CN117795086A - 用于枫糖尿症(msud)中bcaa调节的基因疗法 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本公开提供了用于促进受试者的功能性BCKDHA蛋白和/或BCKDHB的表达的组合物和方法，所述功能性BCKDHA蛋白是支链α‑酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1‑α亚基，所述BCKDHB是支链α‑酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1‑β亚基。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法。

Description

用于枫糖尿症(MSUD)中BCAA调节的基因疗法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2021年4月26日提交的名称为“用于枫糖尿症(MSUD)中BCAA调节的基因疗法(GENE THERAPY FOR BCAA MODULATION IN MAPLE SYRUPURINE DISEASE(MSUD))”的美国临时申请号63/179,676的权益，该申请的全部公开内容通过引用并入本文。

对经由EFS-WEB以文本文件提交的序列表的引用

本申请包含已经经由EFS-web以ASCII格式提交的序列表，该序列表通过引用以其整体并入本文。该ASCII文件于2022年4月25日创建，命名为U012070161WO00-SEQ-SXT，大小为79,118字节。

发明背景

枫糖尿症(maple syrup urine disease，MSUD)是一种罕见的遗传病，其影响支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解。它是由编码支链酮酸脱氢酶复合物亚基的三个基因(BCKDHA、BCKDHB和DBT)之一中的双等位基因突变引起的。严重(即经典)的MSUD不治疗就致命。饮食BCAA限制是治疗的主要方法，但难以实施，功效不完善，并且不能提供针对阵发性和威胁生命的脑病危机的保护。肝移植是饮食疗法的有效替代，但伴有手术和长期免疫抑制的风险。

发明内容

在一些方面，本公开涉及一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；该方法包括向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变(loss-of-function mutation)的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开涉及一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；该方法包括向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开涉及一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸的rAAV，其中转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的BCAA比率血清水平正常化。在一些实施方案中，正常化的血清水平范围为：(a)亮氨酸与异亮氨酸的比率为约1.4至约1.7摩尔比摩尔(mol/mol)；和/或(b)缬氨酸与亮氨酸的比率为约1.3至约1.6mol/mol。

在一些方面，本公开涉及一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸的rAAV，其中转基因编码BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸血清水平正常化。在一些实施方案中，正常化的血清水平范围为：(a)约80至200微摩尔/升(μmol/L)的亮氨酸；(b)约40至160μmol/L的异亮氨酸；和/或(c)约140至300μmol/L的缬氨酸。

在一些实施方案中，本公开的方法的rAAV进一步包含衣壳蛋白。

在一些实施方案中，转基因被表达并且表达在施用后持续至少8周。

在一些实施方案中，通过全身注射进行施用。在一些实施方案中，全身注射是静脉内注射。

在一些实施方案中，衣壳是AAV9衣壳。

在一些实施方案中，核酸被工程化以表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA)、opti-BCKDHB、密码子优化的牛BCKDHA基因(opti-cBCKDHA)、opti-cBCKDHB，或其组合。

在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO：1-8、11和12中任一个所示的序列。

在一些实施方案中，核酸包含一个或多个反向末端重复序列(ITR)，其中每个ITR选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR。在一些实施方案中，ITR是deltaITR(ΔITR)。

在一些实施方案中，别异亮氨酸的血清浓度降低(例如，相对于施用转基因或编码转基因的rAAV之前受试者的血清浓度)。

在一些方面，本公开涉及一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开涉及一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些实施方案中，本公开的方法的rAAV还包含衣壳蛋白。

在一些实施方案中，本公开涉及包含本公开的rAAV的药物组合物。在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其包含SEQ ID NO：11或12所示的序列。在一些实施方案中，本公开涉及宿主细胞，其包含本公开的分离的核酸构建体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码AAV衣壳蛋白的分离的核酸。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

在一些实施方案中，受试者是人类。

这些和其他方面和实施方案将在本文中更详细地描述。本公开的一些示例性实施方案的描述仅出于说明目的而提供，并且不意在限制。本公开还包括另外的组合物和方法。

以上概述意在以非限制性方式说明本文公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。本文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将通过发明详述、附图、实施例和权利要求书而变得明显。

附图简要说明

图1A-1C显示了表达BCKDHA的AAV构建体及其在HEK 293T细胞中的表达。图1A：人和牛BCKDHA蛋白的氨基酸序列比对。箭头分别表示牛模型和孟诺特(Mennonite)患者中的突变。下划线突出显示BCKDHA蛋白的信号肽。图1B：显示分别以单链和自身互补形式表达相同的密码子优化的人BCKDHA互补DNA(cDNA)的两个构建体的示意图。图1C：蛋白质印迹显示HEK 293T细胞中的内源和AAV-携带的BCKDHA蛋白。

图2A-2B描述了表达BCKDHA和BCKDHB的AAV构建体。图2A：显示分别以单链和自身互补形式表达相同的密码子优化的人BCKDHB cDNA的两个构建体的示意图。图2B：显示同时以单链形式表达BCKDHA-BCKDHB cDNA的两个构建体的示意图。上图使用T2A序列连接两个基因盒。下图使用共享一个共同增强子的双向启动子来驱动两个基因的表达。

图3A-3B描述了HEK 293T细胞中AAV构建体的表达和活性试验。图3A：蛋白质印迹显示野生型(WT)和BCKDHA敲除(KO)HEK 293T细胞中内源和AAV构建体表达的BCKDHA和BCKDHB蛋白。显示了与BCKDHB共表达或单独表达的BCKDHA载体。BCKDHB在共表达时可使BCKDHA稳定。图3B：用表达BCKDHA和/或BCKDHB蛋白的不同AAV构建体转染的WT和BCKDHA KOHEK 293T细胞的BCKDC酶活性。当BCKDHA和BCKDHB在BCKDHA KO HEK 293T细胞中共表达时，BCKDC酶活性可更有效地恢复。

图4A-4F显示表达BCKDHA的AAV构建体的体内安全性试验。图4A：AAV载体在WT小鼠中的递送的体内安全性和效率试验。图4B：表达BCKDHA的AAV载体的注射剂量。图4C：不同剂量注射的雄性小鼠体重曲线。图4D：不同剂量注射的雌性小鼠体重曲线。图4E：不同剂量注射的小鼠的ALT试验。图4F：不同剂量注射的小鼠的AST试验。

图5A-5C显示单基因载体的安全性测试。图5A显示检查对新生阶段的WT小鼠进行单基因载体注射的安全性的工作流程。图5B显示注射后4周的经治疗小鼠的ALT和AST。图5C显示载体治疗后小鼠的体重变化。WPI：注射后周数。ssA-L：单链BCKDHA载体-低剂量。scA-L：自我互补的BCKDHA载体-低剂量。scA-H：自我互补的BCKDHA载体-高剂量。

图6A-6F显示双元载体(binary vector)的安全性测试。图6A显示检查对新生阶段的WT小鼠进行双元载体注射的安全性的工作流程。图6B显示用T2A双元载体治疗的小鼠的ALT和体重变化。图6C显示用双向双元载体治疗的小鼠的ALT和体重变化。图6D显示检查对WT小鼠的青年成年(young adult)阶段进行双元载体注射的安全性的工作流程。图6E显示用T2A双元载体治疗的小鼠的ALT和体重变化。图6F显示用双向双元载体治疗的小鼠的ALT和体重变化。WPI：注射后周数。

图7A-7C显示用双元载体治疗的WT小鼠的血清BCAA浓度和比率。图7A显示用T2A双元载体治疗的WT小鼠的血清BCAA浓度。图7B显示用双向双元载体治疗的WT小鼠的血清BCAA浓度。图7C显示用T2A或双向双元载体治疗的WT小鼠的血清Leu/Iso和Val/Leu比率。BCAA：支链氨基酸。

图8A-8B显示表达牛BCKDHA和BCKDHB的AAV构建体。图8A示出了显示同时以单链形式表达牛BCKDHA-BCKDHB cDNA的两个构建体的示意图。上图使用T2A序列连接两个基因盒(SEQ ID NO：12)。下图使用共享一个共同增强子的双向启动子来驱动两个基因的表达(SEQID NO：11)。图8B显示蛋白质印迹，其显示来自不同物种的细胞系中内源性和AAV构建体表达的BCKDHA和BCKDHB蛋白。hA：人BCKDHA。hB：人BCKDHB。cA：牛BCKDHA。cB：牛BCKDHB。

图9A-9B显示描述牛BCKDHA和BCKDHB的rAAV构建体的两个实施方案的示意图。图9A：pAAV-Bi-cBCKDHA-cBCKDHB(例如，SEQ ID NO：11)。图9B：pAAV-cBCKDHB-2A-cBCKDHA(例如，SEQ ID NO：12)。

图10A-10C显示Bckdha KO小鼠模型的表征。图10A显示Bckdha KO小鼠模型与同窝对照小鼠相比的生存曲线。图10B显示在指定年龄时的体重量化和身体尺寸的代表性图片。图10C显示P2幼崽血清中的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和疾病标志物别异亮氨酸水平。

图11A-11D显示在P0时在Bckdha KO小鼠中用rAAV9载体进行全身治疗后的治疗益处。图11A显示在Bckdha KO小鼠中用rAAV9载体进行新生儿治疗的工作流程和剂量方案。图11B显示用不同剂量的PBS或rAAV9载体治疗的Bckdha KO小鼠的生存曲线。图11C显示用PBS注射的WT对照小鼠和用不同剂量的rAAV9载体治疗的Bckdha KO小鼠的体重生长。图1ID显示用PBS注射的WT对照小鼠或用不同剂量的rAAV9载体治疗的Bckdha KO小鼠的血清中的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和疾病标志物别异亮氨酸水平。sCA：rAAV9sc-hBCKDHA。A-Bip-B：rAAV9-hBCKDHA-Bip-hBCKDHB。Bip：双向启动子。

图12A-12D显示经治疗的Bckdha KO小鼠中的高蛋白饮食挑战。图12A显示高蛋白饮食挑战测定的工作流程。在挑战前一天(-1)，从喂食含有20％蛋白质的常规饮食的16周龄小鼠中采集血清。在更换为含有40％蛋白质的高蛋白饮食后，在挑战后一天(+1)和挑战后7天(+7)，从同一只小鼠采集血清。图12B-12D显示了高蛋白饮食挑战前后WT对照小鼠和用不同剂量的rAAV9载体治疗的Bckdha KO小鼠的行为评价(图12B)、通过笼悬置时间测量的运动功能(图12C)以及支链氨基酸的血清生物化学(图12D)。scA：rAAV9sc-hBCKDHA。A-Bip-B：rAAV9-hBCKDHA-Bip-hBCKDHB。Bip：双向启动子。

图13A-13C显示经治疗的Bckdha KO小鼠的T2加权MRI分析。图13A和13B显示在高蛋白饮食挑战之前(图13A)和之后(图13B)WT对照小鼠和用rAAV9载体(低剂量：2.7×10¹³GC/kg)治疗的Bckdha KO小鼠的代表性T2加权MRI图像。每行显示来自一只代表性小鼠的一系列冠状图像。经scA治疗的KO/KO组中显示了两只小鼠，因为在该组中发现了水肿和正常的脑。图13C显示在不同治疗组中通过T2加权MRI测量的脑水肿的汇总表。scA：rAAV9sc-hBCKDHA。A-Bip-B：rAAV9-hBCKDHA-Bip-hBCKDHB。Bip：双向启动子。

图14A-14C显示双基因载体(dual-gene vector)拯救Bckdhb KO小鼠的生存和生长。图14A显示在Bckdhb KO小鼠中用rAAV9载体进行新生儿治疗的工作流程和剂量方案。图14B显示用PBS或不同剂量的rAAV9A-Bip-B载体治疗的Bckdhb KO小鼠的生存曲线。图14C显示WT对照小鼠和用中等剂量(8.7×10¹³GC/kg)的rAAV9 A-Bip-B载体治疗的Bckdhb KO小鼠的体重生长。sCA：rAAV9sc-hBCKDHA。A-Bip-B：rAAV9-hBCKDHA-Bip-hBCKDHB。Bip：双向启动子。

图15A-15C显示小牛股四头肌中AAV载体基因组和转录物的定量。显示了在所示年龄时未经治疗的对照小牛和用5.0×10¹³GC/kg的rAAV9双基因载体治疗的Bckdha缺陷小牛的肌肉活检中的载体基因组拷贝数(图15A)、opt-cBCKDHA mRNA拷贝数(图15B)和内源牛BCKDHA mRNA拷贝数(图15C)。牛TATA结合蛋白(Tbp)mRNA用作标准化的内源标准品。每个点代表技术重复。cBCKDHA：牛BCKDHA

图16A-16F显示将rAAV9双基因载体全身递送至Bckdha缺陷小牛后的功效分析。在P2时用5.0×10¹³GC/kg剂量的rAAV9双基因载体治疗的Bckdha缺陷小牛的生存时间(图16A)、体重生长(图16B)、血浆亮氨酸浓度(图16C)、血浆支链氨基酸(图16D)和别异亮氨酸(图16E)浓度以及支链氨基酸的血浆摩尔比(图16F)。

发明详述

在本公开中，显示通过使用rAAV可以调节(例如，上调、下调)BCKDHA和/或BCKDAB和/或可以促进功能性蛋白的表达。例如但不限于，这可能对在至少一个内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因中具有功能丧失性突变的受试者感兴趣，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度异常，和/或其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率异常。因此，本文提供了一种调节受试者的BCAA血清水平和/或亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的比率的方法。

因此，除其他方法外，本文提供了一种用于促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开涉及一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开涉及一种向有需要的受试者递送转基因的方法，其中转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的BCAA比率血清水平正常化，所述方法通过向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸的rAAV。

在一些方面，本公开涉及用于由BCKDHA双等位基因突变引起的枫糖尿症(MSUD)的AAV介导的基因替代疗法。在一些实施方案中，提供了表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA)的AAV载体，其显示了在各种细胞系中经验证的蛋白表达(例如实施例1)。在一些实施方案中，opti-BCKDHA盒是包含AAV9衣壳的rAAV的一部分。在一些实施方案中，rAAV通过全身注射递送，并有效靶向肝脏和骨骼肌，即显示高水平BCKDHA表达的组织。在一些实施方案中，与现有治疗相比，本文公开的BCKDHA基因替代疗法是治疗MSUD的更安全且更有效的选择。

在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含T-A颠换(transversion)，导致tyr394至asn(TYR394ASN)。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含剪接位点突变、错义突变、截短突变或无义突变。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因具有相同的功能丧失性突变(纯合状态)。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因具有不同的功能丧失性突变(复合杂合状态)。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含8-bp缺失(887_894del)。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因在外显子7中包含895G-A转换，导致gly245至arg(G245R)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含1253T-G颠换，导致phe364至cys(F364C)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含C至T转换，导致arg220至trp(R220W)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含G至A转变，导致gly204至ser(G204S)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含C至G颠换，导致thr265至arg(T265R)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因在BCKDHA基因中包含C至G颠换，导致cys219至trp(C219W)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含1-bp缺失(117delC)，导致移码，编码仅具有61个残基的截短蛋白。

在一些方面，本公开涉及用于由BCKDHB双等位基因突变引起的MSUD的AAV介导的基因替代疗法。在一些实施方案中，提供了表达密码子优化的人BCKDHB基因(opti-BCKDHB)的AAV载体，其显示了在各种细胞系中经验证的蛋白表达(例如，实施例2)。在一些实施方案中，将opti-BCKDHB盒包装至包含AAV9衣壳的rAAV中。在一些实施方案中，rAAV通过全身注射递送，并有效靶向肝脏和骨骼肌，即显示高水平的BCKDHB表达的组织。在一些实施方案中，与现有治疗相比，本文公开的BCKDHB基因替代疗法是治疗MSUD的更安全且更有效的选择。

在一些实施方案中，内源BCKDHB等位基因包含剪接位点突变、错义突变、截短突变或无义突变。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子1中包含11个碱基对的缺失。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子5中包含鸟嘌呤(G)至胞嘧啶(C)的变化，导致残基183处的精氨酸至脯氨酸取代(R183P)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因包含C至胸腺嘧啶(T)转换，导致残基156处的组氨酸至酪氨酸取代(H156Y)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因包含T至G颠换，导致残基69处的缬氨酸至甘氨酸取代(V69G)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在内含子9中包含4个碱基对的缺失，导致外显子10缺失，以及在外显子10中包含8个碱基对的插入，导致移码。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子10中包含8个碱基对的插入。

在一些方面，本公开涉及用于由BCKDHA和/或BCKDHB双等位基因突变引起的MSUD的AAV介导的基因替代疗法。在一些实施方案中，提供了表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA)和/或密码子优化的人BCKDHB基因(opti-BCKDHB)的AAV载体，其显示了在各种细胞系中经验证的蛋白表达(例如，实施例2)。在一些实施方案中，将opti-BCKDHA和opti-BCKDHB盒包装至包含AAV9衣壳的rAAV中。在一些实施方案中，rAAV通过全身注射递送，并有效靶向肝脏和骨骼肌，即显示高水平的BCKDHA和/或BCKDHB表达的组织。在一些实施方案中，与现有治疗相比，如本文公开的BCKDHA和BCKDHB基因替代疗法是治疗MSUD的更安全且更有效的选择。

