KR20210052469A - 갈락토스혈증의 치료를 위한 유전자 요법 - Google Patents

갈락토스혈증의 치료를 위한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

본원에는 GALT 단백질을 암호화하는 재조합 AAV 벡터가 제공된다. 또한 본 개시에는 갈락토스혈증의 치료를 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

갈락토스혈증의 치료를 위한 유전자 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 30일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제 62/725,225호에 대한 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 그 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 개시는 일반적으로 유전자 치료 분야, 특히 갈락토스혈증(갈락토스mia)의 치료에 관한 것이다.
현재 갈락토스 함유 식품의 식이 제한 외에 갈락토스혈증 환자에 대한 치료 옵션은 없다. 갈락토스가 없는 식단을 엄격히 지키더라도, 많은 환자가 식품에서 발견되는 소량의 갈락토스 및 내생적으로 생성된 갈락토스로 인해 장기간의 정신적 및 신체적 결핍을 겪고 있다.
그러므로 효과적인 치료에 대한 필요성이 기술분야에 존재한다. 본 개시는 이러한 필요성을 총족시키며 관련된 장점 또한 제공한다.
개시된 유전자 요법은 기능성 GALT 단백질의 지속적인 발현 및 질환 증상의 완화를 제공하기 위하여 뇌를 포함한, 환자의 세포에 GALT 유전자를 효율적으로 전달함으로써 갈락토스혈증 환자에 대한 지속적인, 장기간 치료 옵션을 제공한다.
이런 치료법을 이루기 위하여, 본원에는 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 ("GALT")를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터가 제공된다. 한 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 서열은 야생형 서열로부터 변형된 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85% 동일하다 (도 4 참조). 다른 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 그것의 동등물을 암호화한다.
한 측면으로, 벡터는 자기-상보성 벡터 또는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 벡터이다.
한 측면으로, 재조합 아데노-관련 바이러스 ("AAV")는 2개의 반전된 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 AAV, 예컨대 scAAV 또는 ssAAV를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 이들 ITR은 후속 감염 단계가 시작할 수 있기 전에 제2 가닥의 합성을 개시하기 위한 프라이머로서 작용하기 위해 서열의 끝에서 헤어핀을 형성한다. 제2 가닥 합성은 효율적인 감염에 대한 여러 블럭 중 하나인 것으로 여겨진다. scAAV의 추가적인 장점으로는 시험관내 및 셍체내에서의 증가되고 연장된 도입유전자 발현을 들 수 있다. 그러므로, 한 측면으로, AAV는 2개의 ITR을 추가로 포함한다.
벡터를 생성하기 위한 재조합 AAV 골격의 비제한적인 예로 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74의 군으로부터의 AAV 벡터 혈청형을 들 수 있다. 추가의 측면으로, 벡터 골격은 AAV9 혈청형, rh74 혈청형, 또는 변형된 AAVrh74 혈청형이다. 또한 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 아르기닌에 대한 트립토판의 선택적 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR의 삽입의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형, 또는 그것의 동등물을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 하나 이상의, 또는 둘 이상의, 또는 셋 이상의, 또는 넷 이상의 변형이 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질의 아미노산에 동일하다는 전제로 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오타이드 및 이들 폴리뉴클레오타이드의 보체가 제공된다. 또한 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 아르기닌에 대한 트립토판의 선택적 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG의 삽입의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형, 또는 그것의 동등물을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질, 또는 하나 이상의, 또는 둘 이상의, 또는 셋 이상의, 또는 넷 이상의 변형이 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질의 아미노산에 동일하다는 전제로 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 조직 특이적 제어 요소, 또는 구성성 프로모터에 선택적으로 작동 가능하게 연결된다. 구성성 프로모터의 비제한적인 예로는, 예를 들어, 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 또는 EF1 프로모터를 들 수 있다. 특정 측면으로, β-액틴 프로모터는 닭 β-액틴 ("CBA") 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 CMV 프로모터, EF1a 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 (인간 또는 마우스) 프로모터, P5 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터,H1 프로모터, U6 프로모터, 또는 알파-1-항트립신 프로모터로부터 선택된다.
추가의 측면으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 AAV는 인핸서 요소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 비제한적인 예로 CMV 인핸서, WPRE 및 RSV 인핸서를 들 수 있다.
특정 측면으로, 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 서열은 야생형 GALT (도 4 참조) 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 SEQ ID NO: 2 또는 3으로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 2 또는 3에 대해 적어도 85% 동일하다. 추가의 측면으로, 재조합 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다
본원에 기술된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV 벡터는 검출 가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 및 담체, 예컨대 보존제 또는 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서 함유될 수 있다.
또한 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터를 포함하는 세포 또는 바이러스 입자가 제공된다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있고 패키징 세포주를 포함할 수 있다. 세포 및 바이러스 입자는 벡터 및 담체, 예컨대 보존제 또는 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서 함유될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 치료적 또는 다른 방법에 사용할 수 있고 야행형 또는 변형된 캡시드 단백질 내에 함유된다. 그러므로, 본원에는 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자, 뿐만 아니라 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 바이러스 입자를 함유한 조성물이 제공된다. 추가로 벡터, 폴리뉴클레오타이드 및 그것들을 함유하는 바이러스 입자를 제조하는 방법이 제공된다. 한 측면으로, 기능성 GALT 효소를 세포에 도입하기 위한 방법이 제공되며, 방법은 세포를 본원에서 기술되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터 또는 캡시드 또는 그것을 함유하는 바이러스 입자, 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉은 생체외에서 또는 생체내에서 이루어질 수 있다.
또한 그것을 필요로 하는 대상체에서 칼락토스혈증을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 본원에 기술된 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자, 또는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
또한 한 측면으로, 갈락토스혈증에 걸릴 수 있는 대상체에서 갈락토스 대사를 증가시키는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 본원에서 기술되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 전달된 양은 치료 전문가에 의해 결정된 유효량이다.
또한 추가로 갈락토스혈증을 앓고 있는 대상체에서 갈락토스혈증과 관련된 질환 상태 또는 증상을 감소시키는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 본원에서 기술되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지며, 질환 상태는 황달, 간 비장 비대, 간세포 기능부전, 저혈당증, 신세뇨관 기능장애, 근력 저하, 패혈증, 백내장, 운동 실조, 떨림, 감소된 골밀도, 성인 여성의 생식력, GalT 결핍의 운동 기능 장애 및 성장 제한, 또는 원발성 난소 기능부전 중 하나 이상을 포함한다. 한 측면으로, 방법은 대상체를 갈락토스혈증을 앓고 있는 것으로 확인한 후, 방법에 의해 확인된 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 한 측면으로, 전달된 양은 치료 전문가에 의해 결정된 유효량이다.
이들 각각의 방법에서, 치료될 갈락토스혈증은 제1형 갈락토스혈증, 제2형 갈락토스혈증, 또는 제3형 갈락토스혈증이다. 특정 측면으로, 갈락토스혈증은 제1형 갈락토스혈증이다.
재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 대안으로, 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 바이러스 입자, 또는 조성물은 전신적으로 투여된다. 또한 추가로, 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로 투여된다. 추가의 측면으로, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된 후 계속해서 전신적으로 투여된다.
키트가 또한 본 개시에 의해 제공되는데, 키트는 본원에서 기술되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터, 바이러스 입자, 및/또는 조성물을 포함한다. 키트는 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 바이러스 입자 또는 조성물을 제조 및 사용하기 위한 설명서를 선택적으로 함유할 수 있다.
도 1A-1C는 3개의 예시 벡터: pAAV-CB-GALT-WPRE-kan (도 1A), pAAV-CB-hGALT (도 1B), 및 pAAV-CB-hGALT-WPREv2 (도 1C)를 도시한다.
도 2는 pAAV-CB-GALT-WPRE-kan 벡터 (도 1A)의 생물 분포를 도시한다.
도 3은 pAAV-CB-GALT-WPRE-Kan 벡터 (FIG 1A)의 벡터를 사용하여 발현된 인간 GALT 단백질의 발현을 도시한다.
도 4는 상응하는 야생형 서열과 비교하여 본원에서 기술된 GALT를 암호화하는 코돈 최적화된 재조합 폴리뉴클레오타이드의 서열 정렬이다.
도 5는 AAV9 벡터 생물 분포를 도시한다. C57Bl/6J (WT) 또는 GalT -/- (CG) 암컷 마우스가 AAV9/lucEYFP 리포터 바이러스의 1E+12 바이러스 게놈 (Vg)으로 정맥내 주사되었고 1주 후에 조직이 수득되었으며 qPCR에 의해 벡터 게놈 복사물에 대해 분석되었다.
도 6은 단백질 발현을 도시한다. 플라스미드 pAAV-CB-GALT-WPRE 또는 pAAV- CB-lucEYFP 리포터 플라스미드가 HEK293 세포에 트랜스펙션되었고 2일 후에 웨스턴 블롯 분석에 의해 GALT 발현에 대해 검정되었다. GALT 트랜스펙션된 세포 용해물 (30 또는 3 μg), LucEYFP 세포 용해물 (138 μg), HepG2 내인성 GALT 단백질 대조군 (135 μg), 정제 태그로 인해 약간 더 높은 분자량을 가지는, 정제된 박테리아에 의해 발현된 GALT 단백질 표준.
본 발명에 따르는 구체예들은 하기에서 보다 자세하게 기술될 것이다. 그러나, 개시의 측면은 상이한 형태로 구체화될 수 있고 본원에서 제시된 구체예들에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 이들 구체예는 본 개시가 철저하고 완전해지고, 기술분야에 숙련된 사람들에게 발명의 범주를 완전하게 전달하게 되도록 제공된다. 본원의 설명에서 사용된 용어는 특정 구체예만을 기술할 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 (기술적 및 과학적 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 용어, 예컨대 일반적으로 사용된 사전에서 정의된 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서 그것이 의미하는 것과 일관되는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며 본원에서 분명하게 정의되지 않는 한 이상적인 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 하는 것이 추가로 이해될 것이다. 하기에서 분명하게 정의되지 않지만, 그러한 용어는 그것의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다.
본원의 설명에서 사용된 용어는 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이며 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본원에서 언급되는 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 기술의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련된 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 종래 기법을 사용할 것이다.
맥락이 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 기술되는 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 특별히 의도된다. 더욱이, 개시는 또한 일부 구체예에서, 본원에 제시된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시하기 위하여, 만약 명세서가 복합체가 구성요소 A, B 및 C를 포함한다고 기술한다면, A, B 또는 C 중 어느 하나, 또는 그것의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략될 수 있고 청구되지 않을 수 있는 것으로 특별히 의도된다.
분명하게 다르게 표시되지 않는 한, 모든 명시된 구체예, 특징, 및 용어는 인용된 구체예, 특징, 또는 용어 및 그것들의 생물학적 동등물을 전부 포함하는 것으로 의도된다.
범위를 포함한 모든 숫자 표시, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 필요에 따라 1.0 또는 0.1의 증분씩 (+) 또는 (-)로, 또는 대안으로 +/- 15 %, 또는 대안으로 10%, 또는 대안으로 5%, 또는 대안으로 2%의 편차로 변하는 근사치이다. 비록 언제나 분명하게 진술되지는 않지만, 모든 숫자 표시는 앞에 용어 "약"이 선행되는 것이 이해될 것이다. 또한 비록 언제나 분명하게 진술되지는 않지만, 본원에서 기술되는 시약은 단순히 예시적인 것이고 그것의 동등물이 기술분야에 알려져 있다는 것이 이해될 것이다.
본 개시 전체에서, 다양한 출판물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 식별하는 인용에 의해 또는 아라비아 숫자에 의해 언급된다. 아라비아 숫자에 의해 식별되는 출판물에 대한 전체 인용은 청구범위 직전에 찾아볼 수 있다. 이들 출판물, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에, 본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 보다 완전하게 기술하기 위하여 그 전문이 본 개시에 참조로 포함된다.
정의
본 기술의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는 유기 화학, 제약학, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래 기법을 사용할 것이다. 예컨대, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) 시리즈: PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))를 참조한다.
