定实施方案中，所述核酸分子在单个载体(例如，病毒载体或质粒)中递送。
如上文所述，抑制性核酸分子，如反义、siRNA或shRNA分子(或编码抑制性核酸分子的核酸分子)，可用于灭活/抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR。当抑制性核酸分子(例如shRNA)被递送至细胞或受试者时，可以直接施用抑制性核酸分子或使用表达载体。抑制性核酸分子(例如，shRNA)的示例性靶序列包括但不限于SEQ ID NO：2至33中的任何一个。在一些实施方案中，所述shRNA被嵌入微小RNA中。
可以通过本领域已知的任何方法实现将核酸分子施用到细胞中(包括施用于受试者)。在一些实施方案中，所述核酸分子通过感染引入细胞(例如，当使用病毒载体时)。在一些实施方案中，通过以下将所述核酸分子递送至细胞：注射、转染、电穿孔、基因枪颗粒递送系统(例如基因枪)、超声穿孔(例如，细胞超声处理以增加细胞渗透性)、磁转染(例如，利用磁场将含有核酸的颗粒带入靶细胞)、流体动力学递送、阳离子脂质体递送、聚合物囊泡递送、复合载体递送、树状聚合物递送、纳米颗粒递送(例如无机纳米颗粒)和/或通过使用细胞穿透肽。
本发明的核酸分子可以包含在载体(例如质粒、转座子、病毒载体(例如腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒)等)中。在一些实施方案中，所期望的核酸序列可以从载体内合适的启动子表达，所述启动子包括强启动子、组成型启动子、组织或细胞特异性启动子(例如，肝细胞特异性启动子)和/或调控启动子。启动子的实例是本领域众所周知的，其包括但不限于RNA聚合酶II启动子、T7 RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶III启动子(例如U6和H1；参见，例如，Myslinski等人(2001)Nucl.Acids Res.,29:2502-09)。在一些实施方案中，所期望的核酸序列由内源启动子(例如，细胞内的启动子)表达。
在一些实施方案中，所述载体是整合载体。在进一步的实施方案中，所述整合载体不需要核酸内切酶来切割DNA或使用启动子来激活基因表达(例如，利用GeneRideTM技术(LogicBio Therapeutics,Cambridge,MA))。GeneRideTM是一种基因编辑方案，其使用同源重组以实现遗传材料的位点特异性转移，而无需核酸内切酶来切割DNA或使用启动子来激活基因表达。在进一步的实施方案中，所述方法利用具有其自身内源性启动子的随机整合载体，使得整合随机发生在一些实施方案中，本发明利用非整合载体。
在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，特别是rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体是质粒DNA载体。在一些实施方案中，本发明利用合成的寡核苷酸载体。在一些实施方案中，本发明利用逆转录病毒载体，例如基于泡沫病毒、癌病毒和/或慢病毒的载体。在另一个实施方案中，所述载体基于腺病毒。在另一个实施方案中，所述载体基于AAV。在另一个实施方案中，所述载体基于病毒载体的包膜蛋白假型化。在另一个实施方案中，所述载体是基于具有复制能力的载体以及顺式和反式作用元件。在另一个实施方案中，所述载体基于单纯疱疹病毒。
在一些实施方案中，施用于细胞的前药(原毒素)是通过CYP活性或依赖CYP活性的活性进行代谢的化合物(例如小分子)。可以在细胞上测试施用于细胞的前药(原毒素)的毒性，以确定毒素代谢物是否具有足够的毒性，使得可以在编辑过的细胞中获得有利的抗性。在一些实施方案中，可以测量毒素的致死性，其中对未处理的细胞造成细胞死亡或凋亡的毒素具有足够的毒性，使得可以在编辑过的细胞中获得有利的抗性。在一些实施方案中，可以测量细胞内的生物标志物，以确定毒素是否具有足够的毒性。例如，关于肝细胞，可以确定毒素具有足够的毒性，如果检测到某些肝酶水平升高，所述肝酶包括但不限于：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)或γ-谷氨酰转肽酶(GGT)。已知这些肝酶中的一种或多种的表达增加指示肝毒性，其中至少轻度至中度肝毒性的存在证明了必要的毒性。此外，达到轻度至中度肝毒性的剂量指南在本领域中是已知的(参见，例如，Jaeschke,H.(2015)Dig.Dis.,33:464-471；Arafa,等人(2018)Toxicol.Appl.Pharmacol.,346:37-44；Calvo,等人(2017)Invest New Drugs,36(3):476-486；Fashe等人(2015)Chem.Res.Toxicol.,28:702-710；Huttunen等人(2008)Curr.Med.Chem.,15:2346-2365；Maruyama等人(1995)Dig.Dis.Sci.,40:2602-2607；McEneny-King等人(2017)Bioorg.Med.Chem.Lett.,27:2443-2449)。
肝毒性可以使用由药物诱导的肝损伤网络(DILIN)开发的5分制进行分级(参见，例如，Fontana等人(2009)Drug Safety,32:55-68)。轻度肝毒性(或1+)定义为：血清转氨酶或碱性磷酸酶水平升高或两者均升高，但血清总胆红素低于<2.5mg/dL，并检测到凝血病(INR<1.5)。中度肝毒性(或2+)定义为：血清转氨酶或碱性磷酸酶水平升高或两者均升高，并且血清总胆红素水平大于或等于2.5mg/dL或无高胆红素血症的凝血病(IND≥1.5)。中度至重度肝毒性(或3+)定义为：血清转氨酶或碱性磷酸酶水平升高，血清总胆红素水平≥2.5mg/dL，且因药物引起的肝损伤而导致住院(或之前的住院延长)。重度肝毒性(或4+)定义为：血清转氨酶或碱性磷酸酶水平升高，并且血清胆红素≥2.5mg/dL，且有下列情况的至少一种：(a)超过三(3)个月的长期黄疸和症状，(b)肝失代偿迹象(INR≥1.5、腹水、脑病)，或(c)其他被认为与药物引起的肝损伤有关的器官衰竭。
如上所述，所述前药(原毒素)可以直接施用于受试者。因此，本发明提供了用于向人施用有效剂量的前药(原毒素)的方法，其中显示轻度至中度肝毒性的来自血液的肝功能测试升高或异常指示足够的剂量以放大选择或编辑的细胞。在一些实施方案中，足以引起成人选择性毒性的对乙酰氨基酚的剂量为：(1)6克/天对乙酰氨基酚，连续数天，或(2)单剂大于10克对乙酰氨基酚。
如本文所用，CYP依赖性毒素是指前药(原毒素)，其毒性取决于涉及CYP酶、Cypor(POR)蛋白或两者的细胞色素p450代谢的激活。许多CYP依赖性毒素被细胞色素p450代谢代谢激活(一般参见Jaeschke,H.(2015)Dig.Dis.,33:464-471；Huttunen等人(2008)Curr.Med.Chem.,15:2346-2365)。亲本化合物通常是惰性且无毒的(如前药)，但其由Cyp介导的酶促转化产生的代谢物是有毒的，尤其是肝毒性的。例如，对乙酰氨基酚被三种POR依赖性CYP酶(CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4)代谢为肝毒性化合物N-乙酰基-对苯醌亚胺(NAPQI)。在一些实施方案中，Cyp依赖性毒素用于基因修饰的肝细胞或其他修饰的细胞的体内选择，其中负责产生毒性代谢物的Cyp活性已经被失活。表1提供了Cyp依赖性毒素的实例。
表1：Cyp依赖性毒素(参见，例如，Jaeschke,H.(2015)Dig.Dis.,33:464-471；Arafa,等人(2018)Toxicol.Appl.Pharmacol.,346:37-44；Calvo,等人(2017)Invest NewDrugs,36(3):476-486；Fashe等人(2015)Chem.Res.Toxicol.,28:702-710；Huttunen等人(2008)Curr.Med.Chem.,15:2346-2365；Maruyama等人(1995)Dig.Dis.Sci.,40:2602-2607；McEneny-King等人(2017)Bioorg.Med.Chem.Lett.,27:2443-2449；Utkarsh,等人(2016)Chem.Biol.Interact.,255:12-22)。
在一方面，所述CYP依赖性毒素可包括对乙酰氨基酚(APAP)作为前药，其被CYP2E1、CYP1A2、CYPA4或CYP2D6的任何一种转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括倒千里光碱作为前药，其被CYP3A4转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括贝沙罗汀(tangretin)。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括环磷酰胺作为前药，其通过被CYP2B6、CYP2C9或CYP3A4的任何一种促进的羟基化被转化为活性药物磷酰胺氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括异环磷酰胺作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物异环磷酰胺氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括曲磷胺作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物曲磷胺氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括帕拉德福韦(pradefovir)作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物PMEA-三磷酸。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括MB07133作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物araC-三磷酸。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括MB07811作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物MB07344。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括布帕伐醌(buparvaquone)羟亚胺作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物布帕伐醌氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括倒萘丁美酮(nabumetone)羟亚胺作为前药，其通过氧化被转化为活性药物萘丁美酮。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括DB289作为前药，其通过通过O-去甲基化还原被转化为活性药物(DB75)氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括西拉非班(sibrafiban)作为前药，其通过还原被转化为活性药物Ro 48-3888氮芥。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括希美加群(ximelagatran)作为前药，其通过还原被转化为活性药物美拉加群(melagartan)。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括胍诺沙苄(guanoxabenz)作为前药，其通过还原被转化为活性药物胍那苄(guanabenz)。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括AQ4N作为前药，其通过还原被转化为活性药物AQ4。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括达卡巴嗪(“DTIC”)作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物MTIC。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括替加氟作为前药，其通过羟基化被转化为活性药物5-FU。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括4-甘薯苦醇(ipomeanol)作为前药，其通过氧化或环氧化被转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括DDMX(“PNU-152243”)作为前药，其通过环化被转化为活性药物PNU-159682。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括他莫西芬作为前药，其通过被CYP3A4促进的羟基化被转化为活性药物4-羟基-他莫西芬。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括他莫西芬作为前药，其通过N-去甲基化被转化为活性药物N-去甲基他莫昔芬。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括他莫西芬作为前药，其通过羟基化或N-去甲基化被转化为活性药物羟基他莫西芬(endoxifen)。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括酮康唑作为前药，其被CYP3A4转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括曲马多作为前药，其被CYP2D6转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括他克林作为前药，其被CYP1A2转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括毛果天芥菜碱作为前药，其被CYP3A4转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括克氏千里光碱作为前药，其被CYP3A4转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括dascarbazine作为前药，其被CYP1A1、CYP1A2或CYP2C8的任一种转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括替加氟作为前药，其被CYP2A6、CYP1A2或CYP2C8的任一种转化为活性药物。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括氯吡格雷(clopidogrel)作为前药，其通过氧化被转化为活性药物R-130964。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括V-PYRRO/NO作为前药，其通过氧化或环氧化被转化为活性药物PYRRO/NO。在另一方面，所述CYP依赖性毒素可包括V-PROLI/NO作为前药，其通过氧化或环氧化被转化为活性药物PROLI/NO。
