KR20240001708A - 유전적 장애의 치료를 위해 생체내 뉴클레아제-매개의 유전자 표적화를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유전적 장애의 치료를 위해 생체내 뉴클레아제-매개의 유전자 표적화를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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릴리 왕
제임스 엠. 윌슨
안나 트레티아코바
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템이 제공된다. 시스템은 (a) 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 편집 벡터; 및 (b) PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터를 포함하고, 여기서 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않으며, 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함하고; 표적 세포 내의 천연 PCSK9는 이중 벡터 시스템을 이용한 투약 후에 선택적으로 제거되거나 감소된다.

Description

유전적 장애의 치료를 위해 생체내 뉴클레아제-매개의 유전자 표적화를 위한 조성물 및 방법
부위 특이적 뉴클레아제(예컨대, CRISPR-Cas9 또는 메가뉴클레아제)는 염색체에서 이중 가닥 절단(DSB)을 생성하여 DNA 복구를 유도한다. 공여자 DNA의 존재 하에 상동성 지정 복구(HDR)가 일어나고 염색체의 유전자 정보를 공여자 유전자의 새로운 정보로 대체한다.
상동성 지정 복구(HDR)는 DNA 주형을 사용하여 상동성 재조합을 통해 DNA 이중 가닥 절단(DSB)이 복구되는 과정이다. 이 주형은 유사분열이 완료되기 전에 자매 염색분체가 사용 가능한 경우, 세포 주기의 후기 S기 또는 G2기 동안 세포 내에서 생길 수 있다. 추가적으로, 외인성 복구 주형은 게놈에 정확한 변화를 생성하기 위해 가장 흔히 합성 단일 가닥 DNA 공여자 올리고 또는 공여자 플라스미드의 형태로 세포 내로 전달될 수 있다.
안전 항구 부위(SHS)는 유전자 또는 기타 유전자 요소가 안전하게 삽입되고 발현될 수 있는 게놈 유전자좌이다. 이러한 SHS는 효과적인 인간 질환 유전자 치료법; 유전자 구조, 기능 및 조절의 조사; 및 세포 표식 및 추적에 중요하다.
필요한 것은 유전자 편집을 위한 개선된 조성물 및 방법이다.
본원에는 천연 PCSK9 유전자의 녹다운 또는 절제 및 PCSK9 유전자좌에 외인성 이식유전자의 삽입 및/또는 발현을 허용하는 유전자 편집을 위한 조성물, 방법, 시스템 및 키트가 제공된다.
제1 측면에서, 본원에는 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 PCSK9 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 편집 구성요소를 포함한다. 시스템은 이식유전자를 암호화하는 핵산 서열 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 이식유전자 카세트를 포함하는 공여자 벡터를 추가로 포함하며, 공여자 벡터는 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하며, 여기서 이식유전자는 PCSK9가 아니다. 뉴클레아제는 PCSK9 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 PCSK9 엑손 7을 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 메가뉴클레아제는 ARCUS 메가뉴클레아제이다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 Cas9를 암호화하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터는 적어도 20개의 뉴클레오타이드 시드(seed) 영역을 포함하는 sgRNA를 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 sgRNA는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다.
다른 실시양태에서, 공여자 벡터는 적어도 20개 뉴클레오타이드 시드 영역을 포함하는 sgRNA를 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 sgRNA는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다.
또 다른 측면에서, 본원에는 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 PCSK9 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소를 포함한다. 시스템은 이식유전자를 암호화하는 핵산 서열 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 이식유전자 카세트를 포함하는 공여자 벡터를 추가로 포함하며, 공여자 벡터는 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하고, 여기서 이식유전자는 PCSK9가 아니다. 뉴클레아제는 PCSK9 유전자를 표적으로 한다. 특정 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 지질 나노입자에 제공된다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 Cas9를 암호화하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터는 적어도 20개의 뉴클레오타이드 시드 영역을 포함하는 sgRNA를 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 sgRNA는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다.
다른 실시양태에서, 공여자 벡터 추가 구성요소는 적어도 20개의 뉴클레오타이드 시드 영역을 포함하는 sgRNA를 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 sgRNA는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다.
특정 실시양태에서, 이식유전자는 간 대사 장애에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이식유전자는 OTC, PKU, CTLN1 또는 LDLR이다.
특정 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이고, 벡터는 AAV 5' ITR 및 AAV 3' ITR을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 메가뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에서 PCSK9를 표적으로 하는 메가뉴클레아제를 암호화하는 서열, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV; 및 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함하고, 여기서 이식유전자는 PCSK9를 암호화하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 saCas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV; 및 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, U6 프로모터, PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서 상기 표적 부위가 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함하고, 여기서 이식유전자는 PCSK9를 암호화하지 않는다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, U6 프로모터, PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서 상기 표적 부위가 상기 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 Cas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 AAV 벡터 및 공여자 AAV 벡터는 동일한 AAV 캡시드를 갖는다. 다른 실시양태에서, 유전자 편집 AAV 벡터 및 공여자 AAV 벡터는 상이한 AAV 캡시드를 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV8, AAV9, rh10, AAV6.2, AAV3B, hu37, rh79, 및 rh64로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 이중 벡터 시스템을 공동투여하여 인간의 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 대상체의 간 대사 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 간 대사 장애를 가진 대상체에게 뉴클레아제를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 공여자 AAV 벡터로서, 이 공여자 벡터가 전이유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하고, 여기서 이식유전자는 PCSK9가 아닌 공여자 AAV 벡터를 공동투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 간 대사 장애는 오르니틴 트랜스카르바밀라제이다. 다른 실시양태에서, 가족성 고콜레스테롤혈증 또는 페닐케톤뇨증이다. 한 실시양태에서, 대상체는 신생아이다.
또 다른 측면에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 PCSK9 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 서열을 포함하는 지질 나노입자(LNP); 및 이식유전자 및 표적 세포에서 이의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 공여자 AAV 벡터로서, 이 공여자 벡터는 추가로 이식유전자에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 포함하고, 여기서 이식유전자는 PCSK9가 아닌, 공여자 AAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 PCSK9 엑손 7을 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 메가뉴클레아제는 ARCUS 메가뉴클레아제이다.
다른 실시양태에서, 유전자 편집 벡터는 Cas9를 암호화한다. 특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 추가로 암호화하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다. 일부 실시양태에서, 시스템이 LNP를 포함하는 경우, LNP는 Cas9 암호 서열 및 gRNA 둘 모두를 포함한다.
다른 실시양태에서, 공여자 벡터는 적어도 20개의 뉴클레오타이드 시드 영역을 포함하는 sgRNA를 추가로 암호화하고, 여기서 sgRNA는 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다.
추가의 또 다른 측면에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템이 제공된다. 시스템은 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 편집 벡터; 및 PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위해 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않는 공여자 벡터를 포함하고, 여기서 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함하고; 표적 세포의 천연 PCSK9는 이중 벡터 시스템을 이용한 투약 후, 선택적으로 제거되거나 감소된다.
추가의 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 시스템을 사용하여 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 여기서 환자의 천연 PCSK9 발현 수준은 감소되고 환자는 외인성 생성물을 발현한다.
추가의 또 다른 측면에서, 오르니틴 트랜스카르바말라제에 대한 조작된 암호 서열이 제공된다. 이를 포함하는 벡터, 발현 카세트, 및 재조합 바이러스도 포함된다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 다음과 같은 본 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 엑손 7 내의 공여자 스플라이스 부위, 및 관심 공여자 주형, 예를 들어 hFIX, hOTC를 포함하는 HDR 공여자 벡터를 보여주는 rhPCSK9 유전자좌의 개략도를 보여준다.
도 2는 신생아 NHP에서 ARCUS2 또는 SaCas9에 의한 PCSK9 유전자좌의 hFIX 미니 유전자 녹-인(knock-in)을 포함하는 파일럿 연구의 타임라인을 보여준다.
도 3a 내지 3c는 SaCas9- 또는 ARCUS-매개 유전자 교정을 위한 이중 AAV 벡터 시스템에 대한 도식적 표현을 보여준다. 도 3a는 ARCUS2-매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 AAVhu37-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열을 포함한다. 도 3b는 SaCas9 매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템(트랜스; AAVhu37-SaCas9)에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 SaCas9 및 sgRNA에 대한 발현 카세트는 2개의 별도의 벡터에 있고 AAVhu37.sgRNA-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열 및 U6.sgRNA 카세트를 포함한다. 도 3c는 SaCas9 매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템(시스; AAVhu37.PCSK9-sgRNA.SaCas9)에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 SaCas9 및 sgRNA에 대한 발현 카세트는 동일한 벡터에 있고 hOTC 공여자 벡터는 별도의 벡터에 있다.
도 4a 내지 4h는 신생아 NHP에서 뉴클레아제-매개 유전자 표적화의 생체내 테스트를 보여준다. 도 4a, 4b 및 5g에 도시된 바와 같이, 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.ARCUS2.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR 또는 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.SaCas9.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR.U6.sgR, 또는 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.GFP.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR.U6.sgR을 동물에게 투여했다. 도 4c는 신생아 NHP에서 표시된 시점의 hFIX 수준(ng/mL로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 4d는 신생아 NHP에서 표시된 시점의 PCSK9 수준(0일째 기준선의 백분율로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 4e는 신생아 NHP에서 표시된 시점의 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제) 수준(U/L로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 4f는 신생아 NHP에서 표시된 시점의 항-FIX IgG 수준(희석 인자인 1/희석으로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 4g는 신생아 NHP에서 표시된 시점의 PCSK9 수준(ng/mL로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 4h는 신생아 NHP에서 측정된 중량(g으로서 플로팅됨)을 보여준다.
도 5a 내지 5h는 3개월된 영아 NHP에게 투여된, 도 4에 기술된 생체내 테스트의 결과를 보여준다. 도 5a는 영아 NHP에서 표시된 시점의 hFIX 수준(ng/mL로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5b는 영아 NHP에서 표시된 시점의 PCSK9 수준(0일째 기준선의 백분율로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5c는 영아 NHP에서 표시된 시점의 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제) 수준(U/L로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5d는 영아 NHP에서 표시된 시점의 항-FIX IgG 수준(희석 인자인 1/희석으로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5e는 영아 NHP에서 표시된 시점의 PCSK9 수준(ng/mL로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5f는 영아 NHP에서 표시된 시점에서 측정된 중량(g으로서 플로팅됨)을 보여준다. 도 5g는 도 4a-5g에 기술된 실험의 데이터를 보여주는 요약표이다. 도 5h는 테스트된 신생아 NHP와 영아 NHP 사이의 다양한 데이터 비교를 보여준다.
도 6a 내지 6g는 도 4a-4h에 기술된 바와 같이 처리된 NHP에서 치료 후 다양한 일자에 수집된 간 생검 샘플 중 벡터 형질도입(GC) 및 이식유전자 발현을 보여준다. 도 6a는 이배체 세포당 AAV 게놈 카피(GC)로서 플로팅된 간 생검 샘플 중 벡터 형질도입 수준을 보여준다. 도 6b는 간 생검 샘플에서 이식유전자 RNA의 상대적 발현을 보여준다. 도 6c는 간 생검에서 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용하는 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여준다. 도 6d는 형질도입 백분율의 정량화에 사용된 디지털화된 ISH 이미지를 보여준다. 도 6e는 ISH에 의해 정량화되고, 형질도입 백분율로 플로팅된 FIX 이식유전자의 형질도입 효율을 보여준다.
도 7a 내지 7l은 NHP에서 치료 후 84일째 수집된 간 생검에서의 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용하는 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여주며; 다양한 배율의 뷰로 보여주었다(AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX로 처리된 NHP). 도 7a는 4x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 ARCUS를 보여준다. 도 7b는 4x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7c는 4x 배율로 관찰된 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7d는 4x 배율로 관찰된, DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서의 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다. 도 7e는 10x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 ARCUS를 보여준다. 도 7f는 10x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7g는 10x 배율로 관찰된 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7h는 10x 배율로 관찰된 DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서의 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다. 도 7i는 20x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 ARCUS 발현을 보여준다. 도 7j는 20x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7k는 20x 배율로 관찰된 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7l은 20x 배율로 관찰된 DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다.
도 8a 내지 8m은 NHP에서 치료 후 84일째 수집된 간 생검에서의 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용하는 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여주며; 다양한 배율의 뷰로 보여주었다(AAVhu37.EGFP 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX.U6.sgR로 처리된 NHP). 도 8a는 4x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 GFP-WRPE를 보여준다. 도 8b는 4x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8c는 4x 배율로 관찰된 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8d는 4x 배율로 관찰된, DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서의 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8e는 10x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 GFP-WRPE를 보여준다. 도 8f는 10x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8g는 10x 배율로 관찰된 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8h는 10x 배율로 관찰된 DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서의 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8i는 20x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 GFP-WRPE 발현을 보여준다. 도 8j는 20x 배율로 관찰된 간 생검에서의 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8k는 20x 배율로 관찰된 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8l은 20x 배율로 관찰된 DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8m은 미처리된 대조군으로서 20x 배율로 관찰된, DAPI(핵 염색용)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다.
도 9는 AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX로 처리된 NHP에서의 ARCUS 매개의 표적상(on-target)의 편집을 보여준다. 치료 후 84일째, 간 생검 샘플을 수집하고, 존재하는 표적 영역 중 총 삽입-결실(indel)의 백분율을 앰플리콘-seq에 기초하여 계산했다.
도 10a 및 10b는 PCSK9-hE7-KI 마우스 모델의 도식적 표현을 보여준다. 도 10a는 인간 pcsk9 엑손 7(hE7은 ARCUS 표적화 서열을 함유함)로 대체되는 마우스 pcsk9 엑손 7의 도식적 표현을 보여준다. 인간 PCSK9 엑손 7 서열은 서열번호 44에 제시되어 있다. 도 10b는 PCSK9-hE7-KI 마우스 모델을 OTC spf ash, KI-spf ash 모델과 같은 다른 질환 마우스 모델과 교배시키는 도식적 표현을 보여준다. PCSK9-hE7-KI 녹-인 마우스 모델은 먼저 뮤린 Pcsk9 유전자의 엑손 7을 포함하는 영역을 엑손 7을 함유하는 인간 PCSK9 유전자 영역으로 대체하여 발생시켰다. 그런 다음 PCSK9-hE7-KI 마우스는 털이 성긴 ash(spfash) 마우스와 교배했고, 이는 Otc 유전자의 엑손 4 끝에 있는 스플라이스 공여자 부위의 G에서 A로의 점 돌연변이로 인해 OTC 발현이 20배 감소함을 나타낸다. 이 교배로부터의 마우스는 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스로 명명되고, 본원에 기술된 바와 같이 활용했다. 약어: bp, 염기쌍; E6, 엑손 6; E7: 엑손 7; E8, 엑손 8; HDR, 상동성 의존적 재조합; PCSK9, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(유전자, 인간); Pcsk9, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(유전자, 마우스).
도 11a-11i는 도 11i에 도시된 바와 같은 벡터에 대한 신생아 NHP에서의 뉴클레아제-매개 유전자 표적화의 생체내 테스트를 보여준다. 도 11a는 실시예 3에 기재된 바와 같은 벡터에 대한 신생아 NHP에서의 뉴클레아제-매개 유전자 표적화에 대한 생체내 테스트의 실험 설계를 보여주는 차트이다. 동물 21-111, 21-122, 및 21-113은 투약 전에 AAV 결합 항체(BAb) 양성이었다. 21-178의 0일째 샘플은 Bab 검정을 방해할 벡터 투약 후에 수집했다. c: 독립적인 ITRseq 검정에서 식별된 OT 부위의 수가 나열된다. 도 11b는 도 11a에 도시된 그룹에 대한 ng/mL(상단 행) 또는 0일째의 %(하단 행)로 표시된 PCSK9 수준을 보여준다. 도 11c는 도 11a에 도시된 그룹에 대한 U/L로 표시된 ALT 수준(상단 행) 또는 U/L로 표시된 AST(하단 행)를 보여준다. 도 11d는 ISH 또는 IF에 의해 정량화되고, 형질도입된 간세포 백분율로 플로팅된 OTC 이식유전자의 형질도입 효율을 보여준다. 도 11e는 마우스의 체중을 보여준다. 도 11f는 84일째 정량적 PCR 분석에 의한 간의 벡터 GC를 보여준다. 도 11g는 간 생검 샘플로부터 단리된 전체 RNA에 대한 정량적 PCR에 이어 역전사에 의해 측정되고 GAPDH 수준에 의해 정규화된 상대적 발현 수준으로 제시된 84일째 마카크 간에서의 hOTC 및 뉴클레아제의 발현을 보여준다. 도 11h는 앰플리콘-seq에 의해 수행된 rhPCSK9 표적화 유전자좌에 대한 Indel 분석을 보여준다. 도 11i는 실시예 3에 기술된 실험에 대해 테스트된 벡터를 포함하는 신생아 NHP에서 뉴클레아제-매개 유전자 표적화의 생체내 테스트에 대한 타임라인의 개략도이다.
도 12는 pcsk9-hE7 녹-인 대립유전자의 인간 PCSK9 서열, 마우스 PCSK9(mPCSK9) 및 리서스 마카크 PCSK9(rhPCSK9)를 나타내는 265bp 서열의 서열 정렬을 보여준다. 약어: GAPDH, 글리세르알데하이드-3-인산염 탈수소효소; GC, 게놈 카피; hOTC, 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제; OT, 표적외(off-targe); PCR, 중합효소연쇄반응; rhPCSK9, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(리서스 유전자); RNA, 리보핵산.
도 13은 ARCUS2-매개 유전자 교정을 위한 이중 AAV 벡터 시스템에 대한 공여자 작제물의 개략도를 보여주며, 여기서 AAV-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열을 포함한다. 녹-인 마우스 모델(도 10a-10b), NHP 및 인간 표적 영역과 작제물 내 HDR 아암의 상동성을 보여준다.
도 14a는 실시예 5에 기술된 바와 같이 PCSK9-hE7-KI.spf-ash 새끼(부분 OTC 결핍 모델)에서 수행된 ARCUS2에 의한 PCSK9 유전자좌 내 hOTC 미니-유전자 녹-인을 포함하는 연구에 대한 타임라인을 보여준다. 도 14b는 도 14a의 연구에서 각 그룹이 투여받을 벡터 및 투여량을 보여준다.
도 14c-14i는 도 7에 도시된 벡터로 처리되거나, 또는 처리되지 않고(KI WT) 10일 동안 고단백질(HP) 식이를 먹인 마우스에 대한 연구 결과를 보여준다. 도 14c는 생존 확률을 보여준다. 도 14d는 HP 식이의 도입 전 체중의 백분율로서의 체중을 보여준다. 도 14e는 HP 식이 10일째 혈장 NH3 수준을 보여준다. 도 14f는 48일째 mPCSK9 단백질 수준을 보여준다. 도 14g는 59일째 앰플리콘-seq로 측정된 indel%를 보여준다. 도 14h는 59일째 측정된, 이배체 세포당 AAV 게놈 카피(GC)로서 플로팅된 간 생검 샘플에서의 벡터 형질도입 수준을 보여준다. 도 14i는 8주째 OTC IF를 보여준다.
도 15는 PCSK9-hE7-KI.ldlr-/ldlr-.apobec-/apobec-Pups(hoFH 모델)에서 SaCas9에 의해 PCSK9 유전자좌 내 hLDLR 미니 유전자 녹-인을 생성하기 위한 실시예 10에 기술된 실험 설계의 개략도이다.
도 16은 실시예 10에서 사용된 벡터를 보여주는 개략도이다.
도 17은 실시예 10의 실험 설계를 보여준다.
도 18a-18d는 실시예 10의 실험 결과를 보여준다. 도 18a는 shHDR + saCas9, mhHDR + saCas9, shHDR 단독 및 미처리된 마우스에 대한 혈청 LDL 수준을 보여준다. 도 18b는 shHDR + saCas9, mhHDR + saCas9, shHDR 단독 처리된 마우스에 대한 indel 백분율을 보여준다. 도 18c는 63일째 간에서 측정된 이배체 게놈당 hLDLR 게놈 카피를 보여준다. 도 18d는 shHDR + saCas9, mhHDR + saCas9, shHDR 단독 및 미처리된 마우스에 대한 63일째 혈청 LDL 수준을 보여준다.
도 19는 실시예 10의 마우스에 대해 63일째에 채취한 간 샘플에 대한 면역조직화학 데이터를 보여준다.
본원에는 간 대사 장애를 비롯한 특정 유전적 장애가 있는 환자에게 안정하고 장기적인 치료 효과를 제공하는 조성물, 키트 및 방법이 제공된다. 조성물, 키트 및 방법은 표적 세포의 PCSK9 유전자좌를 표적으로 하는 뉴클레아제를 활용하고, 공여자 벡터는 PCSK9 유전자좌 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 포함하는 주형을 제공하며, 여기서 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않고, 내인성 PCSK9의 발현은 중단되고 발현 수준은 감소된다.
PCSK9
전구단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 9(PCSK9)는 간 및 간외 저밀도 지단백질(LDL) 수용체(LDLR; 606945) 수준을 모두 감소시키고 혈장 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 세린 프로테아제이다. PCSK9는 혈장 콜레스테롤 항상성의 조절에 중요하다. PCSK9는 저밀도 지질 수용체 계열 구성원인 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR), 아포지단백질 E 수용체(LRP1/APOER) 및 아포지단백질 수용체 2(LRP8/APOER2)에 결합하고, 세포내 산성 구획에서 이들의 분해를 촉진한다. 인간 PCSK9는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 NP_777596.2의 단백질 서열을 가지며, 암호 서열은 서열번호 22에 제시되어 있다.
PCSK9 유전자는 콜레스테롤 관련 질환의 치료를 위해 표적화되었지만, PSCK9 유전자좌가 다른 비-PCSK9 이식유전자의 삽입을 위한 유전자 표적화에 대한 안전 항구임은 본원에서 입증되었다. 따라서, 본원에 제공된 조성물, 키트 및 방법은 PCSK9 유전자좌를 표적으로 하는 뉴클레아제를 활용하고, 공여자 주형을 사용하여 치료용 이식유전자를 표적 PCSK9 유전자좌에 삽입한다.
본원에 제공된 조성물, 키트 및 방법은 유전자 편집 구성요소(일부 실시양태에서는 벡터), 및 숙주 세포에서 발현될 치료용 이식유전자를 제공하는 공여자 벡터를 포함한다.
유전자 편집 구성요소
본원에 제공된 조성물, 키트 및 방법은 뉴클레아제(또는 이에 따른 암호 서열) 및 뉴클레아제가 염색체 1의 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소를 포함한다. 본원에 사용된, "표적 PCSK9 유전자좌" 또는 "PCSK9 유전자좌"는 이종 이식유전자의 삽입이 요구되는 PCSK9 암호 영역의 임의의 부위이다. 특정 실시양태에서, 표적 PCSK9 유전자좌는 PCSK9 암호 서열의 엑손 7에 있다. 도 12는 SaCas9 및 PCSK9에 표적화된 메가뉴클레아제(ARCUS로 지칭됨)를 사용하여 본원에 예시된 인간(h), 리서스(rh) 및 마우스(m) PCSK9 엑손 7 스플라이스 부위의 정렬을 제공한다.
본원에는 이식유전자의 삽입을 위해 유전자를 표적화하는 데 유용한 조성물, 특히 뉴클레아제, 예를 들어 PCSK9에 특이적인 뉴클레아제가 기술된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 자연 발생인 것이다. 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 비-자연 발생, 즉 DNA 결합 도메인 및/또는 절단 도메인에 조작된 것이다. 예를 들어, 자연 발생 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 선택된 표적 부위(예를 들어, 동족 결합 부위와 다른 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제)에 결합하도록 변경될 수 있다. 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 이종 DNA 결합 및 절단 도메인(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제; TAL-이펙터 뉴클레아제; 이종 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 PCSK9를 표적으로 하는 메가뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제는 큰 인식 부위(12 내지 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제, 예를 들어, I-SceI이다. 뉴클레아제와 조합될 때, DNA는 특정 위치에서 절단될 수 있다. 제한 효소는 유전자 편집에 사용하거나 동일계에서 게놈 편집을 위해 세포에 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG(서열번호 31) 계열의 구성원이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 22개 염기쌍 인식 서열, 서열번호 32 - CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG를 인식하고 절단하는 귀소 엔도뉴클레아제의 I-CreI 계열의 구성원이다. 예를 들어, WO 2009/059195를 참조한다. 포유류, 효모, 식물, 박테리아, 및 바이러스 게놈의 부위를 포함하여 광범위하게 분기되는 DNA 부위를 표적으로 하기 위해 I-CreI 및 기타 귀소 엔도뉴클레아제를 포괄적으로 재설계할 수 있는 단일-LAGLIDADG(서열번호 32) 귀소 엔도뉴클레아제를 합리적으로 설계하는 방법은 설명되었다(WO 2007/047859). 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 서열번호 19에 나타낸 서열, nt 330 내지 1424, 또는 이에 대해 적어도 95%, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 서열에 의해 암호화된다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질 서열은 서열번호 20에 제시된 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 서열이다. 이러한 뉴클레아제는 때로 본원에서 ARCUS 뉴클레아제라고 지칭된다. "귀소 엔도뉴클레아제"라는 용어는 용어 "메가뉴클레아제"와 동의어이다. 특정 PCSK9 메가뉴클레아제를 기술하는 WO 2018/195449를 참조하고, 이 문헌은 전체가 본원에 포함된다.
아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시켜 생성된 인공 제한 효소이다. 아연 핑거 도메인은 특정의 원하는 DNA 서열을 표적으로 하도록 조작될 수 있고, 이를 통해 아연 핑거 뉴클레아제는 복잡한 게놈 내의 고유한 서열을 표적으로 삼을 수 있다. 내인성 DNA 복구 기구를 이용함으로써 이들 시약은 고등 유기체의 게놈을 정확하게 변경하고 게놈 편집 분야에서 탁월한 도구 역할을 하는데 사용될 수 있다. 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. 이들은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합시켜 제조된다. 다른 실시양태에서, 암호 서열은 아연 핑거 뉴클레아제 또는 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 암호화한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR-연관 뉴클레아제(Cas), 선택적으로 Cas9이다. "Cas9"(CRISPR 연관 단백질 9)는 2개의 시그니처 뉴클레아제 도메인인 RuvC(비암호 가닥을 절단함) 및 HNH(암호 가닥)를 특징으로 하는 RNA-유도 DNA 엔도뉴클레아제 계열을 지칭한다. Cas9의 적합한 박테리아 공급원으로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (SaCas9), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (SpCas9) 및 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitides)를 포함한다[KM Estelt 등, Nat Meth, 10: 1116-1121 (2013)]. 야생형 암호 서열은 본원에 기술된 작제물에 활용될 수 있다. 대안적으로, 박테리아 코돈은 예를 들어 임의의 다양한 공지된 인간 코돈 최적화 알고리즘을 사용하여 인간에서의 발현에 대해 최적화된다. 대안적으로, 이들 서열은 전체 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 유사한 특성을 갖는 다른 엔도뉴클레아제는 선택적으로 치환될 수 있다. 예를 들어 http://crispr.u-psud.fr/crispr에서 엑세스 가능한 공공 CRISPR 데이터베이스(db)를 참조한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제 암호 서열의 조성물, 키트 및 방법은 유전자 편집 벡터에 포함된다. 유전자 편집 벡터는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본원에 사용된 "벡터"는 상기 핵산 서열의 복제 또는 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 생물학적 또는 화학적 모이어티이다. 일반적인 벡터에는 비바이러스 벡터와 바이러스 벡터가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 비바이러스 시스템은 나노입자, 전기천공 시스템 및 신규 생체재료, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포존, 플라스미드, 코스미드(Phillip McClean, www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/-plsc731/cloning)/cloning4.htm) 및 인공 염색체(Gong, Shiaoching, 등 "A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes" Nature 425.6961 (2003): 917-925)로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 "발현 카세트"는 생물학적으로 유용한 핵산 서열(예를 들어, 단백질, 효소 또는 다른 유용한 유전자 생성물, mRNA 등을 암호화하는 유전자 cDNA) 및 핵산 서열 및 이의 유전자 생성물의 전사, 해독 및/또는 발현을 지시하거나 조절하는, 이에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 서열은 핵산 서열과 인접한 조절 서열 및 서열을 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 조절 서열 둘 모두를 포함한다. 이러한 조절 서열은 전형적으로 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열 및 TATA 신호 중 하나 이상을 포함한다. 발현 카세트는 유전자 서열의 상류(5')에 있는 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론 등 중 하나 이상, 및 인핸서, 또는 유전자 서열의 하류(3')에 있는 조절 서열, 예를 들어, 무엇보다도 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비해독 영역 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 용어 "이식유전자"는 표적 세포에 삽입되는 외인성 공급원으로부터의 하나 이상의 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이러한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 신호가 측면에 있는 본원에 기술된 유전자 생성물에 대한 암호 서열 및 본원에 기술된 것과 같은 다른 발현 제어 서열을 함유한다. 특정 실시양태에서, 벡터 게놈은 2개 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있다.