分离的核酸

在一些方面，本公开提供了包含至少一个与启动子有效连接的转基因的核酸，其中所述转基因编码BCKDHA(支链酮酸脱氢酶E1α多肽；GENE ID：593)。

BCKDHA基因编码支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物(BCKD；EC 1.2.4.4)的E1-α亚基，该复合物是催化从异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸衍生的支链α-酮酸的氧化脱羧的一种线粒体内的酶复合物。该反应是支链氨基酸分解代谢中的第二个主要步骤。BCKD复合物由三种催化组分组成：异四聚体(α2-β2)支链α-酮酸脱羧酶(E1)，同-24-聚体二氢硫辛酰转酰酶(E2；248610)，和同二聚体二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3；238331)。E1是依赖于硫胺素焦磷酸(TPP)的酶。该反应是不可逆的，并且构成BCAA氧化中的第一个关键步骤。BCKDHB基因(248611)编码E1的β亚基。该复合物还含有2种调节酶、1种激酶和1种磷酸化酶。

BCKDHA基因可编码具有NM_000709.4或NM_001164783.1的核苷酸序列的mRNA。BCKDHA基因可编码具有氨基酸序列NP_000700.1或NP_001158255.1的蛋白。在一些实施方案中，所述opti-BCKDHA转基因包含SEQ ID NO：1的序列。在一些实施方案中，所述opti-BCKDHA转基因包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。术语“同一性百分比”、“序列同一性”、“％同一性”、“％序列同一性”和“％同一”在本文中可互换使用，指两个序列(例如，核酸或氨基酸)之间相似性的定量测定值。人类和其他物种之间的基因组DNA序列、内含子和外显子序列以及氨基酸序列的同一性百分比随物种类型而变化，其中在每一类别中所有物种中黑猩猩与人具有最高的同一性百分比。同一性百分比可以使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法，其改良版是Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993。这类算法并入在NBLAST和XBLAST程序(2.0版)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与目的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在缺口时，可以使用缺口BLAST，如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997所述。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。除非另有说明，否则当陈述同一性百分比或其范围(例如，至少、大于等等)时，应包括端值并且范围(例如，至少70％同一性)应包括所述范围内的所有范围(例如，至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性)和其所有增量(例如百分数的十分之一(即0.1％)、百分数的百分之一(即0.01％)，等等)。在一些实施方案中，核酸包含至少一种编码BCKDHA的转基因，其中BCKDHA是人BCKDHA。在一些实施方案中，核酸包含至少一种编码BCKDHA的转基因，其中BCKDHA是牛(例如，牛科)BCKDHA。

在一些方面，本公开提供了包含至少一个与启动子有效连接的转基因的核酸，其中所述转基因编码BCKDHB(支链酮酸脱氢酶E1β多肽；GENE ID：594)。

BCKDHB基因编码支链α-酮酸BCAA的E1-β亚基。BCKDHB基因编码E1的β亚基。

BCKDHB基因可编码具有NM_000056.4、NM_001318975.1或NM_183050.4的核苷酸序列的mRNA。BCKDHB基因可编码具有氨基酸序列NP_000047.1、NP_898871.1或NP_001305904.1的蛋白。在一些实施方案中，opti-BCKDHB转基因包含SEQ ID NO：4的序列。在一些实施方案中，opti-BCKDHB转基因包含与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，核酸包含至少一种编码BCKDHB的转基因，其中BCKDHB是人BCKDHB。在一些实施方案中，核酸包含至少一种编码BCKDHB的转基因，其中BCKDHB是牛(例如，牛科)BCKDHB。

编码蛋白的转基因通常有效连接至启动子。如本文所用，“有效连接”的序列包括与目的基因(例如转基因)邻接的表达控制序列和以反式或以一定距离作用以控制目的基因(例如转基因)的表达控制序列两者。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子，例如鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子(任选地与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起)[参见，例如Boshart et al.,Cell,41:521-530(1985)]、猿猴空泡病毒40(SV40)启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是U6启动子。

在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素如温度或特定生理状态的存在来调节，所述特定生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已有描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)，另见Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导系统(Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。可在该上下文中使用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态调节的启动子，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。

在另一个实施方案中，将使用针对转基因(例如BCKDHA、BCKDHB)的天然启动子。当希望转基因的表达模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发育上或以组织特异性方式或响应于特异性转录刺激而调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列，也可用于模拟天然表达。

在一些实施方案中，启动子驱动神经元组织中的转基因表达。在一些实施方案中，本公开提供了有效地包含有效连接至转基因的组织特异性启动子的核酸。如本文所用，“组织特异性启动子”是指相对于其他细胞类型优先调节(例如，驱动或上调)特定细胞类型中的基因表达的启动子。细胞类型特异性启动子可以是对任何细胞类型特异的，例如肝细胞(例如肝实质细胞(hepatocyte))、心脏细胞、肌细胞等。

组织特异性启动子的其他实例包括但不限于肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子(Arbuthnot etal.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨钙蛋白启动子(Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen et al.,J.BoneMiner.Res.,11:654-64(1996))、CD2启动子(Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)和免疫球蛋白重链启动子，以及对技术人员显而易见的其他启动子。

在一些方面，本公开涉及分离的核酸，其包含通过嵌合内含子与启动子有效连接的转基因(例如BCKDHA、BCKDHB)。在一些实施方案中，嵌合内含子包含来自鸡β-肌动蛋白基因的核酸序列，例如来自鸡β-肌动蛋白基因的内含子1的非编码内含子序列。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列的长度范围为约50至约150个核苷酸(例如，50至150个核苷酸之间(包括端值)的任何长度)。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列的长度范围为约100至120(例如，100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120)个核苷酸。在一些实施方案中，嵌合内含子与一个或多个非翻译序列(例如，位于启动子序列和嵌合内含子序列之间的非翻译序列和/或位于嵌合内含子和转基因序列的第一密码子之间的非翻译序列)相邻。在一些实施方案中，所述一个或多个非翻译序列中的每一个均是来自兔β-球蛋白基因的非编码序列(例如，来自兔β-球蛋白外显子1、外显子2等的非翻译序列)。

重组AAV

本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)和含有编码BCKDHA或BCKDHAB的第一转基因的第二区域。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHA的第一转基因。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHB的第一转基因。在一些实施方案中，分离的核酸还包含含有第二转基因的第三区域，所述第二转基因可以与第一转基因不同或相同。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHA的第一转基因，并且第三区域包含编码第二目的基因(例如转基因)的第二转基因。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHB的第一转基因，并且第三区域包含编码第二目的基因(例如转基因)的第二转基因。在一些实施方案中，第二区域和第三区域各自包含编码BCKDHA的转基因。在一些实施方案中，第二区域和第三区域各自包含编码BCKDHB的转基因。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHA的第一转基因并且第三区域包含编码BCKDHB的第二转基因。在一些实施方案中，第二区域包含编码BCKDHB的第一转基因并且第三区域包含编码BCKDHA的第二转基因。分离的核酸(例如rAAV载体)可包装至衣壳蛋白中并施用给受试者和/或递送至所选靶细胞。转基因也可包含编码例如蛋白和/或表达控制序列(例如poly-A尾)的区域，如本公开中其他地方所述。

本公开提供了包含单个顺式作用的WT ITR的载体。在一些实施方案中，ITR是5’ITR。在一些实施方案中，ITR是3’ITR。通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用编码ITR的基本整个序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。在一些实施方案中，ITR可在其末端解析位点(TR)突变，这抑制了TR在此已突变的载体末端处的复制，并导致自身互补的AAV的形成。本公开中使用的这种分子的另一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选的转基因序列和相关调节元件的侧翼为5’AAV ITR序列和3’形成发夹的RNA序列。腺相关病毒ITR序列可从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，ITR序列是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10和/或AAVrh10 ITR序列。

在一些实施方案中，rAAV载体(例如pJW1-pAAV.pCB-CBA-opt-hBCKDHA-1)包含SEQID NO：2的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体是自身互补的载体(例如，pJW2-pAAVsc.CB6-opt-hBCKDHA-1)，其包含SEQ ID NO：3的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体(例如pJW152-pAAV.pCB-CBA-opt-hBCKDHB)包含SEQID NO：5的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体是自身互补的载体(例如，pJW153-pAAVsc.CB6-opt-hBCKDHB)，其包含SEQ ID NO：6的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：6具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体(例如pJW154-pAAV-pCB-opt-BCKDHB-T2A-opt-BCKDHA-1)包含SEQ ID NO：7的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQID NO：7具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体是自身互补的载体(例如pJW162-SURE\Cell-pAAV-SV40-opti-BCKDHA-BiCB6-opti-BCKDHB-RBG)，其包含SEQ ID NO：8的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体(例如，pAAV-Bi-cBCKDHA-cBCKDHB)包含SEQ ID NO：11的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，rAAV载体(例如，pAAV-cBCKDHB-2A-cBCKDHA)包含SEQ ID NO：12的核酸序列或其部分。在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

本公开的分离的核酸和/或rAAV可以经修饰和/或选择以增强分离的核酸和/或rAAV靶向至靶组织(例如，肝脏或骨骼肌)。修饰和/或选择的非限制性方法包括AAV衣壳血清型(例如AAV9)、组织特异性启动子和/或靶向肽。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包含对肝脏或骨骼肌组织具有增强的靶向性的AAV衣壳血清型(例如AAV9)。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包含对肝脏或骨骼肌组织具有增强的靶向性的AAV衣壳血清型以及组织特异性启动子。

在一些方面，本公开提供了分离的AAV。如本文所用，就AAV而言，术语“分离的”是指人工获得或生产的AAV。分离的AAV可以使用重组方法产生。这样的AAV在本文中称为“重组AAV”或“rAAV”。重组AAV优选具有组织特异性靶向能力，以便rAAV的转基因将被特异性递送至一种或多种预定组织。AAV衣壳是决定这些组织特异性靶向能力的重要元件。因此，可以选择具有适于靶向所述组织的衣壳的rAAV。在一些实施方案中，rAAV包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10或AAVrh10衣壳蛋白，或与其具有基本同源性的蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含AAV9衣壳蛋白。

在一些实施方案中，本公开的rAAV是假型化的rAAV。假型化是生产与外源病毒包膜蛋白组合的病毒或病毒载体的方法。结果是假型化的病毒颗粒。利用该方法，外源病毒包膜蛋白可用于改变宿主向性或增加/降低病毒颗粒的稳定性。在一些方面，假型化的rAAV包含来自两种或更多种不同AAV的核酸，其中来自一种AAV的核酸编码衣壳蛋白，并且至少一种其他AAV的核酸编码其他病毒蛋白和/或病毒基因组。在一些实施方案中，假型化的rAAV是指包含一种AAV血清型的反向末端重复(ITR)和不同AAV血清型的衣壳蛋白的AAV。例如，含有血清型X的ITR的用Y的蛋白作为衣壳的假型化的AAV载体将被命名为AAVX/Y(例如，AAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的衣壳)。在一些实施方案中，假型化的rAAV可用于组合来自一种AAV血清型的衣壳蛋白的组织特异性靶向能力与来自另一种AAV血清型的病毒DNA，从而允许将转基因靶向递送至靶组织。

获得具有期望衣壳蛋白的rAAV的方法是本领域公知的。(参见例如美国专利申请公开号US2003/0138772，其内容通过引用整体并入本文)。通常，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成的rAAV载体；和足够的辅助功能以允许将rAAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。通常，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三种衣壳蛋白，病毒体蛋白1至3(称为VP1、VP2和VP3)，所有这些病毒体蛋白通过可选剪接由单个cap基因转录。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译后，衣壳蛋白形成围绕病毒基因组的球形60-mer蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白保护病毒基因组，递送基因组和/或与宿主细胞相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白是选自AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10和AAVrh10的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有AAVrh8或AAVrh10血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有AAVrh8血清型。

在一些实施方案中，可以反式向宿主细胞提供要在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分。可选地，任何一种或多种所需组分(例如rAAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法工程化以含有一种或多种所需组分。最合适地，这种稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，所需组分可以在组成型启动子的控制下。在讨论适用于转基因的调节元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个可选方案中，选择的稳定宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的选择的组分和在一种或多种诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可产生稳定的宿主细胞，其源自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。

在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：1-8或11-12的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：1-8或11-12具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及包含核酸的宿主细胞，所述核酸含有与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：1的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQID NO：2的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：3的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQID NO：3具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：4的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：5的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQID NO：6的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：6具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：7的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQID NO：7具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：8的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：11的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的选自SEQ ID NO：12的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子有效连接的与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％同一性或更高)的序列。

在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。

用于生产本公开的rAAV的rAAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能可使用任何合适的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。所选的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些方法。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作领域的技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.。类似地，产生rAAV病毒体体(即感染性病毒颗粒)的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher et al.,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。

在一些实施方案中，rAAV可使用三重转染方法(详细描述于美国专利号6,001,650中)产生。通常，rAAV通过用将待包装成AAV颗粒的rAAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体(AAV helper function vector)和附属功能载体(accessory function vector)转染宿主细胞来制备。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，其以反式发挥作用用于生产性AAV的复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体生产，而不产生任何可检测的WT AAV病毒体(即含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括在美国专利号6,001,650中描述的pHLP19和在美国专利号6,156,303中描述的pRep6cap6载体，两者的全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码用于非AAV来源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV复制依赖于这些功能(即“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除单纯疱疹病毒1型之外)和牛痘病毒。

在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，并且当外源DNA已经通过细胞膜引入细胞时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域通常已知的。参见，例如Graham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier和Chuet al.(1981)Gene 13:197。这样的技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子，引入合适的宿主细胞。

“宿主细胞”是指携带或能够携带目的物质的任何细胞。通常宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或其他与rAAV生产相关的转移DNA的受体。该术语包括已经被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应理解，由于天然、偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代可不必须在形态学或基因组或总DNA互补物上与原始亲本完全相同。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域还已知，在这种克隆群体的储存或转移期间，核型中可发生自发或诱导的变化。因此，源自所提及的细胞系的细胞可能与祖细胞或培养物不是精确相同的，并且所提及的细胞系包括这样的变体。

如本文所用，术语“重组细胞”是指其中导入了外源DNA片段的细胞，所述外源DNA片段例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸如RNA产生的DNA片段。

如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制，并且其能够在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指启动基因的特异性转录所需的被细胞的合成机制或导入的合成机制识别的DNA序列。短语“有效地定位于”、“在控制下”或“在转录控制下”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。术语“表达载体或构建体”是指含有核酸的任何类型的基因构建体，核酸编码序列的部分或全部在其中均能够被转录。在一些实施方案中，例如，表达包括核酸的转录以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制物)。

前述用于将重组载体包装在所需AAV衣壳中以产生本公开的rAAV的方法不意在限制，并且其他合适的方法对本领域技术人员是显而易见的。

重组AAV载体

本公开的分离的核酸可以是rAAV载体。本公开的重组AAV载体通常至少由转基因及其调节序列以及5’和3’AAV ITR组成。正是这种rAAV载体被包装至衣壳蛋白中并被递送至所选的靶细胞。在一些实施方案中，转基因是与载体序列异源的核酸序列，其编码多肽、蛋白、功能性RNA分子或其他目的基因产物。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调节组分有效连接。

本公开的方面涉及以下发现，即rAAV调节序列的修饰产生了治疗有效但不引起与先前使用的rAAV相关的载体介导的毒性的转基因表达水平。因此，在一些实施方案中，本公开涉及包含修饰的基因调节元件的rAAV。在一些实施方案中，修饰的基因调节元件是杂合启动子。

如本文所用，术语“杂合启动子”指能够驱动RNA转录物(例如，包含转基因编码的转录物)转录的调节构建体，其中该构建体包含两个或更多个人工排列的调节元件。通常，杂合启动子包含至少一个是最小启动子的元件和至少一个具有增强子序列或包含一个或多个转录调控元件的内含子、外显子或非翻译区(UTR)序列的元件。在杂合启动子包含外显子、内含子或UTR序列的实施方案中，这样的序列可编码RNA转录物的上游部分，同时还含有调节(例如增强)转录物转录的调节元件。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件相对于彼此来自异源来源。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件相对于转基因来自异源来源。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件来自不同的遗传基因座。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件来自相同的遗传基因座，但以在遗传基因座处未发现的方式排列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自一个启动子的第一核酸序列，其融合至包含不同来源的启动子或增强子元件的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和CMV增强子的第二序列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和来自鸡β肌动蛋白基因的内含子的第二序列。在一些实施方案中，杂合启动子包含与CMV增强子序列融合的来自鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和来自鸡-β肌动蛋白基因的内含子的序列。