在一些实施方案中，本发明的方法提供了用于选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)施用供体分子，其包括：
i)gRNA(例如scgRNA)，其中所述gRNA序列与cas9核酸酶结合，产生一种活性的位点核酸酶，其被设计用于切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏CYP酶、Cypor基因或Ctnnb1基因；
ii)聚合酶II启动子(例如细胞和/或组织特异性启动子)；
iii)转基因(任选的)；
iv)细胞和/或组织特异性同源臂序列，其被设计为促进、提升或以其他方式实现到期望的受体细胞基因座的同源整合；
b)施用cas9核酸酶(例如，编码Cas9的蛋白质或核酸)，其中所述cas9核酸酶与gRNA结合，产生一种活性的位点核酸酶，其被设计用于切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏CYP酶、Cypor基因或Ctnnb1基因；和
c)施用前药(原毒素)(例如，CYP依赖性毒素)。
scgRNA供体分子允许表达功能性gRNA(能够与cas9结合)。scgRNA的表达可以限于特定的细胞和/或组织类型(例如，已经经历了期望的基因编辑事件的那些)。在特定的实施方案中，哺乳动物细胞使用的细胞类型特异性启动子使用RNA聚合酶II(Pol2)启动子。在本领域中还已知由这些启动子驱动的转录不允许cas9 gRNA的正确加工。在本领域中还已知只有经过DNA供体分子与嵌入的Pol2启动子序列的同源重组的受体细胞才会转录DNA供体分子序列，这包括gRNA和可能包含或可能不包含DNA供体分子的任何转基因。相反，本领域已知的是，所述同源DNA供体分子的随机整合不会产生功能性gsRNA或转基因表达。通过将gRNA序列嵌入到具有同源臂的DNA供体分子中(同源臂在gRNA序列的上游和下游均嵌入)，促进了细胞和/或组织特异性同源重组和DNA供体分子整合进入受体细胞基因组。此外，通过将gRNA序列嵌入到DNA供体分子中，其中一个或多个核酶序列嵌入在gRNA序列的上游(“左核酶”)，并且一个或多个核酶序列嵌入在gRNA序列的下游(“右核酶”)，含有gRNA序列的未拼接的Pol2 RNA转录物通过左核酶和右核酶的组合切割而被正确处理。因此，通过scgRNA分子使得靶向特定细胞和/或组织类型的功能性gRNA和转基因的非随机的同时共表达成为可能。
在本发明的一些实施方案中，所述gRNA序列被嵌入到所述转基因的内含子中。在一些实施方案中，使用了rAAV载体。在其他实施方案中，使用了pX330载体。在一些实施方案中，使用其中转基因和选择盒均缺乏其自身启动子的GeneRideTM技术促进同源整合；同源重组进入靶基因座后，所述转基因和CYP毒素选择盒均由细胞启动子表达；仅选择靶向整合。在进一步的实施方案中，使用随机整合载体促进整合。在一些实施方案中，使用其中转基因和选择盒均具有其自身启动子的随机整合载体促进同源整合；随机整合进入细胞染色体后，转基因和CYP毒素选择盒均被表达；可以选择任何染色体整合。在一些实施方案中，将所述gRNA序列设计为与cas9核酸酶结合，从而产生活性的位点核酸酶，其切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏单个的CYP酶。在一些实施方案中，将所述gRNA序列设计为与cas9核酸酶结合，从而产生活性的位点核酸酶，其切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏CYP酶表达所需的转录因子Ctnnb1(β-连环蛋白)。
在一方面，本公开提供了一种scgRNA供体分子序列(及其所有保守修饰的变体)，其编码：(a)相应的反向末端重复序列(“ITR”)，以帮助SEQ ID NO：1的残基1至45和4,406至4,550中所示的连环体形成，(b)SEQ ID NO：1的残基212至1516和2978至3012中所示的相应的小鼠白蛋白同源臂，(c)SEQ ID NO：1的残基1517至1582中所示的RNA聚合酶II启动子序列，(d)SEQ ID NO：1的残基1589至2971中所示的人因子IX序列的实例，(e)SEQ ID NO：1的残基3026至3068中所示的锤头状核酶序列的实例，(f)gRNA的实例，其中所述gRNA包含与SEQ ID NO：1的残基3067至3088中所示的人POR基因互补的DNA靶向片段，以及(g)SEQ IDNO：1的残基3089至3236中所示的丁型肝炎病毒核酶的实例。在一些实施方案中，Cypor人因子9GeneRideTM作为rAAV载体包含在质粒中。在一个实施方案中，元件(e)和(g)切割未剪接的Pol2启动子产生的RNA转录物，从而释放正确加工的gRNA。在一个非限制性实施例中，元件(e)序列的3′-末端最优地直接位于元件(f)的5′-末端的上游(5′)，无间隔，并且元件(g)的5′-末端最优地直接位于元件(f)3′-末端的下游(3′)，无间隔。在一些实施方案中，元素(e)和(g)不分别直接位于元素(f)的上游和下游，但是，分别地，在元素(e)的情况下可以在上游位于远至100个碱基对或更多处(例如，至少50、至少70或至少100个碱基对)，并且在元素(f)的情况下可以在下游位于远至100个碱基对或更多处(例如，至少50、至少70或至少100个碱基对)。在一些实施方案中，元件(f)包含与SEQ ID No：34-516之一所示的人POR基因互补的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)施用供体分子，其包括：
i)聚合酶III启动子(例如U6启动子序列)；
ii)gRNA，其中所述gRNA序列与cas9核酸酶结合，产生一种活性的位点核酸酶，其被设计用于切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏CYP酶或Cypor基因；
iii)启动子；
iv)SpCAS9序列，其中表达的cas9核酸酶将与元件(b)的gsRNA结合，产生一种活性的位点核酸酶，其被设计用于切割、敲落、敲除和/或以其他方式破坏CYP酶、Cypor基因或Ctnnb1；以及
b)施用前药(原毒素)(例如，CYP依赖性毒素)。
在一方面，元件ii)的gRNA包含与SEQ ID NO：34-516之一所示的人POR基因的互补。在一些实施方案中，使用了pX330质粒载体。在一些实施方案中，使用其中转基因和选择盒均缺乏其自身启动子的GeneRideTM技术促进同源整合；同源重组进入靶基因座后，所述转基因和CYP毒素选择盒均由细胞启动子表达；仅选择靶向整合。在进一步的实施方案中，使用其中转基因和选择均具有其自身启动子的随机整合载体促进同源整合；随机整合进入细胞染色体后，转基因和Cypor选择盒均被表达；可以选择任何染色体整合。
在一些实施方案中，本发明提供了用于选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)施用供体分子，其包括：
i)聚合酶III启动子(例如U6启动子序列)；
ii)慢病毒构建的shRNAmir主链，其中嵌入微小RNA的shRNA包含与Cypor基因同源的序列；以及
b)施用前药(原毒素)(例如，CYP依赖性毒素)。
在一方面，元件ii)的shRNA包含与SEQ ID NO：2-33之一所示的人POR基因的序列互补。在一些实施方案中，使用了rAAV载体。在其他实施方案中，使用了pX330载体。在一些实施方案中，使用其中转基因和选择盒均缺乏其自身启动子的GeneRideTM技术促进同源整合；同源重组进入靶基因座后，所述转基因和CYP毒素选择盒均由细胞启动子表达；仅选择靶向整合。在进一步的实施方案中，使用随机整合载体促进整合。在一些实施方案中，使用其中转基因和选择均具有其自身启动子的随机整合载体促进同源整合；随机整合进入细胞染色体后，转基因和CYP毒素选择盒均被表达；可以选择任何染色体整合。
在一些实施方案中，所述方法包括向细胞施用基于mRNA的供体分子。例如，所述RNA分子可以包含编码Cas9的gRNA和mRNA。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗、抑制和/或预防受试者的疾病或病症的方法。在特定的实施方案中，所述方法包括执行本发明的方法，其中所述转基因对于待治疗的疾病或病症是治疗性的(例如，编码治疗性蛋白质)。在特定的实施方案中，所述方法包括将前药(原毒素)施用给受试者。所述方法可用于基因编辑细胞可以在体内生长的任何体系。靶组织的实例包括但不限于：肝脏(例如肝细胞和/或胆管)、造血系统(例如干细胞、T细胞和/或祖细胞)、皮肤(例如真皮和/或毛囊干细胞)、肾脏(例如肾小管上皮)、肠道(例如干细胞)、肺和胰腺。
在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是肝病。肝病的实例包括但不限于肝硬化、纤维化、肝细胞癌(HCC)和肝感染。在一些实施方案中，要治疗的疾病或病症选自遗传性肝病的组，其包括Crigler-Najjar综合征(1型和2型)、家族性高胆固醇血症、枫糖浆尿病，进行性家族性肝内胆汁淤积症、苯丙酮酸尿症、酪氨酸血症、粘多糖贮积症VII、α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症，威尔逊氏病、糖原贮积病、冯·吉尔克氏病、庞贝氏病、高胆红素瘤、急性间歇性卟啉症(AIP)和1型瓜氨酸血症。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症选自血友病A、血友病B和草酸中毒的组。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是乙型肝炎或丙型肝炎。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症选自肝癌、胆管癌、肝转移性肿瘤和肝外肿瘤的组。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症选自急性肝功能衰竭、同种异体移植排斥和异种移植排斥的组。
本文所述的组分通常作为药物制剂被施用于受试者。如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指人或动物受试者。在医师的指导下，本发明的组分可以在治疗上用于所指示的疾病或病症的治疗。
包含本发明组分的药物制剂可以方便地配制成与可接受的介质(例如，药学上可接受的载体)一起施用，所述介质例如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、二甲基亚砜(DMSO)、油、洗涤剂、悬浮剂或其合适的混合物。所述药剂的浓度在所选介质中可以不同，并且可以基于所需的药物制剂的施用途径来选择介质。除非任何常规介质或药剂与要施用的药剂不相容，否则考虑将其用于所述药物制剂中。
合适的药物制剂的选择取决于所选择的施用方法。例如，本发明的组分可以通过直接注射到任何期望的组织(例如，肝脏)或周围区域来施用。在这种情况下，药物制剂包括分散在与血液或目标组织相容的介质中的组分。
所述疗法可以，例如，肠胃外、通过注射到血流中(例如静脉内)、口服或通过皮下、肌内或腹膜内注射施用。在特定实施方案中，通过直接注射(例如，进入待治疗的组织)或口服来施用所述疗法。用于注射的药物制剂是本领域已知的。如果选择注射作为用于施用疗法的方法，则必须采取步骤以确保足够量的分子到达其靶细胞以发挥生物学作用。
含有本发明化合物作为活性成分并与药物载体紧密混合的药物组合物可以根据常规药物配制技术制备。根据施用所需的制剂形式，载体可以采取多种形式，例如静脉内、口服或肠胃外。在口服剂型的制备中，可以使用任何常用的药物介质，在口服液体制剂的情况下(例如悬浮液、酏剂和溶液)，例如水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或者在口服固体制剂(例如粉末、胶囊和片剂)的情况下，载体如淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下，可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。
本发明的药物制剂可以配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指适合于接受治疗的患者的药物制剂的物理上离散的单位。每个剂量应包含一定量的活性成分，所述成分经计算可与选定的药物载体一起产生所需的效果。确定合适剂量单位的方法是本领域技术人员众所周知的。剂量单位可以基于患者的体重成比例地增加或减少。如本领域已知的，用于缓解特定病理状况的适当浓度可以通过剂量浓度曲线计算来确定
本发明的方法可进一步包括在施用本发明的组合物后监测受试者的疾病或病症，以监测所述方法的功效。
根据本发明的另一方面，提供了表达gRNA的方法。所述方法包括在pol2启动子(例如组织或细胞特异性pol2启动子)的控制下表达自切割指导RNA(scgRNA)。自切割gRNA在单个指导RNA的5′和3'末端包含核酶。在表达scgRNA时，自切割的核酶会释放细胞内的gRNA以与Cas9相互作用。在一些实施方案中，所述scgRNA在gRNA的5′端包含锤头状核酶，并在gRNA的3′端包含丁型肝炎病毒核酶。scgRNA的表达可与任何基因编辑事件(例如同源重组)一起使用。在特定实施方案中，scgRNA与本文所述的基因编辑一起使用(例如，以抑制细胞中的一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR)。在特定的实施方案中，将scgRNA与实施例3中所述的基因编辑一起使用(例如，以抑制苯丙酮酸双加氧酶(Hpd)或尿黑酸双加氧酶(Hgd)，特别是在富马酰乙酰乙酸水解酶(Fah-/-)背景下)。本发明也包括受pol2启动子(例如组织或细胞特异性pol2启动子)控制的包含scgRNA的载体。
定义
提供以下定义以帮助理解本发明：
除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数引用。除非上下文另外明确指出，本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
“药学上可接受的”表示经联邦或州政府的监管机构批准，或列在《美国药典》或其他公认药典中，可用于动物，尤其是人类。
“载体”是指例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如，
80、聚山梨醇酯80)、乳化剂、缓冲液(例如TrisHCl、乙酸盐、磷酸盐)、抗菌剂、膨胀物质(例如乳糖、甘露醇)、赋形剂、辅助剂或与本发明活性药剂一起施用的载体。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。优选将水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液用作载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物载体描述于Remington：The Science and Practiceof Pharmacy,(Lippincott,Williams和Wilkins)；Liberman,等人,Eds.,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.；以及Rowe,等人,Eds.,Handbook ofPharmaceutical Excipients,Pharmaceutical Pr.