발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단일한 것을 나타내는 단어는 맥락이 분명하게 다른 것을 표시하지 않는 한 복수의 대상물을 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바, 본질적으로 이루어지는 (및 문법적 변형)이라는 전이 문구는 인용된 물질 또는 단계 및 인용된 구체예의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다. 그러므로, 본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하게 해석되지 않아야 한다. "이루어지는"은 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 다른 성분의 미량 요소 및 실질적인 방법 단계 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 전이 문구의 각각에 의해 정의된 측면은 본 개시의 범주 내에 있다.
양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 구성요소, 범위, 용량 형태, 등의 선택을 기술하기 위해 사용될 때 용어 또는 "허용되는", "효과적인", 또는 "충분한"은 상기 구성요소, 범위, 용량 형태, 등이 개시된 목적에 적합한 것을 의도한다.
또한 본원에서 사용되는 바, "및/또는"은 관련된 열거된 항목들의 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적으로 해석될 때 ("또는") 조합의 결핍을 나타내며 그것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "아데노-관련 바이러스" 또는 "AAV"는 이 명칭과 관련되고 파보비리다에과 디펜도파보바이러스 속에 속하는 바이러스 부류의 구성원을 나타낸다. 이 바이러스의 다중 혈청형은 유전자 전달에 적합한 것으로 알려져 있다; 모든 공지된 혈청형이 다양한 조직 유형으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 적어도 11개의 차례로 넘버링된 AAV 혈청형이 기술분야에 알려져 있다. 본원에 개시된 방법에 유용한 비제한적인 예시의 혈청형으로 11개 혈청형 중 임의의 것, 예컨대 AAV2, AAV8, AAV9, 또는 변이 혈청형, 예컨대, AAV-DJ 및 AAV PHP.B를 들 수 있다. AAV 입자는 3가지 주요 바이러스 단백질: VP1, VP2 및 VP3을 포함한다. 한 구체예에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74를 나타낸다.
용어 "갈락토스혈증"은 갈락토스를 대사하는 대상체의 능력에 영향을 미치는 유전자 장애를 나타낸다. 식품 (예컨대 유제품)의 락토스는 효소 락타제에 의해 글루코스와 갈락토스로 분해된다. 갈락토스혈증이 있는 개체에서, 갈락토스의 추가의 대사에 필요한 효소 (갈락토키나제 및 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제)는 심각하게 감소되거나 전적으로 없어서, 고전적 갈락토스혈즈의 경우에서와 같이 다양한 조직에서 갈락토스 또는 갈락토스 1-포스페이트 (어떤 효소가 없는지에 따라)의 독성 수준으로 이어져, 한정하는 것은 아니지만, 황달, 간비대 (확대된 간), 신세뇨관 기능장애, 근력 저하, 패혈증, 간세포 기능부전, 간경변, 신부전, 백내장, 구토, 발작, 저혈당증, 무기력, 뇌 손상, 및 난소 부전을 포함하는 질환 상태를 초래한다. 그러므로, 이들 상태는 또한 대상체의 갈락토스혈증과 관련될 때 본 개시의 방법에 의해 적합하게 치료될 수 있다.
대상체에서 결핍된 효소에 따라 갈락토스혈증은 제1형 갈락토스혈증 (갈락토스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제), 제2형 갈락토스혈증 (갈락토키나제), 및 제3형 갈락토스혈증 (UDP 갈락토스 에피머라제)으로서 분류될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에 개시된 재조합 벡터 또는 방법은 제1형, 제2형, 또는 제3형 갈락토스혈증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 또는 방법은 제1형 갈락토스혈증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 갈락토스혈증이 많은 질환 상태와 관련이 있기 때문에, 다른 구체예에서, 개시는 갈락토스혈증을 앓고 있는 대상체에서 질환 상태를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 질환 상태는 황달, 간비대 (확대된 간), 신세뇨관 기능장애, 근력 저하, 패혈증, 간세포 기능부전, 간경변, 신부전, 백내장, 구토, 발작, 저혈당증, 무기력, 뇌 손상, 또는 난소 부전으로부터 선택된다.
갈락토스혈증과 관련된 다른 질환 상태로, 한정하는 것은 아니지만, 언어 장애, 운동 실조, 프리드리히 운동 실조, 운동거리 측정 장애, 감소된 골밀도, 또는 조기 난소 부전을 들 수 있다. 이들 상태는 또한 본 개시의 방법에 의해 치료될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포"는 대상체 또는 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 선택적으로 얻어진 원핵 세포 또는 진핵 세포를 나타낼 수 있다.
"진핵 세포"는 모네라(monera)를 제외한 생명계의 모든 것을 포함한다. 그것은 막-결합 핵을 통해 쉽게 구별될 수 있다. 동물, 식물, 진균, 및 원생생물은 그것의 세포가 내부 막 및 세포골격에 의해 복잡한 구조로 조직화되어 있는 진핵생물 또는 유기체이다. 가장 특징적인 막-결합 구조는 핵이다. 특별히 언급되지 않는 한, 용어 "숙주"는 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함한 진핵생물 숙주를 포함한다. 진핵 세포 또는 숙주의 비제한적인 예는 유인원, 소, 돼지, 쥐과, 래트, 조류, 양서류 및 인간, 예컨대, HEK293 세포 및 293T 세포를 들 수 있다.
"원핵 세포"는 일반적으로 핵 또는 임의의 다른 막-결합 소기관이 없고 두 범주, 박테리아 및 고세균으로 나누어진다. 염색체 DNA 외에, 이들 세포는 또한 에피솜이라 불리는 원형 루프에 유전자 정보를 함유할 수 있다. 박테리아 세포는 매우 작고, 대략 크기가 동물의 미토콘드리아 정도이다 (직경 약 1-2 μm 길이 약 10 μm). 원핵 세포는 3가지 주요 모양을 특징으로 한다: 막대 모양, 구형, 및 나선형. 진핵 세포와 같은 정교한 복제 과정을 통해 진행되는 대신, 박테리아 세포는 이진법 방식으로 분할된다. 예로는 바실루스 박테리아, 대장균 박테리아 및 살모넬라 박테리아를 들 수 있고, 이에 한정되지 않는다.
핵산 서열에 적용될 때 용어 "암호화"는, 본래 상태에서 또는 기술분야의 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대한 mRNA를 생성하도록 전사 및/또는 번역될 수 있다면 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 말할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 안티센스 가닥은 그러한 핵산의 상보물이며, 암호화 서열은 그것으로부터 추론될 수 있다.
용어 "동등한" 또는 "생물학적으로 동등한"은 특정 분자, 생물학적, 또는 세포 물질을 언급할 때 상호교환적으로 사용되며 최소 상동성을 가지는 한편 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하는 것으로 의도된다. 동등한 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는 그것에 대해 또는 폴리펩타이드 서열, 또는 그러한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 상보물에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대해 적어도 60%, 또는 대안으로 적어도 65%, 또는 대안으로 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 매우 엄격한 조건은 본원에서 기술되며 본원에 참조로 포함된다. 대안으로, 그것의 동등물은 참조 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 야생형 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것에 대한 상보물에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다.
동등한 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 60%, 또는 대안으로 적어도 65%, 또는 대안으로 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95%, 또는 대안으로 적어도 97% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 동등물은 또한 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 상보물을 의도한다.
다른 서열에 대해 특정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)의 "서열 동일성"을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 정렬될 때, 염기 (또는 아미노산)의 백분율이 두 서열의 비교에서 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기술되어 있는 것들을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 비제한적인 예시의 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 예시의 프로그램으로 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP를 들 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양 가닥; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 분류=높은 점수; 데이터베이스=비중복성, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세한 내용은 다음 인터넷 주소: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST에서 찾아볼 수 있다. 서열 동일성 및 퍼센트 동일성은 그것을 clustalW (web 주소: grnome.jp/tools/clustalw/에서 이용 가능하고, 2017년 1월 13일에 마지막 접속됨)에 포함시킴으로써 측정될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지되면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유된 매칭되는 또는 상동하는 위치의 수의 함수이다. "비관련" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 또한 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 두 핵산 분자를 나타낼 수 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 나타낸다. 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 쌍형성, 후그스타인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자체-혼성화 가닥, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 광범위한 과정, 예컨대 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오타이드의 효소적 절단의 단계를 구성할 수 있다.
엄격한 혼성화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6xSSC 내지 약 10xSSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4xSSC 내지 약 8xSSC의 세척 용액. 중간 혼성화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9xSSC 내지 약 2xSSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아마이드 농도; 및 약 5xSSC 내지 약 2xSSC의 세척 용액. 높은 엄격한 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1xSSC 내지 약 0.1xSSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1xSSC, 0.1xSSC의 세척 용액, 또는 탈이온수. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이며, 1, 2회, 또는 그 이상의 세척 단계가 있고, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충액이다. 다른 완충 시스템을 사용하는 SSC의 동둥물이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속해서 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 나타낸다. 만약 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자"는 전사되고 번역된 후에 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 LDt는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. "유전자 생성물" 또는 대안으로 "유전자 발현 생성물"은 유전자가 전사되고 번역될 때 생성된 아미노산 (예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)을 나타낸다.
"전사 제어 하에"는 기술분야에서 널리 이해되는 용어이며 폴리뉴클레오타이드 서열, 보통 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하는, 또는 전사를 촉진하는 요소에 작동 가능하게 연결되는 것에 의존하는 것을 나타낸다. "작동 가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드가 그것이 세포에서 기능할 수 있는 방식으로 배열되는 것을 의도한다. 한 측면으로, 본 발명은 하류 서열, 예컨대, 자살 유전자, VEGF, 165A VEGF, tet 활성자, 등에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 제공한다.
용어 "암호화"는 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때, 만약 본래 상태에서 또는 기술분야에서 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대한 mRNA를 생성하도록 전사 및/또는 번역될 수 있다면 폴리펩타이드를 "암호화"하는 것으로 말할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 안티센스 가닥은 그러한 핵산의 상보물이고, 암호화 서열은 그것으로부터 추론될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "기능성"은 그것이 특정한, 명시된 효과를 이루는 것을 의도하도록 임의의 분자, 생물학적, 또는 세포 물질을 변형하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드이든 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러므로, 이 용어는, 한정하는 것은 아니지만, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적인, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열, 예컨대 유전자의 발현을 조절하는 임의의 서열을 나타낸다. 프로모터는 예를 들어, 구성성, 유도성, 억제성, 또는 조직 특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열이다. 그것은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 요소, 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 비제한적인 예시의 프로모터로는 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서 포함), 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, 또는 EF1 프로모터를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 닭 β-액틴 ("CBA") 프로모터이다 (예컨대, SEQ ID NO: 2의 염기쌍 번호 439 내지 708 또는 SEQ ID NO: 3의 염기쌍 번호 644 내지 921, 또는 이것들 각각의 동등물).
특정 표적 특이서을 가진 추가적인 비제한적인 예시의 프로모터가 하기에 제공되며, 이것들에 한정되지 않는다: CMV, EF1a, SV40, PGK1 (인간 또는 마우스), P5, Ubc, 인간 베타 액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, 폴리헤드린, CaMKIIa, Gal1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6, 및 알파-1-항트립신 프로모터. 합성에 의해 유래된 프로모터가 편재성 또는 조직 특이적 발현에 사용될 수 있다. 추가로, 일부가 상기에서 주지된 바 있는, 바이러스-유래 프로모터, 예컨대, CMV, HIV, 아데노바이러스, 및 AAV 프로모터가 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 전사 효율을 증가시키기 위하여 인핸서에 결합된다. 인핸서의 비제한적인 예로 RSV 인핸서 또는 CMV 인핸서(예컨대, SEQ ID NO: 2의 염기쌍 번호 153 내지 432)를 들 수 있다.
인핸서는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부가 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성"을 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈의 주어진 유전자와 자연적으로 결합되는 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 유저자 조작 (즉 분자 생물학적 기법)에 의해 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자와 나란히 놓여 있는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되며 가장 넓은 의미로 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드 모방물의 둘 이상의 하위단위의 화합물을 나타낸다. 하위단위들은 펩타이드 결합에 의해 결합될 수 있다. 다른 측면으로, 하위유닛은 다른 결합, 예컨대, 에스테르, 에테르, 등에 의해 결합될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고 단백질 서열 또는 펩타이드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방물을 포함하여, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "벡터"는, 예를 들어, 형질전환 과정에 의해 벡터가 세포 내에 배치되었을 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하는 비-염색체 핵산을 나타낸다. 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 배큘로바이러스, 변형된 배큘로바이러사, 파포바이러스(papovirus), 또는 그렇지 안으면 변형된 자연 발생적인 바이러스를 포함한다. 핵산을 전달하기 위한 예시의 비바이러스성 벡터는 네이키드 DNA; 단독의 또는 양이온성 중합체와 조합된, 양이온성 지질과 복합체를 형성한 DNA; 음이온성 및 양이온성 리포솜; 일부 경우에 리포솜에 함유된, 이종성 폴리리신, 규정된 길이의 올리고펩타이드, 및 폴리에틸렌 이민과 같은 양이온성 중합체와 축합된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 삼원 복합체의 사용을 포함한다.