뉴클레아제에 대한 암호 서열 외에도, 특정 실시양태에서 유전자 편집 벡터는 숙주 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조절 요소는 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스템이 간세포에서의 돌연변이 또는 표현형을 특징으로 하는 대사 장애의 치료를 위해 설계되는 경우, 유전자 편집 벡터는 뉴클레아제가 간 특이적 프로모터의 제어 하에 발현되도록 설계될 수 있다. 본원에 기술된 예시적인 플라스미드 및 벡터는 서열번호 41의 서열을 특징으로 하는 간 특이적 프로모터 티록신 결합 글로불린(TBG)을 사용한다. 다른 실시양태에서, 서열번호 11의 서열을 특징으로 하는 본원에서 TBG-S1로 명명되는 변이체인 TBG의 단축 버전이 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 서열번호 12의 서열을 갖는 하이브리드 간 프로모터(HLP)가 활용된다.
일부 실시양태에서, 전사 활성이 낮은 프로모터 또는 약한 프로모터를 활용하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 프로모터는 간 특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터의 약화된 버전이다. 한 실시양태에서, 약한 프로모터는 TBG-S1 서열 또는 천연 프로모터의 5' 또는 3' 말단에서 절두된다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 TBG-S1 프로모터로부터 3' 말단 113 nt만을 보유하고 F113(TBG-S1-F113이라고도 불림)(서열번호 19, nt 206 내지 318)으로 명명된다. 2020년 4월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/016,145호, 2020년 6월 2일자로 출원된 제63/033,738호, 및 2020년 10월 9일자로 출원된 제63/089,796호, 2021년 4월 27일자로 둘 모두가 출원된 PCT/US21/29386 및 PCT/US21/29403은 각각 COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING NUCLEASE EXPRESSION AND OFF-TARGET ACTIVITY USING A PROMOTER WITH LOW TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY라는 명칭을 갖고, 본원에 전체가 참고로 포함된다.
대안적으로, 알파 1 항트립신(A1AT), 인간 알부민(Miyatake 등, J. Virol., 71:5124 32(1997)) 및 B형 간염 바이러스 코어 프로모터(Sandig 등, Gene Ther., 3:1002 9 (1996), TTR 최소 인핸서/프로모터, 알파-항트립신 프로모터, LSP(845 nt)와 같은 다른 간-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD를 참조한다. 대안적으로, 다른 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 특이적 프로모터, 예컨대 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터 또는 근육 하이브리드(MH) 프로모터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 프로모터, 예컨대 구성적 프로모터(CMV, CBG, CB7 등), 조절 가능한(유도 가능한) 프로모터[예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO 2011/126808 및 WO 2013/049493 참조], 또는 생리학적 단서에 반응성인 프로모터는 본원에 기술된 벡터에 활용될 수 있다. 선택적으로, 조절 가능한 시스템이 선택되면, 조절 기능을 제공하기 위해 제3 벡터가 필요할 수 있다.
프로모터 외에도, 유전자 편집 카세트, 발현 카세트 및/또는 벡터는 하나 이상의 적절한 "조절 요소" 또는 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 인핸서; 전사인자; 전사 종결인자; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(polyA)와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 예를 들어 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE); 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 콘센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 폴리A 서열의 예로는 예를 들어 SV40, 소 성장 호르몬(bGH) 및 TK 폴리A를 포함한다. 적합한 인핸서의 예로는 특히, 예를 들어 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP(TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서)를 포함한다. 이들 제어 서열 또는 조절 서열은 뉴클레아제 암호 서열 또는 이식유전자 암호 서열에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터는 TBG 프로모터, 하나 이상의 알파 mic/bik 인핸서(들), ARCUS 메가뉴클레아제에 대한 암호 서열, 선택적으로 WPRE 및 폴리A를 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 서열번호 42의 nt 211 내지 nt 2964를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 뉴클레아제를 PCSK9 표적 유전자좌 내의 표적 부위로 유도하는 서열을 추가로 포함한다. PCSK9에 특이적인 메가뉴클레아제와 같은 특정 실시양태에서는 뉴클레아제를 표적 부위로 유도하기 위해 추가 서열을 필요로 하지 않는다. 그러나, 예를 들어 Cas9의 경우에는, 표적 서열에 특이적인 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"라고 하는 추가 서열이 제공된다. sgRNA는 Cas9와 동일한 벡터(시스) 또는 다른 벡터(트랜스)에 제공될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, sgRNA는 gRNA 스캐폴드와 조합으로, 특정 DNA 결합(즉, 표적 DNA에 상동성)을 위한 적어도 20개 염기 서열(또는 약 24-28개 염기, 때로는 시드 영역이라고도 함)을 갖는다. sgRNA의 전사는 정확히 5' 말단에서 시작해야 한다. 주형 DNA 가닥을 표적으로 할 때, sgRNA의 염기쌍 형성 영역은 전사된 서열과 동일한 서열 동일성을 갖는다. 비주형 DNA 가닥을 표적화할 때에는, sgRNA의 염기쌍 형성 영역은 전사된 서열의 역보체이다. 선택적으로, 유전자 편집 벡터는 하나보다 많은 sgRNA를 함유할 수 있다. sgRNA는 Cas9(또는 Cpf1) 효소에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다. 전형적으로, sgRNA는 PAM 서열에 대해 "바로" 5'이고, 즉, 스페이서 또는 중재 서열이 없다. 한 실시양태에서, sgRNA "시드(seed)" 암호 서열은 AAGTTGGTCCCCAAAAGTCCC(서열번호 8)이며, 이는 SaCas9가 인간 및 마카크 PCSK9의 엑손 7을 표적화하는데 유용하다. 그러나, 다른 sgRNA는 관련 기술분야의 기술자에 의해 설계될 수 있다.
특정 실시양태에서, sgRNA는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하고 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하며, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'이다. 일부 실시양태에서 시드 영역은 PCSK9 유전자의 표적 부위와 100% 상보성을 공유한다. 다른 실시양태에서, 시드 영역은 표적 부위와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 미스매치를 함유한다.
sgRNA는 RNA 중합효소 프로모터 및/또는 터미네이터의 제어 하에 있다. 특정 실시양태에서, RNA 중합효소 프로모터는 U6 프로모터와 같은 Pol III 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 H1 프로모터이다. 예시적인 U6 프로모터의 서열은 서열번호 10에서 찾을 수 있다. 다른 실시양태에서, sgRNA 및 RNA 중합효소 프로모터는 공여자 벡터에 위치한다.
예를 들어, 뉴클레아제가 Cas9인 다른 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 하나 이상의 핵 국재화 신호(NLS)를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, NLS는 Cas9에 대한 암호 서열의 측면에 위치한다. 특정 실시양태에서, NLS는 서열번호 5의 nt 4241 내지 4288의 서열을 갖는다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Lu 등 Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus, Cell Commun Signal (May 2021) 19:60을 참조한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제 암호 서열은 메신저 RNA(mRNA)로서 제공된다. mRNA는 5' 비해독 영역, 3' 비해독 영역 및/또는 암호 또는 해독 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, Cas9에 대한 암호 서열은 mRNA로서 제공된다.
mRNA는 자연 발생 또는 비자연 발생의 mRNA일 수 있다. mRNA는 하나 이상의 변형된 핵염기, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 mRNA는 예를 들어 생체내 뉴클레아제 분해에 대한 개선된 저항성을 포함하여 핵산에 증가된 또는 향상된 안정성을 부여하는 적어도 하나의 변형을 포함한다. mRNA는 수십, 수백 또는 수천 개의 염기쌍을 포함하여 임의의 수의 염기쌍을 포함할 수 있다. 핵염기, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드의 임의의 수(예를 들어, 전부, 일부 또는 부재)는 표준 종의 유사체, 치환, 변형 또는 달리 비-자연 발생인 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 특정 핵염기 유형 모두가 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 모든 시토신은 5-메틸시토신일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형" 및 "변형된"은 이 용어가 본원에 제공된 핵산에 관한 것일 때, 바람직하게는 안정성을 향상시키고 mRNA의 야생형 또는 자연 발생의 버전보다 mRNA를 더 안정(예를 들어, 뉴클레아제 분해에 대해 저항성)하게 만드는 적어도 하나의 변경을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "안정한" 및 "안정성"은 본 발명의 핵산에 관한, 특히 mRNA와 관련된 것일 때, 예를 들어 정상적으로 이러한 mRNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제(즉, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의한 분해에 대해 증가된 또는 향상된 저항성을 지칭한다. 증가된 안정성은 예를 들어, 표적 세포 또는 조직 내의 내인성 효소(예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제) 또는 조건에 의한 가수분해 또는 기타 파괴에 대한 적은 민감성을 포함하여 표적 세포, 조직, 대상체 및/또는 세포질에서 이러한 mRNA의 체류를 증가시키거나 향상시킬 수 있다. 본원에 제공되는 안정화된 mRNA 분자는 이들의 자연 발생하는 미변형 대응물(예를 들어, mRNA의 야생형 버전)에 비해 더 긴 반감기를 입증한다. 또한, 용어 "변형" 및 "변형된"은 이 용어들이 본 발명의 mRNA와 관련된 경우, 예를 들어 단백질 해독의 개시에 기능하는 서열(예를 들어, Kozak 콘센서스 서열)의 포함을 비롯한, mRNA 핵산의 해독을 개선하거나 향상시키는 변경도 고려한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 mRNA는 이를 더욱 안정하게 만들기 위해 화학적 또는 생물학적 변형을 겪었다. mRNA에 대한 예시적인 변형으로는 염기의 고갈(예를 들어, 결실에 의해 또는 하나의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 치환하여) 또는 염기의 변형, 예를 들어 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본원에 사용된 문구 "화학적 변형"은 자연 발생 mRNA에서 관찰되는 것과 다른 화학을 도입시키는 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오타이드의 도입과 같은 공유 변형(예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체 또는 이러한 mRNA 분자에서 자연적으로 발견되지 않는 펜던트 기의 포함)을 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열 내의 C 및/또는 U 잔기의 수는 감소된다. 또 다른 실시양태에서, C 및/또는 U 잔기의 수는 특정 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈을 동일하거나 관련된 아미노산을 암호화하는 또 다른 코돈으로 치환함으로써 감소된다. 본 발명의 mRNA 핵산에 대해 고려되는 변형은 슈도우리딘 슈도우리딘(ψ) 또는 5-메틸시토신(m5C)의 혼입도 포함한다. 본 발명의 mRNA에 대한 치환 및 변형은 관련 기술분야의 기술자 또는 숙련자에게 쉽게 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, mRNA는 5' 캡 구조, 사슬 종결 뉴클레오타이드, 줄기 루프 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 캡 구조 또는 캡 종은 링커에 의해 연결된 2개의 뉴클레오시드 모이어티를 포함하는 화합물이며, 자연 발생 캡, 비자연 발생 캡 또는 캡 유사체, 또는 안티-리버스 캡 유사체로부터 선택될 수 있다. mRNA는 대신에 또는 추가적으로 사슬 종결 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, mRNA는 히스톤 줄기 루프와 같은 줄기 루프를 포함한다. 줄기 루프는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 뉴클레오타이드 염기쌍을 포함할 수 있다. 줄기 루프는 mRNA의 임의의 영역에 위치할 수 있다. 예를 들어, 줄기 루프는 비해독 영역(5' 비해독 영역 또는 3' 비해독 영역), 암호 영역, 또는 폴리A 서열 또는 꼬리 내, 그 앞에 또는 뒤에 위치할 수 있다.
특정 실시양태에서, mRNA는 폴리A 서열을 포함한다. 폴리A 서열은 전체적으로 또는 대부분 아데닌 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체 또는 유도체로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리A 서열은 mRNA의 3' 비해독 영역에 인접하게 위치한 꼬리이다.
mRNA는 임의의 자연 발생 또는 비자연 발생 또는 달리 변형된 폴리펩티드를 포함하는 임의의 관심 폴리펩티드, 예를 들어 뉴클레아제를 암호화할 수 있다. mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드는 임의의 크기일 수 있으며 임의의 2차 구조 또는 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드는 세포에서 발현될 때 치료 효과를 가질 수 있다.
공여자 벡터
조성물, 키트 및 방법은 치료적 이식유전자에 대한 암호 서열을 제공하는 공여자 벡터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 공여자 벡터는 이식유전자을 암호화하는 핵산 서열, 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 함유한다. 특정 실시양태에서, 이식유전자는 간 대사 장애 또는 기타 유전적 장애에서 비정상적으로 발현되는 단백질을 암호화한다. 이식유전자는 PCSK9 이외의 다른 단백질을 암호화한다. 이러한 단백질로는 OTC, 저밀도 지단백질 수용체(LDLr), 인자 IX, 예컨대 서열번호 55 또는 56에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 및 인자 VIII, 예컨대 서열번호 53 또는 54에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
공여자 벡터를 통해 전달될 수 있는 추가의 예시적인 유전자로는 글리코겐 축적 질환 또는 1A형 결핍증(GSD1)과 연관된 글루코스-6-포스파타제, PEPCK 결핍증과 연관된 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제(PEPCK); 발작 및 중증 신경발달 장애와 연관된 세린/트레오닌 키나제 9(STK9)로도 알려진 사이클린 의존성 키나제 유사 5(CDKL5); 갈락토스혈증과 연관된 갈락토스-1 포스페이트 우리딜 전이효소, 예컨대 서열번호 63 또는 64에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 페닐케톤뇨증(PKU)과 연관된 페닐알라닌 수산화효소(PAH); 하이드록시산 산화효소 1(GO/HAO1)을 포함하는 원발성 고옥살산뇨증 1형과 연관된 유전자 생성물, 예컨대 서열번호 49 또는 50에 제시된 서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열 및 AGXT, 예컨대 서열번호 47 또는 48에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 단풍당뇨증과 연관된 BCKDH, BCKDH-E2, BAKDH-E1a 및 BAKDH-E1b를 포함하는 분지쇄 알파-케토산 탈수소효소; 티로신혈증 1형과 연관된 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소; 메틸말론산혈증과 연관된 메틸말로닐-CoA 뮤타제; 중쇄 아세틸 CoA 결핍증과 연관된 중쇄 아실 CoA 탈수소효소; 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증과 연관된 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC); 시트룰린혈증과 연관된 아르기니노숙신산 합성효소(ASS1), 예컨대 서열번호 69 또는 70에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 결핍증; 무메틸말론산혈증(MMA); 니만-픽병 C1형과 연관된 NPC1; 프로피온산혈증(PA); 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)과 연관된 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 단백질, 예컨대 서열번호 73 또는 74에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 예컨대 WO 2015/164778에 기술된 것과 같은 LDLR 변이체, 또는 서열번호에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열을 갖는 것; 치매와 연관된 ApoE 및 ApoC 단백질; 지단백질 리파제(LPL)(지단백질 리파제 결핍증), 예컨대 서열번호 67 또는 68에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 크리글러-나자르병과 연관된 UDP-글루코우로노실전이효소; 중증 복합성 면역결핍 질환과 연관된 아데노신 탈아미노효소; 통풍 및 레쉬-니한 증후군과 연관된 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전이효소; 비오티미다제 결핍증과 연관된 비오티미다제; 파브리병과 연관된 알파-갈락토시다제 A(a-Gal A), 예컨대 서열번호 75 또는 76에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; GM1 강글리오시드증과 연관된 베타-갈락토시다제(GLB1); 윌슨병과 연관된 ATP7B; 고셔병 2형 및 3형과 연관된 베타-글루코세레브로시다아제, 예컨대 서열번호 51 또는 52에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 젤위거 증후군과 연관된 퍼옥시좀 막 단백질 70 kDa; 이염성 백질이영양증과 연관된 아릴설파타제 A(ARSA), 크라베병과 연관된 갈락토세레브로시다아제(GALC) 효소, 폼페병과 연관된 알파-글루코시다제(GAA), 예컨대 서열번호 79 또는 80에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 니만픽병 A형과 연관된 스핑고미엘리나제(SMPD1) 유전자; 카르노시나제(CN1); 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT); 에리스로포이에틴(EPO); 카르바밀 인산염 합성효소(CPS1), N-아세틸글루타메이트 합성효소(NAGS); 아르기니노숙신산 분해효소(ASL)(아르기니노 숙신산뇨증), 예컨대 서열번호 57 또는 58에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 및 아르기나제(AG); 성인 발병 제2형 시트룰린혈증(CTLN2)과 연관된 아르기니노숙신산 신타제(WO 2018/144709, 이는 참고로 본원에 포함됨); 요소 회로 장애와 연관된 카르바모일-포스페이트 신타제 1(CPS1); 척수성 근위축과 연관된 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질; 파아버 지방육아종증과 연관된 세라미다제; GM2 강글리오시드증 및 Tay-Sachs 및 Sandhoff 질병과 연관된 b-헥소사미니다제; 아스파르틸-글루코사민뇨증과 연관된 아스파르틸글루코사미니다제; 푸코시드증과 연관된 α-푸코시다제; 알파-만노시드증과 연관된 α-만노시다제; 급성 간헐성 포르피린증(AIP)과 연관된 포르포빌리노겐 탈아미노효소; 알파-1 항트립신 결핍증(폐기종) 치료를 위한 알파-1 항트립신, 예컨대 서열번호 77 또는 78에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열; 지중해빈혈 또는 신부전으로 인한 빈혈 치료를 위한 에리스로포이에틴; 허혈성 질환 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자, 안지오포이에틴-1 및 섬유아세포 성장 인자; 죽상동맥경화증, 혈전증 또는 색전증 등에서 볼 수 있는 폐색된 혈관의 치료를 위한 트롬보모듈린 및 조직 인자 경로 저해제; 파킨슨병 치료를 위한 방향족 아미노산 탈탄산효소(AADC) 및 티로신 수산화효소(TH); 울혈성 심부전의 치료를 위한 포스포람반, 사르코(내)형질 세망 아데노신 트리포스파타제-2(SERCA2) 및 심장 아데닐릴 시클라제에 대해 안티센스인 베타 아드레날린 수용체, 또는 이의 돌연변이 형태; 다양한 암 치료를 위한 p53과 같은 종양 억제 유전자; 염증성 및 면역 장애 및 암 치료를 위한 다양한 인터루킨 중 하나와 같은 사이토카인; 근이영양증의 치료를 위한 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 및 유트로핀 또는 미니유트로핀; 및 당뇨병 치료를 위한 인슐린 또는 GLP-1을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
전달에 적합한 이식유전자의 예로는, 예를 들어 가족성 고콜레스테롤혈증과 연관된 것(예를 들어, VLDLr, LDLr, ApoE, 예를 들어 WO 2020/132155, WO 2018/152485, WO 2017/100682 참조, 이들은 본원에 참고로 포함됨), 근이영양증, 낭포성 섬유증, 및 희귀 또는 고아 질환을 포함한다. 이러한 희귀 질환의 예로는 특히 척수성 근위축증(SMA), 헌팅던병, 레트 증후군(예를 들어, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2); UniProtKB - P51608), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 뒤시엔형 근이영양증, 프리드리히 운동실조증(예: 프라탁신), 프로그래눌린(PRGN)(전두측두엽 치매(FTD), 진행성 비달변성 실어증(PNFA) 및 의미 치매를 포함한 비알츠하이머 뇌 변성과 연관됨)을 포함할 수 있다. 다른 유용한 유전자 생성물로는 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC), 아르기노숙신산 합성효소, 아르기노숙신산 분해효소 결핍증 치료를 위한 아르기노숙신산 분해효소(ASL), 아르기나아제, 푸마릴아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 수산화효소, 알파-1 항트립신, 리서스 알파-태아단백질(AFP), 리서스 융모성 성선 자극 호르몬(CG), 글루코스-6-포스파타제, 예컨대 서열번호 59 또는 60에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 유전성 혈관부종과 연관된 혈장 프로테아제 C1 저해제(SERPING1), 예컨대 서열번호 61 또는 62에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 포르포빌리노겐 탈아미노효소, 호모시스틴뇨증과 연관된 시스타티온 베타-신타제, 예컨대 서열번호 65 또는 66에 제시된 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열, 분지쇄 케토산 탈탄산효소, 알부민, 이소발레릴-coA 탈수소효소, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 탈수소효소, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 탈탄산효소, H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막관통 조절인자(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 유전자 생성물[예를 들어, 미니- 또는 마이크로-디스트로핀]을 포함한다. 또 다른 유용한 유전자 생성물로는 효소 대체 요법에 유용할 수 있는 효소를 포함하며, 이는 효소의 결핍 활성으로 인해 발생하는 다양한 병태에 유용하다. 예를 들어, 만노스-6-포스페이트를 함유하는 효소는 리소좀 축적 질환에 대한 치료법에 활용될 수 있다(예를 들어, 적합한 유전자로는 β-글루쿠로니다제(GUSB)를 암호화하는 것을 포함함). 전달에 적합한 이식유전자의 예로는 예를 들어 2020년 12월 18일자로 출원된 PCT/US20/66167, 2019년 12월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/950,834호 및 2021년 1월 11일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/136,059호에 기술된 바와 같은 AAV 벡터에서 전달되는 인간 프라탁신을 포함할 수 있으며, 이 문헌들은 본원에 참고로 포함된다. 전달에 적합한 이식유전자의 또 다른 예로는 2020년 4월 30일자로 출원되고 현재 WO2020/223362A1로서 공개된 PCT/US20/30493, 2020년 4월 20일자로 출원되고 현재 WO 2020/223356A1로서 공개된 PCT/US20/30484, 2019년 4월 30일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/840,911호, 2019년 10월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62.913,401호, 2020년 5월 14일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/024,941호, 및 2020년 11월 4일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/109,677호에 기술된 바와 같은 AAV 벡터에서 전달되는 인간 산-α-글루코시다제(GAA)를 포함할 수 있으며, 이 문헌들은 본원에 참고로 포함된다. 또한, 전달에 적합한 이식유전자의 또 다른 예로는 예를 들어 2014년 3월 13일자로 출원되고 현재 WO 2014/151341로서 공개된 PCT/US2014/025509, 및 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/788,724호에 기술된 바와 같은 AAV 벡터에서 전달되는 인간 α-L-이두로니다제(IDUA)를 포함할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
다른 유용한 치료 생성물로는 심장 근육을 포함한 근육에서 발현되는 것을 포함한다. 이식유전자에 의해 암호화되는 다른 유용한 치료 생성물로는 호르몬 및 성장 및 분화 인자, 예를 들어, 비제한적으로 인슐린, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체 형성 호르몬(LH), 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 변환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), 형질전환 성장 인자 β 수퍼패밀리, 예를 들어 TGF β, 액티빈, 인히빈 또는 임의의 골형성 단백질(BMP) BMP 1-15 중 어느 하나, 성장 인자의 헤레글루인/뉴레귤린/ARIA/neu 분화 인자(NDF) 계열 중 어느 하나, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴르투린, 아그린, 세마포린/콜랩신 계열 중 어느 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제를 포함한다. 본원에서 유용한 다른 이식유전자로는 점액다당류증 I형-VII형(IDUA, IDS, GNA, HGSNAT, NAGLU, SGSH, GALNS, GLB1, ARSB, GUSB)을 치료하기 위한 것을 포함한다. MPSI 치료에 유용한 예시적인 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2019/010335에서 찾을 수 있다. MPSII 치료에 유용한 예시적인 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2019/060662에서 찾을 수 있다. MPSIIIa 치료에 유용한 예시적인 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2019/108857에서 찾을 수 있다. MPSIIIb의 치료에 유용한 예시적인 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2019/108856에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 이식유전자 카세트는 프로모터, 이식유전자 암호 서열 및 폴리 A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 간-특이적 프로모터, 예컨대 TBG 프로모터, TBG-S1 프로모터, HLP 프로모터, 또는 본원에 기술된 다른 것이다. 다른 실시양태에서, 이식유전자는 프로모터 없이 제공되며, 천연 PSCK9 프로모터의 하류에서 게놈에 삽입된다.
이식유전자 카세트, 발현 카세트 및/또는 벡터(편집용 또는 공여자)는 하나 이상의 적절한 "조절 요소" 또는 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 인핸서; 전사인자; 전사 종결인자; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(폴리A)와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 예를 들어 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE); 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 콘센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요한 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 폴리A 서열의 예로는, 예를 들어 SV40, 소 성장 호르몬(bGH) 및 TK 폴리A를 포함한다. 적합한 인핸서의 예로는 특히 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP(TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서) 등을 포함한다. 이들 제어 서열 또는 조절 서열은 뉴클레아제 암호 서열 또는 이식유전자 암호 서열에 작동가능하게 연결된다.
이식유전자 카세트에 더하여, 특정 실시양태에서, 공여자 벡터는 또한 내인성 게놈 내로 이식유전자의 상동성 지정 재조합을 촉진하기 위해 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 포함한다. 상동성 아암은 표적 PCSK9 유전자좌로 유도되고, 길이가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, HDR 아암은 각각 길이가 약 100bp 내지 약 1000bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 130bp 내지 약 500bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 100bp 내지 약 300bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 100bp 내지 약 400bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 250bp 내지 약 500bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 300bp 내지 약 500bp이다. 특정 실시양태에서, HDR 아암은 각각 약 100bp, 125bp, 150bp, 175bp, 200bp, 225bp, 250bp, 275bp, 300bp, 325bp, 350bp, 375bp, 400bp, 425bp, 450bp, 450bp, 475bp 또는 500bp이다. 한 실시양태에서, HDR 아암은 130bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 137bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 약 130bp 내지 140bp이다. 다른 실시양태에서, HDR 아암은 약 500bp이다. 다른 실시양태에서는 HDR 아암은 존재하지 않는다. HDR 아암은 100% 상보성일 필요는 없지만, 이상적으로 표적 PCSK9 유전자좌와 높은 수준의 상보성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 미스매치가 각 HDR 아암에서 허용된다. PCSK9 엑손 7을 표적화하는데 적합한 HDR 아암 서열은 서열번호 24-29에 제시되어 있다. 한 실시양태에서, HDR 아암 서열은 서열번호 24-29로부터 선택된다.
또한, 본원에는 OTC 결핍증 환자에게 장기적인 치료 이점을 제공하는 게놈의 PCSK9 안전 항구에 OTC 이식유전자 카세트의 뉴클레아제 매개, 부위 특이적 통합을 위한 조성물, 키트 및 방법이 제공된다. 본원에서 hOTCco2로 지칭되고 서열번호 17에 제시된 OTC에 대한 조작된 암호 서열이 제공된다. 서열번호 17의 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 동일성을 공유하는 서열을 갖는 핵산이 제공된다. 한 실시양태에서, 핵산은 서열번호 30에 제시된 천연 OTC 암호 서열과 80% 미만, 79% 미만, 78% 미만, 77% 미만, 76% 미만, 75% 미만, 74% 미만, 73% 미만, 72% 미만, 71% 미만, 또는 70% 미만의 동일성을 공유한다.
OTC 치료에 유용한 다른 서열은 본원에 참고로 포함된 WO 2015/138348 및 WO 2015/138357에 기술되어 있다. PKU의 치료에 유용한 예시적인 서열은 WO 2018/126112에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 다른 서열은 서열번호 71 또는 72, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유하는 서열에 제시된다.
바이러스 및 비바이러스 벡터
본원에 기술된 발현 카세트(유전자 편집 및 공여자) 또는 암호 서열은 간 세포와 같은 표적 세포로 전달하기 위해 임의의 적합한 유전자 요소, 예컨대 벡터로 조작될 수 있다. 본원에 사용된 "벡터"는 상기 핵산 서열의 복제 또는 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 생물학적 또는 화학적 모이어티이다. 일반적인 벡터로는 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 비바이러스 시스템은 나노입자, 전기천공 시스템 및 신규 생체재료, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포존, 플라스미드, 코스미드(Phillip McClean, www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/-plsc731/cloning)/cloning4.htm) 및 인공 염색체(Gong, Shiaoching, 등 "A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes" Nature 425.6961 (2003): 917-925)로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 본원에 기술되거나 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 비-바이러스 벡터 또는 지질 나노입자를 통해 전달된다.