如本文所用，术语“治疗”是指使受疾病折磨的患者受益的任何类型的治疗，包括改善患者病况(例如，一种或多种症状)，延迟病况进展等。
如本文所用，术语“预防”是指对处于发展为病况的风险的受试者的预防性治疗，这导致该受试者发展成病况的概率降低。
化合物或药物组合物的“治疗有效量”是指有效预防、抑制或治疗特定病症或疾病和/或其症状的量。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，尤其是哺乳动物，尤其是人。
术语“分离的”是指将化合物在其生产过程中与存在的其他组分分离。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或不存在杂质，所述杂质基本不干扰基本活性，并且是例如由于不完全纯化或添加稳定剂而可能存在的。
如本文所用，术语“寡核苷酸”包括由两个或多个，优选三个以上的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素以及寡核苷酸的特定应用和用途。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”是指单链或双链的任何DNA或RNA分子，并且如果是单链，则指其线性或环状形式的互补序列的分子。在讨论核酸分子时，特定核酸分子的序列或结构可以根据在5′至3′方向提供序列的正常惯例在本文中描述。关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。这个术语在应用于DNA时，指的是从它所起源的生物体的天然基因组中与其紧邻的序列中分离出来的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包含插入到载体(如质粒或病毒载体)中的、或者整合到原核或真核细胞或宿主生物的基因组DNA中的DNA分子。
术语“载体”是指载体核酸分子(例如RNA或DNA)，核酸序列可以插入其中，例如用于导入宿主细胞，在所述宿主细胞中可以表达和/或复制所述核酸序列。载体可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链。载体可以用作通过转化、转染、转导或任何其他方式的细胞渗透将外源物质递送到受体细胞中的媒介物。“表达载体”是特定的载体，其包含具有在宿主细胞中表达所需的必需的可操作地连接的调节区的基因或核酸序列(例如，启动子、增强子、翻译起始信号、聚腺苷酸化信号、终止子等)。术语“可操作地连接的”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于所述编码序列的适当位置，以实现所述编码序列的表达。有时将该相同定义应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。
如本文所用，术语“小分子”是指具有相对低分子量(例如，小于4000、小于2000、特别是小于1kDa或800Da)的物质或化合物。通常，小分子是有机的，但不是蛋白质、多肽、氨基酸或核酸。
短语“小干扰RNA(siRNA)”是指短的(通常少于30个核苷酸长，特别是长度为12-30或20-25个核苷酸)双链RNA分子。通常，siRNA调节siRNA靶向的基因的表达。鉴定和合成siRNA分子的方法是本领域已知的(参见，例如，Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Inc)。短发夹RNA分子(shRNA)通常由被小的环序列(例如6-15个核苷酸，特别是7-10个核苷酸)隔开的短互补序列(例如siRNA)组成，其中所述序列之一与基因靶互补。shRNA分子通常被核酸内切酶加工成细胞内的siRNA。美国申请公开号20050032733中提供了对siRNA分子的示例性修饰。例如，可以用核酸酶抗性修饰来修饰siRNA和shRNA分子(例如，硫代磷酸酯、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基修饰或吗啉连接)。用于表达siRNA或shRNA分子的表达载体可以使用强启动子，该启动子可以是组成型的或受调控的。
“反义核酸分子”或“反义寡核苷酸”包括靶向(互补)于选择的序列(例如，翻译起始位点和/或剪接位点)以抑制目标蛋白质表达的核酸分子(例如，单链分子)。这种反义分子的长度通常在约15至约50个核苷酸之间，更特别地在约15至约30个核苷酸之间，并且通常跨越mRNA分子的翻译起始位点。还可以产生反义构建体，其包含反向定向的靶核酸分子的整个序列。靶向任何已知核苷酸序列的反义寡核苷酸可以根据标准方法通过寡核苷酸合成来制备。可以如上所述对反义寡核苷酸进行修饰以包含核酸酶抗性修饰。
如本文所用，“下游”是指相对于参考基因座更靠近3′末端的遗传基因座或序列位置，其中所述寡核苷酸序列以5′末端开始并“从5′至3′”延伸，直到在3′末端结束。
如本文所用，“供体分子”是指外源分子，其中所述分子被设计为对受体细胞产生作用。
如本文所用，“嵌入”是指在较大的合成寡核苷酸中包含某些所需的寡核苷酸序列，从而形成单个分子，其中所述分子可以具有或可以不具有除嵌入序列之外的其他活性或目的。
如本文所用，“同源臂”是指与所需的基因座具有同源性的靶序列，其被设计成提升、促进和实现供体分子向受体细胞基因组的同源整合。
如本文所用，“整合载体”是指递送供体分子、转基因或其他外源DNA或RNA的载体，其被整合到受体细胞染色体或基因组中。
如本文所用，“敲除”是指使生物体基因不起作用的技术。
如本文所用，“敲落”是指降低生物体基因表达的技术。
如本文所用，“前药”是指当施用于生物体系时，由于自发化学反应、酶催化化学反应、光解和/或代谢化学反应而产生药物物质(即活性成分)的任何化合物。因此，前药是具有治疗或毒性活性的化合物的共价修饰的类似物或潜在形式(例如，原毒素)。
“接头”是指包含共价连接至少两种化合物的原子链的化学部分。所述接头可以与化合物的任何在合成上可行的位置连接，但是优选以避免阻断化合物所需活性的方式连接。接头是本领域公知的。在特定的实施方案中，所述接头可包含1至约50个原子、1至约10个原子或约1至约5个原子。
如本文所用，“shRNAmir”是指shRNA分子嵌入的微小RNA。
如本文所用，“非整合载体”是指递送供体分子、转基因或其他外源DNA或RNA的载体，其中所述供体分子保持游离状态和/或不整合至受体细胞染色体或基因组中。
如本文所用，“合成寡核苷酸”是指由人制造且未与现有天然来源分离的寡核苷酸。
如本文所用，“靶序列”是指包含“靶位点”或“靶序列”的DNA多核苷酸。术语“靶位点”或“靶序列”在本文可互换使用，是指存在于靶DNA中的核酸序列，载体的DNA靶片段将与之结合，只要存在足够的结合条件。合适的DNA/RNA结合条件包括细胞中通常存在的生理条件。其他合适的DNA/RNA结合条件(例如，无细胞体系中的条件)是本领域已知的(参见，例如，Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press)。与指导RNA互补并杂交的靶DNA链称为“互补链”，而与“互补链”互补的靶DNA链(因此与指导RNA不互补)被称为“非互补链”或“非互补的链”。“定点修饰多肽”或“RNA结合定点多肽”或“RNA结合定点修饰多肽”或“定点多肽”是指结合RNA并靶向特定DNA序列的多肽。本文所述的定点修饰多肽被与其结合的RNA分子靶向特定的DNA序列。所述RNA分子包含与靶DNA内的靶序列结合、杂交或互补的序列，从而将结合的多肽靶向靶DNA内的特定位置(靶序列)。
如本文所用，“转基因”是指在导入受体细胞后具有改变受体细胞表型的潜力的非天然遗传材料。
如本文所用，“上游”是指相对于参考基因座更靠近5′或末端的遗传基因座或序列位置，其中所述寡核苷酸序列以5′末端开始并“从5′至3′”延伸，直到在3′末端结束。
提供以下实施例以说明本发明的各种实施方案。所述实施例是说明性的且无意于以任何方式限制本发明。
实施例1
材料和方法
质粒构建：使用具有序列5′-TCGTGGGGGTCCTGACCTAC-3′(SEQ ID NO：518)的在线设计工具(可从www.crispr.mit.edu获得)，在小鼠Cypor基因的外显子1中鉴定了一个CRISPR识别位点。将编码该序列的寡核苷酸退火并连接到用BbsI切割的pX330(Addgenecat.42230；Watertown,MA)中。pX330是人密码子优化的SpCas9和嵌合指导RNA表达质粒(Cong,等人Science(2013)339(6121):819-23)。简而言之，该质粒包含在U6启动子控制下的gRNA和在CBh启动子(杂交鸡β肌动蛋白启动子)控制下的SpCas9。寡核苷酸序列为5′-CACCGTCGTGGGGGTCCTGACCTAC-3′(SEQ ID NO：519)和5′-AAACGTAGGTCAGGACCCCCACGAC-3′(SEQ ID NO：520)。使用Guide-ItTM突变检测试剂盒(Takara Bio USA，Inc.，MountainView，CA)对所得质粒(pX330-Cypor)进行了验证以切割靶序列。
动物规程：通过流体动力学尾静脉注射对7-9周龄的129/sv雄性小鼠施用40μg在盐水中稀释的pX330-Cypor质粒。三周后，将所述小鼠分成两个组：通过IP注射对四只小鼠每周两次注射对乙酰氨基酚(APAP，13mg/ml生理盐水)，共16次注射。保留三只小鼠作为对照，不接受APAP。对于最后的6次APAP给药，在注射前16小时将小鼠禁食。使用ALT试剂盒(可从BKKits.com，BQ 004A-CR获得)从隐静脉穿刺抽取的10μl血液中注射APAP后6-20小时，测量丙氨酸转氨酶(ALT)水平。在最后一次APAP注射后两周，杀死小鼠并收获肝脏。
免疫荧光：将肝脏切片在多聚甲醛中固定5小时，在30％的蔗糖中低温保护过夜，并在最佳切割温度(OCT)包埋在化合物中。将七微切片在PBS中洗涤，在含0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中渗透处理12分钟，用0.3M甘氨酸封闭30分钟，然后在4℃下与第一抗体孵育过夜(Abcam ab180597(Cambridge，英国)；1：200在含10％正常山羊血清的PBS中)。在PBS中洗涤3×5分钟后，将切片在第二抗体(山羊抗兔
555，Invitrogen cat.A27039(Carlsbad,CA)，稀释1/2000)中于室温孵育1小时。将切片在DAPI
中(Southern Biotech,Inc.,Birmingham,AL)安装，并使用蔡司共聚焦显微镜观差。
结果
如图2所示，对于注射有pX330-Cypor的小鼠，通过血液ALT水平测量肝脏损伤随着时间降低。约10周后，经处理的小鼠对APAP具有抗性。图3中提供了CYPOR免疫组织化学结果。在接受APAP注射的pX330-CYPOR处理的小鼠中，存在大的Cypor阴性结节分布，从而表明无Cypor的肝细胞的克隆性放大(下部组图；虚线表示无Cypor的结节)。未用APAP处理的小鼠中不存在大的CYPOR阴性结节(上部组图)。
图4示出了注射(从左至右)对照质粒(pX330)、未经APAP选择的pX330-Cypor、注射APAP的pX330-Cypor和具有APAP饮食的pX330-Cypor的小鼠中的Cypor插入缺失的数目。在接受APAP(无论是通过注射还是通过饮食)的小鼠中，APAP处理的小鼠的插入缺失频率均显著较高(p<0.01)，从而证明可以通过Cypor敲除选择肝细胞。
除此之外，还向小鼠注射Cyp1A2/2E1 CRISPR敲除质粒并用APAP处理。如图5所示，与未使用APAP处理的小鼠相比(左图)，经APAP选择的注射有Cyp1A2/2E1 CRISPR敲除质粒的小鼠肝脏导致Cyp2E1阴性结节(右图；虚线表示无Cyp2E1的结节)。随APAP的施用，Cyp1A2和Cyp2E1插入缺失的频率从1％增加到约12％(约占肝细胞的17％)。这表明即使在Cypor正常的肝脏中，Cyp1A2和Cyp2E1的敲除也足以获得APAP抗性。
实施例2
使用睡美人转座子系统来测试被shRNA敲落的CYPOR。简要地，小鼠被注射有两种单独的质粒。一种质粒包含在CMV启动子控制下的睡美人转座酶。第二种质粒包含转座子盒，其包含GFP表达盒和U6驱动的Cypor shRNA。处理后，将注射的小鼠暴露于3个月的APAP选择。
图6提供了在用“睡美人”转座子系统和APAP处理的实验中，小鼠肝脏中的CYPOR免疫组织化学和GFP荧光。上部组图示出了阴性对照(无关shRNA)的结果。可以看到很少的GFP+细胞，但是没有结节形成。下部组图示出了注射有GFP-Cypor shRNA转座子的经APAP处理小鼠的图像。在Cypor阴性区域可以看到大的GFP表达融合区。这为转座子阳性肝细胞的放大提供了明确的证据。
实施例3
还测试了自切割的指导RNA。自切割的指导RNA在所述指导RNA的任一侧均包含核酶，因此所述指导RNA可以从pol II启动子驱动。例如，锤头状(HH)核酶可能在所述指导RNA的5′端，而丁型肝炎病毒(HDV)核酶可能在所述指导RNA的3′端。图7提供了自切割指导RNA的示意图。
在一个实验中，使用了包含侧接锤头型核酶和丁型肝炎病毒型核酶的指导RNA的scgRNA。用于这些实验的靶向载体包含人因子IX作为生物标记物，以及与鼠白蛋白基因座同源的臂之间的scgRNA。选择白蛋白基因作为细胞类型特异性基因座的实例。载体被设计成包含scgRNA，其靶向4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(Hpd)外显子3、Hpd的外显子4或尿黑酸双加氧酶(Hgd)外显子4。简而言之，所述载体依次包括：同源(白蛋白)左臂-p2A(2A肽)-人因子IX基因-同源(白蛋白)区域-HH核酶-gRNA-HDV核酶-同源(白蛋白)右臂。同源臂允许靶向整合(同源重组)，并且scgRNA嵌入内含子中。从这些载体产生重组腺相关病毒血清型8。给予富马酰乙酰乙酸酯水解酶敲除(Fah-/-)的新生小鼠含有具有3种gRNA之一的scgRNAGene Ride载体的rAAV8，随后在大约4周后给予含有由微小肝特异性启动子驱动的SpCas9的rAAV8。将小鼠在2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮(NTBC)上循环以允许选择肝细胞，所述肝细胞具有靶向载体的正确整合并因此表达能够破坏可选择的基因的gRNA。在Fah-/-小鼠中，Hpd或Hgd的缺失赋予了肝细胞选择性的生长优势。在5、9、14和18周龄时评估了循环人因子IX的水平。在第5周和第9周，所有小鼠显示了低水平的人因子IX。在第14周时，已接受具有抗Hpd外显子3gRNA的scgRNA载体的小鼠开始显示增加的hF9水平。这些水平在18周龄时显著增加，这证明选择了正确靶向的肝细胞。此外，接受具有靶向Hpd或Hgd外显子4的gRNA的scgRNA载体的小鼠在18周龄时显示了高水平的hF9。这一发现清楚地表明，自切割的核酶确实可以从pol 2启动子产生功能性gRNA，并且可以用于在体内在肝脏中产生可选择的基因编辑事件。
用掺有针对Cypor的自切割指导RNA的GeneRideTM载体靶向白蛋白基因座。在最初的实验中，使用了转基因荧光素酶。简而言之，所述载体依次包括：同源左臂-p2A(2A肽)-荧光素酶基因-同源区域-HH核酶-gRNA-HDV核酶-同源右臂。在同源重组到靶基因座(白蛋白)后，所述转基因和自切割指导RNA被表达。
给新生小鼠注射该载体，并在断奶时给予cas9，然后注射APAP8周。在基线和5、11和16剂后，对同一只小鼠进行了实时荧光素酶成像。荧光素酶表达随每次剂量增加，达到50倍的增加(参见图8)。收获时，Cypor染色显示较大的阴性区域，并且插入缺失频率为21％。
在另外的实验中，在上述载体中将人因子IX表达为转基因而不是荧光素酶。所述载体被命名为GRCyporF9。给新生小鼠注射AAV GRCyporF9作为新生儿，并在断奶时给予单剂量的Cas9。然后每周两次给它们注射APAP。图9示出了0、3、9和15剂APAP后血液中人因子IX的水平。响应APAP注射，人因子IX水平明显增加。未接受APAP的GRCyporF9注射小鼠未表现出增加，并且盐水对照也呈阴性。
AAV GRCyporF9也与Cas9一起被注入成年小鼠。随后给予小鼠多剂量的APAP。图10示出了0、2、7、13和19剂后人因子IX的水平，其中APAP依赖性增加明显。在19剂后杀死小鼠，并测量肝细胞中Cypor插入缺失的频率。所有经APAP选择的小鼠的插入缺失频率均为约20％，这表明有明显的选择。
图11显示了在APAP选择之后，在用GRCyporF9处理的小鼠中的CYPOR(上部组图)和人因子IX(下部组图)的免疫组织化学。示出了3只小鼠。所有经APAP处理的小鼠在中央静脉周围均显示出广泛的Cypor阴性区域(中间组图中的虚线和箭头)。相同的动物以相同的分布模式显示出大的人因子IX阳性小鼠肝细胞区域(中间组图中的虚线和箭头)。这些数据表明选择的Cypor阴性肝细胞表达治疗性转基因。
尽管上面已经描述并具体举例说明了本发明的某些优选实施方案，但是这并不意味着本发明限于这些实施方案。如所附权利要求书所述，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对其进行多种修改。
序列表
<110> 马库斯·格罗佩
<120> 基因疗法的方法
<130> 3422-P06657WO00
<150> 62/664,930
<151> 2018-04-30
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<151> 2018-04-30
<160> 523
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor 人类因子 9 gene ride
<400> 1
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtaaag atctgatatc 180
atcgatcgcg atgcattaat taagcggccg ctgtacatag gaggttcgaa ccctgctgaa 240
gggagaggtt ccaatactac aaaatgtagc gggatattgt catcaccttt ggggacatgt 300
catcatggtc cccagacaga gttacaaaac tcatccccta cacagcacta tgtctctggt 360
actgtttgtt ctacagatgt caacaacaga ggcccagcca tctcctattg cttggcttgt 420
cagtctttct agcctcccca ttattaattt caaatggggc aggtgttagg agggcaaaaa 480
tccacatatt aagtgcaaag cctttcagga gatttcctga aactagacaa aacccgtgtg 540
actggcatcg attattctat ttgatctagc tagtcctagc aaagtgacaa ctgctactcc 600
cctcctacac agccaagatt cctaagttgg cagtggcatg cttaatcctc aaagccaaag 660
ttacttggct ccaagattta tagccttaaa ctgtggcctc acattccttc ctatcttact 720
ttcctgcact ggggtaaatg tctccttgct cttcttgctt tctgtcctac tgcagggctc 780
ttgctgagct ggtgaagcac aagcccaagg ctacagcgga gcaactgaag actgtcatgg 840
atgactttgc acagttcctg gatacatgtt gcaaggctgc tgacaaggac acctgcttct 900
cgactgaggt cagaaacgtt tttgcatttt gacgatgttc agtttccatt ttctgtgcac 960
gtggtcaggt gtagctctct ggaactcaca cactgaataa ctccaccaat ctagatgttg 1020
ttctctacgt aactgtaata gaaactgact tacgtagctt ttaattttta ttttctgcca 1080
cactgctgcc tattaaatac ctattatcac tatttggttt caaatttgtg acacagaaga 1140
gcatagttag aaatacttgc aaagcctaga atcatgaact catttaaacc ttgccctgaa 1200
atgtttcttt ttgaattgag ttattttaca catgaatgga cagttaccat tatatatctg 1260
aatcatttca cattccctcc catggcctaa caacagttta tcttcttatt ttgggcacaa 1320
cagatgtcag agagcctgct ttaggaattc taagtagaac tgtaattaag caatgcaagg 1380
cacgtacgtt tactatgtca ttgcctatgg ctatgaagtg caaatcctaa cagtcctgct 1440
aatacttttc taacatccat catttctttg ttttcagggt ccaaaccttg tcactagatg 1500
caaagacgcc ttagccggaa gcggcgccac caatttcagc ctgctgaaac aggccggcga 1560
cgtggaagag aaccctggcc ctgctagcca gcgcgtgaac atgattatgg ccgagagccc 1620
tggcctgatc accatctgcc tgctgggcta cctgctgagc gccgagtgta ccgtgttcct 1680
ggaccacgag aacgccaaca agatcctgaa cagacccaag agatacaaca gcggcaagct 1740
ggaagagttc gtgcagggca acctggaacg cgagtgcatg gaagagaagt gcagcttcga 1800
agaggccaga gaggtgttcg agaacaccga gagaaccacc gagttctgga agcagtacgt 1860
ggacggcgac cagtgcgaga gcaacccttg tctgaacggc ggcagctgca aggacgacat 1920
caacagctac gagtgctggt gccccttcgg cttcgagggc aagaactgcg agctggacgt 1980
gacctgcaac atcaagaacg gcagatgcga gcagttctgc aagaacagcg ccgacaacaa 2040
ggtcgtgtgc tcctgcaccg agggctacag actggccgag aaccagaagt cctgcgagcc 2100
cgctgtgcct ttcccatgcg gaagagtgtc cgtgtcccag accagcaagc tgaccagagc 2160
cgagacagtg ttccccgacg tggactacgt gaacagcacc gaggccgaga caatcctgga 2220
caacatcacc cagagcaccc agtccttcaa cgacttcacc agagtcgtgg gcggcgagga 2280
tgctaagcct ggccagttcc cgtggcaggt ggtgctgaac ggaaaggtgg acgccttctg 2340
cggcggctcc atcgtgaacg agaagtggat cgtgacagcc gcccactgcg tggaaaccgg 2400
cgtgaagatc acagtggtgg ccggcgagca caacatcgag gaaaccgagc acacagagca 2460
gaaaagaaac gtgatcagga tcatccccca ccacaactac aacgccgcca tcaacaagta 2520
caaccacgat atcgccctgc tggaactgga cgagcccctg gtgctgaata gctacgtgac 2580
ccccatctgt atcgccgaca aagagtacac caacatcttt ctgaagttcg gcagcggcta 2640
cgtgtccggc tggggcagag tgtttcacaa gggcagatcc gctctggtgc tgcagtacct 2700
gagagtgcct ctggtggaca gagccacctg tctgagaagc accaagttca ccatctacaa 2760
caacatgttc tgcgctggct tccacgaggg cggcagagac tcttgtcagg gcgattctgg 2820
cggccctcac gtgacagagg tggaaggcac cagctttctg accggcatca tcagctgggg 2880
cgaggaatgc gccatgaagg ggaagtacgg catctacacc aaggtgtcca gatacgtgaa 2940