"바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내 중 어느 하나에서 숙주 세포에 절달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등이 있다. 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 포리스트 바이러스-기반 벡터 및 신드비스 바이러스-기반 벡터가 또한 유전자 요법 및 면역요법에 사용하기 위해 개발되었다. Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827 참조.
다른 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 특정 관련 구체예에서, 프로모터는 유도성 테트라사이클린 프로모터이다. Tet-오프 및 Tet-온 유전자 발현 시스템으로 인해 연구자들은 Gossen & Bujard (1992; Tet-오프) 및 Gossen et al. (1995; Tet-온)에 의해 기술된 조절된, 고수준 유전자 발현 시스템에 접근할 수 있다. Tet-오프 시스템에서, 유전자 발현은 테트라사이클린 (Tc) 또는 독시사이클린 (Dox; Tc 유도체)이 배양 배지로부터 제거될 때 시작된다. 반대로, 발현은 Tet-온 시스템에서 Dox의 첨가에 의해 시작된다. 두 시스템 모두 유전자 발현이 달라지는 농도의 Tc 또는 Dox에 대한 반응으로 엄격하게 조절되도록 한다. Tet 시스템에서 최대 발현 수준은 매우 높고 CMV와 같은 강력한, 구성성 포유류 프로모터로부터 얻을 수 있는 최대 수준과 유리하게 비교된다 (Yin et al., 1996). 다른 유도성 포유류 발현 시스템과 달리, Tet 시스템에서의 유전자 조절은 매우 특이적이고, 따라서 결과의 해석은 다면발현 효과 또는 비특이적 유도에 의해 복잡해지지 않는다. 대장균에서, Tet 억제 단백질 (TetR)은 Tn10 트랜스포존 상의 테트라사이클린-내성 오페론의 유전자를 부정적으로 조절한다. TetR은 Tc의 부재 하에 tet 오퍼레이터 서열 (tetO)에 결합함으로써 이들 유전자의 전사를 차단한다. TetR 및 tetO는 포유류 실험 시스템에서 사용하기 위한 조절 및 유도의 토대를 제공한다. Tet-온 시스템에서, 조절 단백질은 TetR의 4개의 아미노산 변화에 의해 생성된 "역" Tet 억제자 (rTetR)를 토대로 한다 (Hillen & Berens, 1994; Gossen et al., 1995). 그 결과의 단백질, rtTA (역 tTA는 또한 테트라사이클린 활성자 단백지로 언급됨)는 pTet-온 조절자 플라스미드에 의해 암호화된다. 이 유전자는 별도의 벡터에 GALT 유전자로서 있거나 또는 동일한 유전자 상에 암호화될 수 있다.
관련된 구체예에서, 벡터는 테트라사이클린 활성자 단백질을 암호화하는 핵산; 및 테트라사이클린 활성자 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 벡터, 분리된 세포, 바이러스 포장 시스템, 및 방법에서 유용한 다른 유도성 시스템은 엑디손에 의해, 에스트로겐, 프로게스테론, 다이머화의 화학적 유도물질, 및 아이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드 (EPTG)에 의한 조절을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "재조합 발현 시스템" 또는 "재조합 벡터"는 재조합에 의해 형성된 특정 유전자 물질의 발현을 위한 유전자 구성물 또는 구성물들을 나타낸다.
"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 운반할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포솜, 미셸 생체부합성 중합체, 이를테면 천연 중합체 및 합성 중합체; 리포단백질; 폴리펩타이드; 다당; 리포다당; 인공 바이러스 엔벨로프; 금속 입자; 및 박테리아, 또는 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현에 대해 기술되었고, 간단한 단백질 발현을 위해서뿐만 아니라 유전자 요법에 대해서 사용될 수 있는, 기술분야에서 전형적으로 사용된 기타 재조합 비히클이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 "유전자 전달", "유전자 수송", "형질도입하는" 등은 도입에 사용된 방법과는 무관하게, 외인성 폴리뉴클레오타이드 (때로는 "도입유전자"로서 언급됨)를 숙주 세포에 도입하는 것을 나타내는 용어이다. 이러한 방법으로는 벡터-매개 유전자 전달 (예컨대, 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의함)뿐만 아니라 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하는 기법 (예컨대 전기천공법, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위해 사용된 다양한 다른 기법)과 같은 다양한 잘 알려져 있는 기법을 들 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정적인 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포와 부합하는 복제 기원을 함유하거나 염색체외 레플리콘 (예컨대, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 숙주 세포의 레플리콘에 통합되는 것을 필요로 한다. 많은 벡터가 기술분야에 알려져 있고 본원에 기술된 것과 같이, 포유류 세포에 유전자의 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.
"플라스미드"는 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는, 염색체 DNA와 별개의 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우에, 그것은 원형이고 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내에서 수평적인 유전자 전달을 위한 메커니즘을 제공하고 전형적으로 주어진 환경 상태 하에서 선택적 장점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁적인 환경 틈새에서 자연적으로 발생하는 항생물질에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반할 수 있거나, 또는 대안으로 생성된 단백질이 유사한 상황 하에서 독소로서 작용할 수 있다.
유전자 조작에 사용된 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로 불린다. 많은 플라스미드가 그러한 용도에 대해 상업적으로 이용될 수 있다. 복제될 유전자는 세포를 특정 항생물질에 대해 내성으로 만드는 유전자 및 이 위치에서 DNA 단편의 용이한 삽입을 허용하는 여러 개의 일반적으로 사용된 제한 부위를 함유한 짧은 영역인 다중 클로닝 부위 (MCS, 또는 폴리링커)를 함유하는 플라스미드의 복사물에 삽입된다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 다량의 단백질을 제조하는 것이다. 이 경우에, 연구자들은 관심 있는 유전자를 은닉한 플라스미드를 함유하는 박테리아를 성장시킨다. 박테리아가 항생물질 내성을 부여하기 위한 단백질을 생성하는 것과 같이, 그것은 또한 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질을 생성하도록 유도될 수 있다.
유전자 전달이 DNA 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 구성물은 바이러스 게놈 또는 그것의 일부, 및 도입유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 아데노바이러스 (Ad)는 50개 이상의 혈청형을 포함한, 상대적으로 잘 특성화되어 있는, 균일한 바이러스 그룹이다. Ad는 숙주 세포 게놈에의 통합을 필요로 하지 않는다. 재조합 Ad 유래 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성에 대한 잠재력을 감소시키는 것들이 또한 구성되었다. 이러한 벡터는 Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA), 및 Creative Biogene (Shirley, NY)과 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 야생형 AAV는 높은 감염력 및 특이성을 가지며 숙주 세포 게놈에 통합된다. Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 및 Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 참조.
프로모터 및 폴리뉴클레오타이드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 둘 다를 함유한 벡터가 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러한 벡터는 시험관내에서 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있고, Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.)와 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위하여, 잠재적인 부적절한 대체 번역 개시 코돈 또는 전사 또는 번역 수준에서 발현을 간섭하거나 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거하기 위해 클론의 5' 및/또는 3' 미번역 부분을 제거하거나, 첨가하거나 변경하는 것이 필요할 수 있다. 대안으로, 공통 리보좀 결합 부위가 발현을 향상시키기 위하여 출발 코돈의 5' 직후에 삽입될 수 있다.
유전자 전달 비히클은 또한 DNA/리포솜 복합체, 미셸 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체를 포함한다. 또한 표적화 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 리포솜은 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 세포 또는 세포 집단에의 전달 외에, 본원에 기술된 단백질의 세포 또는 세포 집단에의 직접적인 도입은 단백질 트랜스펙션의 비제한적인 기법에 의해 실시될 수 있고, 대안으로 본원에 개시된 단백질의 발현을 향상시킬 수 있고 및/또는 활성을 촉진할 수 있는 배양 조건이 다른 비제한적인 기법이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "신호 펩타이드" 또는 "신호 폴리펩타이드"는 새롭게 합성된 분비 또는 막 폴리펩타이드 또는 단백질의 N-말단부에서 일반적으로 존재하는 아미노산 서열을 의도한다. 그것은 폴리펩타이드를 특정 세포 위치로, 예컨대 세포막을 가로질러, 세포막으로, 또는 핵으로 지시하는 작용을 한다. 일부 구체예에서, 신호 펩타이드는 국지화 후에 제거된다. 신호 펩타이드의 예는 기술분야에 잘 알려져 있다. 비제한적인 예는 미국 특허 제 8,853,381호, 5,958,736호, 및 8,795,965호에서 기술된 것들이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 입자의 단백질성 껍질 또는 코트를 나타낸다. 캡시드는 바이러스 게놈을 캡시드화하고, 보호하고, 수송하고, 숙주 세포에 방출하는 기능을 한다. 캡시드는 일반적으로 단백질 ("캡시드 단백질")의 올리고머 구조의 하위단위로 구성된다. 본원에서 사용되는 용어 "캡시드화된"은 바이러스 캡시드로 동봉된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 또는 플라스미드와 관련하여 용어 "헬퍼"는 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자드, 예컨대 본원에 개시된 변형된 AAV의 복제 및 포장에 필요한 추가적인 구성요소를 제공하기 위해 사용된 바이러스 또는 플라스미를 나타낸다. 헬퍼 바이러스에 의해 암호화된 구성요소는 비리온 조립, 캡시드화, 게놈 복제, 및/또는 포장에 필요한 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스는 바이러스 게놈의 복제를 위해 필요한 효소를 암호화할 수 있다. AAV 구성물과 함께 사용하기에 적합한 헬퍼 바이러스 및 플라스미드의 비제한적인 예로는 pHELP (플라스미드), 아데노바이러스 (바이러스), 또는 헤르페스바이러스 (바이러스)를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스의 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 공동 감염시키는 헬퍼 바이러스에 의해 특정 기능이 제공되는 세포에서만 성장하는 단일 가닥의 DNA 파보바이러스이다. AAV의 일반적인 정보 및 개요는 예를 들어, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228, 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)에서 찾아볼 수 있다. 이들 개요에서 기술된 동일한 원리가 리뷰의 공개일 이후에 특성화된 추가의 AAV 혈청형에도 적용될 것으로 전적으로 예상되는데, 다양한 혈청형이 구조적으로 및 기능적으로, 심지어 유전자 수준에서도 아주 밀접하게 관련된 것으로 잘 알려져 있기 때문이다 (예를 들어, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974) 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 외관상 상동성 rep 유전자에 의해 매개된 매우 유사한 복제 특성을 나타내고; 전부 AAV2에서 발현된 것과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 포함한다. 관련성 정도는 게놈의 길이를 따르는 혈청형과 "역위 말단 반복부 서열" (ITR)에 상응하는 말단에서의 유사한 자가-어닐링 분절의 존재 사이의 광범위한 교차 혼성화를 드러내는 헤테로듀플렉스 분석에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염성 패턴이 또한 각각의 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 시사한다.
본원에서 사용되는 바 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 관심의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (또는 도입유전자)를 포함하는 벡터를 나타낸다. 그러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포에서 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 포장될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 나타낸다. 만약 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉 포유류 세포에 전달될 도입유전자와 같은, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다면, 그것은 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "AAV 벡터"로서 언급된다. 그러므로, AAV 벡터 입자의 생성은 AAV 벡터의 생성을 필연적으로 포함하며, 이것은 그러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되기 때문이다.