특정 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된다. 예를 들어, Conway 등, Non-viral Delivery of Zinc Finger Nuclease mRNA Enables Highly Efficient In Vivo Genome Editing of Multiple Therapeutic Gene Targets, Molecular Therapy, 27(4):866-877(April 2019)을 참조하고, 이는 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 사용되는, 문구 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 PEG-변형된 지질)을 포함하는 전달 비히클을 지칭한다. 바람직하게는, 지질 나노입자는 하나 이상의 mRNA를 하나 이상의 표적 세포(예를 들어, 간 및/또는 근육)로 전달하도록 제형화된다. 적합한 지질의 예로는, 예를 들어 포스파티딜 화합물(예를 들어, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로사이드 및 강글리오사이드)을 포함한다. 단독으로 또는 다른 전달 비히클과 조합 여부에 관계없이 전달 비히클로서 중합체의 사용도 고려된다. 적합한 중합체로는, 예를 들어 폴리아크릴레이트, 폴리알키시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 전달 비히클은 표적 세포로의 mRNA의 형질감염을 촉진하는 능력에 기초하여 선택된다. mRNA에 유용한 지질 나노입자는 캡슐화할 양이온 지질을 포함하고/하거나 단백질 생산에 대한 저장소(depot)로서 작용할 표적 세포 내로 mRNA의 전달을 향상시킨다. 본원에 사용된 "양이온성 지질"이란 문구는 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 운반하는 임의의 다수의 지질 종을 지칭한다. 고려된 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 사용하는 다양한 비율의 다성분 지질 혼합물을 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 여러 양이온성 지질은 문헌에 기술되어 있으며, 그 중 다수가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 참고로 포함되는 WO2014/089486, US 2018/0353616A1 및 US 8,853,377B2를 참고한다. 특정 실시양태에서, LNP 제형화는 캡슐화된 핵산 주위에 지질 이중층을 형성하는 콜레스테롤, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, PEG-지질 및 중합체를 포함하는 일상적인 절차를 사용하여 수행된다(Kowalski 등, 2019, Mol. Ther. 27(4):710-728). 일부 실시양태에서, LNP는 양이온성 지질(즉, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP))을 헬퍼 지질 DOPE와 함께 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 이온화 가능한 지질 Dlin-MC3-DMA 이온화 가능한 지질, 또는 디케토피페라진계 이온화 가능한 지질(cKK-E12)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI), 또는 폴리(β-아미노)에스테르(PBAE)를 포함한다. 예를 들어, 참고로 포함되는 WO2014/089486, US 2018/0353616A1, US2013/0037977A1, WO2015/074085A1, US9670152B2 및 US 8,853,377B2를 참고한다. 유전자 편집 구성요소가 Cas9 mRNA를 포함하는 특정 실시양태에서, LNP는 또한 gRNA를 포함한다.
본원에서 유용한 특정 LNP는 본원에 각각의 전체 내용이 참고로 포함되는, WO 2021/077066 및 WO 2021/055892에 기술된 것을 포함한다. 유용한 LNP로는 간으로의 향상된 전달을 보여주는 것을 포함한다. LNP 제형은 간 전달을 향상시키기 위해 변동될 수 있다. 예를 들어, 유형 및 이온화 가능한 지질:mRNA 비, mRNA:sgRNA 비, 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 몰 비 등은 변동될 수 있다. 한 실시양태에서, LNP는 본원에 참고로 포함되는 Kauffman, K. J.; Dorkin, J. R.; Yang, J. H.; Heartlein, M. W.; DeRosa, F.; Mir, F. F.; Fenton, O. S.; Anderson, D. G., Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano letters 2015, 15 (11), 7300-7306에 기술된 것이다. 특정 실시양태에서, LNP는 5:1 내지 25:1 사이에서 변동되는 이온화 가능한 지질:mRNA 중량비로 설계된다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질:mRNA 중량비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12.5:1, 15:1, 20:1 또는 25:1이다. 특정 실시양태에서, mRNA:sgRNA 중량비는 1:1, 1:2, 2:1, 1:4, 1:5, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1이다.
다른 LNP가 기술되며 본원에서 유용하다. 예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함되는 WO 2016/118724, US 10,413,618B2, US 10,723,692B2 및 US8754062B2를 참조한다.
본원의 특정 예는 AAV 벡터 게놈에 유전자 편집 구성요소(뉴클레아제) 암호 서열 및 이식유전자 암호 서열을 함유하는 AAV 벡터의 사용을 예시한다. 그러나, 본원에 기술된 작제물의 사용은 AAV 작제물에 제한되지 않고 다른 벡터에도 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터 게놈은 상이한 벡터(예를 들어, 재조합 보카바이러스)에 패키징될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 상이한 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 및/또는 상이한 전달 시스템에 패키징될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 LNP에서 제공된다.
"플라스미드" 또는 "플라스미드 벡터"는 일반적으로 본원에서 벡터 명칭 앞 및/또는 뒤에 소문자 p로 표시된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라스미드, 기타 클로닝 및 발현 벡터, 이의 특성, 및 이의 작제/조작 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 자명하다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산 서열 또는 본원에 기술된 발현 카세트는 바이러스 벡터를 생성하고/하거나 숙주 세포에게 전달하기에 유용한 적합한 유전자 요소(벡터), 예를 들어, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 에피솜 등에 조작되고, 이는 여기에 운반되는 뉴클레아제 서열을 전달한다. 선택된 벡터는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합에 의해 전달될 수 있다. 이러한 작제물을 만드는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 기술자에게 알려져 있으며 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY를 참조한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 바이러스 캡시드 내로 패키징되기 위해 벡터 게놈에 위치한다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈의 경우 발현 카세트의 구성 요소는 AAV 역위 말단 반복 서열에 의해 5' 맨 끝 및 3' 맨 끝에서 측면에 위치한다. 예를 들어, 5' AAV ITR, 발현 카세트, 3' AAV ITR이다. 다른 실시양태에서, 자가 상보적 AAV가 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 레트로바이러스 시스템, 렌티바이러스 벡터 시스템, 또는 아데노바이러스 시스템이 사용될 수 있다.
AAV 벡터
특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터 및/또는 공여자 벡터는 재조합 AAV로서 제공된다. "재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 AAV 캡시드 및 AAV 캡시드 내에 패키징된 적어도 비-AAV 암호 서열을 함유하는 벡터 게놈인, 2가지 요소를 함유하는 DNAse-저항성 바이러스 입자이다. 달리 명시되지 않는 한, 이 용어는 "rAAV 벡터" 또는 "AAV 벡터"라는 문구와 상호교환적으로 사용될 수 있다. rAAV는 임의의 기능성 AAV rep 유전자 또는 기능성 AAV cap 유전자가 결여되어 자손을 생성할 수 없기 때문에 "복제 결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"이다. 특정 실시양태에서, 유일한 AAV 서열은 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)이고, 전형적으로 ITR 사이에 위치한 조절 서열 및 유전자가 AAV 캡시드 내에 패키징되도록 하기 위해 전형적으로 벡터 게놈의 5' 맨 끝 및 3' 맨 끝에 위치한다.
AAV 캡시드의 공급원은 임의의 수십 개의 자연 발생적이고 입수 용이한 아데노 연관 바이러스, 뿐만 아니라 조작된 AAV 중 하나일 수 있다. 유전자 편집 벡터 및/또는 공여자 벡터에 대한 AAV 캡시드의 공급원은 한 실시양태에서 동일하다. 다른 실시양태에서, 유전자 편집 벡터 및/또는 공여자 벡터에 대한 AAV 캡시드의 공급원은 상이하다. 아데노 연관 바이러스(AAV) 바이러스 벡터는 표적 세포로 전달하기 위해 핵산 서열이 패키징되어 있는 AAV 단백질 캡시드를 갖는 AAV DNase-저항성 입자이다. AAV 캡시드는 선택된 AAV에 따라 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 정이십면체 대칭으로 배열된 60개의 캡시드(cap) 단백질 하위단위인 VP1, VP2 및 VP3으로 구성된다. 위에서 확인된 바와 같이 AAV 바이러스 벡터의 캡시드에 대한 공급원으로 다양한 AAV가 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2007-0036760-A1호; 미국 공개 특허 출원 제2009-0197338-A1호; EP 1310571을 참조한다. 또한, WO 2003/042397(AAV7 및 기타 유인원 AAV), 미국 특허 제7790449호 및 미국 특허 제7282199호(AAV8), WO 2005/033321 및 US 제7,906,111호(AAV9), 및 WO 2006/110689, WO 2003/042397(rh.10) 및 WO 2018/160582(AAVhu68)를 참조한다. 이들 문서는 또한 AAV 생성을 위해 선택될 수 있는 다른 AAV를 기술하며, 참고로 포함된다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 기술된 AAV 캡시드, ITR 및 다른 선택된 AAV 구성요소는 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8, AAVAnc80, AAVrh10, AAVrh79 및 AAVPHP.B로서 일반적으로 식별된 AAV, 및 임의의 공지되거나 언급된 AAV의 변이체 또는 아직 발견되지 않은 AAV, 또는 이들의 변이체 또는 혼합물을 포함하는 임의의 AAV 중에서 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO 2005/033321을 참조한다. 한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV1 캡시드 또는 이의 변이체, AAV8 캡시드 또는 이의 변이체, AAV9 캡시드 또는 이의 변이체, AAVhu.68 캡시드 또는 이의 변이체, AAVrh.10 캡시드 또는 이의 변이체, AAVrh64R1 캡시드 또는 이의 변이체, AAVhu.37 캡시드 또는 이의 변이체, 또는 AAV3B 또는 이의 변이체이다. 한 측면에서, 캡시드는 AAVhu.37 캡시드이다. 또한, 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 WO 2019/168961 및 WO 2019/169004도 참조한다. 다른 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAVrh79 캡시드 또는 이의 변이체이다. 다른 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAVrh.90 또는 이의 변이체이다.
특정 실시양태에서, rAAV는 AAVhu37 캡시드를 포함한다. AAVhu37 캡시드는 서열번호 38의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 38의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 38의 적어도 아미노산 204 내지 738을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함하고, 여기서: vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 38의 아스파라긴-글리신 쌍에 적어도 2개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N)을 포함하는 아미노산 변형을 갖는 하위집단을 함유하고, 선택적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화를 초래한다. AAVhu37은 고도로 탈아미드화된 잔기를, 예를 들어 AAVhu37 VP1(서열번호 38)의 넘버링에 기초한 위치 N57, N263, N385 및/또는 N514에 갖는 것을 특징으로 한다.
탈아미드화는 아래 표 및 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 2019년 9월 6일자로 공개된 WO 2019/168961에 제시된 바와 같은 다른 잔기들에서 관찰되었다. 특정 실시양태에서, AAVhu37 캡시드는 트립신 효소를 이용한 질량 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이 하기 제공된 범위 내에서 다음 위치 중 하나 이상에서 변형된다. 특정 실시양태에서, 다음 위치 중 하나 이상, 또는 N 다음의 글리신은 본원에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, G는 예를 들어 위치 58, 264, 386 또는 515에서 S 또는 A로 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, AAVhu37 캡시드는 위치 N57/G58에서 N57Q 또는 G58A로 변형되어, 이 위치에 감소된 탈아미드화를 갖는 캡시드를 제공한다. 다른 실시양태에서, N57/G58은 NS57/58 또는 NA57/58로 변경된다. 그러나, 특정 실시양태에서, NG가 NS 또는 NA로 변경되는 경우, 탈아미드화의 증가가 관찰된다. 특정 실시양태에서, NG 쌍의 N은 Q로 변형되는 반면 G는 보유한다. 특정 실시양태에서, NG 쌍의 두 아미노산 모두가 변형된다. 특정 실시양태에서, N385Q는 해당 위치에서 탈아미드화의 유의미한 감소를 초래한다. 특정 실시양태에서, N499Q는 해당 위치에서 탈아미드화의 유의미한 증가를 초래한다.
특정 실시양태에서, AAVhu37은 탈아미드화된 이들 잔기 또는 다른 잔기를 예를 들어 전형적으로 10% 미만으로 가질 수 있고/있거나, 다른 변형, 예를 들어 메틸화(예를 들어, ~R487)(주어진 잔기에서 전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만), 이성질체화(예를 들어, D97에서)(주어진 잔기에서 전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만), 인산화(예를 들어, 존재하는 경우 약 10 내지 약 60% 범위, 또는 약 10 내지 약 30%, 또는 약 20 내지 약 60% 범위로)(예를 들어, S149, ~S153, ~S474, ~T570, ~S665 중 하나 이상에서), 또는 산화(예를 들어, W248, W307, W307, M405, M437, M473, W480, W480, W505, M526, M544, M561, W621, M637 및/또는 W697 중 하나 이상에서)를 가질 수 있다. 선택적으로 W는 키누레닌으로 산화될 수 있다.
또 다른 위치에도 이러한 이들 변형 또는 다른 변형(예를 들어, 아세틸화 또는 추가 탈아미드화)을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, AAVhu37 vp1 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 37에 제공된다. 다른 실시양태에서, 서열번호 37과 70% 내지 99.9% 동일성인 핵산 서열은 AAVhu37 캡시드 단백질을 발현하기 위해 선택될 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 37과 적어도 약 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 그러나, 서열번호 38의 아미노산 서열을 암호화하는 다른 핵산 서열은 rAAVhu37 캡시드를 생산하는데 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 37의 핵산 서열 또는 서열번호 38을 암호화하는 서열번호 37과 적어도 70% 내지 적어도 99% 동일, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 37의 핵산 서열, 또는 서열번호 38의 vp2 캡시드 단백질(약 aa 138 내지 738)을 암호화하는 서열번호 37의 약 nt 412 내지 약 nt 2214와 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 37의 약 nt 610 내지 nt 2214의 핵산 서열, 또는 서열번호 38의 vp3 캡시드 단백질(약 aa204 내지 738)을 암호화하는 서열번호 37 nt와 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 참고로 포함되는 EP 2 345 731 B1 및 이 문헌에서의 서열번호 88을 참고한다.
특정 실시양태에서, rAAV는 AAV8 캡시드를 포함한다. AAV8 캡시드는 질량 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 캡시드 내의 VP 단백질의 총량에 기초하여 다음 표에 정의된 바와 같이 탈아미드화된 VP 이소폼(isoform)의 이종 집단을 포함한다. 적합한 변형으로는 본원에 포함된 탈아미드화의 표지된 조정 위의 문단에 기술된 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 질량 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 이하에 제공되는 범위 내에서 다음 위치 중 하나 이상에서 변형된다. 특정 실시양태에서, 다음 위치들 중 하나 이상, 또는 N 다음의 글리신은 본원에 기술된 바와 같이 변형된다. 특정 실시양태에서, 인공 NG는 이하에서 식별된 위치 중 하나와 상이한 위치 내로 도입된다. 특정 실시양태에서, 다음 위치들 중 하나 이상 또는 N 다음의 글리신은 본원에 기술된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, G는 예를 들어 위치 58, 67, 95, 216, 264, 386, 411, 460, 500, 515, 또는 541에서 S 또는 A로 변형될 수 있다. 탈아미드화의 유의미한 감소는 NG57/58이 NS57/58 또는 NA57/58로 변경될 때 관찰된다. 하지만, 특정 실시양태에서, 탈아미드화의 증가는 NG가 NS 또는 NA로 변경될 때 관찰된다. 특정 실시양태에서, NG 쌍의 N은 Q로 변형되는 반면, G는 보유된다. 특정 실시양태에서, NG 쌍의 두 아미노산이 변형된다. 특정 실시양태에서, N385Q는 해당 위치에서 탈아미드화의 유의미한 감소를 초래한다. 특정 실시양태에서, N499Q는 해당 위치에서 탈아미드화의 유의미한 증가를 초래한다. 특정 실시양태에서, NG 돌연변이는 N263에 위치한 쌍에서 이루어진다(예를 들어, N263A로). 특정 실시양태에서, NG 돌연변이는 N514에 위치한 쌍에서 이루어진다(예를 들어, N514A로). 특정 실시양태에서, NG 돌연변이는 N540에 위치한 쌍에서 이루어진다(예를 들어, N540A). 특정 실시양태에서, 이들 위치의 돌연변이 중 적어도 하나 및 다중 돌연변이를 함유하는 AAV 돌연변이체가 조작된다. 특정 실시양태에서, 위치 N57에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 N94에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 N305에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 G386에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 Q467에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 N479에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 위치 N653에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 특정 실시양태에서, 캡시드는 그 다음 "NG" 쌍 이외의 위치에서 "N" 또는 "Q"를 감소시키기 위해 변형된다. 잔기 번호는 서열번호 36에 재현된, 공개된 AAV8 서열에 기초한다.
특정 실시양태에서, rAAV는 본원에 참고로 포함되는 2019년 9월 6일에 공개된 WO 2019/169004에 기술된 바와 같은 AAVrh79 캡시드를 포함한다. 한 실시양태에서, AAVrh79 캡시드는 AAVrh79 vp1 단백질, AAVrh79 vp2 단백질, 및 AAVrh79 vp3 단백질의 이종 집단을 포함한다. 한 실시양태에서, AAVrh79 캡시드는 서열번호 34의 예측된 아미노산 서열의 1 내지 738을 암호화하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생산된다. 선택적으로, 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1 내지 137) 또는 vp2-고유 영역(약 aa 1 내지 203)을 배제한 핵산 서열로부터의 vp3 단백질, 또는 서열번호 33으로부터 생산된 vp1 단백질, 또는 서열번호 34의 예측된 아미노산 서열의 1 내지 738을 암호화하는 서열번호 33과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산된 vp1 단백질을 공동발현한다. 다른 실시양태에서, AAVrh79 vp2 단백질은 서열번호 34의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생산되고, vp2 단백질은 서열번호 33의 적어도 뉴클레오타이드 412 내지 2214를 포함하는 서열로부터 생산되거나, 또는 vp2 단백질은 서열번호 34의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 33의 적어도 뉴클레오타이드 412 내지 2214와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산되고, AAVrh79 vp3 단백질은 서열번호 34의 적어도 약 아미노산 204 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생산되고, vp3 단백질은 서열번호 33의 적어도 뉴클레오타이드 610 내지 2214를 포함하는 서열로부터 생산되거나, 또는 서열번호 34의 적어도 약 아미노산 204 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 33의 적어도 뉴클레오타이드 610 내지 2214와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산된다.
특정 실시양태에서, AAVrh79 캡시드는 서열번호 34의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 34의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 34의 적어도 아미노산 204 내지 738을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함한다.
AAVrh79 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 34의 아스파라긴-글리신 쌍에 적어도 2개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N)을 포함하는 아미노산 변형을 갖는 하위집단을 함유하고, 선택적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화를 초래한다. 서열번호 34의 번호에 대비하여, N-G 쌍, N57, N263, N385 및/또는 N514에서의 높은 수준의 탈아미드화가 관찰된다. 아래 표 및 실시예에 나타낸 바와 같이, 다른 잔기에서도 탈아미드화가 관찰되었다. 특정 실시양태에서, AAVrh79는 탈아미드화된 다른 잔기를, 예를 들어 전형적으로 10% 미만으로 가질 수 있고/있거나 다른 변형, 예를 들어 메틸화(예를 들어, ~R487)(주어진 잔기에서 전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만), 이성질체화(예를 들어, D97에서)(주어진 잔기에서 전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만), 인산화(예를 들어, 존재하는 경우 약 10 내지 약 60% 범위, 또는 약 10 내지 약 30%, 또는 약 20 내지 약 60% 범위로)(예를 들어, S149, ~S153, ~S474, ~T570, ~S665 중 하나 이상에서), 또는 산화(예를 들어, W248, W307, W307, M405, M437, M473, W480, W480, W505, M526, M544, M561, W621, M637 및/또는 W697 중 하나 이상에서)를 포함할 수 있다. 선택적으로 W는 키누레닌으로 산화될 수 있다.
특정 실시양태에서, AAVrh79 캡시드는 트립신 효소를 이용한 질량 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이, 앞선 표에서 식별된 위치 중 하나 이상에서 아래에 제공된 범위로 변형된다. 특정 실시양태에서, 다음 위치 중 하나 이상, 또는 N 다음의 글리신은 본원에 기재된 바와 같이 변형된다. 잔기 번호는 본원에 제공된 AAVrh79 서열에 기초한다. 서열번호 34 참조.
특정 실시양태에서, AAVrh79 vp1 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 33에 제공된다. 다른 실시양태에서, 서열번호 33과 70% 내지 99.9% 동일성의 핵산 서열은 AAVrh79 캡시드 단백질을 발현하도록 선택될 수 있다. 특정한 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 33과 적어도 약 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 그러나, 서열번호 34의 아미노산 서열을 암호화하는 다른 핵산 서열도 rAAV 캡시드 생산에 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 33의 핵산 서열 또는 서열번호 34를 암호화하는 서열번호 33과 적어도 70% 내지 99% 동일, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 33의 핵산 서열, 또는 서열번호 34의 vp2 캡시드 단백질(약 aa138 내지 738)을 암호화하는 서열번호 33의 약 nt412 내지 약 nt2214와 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 33의 약 nt610 내지 약 nt2214의 핵산 서열 또는 서열번호 34의 vp3 캡시드 단백질(약 aa204 내지 738)을 암호화하는 서열번호 33 nt와 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 하나 이상의 잔기가 탈아미드화를 감소시키도록 변경된 돌연변이 AAVrh79를 암호화하는 핵산 서열, 또는 본원에서 식별되는 다른 변형을 포괄한다. 이러한 핵산 서열은 돌연변이 rAAVrh79 캡시드의 생산에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV는 본원에 참고로 포함되는 2020년 11월 5일자로 공개된 WO 2020/223232에 기술된 바와 같은 AAVrh.90 캡시드를 포함한다. 추가 측면에서, 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 (A) (1) 서열번호 40의 예측된 아미노산 서열 1 내지 738을 암호화하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생산된 vp1 단백질, 서열번호 39로부터 생산된 vp1 단백질, 또는 서열번호 40의 예측된 아미노산 서열 1 내지 738을 암호화하는 서열번호 39와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산된 vp1 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 vp2 단백질, 서열번호 39의 적어도 뉴클레오타이드 412 내지 2214를 포함하는 서열로부터 생산된 vp2 단백질, 또는 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 39의 적어도 뉴클레오타이드 412 내지 2214와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산된 vp2 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp2 단백질의 이종 집단, 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 204 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 vp3 단백질, 서열번호 39의 적어도 뉴클레오타이드 610 내지 2214를 포함하는 서열로부터 생산된 vp3 단백질, 또는 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 204 내지 738의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 39의 적어도 뉴클레오타이드 610 내지 2214와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생산된 vp3 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp3 단백질의 이종 집단을 포함하는 AAVrh.90 캡시드 단백질; 및/또는 (2) 서열번호 40의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 40의 적어도 아미노산 204 내지 738을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp3 단백질의 이종 집단으로서, 여기서 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 40의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴을 포함하는 아미노산 변형을 갖는 하위집단을 함유하고, 선택적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 추가로 포함하고, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화를 초래하는, 이종 집단 중 하나 이상을 포함하는 AAVrh.90 캡시드; 및 (B) AAVrh.90 캡시드 내의 벡터 게놈으로서, AAV 역위 말단 반복 서열을 포함하는 핵산 분자 및 숙주 세포에서 생성물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 생성물을 암호화하는 비-AAV 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 것이 제공된다.
특정 실시양태에서, AAVrh79 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 40에서 아스파라긴-글리신 쌍에 적어도 2개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N)을 포함하는 아미노산 변형을 갖는 하위집단을 함유하고, 선택적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화를 초래한다. 서열번호 40의 번호에 대비하여, N-G 쌍, N57, ∼N263, ∼N385 및/또는 ∼N514에서의 높은 수준의 탈아미드화가 관찰된다. 아래 표에 나타낸 바와 같이, 다른 잔기에서도 탈아미드화가 관찰되었다. 특정 실시양태에서, AAVrh.90은 탈아미드화된 다른 잔기(예를 들어, ∼N305, ∼N499, 및/또는 ∼N599, 전형적으로 20% 미만으로)를 가질 수 있고/있거나 다른 변형, 예를 들어 인산화(예를 들어, 존재하는 경우 약 2 내지 약 30%, 또는 약 2 내지 약 20%, 또는 약 2 내지 약 10% 범위로)(예를 들어, S149에서), 또는 산화(예를 들어, ∼W23, ∼M204, ∼M212, W248, W282, M405, M473, W480, W505, M526, ∼N544, M561, 및/또는 ∼M607 중 하나 이상에서)를 가질 수 있다. 선택적으로, W는 키누레닌으로 산화될 수 있다.
특정 실시양태에서, AAVrh.90 캡시드는 트립신 효소를 이용한 질량 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이, 이전 표에서 식별된 위치 중 하나 이상에서 제공된 범위로 변형된다. 특정 실시양태에서, 위치 중 하나 이상, 또는 N 다음의 글리신은 본원에 기재된 바와 같이 변형된다. 잔기 번호는 본원에 제공된 AAVrh.90 서열에 기초한다. 서열번호 40 참조.
특정 실시양태에서, AAVrh.90 캡시드는 서열번호 40의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 40의 적어도 약 아미노산 138 내지 738의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 40의 적어도 아미노산 204 내지 738을 암호화하는 핵산 서열의 생성물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함한다.
특정 실시양태에서, 파보바이러스 벡터 캡시드는 간-향성에 대해 선택되고, 치료되는 환자는 간 대사 장애를 갖는다. 특정 실시양태에서, 파보바이러스 벡터 캡시드는 심장-향성에 대해 선택되고, 치료되는 환자는 심장 장애를 갖는다. 특정 실시양태에서, 파보바이러스 벡터 캡시드는 골격근 세포에 대한 향성에 대해 선택되고, 치료되는 환자는 근육 장애를 갖고 있다.
본원에 사용된 "벡터 게놈"은 바이러스 입자를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 핵산 서열은 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)을 함유한다. 본원의 예에서, 벡터 게놈은 최소한 5'에서 3'로, AAV 5' ITR, 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이식유전자 또는 암호 서열(들)을 함유하는 발현 카세트, 및 AAV 3' ITR을 함유한다. ITR은 벡터 생산 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전자 요소이며 rAAV를 생성하는 데 필요한 유일한 바이러스 시스 요소이다. 한 실시양태에서, ITR은 캡시드를 공급하는 AAV와는 상이한 AAV 유래인 것이다. 바람직한 실시양태에서, AAV2 유래의 ITR 서열 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)이 편의상 사용될 수 있다. 하지만, 다른 AAV 공급원의 ITR도 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2 유래이고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원 유래인 경우, 결과적으로 생성되는 벡터는 위형화된이라고 지칭될 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, 유전자 생성물(들)을 암호화하는 핵산 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이들 요소의 다른 배열이 적합할 수 있다. 한 실시양태에서, 자가 상보적 AAV가 제공된다. D-서열 및 말단 분해 부위(trs)가 결실된 ΔITR로 지칭되는 5' ITR의 단축 버전은 기술된 바 있다. 특정 실시양태에서, 벡터 게놈은 130개 염기쌍의 단축된 AAV2 ITR을 포함하며, 여기서 외부 "a" 요소는 결실된다. 단축된 ITR은 내부 A 요소를 주형으로서 사용하여 벡터 DNA 증폭 동안 145개 염기쌍의 야생형 길이로 다시 복귀된다. 다른 실시양태에서는 전체길이의 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 다른 실시양태에서는 전체 길이 또는 조작된 ITR이 선택될 수 있다. 캡시드와 다른 AAV 공급원인 AAV2 유래의 ITR, 또는 전체 길이 ITR이 아닌 다른 것이 선택될 수 있다. ITR은 생산 동안 rep 기능을 제공하는 AAV와 동일한 AAV 공급원 또는 상호보완 AAV에서 유래된다. 또한, 다른 ITR이 사용될 수도 있다. 적합한 ITR 서열의 예는 서열 목록, 예를 들어 서열번호 42, nt 1 내지 130 및 3052 내지 3181에 제시되어 있다. 또한, 벡터 게놈은 유전자 생성물의 발현 조정을 지시하는 조절 서열을 함유한다(예를 들어, 직접적으로 또는 전사 및/또는 해독을 조정하여 간접적으로). 벡터 게놈의 적합한 구성요소는 본원에서 더 자세히 논의된다.
특정 실시양태에서, 유전자 편집 벡터 게놈은 TBG 프로모터, 하나 이상의 알파 mic/bik 인핸서(들), ARCUS 메가뉴클레아제에 대한 암호 서열, 선택적으로 WPRE, 및 폴리A를 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 5' 및 3' ITR이 측면에 있는 서열번호 42의 nt 211 내지 nt 2964를 포함한다.
AAV 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합(r) AAV)를 생산하는데 사용하기 위해, 발현 카세트는 패키징 숙주 세포로 전달되는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 상에서 운반될 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스미드는 무엇보다도 원핵 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포에서 시험관내 복제 및 패키징에 적합하도록 조작될 수 있다. 적합한 형질감염 기술 및 패키징 숙주 세포는 공지되어 있고/있거나 관련 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 설계될 수 있다.
벡터로 사용하기에 적합한 AAV를 생성하고 단리하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다. 일반적으로, 예를 들어 Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning 등, 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733; 및 이하에 인용되는 참고문헌을 참조하고, 이들 각각은 본원에 전체가 참고로 포함된다. 이식유전자를 비리온에 패키징하기 위해, ITR은 발현 카세트를 함유하는 핵산 분자로서 동일 작제물에 시스로 요구되는 유일한 AAV 구성요소이다. cap 및 rep 유전자는 트랜스로 공급될 수 있다.
용어 "AAV 중간체" 또는 "AAV 벡터 중간체"라는 용어는 내부에 패키징된 원하는 게놈 서열이 결여된 조립된 rAAV 캡시드를 지칭한다. 이는 "빈(empty)" 캡시드라고도 불릴 수 있다. 이러한 캡시드는 발현 카세트의 검출 가능한 게놈 서열을 함유하지 않거나, 또는 유전자 생성물의 발현을 달성하기에 불충분한 부분적으로 패키징된 게놈 서열만을 함유할 수 있다. 이러한 빈 캡시드는 관심 유전자를 숙주 세포로 전달하는 데 비-기능적이다.