在一些方面，rAAV包含增强子元件。如本文所用，术语“增强子元件”是指当与激活蛋白结合时激活或增加一个或多个基因转录的核酸序列。增强子序列可以相对于它们调节的基因是上游(即5’)或下游(即3’)。增强子序列的实例包括巨细胞病毒(CMV)增强子序列和SV40增强子序列。在一些实施方案中，rAAV包含CMV增强子元件或其部分。如本文所用，术语“其部分”是指核苷酸或氨基酸序列的片段，其保留了其所来源的完整核苷酸或氨基酸序列的所需功能特征。例如，“CMV增强子序列或其部分”是指来源于WT CMV增强子的核苷酸序列，其能够增加转基因的转录。

在一些方面，rAAV包含转录后应答元件。如本文所用，术语“转录后应答元件”是指转录时采取增强基因表达的三级结构的核酸序列。转录后调节元件的实例包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、小鼠RNA转运元件(RTE)、猿逆转录病毒1型(SRV-1)的组成型转运元件(CTE)、来自Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)的CTE和人热休克蛋白70的5’非翻译区(Hsp705’UTR)。在一些实施方案中，rAAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。

在一些方面，本公开提供了包含杂合或嵌合内含子的rAAV载体。如本文所用，术语“嵌合内含子”是指具有来自两种或更多种不同来源的序列的内含子。在一些实施方案中，嵌合内含子包含编码来自第一来源(例如生物体或物种)的剪接供体位点和来自第二来源(例如生物体或物种)的剪接受体位点的核酸。在一些实施方案中，嵌合内含子包含一个或多个转录调节元件和/或增强子序列。在一些实施方案中，嵌合内含子位于杂合启动子的外显子和转基因之间。在一些实施方案中，本公开提供了包含与转基因有效连接的启动子的rAAV，其中转基因编码BCKDHA蛋白，且其中rAAV还包含嵌合内含子。在一些实施方案中，本公开提供了包含与转基因有效连接的启动子的rAAV，其中该转基因编码BCKDHB蛋白，且其中该rAAV进一步包含嵌合内含子。在一些实施方案中，本公开提供了包含与第一转基因(其中该转基因编码BCKDHA蛋白)和第二转基因(其中该转基因编码BCKDHB蛋白)有效连接的启动子的rAAV，且其中该rAAV还包含嵌合内含子。

在一些实施方案中，本公开涉及包含人工转录元件的rAAV载体。如本文所用，在一些实施方案中，术语“人工转录元件”是指能够实现RNA聚合酶对DNA的受控转录以产生RNA转录物的合成序列。本公开的转录活性元件通常小于500bp，优选小于200bp，更优选小于100bp，最优选小于50bp。在一些实施方案中，人工转录元件包含来自转录活性元件的两个或更多个核酸序列。转录活性元件是本领域普遍认可的，并且包括例如启动子、增强子序列、TATA盒、G/C盒、CCAAT盒、特异性蛋白1(Sp1)结合位点、Inr区、CRE(cAMP调节元件)、激活转录因子1(ATF1)结合位点、ATF1-CRE结合位点、APBbeta盒、APBalpha盒、CArG盒、CCAC盒和美国专利号6,346,415所公开的那些。也包括上述转录活性元件的组合。

在一些实施方案中，人工转录元件包含启动子序列。在一些实施方案中，人工转录元件包含增强子序列。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点。在一些实施方案中，人工转录元件包含SP1结合位点。在一些实施方案中，人工转录元件包含C盒。在一些实施方案中，人工转录元件包含TATA盒。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点、SP1结合位点和TATA盒。

表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。本领域已知并且可以利用大量表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子。

如本文所用，当核酸序列(例如编码序列)和调节序列以使核酸序列的表达或转录处于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，称它们是“有效(operably)”连接的。如果希望核酸序列翻译成功能性蛋白，如果5’调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白的能力，则认为两个DNA序列是有效连接的。因此，如果启动子区能够影响DNA序列的转录，使得所得转录物可以翻译成所需蛋白或多肽，则该启动子区将与核酸序列有效连接。类似地，当两个或更多个编码区以这样的方式连接时，即它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已在框内翻译的蛋白的表达，则它们是有效连接的。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生功能性RNA(例如shRNA、miRNA、miRNA抑制物)。

对于编码蛋白的核酸，通常在转基因序列之后和3’AAV ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。可用于本公开的rAAV构建体也可含有内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列衍生自SV-40，并称为SV-40T内含子序列。

可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列被用于从单个基因转录物产生多于一种多肽。IRES序列将用于产生含有多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见的载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列都是可获得的[参见，例如，Sambrook等人以及其中引用的参考文献，例如，第3.183.26和16.17 16.27页和Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989]。在一些实施方案中，口蹄疫病毒2A序列包括在多蛋白中；这是一种小肽(长度约18个氨基酸)，已显示它介导多蛋白的裂解(Ryan,M D et al.,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M etal.,J Virology,November 1996；p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy,2001；8:864-873；和Halpin,C et al.,The Plant Journal,1999；4:453-459)。2A序列的切割活性先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证实(Ryan,M Det al.,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M et al.,J Virology,1996年11月；p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy,2001；8:864-873；和Halpin,C et al.,The PlantJournal,1999；4:453-459；de Felipe,P et al.,Gene Therapy,1999；6:198-208；deFelipe,P et al.,Human Gene Therapy,2000；11:1921-1931.；和Klump,H et al.,GeneTherapy,2001；8:811-817)。

宿主细胞中基因表达所需的调节序列的精确性质可以在物种、组织或细胞类型之间变化，但通常应包括(根据需要)分别涉及转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、增强子元件等。特别地，这种5’非转录调控序列将包括启动子区，该启动子区包括用于有效连接的基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。本公开的载体可以任选地包括5’前导或信号序列。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起)[参见，例如Boshart et al.,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。

诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素如温度或特定生理状态的存在来调节，所述生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已有描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)，另见Harveyet al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导系统(Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在该上下文中可使用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态调节的启动子，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。

载体的AAV序列通常包含顺式作用5’和3’反向末端重复序列(参见，例如，B.J.Carter,in"Handbook of Parvoviruses",ed.,P.Tijsser,CRC Press,pp.155 168(1990))。ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用编码ITR的基本上全部序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域技术人员的能力范围内。(参见，例如，教科书如Sambrook et al.,"Molecular Cloning.A LaboratoryManual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher etal.,J Virol.,70:520532(1996))。本公开中使用的这种分子的一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关调节元件的侧翼为5’和3’AAV ITR序列。AAVITR序列可从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。

在一些实施方案中，本公开的rAAV是假型化的rAAV。例如，含有血清型X的ITR的用Y的蛋白作为衣壳的假型化的AAV载体将被命名为AAVX/Y(例如，AAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的衣壳)。在一些实施方案中，假型化的rAAV可用于组合来自一种AAV血清型的衣壳蛋白的组织特异性靶向能力与来自另一种AAV血清型的病毒DNA，从而允许转基因靶向递送至靶组织。

除了以上鉴定的rAAV载体的主要元件外，所述载体还包括必需的常规控制元件，其以允许其在用质粒载体转染的或用本公开产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式有效连接至转基因。

重组AAV载体：转基因编码序列

rAAV载体的转基因序列的组成将取决于所得载体的用途。例如，一种类型的转基因序列包含报告序列，其在表达时产生可检测的信号。在另一个实例中，转基因编码治疗性蛋白。在另一个实例中，转基因编码旨在用于研究目的的蛋白，例如，以产生携带所述转基因的体细胞转基因动物模型，例如，以研究所述转基因产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于创建疾病动物模型的蛋白。

在一些实施方案中，本公开提供了包含编码BCKDHA的转基因的rAAV。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码BCKDHB的转基因的rAAV。在一些实施方案中，本公开提供了包含多于一个转基因的rAAV。在一些实施方案中，rAAV包含编码BCKDHA和BCKDHB的转基因。本文还涉及通过使用本文所述的rAAV将转基因递送至受试者来治疗MSUD的方法。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码BCKDHB的转基因的rAAV。本文还涉及通过使用本文所述的rAAV将转基因递送至受试者来治疗MSUD的方法。本文还涉及通过使用本文所述的rAAV将转基因递送至受试者来治疗MSUD的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗MSUD的方法，所述方法包括将rAAV施用至受试者。在一些实施方案中，rAAV包含杂合启动子。在一些实施方案中，rAAV包含嵌合内含子。在一些实施方案中，rAAV包含人工转录元件。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点、SP1结合位点和TATA盒。在一些实施方案中，启动子、嵌合内含子或人工转录元件与转基因有效连接。在一些实施方案中，转基因编码BCKDHA。在一些实施方案中，转基因编码BCKDHB。在一些实施方案中，转基因编码BCKDHA和BCKDHB。

重组AAV施用方法

rAAV可以根据本领域已知的任何合适的方法以组合物递送至受试者。rAAV，优选悬浮在生理学上相容的载体中(即，在组合物中)，可施用给受试者(即，宿主动物(例如，人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如，猕猴)))。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。

rAAV向哺乳动物受试者的递送可以通过例如肌内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流中。可以通过注射至静脉、动脉或任何其他血管导管中来施用至血流中。在一些实施方案中，通过分离的肢体输注将rAAV施用至血流中，所述分离的肢体输注是外科领域中公知的技术，该方法基本上使得技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体从体循环分离。技术人员还可以使用美国专利号6,177,403中描述的分离的肢体输注技术的变体将病毒体施用至分离的肢体的脉管系统以潜在地增强向肌肉细胞或组织的转导。

本公开的方面涉及包含rAAV的组合物，所述rAAV包含至少一个修饰的遗传调控序列或元件。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

本公开的组合物可包含单独的rAAV，或与一种或多种其他病毒组合(例如，编码具有一个或多个不同转基因的第二rAAV)。在一些实施方案中，组合物包含各自具有一个或多个不同转基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的rAAV。

在一些方面，本公开涉及包含rAAV的组合物(例如药物组合物)，所述rAAV包含编码BCKDHA的核酸。在一些方面，本公开涉及包含rAAV的组合物(例如药物组合物)，所述rAAV包含编码BCKDHB的核酸。在一些方面，本公开涉及包含rAAV的组合物(例如药物组合物)，所述rAAV包含编码BCKDHA和BCKDHB的核酸。

本领域技术人员根据rAAV所针对的适应症可以容易地选择合适的运载体(carrier)。例如，一种合适的运载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性运载体包括无菌生理盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不是本公开的限制。

任选地，本公开的组合物除了rAAV和运载体之外还可含有其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括三氯叔丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

重组AAV以足够量施用，以转染所需组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达，而没有不适当的副作用。常规的药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至选定的器官(例如注射至肝、骨骼肌)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。

实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，以基因组拷贝/每千克体重(GC/kg)表示的剂量单位，将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于：rAAV病毒体施用的途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症、以及基因或RNA产物的稳定性。本领域技术人员可基于上述因素以及本领域熟知的其他因素容易地确定rAAV病毒体剂量范围以治疗患有特定疾病或病症的患者。

术语“有效量”、“治疗有效量”和“药学有效量”在本文中可互换使用，指的是足以引发期望的应答的生物活性剂(例如，本公开的分离的核酸、rAAV、组合物)的量。有效量将主要取决于诸如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织等因素，因此可在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml含有约10⁶至10¹⁶个基因组拷贝(例如，1x 10⁶至1x 10¹⁶，包括端值)的溶液的范围内。在一些情况下，约10¹¹至10¹²个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹³个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹⁴个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约10¹¹至10¹⁵个rAAV基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，4.68×10⁷的剂量是合适的。在一些实施方案中，4.68×10⁸个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，4.68×10⁹个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，1.17×10¹⁰个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，2.34×10¹⁰个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，3.20×10¹¹个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，1.2×10¹³个基因组拷贝的剂量是合适的。在一些实施方案中，约1×10¹⁴个载体基因组(vg)拷贝的剂量是合适的。

在一些方面，本公开涉及以下认识：向受试者施用AAV的一种潜在副作用是受试者对AAV的包括炎症在内的免疫应答。在一些实施方案中，在施用如本文所述的一种或多种rAAV之前对受试者进行免疫抑制。

如本文所用，“免疫抑制的”或“免疫抑制”是指受试者的免疫应答的激活或效力的降低。可以使用一种或多种(例如多种，例如2、3、4、5或更多种)药剂诱导受试者的免疫抑制，所述药剂包括但不限于利妥昔单抗、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、西罗莫司、免疫球蛋白注射、泼尼松、甲氨蝶呤及其任何组合。

在一些实施方案中，本公开所述的方法还包括在向受试者施用rAAV(例如，本公开所述的rAAV或药物组合物)之前诱导受试者的免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)的步骤。在一些实施方案中，在将rAAV施用至受试者之前约30天至约0天之间(例如，30天直至施用rAAV之间的任何时间，包括端值)，对受试者进行免疫抑制(例如，诱导受试者的免疫抑制)。在一些实施方案中，用免疫抑制(例如，利妥昔单抗、西罗莫司和/或泼尼松)预处理受试者至少7天。

在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物期间和/或之后维持受试者的免疫抑制。在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物后1天至1年之间，对受试者进行免疫抑制(例如施用一种或多种免疫抑制剂)。

在一些实施方案中，rAAV组合物经配制以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是当存在高rAAV浓度(例如约10¹³GC/ml或更高)时。用于减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等。参见，例如Wright FR,et al.,Molecular Therapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。

药学上可接受的赋形剂和运载体溶液的制剂是本领域技术人员公知的，在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案的开发也是公知的。

通常，这些制剂可以含有至少约0.1％或更多的活性化合物，当然活性成分的百分比可以变化，并且可以方便地为总制剂的重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更多。当然，可以制备各治疗上有用的组合物中活性化合物的量，使得在化合物的任何给定单位剂量中获得合适的剂量。制备这类药物制剂的本领域技术人员会考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑因素的因素，并且由此可以要求多种剂量和治疗方案。

在一些情况下，在本文公开的合适配制的药物组合物中以皮下、胰腺内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入递送基于rAAV的治疗性构建体是合乎需要的。在一些实施方案中，如美国专利号5,543,158、5,641,515和5,399,363(其每个通过引用以其整体具体地并入本文)中所述的施用方式可用于递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用模式是通过门静脉注射。

适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，所述形式是无菌的，并且具有容易注射的程度的流动性。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须防腐以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用包衣剂如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。预防微生物作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

例如，对于可注射水性溶液的施用，如果需要，溶液可以适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下输液(hypodermoclysis)的液体中或在预定的输注部位注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体宿主的合适剂量。

通过将所需量的活性rAAV与本文列举的各种其他成分一起掺入适当溶剂中，并根据需要随后过滤灭菌，来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入至无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从其先前的无菌过滤溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。

本文公开的rAAV组合物也可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其利用无机酸如盐酸或磷酸形成，或利用有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。利用游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，例如，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量施用。所述制剂易于以各种剂型施用，例如注射溶液、药物释放胶囊等。

如本文所用，“运载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣剂、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。这类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充的活性成分也可以掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

递送媒介物如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等，可以用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，可以配制rAAV载体递送的转基因，用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的递送。

这样的制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂可以是优选的。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法(美国专利5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。

脂质体已经成功地用于通常对通过其他方法的转染有抗性的许多细胞类型。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度限制。脂质体已经被有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和别构效应剂引入至多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了一些成功的临床试验，用于检验脂质体介导的药物递送的有效性。

脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的直径通常是25nm至4μm。MLV的超声处理导致形成直径在200至500埃范围内的小的单层囊泡(SUV)，在核中包含水性溶液。

或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可再现的方式捕获物质。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，这种超细颗粒(尺寸为约0.1μm)应当使用能够在体内降解的聚合物来设计。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。

除了上述递送方法之外，还考虑下列技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。已经使用超声波导入法(sonophoresis)(例如超声)，并且在美国专利号5,656,016中其被描述为用于提高药物渗透进入和通过循环系统的速率和功效的装置。其他预期的药物递送替代方案是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼用制剂(Bourlais等人,1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制递送(美国专利号5,697,899)。

在一些实施方案中，本公开涉及将一种或多种另外的治疗剂施用给已被施用如本文所述的rAAV或药物组合物的受试者。

试剂盒和相关组合物

在一些实施方案中，本文所述的药剂(例如，核酸、rAAV、载体等)可被组装成药物试剂盒或诊断试剂盒或研究试剂盒，以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可以包括一个或多个容器，其容纳本公开的组分和使用说明书。具体地，这样的试剂盒可以包括一种或多种本文所述的药剂，以及描述这些药剂的预期应用和正确使用的说明书。在一些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适合于特定应用和适合于药剂的施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含用于进行各种实验的适当浓度或量的组分。