일부 구체예에서, AAV는 복제 결핍 파보바이러스이고, 그것의 단일 가닥 DNA 게놈은 길이가 약 4.7 kb이며 2개의 145 뉴클레오타이드 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함하고 있다. AAV의 다중 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 알려져 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)에서 제공되며; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829로 제공되며; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862로 제공되며; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고; AAV-9 게놈은 Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에서 제공되며; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에서 제공되고; 그리고 AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에서 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 미국 특허 제 9,434,928호 (본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다. 미국 특허 제 9,434,928호는 또한 캡시드 단백질 및 자체 상보성 게놈의 서열들을 제공한다. 한 측면으로, 게놈은 자체 상보성 게놈이다. 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡시드화/포장 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 Cis-작용 서열이 AAV ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터 (상대적인 지도 위치에 대해 p5, pl9, 및 p40으로 명명됨)가 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 구동시킨다. 2개의 rep 프로모터 (p5 및 pi 9)는 단일 AAV 인트론의 상이한 스플라이싱 (뉴클레오타이드 2107과 2227에서)과 결합되어, rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)의 생성을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈의 복제에 기여하는 다중 효소 특성을 가지고 있다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 대체 스플라이싱 및 비-공통 번역 출발 부위는 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성에 기여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 생명 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에서 리뷰된다.
AAV는 예를 들어 유전자 요법에서 그것을 외래 DNA를 세포로 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 만드는 독특한 특징을 가지고 있다. 배양 중의 세포의 AAV 감염은 비세포병원성(noncytopathic)이며, 인간 및 다른 동물의 자연적인 감염은 침묵성이고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜서 생체내에서 많은 상이한 조직을 표적으로 할 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 느리게 분할하는 및 비분할 세포를 형질도입하고, 전사적으로 활성인 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 본질적으로 그런 세포의 수명 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드에 클로닝된 DNA로서 삽입되며, 그것은 재조합 게놈의 구성을 실현가능하게 만든다. 나아가, AAV 복제 및 게놈 캡시드화를 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, 게놈 (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화함)의 내부적인 대략 4.3 kb의 일부 또는 전부는 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위하여, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 그것이 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 그것은 아데노바이러스를 비활성화하기 위해 사용된 조건 (수 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 쉽게 견뎌서, AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 대해 내성이 아니다.
다중 연구가 근육에서의 장기간 (> 1.5년) 재조합 AAV-매개 단백질 발현을 입증하였다. Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); 및 Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996) 참조. 또한, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001) 참조. 더욱이, 근육이 매우 혈관이 발달되어 있기 때문데, 재조합 AAV 형질도입은 Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) 및 Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)에 기술된 것과 같이 근육내 주사 후에 전신 순환에서 도입유전자 생성물의 출현을 초래하였다. 더욱이, Lewis 등은 J Virol, 76: 8769-8775 (2002)에서 골격 근섬유가 정확한 항체 글리코실화, 접힘, 및 분비에 필요한 세포 인자를 가지고 있고, 이것은 근육이 분비된 단백질 치료제의 안정적인 발현을 할 수 있음을 나타낸다는 것을 입증하였다. 발명의 재조합 AAV (rAAV) 게놈은 GALT를 암호화하는 핵산 분자 (예컨대, SEQ ID NO: 1) 및 그 핵산 분자를 플랭킹하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈의 AAV DNA는 한정하는 것은 아니지만 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13, AAV PHP.B 및 AAV rh74를 포함한, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 의사유형 rAAV의 제조는, 예를 들어 WO 01/83692에서 개시된다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 가진 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열이 기술분야에 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 캡시드 단백질과 관련하여 용어 "외부"는 조립된 바이러스 캡시드에서 외부를 향하고 있는 캡시드 단백질의 표면, 도메인, 영역, 또는 말단부를 나타낸다. 바이러스 캡시드 단백질과 관련하여 용어 "내부"는 조립된 바이러스 캡시드에서 내부를 향하고 있는 캡시드 단백질의 표면, 도메인, 영역, 또는 말단부 (아미노 말단부 또는 카르복시 말단부)를 나타낸다. 조립된 바이러스 캡시드와 관련하여 사용될 때, 용어 "내부"는 바이러스 캡시드 내부의 캡시드화된 공간 및 밀폐된 공간에 노출되는 캡시드의 내부를 향한 표면을 나타낸다. 내부 공간은 바이러스 캡시드 단백질에 의해 캡시드화되고 바이러스 게놈, 바이러스 단백질, 숙주 또는 포장 세포의 단백질과 같은 핵산, 및 복제, 비리온 조립, 캡시드화, 및/또는 포장 중에 포장되거나 캡시드화된 임의의 다른 구성요소 또는 인자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "콘쥬게이션된"은 바이러스 캡시드 단백질을 GALT 단백질 또는 그것의 동등물에 부착, 결합, 융합, 및/또는 연결시키는 임의의 방법을 나타낸다. 콘쥬게이션의 비제한적인 예로는 GALT 단백질 또는 그것의 동등물과 바이러스 캡시드 단백질이 GALT 단백질 또는 그것의 동등물 및 바이러스 캡시드 단백질 둘 다에 대한 유전자를 포함하는 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 재조합 융합 단백질, GALT-인테인 단백질 및 바이러스 캡시드-인테인 단백질의 모듈식 인테인 기반 어셈블리, GALT 단백질 또는 그것의 동등물과 바이러스 캡시드 단백질 사이에서 화학적 결합이 형성되도록 하는 번역후 변형, 및 하나 이상의 링커를 통한 GALT 또는 그것의 동등물과 바이러스 캡시드 단백질과의 결합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 콘쥬게이션은 바이러스 캡시드 단백질과 그것의 동등물 사이의 일시적인 또는 과도기적 결합 상태일 수 있다. 예를 들어, GALT 또는 그것의 동등물은 감염의 후기 단계에서 또는 특정 세포 미세환경 내에서 pH의 변화 또는 이온 구배에 민감한 중합체를 통해 바이러스 캡시드 단백질에, 예컨대 옥심 결합처럼, 일시적으로 결합될 수 있다 (예컨대 Jin et al. Biomacromolecules, 2011, 12 (10), pp 3460-3468 및 Yoshida et al. Expert Opin Drug Deliv. 2013 Nov; 10(11): 1497-1513 참조).
본원에서 사용되는 바, 용어 "표지"는 "표지된" 조성물을 생성하기 위하여 검출될 조성물에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이션된 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물 또는 조성물, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와 같은 단백질을 의도한다. 용어는 또한 삽입된 서열의 발현시 신호를 제공할 폴리뉴클레오타이드에 콘쥬게이션된 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 등을 포함한다. 표지는 자체로 검출 가능하거나 (예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소적 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다. 표지는 소규모 검출에 적합하거나 또는 고처리량 스크리닝에 보다 적합할 수 있다. 그와 같이, 적합한 표지로는, 한정하는 것은 아니지만, 방사성 동위원소, 형광 색소, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함한 단백질을 들 수 있다. 표지는 간단히 검출되거나 또는 정량화될 수 있다. 간단히 검출되는 반응은 일반적으로 그것의 존재가 단순히 확인되는 반응을 포함하는 반면, 정량화되는 반응은 일반적으로 세기, 분극, 및/또는 다른 특성과 같이 정량화될 수 있는 (예컨대, 숫자로 기록할 수 있는) 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출 가능한 반응은 결합에 실제로 포함된 검정 구성요소와 회합된 발광단 또는 형광단을 사용하여 직접 생성될 수 있거나, 또 다른 (예컨대, 리포터 또는 지표) 구성요소와 회합된 발광단 또는 형광단을 사용하여 간접적으로 생성될 수 있다.
신호를 생산하는 발광 표지의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 생물발광 및 화학발광을 들 수 있다. 검출 가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화, 또는 발생을 포함한다. 발광에 의해 표지화하는 검정 구성요소에 적합한 방법 및 발광단은 기술분야에 알려져 있고 예를 들어 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)에서 기술된다. 발광 프로브의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 에쿼린 및 루시페라제를 들 수 있다.
적합한 형광 표지의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 파이렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루.TM., 및 텍사스 레드를 들 수 있다. 다른 적합한 광학적 염료는 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)에 기술되어 있다.
다른 측면으로, 형광 표지는 세포 표면 마커와 같은 세포 또는 조직에 또는 표면 상에 존재하는 세포 구성요소에 대한 공유 부착을 용이하게 하기 위해 기능화된다. 적합한 작용기로는, 한정하는 것은 아니지만, 이소티오시아네이트 기, 아미노 기, 할로아세틸 기, 말레이미드, 석신이미딜 에스테르, 및 설포닐 할로겐화물을 들 수 있고, 이것들은 모두 형광 표지는 제2 분자에 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 형광 표지의 작용기의 선택은 링커, 작용제, 마커, 또는 제2 표지화제 중 어느 하나에의 부착 부위에 좌우될 것이다.
형광 표지의 부착은 세포 구성요소 또는 화합물에 직접적이거나 또는 대안으로, 링커를 통해서일 수 있다. 형광 표지를 중간체에 간접적으로 연결하는 데 사용하기 위한 적합한 결합 쌍으로는, 한정하는 것은 아니지만, 항원/항체, 예컨대, 로다민/항-로다민, 비오틴/아비딘 및 비오틴/스트렙타비딘을 들 수 있다.
문구 "고체 지지체"는 "배양 플레이트", "유전자 칩" 또는 "마이크로어레이"와 같은 비수성 표면을 나타낸다. 이러한 유전자 칩 또는 마이크로어레이는 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 많은 기법에 의해 진단 및 치료 목적에 사용될 수 있다. 한 기법에서, 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화 접근법, 예컨대 미국 특허 제 6,025,136호 및 6,018,041호에서 개관된 접근법에 의해 DNA 서열을 측정하기 위해 유전자 칩에 부착되어 그 위에 배열된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 프로브에 대해 변형될 수 있고, 결국 유전자 서열의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어 미국 특허 제 5,968,740호 및 5,858,659호에서 기술되어 있다. 프로브는 또한 Kayem 등에 의해 미국 특허 제 5,952,172호에 및 Kelley 등에 의해 Nucleic Acids Res. 27:4830-4837 (1999)에서 기술된 것과 같이 핵산 서열의 전기화학적 검출을 위해 전극 표면에 부착 또는 고정될 수 있다.
"조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또한 항체 및 또 다른 화합물 또는 조성물, 비활성 (예컨대, 검출 가능한 표지) 또는 활성 (예컨대, 유전자 전달 비히클)의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.
"제약학적 조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와, 고체 지지체와 같은 활성 또는 비활성의 담체를 조합하여 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도에 적합한 조성물을 만드는 것을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 표준 제약학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 및 에멀션, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해서는 Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)을 참조한다.
진단 또는 치료의 "대상체"는 세포 또는 포유류, 또는 인간과 같은 동물이다. 대상체는 특정 종에 제한되지 않으며 진단 또는 치료를 받는 비인간 동물 대상체를 포함하고 감염 또는 동물 모델의 대상인 것들, 예를 들어 유인원, 쥐과, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물, 및 애완동물이다. 인간 환자 또한 용어 내에 포함된다.