본원에 기술된 재조합 아데노 연관 바이러스(AAV)는 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2를 참조한다. 이러한 방법은 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; 최소한 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 발현 카세트; 및 AAV 캡시드 단백질 내로 발현 카세트의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 수반한다. 캡시드, 이에 대한 암호 서열을 생성하는 방법, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생산 방법은 기술된 바 있다. 예를 들어, Gao, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086(2003) 및 US 2013/0045186A1을 참조한다.
한 실시양태에서, 재조합 AAV를 생산하는데 유용한 생산 세포 배양물이 제공된다. 이러한 세포 배양물은 숙주 세포에서 AAV 캡시드 단백질을 발현하는 핵산; AAV 캡시드에 패키징하는 데 적합한 핵산 분자, 예를 들어 AAV ITR 및 숙주 세포에서 생성물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물을 암호화하는 비-AAV 핵산 서열을 함유하는 벡터 게놈; 및 재조합 AAV 캡시드 내로 핵산 분자의 패키징을 허용하기에 충분한 AAV rep 기능 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한다. 한 실시양태에서, 세포 배양물은 포유동물 세포(예를 들어, 특히 인간 배아 신장 293 세포) 또는 곤충 세포(예를 들어, 바큘로바이러스)로 구성된다.
선택적으로, rep 기능은 캡시드를 제공하는 AAV 이외의 다른 AAV에 의해 제공된다. 예를 들어, rep는 AAV1 rep 단백질, AAV2 rep 단백질, AAV3 rep 단백질, AAV4 rep 단백질, AAV5 rep 단백질, AAV6 rep 단백질, AAV7 rep 단백질, AAV8 rep 단백질; 또는 rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep68/78, 및 rep40/52; 또는 이의 단편; 또는 또 다른 공급원일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로, rep 및 cap 서열은 세포 배양물에서 동일한 유전자 요소에 있다. rep 서열과 cap 서열 사이에는 스페이서가 있을 수 있다. 이들 AAV 또는 돌연변이 AAV 캡시드 서열 중 임의의 서열은 숙주 세포에서 이의 발현을 지시하는 외인성 조절 제어 서열의 제어 하에 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 적합한 세포 배양(예를 들어, HEK 293) 세포에서 제조된다. 본원에 기술된 유전자 치료 벡터를 제조하는 방법으로는 유전자 치료 벡터의 생산에 사용되는 플라스미드 DNA의 생성, 벡터의 생성 및 벡터의 정제와 같이 관련 기술분야에 잘 알려진 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 벡터이고, 생성된 플라스미드는 AAV 게놈 및 관심 유전자를 암호화하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 공정은 세포 배양 개시, 세포 계대, 세포 파종, 플라스미드 DNA로 세포의 형질감염, 형질감염 후 무혈청 배지로의 배지 교환, 및 벡터 함유 세포 및 배양 배지의 수확과 같은 방법 단계를 포함할 수 있다. 수확된 벡터 함유 세포 및 배양 배지는 본원에서 조 세포 수확물로서 지칭된다. 또 다른 시스템에서, 유전자 치료 벡터는 바큘로바이러스 기반 벡터를 이용한 감염에 의해 곤충 세포 내로 도입된다. 이들 생산 시스템에 대한 검토는 일반적으로, 예를 들어 Zhang 등, 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production", Human Gene Therapy 20:922-929를 참조하고, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 이들 및 기타 AAV 생산 시스템을 제조하고 사용하는 방법은 다음 미국 특허에도 기술되어 있으며, 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다: 제5,139,941호; 제5,741,683호; 제6,057,152호; 제6,204,059호; 제6,268,213호; 제6,491,907호; 제6,660,514호; 제6,951,753호; 제7,094,604호; 제7,172,893호; 제7,201,898호; 제7,229,823호; 및 제7,439,065호.
조 세포 수확물은 이하 벡터 수확물의 농축, 벡터 수확물의 정용여과, 벡터 수확물의 미세유동화, 벡터 수확물의 뉴클레아제 분해, 미세유동화된 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의한 조(crude) 정제, 초원심분리에 의한 조 정제, 접선유동여과에 의한 완충액 교환, 및/또는 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형화 및 여과와 같은 방법 단계를 거칠 수 있다.
음이온 교환 수지 크로마토그래피에 이은 고염 농도에서의 2단계 친화도 크로마토그래피 정제는 벡터 의약품을 정제하고 빈 캡시드를 제거하는 데 사용된다. 이러한 방법은 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO 2017/160360에 더 자세히 기술되어 있다. AAV8에 대한 정제 방법, 국제 특허 공개 번호 WO 2017/100676, 및 rh10에 대한 정제 방법, 국제 특허 공개 번호 WO 2017/100704, 및 AAV1에 대한 정제 방법, 국제 특허 공개 번호 WO 2017/100674는 모두 본원에 참고로 포함된다.
빈 입자 및 채워진 입자의 함량을 계산하기 위해, 선택된 샘플(예를 들어, 본원의 예에서 요오딕사놀 구배-정제된 제제, 여기서 GC # = 입자 #임)에 대한 VP3 밴드 부피를 로딩된 GC 입자에 대해 플로팅한다. 결과적으로 생성되는 선형 방정식(y = mx+c)은 테스트 물품 피크의 밴드 부피에서 입자 수를 계산하는 데 사용된다. 로딩된 20 μL당 입자 수(pt)는 그 다음 50을 곱하여 입자(pt)/mL를 제공한다. Pt/mL을 GC/mL로 나눈 값은 게놈 카피에 대한 입자 비(pt/GC)를 제공한다. Pt/mL - GC/mL은 빈 pt/mL를 제공한다. 빈 pt/mL를 pt/mL로 나누고 x 100을 하면 빈 입자의 백분율이 제공된다.
일반적으로, 빈 캡시드 및 패키징된 게놈을 갖는 AAV 벡터 입자에 대한 검정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Grimm 등, Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer등, Molec. Ther. (2003) 7:122-128을 참조한다. 변성된 캡시드에 대해 테스트하기 위해, 방법은 처리된 AAV 스톡을 3개의 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어 완충액에 3-8% 트리스-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 구성된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리하는 단계, 그 다음 샘플 물질이 분리될 때까지 겔을 진행시키는 단계, 및 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막, 바람직하게는 나일론 위에 겔을 블로팅하는 단계를 포함한다. 항-AAV 캡시드 항체는 그 다음 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 1차 항체, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단클론 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단클론 항체로서 사용된다(Wobus 등, J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 그 다음, 1차 항체에 결합하고 1차 항체와의 결합을 검출하는 수단을 함유하는 것, 보다 바람직하게는 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 양고추냉이 퍼옥시다제에 공유 연결된 양의 항-마우스 IgG 항체인 2차 항체가 사용된다. 결합을 검출하는 방법은 1차 항체와 2차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 결정하는 데 사용되며, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사선 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트가 있다. 예를 들어, SDS-PAGE를 위해, 컬럼 분획의 샘플을 취하여 환원제(예: DTT)를 함유한 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열할 수 있고, 캡시드 단백질은 사전 주조된 구배 폴리아크릴아미드 겔(예: Novex)에서 분리되었다. 은 염색은 SilverXpress(Invitrogen, CA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하거나 기타 적절한 염색 방법, 즉 SYPRO 루비 또는 쿠마시 염색을 사용하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 컬럼 분획 중 AAV 벡터 게놈의 농도(vg)는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플은 희석하고 DNase I(또는 다른 적합한 뉴클레아제)로 분해하여 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 비활성화 후, 샘플은 추가로 희석하고, 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan™ 형광성 프로브를 사용하여 증폭시킨다. 정해진 형광 수준에 도달하는 데 필요한 주기 수(임계값 주기, Ct)는 Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System에서 각 샘플에 대해 측정한다. AAV 벡터에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA는 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성하는 데 사용된다. 샘플에서 수득되는 주기 임계(Ct) 값은 이를 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값에 대해 정규화함으로써 벡터 게놈 역가를 결정하는 데 사용된다. 디지털 PCR에 기초한 엔드 포인트 검정도 사용될 수 있다.
한 측면에서, 광범위한 스펙트럼의 세린 프로테아제, 예를 들어 프로테이나제 K(예컨대, Qiagen에서 시판됨)를 활용하는 최적화된 q-PCR 방법이 사용된다. 보다 구체적으로, 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은 DNase I 분해 후 샘플을 프로테이나제 K 완충액으로 희석하고 프로테이나제 K로 처리한 후 열 불활성화한다는 점을 제외하고는 표준 검정과 유사하다. 적합하게는 샘플은 샘플 크기와 동일한 양의 프로테이나제 K 완충액으로 희석된다. 프로테이나제 K 완충액은 2배 이상 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테이나제 K 처리는 약 0.2 mg/mL이지만, 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL로 변동될 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15분 동안 수행되지만, 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 더 오랜 시간 기간(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)에 걸쳐 수행될 수 있거나, 더 높은 온도(예를 들어, 최대 약 60℃)에서 더 짧은 시간 기간(예를 들어, 약 5 내지 10분) 동안 수행될 수 있다. 이와 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15분 동안 이루어지지만, 온도는 더 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃) 시간은 연장될 수 있다(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분). 그런 다음 샘플은 희석하고(예를 들어, 1000배), 표준 검정에 기술된 바와 같이 TaqMan 분석으로 처리될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해 단일 가닥 및 자가 상보적 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법은 기술된 바 있다. 예를 들어, M. Lock 등, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14를 참조한다. ddPCR 방법은 캡시드화된 벡터 게놈의 농도를 직접 측정한다. 샘플은 DNase I로 처리되어 샘플에 존재하는 임의의 비-캡시드화 DNA를 분해한 후, 프로테이나제 K로 처리하여 캡시드를 절단한다. 그런 다음 샘플을 검정 범위에 맞게 희석한다. 샘플은 ddPCR Supermix와 혼합되고, PCSK9 유전자에 특이적인 메가뉴클레아제(M2PCSK9)를 표적으로 하는 서열 특이적 프라이머를, 동일한 영역에 하이브리드화되는 형광 태그화된 프로브와 조합으로 사용하여 검출을 수행한다. 20 마이크로리터의 ddPCR 반응 혼합물은 Bio-Rad 액적 생성기에서 처리되고, ddPCR 반응 혼합물은 ≥10,000 액적으로 분할된다. 액적 생성 후 ddPCR 반응 혼합물은 PCR 증폭을 겪고, 증폭된 ddPCR 반응 혼합물은 Bio-Rad Droplet Reader를 사용하여 판독된다.
감염 단위(IU) 검정은 RC32 세포(Rep2 발현 HeLa 세포)에서 rAAV 벡터의 생산적 흡수 및 복제를 결정하는 데 사용될 수 있다. 96웰 엔드포인트 형식은 이전에 공개된 것과 유사하게 사용되었다. 간략히 설명하면, RC32 세포는 각 rAAV 희석물마다 12개의 복제물을 이용하여 rAAV BDS의 연속 희석물 및 Ad5의 균일한 희석물에 의해 공동감염될 것이다. 감염 72시간 후, 세포는 용해될 것이고, 투입물 대비 rAAV 벡터 증폭을 검출하기 위해 qPCR이 수행될 것이다. 엔드포인트 희석 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 계산(스피어만-카버)은 IU/mL로서 표현된 감염 역가를 결정하기 위해 수행될 것이다. "감염성" 값은 세포와 각 입자의 접촉, 수용체 결합, 내재화, 핵으로의 수송, 및 게놈 복제에 의존적이므로, 이 값은 검정 기하형태 및 사용된 세포주에서 적절한 수용체 및 결합후 경로의 존재에 의해 영향을 받는다. 수용체 및 결합후 경로는 일반적으로 불멸화된 세포주에서 유지되지 않아서, 감염성 검정 역가는 존재하는 "감염성" 입자 수의 절대적인 척도가 아니다. 그러나, "감염 단위"에 대한 캡시드화된 GC의 비(GC/IU 비로서 기술됨)는 로트 간 생성물 일관성의 척도로서 사용될 수 있다.
간략하게 설명하면, 패키징된 게놈 서열을 갖는 rAAV 입자를 게놈-결핍 AAV 중간체로부터 분리하는 방법은 재조합 AAV 바이러스 입자 및 AAV 캡시드 중간체를 포함하는 현탁액을 고속 성능 액체 크로마토그래피를 거치게 하는 단계를 수반하고, 여기서 AAV 바이러스 입자 및 AAV 중간체는 높은 pH에서 평형화된 강한 음이온 교환 수지에 결합되며, 염 구배를 거치면서 용출액은 약 260 및 약 280의 자외선 흡광도로 모니터링된다. pH는 선택된 AAV에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO2017/160360(AAV9), WO2017/100704(AAVrh10), WO 2017/100676(예를 들어, AAV8) 및 WO 2017/100674(AAV1)]를 참조한다. 이 방법에서 AAV 전체 캡시드는 A260/A280의 비가 변곡점에 도달할 때 용출되는 분획에서 수집된다. 한 예에서, 친화성 크로마토그래피 단계의 경우, 정용여과된 생성물은 AAV2 혈청형을 효율적으로 포획하는 Capture SelectTM Poros-AAV2/9 친화성 수지(Life Technologies)에 적용될 수 있다. 이러한 이온 조건에서 유의미한 백분율의 잔류 세포 DNA 및 단백질은 컬럼을 통해 흐르는 반면, AAV 입자는 효율적으로 포획된다.
이중 벡터 시스템
또 다른 측면에서, 유전적 장애를 치료하기 위한 이중 벡터 시스템이 제공된다. 시스템은 (a) PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 선택적으로 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소; 및 (b) PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터로서, 여기서 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않는 공여자 벡터를 포함하고, 여기서 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함한다. 시스템은 예를 들어, 유도성 프로모터와 함께 유도제의 사용을 통해서와 같이, 이중 벡터 시스템을 사용한 투약 후에 표적 세포 내의 천연 PCSK9가 제거되거나 감소되도록 하는 구성요소를 선택적으로 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 편집 구성요소는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 편집 벡터에 포함된다. 이중 벡터의 구성요소는 본원에 기술된 것과 같다.
유전자 편집 구성요소 대 공여자 벡터의 비가 약 1 대 약 1이면 시스템이 효과적일 수 있지만, 공여자 주형 벡터는 유전자 편집 구성요소를 초과하여 존재하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 편집 벡터(a) 대 공여체 벡터(b)의 비는 약 1:3 내지 약 1:100, 또는 약 1:10이다. 이러한 유전자 편집 효소(예: Cas9 또는 메가뉴클레아제) 대 공여자 주형의 비는 효소가 AAV 벡터 이외의 다른 공급원에 의해 추가로 또는 대안적으로 공급될지라도 유지될 수 있다.
한 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 메가뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 PCSK9를 표적으로 하는 메가뉴클레아제를 암호화하는 서열, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 게놈 편집 AAV 벡터; 및 (b) AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 SaCas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 게놈 편집 AAV; 및 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, U6 프로모터, PCSK9 유전자에서 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' IRT, U6 프로모터, PCSK9 유전자에서 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 Cas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 게놈 편집 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 시스템의 특정 실시양태에서, 유전자 편집 AAV 벡터 및 공여자 AAV 벡터는 동일한 AAV 캡시드를 갖는다. 다른 실시양태에서, 유전자 편집 AAV 벡터 및 공여자 AAV 벡터는 상이한 AAV 캡시드를 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV8, AAV9, rh10, AAV6.2, AAV3B, hu37, rh79, 및 rh64 중에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이고, Cas9는 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 중에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제 및/또는 이식유전자는 조직 특이적 프로모터의 제어하에 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 및/또는 이식유전자는 구성적 프로모터의 제어하에 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 및/또는 이식유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 및/또는 이식유전자는 간 특이적 프로모터, 선택적으로 인간 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터, 또는 하이브리드 간 프로모터(HLP)의 제어하에 있다. 특정 실시양태에서, 시스템은 유도제를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 시스템은 (a) PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 LNP에 캡슐화된 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소; 및 (b) LNP에 캡슐화된 PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터를 포함하며, 여기서 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않고, 시스템은 뉴클레아제를 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함한다. 시스템은 예를 들어 유도성 프로모터와 함께 유도제의 사용을 통해서와 같이, 이중 벡터 시스템을 사용한 투약 후에 표적 세포의 천연 PCSK9가 제거되거나 감소되도록 하는 구성요소를 선택적으로 포함한다.
다른 실시양태에서, 시스템은 (a) PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소로서, 여기서 유전자 편집 구성요소가 AAV 벡터를 통해 제공되는 것인, 유전자 편집 구성요소; 및 (b) LNP에 캡슐화된 PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터로서, 여기서 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호하지 않는 것인, 공여자 벡터를 포함하며, 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함한다. 시스템은 예를 들어 유도성 프로모터와 함께 유도제의 사용을 통해서와 같이, 이중 벡터 시스템을 사용한 투약 후에 표적 세포의 천연 PCSK9가 제거되거나 감소되도록 하는 구성요소를 선택적으로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 시스템은 (a) PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 LNP에 캡슐화된 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 구성요소; 및 (b) PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위한 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터로서, 여기서 공여자 벡터는 AAV 벡터인 것이고, 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않는 것인 공여자 벡터를 포함하고, 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적화하도록 지시하는 서열을 추가로 포함한다. 시스템은 예를 들어 유도성 프로모터와 함께 유도제의 사용을 통해서와 같이 이중 벡터 시스템을 사용한 투약 후에 표적 세포의 천연 PCSK9가 제거되거나 감소되도록 하는 구성요소를 선택적으로 포함한다.
한 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 (a) PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 메가뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 PCSK9를 표적으로 하는 메가뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 LNP; 및 (b) AAV 캡시드 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 (a) Cas9를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 및 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 포함하는 LNP로서, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인, LNP; 및 (b) AAV 캡시드, 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암 및 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다. Cas9를 암호화하는 서열은 mRNA로서 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 이중 벡터 시스템은 AAV 캡시드 및 5' ITR, U6 프로모터, PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 Cas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드, 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터를 포함한다.
약제학적 조성물
또 다른 측면에서, PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 유전자 편집 벡터를 포함하는 제1 rAAV 스톡(stock); 및 이식유전자를 암호화하는 핵산 서열 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 이식유전자 카세트를 포함하는 rAAV 공여체 벡터를 포함하는 제2 rAAV 스톡을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 선택적인 담체, 부형제 및/또는 보존제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 공여자 벡터는 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAVrh79 캡시드이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAVrh.90 캡시드이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAVhu.37 캡시드이다. 한 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 한 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAVrh.91 캡시드이다. 한 실시양태에서, 공여자 벡터, 유전자 편집 벡터, 또는 둘 모두에 대한 AAV 캡시드는 AAVhu.68 캡시드이다.
본원에서 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분도 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이라는 문구는 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 이와 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 비히클은 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포에 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 벡터 게놈을 전달한 rAAV 벡터는 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노스피어, 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 전달을 위해 제형화될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 전달하기에 적합한 최종 제형을 포함하며, 예를 들어 생리학적으로 적합한 pH 및 염 농도로 완충된 수성 액체 현탁액이다. 선택적으로, 하나 이상의 계면활성제가 제형에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 대상체에 투여하기 위해 희석되는 농축물로서 운반될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 투여 시 동결건조되고 재구성될 수 있다.
제형을 제조하기 위한 관련 기술분야에 잘 알려진 방법 및 제제는 예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Company, 펜실베니아주 이스턴 소재]에 기재되어 있다. 제형은 예를 들어 부형제, 담체, 안정화제 또는 희석제, 예를 들어 멸균수, 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일 또는 수소화된 나프탈렌, 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질, 염화암모늄, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜탄올, 및 m-크레졸), 저분자량 폴리펩타이드, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 및 리신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 만노스 및 덱스트린, EDTA와 같은 킬레이트제, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예: Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
적합한 계면활성제 또는 계면활성제의 조합은 비독성인 비이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 1차 하이드록실 기로 종결되는 이작용기성 블록 공중합체 계면활성제, 예를 들어 폴록사머 188로도 알려져 있고 중성 pH를 가지며 평균 분자량이 8400인 Pluronic® F68 [BASF]이 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬이 측면에 있는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글리세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌글리콜이 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이러한 공중합체는 일반적으로 문자 "P"(폴록사머의 경우) 뒤에 세 자릿수로 명명된다: 처음 두 자릿수 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고 마지막 자릿수 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량의 백분율을 제공한다. 한 실시양태에서, 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다.
벡터는 세포를 형질감염시키고 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하여 과도한 부작용 없이 또는 의학적으로 허용되는 생리학적 효과(의학 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있음)를 갖는 치료적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 투여되고, 이는 의료 기술분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 원하는 기관(예: 간(선택적으로 간 동맥을 통해), 폐, 심장, 눈, 신장)으로의 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 척추강내, 기관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 및 기타 비경구 투여 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 투여 경로는 원한다면 조합될 수 있다.
바이러스 벡터의 투여량은 주로 치료되는 병태, 환자의 연령, 체중 및 건강과 같은 요인에 따라 달라지므로 환자마다 다를 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 치료적으로 효과적인 인간 투여량은 일반적으로 약 1 x 109 내지 1 x 1016 게놈 바이러스 벡터의 농도를 함유하는 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 내지 약 100 mL의 용액 범위이다. 투여량은 임의의 부작용에 대하여 치료적 이점의 균형을 이루도록 조정되며 이러한 투여량은 재조합 벡터가 사용되는 치료 적용에 따라 달라질 수 있다. 이식유전자 생성물의 발현 수준은 모니터링하여 바이러스 벡터, 바람직하게는 미니유전자를 함유하는 AAV 벡터를 초래하는 투여량 빈도를 결정할 수 있다. 선택적으로, 치료 목적을 위해 기술된 것과 유사한 투여 요법은 본 발명의 조성물을 사용한 면역화에 활용될 수 있다.
벡터 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 약 1.0 x 109 GC 내지 약 1.0 x 1016 GC 범위(체중이 70kg인 평균 대상체를 치료하기 위해), 및 바람직하게는 인간 환자의 경우 1.0 x 1012 GC 내지 1.0 x 1014 GC인 복제 결함 바이러스의 양을 함유하는 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109 또는 9x109 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010 또는 9x1010 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 또는 9x1011 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012 또는 9x1012 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013 또는 9x1013 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014 또는 9x1014 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 적어도 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015 또는 9x1015 GC를 함유하도록 제형화된다. 한 실시양태에서, 인간 적용의 경우 용량은 다음 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여, 용량당 1x1010 내지 약 1x1012 GC 범위일 수 있다.
이러한 상기 용량은 치료할 부위의 크기, 사용된 바이러스 역가, 투여 경로, 및 방법의 원하는 효과에 따라, 다음 범위 내의 모든 수를 포함하여, 약 25 내지 약 1000 마이크로리터, 또는 그 이상의 용량 범위의 담체, 부형제 또는 완충제 제형의 다양한 용량으로 투여될 수 있다.
임의의 적합한 투여 경로가 선택될 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들어 액체 용액 또는 현탁액의 형태(예를 들어, 정맥내 투여, 경구 투여 등)로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 고체 형태(예를 들어, 경구 투여용 정제 또는 캡슐 형태 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 분말, 점적제, 에어로졸 등의 형태일 수 있다.
한 측면에서, 본원에는 제형 완충액 중에 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 유전자 편집 벡터 및 적어도 하나의 공여자 벡터를 포함하는 적어도 파보바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 상이한 벡터 집단의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 제형 완충액 중에 본원에 기재된 단일 rAAV 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본원에 제공된 방법은 2개의 개별 벡터 함유 현탁액의 공동 투여를 제공한다.
방법
본원에 제공된 조성물은 간 대사 장애를 비롯한 다양한 유전적 장애의 치료에 유용하다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 치료하는 데 유용하다. 다른 실시양태에서, 조성물은 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하는 데 유용하다. 다른 실시양태에서, 조성물은 페닐케톤뇨증을 치료하는 데 유용하다.
치료될 수 있는 예시적인 간 질환 또는 장애로는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 담관염, 원발성 경화성 담관염, 혈색소증, 윌슨병, 알파-1 항트립신 결핍증, 간암, 담관암, 간 선종, 트랜스티레틴(TTR), 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9) 기반 질환 또는 장애, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가 장애로는 글리코겐 축적 질환 또는 결핍증 1A형(GSD1), PEPCK 결핍증, CDKL5 결핍증, 갈락토스혈증, 페닐케톤뇨증(PKU), 원발성 고옥살산뇨증 1형, 단풍당뇨증, 1형 티로신혈증, 메틸말론산혈증, 중쇄 아세틸 CoA 결핍증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증, 시트룰린혈증; 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 결핍증, 무메틸말론산혈증(MMA), 니만-픽병, 프로피온산혈증(PA); 가족성 고콜레스테롤혈증(FH), 치매, 지단백질 리파제 결핍증, 크리글러-나자르병, 중증 복합성 면역결핍 질환, 통풍 및 레쉬-니안 증후군, 바이오티미다제 결핍증, 파브리병, GM1 강글리오시드증, 윌슨병, 고셔병 2형 및 3형, 젤위거 증후군, 이염색성 백질이영양증, 크라베병, 폼페병, 니만픽병 A형, 아르기니노 숙신산뇨증, 성인 발병 제2형 시트룰린혈증, 요소 회로 장애; 파버 지방육아종증, 아스파르틸-글루코사민뇨증, 푸코시드증, 알파-만노시드증, 급성 간헐성 포르피린증(AIP), 알파-1 항트립신 결핍증(폐기종), 지중해빈혈 또는 신부전으로 인한 빈혈, 허혈성 질환, 예를 들어 죽상경화증, 혈전증 또는 색전증에서 볼 수 있는 폐색 혈관, 파킨슨병, 울혈성 심부전, 근이영양증, 및 당뇨병을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기술된 특정 방법에서, 천연 PCSK9 발현은 감소되거나 제거되고, 이식유전자는 천연 PCSK9 유전자좌에서의 삽입으로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 천연 PCSK9 발현은 감소되거나 제거되고, 이식유전자는 외인성으로, 즉 대상체의 게놈에 통합됨이 없이 발현된다.
본원에는 본원에 기술된 바와 같은 이중 벡터 시스템을 공동투여함으로써 인간의 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 대상체의 간 대사 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 PCSK9를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열 및 이식유전자를 포함하는 공여자 AAV 벡터를 간 대사 장애가 있는 대상체에게 공동 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 PCSK9를 표적화하는 sgRNA를 포함하는 LNP; 및 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열 및 이식유전자를 포함하는 공여자 AAV 벡터를 간 대사 장애가 있는 대상체에게 공동 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체는 신생아이다.
특정 실시양태에서, 유전자 편집 AAV 벡터 및 공여자 벡터는 동일한 경로를 통해 본질적으로 동시에 전달된다. 다른 실시양태에서, 유전자 편집 벡터가 먼저 전달된다. 다른 실시양태에서, 공여자 벡터가 먼저 전달된다.