在一些实施方案中，本公开涉及用于产生rAAV的试剂盒，所述试剂盒包含容纳具有SEQ ID NO：1-8或11-12中任一序列的分离的核酸的容器。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于产生rAAV的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含至少一个容纳rAAV载体的容器，其中rAAV载体包含转基因。

在一些实施方案中，本公开涉及包含容纳如上所述的rAAV的容器的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含容纳药学上可接受的运载体的容器。例如，试剂盒可以包含一个容纳rAAV的容器和容纳适于将rAAV注射至受试者中的缓冲剂的第二容器。在一些实施方案中，容器是注射器。

试剂盒可以经设计以便于研究人员使用本文所述的方法，并且可以采取许多形式。在适用的情况下，试剂盒的组合物的每种均可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可组成的(constitutable)或其他可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或细胞培养基)，其可以与或可以不与试剂盒一起提供。如本文所用，“说明书”可定义指导和/或推广的组成部分，并且通常涉及在本公开的包装上的或与之相关联的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，使得使用者清楚地认识到说明书与试剂盒相关联，例如视听(例如录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的沟通等。书面说明书可以采用管制药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书也可以反映动物施用的制造、使用或销售机构的批准。

试剂盒可以在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。作为一个实例，在一个实施方案中，试剂盒可以包括关于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。该试剂盒可以包括容纳本文所述的药剂的容器。所述药剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。所述药剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷冻运输。可选地，它可以容纳在小瓶或其他容器中以便储存。第二容器可以具有无菌制备的其他药剂。可选地，试剂盒可以包括预混合并在注射器、小瓶、管或其他容器中运输的活性剂。试剂盒可以具有将药剂施用给动物所需的一种或多种或所有组分，例如注射器、局部(topical)施用装置或静脉内(iv)针管和袋，特别是在用于产生特定身体动物模型的试剂盒的情况下。

在一些情况下，所述方法包括用从可能以非常低的丰度携带原病毒AAV基因组的组织分离的总细胞DNA转染细胞，并补充辅助病毒功能(例如腺病毒)，以触发和/或加强转染的细胞中AAV rep和cap基因转录。在一些情况下，来自转染的细胞的RNA提供了用于cDNA的RT-PCR扩增和新的AAV检测的模板。在用从可能携带原病毒AAV基因组的组织分离的总细胞DNA转染细胞的情况下，通常需要给细胞补充促进AAV基因转录的因子。例如，细胞也可用辅助病毒(helper virus)感染，如腺病毒或疱疹病毒。在一个具体实施方案中，辅助功能由腺病毒提供。腺病毒可以是WT腺病毒，并且可以是人或非人来源的，优选非人灵长类(NHP)来源。类似地，已知感染非人动物(例如黑猩猩、小鼠)的腺病毒也可用于本公开的方法中(参见例如美国专利号6,083,716)。除了WT腺病毒之外，还可以使用携带必需辅助功能的重组病毒或非病毒载体(例如质粒、附加体等)。这类重组病毒是本领域已知的，并且可以根据公开的技术制备。参见，例如，美国专利号5,871,982和美国专利号6,251,677，它们描述了杂合Ad/AAV病毒。多种腺病毒毒株可从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.)获得，或者可以根据请求从各种商业和机构来源获得。此外，许多此类毒株的序列都可从包括例如PubMed和GenBank的多种数据库获得。

细胞也可用载体(例如辅助载体)转染，所述载体为AAV提供辅助功能。提供辅助功能的载体可提供腺病毒功能，包括例如E1a、E1b、E2a、E4ORF6。提供这些功能的腺病毒基因的序列可从任何已知的腺病毒血清型获得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且还包括本领域已知的任何目前鉴定的人类类型。因此，在一些实施方案中，所述方法包括用表达AAV复制、AAV基因转录和/或AAV包装所需的一个或多个基因的载体转染细胞。

在一些情况下，新的分离的衣壳基因可使用本领域熟知的方法用于构建和包装rAAV载体，以确定与由该基因编码的新衣壳蛋白相关的功能特征。例如，新的分离的衣壳基因可用于构建和包装包含报告基因(例如，B-半乳糖苷酶、GFP、萤光素酶等)的rAAV载体。然后rAAV载体可被递送至动物(例如小鼠)，并且新的分离的衣壳基因的组织靶向特性可通过检测报告基因在动物的各种组织(例如心脏、肝、肾脏)中的表达来确定。本文公开了用于表征新的分离的衣壳基因的其他方法，并且其他方法是本领域公知的。

试剂盒可具有多种形式，例如泡罩袋(blister pouch)、收缩包裹袋(shrinkwrapped pouch)、真空可密封袋、可密封的热成形托盘或类似的袋或托盘形式(其中附件松散地包装在该袋内)、一个或多个管、容器、盒或包。在添加附件之后，可对试剂盒进行消毒，从而允许容器中的各个附件以其他方式打开包装。可以使用任何合适的灭菌技术，例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法，将试剂盒灭菌。根据具体应用，试剂盒还可以包括其他组件，例如容器、细胞培养基、盐、缓冲剂、药剂、注射器、针、用于施用或除去消毒剂的织物如纱布、一次性手套、施用前药剂的支持物等。

试剂盒中包含的说明书可涉及用于检测细胞中潜在AAV的方法。此外，本公开的试剂盒还可包括说明书、阴性和/或阳性对照、用于样品的容器、稀释剂和缓冲液、样品制备管和用于序列比较的参考AAV序列的印刷或电子表格。

治疗枫糖尿症(MSUD)的方法

本公开的方面提供了用于治疗MSUD的方法。MSUD由E1-α亚基基因中的突变引起，称为MSUD“IA型”；由E1-β亚基基因中的突变引起，称为“IB型”；和由E2亚基基因中的缺陷引起，称为“II型”。在一些实施方案中，MSUD的临床特征是智力和身体发育迟缓、进食问题和枫糖尿臭味。在一些实施方案中，支链氨基酸的酮酸存在于尿中，其由氧化脱羧的阻断产生。

因此，在一些实施方案中，本公开提供了可用于治疗MSUD的分离的核酸、rAAV、组合物和方法。术语“治疗”(treatment、treat和treating)在本文中可互换使用，指旨在逆转、减轻适应症、疾病、病症或其一种或多种症状，延迟其发作或抑制其进展的临床干预，如本文所述(例如MSUD)。在一些实施方案中，治疗可以在已经发展一种或多种症状之后和/或在疾病已经诊断之后施用。在其他实施方案中，治疗可以在没有症状时施用(例如，以预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展)。例如，治疗可以在症状发作之前(例如，根据症状的历史和/或根据遗传或其他易感性因素)施用给易感个体(例如，受试者)。在症状已经解决之后，也可以继续治疗，例如，以预防或延迟其复发。

在一些方面，本公开涉及促进受试者的功能性BCKDHA蛋白(其为支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基)表达的方法，该方法包括向受试者施用包含衣壳的rAAV，其含有经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA的核酸，其中所述受试者包含至少一个内源BCKDHA等位基因，其具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变。在一些实施方案中，所述分离的核酸、rAAV、组合物和方法用于治疗MSUD。在一些实施方案中，受试者的MSUD可为至少一个内源BCKDHA等位基因的结果，所述等位基因具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变。

在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHA等位基因包含T-A颠换，导致tyr394至asn(TYR394ASN)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHA等位基因包含剪接位点突变、错义突变、截短突变或无义突变。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含8个碱基对的缺失(887_894del)。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因在外显子7中包含895G-A转换，导致gly245至arg(G245R)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含1253T-G颠换，导致phe364至cys(F364C)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含C至T转换，导致arg220至trp(R220W)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含G至A转换，导致gly204至ser(G204S)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含C至G颠换，导致thr265至arg(T265R)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因在BCKDHA基因中包含C至G颠换，导致cys219至trp(C219W)取代。在一些实施方案中，内源BCKDHA等位基因包含1个碱基对的缺失(117delC)，导致移码，编码仅具有61个残基的截短的蛋白。

在一些实施方案中，受试者具有两个具有相同功能丧失性突变(纯合状态)的内源BCKDHA等位基因。在一些实施方案中，受试者具有两个具有不同的功能丧失性突变(复合杂合状态)的内源BCKDHA等位基因。

一种用于促进受试者的功能性BCKDHB蛋白表达的方法，所述功能性BCKDHB蛋白是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基，所述方法包括向所述受试者施用包含衣壳的rAAV，其含有经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHB等位基因。在一些实施方案中，受试者的MSUD可以是至少一个内源BCKDHB等位基因的结果，该等位基因具有至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHB等位基因。

在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子1中包含11个碱基对的缺失。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子5中包含鸟嘌呤(G)至胞嘧啶(C)改变，导致残基183处的精氨酸至脯氨酸取代(R183P)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因包含C至胸腺嘧啶(T)转换，导致在残基156处的组氨酸至酪氨酸取代(H156Y)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因包含T至G颠换，导致残基69处的缬氨酸至甘氨酸取代(V69G)。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在内含子9中包含4个碱基对的缺失，导致外显子10缺失，以及在外显子10中包含8个碱基对的插入，导致移码。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因在外显子10中包含8个碱基对的插入。在一些实施方案中，所述至少一个内源BCKDHB等位基因包含剪接位点突变、错义突变、截短突变或无义突变。在一些实施方案中，受试者具有两个具有相同功能丧失性突变(纯合状态)的内源BCKDHB等位基因。在一些实施方案中，受试者具有两个具有不同的功能丧失性突变(复合杂合状态)的内源BCKDHB等位基因。

用于治疗受试者的MSUD的方法可以包括施用包含编码BCKDHA的转基因的本公开的分离的核酸、rAAV或组合物。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)增加了受试者的功能性BCKDKA的表达。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的BCKDKA的功能性表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。许多方法是本领域技术人员已知的用于评价蛋白表达的方法，并且本领域技术人员将立即认识到它们的适用性。例如但不限于，可用于评价蛋白表达的方法是蛋白质印迹、HPLC LC/MS、抗体检测、ELISA、蛋白免疫沉淀、免疫电泳和/或蛋白免疫染色。可以相对于对照评价蛋白表达。在一些实施方案中，对照是已知与不具有功能丧失性等位基因或不具有MSUD的健康受试者的值相关的既定值。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)增加了支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。

用于治疗受试者的MSUD的方法可以包括施用包含编码BCKDHB的转基因的本公开的分离的核酸、rAAV或组合物。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)增加了受试者的功能性BCKDKB的表达。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的BCKDKB的功能性表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)增加了支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解(例如，相对于施用rAAV前的受试者)。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。许多方法是本领域技术人员已知的用于评价样品中氨基酸的方法，并且本领域技术人员将立即认识到它们的适用性。例如但不限于，可用于评价氨基酸的方法是离子交换色谱法、分光光度检测、液相色谱分离和/或质谱法。可以相对于对照评价氨基酸水平。在一些实施方案中，对照是已知与不具有功能丧失性等位基因或不具有MSUD的健康受试者的值相关的既定值。

在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)降低了亮氨酸与丙氨酸的比率。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的亮氨酸与丙氨酸的比率降低至少1％、10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与丙氨酸的比率降低至0.6或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与丙氨酸的比率降低至0.5或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与丙氨酸的比率降低至0.4或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与丙氨酸的比率降低至0.3或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)减少尿液支链α-酮酸(BCKA)：2-氧代异己酸、2-氧代-3-甲基戊酸、2-氧代异戊酸、2-羟基异戊酸、2-羟基异己酸和/或2-羟基-3-甲基戊酸。许多方法是本领域技术人员已知的用于评价样品中氨基酸的方法，并且本领域技术人员将立即认识到它们的适用性。例如但不限于，可用于评价氨基酸的方法是离子交换色谱法、分光光度检测、液相色谱分离和/或质谱法。可以相对于对照评价氨基酸水平。在一些实施方案中，对照是已知与不具有功能丧失性等位基因或不具有MSUD的健康受试者的值相关的既定值。

在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)降低了亮氨酸与异亮氨酸的比率。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的亮氨酸与异亮氨酸的比率降低至少1％、10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与异亮氨酸的比率降低至0.6或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与异亮氨酸的比率降低至0.5或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与异亮氨酸的比率降低至0.4或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将亮氨酸与异亮氨酸的比率降低至0.3或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)减少尿液支链α-酮酸(BCKA)：2-氧代异己酸、2-氧代-3-甲基戊酸、2-氧代异戊酸、2-羟基异戊酸、2-羟基异己酸和/或2-羟基-3-甲基戊酸。

在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)降低了缬氨酸与亮氨酸的比率。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的缬氨酸与亮氨酸的比率降低至少1％、10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将缬氨酸与亮氨酸的比率降低至0.6或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将缬氨酸与亮氨酸的比率降低至0.5或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将缬氨酸与亮氨酸的比率降低至0.4或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)将缬氨酸与亮氨酸的比率降低至0.3或更低。在一些实施方案中，所述方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)减少尿液支链α-酮酸(BCKA)：2-氧代异己酸、2-氧代-3-甲基戊酸、2-氧代异戊酸、2-羟基异戊酸、2-羟基异己酸和/或2-羟基-3-甲基戊酸。许多方法是本领域技术人员已知的用于评价样品中氨基酸的方法，并且本领域技术人员将立即认识到它们的适用性。例如但不限于，可用于评价氨基酸的方法是离子交换色谱法、分光光度检测、液相色谱分离和/或质谱法。可以相对于对照评价氨基酸水平。在一些实施方案中，对照是已知与不具有功能丧失性等位基因或不具有MSUD的健康受试者的值相关的既定值。

在一些实施方案中，该方法(例如，施用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物)使受试者的别异亮氨酸的血清浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多(例如，相对于施用rAAV之前的受试者)。

在一些实施方案中，本公开的任何方法的效果在受试者中持续给定的时间段。如本文所用，术语“持续”通常为本领域技术人员所知，意指测量的质量，意味着方法的预期效果在受试者中是可观察到或可测量的。例如但不限于，通常理解为意指在一段时间内可以观察到转基因的表达，和/或可以看到或测量施用的改善效果(例如，通过医学评价和/或受试者评价、主观地、客观地或其组合)。例如但不限于，在一些实施方案中，转基因(例如，BCKDHA、BCKDHB或其组合)的表达可以发生(例如，持续、保持在正常范围内等)至少1天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更多天)、1周(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52周或更多周)、1个月(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月)和/或1年(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年；或其任何组合和/或分数)。如将理解和领会的，术语和定义可以以多种方式呈现并且可以不明确使用术语持续，并且以上范围可以是指表达持续时间或度量保持在特定范围内(例如，血清水平保持在特定或给定范围内)的经过时间段。

在一些方面，本公开的方法涉及促进受试者的以下功能性蛋白的表达：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用包含衣壳的rAAV，所述衣壳含有经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开的方法涉及促进受试者的以下功能性蛋白的表达：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用包含衣壳的rAAV，所述衣壳包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

在一些方面，本公开的方法涉及通过向受试者施用包含衣壳的rAAV向有需要的受试者递送转基因，其中转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的BCAA比率血清水平正常化，所述衣壳包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸。

在一些方面，本公开的方法涉及通过向受试者施用包含衣壳的rAAV向有需要的受试者递送转基因，其中转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸血清水平正常化，所述衣壳包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸。

在一些实施方案中，本公开的方法用于使血清水平正常化。在一些实施方案中，当介于血清中BCAA的两个测量值之间时，血清水平正常化。在一些实施方案中，测量的BCAA是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或其组合。在一些实施方案中，测量的BCAA是亮氨酸。在一些实施方案中，测量的BCAA是异亮氨酸。在一些实施方案中，测量的BCAA是缬氨酸。在一些实施方案中，当(a)亮氨酸介于50至230微摩尔/升(μmol/L)之间；(b)异亮氨酸介于10至190μmol/L之间；和/或(c)缬氨酸介于110至330μmol/L之间时，血清水平正常化。在一些实施方案中，当(a)亮氨酸介于80至200微摩尔/升(μmol/L)之间；(b)异亮氨酸介于40至160μmol/L之间；和/或(c)缬氨酸介于140至300μmol/L之间时，血清水平正常化。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是鼠科动物。在一些实施方案中，受试者是牛科动物。

在一些实施方案中，本公开的方法用于使BCAA比率的血清水平正常化。在一些实施方案中，BCAA比率是亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的比率。在一些实施方案中，当(a)亮氨酸与异亮氨酸的比率介于1.2至1.9摩尔比摩尔(mol/mol)之间；和/或(b)缬氨酸与亮氨酸的比率介于1.1至1.8mol/mol之间时，血清水平正常化。在一些实施方案中，当(a)亮氨酸与异亮氨酸的比率介于1.4至1.7摩尔比摩尔(mol/mol)之间；和/或(b)缬氨酸与亮氨酸的比率介于1.3至1.6mol/mol之间时，血清水平正常化。

在一些实施方案中，正常化的量度可以是多于1天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更多天)、1周(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52周或更多周)、1个月(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月)和/或1年(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年；或其任何组合和/或分数)的量度。