용어 "조직"은 본원에서 살아있는 또는 죽은 유기체의 조직 또는 살아있는 또는 죽은 유기체로부터 유래되거나 그것을 모방하기 위해 설계된 임의의 조직을 나타내기 위해 사용된다. 조직은 건강한, 병든 것이거나, 및/또는 유전자 돌연변이를 가질 수 있다. 생물학적 조직은 유기체 신체의 장기 또는 부분 또는 영역을 구성하는 임의의 단일 조직 (예컨대, 상호연결될 수 있는 세포의 모음) 또는 조직의 그룹을 포함할 수 있다. 조직은 균일한 세포 물질을 포함하거나 또는 그것은 흉부를 포함한 신체 영역에서 볼 수 있는 것과 같은 복합 구조일 수 있고, 예를 들어 폐 조직, 골격 조직, 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있다. 예시의 조직으로는, 한정하는 것은 아니지만 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담관, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장, 및 이것들의 임의의 조합으로부터 유래된 것들을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 대상체에서 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환의 소인이 있거나 또는 질환의 증상을 아직 나타내지 않는 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (2) 질환을 억제하거나 그것의 발달을 저지하는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 개선하거나 또는 퇴행을 유발하는 것을 나타낸다. 기술분야에서 이해되는 바, "치료"는 임상 결과를 포함한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 검출할 수 있거나 검출할 수 없거나 간에 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 상태 (질환 포함)의 정도의 감소, 상태 (질환 포함)의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 상태 (질환 포함)의 지연 또는 둔화, 상태 (질환 포함)의 진행, 개선 또는 완화, 상태 및 차도 (부분적이거나 전체적임) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 이루기 위해 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 치료 또는 예방 적용의 맥락에서, 유효량은 문제되는 상태의 유형 및 중증도 및 개별 대상체의 특징, 예컨대 일반적 건강상태, 연령, 성별, 체중, 및 제약학적 조성물에 대한 허용성에 좌우될 것이다. 유전자 요법의 맥락에서, 일부 구체예에서 유효량은 대상체에서 결핍된 유전자의 일부 또는 전체 기능을 다시 획득하는 것을 초래하기에 충분한 양이다. 다른 구체예에서, AAV 바이러스 입자의 유효량은 대상체에서 유전자의 발현을 초래하기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 유효량은 그것을 필요로 하는 대상체에서 갈락토스 대사를 증가시키기 위해 필요한 양이다. 숙련된 전문가는 이들 및 다른 요인들에 따라 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서 유효량은 문제의 적용의 크기 및 본질에 좌우될 것이다. 그것은 또한 표적 대상체 및 사용되는 방법의 본질 및 민감도에 좌우될 것이다. 숙련된 전문가는 이들 및 다른 고려사항을 토대로 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 유효량은 구체예에 다라 조성물의 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "투여하다" 또는 "투여"는 동물 또는 인간과 같은 대상체에 물질을 전달하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 투여는 치료 전 과정을 통해 한 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 투여의 가장 효과적인 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료를 위해 사용된 조성물, 치료 목적, 뿐만 아니라 치료되는 대상체의 연령, 건강상태 또는 성별에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여가 치료하는 의사에 의해 또는 애완동물 및 동물의 경우에 치료하는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적합한 투여 제형 및 작용제의 투여 방법은 기술분야에 알려져 있다. 투여 경로 또한 결정될 수 있고 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있으며 치료를 위해 사용된 조성물, 치료의 목적, 치료되는 대상체의 건강 상태 또는 질환 단계 및 표적 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 투여 경로의 비제한적인 예로는 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수강내, 심실하, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 망막하, 유리체내, 관절내, 안구내, 복강내, 자궁내, 피내, 피하, 경피, 경점막, 및 흡입을 들 수 있다.
개시를 수행하기 위한 방식
AAV 벡터, 캡시드 및 제조 방법
본원에는 갈락토스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제 ("GALT")를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터가 제공된다. 한 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 서열은 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개 또는 그 이상, 또는 전부가 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일하다. 다른 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 그것의 동등물을 암호화한다.
한 측면으로, 벡터는 자체 상보성 벡터 또는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 벡터이다.
한 측면으로, AAV는 2개의 역말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 AAV, 예컨대 scAAV 또는 ssAAV를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 이들 ITR은 후속 감염 단계가 시작될 수 있기 전에 제2 가닥의 합성을 개시하기 위한 프라이머로서 작용하기 위해 서열의 단부에서 헤어핀을 형성한다. 제2 가닥 합성은 효율적인 감염에 대한 여러 블록들 중 하나인 것으로 여겨진다. scAAV의 추가적인 장점으로는 시험관내 및 생체내에서의 증가되고 연장된 도입유전자 발현을 들 수 있다. 그러므로, 한 측면으로, AAV는 2개의 ITR을 추가로 포함한다.
벡터를 생성하기 위한 재조합 AAV 골격의 비제한적인 예로는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74의 군으로부터의 AAV 벡터 혈청형을 들 수 있다. 추가의 측면으로, 벡터 골격은 AAV9 혈청형, rh74 혈청형, 또는 변형된 AAVrh74 혈청형이다.
GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 조직 특이적 제어 요소, 또는 구성성 프로모터에 선택적으로 작동 가능하게 연결된다. 구성성 프로모터의 비제한적인 예로는, 예를 들어, 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서 포함함), 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 또는 EF1 프로모터를 들 수 있다. 특정 측면으로, β-액틴 프로모터는 닭 β-액틴 ("CBA") 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 CMV 프로모터, EF1a 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 (인간 또는 마우스) 프로모터, P5 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, H1 프로모터, U6 프로모터, 또는 알파-1-항트립신 프로모터로부터 선택된다.
추가의 측면으로, 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV는 인핸서 요소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 비제한적인 예로 CMV 인핸서, WPRE 및 RSV 인핸서를 들 수 있다.
특정 측면으로, 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 서열은 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개 또는 그 이상, 또는 전부가 SEQ ID NO: 2 또는 3으로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 2 또는 3에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일하다. 추가의 측면으로, 재조합 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
본원에서 기술된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV 벡터는 검출 가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터는 벡터 및 담체, 예컨대 보존성 또는 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서 함유될 수 있다.
AAV 벡터 전달은 현재 바이러스의 자연적인 향성을 토대로 한 조직 표적화에 대한 혈청형 선택의 사용에 의존하거나 또는 표적 조직으로의 직접 주사에 의해 이루어진다. 만약 최대 치료 이익을 이루기 위해 전신적 전달이 필요하다면, 혈청형 선택은 단지 조직 특이적 프로모터와 조합된 조직 표적화에 대한 이용 가능한 옵션일 뿐이다. 그러므로, AAV 벡터는 조직 향성을 가진 캡시드에 포장될 수 있다.
일부 측면으로, 벡터는 야생형 또는 변형된 캡시드 입자인 바이러스 캡시드에 캡슐화된다. 한 측면으로, 개시는 캡시드 단백질, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 캡시드 단백질의 제조 방법, 재조합 바이러스 입자 및 바이러스 입자의 생성을 위한 재조합 발현 시스템을 제공한다. 한 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질 또는 대안으로, 아미노산 치환 또는 1 내지 7개 아미노산의 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 선택적으로 AAV9, AAV PHP.B, 또는 변형된 AAVrh74의 VP1이다. 예를 들어, AAV PHP.B는 간 향성을 감소시키기 위하여 아스파라긴에서 리신으로 변형된 AAV9 VP1의 아미노산 498을 가진다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 아르기닌에 대한 트립토판의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대해 높은 친화도를 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 또한 이들 폴리펩타이드 및 그것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 동등물이 제공되는데, 동등물은 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부가 돌연변이된 서열로부터 변경되지 않는다는 전제로 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97, 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
바이러스, 예컨대, AAV는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 배큘로 바이러스 포장 시스템과 같은 바이러스 포장 시스템을 사용하여 포장될 수 있다. 일부 구체예에서, 포장은 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드 및 세포주를 사용함으로써 이루어진다. 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 유전자 물질의 세포 안으로의 전달을 용이하게 하는 요소 및 서열을 함유한다. 다른 측면으로, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 포장 세포주의 게놈에 안정적으로 통합되어서, 포장 세포주는 헬퍼 플라스미드로의 추가의 트랜스펙션을 필요로 하지 않는다.
헬퍼 플라스미드는 예를 들어, 복제 불능 AAV를 포장하기 위해 필요한, 그리고 복제 불능 AAV를 생성하지 않으면서 고역가로 복제 불능 AAV를 포장할 수 있는 비리온 단백질을 생성하기 위한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 암호화하는 복제 불능 바이러스 게놈으로부터 유래된 적어도 하나의 헬퍼 DNA 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 DNA 서열은 바이러스의 바이러스 5' LTR의 천연 인핸서및/또는 프로모터를 암호화하는 영역이 없고, 헬퍼 게놈을 포장하는 책임이 있는 psi 기능 서열 및 3' LTR이 둘 다 없지만, 외래 폴리아데닐화 부위, 예를 들어 SV40 폴리아데닐화 부위, 및 바이러스 생성이 필요한 세포 유형에서 효율적이도록 지시하는 외래 인핸서및/또는 프로모터를 암호화한다. 바이러스는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV)와 같은 백혈병 바이러스이다.
외래 인핸서 및 프로모터는 may be the 인간 사이토메갈로 바이러스 (HCMV) 즉시 초기 (IE) 인핸서 및 프로모터, 몰로니 쥐과 육종 바이러스 (MMSV)의 인핸서 및 프로모터 (U3 영역), 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 U3 영역, 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV)의 U3 영역, 또는 천연 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV) 프로모터에 연결된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 헬퍼 플라스미드는 플라스미드 기반 발현 벡터에 의해 암호화된 2개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 이루어질 수 있는데, 예를 들어 제1 헬퍼 서열은 자기지향성(ecotropic) MMLV 또는 GALV의 gag 및 pol 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하고 제2 헬퍼 서열은 env 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유한다. 숙주 범위를 결정하는 env 유전자는 이종향성(xenotropic), 양종향성(amphotropic), 자기지향성, 다중지향성(polytropic) (밍크 병소 형성) 또는 10A1 쥐과 백혈병 바이러스 env 단백질, 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) env 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 env (gp160) 단백질, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) G 단백질, 인간 T 세포 백혈병 (HTLV) 타입 I 및 II env 유전자 생성물을 암호화하는 유전자, 상기 언급된 env 유전자 중 하나 이상의 조합으로부터 유래된 키메라 엔벨로프 유전자 또는 상기 언급된 env 유전자의 세포질 및 경막 생성물을 암호화하는 키메라 엔벨로프 유전자 및 원하는 표적 세포 상에서 특정 표면 분자에 대해 지정된 단클론성 항체로부터 유래될 수 있다.
포장 과정에서, AAV 바이러스 단백질을 암호화하는 헬퍼 플라스미드 및 플라스미드는 고역가 재조합 레트로바이러스-함유 상층액을 생성하기 위하여 바이러스를 생성할 수 있는 포유류 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 세포 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.)의 제1 집단에 일시적으로 공동트랜스펙션된다. 발명의 또 다른 방법에서 이런 일시적으로 트랜스펙션된 제1 집단의 세포는 그런 후에 외래 유전자를 가진 표적 세포를 고효율로 형질도입하기 위해 포유류 표적 세포와 공동배양된다.
포장 시스템
발명은 또한 골격이 플라스미드, 바이러스로부터 유래되는 것인 상기 기술된 벡터; 포장 플라스미드; 및 엔벨로프 플라스미드를 포함하는 바이러스 포장 시스템을 제공한다. 포장 플라스미드는 뉴클레오시드, 캡시드 및 매트릭스 단백질을 함유한다. 포장 플라스미드의 예는 또한 특허 문헌, 예컨대, 미국 특허 제 7,262,049호; 6,995,258호; 7,252,991호 및 5,710,037호 (모두 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. 시스템은 또한 엔벨로프 플라스미드에 의해 제공된 슈도타입의 엔벨로프 단백질을 암호화하는 플라스미드를 함유한다. 슈도타입의 바이러스 벡터는 다른 엔벨로핑된 바이러스로부터 유래된 당단백질을 포함하는 또는 대안으로 기능성 부분을 함유하는 벡터 입자로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 제 7,262,049호 (본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 바람직한 측면으로, 엔벨로프 플라스미드는 바이러스 입자가 세포 또는 세포 집단에 비특이적으로 결합하게 하지 않도록 하는 엔벨로프 단백질을 암호화한다. 바이러스 입자의 특이성은 입자에 삽입된 항체 결합 도메인에 의해 부여된다. 적합한 엔벨로프 단백질의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 황색포도상구균 (Staph. aureus) ZZ 도메인을 함유하는 것을 들 수 있다. 엔벨로프에 사용하기 위한 당단백질의 선택은 부분적으로, 입자가 콘쥬게이션될 수 있는 항체에 의해 결정된다.
본 개시는 또한 적합한 포장 세포주를 제공한다. 한 측면으로, 포장 세포주는 HEK-293 세포주이다. 다른 적합한 세포주는 기술분야에 알려져 있는데, 예를 들어, 미국 특허 제 7,070,994호; 6,995,919호; 6,475,786호; 6,372,502호; 6,365,150호 및 5,591,624호 (각각 본원에 참조로 포함됨)에서의 특허 문헌에 기술되어 있다.
본 발명은 추가로 포장 세포주를 상기 기술된 바이러스 시스템으로, 포장에 적합한 조건 하에서 형질도입시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는, 슈도타입 AAV 입자의 제조 방법을 제공한다. 그러한 조건은 기술분야에 알려져 있고 본원에서 간단하게 기술된다. 슈도타입 바이러스 입자는 세포 상층액으로부터, 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 방법, 예컨대, 원심분리를 사용하여 분리될 수 있다. 그러한 분리된 입자는 본 발명에 의해 추가로 제공된다.