ctggatcaaa gaaaagacca agctgacata agctagctta gcctaaacac atcacaacca 3000
caaccttctc aggtaactaa ccggtccacg actgatgagt ccgtgaggac gaaacgagta 3060
agctcgtctc gtgggggtcc tgacctacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 3120
ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcttttgg ccggcatggt 3180
cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca acatgcttcg gcatggcgaa tgggacctta 3240
agccactatg tggagtcctc catgttagcc tagtcaagct tatcctctgg atgaagttga 3300
aaccatatga aggaatattt ggggggtggg tcaaaacagt tgtgtatcaa tgattccatg 3360
tggtttgacc caatcattct gtgaatccat ttcaacagaa gatacaacgg gttctgtttc 3420
ataataagtg atccacttcc aaatttctga tgtgccccat gctaagcttt aacagaattt 3480
atcttcttat gacaaagcag cctcctttga aaatatagcc aactgcacac agctatgttg 3540
atcaattttg tttataatct tgcagaagag aattttttaa aatagggcaa taatggaagg 3600
ctttggcaaa aaaattgttt ctccatatga aaacaaaaaa cttatttttt tattcaagca 3660
aagaacctat agacataagg ctatttcaaa attatttcag ttttagaaag aattgaaagt 3720
tttgtagcat tctgagaaga cagctttcat ttgtaatcat aggtaatatg taggtcctca 3780
gaaatggtga gacccctgac tttgacactt ggggactctg agggaccagt gatgaagagg 3840
gcacaactta tatcacacat gcacgagttg gggtgagagg gtgtcacaac atctatcagt 3900
gtgtcatctg cccaccaagt aacagatgtc agctaagact aggtcatgtg taggctgtct 3960
acaccagtga aaatcgcaaa aagaatctaa gaaattccac atttctagaa aataggtttg 4020
gaaaccgtat tccattttac aaaggacact tacatttctc tttttgtttt ccaggctacc 4080
ctgagaaaaa aagacatgaa gactcaggac tcatcttttc tgttggtgta aaatcaacac 4140
cctaaggaac acaaatttct ttaaacattt gacttcttgt ctctgtgctg caattaataa 4200
aaaatggaaa gaatctactc tgtggttcag aactctatct tccaaaggcg cgcttcaccc 4260
tagcagcctc tttggctcag aggaatccct gcctttcctc ccttcatctc agcagagaat 4320
gtagttccac atgggactag tgtacacgcg tgatatcaga tctgttacgt agataagtag 4380
catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 4440
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 4500
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa agcgcgcagc 4560
tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt 4620
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 4680
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4740
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 4800
cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 4860
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgcttagcgc 4920
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4980
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 5040
aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 5100
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 5160
cactcaactc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggtct 5220
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 5280
cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 5340
agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 5400
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 5460
catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 5520
tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 5580
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 5640
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 5700
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 5760
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 5820
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 5880
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 5940
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 6000
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 6060
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 6120
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 6180
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 6240
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 6300
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 6360
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 6420
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 6480
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 6540
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 6600
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 6660
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 6720
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 6780
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 6840
agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 6900
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 6960
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 7020
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 7080
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 7140
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 7200
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 7260
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 7320
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 7380
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 7440
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 7500
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 7560
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 7620
ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 7680
acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc atgcctgcag gcagctgcgc 7740
gctcgaactt catgcctgcc gaccttcccc aggtcacgat ccggacggcg ggtgagttca 7800
cattttarca gccggacgtg caractccgc tggtggtcta acgtcggtta ggtcccttga 7860
atcacgggac atatgttggt gttggaggt 7889
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 2
ggtagcgcct cagtggtgt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 3
ggcaaggagc tgtacctga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 4
gcaaggagct gtacctgaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 5
aaggagctgt acctgagca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 6
aggagctgta cctgagcta 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 7
ggaacatcat cgtgttcta 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 8
ctccaaaatc aggtatgaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 9
gcacccttca taggcttca 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 10
gtgatttcca gtgagtgta 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 11
gtggttttct gcatggcca 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 12
gaatgggtgc ttcttgttgg act 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 13
ggccggctga agagctacga gaac 24
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 14
gcacctgtgg aagttgatcg aa 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 15
cctaacctac tggttcctct tct 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 16
cggtggccga agaagtatct cttt 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 17
gccagcgttt catgatcaac a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 18
gaacaagacc tacgagcact t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 19
ggaacttgga ggaggacttc a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 20
ggatgaggag tccaacaaga a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 21
ggcggtggac tacatcaaga a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 22
gcggtggact acatcaagaa a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 23
ggtggactac atcaagaaac t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 24
gcccttggaa taaagttctg t 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 25
gccgaagaag tatctctttc 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 26
ggttcctctt cagaaagaa 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 27
ggtggactac atcaagaaa 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 28
gctgccagcg tttcatgat 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 29
gccagcgttt catgatcaa 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 30
ggccgaagaa gtatctctt 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 31
ggccgtgtgt gaacactttg 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 32
ggaggaacat catcgtgtt 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor shRNA 靶序列
<400> 33
ggtcaagttc gcggtgtttg 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 34
tacagcacgt tggtacgcgg cgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 35
tggccgcatc aacaagggcg tgg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 36
tcataggctt catccaggag cgg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 37
ctgtggaagt tgatcgaagg cgg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 38
tgcggccaag gtgtacatgg ggg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 39
acaggtagtc ctcatccgag cgg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 40
tgggcaagta cgtggacaag cgg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 41
tagtagcggg cctgcaggcg cgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 42
gtcccacaag gtgagacggg cgg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 43
acggattctt ggcatcaaag ggg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 44
ggtccacacc gacatagatg cgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 45
tgaggcgatg gagtagtagc ggg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 46
tgttctacgg ctcccagacg ggg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 47
gatgcggcca aggtgtacat ggg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 48
cctgtcatca tggtgggccc cgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 49
tgcctcgcat cccgtagcgg tgg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 50
gcctcgcatc ccgtagcggt ggg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 51
cgaacatggg caccagcgca cgg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 52
ccctggacgt gtggagctag ggg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 53
ggttctcgta gctcttcagc cgg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 54
agggccgtgc ggtaggacgt agg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 55
cgtgttctac ggctcccaga cgg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 56
tcgtacagca cgttggtacg cgg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 57
gtgcggtagg acgtagggca cgg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 58
ctacgagcac ttcaatgcca tgg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 59
tgcggtagga cgtagggcac ggg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 60
acatgcctcg catcccgtag cgg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 61
agcagtccca caaggtgaga cgg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 62
atgaggcgat ggagtagtag cgg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 63
caagtacgtg gacaagcggc tgg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 64
atgcggccaa ggtgtacatg ggg 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 65
atcatggtgg gccccggcac cgg 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 66
gccagagatc gacaacgccc tgg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 67
tgggacttgc gcacgaacat ggg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 68
tccacacgtc cagggagtag cgg 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 69
caccgacata gatgcggcca agg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 70
ggggagacgc tgctgtacta cgg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 71
agagatcgac aacgccctgg tgg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 72
ggtacagctc ctaagagaca cgg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 73