受试者可以是人、小鼠、大鼠、猪、狗、猫、牛或非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。施用意指使细胞或受试者与本公开的分离的核酸、rAAV或组合物接触。施用的非限制性实例包括静脉内注射、动脉内注射、颅内注射、鞘内注射、脑内注射、输注或吸入。

示例性序列

该表显示了本说明书所公开的一些示例性序列，但不是限制性的。本说明书包括作为ASCII格式的文本文件与本申请同时提交的序列表。序列表及其中包含的所有信息明确地并入本文并构成本说明书的一部分。

表1：示例性序列

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

*除非另外指出，否则所有序列均按5′至3′的方向描述

实施例

实施例1：BCKDHA基因疗法的分析

MSUD是一种罕见的遗传病，其影响支链氨基酸(BCAA；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其酮酸衍生物的降解。它是由编码支链酮酸脱氢酶复合物亚基的三个基因(BCKDHA、BCKDHB和DBT)之一中的双等位基因突变引起的。严重的(经典的)MSUD在没有治疗的情况下是致命的。饮食BCAA限制是治疗的主要方法，但难以实施，具有不完善的功效，并且不能提供针对阵发性的威胁生命的脑病危机的保护。肝移植是饮食疗法的有效替代，但伴有手术和长期免疫抑制的风险。

MSUD在全世界造成的影响是每185,000个出生人口中约1例，并在美国大多数州和大多数发达国家进行筛选。由于以4.5％的群体特异性携带频率隔离的常见BCKDHA起始型变体(c.1312T＞A；p.Tyr438Asn)，在北美的旧时安曼教派(Old Order Mennonites)中出生发生率高得多(每500人中约1例)。BCKDHA和BCKDHB突变(例如BCKDHA c.1312T＞A纯合的患者)是最常见的MSUD原因，并且这些病例中的大多数是严重的经典类型。这些类型的患者具有极低(＜2％)的BCKDC酶活性，并且在生命的数天内变得生化不稳定。1986年早期在澳大利亚Shorthorn和Hereford牛中鉴定出了天然存在的BCKDHA功能丧失性突变(c.248C＞T)，并在2015年重新发现于印第安纳州中部的牧群中。BCKDHA c.248C＞T纯合的新生小牛具有与人类疾病相似的表型。对人和牛序列进行比对和评估(图1A)。

建立了表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA；SEQ ID NO：1)的重组AAV载体。开发了完整的AAV和自身互补的载体(图1B)。在各种细胞系中验证了蛋白表达(图1C)。将opti-BCKDHA盒包装至AAV9中，通过全身注射，其有效地靶向肝脏和骨骼肌，在此内源BCKDHA在WT动物和正常人中高表达。通过全身注射将重组AAV9-opti-BCKDHA递送至野生型新生小鼠。使用递增剂量来确定基因递送的安全性和功效。

实施例2：由BCKDHA或BCKDHB突变引起的枫糖尿症(MSUD)的基因疗法

目的是开发用于由BCKDHA或BCKDHB双等位基因突变引起的MSUD的AAV介导的基因替代疗法。首先设计表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA；SEQ ID NO：1)或BCKDHB基因(opti-BCKDHB；SEQ ID NO：4)的AAV载体，所述基因分别编码BCKD复合物的E1-α和E1-β亚基。考虑到功能性BCKDC E1成分的异四聚体结构(alpha2-beta2，在本领域中也称为“α2β2”)和BCKDHA或BCKDHB的单独表达不能有效地恢复BCKDC酶活性，还设计了同时表达BCKDHA和BCKDHB的双载体(dual-vector)(图1B和图2)。在HEK 293T细胞系中验证了这些载体的蛋白表达(图3A)。基于BCKDC酶活性测定，发现这些载体是有功能的(图3B)。当BCKDHA和BCKDHB共表达时，活性恢复更有效。将opti-BCKDHA、opti-BCKDHB和双-opti-BCKDHA/BCKDHB盒包装至AAV9中，通过全身注射，其有效地靶向在野生型动物和正常人中显示最高BCKD活性的肝脏和骨骼肌组织。

通过全身注射将表达opti-BCKDHA或opti-BCKDHB的重组AAV9载体递送至野生型新生小鼠，并使用递增剂量来确定基因递送的安全性和效率(图4)。

本文提供了治疗由BCKDHA或BCKDHB双等位基因突变引起的MSUD(MSUD)的策略。饮食BCAA限制是治疗的主要方法，但难以实施，具有不完善的功效，并且不能提供针对阵发性和威胁生命的脑病危机的保护。肝移植是饮食疗法的有效替代，但伴有手术和长期免疫抑制的风险。在一些实施方案中，与以前的治疗相比，BCKDHA和/或BCKDHB基因替代疗法是治疗MSUD的更安全且更有效的选择。考虑到BCKDC的功能性E1的异四聚体结构，同时表达BCKDHA和BCKDHB的双载体对于具有BCKDHA或BCKDHB突变的患者可能是更好且更有效的选择。

为了测试表达BCKDHA和BCKDHB的双载体的体内效果，使用Bckdha KO(敲除)小鼠模型来测试rAAV9载体的治疗功效。KO小鼠表现出早期死亡、体重减轻以及血清中支链氨基酸和别异亮氨酸升高(图10)。在P0时将载体静脉内(IV)注射到Bckdha KO小鼠中以剂量依赖性方式挽救致死性(图11A和11B)。图11C显示，存活小鼠的生长和行为与野生型同窝小鼠相似，并且在接受非限制性饮食(20％蛋白)4周后具有正常或接近正常的血浆BCAA(图11D)。经治疗的小鼠在16周龄时还可以耐受高蛋白饮食(40％蛋白)挑战7天(图12)。本申请的发明人令人惊奇地发现，获救的Bckdha KO小鼠在20周龄接受非限制性饮食时或在22周龄接受7天高蛋白饮食挑战后没有表现出脑水肿(图13)。相同的AAV9双基因载体还挽救了经工程化的Bckdhb KO小鼠的早期致死性和生长(图14)。

以5.0×10¹³GC/kg剂量静脉内注射rAAV9双基因载体后，在指定时间点根据肌肉活检分析新生Bckdha缺陷小牛的转导效率(图15A-15C)。经治疗的小牛从早期致死性中获救并在正常生长范围内生长(图16A和16B)。本申请的发明人发现，治疗后血浆中升高的支链氨基酸和别异亮氨酸浓度显著降低(图16C-16E)。另外，失衡的支链氨基酸摩尔比得到恢复(图16F)。小鼠模型和牛模型的体内分析显示，生存时间延长、生长正常、血液中支链氨基酸减少，表明rAAV9双基因载体具有稳健的治疗功效。

实施例3：重组AAV9在新生和成年小鼠中显示了安全且有效的递送机制

通过全身注射将表达opti-BCKDHA或/和opti-BCKDHB的重组AAV9载体递送至野生型新生或成年小鼠。使用逐渐增加的剂量来确定基因递送的安全性和效率(图5A-6F)。与对照相比，在经载体治疗的小鼠中没有观察到明显的ALT或体重变化(图5A-6F)。经载体治疗的小鼠的血清支链氨基酸浓度和比率也在正常范围内(图7A-7C)。这些数据表明表达opti-BCKDHA或/和opti-BCKDHB的rAAV9载体的总体安全性。使用与人载体相同的设计策略，还设计了表达牛BCKDHA和BCKDHB的T2A和双向双元载体以治疗BCKDHA c.248C>T纯合小牛(图8A)。人和牛载体的表达在不同的细胞系中得到验证，这表明双元载体在不同物种中的广泛功能性(图8B)。

其他实施方案

实施方案1.一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

实施方案2.一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，其中所述受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

实施方案3.一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向所述受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸的rAAV，其中转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的BCAA比率血清水平正常化。

实施方案4.根据权利要求3所述的方法，其中正常化的血清水平的范围为：(a)约1.4至约1.7摩尔比摩尔(mol/mol)的亮氨酸与异亮氨酸的比率；和/或(b)约1.3至约1.6mol/mol的缬氨酸与亮氨酸的比率。

实施方案5.一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达转基因的核酸的rAAV，其中转基因编码BCKDHA和/或BCKDHB，其中转基因的表达使受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸血清水平正常化。

实施方案6.根据权利要求5所述的方法，其中正常化的血清水平的范围为：(a)约80至约200微摩尔/升(μmol/L)的亮氨酸；(b)约40至约160μmol/L的异亮氨酸；和/或(c)约140至约300μmol/L的缬氨酸。

实施方案7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其进一步包括衣壳蛋白。

实施方案8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中当转基因被表达时，表达在施用后持续至少8周。

实施方案9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中通过全身注射进行施用。

实施方案10.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述衣壳是AAV9衣壳。

实施方案11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述核酸经工程化以表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA)、opti-BCKDHB、密码子优化的牛BCKDHA基因(opti-cBCKDHA)、opti-cBCKDHB，或其组合。

实施方案12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述核酸包含如SEQID NO：1-8或11-12中任一项所示的序列。

实施方案13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述核酸包含一个或多个反向末端重复序列(ITR)，其中每个ITR选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR。

实施方案14.根据权利要求13所述的方法，其中所述ITR中的至少一个是deltaITR(ΔITR)。

实施方案15.一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

实施方案16.一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

实施方案17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其进一步包括衣壳蛋白。

实施方案18.一种药物组合物，其包含权利要求16所述的rAAV。

实施方案19.一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO：11-12所示的序列。

实施方案20.一种宿主细胞，其包含权利要求19所述的分离的核酸构建体。

实施方案21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

实施方案22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其进一步包含编码AAV衣壳蛋白的分离的核酸。

实施方案23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

除了本文明确描述的实施方案之外，应理解，本公开中公开的所有特征可以任何组合(例如，按顺序组合)组合。本公开中公开的每个元素都可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列一般性的等同或类似特征的示例。

从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且不脱离其精神和范围，并且可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书内。

等同物和范围

应当理解，本公开不限于本文明确描述的任何或所有特定实施方案，并且因此当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试，但现在描述的是优选的方法和材料。

引用本说明书中所引用的所有出版物和专利以结合所引用的出版物公开和描述所述方法和/或材料。所有这些出版物和专利通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地通过引用并入一样。这种通过引用并入明确地限于所引用的出版物和专利中描述的方法和/或材料，并且不延伸至来自所引用的出版物和专利的任何词典式定义(即，所引用的出版物和专利中的在本公开中未明确地重复的任何词典式定义不应被如此对待，并且不应被解读为限定所附权利要求中出现的任何术语)。如果在任何并入的参考文献和本公开之间存在冲突，则以本公开为准。此外，本公开的落入现有技术的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在此没有明确地阐述排除，也可以排除这些实施方案。出于任何原因，本公开的任何特定实施方案可以从任何权利要求中排除，而不管是否与现有技术的存在相关。

任何出版物的引用是因为其公开早于本申请日，并且不应被解释为承认本公开无权由于在先公开而先于这样的出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要独立确认。

如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和示出的每个单独实施方案具有离散的组成和特征，其可容易地与其他若干实施方案中的任一个的特征分离或组合，而不脱离本公开的范围或精神。任何列举的方法可以以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

在权利要求书中，除非相反地指出或从上下文中明显看出，否则诸如“a”、“an”和“the”的冠词可以表示一个或多于一个。无论在本文何处使用，在性别中的代词(例如男性、女性、中性、其他等等…)应当被解释为性别中性(即，解释为等同地指代所有性别)，而不管暗示的性别，除非上下文明确地指示或要求其他含义。在本文使用的任何地方，以单数使用的词语包括复数，并且以复数使用的词语包括单数，除非上下文明确地指示或要求其他含义。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于、用于给定的产品或方法中或以其他方式与之相关，则认为满足在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非相反地指出或以其他方式从上下文显而易见。本公开包括其中组中正好一个成员存在于、用于给定产品或方法中或以其他方式与之相关的实施方案。本公开包括多于一个或所有组成员存在于、用于给定产品或工艺中或以其他方式与之相关的实施方案。

此外，本公开还包括将一项或多项所列权利要求中的一项或多项限制、要素、条款和描述性术语引入另一项权利要求的所有变体、组合和排列。例如，可以修改依赖于一个权利要求的任何另一个权利要求，以包括在依赖于同一基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。如果元素以列表形式呈现(例如，以Markush组的格式)，则还公开了元素的每个子组，并且可以从组中删除任何元素。应当理解，一般来说，在本公开或本公开的方面被称为包括特定元素和/或特征的情况下，本公开或本公开的方面的一些实施方案由这些元素和/或特征组成或基本上由这些元素和/或特征组成。为了简单起见，这些实施方案未在本文用同样的话具体阐述。还应注意，术语“包含”和“包括”旨在开放，并允许纳入额外的元素或步骤。在给定范围的情况下，除非另有规定，否则端点包括在此类范围内。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则表示为范围的值可以认为在本公开不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，直至范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的特定实施方案的许多等同物。本文所描述的本实施方案的范围不旨在限于上述描述，而是如所附权利要求中所述。本领域的普通技术人员将理解，可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下对本说明书进行各种更改和修改，如以下权利要求中所定义。

序列表

<110> 马萨诸塞大学（UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS）

<120> 用于枫糖尿症(MSUD)中BCAA调节的基因疗法

<130> U0120.70161WO00

<140> 尚未指定

<141> 同上

<150> US 63/179,676

<151> 2021-04-26

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 1

atggccgtcg caatcgccgc cgcaagagtg tggagactga atcggggact gagccaggcc 60

gcactgctgc tgctgagaca gccaggagcc agaggcctgg ccaggagcca cccacctagg 120

cagcagcagc agttcagctc cctggacgat aagccacagt ttcccggcgc ctctgccgag 180

ttcatcgaca agctggagtt tatccagcca aacgtgatca gcggcatccc catctaccgc 240

gtgatggacc ggcagggcca gatcatcaat ccatccgagg acccccacct gccaaaggag 300

aaggtgctga agctgtacaa gtctatgacc ctgctgaaca caatggatag aatcctgtat 360

gagtcccagc gccagggccg gatctctttc tacatgacca actatggcga ggagggcaca 420

cacgtgggca gcgccgccgc cctggacaat accgatctgg tgttcggcca gtatagagag 480

gccggcgtgc tgatgtacag ggactatcct ctggagctgt ttatggccca gtgctacggc 540

aatatcagcg atctgggcaa gggccgccag atgccagtgc actatggctg taaggagcgg 600

cacttcgtga ccatctctag ccccctggcc acacagatcc ctcaggcagt gggagcagcc 660

tacgccgcca agagagccaa cgccaatagg gtggtcatct gctattttgg agagggagca 720

gcctccgagg gcgacgcaca cgccggcttc aactttgccg ccaccctgga gtgccctatc 780

atcttctttt gtagaaacaa tggctacgcc atctctaccc caacaagcga gcagtatagg 840

ggcgatggaa tcgcagccag aggcccaggc tacggcatca tgtccatcag ggtggacggc 900

aacgacgtgt tcgccgtgta taatgccaca aaggaggcac ggagaagggc agtggcagag 960

aaccagccct ttctgatcga ggccatgacc tacagaatcg gccaccacag cacatccgac 1020

gattcctctg cctacaggtc tgtggacgaa gtgaattatt gggacaagca ggatcaccct 1080

atcagcagac tgaggcacta tctgctgtcc cagggctggt gggatgagga gcaggagaag 1140

gcctggagga agcagagccg ccggaaagtg atggaggcct tcgagcaggc agagaggaag 1200

ccaaagccca accctaatct gctgttttcc gacgtgtacc aggagatgcc tgcccagctg 1260

aggaagcagc aggagagcct ggcaagacac ctgcagacat acggcgagca ttaccccctg 1320

gaccattttg ataagtga 1338

<210> 2

<211> 6511

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 2

cgcgtggtac ctctagagtc gacccgggcg gcctcgagga cggggtgaac tacgcctgag 60

gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 120

tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 180

gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc 240

ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 300

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 360

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa 420

cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 480

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 540

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 600

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 660

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 720

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 780

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 840

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 900

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 960

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 1020

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 1080

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1140

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1200

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1260

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1320

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1380

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1440

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1500

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1560

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1620

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1680

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1740

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1800

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1860

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1920

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1980

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2040

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2100

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2160

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2220

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2280

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2340

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2400

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2460

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2520

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2580

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2640

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2700

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2760

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2820

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2880

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2940

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3000

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3060

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 3120

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 3180

gaaacagcta tgaccatgat tacgccagat ttaattaagg ccttaattag gctgcgcgct 3240

cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 3300

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 3360

ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacca gggtaatggg gatcctctag 3420