한 실시양태에서, rAAV의 투여량은 용량당 약 1 x 109 GC 내지 약 1 x 1015 게놈 카피(GC)(체중이 70kg인 평균 대상체를 치료하기 위해), 바람직하게는 인간 환자의 경우 1.0 x 1012 GC 내지 2.0 x 1015 GC이다. 다른 실시양태에서, 용량은 대상체의 체중 1kg당 약 1 x 1014 GC 미만이다. 특정 실시양태에서, 환자에게 투여되는 용량은 대상체의 체중을 기준으로 적어도 약 1.0 x 109 GC/kg, 약 1.5 x 109 GC/kg, 약 2.0 x 109 GC/g, 약 2.5 x 109 GC/kg, 약 3.0 x 109 GC/kg, 약 3.5 x 109 GC/kg, 약 4.0 x 109 GC/kg, 약 4.5 x 109 GC/kg, 약 5.0 x 109 GC/kg, 약 5.5 x 109 GC/kg, 약 6.0 x 109 GC/kg, 약 6.5 x 109 GC/kg, 약 7.0 x 109 GC/kg, 약 7.5 x 109 GC/kg, 약 8.0 x 109 GC/kg, 약 8.5 x 109 GC/kg, 약 9.0 x 109 GC/kg, 약 9.5 x 109 GC/kg, 약 1.0 x 1010 GC/kg, 약 1.5 x 1010 GC/kg, 약 2.0 x 1010 GC/kg, 약 2.5 x 1010 GC/kg, 약 3.0 x 1010 GC/kg, 약 3.5 x 1010 GC/kg, 약 4.0 x 1010 GC/kg, 약 4.5 x 1010 GC/kg, 약 5.0 x 1010 GC/kg, 약 5.5 x 1010 GC/kg, 약 6.0 x 1010 GC/kg, 약 6.5 x 1010 GC/kg, 약 7.0 x 1010 GC/kg, 약 7.5 x 1010 GC/kg, 약 8.0 x 1010 GC/kg, 약 8.5 x 1010 GC/kg, 약 9.0 x 1010 GC/kg, 약 9.5 x 1010 GC/kg, 약 1.0 x 1011 GC/kg, 약 1.5 x 1011 GC/kg, 약 2.0 x 1011 GC/kg, 약 2.5 x 1011 GC/kg, 약 3.0 x 1011 GC/kg, 약 3.5 x 1011 GC/kg, 약 4.0 x 1011 GC/kg, 약 4.5 x 1011 GC/kg, 약 5.0 x 1011 GC/kg, 약 5.5 x 1011 GC/kg, 약 6.0 x 1011 GC/kg, 약 6.5 x 1011 GC/kg, 약 7.0 x 1011 GC/kg, 약 7.5 x 1011 GC/kg, 약 8.0 x 1011 GC/kg, 약 8.5 x 1011 GC/kg, 약 9.0 x 1011 GC/kg, 약 9.5 x 1011 GC/kg, 약 1.0 x 1012 GC/kg, 약 1.5 x 1012 GC/kg, 약 2.0 x 1012 GC/kg, 약 2.5 x 1012 GC/kg, 약 3.0 x 1012 GC/kg, 약 3.5 x 1012 GC/kg, 약 4.0 x 1012 GC/kg, 약 4.5 x 1012 GC/kg, 약 5.0 x 1012 GC/kg, 약 5.5 x 1012 GC/kg, 약 6.0 x 1012 GC/kg, 약 6.5 x 1012 GC/kg, 약 7.0 x 1012 GC/kg, 약 7.5 x 1012 GC/kg, 약 8.0 x 1012 GC/kg, 약 8.5 x 1012 GC/kg, 약 9.0 x 1012 GC/kg, 약 9.5 x 1012 GC/kg, 약 1.0 x 1013 GC/kg, 약 1.5 x 1013 GC/kg, 약 2.0 x 1013 GC/kg, 약 2.5 x 1013 GC/kg, 약 3.0 x 1013 GC/kg, 약 3.5 x 1013 GC/kg, 약 4.0 x 1013 GC/kg, 약 4.5 x 1013 GC/kg, 약 5.0 x 1013 GC/kg, 약 5.5 x 1013 GC/kg, 약 6.0 x 1013 GC/kg, 약 6.5 x 1013 GC/kg, 약 7.0 x 1013 GC/kg, 약 7.5 x 1013 GC/kg, 약 8.0 x 1013 GC/kg, 약 8.5 x 1013 GC/kg, 약 9.0 x 1013 GC/kg, 약 9.5 x 1013 GC/kg, 또는 약 1.0 x 1014 GC/kg이다.
본원에 기재된 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 적합한 질환의 다른 예는 가족성 고콜레스테롤혈증, 근이영양증, 낭포성 섬유증 및 희귀 또는 고아 질환이다. 이러한 희귀 질환의 예로는 특히 척수성 근위축증, 헌팅던병, 레트 증후군, 근위축성 측색경화증(ALS), 듀센형 근이영양증, 프리드리히 운동실조증, 척수소뇌실조증 2형(SCA2)/ALS, 프로그래눌린(PRGN)(전두측두엽 치매(FTD), 진행성 비달변성 실어증(PNFA), 및 의미 치매를 포함하는 비-알츠하이머성 뇌 변성과 연관됨)을 포함할 수 있다. 예를 들어, www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php;rarediseases.info.nih.gov/diseases을 참조한다. 본원에 기술된 이식유전자에 의해 나타나는 다른 질환도 본원에 기술된 방법을 사용하여 치료할 수 있다.
벡터는 세포를 형질감염시키고 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하여 과도한 부작용 없이 또는 의학적으로 허용되는 생리학적 효과에 의해 치료적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 투여되며, 이는 의료 기술분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 원하는 기관(예를 들어, 간(선택적으로, 간 동맥을 통해), 폐, 심장, 눈, 신장)으로의 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 척수강내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 및 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 원하는 경우 투여 경로는 조합될 수 있다.
본원에 기술된 시스템은 환자의 병태를 개선하기 위해 충분한 양의 기능성 효소 또는 단백질이 생성된다면, 치료적으로 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 건강한 환자의 5%만큼 낮은 유전자 발현 수준은 환자가 비-유전자 요법 접근법으로 치료될 수 있을 만큼 충분한 치료 효과를 제공할 것이다. 다른 실시양태에서, 유전자 발현 수준은 인간(또는 다른 수의학적 대상체)에서 관찰되는 정상 범위(수준)의 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%이다. 예를 들어, "기능성 효소"란 질환과 연관되지 않은 야생형 효소, 또는 천연 변이체 또는 이의 다형체의 생물학적 활성 수준의 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 대략 동일하거나 100% 초과를 제공하는 야생형 효소(예를 들어, OTCase)를 암호화하는 유전자를 의미한다. 보다 구체적으로, 이형접합성 환자는 효소 기능적 수준이 약 50% 이하만큼 낮을 수 있으므로, 효과적인 치료는 효소 활성을 "정상" 또는 비결핍 환자 범위 내의 수준으로 대체할 필요가 없을 수 있다. 유사하게, 검출 가능한 양의 효소가 없는 환자는 효소 기능을 100% 활성 수준 미만으로 전달함으로써 구제될 수 있으며 선택적으로 추가 치료를 후속적으로 받을 수 있다. 유전자 기능이 공여자 주형에 의해 전달되는 특정 실시양태에서, 환자는 "정상"의 건강한 대상체에서 발견되는 것보다 더 높은 수준을 발현할 수 있다. 유전자 발현의 감소가 요망되는 또 다른 실시양태에서, 20% 감소 내지 50% 감소, 또는 최대 약 100% 감소만큼이 원하는 이점을 제공할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 치료법은 다른 치료, 즉 대상체(환자)의 진단에 대한 치료 표준과 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 대상체에게 면역억제 공동요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 면역억제 공동요법은, 예를 들어 AAV 캡시드에 대한 중화 항체 수준이 바람직하지 않을 정도로 높게 검출되는 경우, 개시된 바와 같은 rAAV 또는 조성물의 전달 전에 시작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 공동요법은 예방 조치로서 rAAV의 전달 이전에 시작될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 치료 후 바람직하지 않은 면역 반응이 관찰되는 경우, rAAV 전달 후 면역억제 공동요법이 시작된다.
이러한 공동요법을 위한 면역억제제로는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물질, T 세포 저해제, 마크롤라이드(예: 라파마이신 또는 라팔로그), 및 세포증식억제제, 예를 들어 알킬화제, 항대사물질, 세포독성 항생제, 항체 또는 면역필린에 활성인 제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 면역 억제제는 프레드니솔론, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체-(CD25-) 또는 CD3-지향 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 아편유사제 또는 TNF-α(종양괴사인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역억제 요법은 rAAV 투여 0, 1, 2, 7일전 또는 그 이상의 이전에 시작하거나, 또는 rAAV 투여 후 0, 1, 2, 3, 7일 후 또는 그 이상의 이후에 시작될 수 있다. 이러한 치료법은 단일 약물(예: 프레드니솔론) 또는 2가지 이상의 약물(예: 프레드니솔론, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(예: 라파마이신))을 같은 날에 공동투여하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 후, 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 치료법은 필요에 따라 약 1주(7일), 2주, 3주, 약 60일 또는 그 이상 동안 지속될 수 있다. 특정 실시양태에서, 타크롤리무스가 없는 요법이 선택된다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 표준 OTC 치료법과의 공동 치료를 포함한다. OTC 결핍증의 치료는 주로 고암모니아혈증를 피하거나 고암모니아혈증 에피소드 동안 혈액에서 과도한 암모니아를 제거하기 위해 혈중 암모니아 수준을 식이 관리하는 데 중점을 둔다(NORD, 2021). OTC 결핍증이 있는 개체는 혈중 암모니아 수준을 제어하기 위해 단백질 섭취를 제한하는 식이 제약을 따른다. 식이 제약은 고암모니아혈증 에피소드를 촉발할 수 있는 과도한 단백질 섭취를 피하면서 적절한 성장을 보장하기에 충분한 단백질을 소비할 필요가 있는 영아에서는 신중하게 균형을 맞추어야 한다(Berry and Steiner, 2001). 이와 같이, 영아에게는 필수 아미노산이 보충된 고칼로리, 저단백질 식이를 마련한다. 고암모니아혈증 에피소드 시, 환자의 식이에서 모든 단백질은 24시간 동안 제거될 수 있다(NORD, 2021).
여러 가지 약물은 혈류에서 질소 제거를 자극하도록 설계된 것이다. 페닐부티르산 나트륨(부페닐)은 OTC 결핍증 환자의 만성 고암모니아혈증 치료용으로 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인되어 있다. 일단 대사되면 부페닐은 페닐아세테이트로 전환되고, 이는 글루타민과 접합하여 페닐아세틸글루타민을 형성하고, 이는 신장에 의해 배설되어 질소 배설을 위한 대안적 경로를 제공한다. 글리세롤 페닐부티레이트(Ravicti)는 또한 요소 회로 장애 환자의 만성 고암모니아혈증 치료용으로 FDA에 의해 승인되어 있다. 부페닐과 마찬가지로 라빅티(Ravicti)는 페닐아세테이트로 전환되고 동일한 질소 배설 메커니즘을 따른다(Lichter-Konecki 등, 1993; Gordon, 2003; Magellan, 2021). 마지막으로, 암모눌(Ammonul)(페닐아세트산 나트륨 및 벤조산나트륨)은 요소 회로 장애 환자의 급성 고암모니아혈증 치료를 위한 보조 요법으로 FDA에 의해 승인되어 있다. 암모눌의 페닐아세트산 나트륨 성분은 부페닐과 라빅티에 의해 생성된 페닐아세트산 대사산물과 동일한 질소 배설 메커니즘을 따른다. 암모눌의 벤조산나트륨 성분은 글리신과 접합하여 히푸르산을 형성하고, 이는 신장에 의해 배설되며 이 과정을 통해 질소를 제거한다. 벤조산나트륨은 또한 OTC 결핍증의 장기간 유지를 위한 경구 제제로도 제공되며 부작용이 더 적은 것으로 생각되어 부페닐 및 라빅티보다 종종 선호된다(Lichter-Konecki 등, 1993).
한 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 프로모터의 제어 하에 인간 PCSK9 유전자 내의 부위를 인식하는 메가뉴클레아제 암호 서열을 포함하는 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하여 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 결핍증이 있는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기술된 바와 같이 서열번호 17의 OTC 이식유전자, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 공유하는 서열을 운반하는 발현 카세트의 투여를 추가로 포함한다. 이러한 발현 카세트는 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다. 천연 인간 OTC 암호 서열은 서열번호 30에 제시되어 있다. 서열번호 17 및 서열번호 30은 약 75.89% 동일성을 공유한다.
또 다른 측면에서, 인간 PCSK9 유전자 내의 부위를 인식하는 Cas9 암호 서열 및 sgRNA를 포함하는 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하여 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 결핍증이 있는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 본원에 기술된 바와 같이 서열번호 17의 OTC 이식유전자, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 공유하는 서열을 운반하는 발현 카세트의 투여를 추가로 포함한다. 이러한 발현 카세트는 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다.
시험관 내에서 OTC 발현 및 활성 수준을 측정하기 위한 다양한 검정이 존재한다. 예를 들어, X Ye, 등, 1996 Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylase-deficient mice with adenoviral vectors. J Biol Chem 271:3639-3646) 참조, 또는 생체내. 예를 들어, OTC 효소 활성은 [1,2,3,4,5-13C5] 시트룰린(98% 13C)으로 정규화된 시트룰린의 형성을 검출하기 위해 액체 크로마토그래피 질량 분석 안정한 동위원소 희석 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 이 방법은 N-아세틸글루타메이트 신타제 활성의 검출을 위해 이전에 개발된 검정으로부터 개조되었다[Morizono H, 등, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4-11]. 신선한 동결 간 조각을 칭량하고 10mM HEPES, 0.5% Triton X-100, 2.0mM EDTA 및 0.5mM DTT를 함유한 완충액에서 잠시 균질화한다. 균질화 완충액의 부피를 조정하여 50 mg/ml 조직을 수득한다. 효소 활성은 50mM 트리스-아세테이트, 4mM 오르니틴, 5mM 카르바밀 포스페이트, pH 8.3에서 250μg 간 조직을 사용하여 측정한다. 효소 활성은 50mM 트리스-아세테이트 pH 8.3에 용해된 새로 제조된 50mM 카르바밀 포스페이트를 첨가하여 개시하고, 25℃에서 5분간 진행시킨 후, 동일한 양의 30% TCA 용액 중 5mM 13C5-시트룰린을 첨가하여 켄칭한다. 5분간 미세원심분리하여 잔해물을 분리하고, 상청액을 질량분석을 위해 바이알로 전달한다. 10μL의 샘플을 93% 용매 A(1L 물에 1ml 트리플루오로아세트산):7% 용매 B(1L의 1:9 물/아세토니트릴 중 1ml 트리플루오로아세트산)의 이동상을 사용하여 등용매 조건 하에 Agilent 1100 시리즈 LC-MS에 주입한다. 시트룰린[176.1 질량:전하 비율(m/z)] 및 13C5-시트룰린(181.1 m/z)에 해당하는 피크를 정량하고, 이들의 비를 각 검정과 함께 실행된 시트룰린의 표준 곡선에 대해 수득된 비와 비교한다. 샘플은 총 간 조직에 대해 또는 Bio-Rad 단백질 검정 키트(Bio-Rad, 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 결정된 단백질 농도에 대해 정규화된다. 간 생검을 필요로 하지 않는 다른 검정도 사용될 수 있다. 이러한 1가지 검정은 글루타민과 시트룰린의 비가 평가되는 혈장 아미노산 검정이고, 글루타민이 높고(>800 마이크로리터/리터), 시트룰린이 낮다면(예를 들어, 1 자릿수), 요소 회로 결함이 의심된다. 혈장 암모니아 수준이 측정될 수 있고, 리터당 약 100 마이크로몰의 농도는 OTCD를 나타낸다. 환자가 과호흡을 하는 경우 혈액 가스가 평가될 수 있다: OTCD에서는 호흡성 알칼리증이 자주 발생한다. 소변 내 오로트산, 예를 들어 크레아틴 밀리몰당 약 20 마이크로몰 초과는 알로퓨리놀 챌린지 테스트 후 소변 오로트산염이 상승되는 것과 같이, OTCD를 나타낸다. OTCD에 대한 진단 기준은 본원에 참고로 포함되는 문헌[Tuchman 등, 2008, Urea Cycle Disorders Consortium(UCDC) of the Rare Disease Clinical Research Network(RDCRN). Tuchman M, 등, Consortium of the Rare Diseases Clinical Research Network. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States. Mol Genet Metab. 2008;94:397-402]에 제시되어 있다. 또한, OTCD에 대한 현재 치료 표준에 대한 논의를 제공하는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK154378/을 참고한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은, 뉴클레아제 발현 카세트, 비-바이러스 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 약제학적 조성물 중 임의의 동일물은 환자의 유전자 편집을 위해 투여가능하다. 특정 실시양태에서, 방법은 비배아 유전자 편집에 유용하다. 특정 실시양태에서, 환자는 영아(예를 들어, 출생부터 약 9개월까지)이다. 특정 실시양태에서, 환자는 영아보다 나이가 많고, 예를 들어 12개월 이상이다.
본원에 사용된 "a", "an" 또는 "the"는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 예를 들어, "a" 세포는 단일 세포 또는 다수의 세포를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "특이성"은 인식 서열로 지칭되는 염기쌍의 특정 서열에서만 또는 인식 서열의 특정 세트에서만 이중 가닥 DNA 분자를 인식하고 절단하는 뉴클레아제의 능력을 의미한다. 인식 서열 세트는 특정 보존적 위치 또는 서열 모티프를 공유할 것이지만, 하나 이상의 위치에서 축퇴성일 수 있다. 매우 특이적인 뉴클레아제는 단 하나 또는 극소수의 인식 서열만을 절단할 수 있다. 특이성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
약어 "sc"는 자가 상보적(self-complementary)인 것을 의미한다. "자가-상보적 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 암호 영역이 분자내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 작제물을 지칭한다. 감염 시 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기 보다는, scAAV의 2개의 상보적인 절반이 회합하여 즉시 복제 및 전사가 가능한 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성할 것이다. 예를 들어, D M McCarty 등, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254를 참고한다. 자가-상보적 AAV는 예를 들어, 각각이 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 관심 유전자와 근접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열 둘 모두를 지칭한다.
핵산 서열 또는 단백질을 기술하기 위해 사용되는 용어 "외인성"은 핵산 또는 단백질이 염색체 또는 숙주 세포에 존재하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않음을 의미한다. 외인성 핵산 서열은 또한 동일한 발현 카세트 또는 숙주 세포로부터 유래되고 이에 삽입되지만, 비-자연 상태, 예를 들어 상이한 카피수 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에 존재하는 서열을 지칭한다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 사용되는 용어 "이종"은 단백질 또는 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합 생산되어 새로운 기능적 핵산을 만들기 위해 배열된 관련 없는 유전자의 2개 이상의 서열을 갖는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 핵산은 상이한 유전자로부터의 암호 서열의 발현을 지시하도록 배열된 하나의 유전자로부터의 프로모터를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터(예를 들어, 재조합 AAV)가 생산 플라스미드로부터 생산되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어 "숙주 세포"는 이식유전자의 발현이 요망되는 임의의 표적 세포를 지칭할 수 있다. 따라서, "숙주 세포"는 임의의 수단, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 형질전환, 바이러스 감염, 형질감염, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA 코팅 펠렛, 바이러스 감염 및 원형질체 융합에 의해 세포 내로 도입된 외인성 또는 이종 핵산 서열을 함유하는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. 본원의 특정 실시양태에서, 용어 "숙주 세포"는 본원에 기술된 조성물의 시험관내 평가를 위한 다양한 포유동물 종의 세포 배양물을 지칭한다. 본원의 다른 실시양태에서, 용어 "숙주 세포"는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스를 생성하고 패키징하는데 사용되는 세포를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "숙주 세포"는 본원에 기술된 질환 또는 병태에 대해 생체내에서 치료되는 대상체의 표적 세포를 언급하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, 용어 "숙주 세포"는 간 세포 또는 간세포이다.
"대상체"는 포유동물, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 또는 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이, 침팬지, 개코원숭이 또는 고릴라이다. 환자는 인간을 지칭한다. 수의학적 대상체는 비인간 포유동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 이들의 PCSK9 유전자에 결함을 갖지 않는다.
"복제 결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프에 패키징되어 있고, 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열도 복제 결손성인, 즉 자손 비리온을 생성할 수 없으나, 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유하는, 합성 또는 인공 바이러스 입자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호가 측면에 있는 관심 유전자만을 함유하는, "거틀리스(gutless)" 로 조작될 수 있음), 이 유전자들은 생산 중에 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소의 존재 없이는 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 발생할 수 없으므로 유전자 치료에 사용하기에 안전한 것으로 간주된다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성" "서열 동일성 %" 또는 "동일성 %"은 최대 일치성으로 정렬되었을 때 동일한 2개 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교 길이는 게놈의 전체 길이에 걸쳐 이루어질 수 있으며, 유전자 암호 서열의 전체 길이, 또는 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오타이드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편, 예를 들어 적어도 약 9개 뉴클레오타이드, 일반적으로 적어도 약 20 내지 24개 뉴클레오타이드, 적어도 약 28 내지 32개 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오타이드의 단편 간의 동일성도 바람직할 수 있다. 유사하게, "서열 동일성 %"는 단백질의 전체 길이, 또는 이의 단편에 걸쳐 있는 아미노산 서열에 대해 쉽게 결정될 수 있다. 적합하게는, 단편은 길이가 적어도 약 8개 아미노산이고, 최대 약 700개 아미노산일 수 있다. 적합한 단편의 예는 본원에 기술되어 있다.
아미노산 또는 이의 단편을 지칭할 때 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"이라는 용어는 적절한 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 다른 아미노산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%에서 아미노산 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 전체 길이의 서열, 또는 이의 단백질, 예를 들어 cap 단백질, rep 단백질 또는 이의 단편인 길이가 적어도 8개 아미노산, 또는 보다 바람직하게는 적어도 15개 아미노산에 대한 것이다. 적합한 단편의 예는 본원에 기술되어 있다.
"고도로 보존된"이라는 용어는 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 97% 초과의 동일성을 의미한다. 동일성은 관련 기술분야의 기술자에게 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 의거하여 관련 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 결정된다.
일반적으로, 2개의 상이한 아데노 연관 바이러스 간의 "동일성", "상동성" 또는 "유사성"을 지칭할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 기준 서열과 비교하여 누락되거나 추가된 염기 또는 아미노산에 대한 교정을 종종 함유하는 다중 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다. 예에서, AAV 정렬은 게시된 AAV9 서열을 기준점으로서 사용하여 수행된다. 정렬은 공개적으로 또는 상업적으로 이용 가능한 임의의 다양한 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 수행된다. 이러한 프로그램의 예로는 인터넷의 웹 서버를 통해 액세스할 수 있는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP" 및 "MEME"를 포함한다. 이러한 프로그램에 대한 기타 공급원은 관련 기술분야의 기술자에게 알려져 있다. 대안적으로, Vector NTI 유틸리티도 사용된다. 위에서 기술된 프로그램에 함유된 알고리즘을 포함하여 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 다수의 알고리즘도 관련 기술분야에 알려져 있다. 또 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™를 사용하여 비교할 수 있다. Fasta™는 질의(query) 서열과 검색 서열 사이에 최상의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 %를 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 간의 서열 동일성 %는 본원에 참고로 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 디폴트 매개변수(단어 크기 6 및 채점 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 Fasta™를 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 아미노산 서열에 대한 다수의 서열 정렬 프로그램, 예를 들어, "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" 및 "Match-Box" 프로그램도 이용 가능하다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것이 디폴트 설정에 사용되지만, 관련 기술분야의 기술자는 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 관련 기술분야의 기술자는 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것과 같은 동일성 또는 정렬 수준을 최소한 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 예를 들어, J. D. Thomson 등, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 기준 정수로부터 ±10%의 차이 및 그 사이의 값을 지칭한다. 예를 들어, "약" 40개의 염기쌍은 ±4(즉, 36 - 44, 여기에 정수 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44를 포함함)를 포함한다. 다른 값의 경우, 특히 백분율이 언급되는 경우(예: 90% 동일성, 약 10% 분산 또는 약 36% 미스매치), 용어 "약"은 정수와 분수를 모두 포함하는 범위 내의 모든 값을 포함한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치도 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "포함하는(comprosing)", "함유하는", "포함하는(including)" 및 이의 변형어는 다른 구성요소, 요소, 정수, 단계 등을 포함한다. 반대로, 용어 "구성되는" 및 이의 변형어는 다른 구성요소, 요소, 정수, 단계 등을 제외한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 기술자에 의해 그리고 관련 기술분야의 기술자에게 본 출원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공하는 공개된 텍스트를 참조하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
실시예
오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 결핍증은 높은 사망률과 연관된 X-연결 요소 순환 장애이다. 후기 발병 OTC 결핍증에 대한 유망한 치료일지라도, 아데노 연관 바이러스(AAV) 신생아 유전자 요법은 간세포 증식 중에 비통합 게놈이 상실되므로 단기적인 치료 효과만을 제공할 것이다. 게놈의 안전 항구에서 OTC 미니 유전자 카세트의 뉴클레아제 매개, 부위 특이적 통합은 OTC 결핍증 환자에게 장기적인 치료 이점을 제공할 것이다. 유전자 표적화를 위한 안전 항구 중 하나는 엑손 7 영역과 같은 PCSK9 유전자이다. 뉴클레아제는 PCSK9를 표적으로 하는 조작된 메가뉴클레아제(ARCUS2) 또는 PCSK9를 표적으로 하는 특이적 sgRNA를 갖는 CRISPR/Cas9일 수 있다. 공여자 벡터는 TBG 프로모터와 같은 간 특이적 프로모터, 코돈 최적화된 hOTC 암호 서열, 및 폴리 A 서열을 포함하는 미니 유전자를 함유한다. 뉴클레아제 및 공여자 주형은 둘 모두가 AAV 벡터(이중 AAV 벡터 시스템)에 의해 전달될 수 있다. 신생아 비인간 영장류(NHP)에서 이중 AAV 벡터의 단일 정맥 주사 후 12주째에 간세포의 12%에서 지속적인 이식유전자 발현 및 효율적인 유전자 표적화가 입증되었다. 공여자 벡터의 미니 유전자는 상동체 지정 재조합(HDR) 아암의 측면에 있다.
신생아 또는 영아일 때 이중 AAV 벡터의 단회 주사 후 치료 단백질을 발현하기 위한 PCSK9 유전자좌에 대한 생체내 뉴클레아제 매개 유전자 표적화가 NHP에서 처음으로 입증되었다. 인간/NHP PCSK9 유전자좌에 대한 유전자 표적화를 위한 OTC 미니 유전자를 함유한 공여자 벡터의 조성은 OTC 결핍증의 치료를 위한 임상에서 테스트되지 않았다. 본 발명자들은 유전자 표적화 효율에 대해 신생아 NHP에서, 그리고 효능에 대해 신생아 트랜스제닉 OTC 결핍 마우스에서 hOTC 공여자 벡터를 테스트할 것이다.
많은 대사 질환은 조기 개입 및 치료법을 필요로 한다; 그러나, AAV 매개 신생아 유전자 치료법은 신생아 단계의 빠른 간 증식 및 AAV 벡터의 비통합 본성으로 인해 불안정하다. 안전 항구에 치료 미니 유전자 카세트의 표적화된 통합은 치료 유전자를 게놈 수준에서 지속적으로 발현할 것이고 치료 효과는 세포 분열을 통해 유지될 것이다. OTC 결핍증과 같은 많은 대사 질환의 경우 임상적 이점을 위해 간에서의 충분한 형질도입 효율이 달성될 필요가 있다.
본 발명자들은 영아기에 치명적인 고암모니아혈증 에피소드를 유발할 수 있는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증(OTCD)의 치료를 위한 게놈 편집 접근법을 기술한다. 게놈 편집의 목표는 돌연변이와 관계없이 모든 OTCD 환자에서 치료 효과가 지속되고 달성되도록 하기 위한 것이다. 본 발명자들은 생존하는 신생아를 하나는 안전 항구 부위에서 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 뉴클레아제를 전달하는 것이고 다른 하나는 이 부위에 녹-인을 위한 OTC 미니유전자를 전달하는 것인 2개의 AAV 벡터를 이용하여 처리함으로써 이를 달성하는 것을 제안한다. 본 발명자들의 가정은 신생아 간의 간세포 분열이 OTC 유전자의 효율적인 녹-인에 도움이 될 것이며 희석을 통해 통합되지 않은 입력 벡터 게놈을 제거할 것이라는 것이다. 본 발명자들은 ARCUS를 AAV 전달한 후 PCSK9의 안전하고, 효율적이며 안정한 감소를 보여주는 성체 마카크에서 수행된 본 발명자들의 이전 작업에 기초하여, 안전 항구 부위로서 PCSK9 유전자 및 이를 표적화하기 위해 ARCUS라 불리는 메가뉴클레아제를 사용하기로 결정했다. OTCD를 위한 게놈 편집에 대한 본 발명자들의 초기 연구는 내인성 PCSK9 유전자의 엑손 7의 생식계열 변형을 통해 PCSK9 ARCUS 뉴클레아제에 민감해진 OTC 결핍 마우스에서 수행되었다. 신생아 마우스에 2개 벡터의 주입은 인간 OTC 미니유전자의 효율적인 녹-인 및 고단백질 식이로 챌린지될 때 치명적인 고암모니아혈증에 대한 보호를 초래했다. 임상 연구를 준비하면서 본 발명자들은 신생아 및 영아 마카크에서의 주요 안전성 및 효능 매개변수를 평가했다. 총 24마리의 동물을 3개월 및 12개월째 간 생검 검사를 포함하는 분석과 함께 AAV 벡터로 처리했다. 이 연구에서 본 발명자들은 편집 효율성 및 독성에 대한 다음 매개변수의 영향을 평가했다: 이식유전자(인간 인자 IX 및 인간 OTC), ARCUS를 유도하는 프로모터, Clade E 캡시드, 이식유전자 측면에 있는 공여자의 길이 및 투약 시 마카크의 연령. 본 발명자들은 최소 3개월 간의 생검 결과를 포함하는 16/24마리의 동물에 대한 예비 데이터를 여기에 보고한다. 본 발명자들은 AAV 벡터의 주사가 ARCUS 처리된 임의의 동물에서 트랜스아미나제 상승 또는 간 조직병리학의 어떠한 증거도 없이 꽤 안전하다는 것을 발견했다. 영장류 모델에서 효능에 대한 주요 척도는 인간 OTC mRNA 및 단백질을 각각 발현하는 세포를 검출하는 동일계내 하이브리드화 및 면역염색을 통해 측정한 형질도입 효율이다. 첫 번째 벡터에 TBG 프로모터로 ARCUS를 유도하는 새로운 클레이드 E 캡시드를 사용하는 벡터 및 공여자 벡터에 500bp 측면 상동성 아암을 사용하는 벡터를 통해 가장 높고 가장 일관된 결과를 수득했다. 이 조합을 통해 본 발명자들은 약 5% OTC 발현 세포인 환자에게 상당한 이점을 제공할 수 있을 것으로 여겨지는 임계값보다 높은 10.0 ± 6.4%(N=6) 형질도입을 달성했다. 예비 데이터는 편집 수준이 1년 넘게 안정적이고 최대 3개월까지 마카크에 주사했을 때 효율적인 표적 삽입이 달성될 수 있음을 시사한다. PCSK9 표적 유전자좌의 분자 분석은 벡터 게놈의 대다수의 녹-인이 상동성 지정 복구(HDR)보다는 비상동성 말단 결합(NHEJ)을 통해 이루어졌음을 시사했다. 요약하면, OTCD의 신생아 형태에 대한 실질적인 미충족 요구는 이 보고서에 기술된 바와 같은 게놈 편집과 같은 실험적 치료법의 고려를 보장한다.