acagcacgtt ggtacgcggc ggg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 74
cgtactggcg aatgctggaa agg 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 75
gtgccctacg tcctaccgca cgg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 76
tccaaggacg cccaccgcta cgg 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 77
tcccacaagg tgagacgggc ggg 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 78
taggacgtag ggcacgggaa tgg 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 79
caccccaaag tgttcacaca cgg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 80
gcagtcccac aaggtgagac ggg 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 81
ggacttctac gactggctgc agg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 82
tcgtgggtct cctaacctac tgg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 83
ctctgctctc gtcaaccagc tgg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 84
tctctctggg gtcaagttcg cgg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 85
cggatgagga ctacctgtac cgg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 86
cgccttcgat caacttccac agg 23
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 87
gtaggtgagg gccgtgcggt agg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 88
ctgggacttg cgcacgaaca tgg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 89
atgtccctga acaacctgga tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 90
ccaaggacgc ccaccgctac ggg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 91
caccttggcc gcatctatgt cgg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 92
gcctatgaag ggtgccaccc cgg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 93
tccctccagg tatgaatctg ggg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 94
tggccgcatc tatgtcggtg tgg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 95
gcagtacgcc tcggagccct cgg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 96
cattcgccag tacgagcttg tgg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 97
aggaacatca tcgtgttcta cgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 98
cacgttggta cgcggcgggt tgg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 99
ctcagccacg atgtcgtaga agg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 100
gtctgaattt tggtgaactc ggg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 101
gtccagggag tagcggccct tgg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 102
gtgttctacg gctcccagac ggg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 103
cggttccctg gttcagcttc cgg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 104
gcacctggaa ttggacatct cgg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 105
tacgacatcg tggctgagct cgg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 106
tcttcctgcc cagggatgca cgg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 107
caactctgtg cacatctgtg cgg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 108
gcccgcccgt ctcaccttgt ggg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 109
gtagaagtcc tgggcattgt cgg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 110
gtactacggc tgccgccgct cgg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 111
gcacgcggtg gcagcttacc agg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 112
ggtagtcctc atccgagcgg cgg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 113
cataggcttc atccaggagc ggg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 114
aaggctggcc gcatcaacaa ggg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 115
atggcctcct cctccggcga ggg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 116
aaacacctgc gtggacacag ggg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 117
cgagctggcg cagtacgcct cgg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 118
gcgtggccac caactggctg cgg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 119
cgggatgcga ggcatgtcag cgg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 120
ctggggttgg gcgacgacga tgg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 121
tactggcgaa tgctggaaag ggg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 122
tcacctggac tcctcgccag tgg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 123
tggtggcctt gaagggcagg cgg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 124
taccaacgtg ctgtacgagc tgg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 125
cacctgtgga agttgatcga agg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 126
caacatggga gactcccacg tgg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 127
gtactggcga atgctggaaa ggg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 128
ggacatgacg acgtccaggt cgg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 129
tggaggagga cttcatcacc tgg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 130
ggtaagctgc caccgcgtgc tgg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 131
tgtacatggg ggagatgggc cgg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 132
tgcatggcca cctacggtga ggg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 133
gtatgaatct ggggaccacg tgg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 134
tggctgcagt caccaccaac cgg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 135
cgacatcgtg gctgagctcg ggg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 136
agtgccggcc ctcaccttgg agg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 137
cttgttgatg cggccagcct tgg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 138
ctggcgagag cagttctggc cgg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 139
tcaggtcggc ctgcagaaac agg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 140
agccacgctc cctccactca cgg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 141
attctgtttt cgctcatcgt ggg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 142
caccaactgg ctgcgggcca agg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 143
gaacaccttc tacgacatcg tgg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 144
tacgagcact tcaatgccat ggg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 145
gtacagctcc taagagacac ggg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 146
tggccacgcc cttgttgatg cgg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 147
atgcccagga cttctacgac tgg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 148
caggtgcatg aggtggcgct cgg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 149
cgagaaccag aagccgtgag tgg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 150
agtcctgggc attgtcggtg ggg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 151
gggcgttgtc gatctctggc agg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 152
ctcacccaca gacgtagatg tgg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 153
ttcggccacc gcctcggaca cgg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 154
tacttcttcg gccaccgcct cgg 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 155
acgatgatgt tcctccccta agg 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 156
aggagctggc gcagttccac agg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 157
caaacacctg cgtggacaca ggg 23
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 158
tggggttggg cgacgacgat ggg 23
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 159
tctgctctcg tcaaccagct ggg 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 160
ctggttcagc ttccggttgg tgg 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 161
gattctgttt tcgctcatcg tgg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 162
ccggccgtgt gtgaacactt tgg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 163
ggccgtgtgt gaacactttg ggg 23
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 164
ctccctggac gtgtggagct agg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 165
gggccgtgcg gtaggacgta ggg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 166
gactgtggca ctcaccatcc agg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 167
ttaggagctg tacctgagct ggg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 168
cggccagaac tgctctcgcc agg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 169
gcccctagct ccacacgtcc agg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 170
gaccaagggc cgctactccc tgg 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 171
ctccttggcc cgcagccagt tgg 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 172
tgcccgcccg tctcaccttg tgg 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 173
tgaggtggcg ctcggttccc tgg 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 174
accagggcgt tgtcgatctc tgg 23
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 175
ggatgaggac tacctgtacc ggg 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 176
tcaccttgtg ggactgctcc cgg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 177
atctcacccc cgtgtctctt agg 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 178
catggagcac gcgcaggcgg tgg 23
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 179
gcgcaccttg ccctcgccgg agg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 180
gatggcctcc tcctccggcg agg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 181
tcgatggggg gccgcaggga cgg 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 182
ggagaacggc ggccgtgcgc tgg 23
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 183
gaagggtgcc accccggtgc cgg 23
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 184
gcccaccgct acgggatgcg agg 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 185
gggtgagcgc accgtccctg tgg 23
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 186
cgacgtccag gtcggcaccc agg 23
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 187
tgcgctcacc cagctcaacg tgg 23
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 188
caaggctggc cgcatcaaca agg 23
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 189
gttttctgca tggccaccta cgg 23
<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 190
cttaccaggt catactcctc agg 23
<210> 191
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 191
ctctgtgcac atctgtgcgg tgg 23
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 192
gcgtggtggc cttgaagggc agg 23
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 193
tcatcctcca aggtgagggc cgg 23
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 194
ctgcatggcc acctacggtg agg 23
<210> 195
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 195
accaaccgga agctgaacca ggg 23
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 196
accccagctc aaagatgcgc tgg 23
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 197
tctgaatttt ggtgaactcg ggg 23
<210> 198
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 198
ctcccgggag cagtcccaca agg 23
<210> 199
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 199
cttaggagct gtacctgagc tgg 23
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 200
gttgacgaga gcagagtcgt tgg 23
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 201
tcagggacat gacgacgtcc agg 23
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 202
aaggagcctg ccggggagaa cgg 23
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 203
caatgccatg ggcaagtacg tgg 23
<210> 204
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 204
accggggtgg cacccttcat agg 23
<210> 205
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 205