aactatagct agtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 3480

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 3540

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 3600

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 3660

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 3720

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 3780

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 3840

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 3900

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 3960

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 4020

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 4080

cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc 4140

gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 4200

gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt 4260

ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc 4320

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc 4380

ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag 4440

gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc 4500

tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg 4560

caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg 4620

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg 4680

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc 4740

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa 4800

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg 4860

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag 4920

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag 4980

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc 5040

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc 5100

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 5160

gaattcgcca ccatggccgt cgcaatcgcc gccgcaagag tgtggagact gaatcgggga 5220

ctgagccagg ccgcactgct gctgctgaga cagccaggag ccagaggcct ggccaggagc 5280

cacccaccta ggcagcagca gcagttcagc tccctggacg ataagccaca gtttcccggc 5340

gcctctgccg agttcatcga caagctggag tttatccagc caaacgtgat cagcggcatc 5400

cccatctacc gcgtgatgga ccggcagggc cagatcatca atccatccga ggacccccac 5460

ctgccaaagg agaaggtgct gaagctgtac aagtctatga ccctgctgaa cacaatggat 5520

agaatcctgt atgagtccca gcgccagggc cggatctctt tctacatgac caactatggc 5580

gaggagggca cacacgtggg cagcgccgcc gccctggaca ataccgatct ggtgttcggc 5640

cagtatagag aggccggcgt gctgatgtac agggactatc ctctggagct gtttatggcc 5700

cagtgctacg gcaatatcag cgatctgggc aagggccgcc agatgccagt gcactatggc 5760

tgtaaggagc ggcacttcgt gaccatctct agccccctgg ccacacagat ccctcaggca 5820

gtgggagcag cctacgccgc caagagagcc aacgccaata gggtggtcat ctgctatttt 5880

ggagagggag cagcctccga gggcgacgca cacgccggct tcaactttgc cgccaccctg 5940

gagtgcccta tcatcttctt ttgtagaaac aatggctacg ccatctctac cccaacaagc 6000

gagcagtata ggggcgatgg aatcgcagcc agaggcccag gctacggcat catgtccatc 6060

agggtggacg gcaacgacgt gttcgccgtg tataatgcca caaaggaggc acggagaagg 6120

gcagtggcag agaaccagcc ctttctgatc gaggccatga cctacagaat cggccaccac 6180

agcacatccg acgattcctc tgcctacagg tctgtggacg aagtgaatta ttgggacaag 6240

caggatcacc ctatcagcag actgaggcac tatctgctgt cccagggctg gtgggatgag 6300

gagcaggaga aggcctggag gaagcagagc cgccggaaag tgatggaggc cttcgagcag 6360

gcagagagga agccaaagcc caaccctaat ctgctgtttt ccgacgtgta ccaggagatg 6420

cctgcccagc tgaggaagca gcaggagagc ctggcaagac acctgcagac atacggcgag 6480

cattaccccc tggaccattt tgataagtga a 6511

<210> 3

<211> 5282

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 3

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120

aagatcaatt caattcacgc gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggata tttacggtaa 360

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 420

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 480

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tgtcgaggcc acgttctgct 540

tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat 600

tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 660

cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 720

ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 780

gcggcgggcg ggagcaagct ctagcctcga ggccaccatg gccgtcgcaa tcgccgccgc 840

aagagtgtgg agactgaatc ggggactgag ccaggccgca ctgctgctgc tgagacagcc 900

aggagccaga ggcctggcca ggagccaccc acctaggcag cagcagcagt tcagctccct 960

ggacgataag ccacagtttc ccggcgcctc tgccgagttc atcgacaagc tggagtttat 1020

ccagccaaac gtgatcagcg gcatccccat ctaccgcgtg atggaccggc agggccagat 1080

catcaatcca tccgaggacc cccacctgcc aaaggagaag gtgctgaagc tgtacaagtc 1140

tatgaccctg ctgaacacaa tggatagaat cctgtatgag tcccagcgcc agggccggat 1200

ctctttctac atgaccaact atggcgagga gggcacacac gtgggcagcg ccgccgccct 1260

ggacaatacc gatctggtgt tcggccagta tagagaggcc ggcgtgctga tgtacaggga 1320

ctatcctctg gagctgttta tggcccagtg ctacggcaat atcagcgatc tgggcaaggg 1380

ccgccagatg ccagtgcact atggctgtaa ggagcggcac ttcgtgacca tctctagccc 1440

cctggccaca cagatccctc aggcagtggg agcagcctac gccgccaaga gagccaacgc 1500

caatagggtg gtcatctgct attttggaga gggagcagcc tccgagggcg acgcacacgc 1560

cggcttcaac tttgccgcca ccctggagtg ccctatcatc ttcttttgta gaaacaatgg 1620

ctacgccatc tctaccccaa caagcgagca gtataggggc gatggaatcg cagccagagg 1680

cccaggctac ggcatcatgt ccatcagggt ggacggcaac gacgtgttcg ccgtgtataa 1740

tgccacaaag gaggcacgga gaagggcagt ggcagagaac cagccctttc tgatcgaggc 1800

catgacctac agaatcggcc accacagcac atccgacgat tcctctgcct acaggtctgt 1860

ggacgaagtg aattattggg acaagcagga tcaccctatc agcagactga ggcactatct 1920

gctgtcccag ggctggtggg atgaggagca ggagaaggcc tggaggaagc agagccgccg 1980

gaaagtgatg gaggccttcg agcaggcaga gaggaagcca aagcccaacc ctaatctgct 2040

gttttccgac gtgtaccagg agatgcctgc ccagctgagg aagcagcagg agagcctggc 2100

aagacacctg cagacatacg gcgagcatta ccccctggac cattttgata agtgaggatc 2160

cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 2220

ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 2280

ctcactcggc ctaggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 2340

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 2400

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 2460

gccttaatta acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 2520

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 2580

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 2640

cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 2700

cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 2760

tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 2820

ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 2880

cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 2940

tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 3000

ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 3060

cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 3120

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 3180

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 3240

ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 3300

aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 3360

actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 3420

gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 3480

agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 3540

cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 3600

catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 3660

aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 3720

gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 3780

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 3840

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 3900

ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 3960

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 4020

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 4080

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 4140

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 4200

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 4260

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 4320

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 4380

agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 4440

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 4500

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 4560

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 4620

cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 4680

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 4740

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 4800

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 4860

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 4920

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 4980

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 5040

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 5100

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 5160

ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 5220

atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga tttaattaag gccttaatta 5280

gg 5282

<210> 4

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 4

atggccgtgg tcgctgctgc tgccggatgg ctgctgagac tgcgggccgc tggggctgag 60

ggacattgga ggagactgcc tggggctggg ctggcaaggg gcttcctgca ccctgcagca 120

acagtggagg acgcagcaca gcggagacag gtggcccact tcacctttca gcccgatcct 180

gagccacgcg agtacggcca gacacagaag atgaacctgt tccagtccgt gacctctgcc 240

ctggacaata gcctggccaa ggatccaaca gccgtgatct ttggcgagga cgtggccttc 300

ggcggcgtgt ttcggtgcac agtgggcctg agagacaagt acggcaagga tcgggtgttc 360

aacaccccac tgtgcgagca gggaatcgtg ggctttggca tcggcatcgc agtgaccgga 420

gcaacagcaa tcgcagagat ccagttcgcc gactatatct tccccgcctt tgatcagatc 480

gtgaacgagg ccgccaagta caggtatcgc tccggcgacc tgtttaattg cggcagcctg 540

accatcagat ccccttgggg atgcgtggga cacggcgccc tgtatcactc tcagagccca 600

gaggccttct ttgcccactg ccccggcatc aaggtggtca tcccacggag ccccttccag 660

gcaaagggcc tgctgctgtc ctgcatcgag gataagaacc cctgtatctt ctttgagcct 720

aagatcctgt acagagcagc agcagaggag gtgcctatcg agccatataa tatccctctg 780

tctcaggccg aagtgatcca ggagggaagc gacgtgaccc tggtggcatg gggaacacag 840

gtgcacgtga tcagggaggt ggcctccatg gccaaggaga agctgggcgt gtcttgcgaa 900

gtgatcgatc tgaggaccat catcccttgg gacgtggata caatctgtaa gtctgtgatc 960

aagaccggcc gcctgctgat cagccacgag gcaccactga caggaggatt cgcatccgag 1020

atcagctcca ccgtgcagga ggagtgcttt ctgaatctgg aggccccaat ctctcgggtg 1080

tgcggctacg ataccccctt ccctcacatc tttgagcctt tctacatccc tgacaagtgg 1140

aagtgctacg acgctctgcg gaagatgatt aactattga 1179

<210> 5

<211> 6352

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 5

cgcgtggtac ctctagagtc gacccgggcg gcctcgagga cggggtgaac tacgcctgag 60

gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 120

tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 180

gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc 240

ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 300

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 360

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa 420

cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 480

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 540

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 600

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 660

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 720

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 780

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 840

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 900

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 960

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 1020

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 1080

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1140

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1200

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1260

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1320

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1380

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1440

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1500

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1560

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1620

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1680

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1740

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1800

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1860

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1920

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1980

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2040

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2100

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2160

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2220

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2280

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2340

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2400

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2460

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2520

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2580

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2640

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2700

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2760

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2820

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2880

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2940

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3000

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3060

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 3120

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 3180

gaaacagcta tgaccatgat tacgccagat ttaattaagg ccttaattag gctgcgcgct 3240

cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 3300

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 3360

ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacca gggtaatggg gatcctctag 3420

aactatagct agtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 3480

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 3540

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 3600

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 3660

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 3720

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 3780

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 3840

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 3900

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 3960

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 4020

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 4080

cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc 4140

gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 4200

gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt 4260

ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc 4320

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc 4380

ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag 4440

gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc 4500

tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg 4560

caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg 4620

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg 4680

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc 4740

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa 4800

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg 4860

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag 4920

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag 4980

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc 5040

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc 5100

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 5160

gaattcgcca ccatggccgt ggtcgctgct gctgccggat ggctgctgag actgcgggcc 5220

gctggggctg agggacattg gaggagactg cctggggctg ggctggcaag gggcttcctg 5280

caccctgcag caacagtgga ggacgcagca cagcggagac aggtggccca cttcaccttt 5340

cagcccgatc ctgagccacg cgagtacggc cagacacaga agatgaacct gttccagtcc 5400

gtgacctctg ccctggacaa tagcctggcc aaggatccaa cagccgtgat ctttggcgag 5460

gacgtggcct tcggcggcgt gtttcggtgc acagtgggcc tgagagacaa gtacggcaag 5520

gatcgggtgt tcaacacccc actgtgcgag cagggaatcg tgggctttgg catcggcatc 5580

gcagtgaccg gagcaacagc aatcgcagag atccagttcg ccgactatat cttccccgcc 5640

tttgatcaga tcgtgaacga ggccgccaag tacaggtatc gctccggcga cctgtttaat 5700

tgcggcagcc tgaccatcag atccccttgg ggatgcgtgg gacacggcgc cctgtatcac 5760

tctcagagcc cagaggcctt ctttgcccac tgccccggca tcaaggtggt catcccacgg 5820

agccccttcc aggcaaaggg cctgctgctg tcctgcatcg aggataagaa cccctgtatc 5880

ttctttgagc ctaagatcct gtacagagca gcagcagagg aggtgcctat cgagccatat 5940

aatatccctc tgtctcaggc cgaagtgatc caggagggaa gcgacgtgac cctggtggca 6000

tggggaacac aggtgcacgt gatcagggag gtggcctcca tggccaagga gaagctgggc 6060

gtgtcttgcg aagtgatcga tctgaggacc atcatccctt gggacgtgga tacaatctgt 6120

aagtctgtga tcaagaccgg ccgcctgctg atcagccacg aggcaccact gacaggagga 6180

ttcgcatccg agatcagctc caccgtgcag gaggagtgct ttctgaatct ggaggcccca 6240

atctctcggg tgtgcggcta cgataccccc ttccctcaca tctttgagcc tttctacatc 6300

cctgacaagt ggaagtgcta cgacgctctg cggaagatga ttaactattg aa 6352

<210> 6

<211> 5123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 6

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120

aagatcaatt caattcacgc gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggata tttacggtaa 360

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 420

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 480

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tgtcgaggcc acgttctgct 540

tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat 600

tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 660

cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 720

ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 780

gcggcgggcg ggagcaagct ctagcctcga ggccaccatg gccgtggtcg ctgctgctgc 840

cggatggctg ctgagactgc gggccgctgg ggctgaggga cattggagga gactgcctgg 900

ggctgggctg gcaaggggct tcctgcaccc tgcagcaaca gtggaggacg cagcacagcg 960

gagacaggtg gcccacttca cctttcagcc cgatcctgag ccacgcgagt acggccagac 1020

acagaagatg aacctgttcc agtccgtgac ctctgccctg gacaatagcc tggccaagga 1080

tccaacagcc gtgatctttg gcgaggacgt ggccttcggc ggcgtgtttc ggtgcacagt 1140

gggcctgaga gacaagtacg gcaaggatcg ggtgttcaac accccactgt gcgagcaggg 1200

aatcgtgggc tttggcatcg gcatcgcagt gaccggagca acagcaatcg cagagatcca 1260

gttcgccgac tatatcttcc ccgcctttga tcagatcgtg aacgaggccg ccaagtacag 1320

gtatcgctcc ggcgacctgt ttaattgcgg cagcctgacc atcagatccc cttggggatg 1380

cgtgggacac ggcgccctgt atcactctca gagcccagag gccttctttg cccactgccc 1440

cggcatcaag gtggtcatcc cacggagccc cttccaggca aagggcctgc tgctgtcctg 1500

catcgaggat aagaacccct gtatcttctt tgagcctaag atcctgtaca gagcagcagc 1560

agaggaggtg cctatcgagc catataatat ccctctgtct caggccgaag tgatccagga 1620

gggaagcgac gtgaccctgg tggcatgggg aacacaggtg cacgtgatca gggaggtggc 1680

ctccatggcc aaggagaagc tgggcgtgtc ttgcgaagtg atcgatctga ggaccatcat 1740

cccttgggac gtggatacaa tctgtaagtc tgtgatcaag accggccgcc tgctgatcag 1800

ccacgaggca ccactgacag gaggattcgc atccgagatc agctccaccg tgcaggagga 1860

gtgctttctg aatctggagg ccccaatctc tcgggtgtgc ggctacgata cccccttccc 1920

tcacatcttt gagcctttct acatccctga caagtggaag tgctacgacg ctctgcggaa 1980

gatgattaac tattgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 2040

gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 2100

gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg cctaggtaga taagtagcat ggcgggttaa 2160

tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 2220

cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 2280

cagtgagcga gcgagcgcgc agccttaatt aacctaattc actggccgtc gttttacaac 2340

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 2400

tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 2460

gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 2520

ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 2580

tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 2640

ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 2700

atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 2760

ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 2820

tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 2880

tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg 2940

cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 3000

tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 3060

gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 3120

tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 3180

tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 3240

ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 3300

atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 3360

cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 3420

attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 3480

gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 3540

ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 3600

gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 3660

agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 3720

gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 3780

gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 3840

ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 3900

tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 3960

tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 4020

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4080

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4140

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4200

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 4260

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4320

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4380

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4440

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4500

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4560

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4620

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4680

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4740

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 4800

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 4860

ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 4920

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 4980

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 5040

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccag 5100

atttaattaa ggccttaatt agg 5123

<210> 7

<211> 6782

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 7

cgcgtggtac ctctagagtc gacccgggcg gcctcgagga cggggtgaac tacgcctgag 60

gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 120

tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 180

gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc 240

ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 300

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 360

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa 420

cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 480

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 540

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 600

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 660

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 720

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 780

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 840

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 900

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 960

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 1020

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 1080

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1140

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1200

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1260

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1320

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1380

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1440

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1500

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1560

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1620

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1680

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1740

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1800

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1860

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1920

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1980

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2040

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2100

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2160

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2220

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2280

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2340

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2400

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2460

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2520

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2580

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2640

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2700

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2760

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2820

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2880

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2940

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3000

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3060

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 3120

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 3180

gaaacagcta tgaccatgat tacgccagat ttaattaagg ccttaattag gctgcgcgct 3240

cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 3300

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 3360

ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacca gggtaatggg gatcctctag 3420