본 발명은 분리된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이 방법에 의해 제조된 AAV 바이러스 입자를 추가로 제공한다. 슈도타입 바이러스 입자는 본원에서 기술되고 GALT 단백질 또는 그것의 동등물 (예컨대 상기 기술된 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 4의 동등물)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
분리된 슈도타입 입자는 사전 선택된 세포 수용체에 결합하는 능력을 보유하는 항체 또는 항체 단편 (예컨대 적어도 Fc 도메인을 함유하는 단편) 중 하나 이상에 콘쥬게이션할 수 있다.
항체는 종 특이적이지 않다. 다시 말하면, 항체는 다중클론성이거나 단클론성이고 쥐과, 양, 인간 또는 다른 종일 수 있다. 더불어, 항체는 키메라이거나 인간화될 수 있다.
숙주 세포
또한 추가로 상기에 기술되고 본원에 참조로 포함되는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 입자, 벡터 및 포장 세스템을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 분리된 세포 또는 세포 집단이 제공된다. 한 측면으로, 분리된 세포는 포장 세포주이다.
또한 본원에서 기술된 GALT 단백질 또는 그것의 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 GALT를 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 분리된 세포 또는 세포 집단이 제공된다. 한 구체예에서, 프로모터는 본원에서 기술되는 유도성 프로모터이다. 다른 측면으로, 프로모터는 본원에서 기술되는 구성성 프로모터이다. 특정 측면으로, GALT를 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO: 1, 또는 그것의 동등물을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 서열은 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개 또는 그 이상, 또는 전부가 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일하다. 추가의 구체예에서, 분리된 세포는 추가로 테트라사이클린 활성자 단백질을 암호화하는 핵산; 및 테트라사이클린 활성자 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 테트라사이클린 활성자 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 구성성 프로모터이다. 관련된 구체예에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터 (PGK) 또는 CMV 프로모터이다.
특정 구체예에서, 분리된 세포 집단은 GALT 단백질, 또는 그것의 생물학적 동등물을 암호화하는 SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 관련된 구체예에서, GALT의 생물학적 동등물은 SEQ ID NO: 1의 보체에 엄격도가 높은 조건 하에서 혼성화하고 GALT 단백질 (예컨대, SEQ ID NO: 4)을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구체예에서, 그것의 생물학적 동등물은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 98% 서열 동일성을 가지는 핵산을 포함하고, 한 측면으로, 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개 또는 그 이상, 또는 전부는 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는다 (도 4 참조). 추가의 측면으로, GALT 단백질은 야생형 인간 GALT 단백질이다.
본원에 기술된 분리된 세포는 쥐과, 래트, 토끼, 유인원, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 말, 및 영장류, 특히 인간 세포로 이루어진 군의 종의 임의의 세포일 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에서 기술된 분리된 세포는 특정 수준의 GALT 단백질을 포함한다. GALT 단백질의 수준은 원하는 수준의 단백질을 생성하는 적절한 구성성 프로모터를 선택함으로써 또는 생성된 단백질의 양을 조절하는 유도성 시스템을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 이들 프로모터 및 유도성 시스템은 이전에 기술된 바 있다. 한 구체예에서, 분리된 세포는 적어도 약 1 x10-7 ng, 약 3 x10-7 ng, 약 5 x10-7 ng, 약 7 x10-7 ng, 약 9 x10-7 ng, 약 1 x10-6 ng, 약 2 x10-6 ng, 약 3 x10-6 ng, 약 4 x10-6 ng, 약 6 x10-6 ng, 약 7 x10-6 ng, 약 8 x10-6 ng, 약 9 x10-6 ng, 약 10 x10-6 ng, 약 12 x10-6 ng, 약 14 x10-6 ng, 약 16 x10-6 ng, 약 18 x10-6 ng, 약 20 x10-6 ng, 약 25 x10-6 ng, 약 30 x10-6 ng, 약 35 x10-6 ng, 약 40 x10-6 ng, 약 45 x10-6 ng, 약 50 x10-6 ng, 약 55 x10-6 ng, 약 60 x10-6 ng, 약 65 x10-6 ng, 약 70 x10-6 ng, 약 75 x10-6 ng, 약 80 x10-6 ng, 약 85 x10-6 ng, 약 90 x10-6 ng, 약 95 x10-6 ng, 약 10 x10-5 ng, 약 20 x10-5 ng, 약 30 x10-5 ng, 약 40 x10-5 ng, 약 50 x10-5 ng, 약 60 x10-5 ng, 약 70 x10-5 ng, 약 80 x10-5 ng, 또는 약 90 x10-5 ng의 GALT 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
치료 조성물 및 방법
본 개시는 갈락토스혈증을 치료하기 위한 치료 유전자 벡터 조성물 및 치료법을 제공한다. 갈락토스혈증은 GALT 유전자 (갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제)의 열성 단일 유전자 결함에 의해 유발되는 희귀 질환이다. ghr.nlm.nih.gov/gene/GALT 참조. 그것은 미국에서 45,000명의 신생아 중 대략 1명에게 영향을 미친다. 다행스럽게도, 그것은 전국 신생아 검진 프로그램으로 초기에 감지된다. 유일한 치료는 아동의 식단에서 모든 공급원의 락토스 및 갈락토스를 제거하는 것이다. 갈락토스 제한으로의 초기 치료는 중증 형태의 질환에서 유익하고 생명을 구하지만 보통 언어 및 인지 장애뿐만 아니라 다른 식품에 함유된 저수준의 갈락토스 및 내생적으로 생성된 갈락토스로부터의 신경근 대 신경근 및 난소 독성으로 인한 신체 손상과 같은 장기간 합병증이 존재한다.
벡터의 다양한 구체예가 본원에서 기술된다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 벡터 및 그 벡터를 사용하는 방법은 본 개시에 의해 제공되는 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 ("GALT")를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터를 투여하는 것을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 측면으로, 서열은 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개 또는 그 이상, 또는 전부가 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는다는 전제로 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 99% 동일하다(도 4 참조). 다른 측면으로, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 암호화한다. 한 측면으로, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터는 벡터의 생체분포를 측정하기 위하여 리포터 유전자 루시퍼라제 또는 GFP를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터는 인간 (예컨대, NCBI 참조 서열: NM_000155.3, 또는 NM_001258332.1), 마우스 (예컨대, NCBI 참조 서열: NM_001302511.1, 또는 NM_016658.3), 래트 (예컨대, NCBI 참조 서열: NM_001013089.2), 침팬지 (예컨대, NCBI 참조 서열: XM_003951414.4 또는 XM_001163419.6), 또는 다른 종으로부터의 GALT 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV 벡터는 인간 GALT 유전자의 코돈-최적화된 버전을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다 (SEQ ID NO. 1 및 도 4). AAV 벡터 중 하나는 pscAAV-CB-hGALT (SEQ ID NO. 2)로서 확인된다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 pAAV-CB-hGALT-WPREv2 (SEQ ID NO. 3)로서 확인된다. pscAAV-CB-hGALT 벡터는 인간 GALT 유전자 (갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제)의 코돈-최적화된 버전을 구동시키는 작은 SV40 인트론을 가진 구성성 CBA 프로모터를 포함한다 (SEQ ID NO. 1 및 도 4).
한 측면으로, AAV 벡터는 인간 GALT 단백질 (예컨대, SEQ ID NO. 4), 마우스 GALT 단백질 (예컨대, NCBI 참조 서열 NP_001289440.1), 래트 GALT 단백질 (예컨대, NCBI 참조 서열: NP_001013107.1), 침팬지 GALT 단백질 (예컨대, NCBI 참조 서열: XP_003951463.1), 또는 다른 종으로부터의 GALT 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, AAV 벡터는 인간 GALT 단백질 (예컨대, SEQ ID NO. 4)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 측면으로, AAV는 AAV9 혈청형이다. 대체 혈청형 또는 변형된 캡시드 바이러스는 뉴런 향성을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 대체 벡터는 표준 AAV9보다 높은 뉴런 향성을 위해 변형된 AAV9 혈청형 벡터, 예컨대 뉴런적으로 표적화된 벡터를 확인하기 위해 Cre-lox 재조합 시스템을 사용하는 PHP.B를 포함한다. 대안으로, AAV9 PHP.B는 간향성을 감소시키기 위한 아스파라긴으로부터 리신으로 변형된 VP1의 아미노산 498을 가지고 있다. 돌연변이된 여러 아미노산을 가지는 AAVrh74의 추가의 변이체가 뇌를 포함한 매우 광범위한 조직 향성에 대해 사용될 수 있다.
한 측면으로 AAV 벡터는 아미노산 치환 또는 1 내지 7개 아미노산의 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질 내에 함유된다. 본 출원인은 3개의 돌연변이를 생성하였다. 돌연변이 중 하나 (AAVmut4, VP1 캡시드의 아미노산 502에서 아스파라긴이 아이소류신으로 치환됨)는 최대 56배 (조직에 따라 3 내지 56배 증가) 더 높은 형질도입 효율로 모든 조직에 전반적으로 유전자 전달을 증가시킨다. 또 다른 돌연변이 (AAVmut5, VP1 캡시드의 아미노산 505에서 트립토판이 아르기닌으로 치환됨)는 AAVrh74보다 거의 50배 심장으로의 유전자 전달을 증가시킨다. 제3 돌연변이 (AAVYIG591)는 위성 세포 향성에도 불구하고 근육 줄기 세포로 여겨지는 위성 세포 상에서 주로 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 특히, AAVYIG591을 설계하기 위해 AAV 결정 구조 및 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 본 출원인의 지식을 토대로 하여 골격근에 대해 더 높은 친화성 및 간에 대해 더 낮은 친화성을 가지는 것으로 여겨진다.
이론에 얽매이지는 않겠지만, 본 출원인은 환자에 대한 치료적 이익이 환자에게 전체적인 용량을 증가시키지 않으면서 근육에 도달하는 유효량을 증가시킴으로써 이루어질 것으로 예상한다. 치료적 이익을 이루기 위해 필요한 전체적인 용량을 감소시킴으로써, 더 적은 바이러스 항원이 환자에게 전달되고, 이상적으로는 벡터에 대한 면역 반응의 감소와 증가된 안전성이 초래된다. 후기 단계 임상 시험을 수행하기 위해 충분한 유전자 요법 약물 제품을 제조하는 것은 추가의 개발에서 중요한 장애물이다. 치료적 이익을 이루기 위한 용량 요구조건을 감소시키는 것은 감소된 제조 요구조건, 감소된 제조 비용, 더 빠른 임상 시험 개발 및 더 많은 환자를 치료하는 더 큰 능력을 초래할 것이다.
따라서, 본 개시는 변형된 캡시드 단백질 내에 함유된 AAV 벡터, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 변형된 캡시드 단백질의 제조 방법, 재조합 바이러스 입자 및 변형된 바이러스 입자를 생성하기 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이다. 개시의 한 측면은 아미노산 치환 또는 1 내지 7개 아미노산의 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 선택적으로 AAV9, AAV PHP.B, 또는 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 아르기닌에 대한 트립토판의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 주로 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대해 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.
2개의 예시적인 벡터의 플라스미드 골격이 본원에서 개시된다. 제1 벡터는 루시페라제 및 증강된 황색 형광 단백질로 구성된 리포터 융합 단백질의 CBA 프로모터/인핸서-구동 발현을 함유한다. 한 측면으로, 루시페라제 및 증강된 황색 형광 단백질 서열이 결실된다. 이 벡터는 표준 AAV9 혈청형 캡시드 또는 돌연변이 캡시드의 내부에서 단일 표준 바이러스로서 포장될 수 있다. 다른 측면으로, AAV는 코돈 최적화된 인간 GALT 유전자 (SEQ ID NO 1) 또는 그것의 동등물이 CBA 프로모터/인핸서 구동 발현되는 자체 상보성 벡터를 함유한다. 이 벡터는 표준 AAV9 혈청형 캡시드에서 포장될 수 있다. 이 벡터는 고수준의 인간 GALT 단백질을 제공할 수 있다. luc-EYFP 리포터 바이러스는 Xenogen IVIS (또는 유사한 것)를 사용하여 다양한 시점에서 생체내에서 루시페라제 염색에 의해 또는 다양한 시점에서 조직을 수득하고 EYEP 또는 루시페라제 활성 중 어느 하나의 유전자 발현에 대해 검정함으로써 생체분포 및 유전자 발현에 대해 평가될 수 있다. 샘플이 추가적으로 얻어지고 qPCR에 의해 벡터 게놈 정량화가 평가될 수 있다. 투여는 신생아 감염 동물 (출산 후 1 또는 2일 후)에게 시작될 수 있다. 동물 모델에서, 마우스 새끼는 안면 정맥을 통해 주사될 수 있고 (jove.com/video/52037/신생 마우스에서 정맥내 주사 참조) 4주 후에 GFP 발현에 의해 벡터의 생체분포를 알아본다. 보통 식단을 공급받은 모로부터 태어난 동형접합성 GALT 결핍 마우스는 녹아웃 (KO) 마우스 모델에서 벡터 향성 및 생체분포의 양호한 지표를 제공할 수 있다.