실시예 1 - 재료 및 방법
재료 및 방법
AAV 벡터는 이전에 확립된 절차와 제조업체의 지침에 따라 작제했다. AAVhu37 캡시드는 표시되는 경우 본원에 기술된 실험에 사용되었다.
모든 동물 절차는 펜실베니아 대학교의 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행했다.
실시예 2 - 파일럿 연구: 신생아 NHP에서 ARCUS2 또는 SACAS9에 의한 PCSK9 유전자좌 내 HFIX 미니 유전자 녹-인
이 연구에서 본 발명자들은 신생아 비인간 영장류(NHP)에서 표적(PSK9) 상의 SaCas9 또는 ARCUS 매개 유전자 편집 및 hFIX 또는 OTC 미니 유전자 녹-인 효율성을 평가했다. 도 1은 엑손 7 내의 공여자 스플라이스 부위를 보여주는 rhPCSK9 유전자좌, 및 관심 공여자 주형, 예를 들어 hFIX, hOTC를 포함하는 HDR 공여자 벡터의 도식적 표현을 보여준다. 또한, 도 3a 내지 3c는 SaCas9- 또는 ARCUS-매개 유전자 교정을 위한 이중 AAV 벡터 시스템에 대한 도식적 표현을 보여준다. 도 3a는 ARCUS2-매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 AAVhu37-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열을 포함한다. 도 3b는 Sa-Cas9 매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템(트랜스; AAVhu37-SaCas9)에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 AAV.hu37.shRNA-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열을 포함한다. 도 3c는 Sa-Cas9 매개 유전자 교정을 위한 이중 AAVhu37 벡터 시스템(시스; AAVhu37.PCSK9-sgRN.SaCas9)에 대한 도식적 표현을 보여주며, 여기서 AAV.hu37-공여자 벡터는 hOTC 공여자 주형 서열을 포함한다.
유전자 편집 뉴클레아제 및 공여자 주형을 포함하는 전술한 이중 AAVhu37 벡터는 신생아 NHP에서 SaCas9 또는 ARCUS2에 의해 매개되는 PCSK9 유전자좌 내의 hFIX 미니 유전자 녹-인을 검사하는데 사용했다. 유전자 편집 AAVhu37 벡터는 1x1013 GC/kg의 용량으로 전달되었고, 공여자 주형 AAVhu37 벡터는 3x1013 GC/kg으로 전달되었다. 종합적으로, 3가지 치료 NHP 그룹이었다: 1) AAVhu37.EGFP 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX.U6.sgR; 2) AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX; 3) AAVhu37.SaCas9 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX.U6.sgR. 도 2는 신생아 NHP에서 ARCUS2 또는 SaCas9를 통해 PCSK9 유전자좌에 hFIX 미니 유전자 녹-인을 포함하는 파일럿 연구의 타임라인을 보여준다. 이 연구에서, NHP에게 0일째 주사했고, 혈액 샘플은 2-4주마다 수집했고(혈청 화학, 혈장 내 hFIX 발현, 혈청 내 PCSK9 수준, LDL 수준 및 중화 항체(NAb) 수준을 검사하기 위해), 1차 간 생검은 84일째 수행했다(벡터 게놈 수준, 유전자 발현 수준, 표적 상 및 표적외 편집 및 조직학을 검사하기 위해).
뉴클레아제 매개 유전자 표적화에 대한 생체내 테스트는 신생아 및 영아 NHP에서 수행했다. 동물에게 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.ARCUS2.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR 또는 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.SaCas9.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR.U6.sgR 또는 1x1013 GC/kg의 AAVhu37.GFP.WPRE 및 3x1013 GC/kg의 AAVhu37.hFIXco-HDR.U6.sgR을 도 4a, 4b 및 5g에 도시된 바와 같이 투여했다. 도 4c는 치료 후 0일부터 13개월까지 표시된 시점에서의 hFIX 수준을 보여준다(ng/mL로 플로팅됨). 도 4d는 치료 후 0일부터 12개월까지 표시된 시점에서의 PCSK9 수준을 보여준다(0일째 기준선의 백분율로 플로팅됨). 도 4e는 치료 후 0일부터 196일까지 표시된 시점에서의 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제) 수준을 보여준다(U/L로 플로팅됨). 도 4f는 치료 후 0일부터 196일까지 표시된 시점에서의 항-FIX IgG 수준을 보여준다(희석 인자인 1/희석으로 플로팅됨). 도 4g는 치료 후 0일부터 196일까지 표시된 시점에서의 PCSK9 수준을 보여준다(ng/mL로 플로팅됨). 도 4h는 치료 후 0일부터 196일까지 표시된 시점에서 측정된 체중을 보여준다(g로 플로팅됨). 도 5a는 영아 NHP에서 표시된 시점에서의 hFIX 수준을 보여준다(ng/mL로 플로팅됨). 도 5b는 영아 NHP에서 표시된 시점에서의 PCSK9 수준을 보여준다(0일째 기준선의 백분율로 플로팅됨). 도 5c는 영아 NHP에서 표시된 시점에서의 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제) 수준을 보여준다(U/L로 플로팅됨). 도 5d는 영아 NHP에서 표시된 시점에서의 항-FIX IgG 수준을 보여준다(희석 인자인 1/희석으로 플로팅됨). 도 5e는 영아 NHP에서 표시된 시점에서의 PCSK9 수준을 보여준다(ng/mL로 플로팅됨). 도 5f는 영아 NHP에서 표시된 시점에 측정된 체중을 보여준다(g로 플로팅됨). 도 5g는 도 4a - 도 5g에 기술된 실험으로부터의 데이터를 보여주는 요약 표이다. 도 5h는 테스트된 신생아 NHP와 영아 NHP 사이의 다양한 데이터의 비교를 보여준다.
도 6a 내지 6e는 NHP에서 치료 후 나타낸 일자에 수집된 간 생검 샘플에서의 벡터 형질도입(GC) 및 이식유전자 발현을 보여준다. 도 6a는 이배체 세포당 AAV 게놈 카피(GC)로 플로팅된 간 생검 샘플의 벡터 형질도입 수준을 보여준다. 도 6b는 간 생검 샘플에서 이식유전자 RNA의 상대적 발현을 보여준다. 도 6c는 간 생검에서 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용하는 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여준다. 도 6d는 형질도입의 정량화에 사용된 디지털화된 ISH 이미지를 보여준다. 도 6e는 ISH에 의해 정량화되고, 형질도입 %로 플로팅된 FIX 이식유전자의 형질도입 효율을 보여준다. 도 6f는 간의 게놈 카피를 보여준다. 두 시점 모두에서 신생아보다 영아(3x)에서 더 높은 FIXco GC가 관찰되었다. 1차 생검에서보다 2차 생검(1.5-2x)에서 FIXco GC가 감소했다. 도 6g는 간 생검에서의 이식유전자 mRNA를 보여준다. FIXco mRNA는 영아에서 3개월 내지 1년 사이에 안정적이었던 반면, FIXco mRNA는 신생아-처리 동물에서 3개월 내지 1년 사이에 3배 감소했다. 도 6h는 간 샘플에 대한 분자 분석 결과를 보여준다. 앰플리콘-seq로 측정된 indel 및 ITR-seq로 측정된 표적외를 보여준다. 또한, 366일째 동물 20-196에 대한 나노포어 긴 판독 seq의 결과가 제시된다. 판독의 0.6%는 양쪽에 HDR의 혼입을 보여주었다. 도 6i는 도 6 a-6h에 기술된 데이터의 요약표이다.
도 7a 내지 7l은 NHP에서 치료 후 84일째 수집된 간 생검에서 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용하는 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여주며; 다양한 배율의 뷰로 보여주었다(AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX로 처리된 NHP). 도 7a는 4x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 ARCUS를 보여준다. 도 7b는 4x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7c는 4x 배율로 관찰한, ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7d는 4x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다. 도 7e는 10x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 ARCUS를 보여준다. 도 7f는 10x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7g는 10x 배율로 관찰한, ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7h는 10x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다. 도 7i는 20x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 ARCUS 발현을 보여준다. 도 7j는 20x 배율로 관찰한 간 생검 중 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 7k는 20x 배율로 관찰한, ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 7l은 20x 배율로 관찰한 DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 ARCUS 및 hFIX를 보여준다. 벡터 형질도입(GC/이배체 게놈)의 요약은 아래 표 1에 제시된다.
도 8a 내지 8m은 NHP에서 치료 후 84일째 수집된 간 생검 중 FIX 및 ARCUS를 검출하기 위해 특정 프로브를 사용한 이중 동일계내 하이브리드화(ISH)를 보여주며; 다양한 배율의 뷰로 보여주었다(AAVhu37.EGFP 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX.U6.sgR로 처리된 NHP). 도 8a는 4x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 GFP-WRPE를 보여준다. 도 8b는 4x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8c는 4x 배율로 관찰한, ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8d는 4x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이된 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8e는 10x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 GFP-WRPE를 보여준다. 도 8f는 10x 배율로 관찰한, 간 생검 중 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8g는 10x 배율로 관찰한, ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8h는 10x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8I는 20x 배율로 관찰한 간 생검에서 ISH-검출된 GFP-WRPE 발현을 보여준다. 도 8J는 20x 배율로 관찰한 간 생검에서 ISH-검출된 hFIX를 보여준다. 도 8K는 20x 배율로 관찰한 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX의 오버레이 이미지를 보여준다. 도 8l은 20x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 도 8m은 미처리 대조군으로 20x 배율로 관찰한, DAPI(핵 염색)에 의한 오버레이 이미지로서 ISH-검출된 GFP-WRPE 및 hFIX를 보여준다. 벡터 형질도입(GC/이배체 게놈)의 요약은 아래 표 2에 제시된다.
도 9는 AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX로 처리된 NHP에서의 ARCUS 매개 표적 상의 편집을 보여준다. 치료 후 84일째, 간 생검 샘플을 수집하고, 존재하는 표적 영역 중 총 indel의 백분율을 계산했다. 또한, AAVhu37.ARCUS2 및 AAVhu37.Donor-HDR-hFIX로 처리된 NHP에서의 ARCUS 매개 표적 상의 편집. 치료 후 84일째 간 생검 샘플을 수집하고, 존재하는 표적 영역 중 총 indel의 빈도를 계산하고, 표적 대비 고유한 UMI OT 판독 빈도로서 플로팅했다. 앰플리콘 시퀀싱에 의해 정량화된 indel의 요약은 아래 표 3에 제시된다.
실시예 3 - 신생아 NHP에서의 ARCUS2 매개 HOTC 유전자 표적화
신생아(1-16일) 또는 영아(3-4개월) 리서스 마카크는 GLP 미준수의 POC 약리학 연구에 사용했다. M2PCSK9 메가뉴클레아제는 인간 및 리서스 마카크 PCSK9 유전자에 존재하는 22bp 서열을 표적으로 한다. 따라서, 리서스 마카크는 표적 상의 편집(약리학) 및 안전성/독성학을 평가하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 신생아 및 영아 리서스 마카크는 인간 영아와 유사한 해부학적 및 생리학적 특징을 갖고 있어 의도된 임상 ROA의 사용(IV)에 허용될 것이다. 해부학 및 ROA의 유사성은 대표적인 벡터 분포 및 형질도입 프로파일을 초래할 것으로 예상되며, 이는 테스트 물품의 약리학 및 독성, 예를 들어 표적상 및 표적외 편집, 및 이는 신생아 마우스에서는 불가능한 임상 병리학에 대한 더욱 정확한 평가를 가능하게 할 것이다.
이 연구에서는 신생아 NHP에게 ARCUS2 뉴클레아제 벡터, 및 다양한 길이의 HDR 아암, 즉 500 bp 아암 또는 짧은 HDR 아암을 갖는 공여자 벡터를 투여했다. 벡터 개략도는 도 11j에 도시된다. 도 12a는 이 실험으로부터의 데이터를 보여주는 요약 표이다. 모두 14마리의 신생아 마카크는 벡터 주입을 잘 견뎌냈고(즉, 명백한 임상적 후유증 없음) 시간이 지남에 따라 체중이 증가했다(도 11i). 간 효소 수준은 14일째에 일부 동물에서 ALT 수준의 일시적이고 적당한 상승을 제외하고는 정상 범위 내였다(도 11c).
투약 전 신생아로부터 수집한 0일째 혈장 샘플에 대한 분석은 3마리의 동물(21-111, 21-113, 21-122)이 AAVrh79에 대한 결합 항체의 높은 수준(≥ 400)을 갖고 있음을 보여주었다(도 11a). 이러한 기존 항-AAVrh79 항체는 AAV 유전자 전달을 차단할 것이다.
시간이 지남에 따라 공여자-전용 대조군 동물을 포함한 모든 신생아 동물에서 PCSK9 수준을 추적했다. 0일째 PCSK9 수준은 신생아마다 다양했다(도 11b). 공여자 전용 대조군 동물 1마리를 포함한 9마리의 동물은 벡터 투여 후 PCSK9 수준이 감소하는 경향을 보인 반면, 나머지 5마리의 동물은 투약 후 PCSK9 수준의 지속적 또는 일시적 상승을 보여주었다(도 11b).
84일째, 개복술을 통한 간 생검을 수행했다. 간에서 hOTC의 형질도입 효율은 이식유전자 mRNA를 검출하기 위해 hOTC- 및 M2PCSK9-특이적 프로브를 사용하는 이중 ISH에 의해, 그리고 인간 OTC 단백질을 검출하기 위해 OTC 면역형광에 의해 평가한 후, 스캔된 슬라이드에서 정량화했다(도 11d). 투약 시점에 기존의 항-AAVrh79 결합 항체를 지닌 3마리의 동물(21-111, 21-113 및 21-122)은 두 방법 모두에서 임의의 OTC 양성 간세포를 보여주었다. 2마리의 공여자 전용 대조군 동물은 낮은 수준(≤ 1%)의 hOTC 형질도입을 보여주었다. AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH 및 AAVrh79.rhHDR.TBG.hOTCco.bGH 공여자 벡터(G6)를 공동 투여 받은 2마리의 동물에서 가장 높은 형질도입 효율(OTC 면역형광에 의해 11.9 및 18.6%)이 검출되었다. 양성 hOTC 발현 간세포도 클러스터에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 수준은 약 5% OTC 발현 세포인, 실질적으로 혜택을 받은 환자의 임계값을 초과하는 것이다.
84일째 각 동물의 간 생검 샘플에 대한 분자 분석을 수행하여 이배체 게놈당 이식유전자 카피 수, mRNA 발현 수준, 표적 상의 편집 및 표적외 편집을 측정했다(도 11f). 형질도입 효율 분석과 일관되게, 그룹 6의 2마리 동물(21-157 및 21-175)은 가장 높은 hOTC 벡터 GC(도 11f), hOTC mRNA(도 12i) 및 표적 상의 indel%(도 11h)를 나타냈다. 동물의 M2PCSK9 벡터 GC는 hOTC 벡터 GC보다 2배 내지 7배 더 낮은 한편, M2PCSK9 mRNA 수준은 hOTC mRNA 수준보다 23배 및 765배 더 낮았다(도 11f 및 11g).
ITR-seq에 의해 평가된 표적외 활성은 본 연구의 84일째 간 생검 샘플에서 2 내지 40개의 잠재적 표적외 부위를 식별했다. 연구 2 및 연구 3에서 각각 hFIX 영아 및 hFIX 신생아 동물을 포함한, 다수의 동물에서 일부 표적외 부위가 검출되었다. 표적외 편집은 잠재적인 표적외 부위에 대한 앰플리콘-seq를 통해 추가로 특징지어질 것이다.
요약하면, 본 발명자들은 신생 마카크에 공동 투여될 때 투약 후 3개월째 간에서 12-18.6%의 형질도입 효율을 달성할 수 있는 M2PCSK9 벡터와 hOTCco 공여자 벡터의 조합을 식별했고, 이 둘 모두는 약 5% OTC 발현 간세포인, 실질적으로 혜택을 받은 환자의 임계값보다 높은 것이었다. 이 연구의 동물은 장기적인 효율성 및 안전성 평가에 대해 추적 중이다. 본 발명자들은 hOTC 형질도입의 안정성, 간의 조직병리학, 간의 표적상 및 표적외를 평가하기 위해 투약 후 1년째에 2차 간 생검을 수행할 것이다.
실시예 4 - PCSK9-HE7-KI 마우스 모델
인간 및 마카크 PCSK9 유전자의 M2PCSK9 표적화 서열은 뮤린 Pcsk9 유전자에 의해 보존되지 않으므로, 본 발명자들은 마우스의 게놈 유전자좌에서 게놈 편집을 위해 M2PCSK9를 사용할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 뮤린 Pcsk9 유전자의 엑손 7을 포함하는 영역을 엑손 7을 함유하는 인간 PCSK9 유전자의 영역으로 대체하는 녹-인 마우스 모델, 일명 PCSK9-hE7-KI 마우스를 생성하도록 잭슨 연구소에 의뢰했다(도 10a-10c). 이 모델은 생체내 게놈 편집 및 유전자 표적화 효율성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 본 발명자들은 PCSK9-hE7-KI 마우스를 털이 성긴 ash(spf ash ) 마우스와 교배했다. spf ash 마우스는 Otc 유전자의 엑손 4 끝에 있는 스플라이스 공여자 부위에 G에서 A로의 점 돌연변이를 갖고 있으며, 이로 인해 OTC mRNA의 비정상적인 스플라이싱 및 OTC mRNA 및 단백질 발현의 20배 감소가 초래된다(Hodges and Rosenberg, 1989). 병에 걸린 동물은 5-10%의 잔류 OTC 활성을 갖고 있으며 식사 식이로 생존할 수 있지만, 고단백질 식이인 경우에는 치명적일 수 있는 고암모니아증을 발생시킬 수 있다(Yang 등, 2016).
PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스 모델은 인간 OTC의 생체내 유전자 표적화 효능을 평가하고 표적화 효율 및 효능의 상관관계를 입증하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 신생아 마우스의 작은 크기로 인해, 혈액 임상 병리학 및 유전자 표적화의 임상 효능의 평가는 마우스가 젖을 뗀 후, 충분한 체중에 도달한 후, 그리고 최종 절차로서만 수행될 수 있다.
도 12는 265bp 서열의 서열 정렬이 PCSK9-hE7 녹-인 대립유전자의 인간 PCSK9 서열, 마우스 PCSK9(mPCSK9) 및 리서스 마카크 PCSK9(rhPCSK9)를 나타낸다는 것을 보여준다. 이 265bp 영역에는 인간과 리서스 마카크 서열 사이에 6개의 미스매치가 있다. 설치류와 영장류 서열은 다양한 LINE 및 LTR의 삽입으로 인해 이 창 외에서는 갈라진다. 인간과 마우스 간에는 엑손 7에 2개의 아미노산 차이가 존재한다. hE7-KI 마우스는 측정된 ELISA에 따르면 정상 수준의 mPCSK9를 발현하고 있다.
실시예 5 - PCSK9-HE7-KI.SPF ASH 새끼의 PCSK9 유전자좌를 표적으로 하는 생체내 OTC 유전자
진행 중인 이 비GLP 준수 약리학 연구는 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에서 인간 OTC 유전자의 M2PCSK9 메가뉴클레아제 매개 녹-인이, 의도된 임상 ROA(IV)를 통해 M2PCSK9 뉴클레아제 발현 벡터 및 인간 OTC 공여자 벡터의 단회 공동 투여 후 OTC 결핍증(간)을 치료하기 위한 표적 조직에서의 치료적 인간 OTC 발현을 달성할 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 한다. 실험 설계의 개략도는 도 14a에 도시되며, 투여량 그룹은 도 14b에 도시되어 있다.
0일째, 신생아(PND 1-2) 수컷 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에게 1.0 x 1013 GC/kg 용량의 M2PCSK9 메가뉴클레아제를 발현하는 AAVrh79 벡터(AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH)를 3.0 x 1013 GC/kg 용량의 3가지 다른 AAVrh79 hOTCco 공여자 벡터 중 하나와 조합으로 IV 공동 투여했다. 본 연구에서 평가된 M2PCSK9 메가뉴클레아제 발현 벡터(AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH)는 주요 임상 후보와 동일한 반면, 각각의 hOTCco 공여자 벡터는 HDR 아암을 제외하고는 주요 임상 후보와 동일했다. 구체적으로, 임상 후보는 인간 HDR 서열의 긴 버전(AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 포함하지만, 본 연구에서 평가된 hOTCco 공여자 벡터는 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH), 인간 HDR 서열의 더 짧은 버전(AAVrh79.shHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 포함하거나, 또는 HDR 서열을 포함하지 않았다(AAVrh79.TBG.hOTCco.bGH). 도 13은 인간, 녹-인 마우스 및 NHP 서열을 갖는 HDR 아암의 상동성을 비교한 것을 보여준다. 음성 대조군으로서, 추가적인 연령 매칭된 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에게 AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH와 조합으로 메가뉴클레아제를 발현하지 않는 AAVrh79 벡터(AAVrh79.TBG.PI.EGFP.WPRE.bGH)를 투여했다.
생애 평가에는 매일 수행되는 생존력 모니터링, 체중 측정, 고단백질 식이 챌린지 후 혈장 PCSK9, 및 혈장 NH3 및 소변 오로트산 수준의 평가, 및 2/3 부분 간절제술 후 인간 OTC 형질도입의 안정성을 평가하기 위한 120일째의 부분 간절제술을 수행했다. 49일 및 170일째, 각 코호트의 하위 그룹에 10일간 고단백질 식이를 챌린지한 후, 챌린지 종료 시 부검을 실시한다. 부검 시, 간을 수집하여 염색 및/또는 효소 활성 검정에 의해 평가되는 인간 OTC mRNA 발현(동일계내 하이브리드화), OTC 단백질 발현(면역염색), 및 OTC 효소 활성의 평가를 포함한, 인간 OTC 유전자의 녹-인을 평가한다. 간 DNA는 단리하여 표적 상의 편집(앰플리콘-seq, Oxford 나노포어 긴 판독 시퀀싱)을 평가하고 벡터 게놈 카피를 평가한다.
예비 결과는 mhHDR 아암을 갖는 벡터를 투여받은 마우스가 야생형 마우스와 동등한 생존을 나타냄을 보여주며, shHDR-처리된 마우스는 10일 고단백질 식이 챌린지 후 80% 생존율을 달성했다(도 14c). 모든 처리된 마우스는 KI-spf-ash 미처리 마우스보다 체중을 더 잘 유지했다(도 14d). mHDR-처리된 마우스의 혈장 암모니아 수준은 미처리 마우스와 비교하여 현저하게 감소되었다(도 14e).
mPCSK9 수준은 48일째 측정했고, 처리된 모든 마우스는 감소를 보여주었다(도 14f). indel 배율은 HDR 유형 전반에 걸쳐 상당히 일관되었다(도 14g). hOTC 수준은 shHDR 및 mhHDR로 처리된 마우스에서 증가되었다(도 14h).
실시예 6 - 신생아 리서스 마카크의 PCSK9 유전자좌를 표적으로 하는 생체내 OTC 유전자
진행 중인 이 GLP 미준수의 약리학 연구는 신생아 리서스 마카크에서 인간 OTC 유전자의 M2PCSK9 메가뉴클레아제 매개 녹-인이, 의도된 임상 ROA(IV)를 통해 M2PCSK9 뉴클레아제 발현 벡터 및 인간 OTC 공여자 벡터의 단회 공동 투여 후 OTC 결핍증(간)을 치료하기 위한 표적 조직에서의 치료적 인간 OTC 발현을 달성할 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 한다.
0일째에 신생아(1-16일령) 리서스 마카크에게 1.0 x 1013 GC/kg 용량의 M2PCSK9 메가뉴클레아제를 발현하는 2가지 다른 벡터 중 하나를 3.0 x 1013 GC/kg 용량의 2가지 다른 AAV hOTCco 공여자 벡터 중 하나와 조합으로 IV 공동 투여했다. 3.0 x 1013 GC/kg의 용량으로 AAV hOTCco 공여자 벡터만을 투여 받은 비-뉴클레아제 그룹은 공여자 전용 대조군으로서 포함되었다.
PCSK9 유전자를 표적으로 하는 AAV 벡터에 대해, 본 발명자들은 간에서 M2PCSK9를 발현하는 2가지 AAV 벡터 작제물을 비교했다. AAV.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH는 전체 길이의 TBG 프로모터 및 2개 카피의 인핸서 요소를 함유하며, WPRE는 짧고 약한 프로모터를 함유하는 AAV.TBG-S1-F113.PI.M2PCSK9.bGH보다 더 높은 수준의 뉴클레아제를 발현한다. hOTC 공여자 벡터에 대해, 본 발명자들은 hOTCco 이식유전자 카세트 측면에 있는 상동성 아암의 길이가 다른 2가지 AAV.hOTCco 공여자 벡터를 비교했다.
NHP는 0일째에 2가지 벡터를 IV 투여받았으며 생존율에 대해 매일 모니터링 받는 중이다. 생애 평가는 체중 측정, 혈액의 임상 병리학, 및 혈장의 유전자 편집 분석을 포함한다. 게놈 편집 효율, 벡터 게놈 카피, 이식유전자 발현, 조직병리학, 면역염색 및 RNA ISH 염색 분석을 위해 간 조직을 단리하기 위한 2회의 개복술 절차를 계획한다. NHP는 장기간 추적 관찰되며 부검될 것이며(날짜는 미정), 이때 게놈 편집 효율, 벡터 게놈 카피, 이식유전자 발현, 조직병리학, 면역염색 및 RNA ISH 염색 평가를 위해 간 및 기타 주요 기관의 조직이 수집될 것이다.
실시예 7 - PCSK9-HE7-KI.SPF ASH 새끼에서 효능 평가 및 벡터 비의 결정
계획된 이 GLP 미준수의 약리학 연구는 의도된 임상 ROA(IV)를 통해 M2PCSK9 뉴클레아제 발현 벡터 및 인간 OTC 공여자 벡터의 단회 공동 투여 후 OTC 결핍증(간)을 치료하기 위한 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에서 인간 OTC 유전자의 M2PCSK9 메가뉴클레아제 매개 녹-인의 가장 높은 효능을 달성하는 데 필요한 벡터 구성요소의 비를 평가하는 것을 목표로 한다.
0일째, 신생아(PND 1-2) 수컷 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에게 3가지 용량 중 하나의 M2PCSK9 메가뉴클레아제를 발현하는 AAVrh79 벡터(AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH)를 3가지 용량 중 하나의 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열을 포함하는 hOTCco 공여자 벡터와 조합으로 IV 공동 투여될 것이다. 본 연구에서 평가된 M2PCSK9 메가뉴클레아제 발현 벡터(AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bH)는 주요 임상 후보와 동일한 반면, hOTCco 공여자 벡터는 HDR 아암을 제외하고는 임상 후보와 동일하다. 구체적으로, 임상 후보는 인간 HDR 서열의 긴 버전(AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 포함하지만, 본 연구에서 평가된 hOTCco 공여자 벡터는 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 포함했다.
이 연구에서 공여자 벡터 내 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 선택하여 공여자 서열이 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스의 서열과 전적으로 상동성인 이 접근법의 약리학을 평가할 수 있었다.
생애 평가는 매일 수행되는 생존력 모니터링, 체중 측정, 고단백질 식이 챌린지 후 혈장 NH3 및 소변 오로트산 수준의 평가를 포함한다. 81일째, 마우스는 10일간 고단백질 식이가 챌린지되고, 이어서 챌린지 종료 시 부검될 것이다. 부검 시, 간을 수집하여 염색 및/또는 효소 활성 검정에 의해 평가되는 인간 OTC mRNA 발현(동일계내 하이브리드화), OTC 단백질 발현(면역염색), 및 OTC 효소 활성의 평가를 포함하여 인간 OTC 유전자의 녹-인이 평가될 것이다. 간 DNA는 또한 단리되어 표적 상의 편집(앰플리콘-seq)이 평가되고 벡터 게놈 카피가 평가될 것이다.