aactatagct agtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 3480

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 3540

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 3600

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 3660

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 3720

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 3780

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 3840

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 3900

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 3960

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 4020

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 4080

cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc 4140

gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacgcca ccatggccgt 4200

ggtcgctgct gctgccggat ggctgctgag actgcgggcc gctggggctg agggacattg 4260

gaggagactg cctggggctg ggctggcaag gggcttcctg caccctgcag caacagtgga 4320

ggacgcagca cagcggagac aggtggccca cttcaccttt cagcccgatc ctgagccacg 4380

cgagtacggc cagacacaga agatgaacct gttccagtcc gtgacctctg ccctggacaa 4440

tagcctggcc aaggatccaa cagccgtgat ctttggcgag gacgtggcct tcggcggcgt 4500

gtttcggtgc acagtgggcc tgagagacaa gtacggcaag gatcgggtgt tcaacacccc 4560

actgtgcgag cagggaatcg tgggctttgg catcggcatc gcagtgaccg gagcaacagc 4620

aatcgcagag atccagttcg ccgactatat cttccccgcc tttgatcaga tcgtgaacga 4680

ggccgccaag tacaggtatc gctccggcga cctgtttaat tgcggcagcc tgaccatcag 4740

atccccttgg ggatgcgtgg gacacggcgc cctgtatcac tctcagagcc cagaggcctt 4800

ctttgcccac tgccccggca tcaaggtggt catcccacgg agccccttcc aggcaaaggg 4860

cctgctgctg tcctgcatcg aggataagaa cccctgtatc ttctttgagc ctaagatcct 4920

gtacagagca gcagcagagg aggtgcctat cgagccatat aatatccctc tgtctcaggc 4980

cgaagtgatc caggagggaa gcgacgtgac cctggtggca tggggaacac aggtgcacgt 5040

gatcagggag gtggcctcca tggccaagga gaagctgggc gtgtcttgcg aagtgatcga 5100

tctgaggacc atcatccctt gggacgtgga tacaatctgt aagtctgtga tcaagaccgg 5160

ccgcctgctg atcagccacg aggcaccact gacaggagga ttcgcatccg agatcagctc 5220

caccgtgcag gaggagtgct ttctgaatct ggaggcccca atctctcggg tgtgcggcta 5280

cgataccccc ttccctcaca tctttgagcc tttctacatc cctgacaagt ggaagtgcta 5340

cgacgctctg cggaagatga ttaactatgg atccggtgag ggcagaggaa gtcttctaac 5400

atgcggtgac gtggaggaga atccgggccc tgaattcgcc accatggccg tcgcaatcgc 5460

cgccgcaaga gtgtggagac tgaatcgggg actgagccag gccgcactgc tgctgctgag 5520

acagccagga gccagaggcc tggccaggag ccacccacct aggcagcagc agcagttcag 5580

ctccctggac gataagccac agtttcccgg cgcctctgcc gagttcatcg acaagctgga 5640

gtttatccag ccaaacgtga tcagcggcat ccccatctac cgcgtgatgg accggcaggg 5700

ccagatcatc aatccatccg aggaccccca cctgccaaag gagaaggtgc tgaagctgta 5760

caagtctatg accctgctga acacaatgga tagaatcctg tatgagtccc agcgccaggg 5820

ccggatctct ttctacatga ccaactatgg cgaggagggc acacacgtgg gcagcgccgc 5880

cgccctggac aataccgatc tggtgttcgg ccagtataga gaggccggcg tgctgatgta 5940

cagggactat cctctggagc tgtttatggc ccagtgctac ggcaatatca gcgatctggg 6000

caagggccgc cagatgccag tgcactatgg ctgtaaggag cggcacttcg tgaccatctc 6060

tagccccctg gccacacaga tccctcaggc agtgggagca gcctacgccg ccaagagagc 6120

caacgccaat agggtggtca tctgctattt tggagaggga gcagcctccg agggcgacgc 6180

acacgccggc ttcaactttg ccgccaccct ggagtgccct atcatcttct tttgtagaaa 6240

caatggctac gccatctcta ccccaacaag cgagcagtat aggggcgatg gaatcgcagc 6300

cagaggccca ggctacggca tcatgtccat cagggtggac ggcaacgacg tgttcgccgt 6360

gtataatgcc acaaaggagg cacggagaag ggcagtggca gagaaccagc cctttctgat 6420

cgaggccatg acctacagaa tcggccacca cagcacatcc gacgattcct ctgcctacag 6480

gtctgtggac gaagtgaatt attgggacaa gcaggatcac cctatcagca gactgaggca 6540

ctatctgctg tcccagggct ggtgggatga ggagcaggag aaggcctgga ggaagcagag 6600

ccgccggaaa gtgatggagg ccttcgagca ggcagagagg aagccaaagc ccaaccctaa 6660

tctgctgttt tccgacgtgt accaggagat gcctgcccag ctgaggaagc agcaggagag 6720

cctggcaaga cacctgcaga catacggcga gcattacccc ctggaccatt ttgataagtg 6780

aa 6782

<210> 8

<211> 6971

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 8

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattctac cacatttgta gaggttttac 180

ttgctttaaa aaacctccca catctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 240

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 300

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 360

atgtatctta tcatgtctgt cgatcactta tcaaaatggt ccagggggta atgctcgccg 420

tatgtctgca ggtgtcttgc caggctctcc tgctgcttcc tcagctgggc aggcatctcc 480

tggtacacgt cggaaaacag cagattaggg ttgggctttg gcttcctctc tgcctgctcg 540

aaggcctcca tcactttccg gcggctctgc ttcctccagg ccttctcctg ctcctcatcc 600

caccagccct gggacagcag atagtgcctc agtctgctga tagggtgatc ctgcttgtcc 660

caataattca cttcgtccac agacctgtag gcagaggaat cgtcggatgt gctgtggtgg 720

ccgattctgt aggtcatggc ctcgatcaga aagggctggt tctctgccac tgcccttctc 780

cgtgcctcct ttgtggcatt atacacggcg aacacgtcgt tgccgtccac cctgatggac 840

atgatgccgt agcctgggcc tctggctgcg attccatcgc ccctatactg ctcgcttgtt 900

ggggtagaga tggcgtagcc attgtttcta caaaagaaga tgatagggca ctccagggtg 960

gcggcaaagt tgaagccggc gtgtgcgtcg ccctcggagg ctgctccctc tccaaaatag 1020

cagatgacca ccctattggc gttggctctc ttggcggcgt aggctgctcc cactgcctga 1080

gggatctgtg tggccagggg gctagagatg gtcacgaagt gccgctcctt acagccatag 1140

tgcactggca tctggcggcc cttgcccaga tcgctgatat tgccgtagca ctgggccata 1200

aacagctcca gaggatagtc cctgtacatc agcacgccgg cctctctata ctggccgaac 1260

accagatcgg tattgtccag ggcggcggcg ctgcccacgt gtgtgccctc ctcgccatag 1320

ttggtcatgt agaaagagat ccggccctgg cgctgggact catacaggat tctatccatt 1380

gtgttcagca gggtcataga cttgtacagc ttcagcacct tctcctttgg caggtggggg 1440

tcctcggatg gattgatgat ctggccctgc cggtccatca cgcggtagat ggggatgccg 1500

ctgatcacgt ttggctggat aaactccagc ttgtcgatga actcggcaga ggcgccggga 1560

aactgtggct tatcgtccag ggagctgaac tgctgctgct gcctaggtgg gtggctcctg 1620

gccaggcctc tggctcctgg ctgtctcagc agcagcagtg cggcctggct cagtccccga 1680

ttcagtctcc acactcttgc ggcggcgatt gcgacggcca tggtggccta gcgctagagc 1740

ttgctcccgc ccgccgcgcg cttcgctttt tatagggccg ccgccgccgc cgcctcgcca 1800

taaaaggaaa ctttcggagc gcgccgctct gattggctgc cgccgcacct ctccgcctcg 1860

ccccgccccg cccctcgccc ccatcgctgc acaaaataat taaaaaataa ataaatacaa 1920

aattgggggt ggggaggggg gggagatggg gagagtgaag cagaacgtgg cctcggatcc 1980

cccgggctgc agtattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 2040

gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 2100

cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 2160

tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 2220

catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 2280

gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 2340

gctattacca tgtcgaggcc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 2400

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgaggggcg 2460

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 2520

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 2580

gggagcaagc tcgctagcac tagtgccacc atggccgtgg tcgctgctgc tgccggatgg 2640

ctgctgagac tgcgggccgc tggggctgag ggacattgga ggagactgcc tggggctggg 2700

ctggcaaggg gcttcctgca ccctgcagca acagtggagg acgcagcaca gcggagacag 2760

gtggcccact tcacctttca gcccgatcct gagccacgcg agtacggcca gacacagaag 2820

atgaacctgt tccagtccgt gacctctgcc ctggacaata gcctggccaa ggatccaaca 2880

gccgtgatct ttggcgagga cgtggccttc ggcggcgtgt ttcggtgcac agtgggcctg 2940

agagacaagt acggcaagga tcgggtgttc aacaccccac tgtgcgagca gggaatcgtg 3000

ggctttggca tcggcatcgc agtgaccgga gcaacagcaa tcgcagagat ccagttcgcc 3060

gactatatct tccccgcctt tgatcagatc gtgaacgagg ccgccaagta caggtatcgc 3120

tccggcgacc tgtttaattg cggcagcctg accatcagat ccccttgggg atgcgtggga 3180

cacggcgccc tgtatcactc tcagagccca gaggccttct ttgcccactg ccccggcatc 3240

aaggtggtca tcccacggag ccccttccag gcaaagggcc tgctgctgtc ctgcatcgag 3300

gataagaacc cctgtatctt ctttgagcct aagatcctgt acagagcagc agcagaggag 3360

gtgcctatcg agccatataa tatccctctg tctcaggccg aagtgatcca ggagggaagc 3420

gacgtgaccc tggtggcatg gggaacacag gtgcacgtga tcagggaggt ggcctccatg 3480

gccaaggaga agctgggcgt gtcttgcgaa gtgatcgatc tgaggaccat catcccttgg 3540

gacgtggata caatctgtaa gtctgtgatc aagaccggcc gcctgctgat cagccacgag 3600

gcaccactga caggaggatt cgcatccgag atcagctcca ccgtgcagga ggagtgcttt 3660

ctgaatctgg aggccccaat ctctcgggtg tgcggctacg ataccccctt ccctcacatc 3720

tttgagcctt tctacatccc tgacaagtgg aagtgctacg acgctctgcg gaagatgatt 3780

aactattgag cggccgctct agagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca 3840

tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag 3900

tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gcatgctggg gagagatcta ggaaccccta 3960

gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca 4020

aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 4080

gagggagtgg ccatgcagcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 4140

cccaacagtt gcgtagcctg aatggcgaat ggcgcgacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4200

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4260

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4320

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 4380

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4440

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 4500

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 4560

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 4620

cgtttacaat ttcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 4680

catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 4740

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 4800

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 4860

acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 4920

aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 4980

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 5040

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 5100

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 5160

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 5220

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 5280

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 5340

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 5400

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 5460

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 5520

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 5580

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 5640

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 5700

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 5760

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 5820

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 5880

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 5940

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 6000

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6060

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6120

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6180

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6240

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6300

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 6360

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 6420

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 6480

acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 6540

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 6600

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 6660

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 6720

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 6780

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 6840

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 6900

gcgttggccg attcattaat gcagctgggc tgcagggggg gggggggggg ggtggggggg 6960

gggggggggg g 6971

<210> 9

<211> 454

<212> PRT

<213> 家牛（Bos taurus）

<400> 9

Met Gln Gly Ser Ala Lys Met Ala Met Ala Val Ala Val Ala Val Ala

1 5 10 15

Arg Val Trp Arg Pro Ser Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Leu Pro Leu

20 25 30

Leu Arg Leu Leu Gly Ala Arg Gly Leu Ala Arg Phe His Pro His Arg

35 40 45

Trp Gln Gln Gln Gln His Phe Ser Ser Leu Asp Asp Lys Pro Gln Phe

50 55 60

Pro Gly Ala Ser Ala Glu Phe Ile Asp Lys Leu Glu Phe Ile Gln Pro

65 70 75 80

Asn Val Ile Ser Gly Ile Pro Ile Tyr Arg Val Met Asp Arg Gln Gly

85 90 95

Gln Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asp Pro His Leu Pro Gln Glu Lys Val

100 105 110

Leu Lys Phe Tyr Lys Ser Met Thr Leu Leu Asn Thr Met Asp Arg Ile

115 120 125

Leu Tyr Glu Ser Gln Arg Gln Gly Arg Ile Ser Phe Tyr Met Thr Asn

130 135 140

Tyr Gly Glu Glu Gly Thr His Val Gly Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asp

145 150 155 160

Thr Asp Leu Val Phe Gly Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Val Leu Met Tyr

165 170 175

Arg Asp Tyr Pro Leu Glu Leu Phe Met Ala Gln Cys Tyr Gly Asn Val

180 185 190

Ser Asp Leu Gly Lys Gly Arg Gln Met Pro Val His Tyr Gly Cys Arg

195 200 205

Glu Arg His Phe Val Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ala Thr Gln Ile Pro

210 215 220

Gln Ala Val Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Lys Arg Ala Asn Ala Asn Arg

225 230 235 240

Trp Ile Cys Tyr Phe Gly Glu Gly Ala Ala Ser Glu Gly Asp Ala His

245 250 255

Ala Gly Phe Asn Phe Ala Ala Thr Leu Glu Cys Pro Ile Ile Phe Phe

260 265 270

Cys Arg Asn Asn Gly Tyr Ala Ile Ser Thr Pro Thr Ser Glu Gln Tyr

275 280 285

Arg Gly Asp Gly Ile Ala Ala Arg Gly Pro Gly Tyr Gly Ile Leu Ser

290 295 300

Ile Arg Val Asp Gly Asn Asp Val Phe Ala Val Tyr Asn Ala Thr Lys

305 310 315 320

Glu Ala Arg Arg Arg Ala Val Ala Glu Asn Gln Pro Phe Leu Ile Glu

325 330 335

Ala Met Thr Tyr Arg Ile Gly His His Ser Thr Ser Asp Asp Ser Ser

340 345 350

Ala Tyr Arg Ser Val Asp Glu Val Asn Tyr Trp Asp Lys Gln Asp His

355 360 365

Pro Ile Ser Arg Leu Arg His His Leu Gln Ser Arg Gly Trp Trp Asp

370 375 380

Asp Glu Gln Glu Lys Ala Trp Arg Lys Gln Ser Arg Lys Lys Val Met

385 390 395 400

Glu Ala Phe Glu Gln Ala Glu Arg Lys Leu Lys Pro Asn Pro Ser Leu

405 410 415

Ile Phe Ser Asp Val Tyr Gln Glu Met Pro Ala Gln Leu Arg Lys Gln

420 425 430

Gln Glu Ser Leu Ala Arg His Leu Gln Thr Tyr Gly Glu His Tyr Pro

435 440 445

Leu Asp His Phe Glu Lys

450

<210> 10

<211> 444

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Met Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Arg Val Trp Arg Leu Asn Arg Gly

1 5 10 15

Leu Ser Gln Ala Ala Leu Leu Leu Leu Arg Gln Pro Gly Ala Arg Gly

20 25 30

Leu Ala Arg Ser His Pro Pro Arg Gln Gln Gln Gln Phe Ser Ser Leu

35 40 45

Asp Asp Lys Pro Gln Phe Pro Gly Ala Ser Ala Glu Phe Ile Asp Lys

50 55 60

Leu Glu Phe Ile Gln Pro Asn Val Ile Ser Gly Ile Pro Ile Tyr Arg

65 70 75 80

Val Met Asp Arg Gln Gly Gln Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asp Pro His

85 90 95

Leu Pro Lys Glu Lys Val Leu Lys Leu Tyr Lys Ser Met Thr Leu Leu

100 105 110

Asn Thr Met Asp Arg Ile Leu Tyr Glu Ser Gln Arg Gln Gly Arg Ile

115 120 125

Ser Phe Tyr Met Thr Asn Tyr Gly Glu Glu Gly Thr His Val Gly Ser

130 135 140

Ala Ala Ala Leu Asp Asn Thr Asp Leu Val Phe Gly Gln Tyr Arg Glu

145 150 155 160

Ala Gly Val Leu Met Tyr Arg Asp Tyr Pro Leu Glu Leu Phe Met Ala

165 170 175

Gln Cys Tyr Gly Asn Ile Ser Asp Leu Gly Lys Gly Arg Gln Met Pro

180 185 190

Val His Tyr Gly Cys Lys Glu Arg His Phe Val Thr Ile Ser Ser Pro

195 200 205

Leu Ala Thr Gln Ile Pro Gln Ala Val Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Lys