본 개시는 또한 담체 및 변형된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 또는 발현 시스템 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가로 변형된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 또는 발현 시스템 중 하나 이상과 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 조성물은 특정 투여 방식에 대해 제제화될 수 있다.
투여
본 개시의 재조합 폴리뉴클레오타이드, 벡터 (예컨대, AAV), 바이러스 입자 또는 조성물의 투여는 한 용량으로, 치료 과정에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 투여는 한정하는 것은 아니지만, 국지화, 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수강내, 심실하, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 망막하, 유리체내, 관절내, 안구내, 복강내, 자궁내, 피내, 피하, 경피, 경점막, 및 흡입을 포함한, 임의의 적합한 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다. 한 구체예에서, 재조합 벡터 또는 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 다른 구체예에서, 재조합 AAV 벡터 또는 조성물은 전신적으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 재조합 AAV 벡터 또는 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로 투여된다. 한 측면으로, AAV 벡터 또는 GALT 폴리뉴클레오타이드는 간에 국소적으로 전달된다.
가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 기술분야의 숙련된 지식을 가진 사람들에게 알려져 있고 치료법에 사용된 조성물, 치료법의 목적 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여가 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 투여량은 투여 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 적합한 투여량 제제 및 작용제의 투여 방법은 기술분야에 알려져 있다. 그러한 적합한 투여량의 비제한적인 예는 투여당 낮게는 1E+9 벡터 게놈 내지 많게는 1E+17 벡터 게놈까지일 수 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 구체예에서, 대상체에게 투여된 바이러스 입자 (예컨대, AAV)의 수는 약 109 내지 약 1017.의 범위이다. 특정 구체예에서, 약 1010 내지 약 1012, 약 1011 내지 약 1013, 약 1011 내지 약 1012, 약 1011 내지 약 1014, 약 5x1011 내지 약 5x1012, 또는 약 1012 내지 약 1013 바이러스 입자가 대상체에게 투여된다.
추가의 측면으로, 개시의 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 입자 및 조성물은 다른 치료, 예컨대, 갈락토스혈증 및 그것과 관련된 장애 또는 상태에 적합한 것으로 승인된 치료와 함께 투여될 수 있다. 비제한적인 예로는 대상체의 식단으로부터 락토스 및/또는 갈락토스를 감소하거나 제거하면서 본 개시의 바이러스 벡터 또는 조성물을 사용한 갈락토스혈증의 치료를 들 수 있다.
성공적인 치료 및/또는 회복은 다음 중 하나 이상의 감지될 때 측정된다: 치료된 대상체의 질환, 장애, 또는 상태의 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 대상체의 질환, 장애, 또는 상태의 정도의 감소, 질환, 장애, 또는 상태의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환, 장애, 또는 상태의 진행의 지체 또는 둔화, 및 질환, 장애, 또는 상태의 개선 또는 완화. 일부 구체예에서, 치료의 성공은 대상체로부터 분리된 하나 이상의 세포, 조직, 또는 장기에서 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출함으로써 측정된다. 일부 구체예에서, 치료의 성공은 대상체로부터 분리된 하나 이상의 세포, 조직, 또는 장기에서 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 존재를 검출함으로써 측정된다.
한 구체예에서, 재조합 폴리뉴클레오타이드 및/또는 바이러스 벡터는 대상체에서 GALT 유전자를 복구할 수 있다. 일부 구체예에서, 성공적으로 치료된 세포, 조직, 장기 또는 대상체에서 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 대 복구되지 않은 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 비율은 약 1.5:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 약 1000:1, 약 10,000:1, 약 100,000:1, 또는 약 1,000,000: 1이다. 복구된 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 양 또는 비율은 한정하는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, PCR, 서열분석, 질량 분석, 유동 세포분석, 면역조직화학, 면역형광, 형광 제자리 혼성화, 차세대 서열분석, 면역블롯, 및 ELISA를 포함한, 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
키트
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드, 작용제, 벡터, 또는 조성물은, 일부 구체예에서, 치료적, 진단적 또는 연구 용도에서의 그것들의 사용을 용이하게 하기 위하여 제약학적 또는 진단적 또는 연구 키트에 조립될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 키트는 본원에 기술된 변형된 바이러스 캡시드 단백질, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 재조합 바이러스 입자, 재조합 발현 시스템, 변형된 AAV, 변형된 세포, 분리된 조직, 조성물, 또는 제약학적 조성물 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 추가로 사용 설명서를 포함한다. 구체적으로, 그러한 키트는 본원에서 기술된 하나 이상의 작용제를, 이들 작용제의 의도된 적용 및 적절한 용도를 기술하는 설명서와 함께 포함할 수 있다. 예로서, 한 구체예에서, 키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 혼합하고 및/또는 샘플을 분리 및 혼합하고 대상체에게 적용하는 단계에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 키트의 작용제는 작용제의 특정 용도 및 작용제의 투여 방법에 적합한 제약학적 제제에 들어 있다. 연구 목적을 위한 키트는 다양한 실험을 작동시키기 위한 적절한 농도 또는 양으로 구성요소를 함유할 수 있다.
키트는 본원에 기술된 방법의 사용을 용이하게 하기 위해 설계될 수 있고 많은 형태를 취할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는, 필요에 따라, 액체 형태로 (예컨대, 용액으로) 또는 고체 형태로 (예컨대, 건조한 분말로) 제공될 수 있다. 특정 경우에, 조성물의 일부는 구성적이거나 또는 그렇지 않으면, 예를 들어 키트와 함께 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예를 들어, 물 또는 세포 배양 배지)의 첨가에 의해 (예컨대, 활성 형태로) 가공 가능하다. 일부 구체예에서, 조성물은 보존 용액 (예컨대, 한랭보존 용액)으로 제공될 수 있다. 보존 용액의 비제한적인 예로는 DMSO, 파라포름알데하이드, 및 CryoStor® (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 보존 용액은 메탈로프로테아제 억제제의 양을 함유한다.
본원에서 사용되는 바, "설명서"는 설명서 및/또는 홍보의 구성요소를 정의할 수 있고, 전형적으로 청구된 방법, 재조합 벡터, 또는 조성물의 포장에 대한 또는 그것과 관련된 서면 설명서를 포함한다. 설명서는 또한 사용자가 설명서가 키트와 관련된 것임을 분명하게 인식하도록 하는 임의의 방식으로 제공된 임의의 구두 또는 전자 설명서, 예를 들어 시청각 (예컨대, 비디오테이프, DVD, 등), 인터넷, 및/또는 웹-기반 커뮤니케이션, 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 서면 설명서는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태이고, 그 설명서는 또한 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본원에서 기술된 임의의 하나 이상의 구성요소를 함유한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 키트는 본원에 기술된 작용제를 하우징하는 용기를 포함할 수 있다. 작용제는 액체, 겔 또는 고체 (분말)의 형태로 있을 수 있다. 작용제는 멸균 제조되고, 주사기에 포장되며 냉장 수송될 수 있다. 대안으로, 그것은 바이알 또는 다른 보관용 용기에 하우징될 수 있다. 제2 용기가 멸균 제조된 다른 작용제를 가질 수 있다. 대안으로, 키트는 주사기, 바이알, 튜브, 또는 다른 용기에 사전혼합되고 수송되는 활성제를 포함할 수 있다. 키트는 대상체에 작용제를 투여하기 위해 필요한 구성요소, 예컨대 주사기, 국소 적용 장치, 또는 IV 바늘 튜빙 및 백 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다.
본원에서 기술된 치료법은 치료법에 대한 환자를 확인하고 선택하기 위한 적절한 진단 기법과 조합될 수 있다. 예를 들어, GALT 유전자의 돌연변이를 확인하기 위한 유전자 테스트가 제공될 수 있다. 그로써, 돌연변이를 포함한 환자는 치료법에 적합한 것으로 확인될 수 있다.
실시예
시험관내 투여
바이러스 입자를 벡터 게놈, AAV rep 및 cap 유전자에 대한 플라스미드 및 AAV를 생성하기 위해 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드를 사용하여 표준 삼중 트랜스펙션 방법에 의해 제조한다. 이들 3개의 플라스미드를 PEI를 사용하여 혈청-유리 현탁액 성장한 HEK293 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 4일 후에 바이러스를 표준 방법에 의해 수득하고 정제한다. 효과적인 용량 범위는 정맥내로 제공되는 경우 유사한 질환 모델 및 혈청형을 토대로 1012 내지 1014 Vg/kg이다. AAVmut4는 CNS 및 근육을 포함한 많은 다른 표적 조직에 대한 더 넓은 향성을 바이러스에 제공하는, 간 특이적 결합에 관여하는 영역에 대한 변형을 포함한다.
플라스미드 pAAV-CB-GALT-WPRE-kan (도 1)을 일시적 트랜스펙션에 의해 HEK292 세포에 트랜스펙션하고 2일 후에 세포를 용해시키고 수득한 단백질을 아크릴아미드 겔 상에서 작동시키고, 나일론 막에 옮겨서 항-인간 GALT 항체 및 이어서 검출을 위한 IR 염료 표지된 이차 항체로 프로빙하였다. 도 3에서 나타낸 것과 같이, 레인 1은 Y 축에 크기가 표시된 분자량 마커이다. 레인 2는 1 μl의 GALT 트랜스펙션된 세포 용해물이고, 레인 3은 0.1 μl의 GALT 트랜스펙션된 세포 용해물이며, 레인 4는 5 μl의 트랜스펙션 및 세포 대조군으로서 사용된, 또한 내생적으로 발현된 소량의 천연 인간 GALT 단백질을 나타내는 lucEYFP 리포터 플라스미드로 트래스펙션된 HEK293 세포의 용해물이고, 레인 6은 천연 인간 GALT 단백질을 나타내는 HepG2 세포 용해물이며, 레인 7은 비어 있고, 레인 8-10은 정제를 위해 사용된 태그로 인해 약간 더 높은 이동성을 보이는 박테리아에서 발현된 증가하는 농도의 GALT 단백질 표준이다.
생체내 투여
본원에서 개시된 GALT 유전자 요법 접근법은 첫째, 고전적인 갈락토스혈증과 관련된 장기간 합병증을 치료하기 위해 승인된 AAV-매개 유전자-기반 치료법 또는 임의의 유전자-기반 치료법이 없기 때문에 매우 획기적인 것이다. 둘째, 기술적인 것 외에, 개시된 치료법은 거리가 먼 장기에서 비정상적인 갈락토스 대사를 정상화하기 위하여 간으로의 국지화된 유전자 전달을 사용할 수 있다.
새로운 GALT 유전자-트랩 (GalT-결핍) 마우스 모델을 Tang, M. et al. Eur. J. Hum. Genet, (2014):1172-1179에서 기술한 것과 같이 사용하였다. LC-MS/MS 과정 (Li, Y. et al., Mol. Genet. Metab. (2011) 102(1):33-40)을 사용하여, GALT 활성의 총 부재를 동형접합성 GalT 유전자-트랩 마우스에서 확인하였다. 동형접합성 GalT 유전자-트랩 마우스의 추가의 특성확인으로 신생아 GalT-결핍 새끼에서 갈락토스 민감성, 성체 암컷에서 감소된 생식력, 손상된 운동 기능 및 두 성별 모두의 GalT-결핍 마우스에서 성장 제한이 나타났다 (Tang, et al. (2014), supra; Balakrishnan, B. et al. (2016) 470(1):205-212; Chen et al. (2017) J. Inherit. Metab. Dis. 40(1):131-137).