cgccagctcg tacagcacgt tgg 23
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 206
acgacatcgt ggctgagctc ggg 23
<210> 207
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 207
cgagagcaga gtcgttggct ggg 23
<210> 208
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 208
ggtagtaggt gagggccgtg cgg 23
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 209
agcaagaccg agagcacctg tgg 23
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 210
cgcaagatgg cctcctcctc cgg 23
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 211
cggtggagct ggtgtccacg tgg 23
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 212
cagccagtcg tagaagtcct ggg 23
<210> 213
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 213
tcctggatga agcctatgaa ggg 23
<210> 214
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 214
acgagagcag agtcgttggc tgg 23
<210> 215
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 215
gacaagcggc tggagcagct cgg 23
<210> 216
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 216
ggatggccag gatgtgcctc cgg 23
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 217
ccagttccgc ctgcccttca agg 23
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 218
gcagccagtc gtagaagtcc tgg 23
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 219
agctcacaca ggtggtcgat ggg 23
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 220
gctctcggtc ttgctttagc agg 23
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 221
tccacgcagg tgtttggtct tgg 23
<210> 222
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 222
ccacgcaggt gtttggtctt ggg 23
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 223
actcaccatc caggttgttc agg 23
<210> 224
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 224
tcaacttcca caggtgctct cgg 23
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 225
cacctccttg cctgcgtggc agg 23
<210> 226
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 226
tgcagccagg aacggattct tgg 23
<210> 227
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 227
cggctgccgc cgctcggatg agg 23
<210> 228
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 228
ggccaccgcc tcggacacgg tgg 23
<210> 229
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 229
cttgcctgcg tggcaggggc cgg 23
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 230
cgcacggccg ccgttctccc cgg 23
<210> 231
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 231
caccgcctgc gcgtgctcca tgg 23
<210> 232
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 232
gctgaaaaga gatacttctt cgg 23
<210> 233
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 233
tgcgggccaa ggagcctgcc ggg 23
<210> 234
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 234
cagctccacc gtgtccgagg cgg 23
<210> 235
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 235
ggtggggtct ccctcaccgt agg 23
<210> 236
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 236
gtggagtacg agaccaaggc tgg 23
<210> 237
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 237
agcggtgggc gtccttggac agg 23
<210> 238
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 238
caccttgtgg gactgctccc ggg 23
<210> 239
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 239
caaaatcctg ggtgccgacc tgg 23
<210> 240
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 240
ggccatggag cacgcgcagg cgg 23
<210> 241
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 241
acagctccta agagacacgg ggg 23
<210> 242
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 242
ctgccacgca ggcaaggagg tgg 23
<210> 243
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 243
tgaggactac ctgtaccggg agg 23
<210> 244
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 244
aggtgctgga cgtagacctg ggg 23
<210> 245
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 245
cccagcgcat ctttgagctg ggg 23
<210> 246
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 246
tacagctcct aagagacacg ggg 23
<210> 247
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 247
ggtggagctg gtgtccacgt ggg 23
<210> 248
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 248
ggccatgcag aaaaccacca ggg 23
<210> 249
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 249
gtggtgactg cagccaggaa cgg 23
<210> 250
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 250
agaccccacc gacaatgccc agg 23
<210> 251
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 251
gtgggactgc tcccgggaga agg 23
<210> 252
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 252
tcacccacag acgtagatgt ggg 23
<210> 253
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 253
ggagctggcg cagttccaca ggg 23
<210> 254
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 254
gccatgttcc gtgcatccct ggg 23
<210> 255
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 255
ctttctgaag aggaaccagt agg 23
<210> 256
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 256
cgcctcatcc tccaaggtga ggg 23
<210> 257
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 257
cttgtccacg tacttgccca tgg 23
<210> 258
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 258
ctctggcagg ctgctcaggt cgg 23
<210> 259
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 259
gctgcgacag cagggtgagt ggg 23
<210> 260
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 260
ctcctggatg aagcctatga agg 23
<210> 261
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 261
catggcattg aagtgctcgt agg 23
<210> 262
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 262
tgcaggactg cccgtccctg cgg 23
<210> 263
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 263
ttggcatcaa aggggctggg tgg 23
<210> 264
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 264
gcccagggat gcacggaaca tgg 23
<210> 265
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 265
tggagtagta gcgggcctgc agg 23
<210> 266
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 266
gatgaagtcc tcctccaagc tgg 23
<210> 267
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 267
tgccacgcag gcaaggaggt ggg 23
<210> 268
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 268
cgtcatgtcc ctgaacaacc tgg 23
<210> 269
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 269
cgcccagcgc atctttgagc tgg 23
<210> 270
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 270
ggcgtccttg gacaggcggt tgg 23
<210> 271
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 271
gcggcgggtt ggtgatgtcc agg 23
<210> 272
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 272
gacagacgtg gatctctctg ggg 23
<210> 273
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 273
ctgcgacagc agggtgagtg ggg 23
<210> 274
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 274
ggtcttgctt tagcaggtgc tgg 23
<210> 275
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 275
tccctggttc agcttccggt tgg 23
<210> 276
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 276
accacgcctg tcatcatggt ggg 23
<210> 277
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 277
cagagttggg gtggacctgt ggg 23
<210> 278
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 278
gctcaacgtg gccttctccc ggg 23
<210> 279
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 279
cgcacagatg tgcacagagt tgg 23
<210> 280
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 280
cgagcgccac ctcatgcacc tgg 23
<210> 281
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 281
tccccagatt catacctgga ggg 23
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 282
tgaagaggaa ccagtaggtt agg 23
<210> 283
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 283
ctccctccag gtatgaatct ggg 23
<210> 284
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 284
gttggtgatg tccaggtagt agg 23
<210> 285
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 285
tccctggacg tgtggagcta ggg 23
<210> 286
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 286
agctcaacgt ggccttctcc cgg 23
<210> 287
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 287
agatgcggcc aaggtgtaca tgg 23
<210> 288
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 288
ctcaccatcc aggttgttca ggg 23
<210> 289
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 289
cggccgtgtg tgaacacttt ggg 23
<210> 290
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 290
cggggccatg gagcacgcgc agg 23
<210> 291
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 291
ctccaccgtg tccgaggcgg tgg 23
<210> 292
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 292
catggtgggc cccggcaccg ggg 23
<210> 293
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 293
ctgcgggcca aggagcctgc cgg 23
<210> 294
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 294
gcgccagctc ctcccggtac agg 23
<210> 295
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 295
agtatctctt ttcagcatga cgg 23
<210> 296
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 296
tgtctgaatt ttggtgaact cgg 23
<210> 297
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 297
cgtgtgtgaa cactttgggg tgg 23
<210> 298
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 298
gtgtctgcct tccttagggg agg 23
<210> 299
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 299
tgtggaccac aagctcgtac tgg 23
<210> 300
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 300
aaccagctgg gcaaaatcct ggg 23
<210> 301
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 301
gtgcccacat ctacgtctgt ggg 23
<210> 302
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 302
caccaaccgg aagctgaacc agg 23
<210> 303
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 303
attgcacact tttgtcttgc agg 23
<210> 304
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 304
tgatgttcct cccctaagga agg 23
<210> 305
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 305
caggtgctgg acgtagacct ggg 23
<210> 306
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 306
ctggagggag atgtgaggct cgg 23
<210> 307
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 307
ctcccagacg gggactgcag agg 23
<210> 308
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 308
catctccccc atgtacacct tgg 23
<210> 309
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 309
cggcctgcag aaacagggac agg 23
<210> 310
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 310
ctcacacagg tggtcgatgg ggg 23
<210> 311
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 311
caccagctcc accgtgtccg agg 23
<210> 312
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 312
gatggccagg atgtgcctcc ggg 23
<210> 313
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 313
tgtccaattc caggtgcatg agg 23
<210> 314
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 314
acatctcgga ctccaaaatc agg 23
<210> 315
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 315
gtttgccaac cgcctgtcca agg 23
<210> 316
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 316
agtccgagat gtccaattcc agg 23
<210> 317
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 317
ggctgcgaca gcagggtgag tgg 23
<210> 318
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 318
aggacgtagg gcacgggaat ggg 23
<210> 319
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 319
cgcatctttg agctggggtt ggg 23
<210> 320
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 320
ccacctcatg cacctggaat tgg 23
<210> 321