실시예 8 - PCSK9-HE7-KI.SPF ASH 새끼에서의 효능 평가 및 최소 유효 용량 결정
이 계획된 GLP 준수 약리학 연구는 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스 모델에서 IV 투여된 AAV의 효능을 평가하고 MED를 결정하는 것을 목표로 한다. M2PCSK9 메가뉴클레아제를 발현하는 AAVrh79 벡터(AAVrh79.TBG.PI.M2PCSK9.WPRE.bGH)는 계획된 GLP 준수 독성학 연구를 위해 제조될 독성학 벡터 로트일 것이다. 인간 HDR 서열의 긴 버전(AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH)을 포함하는 테스트 물품을 활용하는 대신, 이 연구에서는 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열을 포함하는 hOTCco 공여자 벡터(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH)를 활용할 것이다. 이 벡터는 임상 후보의 독성학적 벡터 로트와 비슷한 방법으로 제조될 것이다.
본 발명자들은 공여자 서열이 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스의 서열과 전적으로 상동성인 이 접근법의 약리학을 효과적으로 연구할 수 있도록 이 연구를 위해 공여자 벡터(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH) 내에 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열을 사용하기로 선택했다.
이 연구는 N=60 신생아(PND 1-2)의 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스 및 N=15 연령-매칭된 수컷 PCSK9-hE7-KI.WT(야생형)를 대조군으로 평가할 것이다. 연구는 1회 부검 시점(90일)을 포함할 것이다. 효능 평가를 위해, 마우스는 81일부터 90일까지 10일간 고단백질 식이로 챌린지될 것이다. 생존율, 신체 상태 및 바이오마커 변화가 평가될 것이다. AAV의 3가지 용량 수준은 IV 투여를 사용하여 평가될 것다. 용량 수준은 이전 비임상 연구에서 평가된 용량 범위에 기초하여 선택될 것이다. 평가된 용량 수준은 예상되는 임상 용량을 포함할 것이다.
생애 평가는 일일 생존율 검사, 생존 모니터링, 체중 측정, 고단백질 식이 챌린지 후 혈청 PCSK9 수준, 혈장 NH3 및 소변 오로트산 수준의 평가를 포함할 것이다. 부검은 90일에 수행될 것이다. 부검 시, CBC/감별 및 혈청 임상 화학 분석을 위해 혈액을 수집할 것이다. 조직병리학적 평가를 위해 조직 목록이 수집될 것이다. 간은 인간 OTC mRNA 발현(동일계내 하이브리드화), OTC 단백질 발현(면역염색), 및 염색 및/또는 효소 활성 분석으로 평가한 OTC 효소 활성 평가를 포함한, 인간 OTC 유전자의 녹-인을 평가하기 위해 수집될 것이다. 또한, 간 DNA가 단리되어 표적 상의 편집(앰플리콘-seq)이 평가되고 벡터 게놈 카피가 평가될 것이다.
MED는 고단백질 식이 후 생존율 분석, 고단백질 식이 챌린지 종료 시 혈장 NH3 수준, 인간 OTC mRNA 및 단백질 발현, OTC 효소 활성, 및 비히클 처리된 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 대조 마우스와 비교하여 AAV 처리된 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 의 표적 상의 편집에 기초하여 결정될 것이다.
실시예 9 - PCSK9-HE7-KI.SPF ASH 새끼의 독성학 연구
IV 공동 투여 후 테스트 물품의 안전성, 내약성, 약리학 및 약동학을 조사하기 위해 신생아(PND 1-2) PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에서 6개월 GLP 준수 안전성 연구가 수행될 것이다. 표적 상의 편집, 표적외 편집, 이식유전자 발현 및 조직병리학적 분석을 포함한 중간 분석은 60일 및 180일에 수행될 것인데, 이러한 시점들은 투여 후 뉴클레아제 의존적 유전자 삽입이 안정한 고원 수준에 도달하기에 충분한 시간을 허용할 것이다. 신생아 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스는 테스트 물품의 3가지 용량 수준(1.0 x 1012 GC/kg 뉴클레아제 벡터 및 3.0 x 1012 GC/kg 공여자 벡터, 3.3 x 1012 GC/kg 뉴클레아제 벡터 및 1.0 x 1013 GC/kg 공여자 벡터 또는 1.0 x 1013 GC/kg 뉴클레아제 벡터 및 3.0 x 1013 GC/kg; 용량당 N=20) 중 하나 또는 비히클(인산염 완충 식염수[PBS]; N=20)을 투여 받을 것이다. 테스트 물품 또는 비히클 투여 후, 생애 평가는 고통 및 비정상적인 행동의 징후, 체중 측정, 및 혈액 임상 혈청 화학(구체적으로 ALT, AST 및 총 빌리루빈)에 대해 매일 모니터링하는 임상 관찰을 포함할 것이다.
테스트 물품 투여 후 60일째에, 코호트 1, 3, 5, 및 7은 안락사될 것이고 조직병리학적 분석이 뇌, 척수, 심장, 간, 비장, 신장, 폐, 생식 기관, 부신 및 림프절을 포함하지한, 이에 제한되지 않는 조직의 포괄적인 목록에 대해 수행될 것이다. 기관은 적절한 경우 칭량될 것이다.
간 샘플은 수집되어 앰플리콘-seq 및 AMP-seq에 의해 표적 상의 편집, ITR-seq 및 앰플리콘-seq에 의해 표적외 편집, 벡터 생체분포, 및 이식유전자 발현에 대해 분석될 것이다. 간 샘플에서, 생체분포는 PCR에 의해 평가될 것이고 메가뉴클레아제 RNA 발현은 수행될 RT-PCR에 의해 분석될 것이다. 고도로 관류된 기관은 메가뉴클레아제 RNA에 대해 분석되고 메가뉴클레아제 RNA의 검출 가능한 발현을 갖는 조직은 앰플리콘-seq에 의해 표적 상의 편집에 대해 평가될 것이다. 검출가능한 표적 상의 편집을 갖는 조직은 표적외 편집에 대해 추가로 평가될 것이다.
벡터 생체분포를 위해, 이중 벡터인 M2PCSK9 및 hOTCco의 이식유전자에 특이적인 qPCR 검출이 개발될 것이다. 검정의 효율성, 선형성, 정밀도, 재현성 및 검출 한계는 표적 서열의 대리로서 AAV 시스 플라스미드를 사용하여 평가될 것이다. 검정의 정량 하한(LLOQ)은 테스트 조직 또는 배설물에 대한 검정을 개시하기 전에 결정될 것이다. 이식유전자 특이적 검정을 이전에 수행된 적격성 연구에 가교시키기 위해 적격성 계획이 시행될 것이다. 테스트된 매트릭스에는 생체분포에 대한 의도된 표적인 간을 포함할 것이다. 매트릭스 효과는 생체분포 연구 과정에서 테스트된 모든 샘플에서 스파이크된 표적 대조군의 회수, 뿐만 아니라 이전에 수행된 적격성 연구에서 제외된 데이터에 기초하여 추가로 평가될 것이다.
실시예 10 - PCSK9-HE7-KI.LDLR - /LDLR - .APOBEC - /APOBEC - 새끼(HOFH 모델)에서 SACAS9에 의한 PCSK9 유전자좌 내 HLDLR 미니 유전자 녹-인
이 연구는 신생아 PCSK9-hE7-KI.ldlr - /ldlr - .apobec - /apobec 마우스에서 인간 LDLR 유전자의 Cas9 매개 녹-인이, 의도된 임상 ROA(IV)를 통해 SaCas9 뉴클레아제-발현 벡터 및 인간 LDLR 공여자 벡터의 단회 공동 투여 후, 가족성 고콜레스테롤혈증(간)의 치료를 위해 표적 조직 내 치료적 인간 LDLR 발현을 달성할 수 있는지 여부를 목표로 한다. 마우스 모델은 도 15의 실험 설계를 사용하여 생성하였다. 마우스 모델에서 마우스 PCSK9 엑손 7은 SaCas9 표적화 서열을 함유하는 인간 PCSK9 엑손 7로 대체된다.
0일째, 신생아 PCSK9-hE7-KI.ldlr - /ldlr - .apobec - /apobec 마우스에게 1.0 x 1013 GC/kg 용량의 Cas9를 발현하는 AAVrh79 벡터(AAVrh79.U6.sgR3.PSCK9.APB2.HLP.SaCas9.bGH)를 3.0 x 1013 GC/kg 용량의 2가지 다른 AAVrh79 hLDLR 공여자 벡터 중 하나와 조합으로 IV 공동투여했다. 사용된 벡터를 보여주는 개략도는 도 16에 도시되어 있다. 구체적으로, 이 연구에서 평가된 공여자 벡터 중 하나는 마우스-인간 하이브리드 HDR 서열(AAVrh79.mhHDR.hLDLR011)을 포함했고 다른 하나는 인간 HDR 서열의 더 짧은 버전(AAVrh79.shHDR.hLDLR011)을 포함했다. 음성 대조군으로서, 추가 연령-매칭된 PCSK9-hE7-KI.spf ash 마우스에게 AAVrh79.shHDR.hLDLR011과 조합으로, saCas9를 발현하지 않는 AAVrh79 벡터를 투여했다.
생애 평가는 매일 수행된 생존율 모니터링 및 42, 63, 90, 120, 및 150일째 혈청 LDL-c 수준의 평가를 포함한다. 인간 LDLR 형질도입의 안정성을 평가하기 위해 63일째 부분 간절제술 및 150일째 부검. 부검 시, 인간 LDLR mRNA 발현(동일계내 하이브리드화), LDLR 단백질 발현(면역염색) 평가를 포함하여 인간 LDLR 유전자의 녹-인을 평가하기 위해 간을 수집한다. 간 DNA는 단리하여 표적 상의 편집(앰플리콘-seq, Oxford 나노포어 긴 판독 시퀀싱)을 평가하고 벡터 게놈 카피를 평가한다. 실험 설계는 도 17에 도시된다.
예비 결과는 saCas9 및 공여자 벡터가 투약된 마우스가 상당히 감소된 혈청 LDL 수준을 나타냈음을 보여준다. 2/3 부분 간 절제술 후 LDL의 변화는 없었으며 이는 안정적인 통합을 나타낸다(도 18a). indel은 mhHDR 및 shHDR 공여자 벡터의 사용 시 일관되었다(도 18b). 63일째, shHDR 처리된 마우스는 약간 더 높은 hLDLR 수준을 보인 반면(도 18c), mhHDR 및 shHDR(saCas9 보유) 벡터의 경우 혈청 LDL 수준은 유사했다(도 18d).
도 19는 부분 간 절제술 후 63일째 간에서의 hLDLR 발현의 면역조직화학 평가를 보여준다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참고로 본원에 포함되며, 본 명세서와 함께 제출된 서열 목록의 서열 및 텍스트도 참고로 포함된다. 2021년 4월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/180,603호, 2021년 9월 9일자로 출원된 제63/242,474호, 2021년 9월 14일자로 출원된 제63/244,205호, 2022년 1월 21일자로 출원된 제63/301,933호, 2022년 4월 15일자로 출원된 제63/331,385호는 각각 그 전체가 참고로 포함된다. 본 발명은 특정 실시양태를 참조로 하여 기술되었지만, 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 수정은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR IN VIVO NUCLEASE-MEDIATED GENE TARGETING FOR THE TREATMENT OF GENETIC DISORDERS <130> UPN-21-9650.PCT <150> 63/180,603 <151> 2021-04-27 <150> 63/242,474 <151> 2021-09-09 <150> 63/244,205 <151> 2021-09-14 <150> 63/301,933 <151> 2022-01-21 <150> 63/331,385 <151> 2022-04-15 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> production plasmid U6.sgR.PCSK9.ABP2.TBG-S1.hSaCas9(pX601+3NLS).bGH <220> <221> LTR <222> (1)..(168) <223> AAV ITR <220> <221> terminator <222> (193)..(199) <223> U6 terminator <220> <221> misc_feature <222> (199)..(275) <223> gRNA scaffold <220> <221> misc_feature <222> (276)..(295) <223> PCSK9 sgRNA <220> <221> promoter <222> (297)..(545) <223> U6 promoter <220> <221> enhancer <222> (557)..(656) <223> alpha mic/bik enhancer <220> <221> enhancer <222> (663)..(762) <223> alpha mic/bik enhancer <220> <221> promoter <222> (777)..(952) <223> TBG-S1 <220> <221> misc_feature <222> (956)..(958) <223> Stop codon mutation <220> <221> misc_feature <222> (973)..(1017) <223> SV40 NLS <220> <221> primer_bind <222> (1160)..(1179) <223> SA2-Seq1 <220> <221> primer_bind <222> (1647)..(1666) <223> SA2-Seq2 <220> <221> primer_bind <222> (2170)..(2189) <223> SA2-Seq3 <220> <221> primer_bind <222> (2680)..(2700) <223> SA2-Seq4 <220> <221> primer_bind <222> (3130)..(3149) <223> SA2-Seq5 <220> <221> misc_feature <222> (4174)..(4221) <223> NLS <220> <221> polyA_signal <222> (4233)..(4435) <223> bGH poly A <220> <221> LTR <222> (4456)..(4619) <223> AAV ITR <220> <221> misc_feature <222> (5382)..(6239) <223> Amp-R <220> <221> misc_feature <222> (6413)..(7001) <223> Origin <400> 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta aggctatttc 180 tagctctaaa acaaaaaaat ctcgccaaca 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agcaggaaga aaacagcaag 2760 aagggcaacc ggaccccatt ccagtacctg agcagcagcg acagcaagat cagctacgaa 2820 accttcaaga agcacatcct gaatctggcc aagggcaagg gcagaatcag caagaccaag 2880 aaagagtatc tgctggaaga acgggacatc aacaggttct ccgtgcagaa agacttcatc 2940 aaccggaacc tggtggatac cagatacgcc accagaggcc tgatgaacct gctgcggagc 3000 tacttcagag tgaacaacct ggacgtgaaa gtgaagtcca tcaatggcgg cttcaccagc 3060 tttctgcggc ggaagtggaa gtttaagaaa gagcggaaca aggggtacaa gcaccacgcc 3120 gaggacgccc tgatcattgc caacgccgat ttcatcttca aagagtggaa gaaactggac 3180 aaggccaaaa aagtgatgga aaaccagatg ttcgaggaaa agcaggccga gagcatgccc 3240 gagatcgaaa ccgagcagga gtacaaagag atcttcatca ccccccacca gatcaagcac 3300 attaaggact tcaaggacta caagtacagc caccgggtgg acaagaagcc taatagagag 3360 ctgattaacg acaccctgta ctccacccgg aaggacgaca agggcaacac cctgatcgtg 3420 aacaatctga acggcctgta cgacaaggac aatgacaagc tgaaaaagct gatcaacaag 3480 agccccgaaa agctgctgat gtaccaccac gacccccaga cctaccagaa actgaagctg 3540 attatggaac agtacggcga cgagaagaat cccctgtaca agtactacga ggaaaccggg 3600 aactacctga ccaagtactc caaaaaggac aacggccccg tgatcaagaa gattaagtat 3660 tacggcaaca aactgaacgc ccatctggac atcaccgacg actaccccaa cagcagaaac 3720 aaggtcgtga agctgtccct gaagccctac agattcgacg tgtacctgga caatggcgtg 3780 tacaagttcg tgaccgtgaa gaatctggat gtgatcaaaa aagaaaacta ctacgaagtg 3840 aatagcaagt gctatgagga agctaagaag ctgaagaaga tcagcaacca ggccgagttt 3900 atcgcctcct tctacaacaa cgatctgatc aagatcaacg gcgagctgta tagagtgatc 3960 ggcgtgaaca acgacctgct gaaccggatc gaagtgaaca tgatcgacat cacctaccgc 4020 gagtacctgg aaaacatgaa cgacaagagg ccccccagga tcattaagac aatcgcctcc 4080 aagacccaga gcattaagaa gtacagcaca gacattctgg gcaacctgta tgaagtgaaa 4140 tctaagaagc accctcagat catcaaaaag ggcaaaaggc ctgctgccac caaaaaggcc 4200 ggccaggcaa aaaagaaaaa gtaatgacta gtgcctcgac tgtgccttct agttgccagc 4260 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 4320 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 4380 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 4440 ctggggactc gagtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta 4500 gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4560 aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 4620 cttaattaac ctaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 4680 gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 4740 gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg 4800 ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 4860 cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 4920 gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 4980 ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 5040 ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 5100 ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 5160 attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 5220 aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 5280 gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 5340 aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 5400 gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 5460 cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 5520 tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 5580 tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 5640 agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 5700 cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 5760 tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 5820 ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 5880 tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 5940 cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 6000 actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 6060 ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 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ccacctctga cttgagcgtc 6960 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 7020 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 7080 ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 7140 gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 7200 cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 7260 ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc 7320 aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 7380 ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccagatt taattaagg 7429 <210> 2 <211> 4619 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector genome U6.sgR.PCSK9.ABP2.TBG-S1.hSaCas9(pX601+3NLS).bGH <220> <221> LTR <222> (1)..(168) <223> AAV ITR <220> <221> terminator <222> (193)..(199) <223> U6 Terminator <220> <221> misc_feature <222> (199)..(275) <223> shRNA scaffold <220> <221> misc_feature <222> (276)..(295) <223> PCSK9 sgRNA <220> <221> promoter <222> (297)..(545) <223> U6 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ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta aggctatttc 180 tagctctaaa acaaaaaaat ctcgccaaca agttgacgag ataaacacgg cattttgcct 240 tgttttagta gattctgttt ccagagtact aaaacgggac tttggggacc aacttcggtg 300 tttcgtcctt tccacaagat atataaagcc aagaaatcga aatactttca agttacggta 360 agcatatgat agtccatttt aaaacataat tttaaaactg caaactaccc aagaaattat 420 tactttctac gtcacgtatt ttgtactaat atctttgtgt ttacagtcaa attaattcca 480 attatctctc taacagcctt gtatcgtata tgcaaatatg aaggaatcat gggaaatagg 540 ccctccttaa gctagcaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg 600 cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat 660 ccaggttaat ttttaaaaag cagtcaaaag tccaagtggc ccttggcagc atttactctc 720 tctgtttgct ctggttaata atctcaggag cacaaacatt ccagatccgg cgcgccactc 780 aaagttcaaa ccttatcatt ttttgctttg ttcctcttgg ccttggtttt gtacatcagc 840 tttgaaaata ccatcccagg gttaatgctg gggttaattt ataactaaga gtgctctagt 900 tttgcaatac aggacatgct ataaaaatgg aaagatgttg ctttctgaga gacagtgacc 960 gccacc atg gcc cca aag aag aag cgg aag gtc ggt atc cac gga gtc 1008 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val 1 5 10 cca gca gcc aag cgg aac tac atc ctg ggc ctg gac atc ggc atc acc 1056 Pro Ala Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr 15 20 25 30 agc gtg ggc tac ggc atc atc gac tac gag aca cgg gac gtg atc gat 1104 Ser Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp 35 40 45 gcc ggc gtg cgg ctg ttc aaa gag gcc aac gtg gaa aac aac gag ggc 1152 Ala Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly 50 55 60 agg cgg agc aag aga ggc gcc aga agg ctg aag cgg cgg agg cgg cat 1200 Arg Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His 65 70 75 aga atc cag aga gtg aag aag ctg ctg ttc gac tac aac ctg ctg acc 1248 Arg Ile Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr 80 85 90 gac cac agc gag ctg agc ggc atc aac ccc tac gag gcc aga gtg aag 1296 Asp His Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys 95 100 105 110 ggc ctg agc cag aag ctg agc gag gaa gag ttc tct gcc gcc ctg ctg 1344 Gly Leu Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu 115 120 125 cac ctg gcc aag aga aga ggc gtg cac aac gtg aac gag gtg gaa gag 1392 His Leu Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu 130 135 140 gac acc ggc aac gag ctg tcc acc aaa gag cag atc agc cgg aac agc 1440 Asp Thr Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser 145 150 155 aag gcc ctg gaa gag aaa tac gtg gcc gaa ctg cag ctg gaa cgg ctg 1488 Lys Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu 160 165 170 aag aaa gac ggc gaa gtg cgg ggc agc atc aac aga ttc aag acc agc 1536 Lys Lys Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser 175 180 185 190 gac tac gtg aaa gaa gcc aaa cag ctg ctg aag gtg cag aag gcc tac 1584 Asp Tyr Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr 195 200 205 cac cag ctg gac cag agc ttc atc gac acc tac atc gac ctg ctg gaa 1632 His Gln Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu 210 215 220 acc cgg cgg acc tac tat gag gga cct ggc gag ggc agc ccc ttc ggc 1680 Thr Arg Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly 225 230 235 tgg aag gac atc aaa gaa tgg tac gag atg ctg atg ggc cac tgc acc 1728 Trp Lys Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr 240 245 250 tac ttc ccc gag gaa ctg cgg agc gtg aag tac gcc tac aac gcc gac 1776 Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp 255 260 265 270 ctg tac aac gcc ctg aac gac ctg aac aat ctc gtg atc acc agg gac 1824 Leu Tyr Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp 275 280 285 gag aac gag aag ctg gaa tat tac gag aag ttc cag atc atc gag aac 1872 Glu Asn Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn 290 295 300 gtg ttc aag cag aag aag aag ccc acc ctg aag cag atc gcc aaa gaa 1920 Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu 305 310 315 atc ctc gtg aac gaa gag gat att aag ggc tac aga gtg acc agc acc 1968 Ile Leu Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr 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ccc cac cag atc aag cac att aag gac ttc 3312 Lys Glu Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe 770 775 780 aag gac tac aag tac agc cac cgg gtg gac aag aag cct aat aga gag 3360 Lys Asp Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu 785 790 795 ctg att aac gac acc ctg tac tcc acc cgg aag gac gac aag ggc aac 3408 Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn 800 805 810 acc ctg atc gtg aac aat ctg aac ggc ctg tac gac aag gac aat gac 3456 Thr Leu Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp 815 820 825 830 aag ctg aaa aag ctg atc aac aag agc ccc gaa aag ctg ctg atg tac 3504 Lys Leu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr 835 840 845 cac cac gac ccc cag acc tac cag aaa ctg aag ctg att atg gaa cag 3552 His His Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln 850 855 860 tac ggc gac gag aag aat ccc ctg tac aag tac tac gag gaa acc ggg 3600 Tyr Gly Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly 865 870 875 aac 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cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 900 gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 960 aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 1020 agtgaatgcc accatggccc caaagaagaa gcggaaggtc ggtatccacg gagtcccagc 1080 agccaagcgg aactacatcc tgggcctgga catcggcatc accagcgtgg gctacggcat 1140 catcgactac gagacacggg acgtgatcga tgccggcgtg cggctgttca aagaggccaa 1200 cgtggaaaac aacgagggca ggcggagcaa gagaggcgcc agaaggctga agcggcggag 1260 gcggcataga atccagagag tgaagaagct gctgttcgac tacaacctgc tgaccgacca 1320 cagcgagctg agcggcatca acccctacga ggccagagtg aagggcctga gccagaagct 1380 gagcgaggaa gagttctctg ccgccctgct gcacctggcc aagagaagag gcgtgcacaa 1440 cgtgaacgag gtggaagagg acaccggcaa cgagctgtcc accaaagagc agatcagccg 1500 gaacagcaag gccctggaag agaaatacgt ggccgaactg cagctggaac ggctgaagaa 1560 agacggcgaa gtgcggggca gcatcaacag attcaagacc agcgactacg tgaaagaagc 1620 caaacagctg ctgaaggtgc agaaggccta ccaccagctg gaccagagct tcatcgacac 1680 ctacatcgac ctgctggaaa cccggcggac ctactatgag ggacctggcg agggcagccc 1740 cttcggctgg aaggacatca aagaatggta cgagatgctg atgggccact gcacctactt 1800 ccccgaggaa ctgcggagcg tgaagtacgc ctacaacgcc gacctgtaca acgccctgaa 1860 cgacctgaac aatctcgtga tcaccaggga cgagaacgag aagctggaat attacgagaa 1920 gttccagatc atcgagaacg tgttcaagca gaagaagaag cccaccctga agcagatcgc 1980 caaagaaatc ctcgtgaacg aagaggatat taagggctac agagtgacca gcaccggcaa 2040 gcccgagttc accaacctga aggtgtacca cgacatcaag gacattaccg cccggaaaga 2100 gattattgag aacgccgagc tgctggatca gattgccaag atcctgacca tctaccagag 2160 cagcgaggac atccaggaag aactgaccaa tctgaactcc gagctgaccc aggaagagat 2220 cgagcagatc tctaatctga agggctatac cggcacccac aacctgagcc tgaaggccat 2280 caacctgatc ctggacgagc tgtggcacac caacgacaac cagatcgcta tcttcaaccg 2340 gctgaagctg gtgcccaaga aggtggacct gtcccagcag aaagagatcc ccaccaccct 2400 ggtggacgac ttcatcctga gccccgtcgt gaagagaagc ttcatccaga gcatcaaagt 2460 gatcaacgcc atcatcaaga agtacggcct gcccaacgac atcattatcg agctggcccg 2520 cgagaagaac tccaaggacg cccagaaaat gatcaacgag atgcagaagc ggaaccggca 2580 gaccaacgag cggatcgagg aaatcatccg gaccaccggc aaagagaacg ccaagtacct 2640 gatcgagaag atcaagctgc acgacatgca ggaaggcaag tgcctgtaca gcctggaagc 2700 catccctctg gaagatctgc tgaacaaccc cttcaactat gaggtggacc acatcatccc 2760 cagaagcgtg tccttcgaca acagcttcaa caacaaggtg ctcgtgaagc aggaagaaaa 2820 cagcaagaag ggcaaccgga ccccattcca gtacctgagc agcagcgaca gcaagatcag 2880 ctacgaaacc ttcaagaagc acatcctgaa tctggccaag ggcaagggca gaatcagcaa 2940 gaccaagaaa gagtatctgc tggaagaacg ggacatcaac aggttctccg tgcagaaaga 3000 cttcatcaac cggaacctgg tggataccag atacgccacc agaggcctga tgaacctgct 3060 gcggagctac ttcagagtga acaacctgga cgtgaaagtg aagtccatca atggcggctt 3120 caccagcttt ctgcggcgga agtggaagtt taagaaagag cggaacaagg ggtacaagca 3180 ccacgccgag gacgccctga tcattgccaa cgccgatttc atcttcaaag agtggaagaa 3240 actggacaag gccaaaaaag tgatggaaaa ccagatgttc gaggaaaagc aggccgagag 3300 catgcccgag atcgaaaccg agcaggagta caaagagatc ttcatcaccc cccaccagat 3360 caagcacatt aaggacttca aggactacaa gtacagccac cgggtggaca agaagcctaa 3420 tagagagctg attaacgaca ccctgtactc cacccggaag gacgacaagg gcaacaccct 3480 gatcgtgaac aatctgaacg gcctgtacga caaggacaat gacaagctga aaaagctgat 3540 caacaagagc cccgaaaagc tgctgatgta ccaccacgac ccccagacct accagaaact 3600 gaagctgatt atggaacagt acggcgacga gaagaatccc ctgtacaagt actacgagga 3660 aaccgggaac tacctgacca agtactccaa aaaggacaac ggccccgtga tcaagaagat 3720 taagtattac ggcaacaaac tgaacgccca tctggacatc accgacgact accccaacag 3780 cagaaacaag gtcgtgaagc tgtccctgaa gccctacaga ttcgacgtgt acctggacaa 3840 tggcgtgtac aagttcgtga ccgtgaagaa tctggatgtg atcaaaaaag aaaactacta 3900 cgaagtgaat agcaagtgct atgaggaagc taagaagctg aagaagatca gcaaccaggc 3960 cgagtttatc gcctccttct acaacaacga tctgatcaag atcaacggcg agctgtatag 4020 agtgatcggc gtgaacaacg acctgctgaa ccggatcgaa gtgaacatga tcgacatcac 4080 ctaccgcgag tacctggaaa acatgaacga caagaggccc cccaggatca ttaagacaat 4140 cgcctccaag acccagagca ttaagaagta cagcacagac attctgggca acctgtatga 4200 agtgaaatct aagaagcacc ctcagatcat caaaaagggc aaaaggcctg ctgccaccaa 4260 aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaagta atgactagtg cctcgactgt gccttctagt 4320 tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 4380 cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 4440 tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 4500 aggcatgctg gggactcgag tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 4560 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 4620 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 4680 gcgcagcctt aattaaccta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 4740 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 4800 tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 4860 ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 4920 cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 4980 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 5040 tagtgcttta 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cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5940 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 6000 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 6060 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 6120 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 6180 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 6240 caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 6300 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6360 ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6420 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6480 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6540 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6600 agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6660 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6720 gccagtggcg 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ctggttaata atctcaggag cacaaacatt ccagatccgg cgcgcctgtt 780 tgctgcttgc aatgtttgcc cattttaggg tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca 840 gggggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 900 gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 960 aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 1020 agtgaatgcc acc atg gcc cca aag aag aag cgg aag gtc ggt atc cac 1069 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His 1 5 10 gga gtc cca gca gcc aag cgg aac tac atc ctg ggc ctg gac atc ggc 1117 Gly Val Pro Ala Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly 15 20 25 atc acc agc gtg ggc tac ggc atc atc gac tac gag aca cgg gac gtg 1165 Ile Thr Ser Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val 30 35 40 atc gat gcc ggc gtg cgg ctg ttc aaa gag gcc aac gtg gaa aac aac 1213 Ile Asp Ala Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn 45 50 55 60 gag ggc agg cgg agc aag aga ggc gcc aga agg ctg aag cgg cgg agg 1261 Glu Gly Arg Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg 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Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr 945 950 955 gaa gtg aat agc aag tgc tat gag gaa gct aag aag ctg aag aag atc 3949 Glu Val Asn Ser Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile 960 965 970 agc aac cag gcc gag ttt atc gcc tcc ttc tac aac aac gat ctg atc 3997 Ser Asn Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile 975 980 985 aag atc aac ggc gag ctg tat aga gtg atc ggc gtg aac aac gac ctg 4045 Lys Ile Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu 990 995 1000 ctg aac cgg atc gaa gtg aac atg atc gac atc acc tac cgc gag 4090 Leu Asn Arg Ile Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu 1005 1010 1015 tac ctg gaa aac atg aac gac aag agg ccc ccc agg atc att aag 4135 Tyr Leu Glu Asn Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys 1020 1025 1030 aca atc gcc tcc aag acc cag agc att aag aag tac agc aca gac 4180 Thr Ile Ala Ser Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp 1035 1040 1045 att ctg ggc aac ctg tat gaa gtg aaa tct aag aag cac cct cag 4225 Ile Leu Gly Asn Leu Tyr 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gag gtg gac gac gag gtg ttc tac 1922 His Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr 305 310 315 agc cca cgg agc ctg gtg ttc cca gag gcc gag aac cgg aag tgg acc 1970 Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr 320 325 330 atc atg gcc gtg atg gtg agc ctg ctg acc gat tac agc cca cag ctg 2018 Ile Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu 335 340 345 cag aag cca aag ttc tga taa gcggccgcta tttgtgaaat ttgtgatgct 2069 Gln Lys Pro Lys Phe 350 attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 2129 cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaggcatc gataaggatc 2189 ttcctagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa 2249 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 2309 cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 2369 cgcag 2374 <210> 16 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 20 25 30 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 65 70 75 80 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 100 105 110 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 115 120 125 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 130 135 140 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 145 150 155 160 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala 195 200 205 Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu 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ggagagtacc tgccactgct gcagggaaag 240 agcctgggaa tgatcttcga gaagcggagc acccggaccc ggctgagcac cgagaccgga 300 ttcgccctgc tgggaggaca cccatgcttc ctgaccaccc aggacatcca cctgggagtg 360 aatgagagcc tgaccgacac cgcccgggtg ctgagcagca tggccgacgc cgtgctggcc 420 cgggtgtaca agcagagcga cctggatacc ctggccaagg aggccagcat cccaatcatc 480 aacggactga gcgacctgta ccacccaatc cagatcctgg ccgattacct gaccctgcag 540 gagcactaca gcagcctgaa gggactgacc ctgagctgga tcggagacgg aaacaacatc 600 ctgcacagca tcatgatgag cgccgccaag ttcggaatgc acctgcaggc cgccacccca 660 aagggatacg agccagatgc cagcgtgacc aagctggccg agcagtacgc caaggagaac 720 ggaaccaagc tgctgctgac caacgaccca ctggaggccg cccacggagg aaacgtgctg 780 atcaccgata cctggatcag catgggacag gaggaggaga agaagaagcg gctgcaggcc 840 ttccagggat accaggtgac catgaagacc gccaaggtgg ccgccagcga ttggaccttc 900 ctgcactgcc tgccacggaa gccagaggag gtggacgacg aggtgttcta cagcccacgg 960 agcctggtgt tcccagaggc cgagaaccgg aagtggacca tcatggccgt gatggtgagc 1020 ctgctgaccg attacagccc acagctgcag aagccaaagt tctgataa 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tctacttagc agggtttgta gacggtgacg 420 gttccatctt tgccaggatc aagcctagtc aacgtagtaa gttcaagcac aagctgcatc 480 tcgttttcgc tgtctatcag aagacacagc gccgttggtt cctcgacaag ctggtggacg 540 agatcggtgt gggttacgtg ctggactctg gcagcgtctc cttttactcg ctgtccgaga 600 tcaagccttt gcataatttt ttaacacaac tacaaccttt tctaaaacta aaacaaaaac 660 aagcaaattt agttttaaaa attattgaac aacttccgtc agcaaaagaa tccccggaca 720 aattcttaga agtttgtaca tgggtggatc aaattgcagc tctgaatgat tcgaagacgc 780 gtaaaacaac ttctgaaacc gttcgtgctg tgctagacag tttaccagga tccgtgggag 840 gtctatcgcc atctcaggca tccagcgccg catcctcggc ttcctcaagc ccgggttcag 900 ggatctccga agcactcaga gctggagcag gttccggcac tggatacaac aaggaattcc 960 tgctctacct ggcgggcttc gtcgacgggg acggctccat ctatgcccgt atcaagccgg 1020 ttcagcgggc taagttcaag cacgagctgg ttctcgggtt cgatgtcact cagaagacac 1080 agcgccgttg gttcctcgac aagctggtgg acgagatcgg tgtgggttac gtgtatgaca 1140 agggcagcgt ctccgcgtac cgtctgtccc agatcaagcc tctgcacaac ttcctgaccc 1200 agctccagcc cttcctgaag ctcaagcaga agcaggccaa cctcgtgctg aagatcatcg 1260 agcagctgcc ctccgccaag gaatccccgg acaagttcct ggaggtgtgc acctgggtgg 1320 accagatcgc cgctctgaac gactccaaga cccgcaagac cacttccgaa accgtccgcg 1380 ccgttctaga cagtctctcc gagaagaaga agtcgtcccc ctaaggtacg atctgcctcg 1440 actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 1500 ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 1560 ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 1620 tgggaagaca atagcaggca tgctggggac tcgagttaag ggcgaattcc cgataaggat 1680 cttcctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 1740 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1800 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 1860 gcgcagcctt aattaaccta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 1920 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 1980 tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2040 ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 2100 cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 2160 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 2220 tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 2280 gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 2340 tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 2400 ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 2460 taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat 2520 gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 2580 agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 2640 catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 2700 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 2760 atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 2820 ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 2880 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 2940 ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 3000 ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 3060 gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 3120 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 3180 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 3240 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 3300 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 3360 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 3420 caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 3480 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 3540 ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 3600 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 3660 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 3720 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 3780 agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 3840 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 3900 gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 3960 gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 4020 tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 4080 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 4140 cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 4200 gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 4260 gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 4320 ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 4380 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 4440 cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 4500 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 4560 gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 4620 taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccagatttaa ttaaggcctt 4680 aattagg 4687 <210> 19 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector genome TBG-S1-F113.PCS7-8L.197.bGH <220> <221> repeat_region <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> promoter <222> (206)..