210 215 220

Arg Ala Asn Ala Asn Arg Trp Ile Cys Tyr Phe Gly Glu Gly Ala Ala

225 230 235 240

Ser Glu Gly Asp Ala His Ala Gly Phe Asn Phe Ala Ala Thr Leu Glu

245 250 255

Cys Pro Ile Ile Phe Phe Cys Arg Asn Asn Gly Tyr Ala Ile Ser Thr

260 265 270

Pro Thr Ser Glu Gln Tyr Arg Gly Asp Gly Ile Ala Ala Arg Gly Pro

275 280 285

Gly Tyr Gly Ile Met Ser Ile Arg Val Asp Gly Asn Asp Val Phe Ala

290 295 300

Val Tyr Asn Ala Thr Lys Glu Ala Arg Arg Arg Ala Val Ala Glu Asn

305 310 315 320

Gln Pro Phe Leu Ile Glu Ala Met Thr Tyr Arg Ile Gly His His Ser

325 330 335

Thr Ser Asp Asp Ser Ser Ala Tyr Arg Ser Val Asp Glu Val Asn Tyr

340 345 350

Trp Asp Lys Gln Asp His Pro Ile Ser Arg Leu Arg His Tyr Leu Leu

355 360 365

Ser Gln Gly Trp Trp Asp Glu Glu Gln Glu Lys Ala Trp Arg Lys Gln

370 375 380

Ser Arg Arg Lys Val Met Glu Ala Phe Glu Gln Ala Glu Arg Lys Pro

385 390 395 400

Lys Pro Asn Pro Asn Leu Leu Phe Ser Asp Val Tyr Gln Glu Met Pro

405 410 415

Ala Gln Leu Arg Lys Gln Gln Glu Ser Leu Ala Arg His Leu Gln Thr

420 425 430

Tyr Gly Glu His Tyr Pro Leu Asp His Phe Asp Lys

435 440

<210> 11

<211> 7004

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 11

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattctac cacatttgta gaggttttac 180

ttgctttaaa aaacctccca catctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 240

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 300

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 360

atgtatctta tcatgtctgt cgatcacttc tcaaagtggt ccagtgggta gtgttcgcca 420

taagtctgca ggtgtcgggc cagggactcc tgctgcttgc gcagctgggc gggcatctcc 480

tggtacacgt cggagaagat caggctaggg ttgggcttca gcttcctctc ggcctgctcg 540

aaggcctcca tcaccttctt gcgggactgc ttcctccagg ccttctcctg ctcgtcgtcc 600

caccagcccc tggactgcag gtggtgcctc agcctgctga tggggtggtc ctgcttgtcc 660

cagtagttca cctcgtccac gctccggtag gcggagctgt cgtcggaggt gctgtggtgg 720

ccgattctgt aggtcatggc ctcgatcagg aaaggctggt tctcagccac agcgcgcctc 780

cgagcctcct tggtggcgtt gtacacggcg aacacgtcgt tgccgtccac ccggatggac 840

aggatgccgt agccaggtcc cctagcagcg attccgtctc ccctgtactg ctcggaggta 900

ggggtgctga tggcgtagcc gttgtttctg cagaagaaga tgatggggca ctccagggtg 960

gcagcgaagt tgaatccagc gtgagcgtct ccctcgctag cagctccctc tccgaagtag 1020

cagatcacca cccggttggc gttggctctc ttggcagcgt aagcagctcc cacagcctga 1080

gggatctggg tggccagggg ggagctgatg gtcacgaagt gccgctctct gcatccgtag 1140

tgcacaggca tctgccggcc ctttcccagg tcggacacgt ttccgtagca ctgggccatg 1200

aacagctcca gagggtagtc ccggtacatc agcacgccgg cctctctgta ctggccgaac 1260

accaggtcgg tgtcgtccag ggcggcggcg cttcccacgt gggttccctc ctcgccgtag 1320

ttggtcatgt agaaggagat ccggccctgt ctctggctct cgtacaggat cctgtccatg 1380

gtgttcagca gggtcatgga cttgtagaac ttcagcacct tctcctgagg caggtggggg 1440

tcctcgctag ggttgatgat ctggccctgc cggtccatca ctctgtagat agggatgccg 1500

gagatcacgt tgggctggat gaactccagc ttgtcgatga actcggcgct agctccaggg 1560

aactgaggct tgtcgtccag ggagctgaag tgctgctgct gctgccagcg gtgagggtgg 1620

aagcgagcca gtcccctagc tcccagcagc ctcagcaggg gcagcccagt tctgcccagc 1680

cctcttgaag gtctccacac ccgagcgaca gcgacggcga cagccatagc catcttagca 1740

ctcccctgca tggtggccta gcgctagagc ttgctcccgc ccgccgcgcg cttcgctttt 1800

tatagggccg ccgccgccgc cgcctcgcca taaaaggaaa ctttcggagc gcgccgctct 1860

gattggctgc cgccgcacct ctccgcctcg ccccgccccg cccctcgccc ccatcgctgc 1920

acaaaataat taaaaaataa ataaatacaa aattgggggt ggggaggggg gggagatggg 1980

gagagtgaag cagaacgtgg cctcggatcc cccgggctgc agtattaata gtaatcaatt 2040

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 2100

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 2160

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 2220

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 2280

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 2340

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tgtcgaggcc acgttctgct 2400

tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat 2460

tattttgtgc agcgatgggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc 2520

agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 2580

gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tcgctagcac tagtgccacc 2640

atggctgctg tcgctgcttt cgctgggtgg ctgctgagac tgcgggctgc tggggctgat 2700

ggaccttggc ggagactgtg cggggctgga ctgagcaggg gcttcctgca gagcgcctcc 2760

gcctacggag ctgccgccca gcggaggcag gtggcccact tcaccttcca gcctgaccct 2820

gagcctgtgg agtacggcca gacccagaag atgaacctgt tccaggccgt gaccagcgcc 2880

ctggacaact ccctggccaa ggaccctacc gccgtgatct tcggagagga cgtggccttc 2940

ggcggcgtgt tcaggtgcac cgtgggactg agggacaagt acggcaagga ccgcgtgttc 3000

aacacccctc tgtgcgagca gggaatcgtg ggcttcggca tcggcatcgc tgtgaccgga 3060

gctaccgcta tcgctgagat ccagttcgcc gactacatct tccctgcctt cgaccagatc 3120

gtgaacgagg ccgccaagta ccgctacaga agcggcgacc tgttcaactg cggcagcctg 3180

accatcagat ccccttgggg atgcgtggga cacggcgccc tgtaccacag ccagtcccct 3240

gaggccttct tcgctcactg ccctggcatc aaggtggtgg tgcctcggag ccctttccag 3300

gctaagggac tgctgctgtc ctgcatcgag gacaagaacc cttgcatctt cttcgagccc 3360

aagatcctgt acagggctgc tgtggagcag gtgcctgtgg agccctacaa catccctctg 3420

agccaggctg aggtgatcca ggagggatcc gacgtgaccc tggtggcttg gggaacccag 3480

gtgcacgtga tcagggaggt ggacgccatg gcccaggaga agctgggcgt gtcctgcgag 3540

gtgatcgacc tgcgcaccat cctgccttgg gacgtggaca ccgtgtgcaa gagcgtgatc 3600

aagaccggca gactgctggt gtcccacgag gctcctctga ccggaggctt cgccagcgag 3660

atcagctcca ccgtgcagga ggagtgcttc ctgaacctgg aggctcctat ctccagggtg 3720

tgcggctacg acaccccttt cccccacatc ttcgagcctt tctacatccc cgacaagtgg 3780

aagtgctacg acgccctgag gaagatgatt aactactgag gagcggccgc tctagagatc 3840

tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg 3900

gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac 3960

tcggcatgct ggggagagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4020

cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt 4080

cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccatgca gccagctggc 4140

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgtagc ctgaatggcg 4200

aatggcgcga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 4260

gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 4320

ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 4380

tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 4440

gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 4500

ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 4560

ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 4620

aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcctga tgcggtattt 4680

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 4740

ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 4800

acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 4860

catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat 4920

acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 4980

ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 5040

gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 5100

tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 5160

tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 5220

acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 5280

cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 5340

ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 5400

ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 5460

atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 5520

cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 5580

tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 5640

gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 5700

ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 5760

ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 5820

tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 5880

cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 5940

ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 6000

tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 6060

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 6120

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 6180

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 6240

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 6300

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 6360

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 6420

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 6480

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac 6540

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 6600

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 6660

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 6720

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 6780

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 6840

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 6900

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 6960

ggctgcaggg gggggggggg gggggtgggg gggggggggg gggg 7004

<210> 12

<211> 6812

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 12

ccttaattag gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacca 180

gggtaatggg gatcctctag aactatagct agtcgacatt gattattgac tagttattaa 240

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 300

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 360

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 420

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 480

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 540

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag 600

gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg 660

tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc 720

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 780

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 840

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc 900

ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac 960

tcccacgcca ccatggctgc tgtcgctgct ttcgctgggt ggctgctgag actgcgggct 1020

gctggggctg atggaccttg gcggagactg tgcggggctg gactgagcag gggcttcctg 1080

cagagcgcct ccgcctacgg agctgccgcc cagcggaggc aggtggccca cttcaccttc 1140

cagcctgacc ctgagcctgt ggagtacggc cagacccaga agatgaacct gttccaggcc 1200

gtgaccagcg ccctggacaa ctccctggcc aaggacccta ccgccgtgat cttcggagag 1260

gacgtggcct tcggcggcgt gttcaggtgc accgtgggac tgagggacaa gtacggcaag 1320

gaccgcgtgt tcaacacccc tctgtgcgag cagggaatcg tgggcttcgg catcggcatc 1380

gctgtgaccg gagctaccgc tatcgctgag atccagttcg ccgactacat cttccctgcc 1440

ttcgaccaga tcgtgaacga ggccgccaag taccgctaca gaagcggcga cctgttcaac 1500

tgcggcagcc tgaccatcag atccccttgg ggatgcgtgg gacacggcgc cctgtaccac 1560

agccagtccc ctgaggcctt cttcgctcac tgccctggca tcaaggtggt ggtgcctcgg 1620

agccctttcc aggctaaggg actgctgctg tcctgcatcg aggacaagaa cccttgcatc 1680

ttcttcgagc ccaagatcct gtacagggct gctgtggagc aggtgcctgt ggagccctac 1740

aacatccctc tgagccaggc tgaggtgatc caggagggat ccgacgtgac cctggtggct 1800

tggggaaccc aggtgcacgt gatcagggag gtggacgcca tggcccagga gaagctgggc 1860

gtgtcctgcg aggtgatcga cctgcgcacc atcctgcctt gggacgtgga caccgtgtgc 1920

aagagcgtga tcaagaccgg cagactgctg gtgtcccacg aggctcctct gaccggaggc 1980

ttcgccagcg agatcagctc caccgtgcag gaggagtgct tcctgaacct ggaggctcct 2040

atctccaggg tgtgcggcta cgacacccct ttcccccaca tcttcgagcc tttctacatc 2100

cccgacaagt ggaagtgcta cgacgccctg aggaagatga ttaactacgg atccggtgag 2160

ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atccgggccc tgaattcgcc 2220

accatgcagg ggagtgctaa gatggctatg gctgtcgccg tcgctgtcgc tcgggtgtgg 2280

agaccttcaa gagggctggg cagaactggg ctgcccctgc tgaggctgct gggagctagg 2340

ggactggctc gcttccaccc tcaccgctgg cagcagcagc agcacttcag ctccctggac 2400

gacaagcctc agttccctgg agctagcgcc gagttcatcg acaagctgga gttcatccag 2460

cccaacgtga tctccggcat ccctatctac agagtgatgg accggcaggg ccagatcatc 2520

aaccctagcg aggaccccca cctgcctcag gagaaggtgc tgaagttcta caagtccatg 2580

accctgctga acaccatgga caggatcctg tacgagagcc agagacaggg ccggatctcc 2640

ttctacatga ccaactacgg cgaggaggga acccacgtgg gaagcgccgc cgccctggac 2700

gacaccgacc tggtgttcgg ccagtacaga gaggccggcg tgctgatgta ccgggactac 2760

cctctggagc tgttcatggc ccagtgctac ggaaacgtgt ccgacctggg aaagggccgg 2820

cagatgcctg tgcactacgg atgcagagag cggcacttcg tgaccatcag ctcccccctg 2880

gccacccaga tccctcaggc tgtgggagct gcttacgctg ccaagagagc caacgccaac 2940

cgggtggtga tctgctactt cggagaggga gctgctagcg agggagacgc tcacgctgga 3000

ttcaacttcg ctgccaccct ggagtgcccc atcatcttct tctgcagaaa caacggctac 3060

gccatcagca cccctacctc cgagcagtac aggggagacg gaatcgctgc taggggacct 3120

ggctacggca tcctgtccat ccgggtggac ggcaacgacg tgttcgccgt gtacaacgcc 3180

accaaggagg ctcggaggcg cgctgtggct gagaaccagc ctttcctgat cgaggccatg 3240

acctacagaa tcggccacca cagcacctcc gacgacagct ccgcctaccg gagcgtggac 3300

gaggtgaact actgggacaa gcaggaccac cccatcagca ggctgaggca ccacctgcag 3360

tccaggggct ggtgggacga cgagcaggag aaggcctgga ggaagcagtc ccgcaagaag 3420

gtgatggagg ccttcgagca ggccgagagg aagctgaagc ccaaccctag cctgatcttc 3480

tccgacgtgt accaggagat gcccgcccag ctgcgcaagc agcaggagtc cctggcccga 3540

cacctgcaga cttatggcga acactaccca ctggaccact ttgagaagtg aacgcgtggt 3600

acctctagag tcgacccggg cggcctcgag gacggggtga actacgcctg aggatccgat 3660

ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct 3720

ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca 3780

ctcggaagca attcgttgat ctgaatttcg accacccata atacccatta ccctggtaga 3840

taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 3900

tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 3960

gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agccttaatt aacctaattc 4020

actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 4080

ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 4140

cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta gcggcgcatt 4200

aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 4260

gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca 4320

agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc 4380

caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt 4440

tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac 4500

aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc 4560

ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt 4620

aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 4680

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 4740

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 4800

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 4860

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 4920

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 4980

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 5040

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 5100

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 5160

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 5220

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 5280

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 5340

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 5400

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 5460

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 5520

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 5580

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 5640

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 5700

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 5760

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 5820

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 5880

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 5940

gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 6000

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 6060

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 6120

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 6180

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 6240

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 6300

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 6360

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 6420

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 6480

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 6540

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt 6600

tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag 6660

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 6720

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc 6780

tatgaccatg attacgccag atttaattaa gg 6812

Claims (27)

1.一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：

(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或

(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；

所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，

其中受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，

其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

2.一种促进受试者的以下功能性蛋白的表达的方法：

(a)BCKDHA蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-α亚基；和/或

(b)BCKDHB蛋白，其是支链α-酮酸(BCAA)脱氢酶复合物的E1-β亚基；

所述方法包括向受试者施用rAAV，所述rAAV包含经工程化以在受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸，

其中受试者包含至少一个具有与枫糖尿症(MSUD)相关的功能丧失性突变的内源BCKDHA和/或BCKDHB等位基因，

其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

3.一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向受试者施用包含经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达所述转基因的核酸的rAAV，其中所述转基因包含BCKDHA和/或BCKDHB，其中所述转基因的表达使受试者的BCAA比率血清水平正常化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述正常化的血清水平的范围为：

(a)约1.4至约1.7摩尔比摩尔(mol/mol)的亮氨酸与异亮氨酸的比率；和/或

(b)约1.3至约1.6mol/mol的缬氨酸与亮氨酸的比率。

5.一种向有需要的受试者递送转基因的方法，所述方法通过向所述受试者施用包含经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达所述转基因的核酸的rAAV，其中所述转基因编码BCKDHA和/或BCKDHB，其中所述转基因的表达使受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸血清水平正常化。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述正常化的血清水平的范围为：

(a)约80至约200微摩尔/升(μmol/L)的亮氨酸；

(b)约40至约160μmol/L的异亮氨酸；和/或

(c)约140至约300μmol/L的缬氨酸。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其进一步包括衣壳蛋白。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中当所述转基因被表达时，表达在施用后持续至少8周。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中通过全身注射进行施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述全身注射为静脉内注射。

11.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述衣壳是AAV9衣壳。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述核酸经工程化以表达密码子优化的人BCKDHA基因(opti-BCKDHA)、opti-BCKDHB、密码子优化的牛BCKDHA基因(opti-cBCKDHA)、opti-cBCKDHB，或其组合。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述核酸包含SEQ ID NO：1-8、11和12中任一项所示的序列。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述核酸包含一个或多个反向末端重复序列(ITR)，其中每个ITR选自AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR和AAV6 ITR。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述ITR中的至少一个是deltaITR(ΔITR)。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中别异亮氨酸的血清浓度降低。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

18.一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，

其中受试者的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸的血清BCAA浓度在施用后至少3周保持在正常范围内。

19.一种治疗患有枫糖尿症(MSUD)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含经工程化以在所述受试者的肝脏和/或骨骼肌中表达BCKDHA和/或BCKDHB的核酸的rAAV，

其中受试者的亮氨酸与异亮氨酸和/或缬氨酸与亮氨酸的血清浓度比率在施用后至少3周保持在正常范围内。

20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其进一步包括衣壳蛋白。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述受试者是人。

22.一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO：11或12所示的序列。

23.一种药物组合物，其包含权利要求22所述的分离的核酸。

24.一种宿主细胞，其包含权利要求22所述的分离的核酸构建体。

25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞、细菌细胞或昆虫细胞。

26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其进一步包含编码AAV衣壳蛋白的分离的核酸。

27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。