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 321
ctccatcgcc tcatcctcca agg 23
<210> 322
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 322
agagttgggg tggacctgtg ggg 23
<210> 323
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 323
gcacatctgt gcggtggttg tgg 23
<210> 324
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 324
gccgctactc cctggacgtg tgg 23
<210> 325
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 325
ggccatgttc cgtgcatccc tgg 23
<210> 326
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 326
gttctccccg gcaggctcct tgg 23
<210> 327
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 327
actcctctgc agtccccgtc tgg 23
<210> 328
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 328
gagacagacg tggatctctc tgg 23
<210> 329
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 329
gagcctgccg gggagaacgg cgg 23
<210> 330
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 330
agggtgccac cccggtgccg ggg 23
<210> 331
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 331
agcggcccct gtgtccacgc agg 23
<210> 332
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 332
gcgggcctgg ctgcgacagc agg 23
<210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 333
cgcctcggag ccctcggagc agg 23
<210> 334
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 334
gtggtcgatg gggggccgca ggg 23
<210> 335
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 335
tcatggtggg ccccggcacc ggg 23
<210> 336
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 336
ggcagtgccg gccctcacct tgg 23
<210> 337
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 337
cgtggccacc aactggctgc ggg 23
<210> 338
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 338
caggtcggcc tgcagaaaca ggg 23
<210> 339
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 339
cactttgggg tggaagccac tgg 23
<210> 340
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 340
ttaccaggtc atactcctca ggg 23
<210> 341
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 341
ggtgcccaca tctacgtctg tgg 23
<210> 342
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 342
agacagacgt ggatctctct ggg 23
<210> 343
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 343
ctcctctgca gtccccgtct ggg 23
<210> 344
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 344
gaacggattc ttggcatcaa agg 23
<210> 345
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 345
atcaagaaac tgatgaccaa ggg 23
<210> 346
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 346
ggtggtcgat ggggggccgc agg 23
<210> 347
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 347
aacagtttca tgatcaacat ggg 23
<210> 348
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 348
ccaggtgagc aagtgcccgc agg 23
<210> 349
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 349
tggggtggaa gccactggcg agg 23
<210> 350
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 350
ggtgggcgtc cttggacagg cgg 23
<210> 351
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 351
ggttgtggag tacgagacca agg 23
<210> 352
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 352
tgttccgtgc atccctgggc agg 23
<210> 353
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 353
ggtcctgtcc ctgtttctgc agg 23
<210> 354
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 354
caaggtgtac atgggggaga tgg 23
<210> 355
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 355
gcgcatcttt gagctggggt tgg 23
<210> 356
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 356
cctgtgtctg ccttccttag ggg 23
<210> 357
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 357
ggacgtagac ctggggccaa ggg 23
<210> 358
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 358
acctccttgc ctgcgtggca ggg 23
<210> 359
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 359
cttgaagggc aggcggaact ggg 23
<210> 360
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 360
gtggtcccca gattcatacc tgg 23
<210> 361
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 361
acccttcata ggcttcatcc agg 23
<210> 362
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 362
cgatctctgg caggctgctc agg 23
<210> 363
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 363
cacggccctc acctactacc tgg 23
<210> 364
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 364
accctgtgtc tgccttcctt agg 23
<210> 365
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 365
ggccaccacg cctgtcatca tgg 23
<210> 366
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 366
cgatgggggg ccgcagggac ggg 23
<210> 367
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 367
ggggcgcacc ttgccctcgc cgg 23
<210> 368
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 368
tcacacaggt ggtcgatggg ggg 23
<210> 369
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 369
aacggattct tggcatcaaa ggg 23
<210> 370
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 370
cggccgccgt tctccccggc agg 23
<210> 371
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 371
taacagtttc atgatcaaca tgg 23
<210> 372
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 372
gaaccagaag ccgtgagtgg agg 23
<210> 373
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 373
tcctcggccc agcttggagg agg 23
<210> 374
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 374
atgctggaaa ggggagacca agg 23
<210> 375
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 375
gatgtccagg tagtaggtga ggg 23
<210> 376
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 376
ctggcgcagt tccacaggga cgg 23
<210> 377
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 377
gaagtcctgg gcattgtcgg tgg 23
<210> 378
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 378
caccttggag gatgaggcga tgg 23
<210> 379
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 379
aggcatgtca gcggaccctg agg 23
<210> 380
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 380
catcaagaaa ctgatgacca agg 23
<210> 381
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 381
acaagggcgt ggccaccaac tgg 23
<210> 382
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 382
ggagctgtac ctgagctggg tgg 23
<210> 383
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 383
acagagttgg ggtggacctg tgg 23
<210> 384
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 384
cagctcacac aggtggtcga tgg 23
<210> 385
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 385
tgagctgggt ggtggaggcc cgg 23
<210> 386
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 386
gcaggtgctg gacgtagacc tgg 23
<210> 387
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 387
aagtcctggg cattgtcggt ggg 23
<210> 388
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 388
ggaactgcgc cagctcctcc cgg 23
<210> 389
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 389
gcttcatcca ggagcgggcc tgg 23
<210> 390
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 390
cacccaggat tttgcccagc tgg 23
<210> 391
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 391
gacaggcgtg gtggccttga agg 23
<210> 392
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 392
gcgggccaag gagcctgccg ggg 23
<210> 393
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 393
cgtggctgag ctcggggcca tgg 23
<210> 394
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 394
ttgcctgcgt ggcaggggcc ggg 23
<210> 395
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 395
ctacctgtac cgggaggagc tgg 23
<210> 396
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 396
tcacctggcg agagcagttc tgg 23
<210> 397
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 397
tggcagctgg tacctgattt tgg 23
<210> 398
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 398
cgtagacctg gggccaaggg tgg 23
<210> 399
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 399
gtccccagat tcatacctgg agg 23
<210> 400
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 400
ggatgcacgg aacatggcca ggg 23
<210> 401
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 401
gggatgcacg gaacatggcc agg 23
<210> 402
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 402
ggaccctgag gagtatgacc tgg 23
<210> 403
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 403
ggagaaggcc acgttgagct ggg 23
<210> 404
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 404
catacctgga gggagatgtg agg 23
<210> 405
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 405
gctcacacag gtggtcgatg ggg 23
<210> 406
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 406
ggggtctccc tcaccgtagg tgg 23
<210> 407
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 407
gcacatcctg gccatcctgc agg 23
<210> 408
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 408
ttcttgttgg actcctctgc agg 23
<210> 409
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 409
gcccagcgca tctttgagct ggg 23
<210> 410
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 410
aaggtgtaca tgggggagat ggg 23
<210> 411
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 411
cttgccctcg ccggaggagg agg 23
<210> 412
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 412
caccttgccc tcgccggagg agg 23
<210> 413
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 413
ggcgcggcag cagctcacac agg 23
<210> 414
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 414
cccctgccac gcaggcaagg agg 23
<210> 415
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 415
gcgcagcagc tcctgctccg agg 23
<210> 416
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 416
ctcctcctcc ggcgagggca agg 23
<210> 417
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 417
cgggcctggc tgcgacagca ggg 23
<210> 418
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 418
gtcgcagcca ggcccgctcc tgg 23
<210> 419
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 419
aagggtgcca ccccggtgcc ggg 23
<210> 420
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 420
gcccaccatg atgacaggcg tgg 23
<210> 421
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 421
agggtgagtg gggtcccatg ggg 23
<210> 422
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 422
tggcatcaaa ggggctgggt ggg 23
<210> 423
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 423
tgtcagagag agcagctttg tgg 23
<210> 424
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 424
tctccctcca ggtatgaatc tgg 23
<210> 425
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 425
tgtggaaaag atgaagaaaa cgg 23
<210> 426
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 426
cttggcccgc agccagttgg tgg 23
<210> 427
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 427
tggacgtaga cctggggcca agg 23
<210> 428
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 428
caccacgcct gtcatcatgg tgg 23
<210> 429
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 429
atgaagtcct cctccaagct ggg 23
<210> 430
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 430
caaccagctg ggcaaaatcc tgg 23
<210> 431
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 431
gaaggtgttc tgcacatccc tgg 23
<210> 432
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 432
aaccagaagc cgtgagtgga ggg 23
<210> 433
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 433
aagccactgg cgaggagtcc agg 23
<210> 434
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 434
aaagctgctc tctctgacag agg 23
<210> 435
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 435