(318) <223> TBG S1 <220> <221> CDS <222> (330)..(1424) <223> PCS7-8L <220> <221> polyA_signal <222> (1435)..(1649) <223> bGH polyA <220> <221> repeat_region <222> (1691)..(1736) <223> ITR <400> 19 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg gaattcgccc ttaagctttg aaaataccat cccagggtta atgctggggt 240 taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa aaatggaaag 300 atgttgcttt ctgagagaca gcggccgcc atg gca ccg aag aag aag cgc aag 353 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 gtg cat atg aat aca aaa tat aat aaa gag ttc tta ctc tac tta gca 401 Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala 10 15 20 ggg ttt gta gac ggt gac ggt tcc atc ttt gcc agg atc aag cct agt 449 Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Phe Ala Arg Ile Lys Pro Ser 25 30 35 40 caa cgt agt aag ttc aag cac aag ctg cat ctc gtt ttc gct gtc tat 497 Gln Arg Ser Lys Phe Lys His Lys Leu His Leu Val Phe Ala Val Tyr 45 50 55 cag aag aca cag cgc cgt tgg ttc ctc gac aag ctg gtg gac gag atc 545 Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile 60 65 70 ggt gtg ggt tac gtg ctg gac tct ggc agc gtc tcc ttt tac tcg ctg 593 Gly Val Gly Tyr Val Leu Asp Ser Gly Ser Val Ser Phe Tyr Ser Leu 75 80 85 tcc gag atc aag cct ttg cat aat ttt tta aca caa cta caa cct ttt 641 Ser Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe 90 95 100 cta aaa cta aaa caa aaa caa gca aat tta gtt tta aaa att att gaa 689 Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu 105 110 115 120 caa ctt ccg tca gca aaa gaa tcc ccg gac aaa ttc tta gaa gtt tgt 737 Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys 125 130 135 aca tgg gtg gat caa att gca gct ctg aat gat tcg aag acg cgt aaa 785 Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys 140 145 150 aca act tct gaa acc gtt cgt gct gtg cta gac agt tta cca gga tcc 833 Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser 155 160 165 gtg gga ggt cta tcg cca tct cag gca tcc agc gcc gca tcc tcg gct 881 Val Gly Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala 170 175 180 tcc tca agc ccg ggt tca ggg atc tcc gaa gca ctc aga gct gga gca 929 Ser Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala 185 190 195 200 ggt tcc ggc act gga tac aac aag gaa ttc ctg ctc tac ctg gcg ggc 977 Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly 205 210 215 ttc gtc gac ggg gac ggc tcc atc tat gcc cgt atc aag ccg gtt cag 1025 Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Arg Ile Lys Pro Val Gln 220 225 230 cgg gct aag ttc aag cac gag ctg gtt ctc ggg ttc gat gtc act cag 1073 Arg Ala Lys Phe Lys His Glu Leu Val Leu Gly Phe Asp Val Thr Gln 235 240 245 aag aca cag cgc cgt tgg ttc ctc gac aag ctg gtg gac gag atc ggt 1121 Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly 250 255 260 gtg ggt tac gtg tat gac aag ggc agc gtc tcc gcg tac cgt ctg tcc 1169 Val Gly Tyr Val Tyr Asp Lys Gly Ser Val Ser Ala Tyr Arg Leu Ser 265 270 275 280 cag atc aag cct ctg cac aac ttc ctg acc cag ctc cag ccc ttc ctg 1217 Gln Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu 285 290 295 aag ctc aag cag aag cag gcc aac ctc gtg ctg aag atc atc gag cag 1265 Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln 300 305 310 ctg ccc tcc gcc aag gaa tcc ccg gac aag ttc ctg gag gtg tgc acc 1313 Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr 315 320 325 tgg gtg gac cag atc gcc gct ctg aac gac tcc aag acc cgc aag acc 1361 Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr 330 335 340 act tcc gaa acc gtc cgc gcc gtt cta gac agt ctc tcc gag aag aag 1409 Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys 345 350 355 360 aag tcg tcc ccc taa ggtacgatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 1464 Lys Ser Ser Pro tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 1524 ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 1584 gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 1644 ggggactcga gttaagggcg aattcccgat aaggatcttc ctagagcatg gctacgtaga 1704 taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 1764 tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 1824 gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag 1866 <210> 20 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Ile Lys Pro Ser Gln Arg Ser Lys Phe 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ttctaaaact aaaacaaaaa caagcaaatt tagttttaaa aattattgaa 360 caacttccgt cagcaaaaga atccccggac aaattcttag aagtttgtac atgggtggat 420 caaattgcag ctctgaatga ttcgaagacg cgtaaaacaa cttctgaaac cgttcgtgct 480 gtgctagaca gtttaccagg atccgtggga ggtctatcgc catctcaggc atccagcgcc 540 gcatcctcgg cttcctcaag cccgggttca gggatctccg aagcactcag agctggagca 600 ggttccggca ctggatacaa caaggaattc ctgctctacc tggcgggctt cgtcgacggg 660 gacggctcca tctatgcccg tatcaagccg gttcagcggg ctaagttcaa gcacgagctg 720 gttctcgggt tcgatgtcac tcagaagaca cagcgccgtt ggttcctcga caagctggtg 780 gacgagatcg gtgtgggtta cgtgtatgac aagggcagcg tctccgcgta ccgtctgtcc 840 cagatcaagc ctctgcacaa cttcctgacc cagctccagc ccttcctgaa gctcaagcag 900 aagcaggcca acctcgtgct gaagatcatc gagcagctgc cctccgccaa ggaatccccg 960 gacaagttcc tggaggtgtg cacctgggtg gaccagatcg ccgctctgaa cgactccaag 1020 acccgcaaga ccacttccga aaccgtccgc gccgttctag acagtctctc cgagaagaag 1080 aagtcgtccc cctaa 1095 <210> 22 <211> 2079 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2079) <223> PCSK9 CDS <400> 22 atg ggc acc gtc agc tcc agg cgg tcc tgg tgg ccg ctg cca ctg ctg 48 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 ctg ctg ctg ctg ctg ctc ctg ggt ccc gcg ggc gcc cgt gcg cag gag 96 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 gac gag gac ggc gac tac gag gag ctg gtg cta gcc ttg cgt tcc gag 144 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 gag gac ggc ctg gcc gaa gca ccc gag cac gga acc aca gcc acc ttc 192 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 cac cgc tgc gcc aag gat ccg tgg agg ttg cct ggc acc tac gtg gtg 240 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 gtg ctg aag gag gag acc cac ctc tcg cag tca gag cgc act gcc cgc 288 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 cgc ctg cag gcc cag gct gcc cgc cgg gga tac ctc acc aag atc ctg 336 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu 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cac gtc ctc aca 1680 Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr 545 550 555 560 ggc tgc agc tcc cac tgg gag gtg gag gac ctt ggc acc cac aag ccg 1728 Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro 565 570 575 cct gtg ctg agg cca cga ggt cag ccc aac cag tgc gtg ggc cac agg 1776 Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg 580 585 590 gag gcc agc atc cac gct tcc tgc tgc cat gcc cca ggt ctg gaa tgc 1824 Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys 595 600 605 aaa gtc aag gag cat gga atc ccg gcc cct cag gag cag gtg acc gtg 1872 Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val 610 615 620 gcc tgc gag gag ggc tgg acc ctg act ggc tgc agt gcc ctc cct ggg 1920 Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly 625 630 635 640 acc tcc cac gtc ctg ggg gcc tac gcc gta gac aac acg tgt gta gtc 1968 Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val 645 650 655 agg agc cgg gac gtc agc 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Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 ttt cca tct caa atg ctg cgg act gga aac aac ttt gaa ttt agc tac 1248 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 acc ttt gag gac gtg ccc ttc cac agc agc tac gca cac agc cag agc 1296 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 ctg gac cgg ctg atg aac cct ctc atc gac cag tac ctg tat tac cta 1344 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 tcc aga act cag tcc aca gga gga act caa ggt aca cag caa ttg tta 1392 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 ttt tct caa gcc ggg cct gca aat atg tcg gct cag gcc aag aac tgg 1440 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 cta cct gga cct tgc tac cgg cag cag cga gtc tcc acg aca ctg tcg 1488 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 caa aac aac aac agc aac ttt gct tgg act ggt gcc acg aaa tat cat 1536 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cgc ccc att gga act cgt tac ctc acc cgt 2208 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 aat ctg 2214 Asn Leu <210> 34 <211> 738 <212> PRT <213> adeno-associated virus rh79 <400> 34 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg 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acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aac cac 768 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 ctc tac aag caa atc tcc aac ggg aca tcg gga gga gcc acc aac gac 816 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 260 265 270 aac acc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttt aac 864 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 aga ttc cac tgc cac ttt tca cca cgt gac tgg cag cga ctc atc aac 912 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 aac aac tgg gga ttc cgg ccc aag aga ctc agc ttc aag ctc ttc aac 960 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 atc cag gtc aag gag gtc acg cag aat gaa ggc acc aag acc atc gcc 1008 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 aat aac ctc acc agc acc atc cag gtg ttt acg gac tcg gag tac cag 1056 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 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agc ttc aag ctc ttc aac 960 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 atc cag gtc aag gag gtc acg cag aat gaa ggc acc aag acc atc gcc 1008 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 aat aac ctt acc agc acg att cag gta ttt acg gac tcg gaa tac cag 1056 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 ctg ccg tac gtc ctc ggc tcc gcg cac cag ggc tgc ctg cct ccg ttc 1104 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 ccg gcg gac gtc ttc atg att ccc cag tac ggc tac ctt aca ctg aac 1152 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 aat gga agt caa gcc gta ggc cgt tcc tcc ttc tac tgc ctg gaa tat 1200 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 ttt cca tct caa atg ctg cga act gga aac aat ttt gaa ttc agc tac 1248 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 acc ttc gag gac 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tgttaaacat ggcttgaatg ggatcttggt gtcgaatcat 780 ggggctcgac aactcgatgg ggtgccagcc actattgatg ttctgccaga aattgtggag 840 gctgtggaag ggaaggtgga agtcttcctg gacgggggtg tgcggaaagg cactgatgtt 900 ctgaaagctc tggctcttgg cgccaaggct gtgtttgtgg ggagaccaat cgtttggggc 960 ttagctttcc agggggagaa aggtgttcaa gatgtcctcg agatactaaa ggaagaattc 1020 cggttggcca tggctctgag tgggtgccag aatgtgaaag tcatcgacaa gacattggtg 1080 aggaaaaatc ctttggccgt ttccaagatc tga 1113 <210> 50 <211> 370 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Leu Pro Arg Leu Ile Cys Ile Asn Asp Tyr Glu Gln His Ala Lys 1 5 10 15 Ser Val Leu Pro Lys Ser Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Ser Gly Ala Asn 20 25 30 Asp Glu Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ile Ala Ala Phe Ser Arg Trp Lys 35 40 45 Leu Tyr Pro Arg Met Leu Arg Asn Val Ala Glu Thr Asp Leu Ser Thr 50 55 60 Ser Val Leu Gly Gln Arg Val Ser Met Pro Ile Cys Val Gly Ala Thr 65 70 75 80 Ala Met Gln Arg Met Ala His Val Asp Gly Glu Leu Ala Thr Val Arg 85 90 95 Ala Cys Gln Ser Leu Gly Thr Gly Met Met Leu Ser Ser Trp Ala 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attaaatgag 2640 aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760 agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820 tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880 aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940 aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000 gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060 aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120 attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180 gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240 aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360 ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420 caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt 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tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttactttaa 1290 <210> 76 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 77 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 atgccgtctt ctgtctcgtg gggcatcctc ctgctggcag gcctgtgctg cctggtccct 60 gtctccctgg ctgaggatcc ccagggagat gctgcccaga agacagatac atcccaccat 120 gatcaggatc acccaacctt caacaagatc acccccaacc tggctgagtt cgccttcagc 180 ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc 240 atcgctacag cctttgcaat gctctccctg gggaccaagg ctgacactca cgatgaaatc 300 ctggagggcc tgaatttcaa cctcacggag attccggagg ctcagatcca tgaaggcttc 360 caggaactcc tccgtaccct caaccagcca gacagccagc tccagctgac caccggcaat 420 ggcctgttcc tcagcgaggg cctgaagcta gtggataagt ttttggagga tgttaaaaag 480 ttgtaccact cagaagcctt cactgtcaac ttcggggaca ccgaagaggc caagaaacag 540 atcaacgatt acgtggagaa gggtactcaa gggaaaattg tggatttggt caaggagctt 600 gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga 660 ccctttgaag tcaaggacac cgaggaagag gacttccacg tggaccaggt gaccaccgtg 720 aaggtgccta tgatgaagcg tttaggcatg tttaacatcc agcactgtaa gaagctgtcc 780 agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat 840 gaggggaaac tacagcacct ggaaaatgaa ctcacccacg atatcatcac caagttcctg 900 gaaaatgaag acagaaggtc tgccagctta catttaccca aactgtccat tactggaacc 960 tatgatctga agagcgtcct gggtcaactg ggcatcacta aggtcttcag caatggggct 1020 gacctctccg gggtcacaga ggaggcaccc ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct 1080 gtgctgacca tcgacgagaa agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccata 1140 cccatgtcta tcccccccga ggtcaagttc aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa 1200 caaaatacca agtctcccct cttcatggga aaagtggtga atcccaccca aaaataa 1257 <210> 78 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 1 5 10 15 Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala 20 25 30 Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn 35 40 45 Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln 50 55 60 Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser 65 70 75 80 Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr 85 90 95 His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro 100 105 110 Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn 115 120 125 Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu 130 135 140 Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys 145 150 155 160 Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys 180 185 190 Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys <210> 79 <211> 2859 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc 60 ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga 120 gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc 180 agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca 240 cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag 300 gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc 360 cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac 420 ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc 480 cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac 540 ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc 600 cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg 660 atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc 720 tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc 780 gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac 840 cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg 900 ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg 960 gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac 1020 atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac 1080 ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc 1140 accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc 1200 cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc 1260 ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg 1320 atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag 1380 ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta 1440 tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag 1500 gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac 1560 gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac 1620 ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc 1680 agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc 1740 atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc 1800 tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc 1860 tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct 1920 ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc 1980 tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg 2040 ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc 2100 ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg 2160 gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg 2220 gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag 2280 gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta 2340 gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc 2400 gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct 2460 gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc 2520 atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac 2580 gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc 2640 aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag 2700 ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt 2760 gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg 2820 ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag 2859 <210> 80 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950

Claims (53)

  1. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) PCSK9 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 벡터; 및
    (b) 이식유전자를 암호화하는 핵산 서열 및 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 이식유전자 카세트를 포함하는 공여자 벡터로서, 상기 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하고, 상기 이식유전자가 PCSK9가 아닌, 공여자 벡터
    를 포함하는 시스템.
  2. 제1항에 있어서, PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 PCSK9 엑손 7을 표적으로 하는 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 PCSK9에 특이적인 메가뉴클레아제인 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 메가뉴클레아제가 ARCUS 메가뉴클레아제인 시스템.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal)가 측면에 있는 Cas9를 암호화하는 서열을 포함하는 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터는 상기 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 추가로 포함하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 시스템.
  8. 제6항에 있어서, 상기 공여자 벡터는 적어도 20개 뉴클레오타이드 시드(seed) 영역을 포함하는 sgRNA를 추가로 포함하고, 상기 sgRNA는 상기 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 시스템.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터를 추가로 포함하는 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RNA 중합효소 프로모터가 U6 프로모터인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 U6 프로모터가 상기 sgRNA의 5'에 위치하는 시스템.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시드 영역이 상기 표적 부위 서열에 100% 상보적인 시스템.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시드 영역이 상기 표적 부위 서열에 100% 미만으로 상보적인 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자가 OTC, PKU, CTLN1 또는 LDLR인 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 벡터 및 유전자 편집 벡터 중 적어도 하나는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이고, 상기 AAV 벡터는 AAV 5' ITR 및 AAV 3' ITR을 포함하는, 시스템.
  16. 제15항에 있어서, (b)의 공여자 AAV 벡터에 대한 (a)의 유전자 편집 AAV 벡터의 비는 (b)의 공여자 AAV 벡터가 (a)의 유전자 편집 벡터의 초과량인, 시스템.
  17. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) AAV 캡시드 및 5' ITR, PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 메가뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에서 PCSK9를 표적으로 하는 메가뉴클레아제를 암호화하는 서열, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV; 및
    (b) AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 상기 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터
    를 포함하는 시스템.
  18. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 saCas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS, 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV; 및
    (b) AAV 캡시드 및 5' ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 상기 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, U6 프로모터, PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서 상기 표적 부위가 상기 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터
    를 포함하는 시스템.
  19. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) AAV 캡시드 및 5' ITR, U6 프로모터, PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서 상기 표적 부위가 상기 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 sgRNA, 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열 및 상기 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 상기 Cas9의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' NLS 및 3' ITR을 포함하는 제1 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및
    (b) AAV 캡시드 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 상기 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터
    를 포함하는 시스템.
  20. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) 다음을 포함하는 유전자 편집 벡터:
    (i) 지질 나노입자;
    (ii) PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA로서, 상기 표적 부위는 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인, sgRNA;
    (iii) 5' 핵 국재화 신호(NLS), Cas9를 암호화하는 서열, 3' NLS를 포함하는 mRNA; 및
    (b) AAV 캡시드, 및 5'ITR, 5' 상동성 지정 재조합(HDR) 아암, 이식유전자 및 상기 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열, 3' HDR 아암, 및 3' ITR을 포함하는 제2 벡터 게놈을 포함하는 공여자 AAV 벡터
    를 포함하는 시스템.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 상기 유전자 편집 AAV 벡터 및 (b)의 상기 공여자 AAV 벡터가 동일한 AAV 캡시드를 갖는 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 AAV 캡시드가 AAV8, AAV9, rh10, AAV6.2, AAV3B, hu37, rh79 및 rh64로부터 선택되는 시스템.
  23. 제6항 내지 제18항, 또는 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9가 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9로부터 선택되는 시스템.
  24. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 조직-특이적 프로모터의 제어 하에 있는 시스템.
  25. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 구성적 프로모터의 제어 하에 있는 시스템.
  26. 제24항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 간 특이적 프로모터, 선택적으로 인간 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터, 또는 하이브리드 간 프로모터(HLP)의 제어 하에 있는 시스템.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 시스템을 공동 투여함으로써 인간의 장애를 치료하는 방법.
  28. 신생아 대상체의 간 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 간 대사 장애가 있는 상기 대상체에게 다음을 공동투여하는 것을 포함하는 방법:
    (a) 뉴클레아제를 암호화하는 서열 및 PCSK9 유전자를 포함하는 표적 세포에서 상기 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 유전자 편집 AAV 벡터; 및
    (b) 이식유전자 및 상기 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 공여자 AAV 벡터로서, 상기 이식유전자 카세트에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하는 공여자 AAV 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 (a)의 유전자 편집 AAV 벡터 및 상기 (b)의 공여자 벡터가 동일한 경로를 통해 본질적으로 동시에 전달되는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 (a)의 유전자 편집 AAV 벡터가 주사용 비히클에 약 2 x 1011 GC/mL 내지 약 2 x 1012 GC/mL의 농도로 현탁되는 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 (a)의 AAV 표적화 벡터가 주사용 비히클에 약 2 x 1012 GC/mL 내지 약 1 x 1013 GC/mL의 농도로 현탁되는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 대사 장애가 오르니틴 트랜스카르바밀라제인 방법.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 대사 장애가 OTC, FH, 시트룰린혈증 I형(CTLN1) 또는 페닐케톤뇨증인 방법.
  34. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 서열을 포함하는 지질 나노입자(LNP); 및
    (b) 이식유전자 및 표적 세포에서 상기 이식유전자의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 공여자 AAV 벡터로서, 상기 공여자 벡터가 상기 이식유전자에 대해 5' 및 3'에 상동성 지정 재조합(HDR) 아암을 추가로 포함하는 공여자 AAV 벡터
    를 포함하는 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 PCSK9 유전자를 표적으로 하는 시스템.
  36. 제34항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 PCSK9 엑손 7을 표적으로 하는 시스템.
  37. 제34항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 PCSK9에 특이적인 메가뉴클레아제인 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 메가뉴클레아제가 ARCUS 메가뉴클레아제인 시스템.
  39. 제34항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이고, 상기 LNP는 sgRNA를 포함하는 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 Cas9 뉴클레아제는 핵 국재화 신호가 측면에 있는 시스템.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 sgRNA는 상기 PCSK9 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 표적 부위는 상기 Cas9에 의해 특이적으로 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 5'인 시스템.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 중합효소 프로모터를 추가로 포함하는 시스템.
  43. 제43항에 있어서, 상기 RNA 중합효소 프로모터가 U6 프로모터인 시스템.
  44. 제46항에 있어서, 상기 U6 프로모터가 sgRNA의 5'에 위치하는 시스템.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sgRNA가 상기 표적 부위 서열에 100% 상보적인 시스템.
  46. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sgRNA가 상기 표적 부위 서열에 100% 미만으로 상보적인 시스템.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자가 간 발현 유전자인 시스템.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자가 OTC, PKU, CTLN1 및 FH로부터 선택되는 시스템.
  49. 유전적 장애를 치료하기 위한 시스템으로서,
    (a) 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 벡터; 및
    (b) PCSK9 유전자좌로부터의 발현을 위해 외인성 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여자 벡터로서, 상기 삽입된 핵산 서열은 PCSK9를 암호화하지 않는, 공여자 벡터
    를 포함하고,
    상기 시스템은 뉴클레아제가 천연 PCSK9 유전자좌를 특이적으로 표적으로 하도록 지시하는 서열을 추가로 포함하고;
    상기 표적 세포의 천연 PCSK9는 이중 벡터 시스템을 이용한 투약 후 선택적으로 제거되거나 감소되는, 시스템.
  50. 제49항의 시스템을 사용하여 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자의 천연 PCSK9 발현 수준은 감소되고 상기 환자는 외인성 생성물을 발현하는 방법.
  51. 서열번호 17의 조작된 암호 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 발현 카세트.
  52. 제51항에 있어서, AAV 5' 및 3' ITR을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  53. 제51항 또는 제52항에 따른 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터.
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