attcttggca tcaaaggggc tgg 23
<210> 436
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 436
ctcaccctgc tgtcgcagcc agg 23
<210> 437
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 437
ccacgcaggc aaggaggtgg ggg 23
<210> 438
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 438
gctgtacctg agctgggtgg tgg 23
<210> 439
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 439
agccgtgagt ggagggagcg tgg 23
<210> 440
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 440
gggtgagtga gtggggtcac tgg 23
<210> 441
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 441
ggacgggcag tcctgcagga tgg 23
<210> 442
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 442
ctcctgctcc gagggctccg agg 23
<210> 443
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 443
cgcctcggac acggtggagc tgg 23
<210> 444
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 444
tcctcctcca agctgggccg agg 23
<210> 445
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 445
ttcttggcat caaaggggct ggg 23
<210> 446
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 446
ctctcctcgg cccagcttgg agg 23
<210> 447
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 447
aagctcgtac tggcgaatgc tgg 23
<210> 448
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 448
cgagcctcac atctccctcc agg 23
<210> 449
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 449
cgccctggtg gttttctgca tgg 23
<210> 450
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 450
ctccctccac tcacggcttc tgg 23
<210> 451
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 451
ggtgggcccc ggcaccgggg tgg 23
<210> 452
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 452
tgatgtccag gtagtaggtg agg 23
<210> 453
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 453
tgatgccaag aatccgttcc tgg 23
<210> 454
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 454
ctggctgcag gagacagacg tgg 23
<210> 455
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 455
gggtgagtgg ggtcccatgg ggg 23
<210> 456
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 456
gtgcatccct gggcaggaag agg 23
<210> 457
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 457
gtacctgagc tgggtggtgg agg 23
<210> 458
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 458
cgcagcagct cctgctccga ggg 23
<210> 459
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 459
tacgtctgtg ggtgagtgag tgg 23
<210> 460
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 460
ctcctctcct cggcccagct tgg 23
<210> 461
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 461
tgagctgctg ccgcgcctgc agg 23
<210> 462
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 462
tcgcctcatc ctccaaggtg agg 23
<210> 463
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 463
gccacgcagg caaggaggtg ggg 23
<210> 464
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 464
tcttgttgga ctcctctgca ggg 23
<210> 465
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 465
ccctgtgtct gccttcctta ggg 23
<210> 466
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 466
atgttgatca tgaaactgtt agg 23
<210> 467
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 467
ctccaagctg ggccgaggag agg 23
<210> 468
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 468
ttggggtgga cctgtgggga ggg 23
<210> 469
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 469
ggccctcacc ttggaggatg agg 23
<210> 470
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 470
gcagggtgag tggggtccca tgg 23
<210> 471
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 471
ggcagtcctg caggatggcc agg 23
<210> 472
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 472
ggatggtgag tgccacagtc agg 23
<210> 473
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 473
gttggggtgg acctgtgggg agg 23
<210> 474
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 474
tgctggaaag gggagaccaa ggg 23
<210> 475
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 475
tggccatgca gaaaaccacc agg 23
<210> 476
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 476
ggcatcaaag gggctgggtg ggg 23
<210> 477
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 477
cagggtgagt ggggtcccat ggg 23
<210> 478
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 478
gcacagatgt gcacagagtt ggg 23
<210> 479
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 479
gcaggagctg ctgcgcaaga tgg 23
<210> 480
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 480
gctcacacgg ccctccccac agg 23
<210> 481
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 481
gcggcagcag ctcacacagg tgg 23
<210> 482
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 482
gatggtgagt gccacagtca ggg 23
<210> 483
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 483
agatgtgcac agagttgggg tgg 23
<210> 484
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 484
gcatccctgg gcaggaagag ggg 23
<210> 485
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 485
gcagggacgg gcagtcctgc agg 23
<210> 486
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 486
ggttggtggt gactgcagcc agg 23
<210> 487
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 487
caccatgatg acaggcgtgg tgg 23
<210> 488
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 488
tggctgggta cacagccacg tgg 23
<210> 489
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 489
tgcctgtctc ttccctgcag agg 23
<210> 490
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 490
ggaggcccgg aggcacatcc tgg 23
<210> 491
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 491
cgggaatggg tgcttcttgt tgg 23
<210> 492
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 492
ctcctctgca gggaagagac agg 23
<210> 493
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 493
gctgggtggt ggaggcccgg agg 23
<210> 494
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 494
agcaccccct cttcctgccc agg 23
<210> 495
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 495
cgtctgtggg tgagtgagtg ggg 23
<210> 496
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 496
atcaaagggg ctgggtgggg agg 23
<210> 497
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 497
tgcctgcgtg gcaggggccg ggg 23
<210> 498
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 498
cacagatgtg cacagagttg ggg 23
<210> 499
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 499
acagcaccac ccttggcccc agg 23
<210> 500
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 500
gggcctccac cacccagctc agg 23
<210> 501
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 501
cggcccctgc cacgcaggca agg 23
<210> 502
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 502
acgtctgtgg gtgagtgagt ggg 23
<210> 503
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 503
cacttacaat gtctgaattt tgg 23
<210> 504
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 504
gctgctctct ctgacagagg agg 23
<210> 505
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 505
acaggcgtgg tggccttgaa ggg 23
<210> 506
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 506
gcaccccctc ttcctgccca ggg 23
<210> 507
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 507
tgcatccctg ggcaggaaga ggg 23
<210> 508
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 508
cctgtgtcca cgcaggtgtt tgg 23
<210> 509
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 509
catccctggg caggaagagg ggg 23
<210> 510
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 510
ctgggccgag gagaggagag ggg 23
<210> 511
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 511
tctgcaggga agagacaggc agg 23
<210> 512
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 512
gctgggccga ggagaggaga ggg 23
<210> 513
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 513
gggagaaggc cacgttgagc tgg 23
<210> 514
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 514
agctgggccg aggagaggag agg 23
<210> 515
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 515
cttctttttt ctttctgaag agg 23
<210> 516
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cypor CRISPR 靶序列
<400> 516
caccccggcc cctgccacgc agg 23
<210> 517
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 517
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 518
tcgtgggggt cctgacctac 20
<210> 519
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 519
caccgtcgtg ggggtcctga cctac 25
<210> 520
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 520
aaacgtaggt caggaccccc acgac 25
<210> 521
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 锤头状核酶
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(6)
<223> n = a, c, g, or u
<400> 521
nnnnnncuga ugaguccgug aggacgaaac gaguaagcuc guc 43
<210> 522
<211> 68
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HDV 核酶
<400> 522
ggccggcaug gucccagccu ccucgcuggc gccggcuggg caacaugcuu cggcauggcg 60
aaugggac 68
<210> 523
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 指导RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n = a, c, g, or u
<400> 523
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uuuaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
Claims (28)
1.一种用于在受试者中选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)抑制细胞中的细胞色素p450(CYP)酶、细胞色素p450还原酶(POR)和/或β-连环蛋白(CTNNB1)；以及
b)向具有通过步骤a)产生的细胞的受试者施用原毒素，
其中所述原毒素在通过步骤a)产生的细胞中不转化为毒性代谢物，从而允许所述受试者内的所述细胞放大和/或扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤b)之前将转基因导入所述细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在体外进行，并且在步骤b)之前将所述细胞施用于所述受试者。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在体内进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用抑制性核酸分子或编码抑制性核酸分子的核酸分子，其中所述抑制性核酸分子对CYP酶、POR或CTNNB1具有特异性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抑制性核酸分子是shRNA。
8.根据权利要求6所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用载体，所述载体包含编码所述抑制性核酸分子的核酸分子以及转基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体是整合载体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述整合载体缺乏启动子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括通过基因编辑使CYP酶、POR和/或CTNNB1失活。
14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用Cas9和对CYP酶、POR或CTNNB1基因具有特异性的指导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸分子，其中所述gRNA序列与所述Cas9结合，从而导致所述CYP酶、POR或CTNNB1基因的切割。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述gRNA是自切割的指导RNA(scgRNA)，其中所述scgRNA包含在5′和3′末端均侧接自切割核酶的gRNA。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述scgRNA从RNA聚合酶II启动子表达。
17.根据权利要求14所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用载体，所述载体包含编码所述gRNA的核酸分子以及转基因。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体是整合载体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述整合载体缺乏启动子。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述原毒素以足以在所述受试者中导致轻度肝毒性的量施用。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述原毒素以足以在所述受试者中导致中度肝毒性的量施用。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述原毒素以足以提高所述受试者的至少一种肝酶的水平的量施用，所述肝酶选自包括以下的组：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述原毒素选自由以下组成的组：对乙酰氨基酚、倒千里光碱、环磷酰胺、他莫昔芬、酮康唑、曲马多、他克林、毛果天芥菜碱、克氏千里光碱、达卡巴嗪、甲氧吗啉基阿霉素(PNU 152243)、异环磷酰胺、曲磷胺、帕拉德福韦、MB07133、布帕伐醌羟亚胺、萘丁美酮羟亚胺、DB289、呋喃二脒、西拉非班、希美加群、胍诺沙苄、AQ4N、4-甘薯苦醇、氯吡格雷、V-PYRRO/NO、V-PROLI/NO和替加氟。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述原毒素是对乙酰氨基酚。
27.根据权利要求26所述的方法，其中将所述对乙酰氨基酚在连续天数中以每天6克的剂量施用于所述受试者。
28.根据权利要求26所述的方法，其中将所述对乙酰氨基酚以10克的单剂量施用于所述受试者。
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