도 6에서 나타난 것과 같이, HEK293 세포주로의 AAV9-GALT 벡터의 형질도입 (도 1 및 2 참조)은 풍부한 GALT 단백질의 생성으로 이어졌다. GALT 단백질 발현은 필요에 따라 생리적 수준에 가깝게 GALT 단백질을 생성하게 될 프로모터로 강력한 CBA 프로모터/인핸서를 치환함으로써 변형될 수 있다.
생체분포: AAV9 벡터는 중추신경계 (CNS)를 포함하는 넓은 생체분포를 가지는 한편, AAV8은 마우스에서 주로 간을 표적으로 하는 것이 확립되었다. 그러므로, GALT 및 코돈 최적화된 GALT의 투여는 AAV8 벡터로 이루어질 수 있다. 생후 4주령의 야생형 및 GalT-결핍 마우스의 혈관구조를 통한 벡터의 전달은 두 그룹 사이의 생체분포의 임의의 차이를 평가할 수 있다. 초기 물질로서, lucEYFP 리포터 구성물을 발현하는 1 E+12 Vg의 각각의 AAV 벡터를 꼬리 정맥을 통해 수컷 및 암컷 마우스에 전달한다 (N=그룹당 성별당 5마리, N은 "산업용 가이드라인: 유전자 요법 임상 시험 - 지연된 부작용에 대한 대상체 관찰"이라는 제목의 문서에서 계획한 것과 같은 독성/생체분포 연구를 위한 FDA 가이드라인을 토대로 함). 마우스를 희생시키기 전 4주 동안 매주 영상을 촬영한다. 대조군은 GALT 유전자가 삽입되지 않는 벡터가 주입된 주령- 및 성별-매칭된 동물이다. 4주 후, 동물을 희생시키고 고정제로 관류한 후, 뇌, 심장, 신장, 간, 눈 및 생식선을 분리한다. 조직을 섹션화하여 현미경에 의한 EYFP를 위해 염색하는 한편, 각 조직의 일부분을 마이크로그램의 게놈 DNA당 벡터 게놈의 qPCR 측정에 사용할 것이다. 또 다른 제어된 투여에서, 마우스를 그것들의 식단에 10% 및 20% 갈락토스로 도전시킨다.
투약 연구: 별도로, 생후 4주령의 수컷 및 암컷 GalT-결핍 마우스를, 그룹당 12마리 마우스 (N=그룹당 성별당 6마리)에, 마우스당 각각 1E+10, 1E+11 또는 1E+12 vg의 AAV9-GALT (또는 AAV8-GALT) 벡터의 3가지 상이한 용량 중 하나로 IV 주사하고, 또한 선택된 혈청형의 대조군 그룹에 빈 벡터를 주입한다. 동물을 최대 6개월 동안 모니터링하고 운동 조정 및 생식 능력의 잠재적 개선에 대해 조사한다. 동물을 또한 치료의 어떠한 명백한 생리적 부작용, 예컨대 중량 손실 또는 비활성에 대해 모니터링하고 검정한다.
행동 분석: 신경학적 장애에 대한 치료의 기능성 영향을 정량화하기 위하여, 마우스 (n=그룹당 12마리)를 생후 6개월째에 행동 수행에 대해 테스트한다. 행동 테스트는 모리스 물 미로에서의 인지 및 수영 능력, 및 로타로드 상에서의 운동 기능을 포함한다. 마우스의 운동실조-관련 운동 장애를 측정하기 위하여, 동물이 지탱하기 위해 자신의 신체를 수동적으로 사용하는 대신, 동물이 사지를 번갈아가면서 막대와 함께 걷도록 고무시키기 위해 변형된 로타로드를 사용할 것이다. 훈련 목적으로 속도를 2분에 걸쳐 점차로 6 RPM으로 증가시킨다. 2분 동안 휴식한 후, 마우스를 6 RPM에서 최대 2분 (만약 동물이 테스트에 실패하면 더 짧은 시간) 동안 테스트한다. 시험은 야생형 (WT) 정상 마우스와 비교하여 증가된 도전의 경우 각 마우스에 대해 12 RPM에서 반복할 수 있다. 각 마우스를 5분간의 휴식기 후에 각 속도에서 3회 테스트한다. 6분이 끝났을 때, 모든 마우스를 안락사시키고 병리학에 대한 위원회 인증 병리학자에 의해 H&E 조직학과 함께 뇌의 다양한 영역 및 다른 조직에서 웨스턴에 의해 GALT 유전자 발현 및 qPCR에 의해 벡터 게놈 함량을 평가한다.
암컷 마우스에서 생식력 평가: 암컷 마우스의 생식 능력을 규칙적인 시간 간격으로 그것들의 발정 주기를 모니터링하고 6개월이 끝났을 때 난포수 계수를 수행함으로써 평가한다. 발정 주기 및 난포 수에 대한 정상화의 어떠한 신호라도 단독으로 이들 동물에서 개선된 생식력에 대한 충분히 양호한 지표이다.
동등물
발명이 상기 구체예들과 관련하여 기술되었지만, 전술한 설명 및 실시예는 예시하기 위해 의도된 것이고 발명의 범주를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 발명의 범주 내에서 다른 측면, 장점 및 변형이 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 사람들에게 분명해질 것이다.
더불어, 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 기술분야에 숙련된 사람들은 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서도 기술되는 것을 인식할 것이다.
본원에서 언급된 모든 기술적 및 특허 출판물은 참조로 포함된다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
SEQ ID NO 1
코돈-최적화된 GALT 서열
Figure pct00003
SEQ ID NO 2 - pAAV-CB-hGALT
돌연변이된 ITR: 뉴클레오타이드 (NT): 1-106
CMV 인핸서: NT: 153-432
닭 베타-액틴 프로모터: NT 439-708
변형된 SV40 인트론: 774-833
인간 GALT: 1004-2143
소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호: NT 2186-2332
ITR: NT: 2412-2552
암피실린 내성 유전자: NT 3455-4315
플라스미드 복제 기원 (ori): NT: 4470-5089
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQ ID NO 3: pAAV-CB-hGALT-WPREv2-KAN
돌연변이된 ITR: 뉴클레오타이드 (NT): 1-145
CMV 인핸서: NT: 190-551
닭 베타-액틴 프로모터: NT 552-834
키메라 인트론: 929-1103
인간 GALT: 1160-2299
우드척 간염 바이러스 Pos 반응 요소 (WPRE): NT 2334-2927
폴리 A 신호 (BGHpA): NT 2942-3176
ITR: NT: 3449-3592
KAN 유전자: NT 5145-5960
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQ ID NO 4:
Figure pct00011
SEQ ID NO 5:
Rh74 VP1 아미노산 서열
Figure pct00012
SEQ ID NO: 6
Rh74 VP1 DNA
Figure pct00013
Figure pct00014
SEQ ID NO: 7 - KAN 유전자 번역 생성물
Figure pct00015
AAV rh74 공통 서열 정렬
AAVrh74
AAVrh74-N502I-캡시드
Rh74 YIG591 cap 단백질
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL <120> GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF GALACTOSEMIA <130> 106887-7751 <140> PCT/US2019/049157 <141> 2019-08-30 <150> 62/725,225 <151> 2018-08-30 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atgagcagaa gcggcaccga ccctcagcag agacagcagg cctctgaagc cgatgccgcc 60 gctgccacct tcagagccaa tgaccaccag cacatccggt acaaccccct gcaggacgag 120 tgggtgctgg tgtccgccca cagaatgaag aggccttggc agggccaggt ggaaccccag 180 ctgctgaaaa ccgtgcccag acacgacccc ctgaaccctc tgtgtcctgg cgccattaga 240 gccaacggcg aagtgaaccc ccagtacgac agcaccttcc tgttcgacaa cgacttcccc 300 gccctgcagc ctgatgcccc atctcctgga cctagcgacc accctctgtt ccaggccaag 360 tctgccagag gcgtgtgcaa agtgatgtgc ttccaccctt ggagcgacgt gaccctgccc 420 ctgatgagcg tgccagagat cagagccgtg gtggatgcct gggccagcgt gacagaagaa 480 ctgggagccc agtacccctg ggtgcagatc ttcgagaaca 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Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Ile Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 580 585 590 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 12 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Tyr Ile 580 585 590 Gly Ser Arg Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 13 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgtcgcgca gtggaaccga tcctcagcaa cgccagcagg cgtcagaggc ggacgccgca 60 gcagcaacct tccgggcaaa cgaccatcag catatccgct acaacccgct gcaggatgag 120 tgggtgctgg tgtcagctca ccgcatgaag cggccctggc agggtcaagt ggagccccag 180 cttctgaaga cagtgccccg ccatgaccct ctcaaccctc tgtgtcctgg ggccatccga 240 gccaacggag aggtgaatcc ccagtacgat agcaccttcc tgtttgacaa cgacttccca 300 gctctgcagc ctgatgcccc cagtccagga cccagtgatc atcccctttt ccaagcaaag 360 tctgctcgag gagtctgtaa ggtcatgtgc ttccacccct ggtcggatgt aacgctgcca 420 ctcatgtcgg tccctgagat ccgggctgtt gttgatgcat gggcctcagt cacagaggag 480 ctgggtgccc agtacccttg ggtgcagatc tttgaaaaca aaggtgccat gatgggctgt 540 tctaaccccc acccccactg ccaggtatgg gccagcagtt tcctgccaga tattgcccag 600 cgtgaggagc gatctcagca ggcctataag agtcagcatg gagagcccct gctaatggag 660 tacagccgcc aggagctact caggaaggaa cgtctggtcc taaccagtga gcactggtta 720 gtactggtcc ccttctgggc aacatggccc taccagacac tgctgctgcc ccgtcggcat 780 gtgcggcggc tacctgagct gacccctgct gagcgtgatg atctagcctc catcatgaag 840 aagctcttga ccaagtatga caacctcttt gagacgtcct ttccctactc catgggctgg 900 catggggctc ccacaggatc agaggctggg gccaactgga accattggca gctgcacgct 960 cattactacc ctccgctcct gcgctctgcc actgtccgga aattcatggt tggctacgaa 1020 atgcttgctc aggctcagag ggacctcacc cctgagcagg ctgcagagag actaagggca 1080 cttcctgagg ttcattacca cctggggcag aaggacaggg agacagcaac catcgcctga 1140

Claims (52)

  1. SEQ ID NO: 1-3 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 동일한 서열, 또는 그것의 각각의 동등물을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 선택적으로 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 그것의 상응하는 야생형 서열로부터 변형되지 않는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. SEQ ID NO: 4의 아미노산 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산, 또는 그것의 동등물을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오타이드의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오타이드, 또는 그것의 동등물을 포함하며, 선택적으로 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항, 또는 제5항 또는 제6항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터.
  8. 제5항에 있어서, 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질 또는 돌연변이된 캡시드 단백질인 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  12. 갈락토스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제 ("GALT")를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  13. 제12항에 있어서, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 선택적으로 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 SEQ ID NO: 1로부터 변형되지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  14. 제12항에 있어서, GALT를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74의 것임을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 AAV9, rh74, 돌연변이된 rh74, 또는 AAV PHP.B의 것임을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 프로모터, 조직 특이적 제어 요소, 또는 구성성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 구성성 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서가 있음), 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, 또는 EF1 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  19. 제18항에 있어서, β-액틴 프로모터는 닭 β-액틴 ("CBA") 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  20. 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 선택적으로 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 SEQ ID NO: 2로부터 변형되지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  21. 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  22. 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 선택적으로 야생형 서열로부터 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나 이상은 SEQ ID NO: 3으로부터 변형되지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  23. 제12항에 있어서, SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  24. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, GALT 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  25. 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
  26. 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 및 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자.
  27. 제26항에 있어서, 캡시드 단백질은 적어도 하나의 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자.
  28. 제26항에 있어서, 캡시드 단백질은 적어도 하나의 자연적으로 발생하지 않는 또는 돌연변이된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자.
  29. 제26항에 있어서, 캡시드 단백질은 적어도 하나의 야생형 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 돌연변이된 캡시드 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자.
  30. 제26항에 있어서, 캡시드 단백질은 아미노산 위치 502에서의 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 505에서의 아르기닌에 대한 트립토판의 선택적 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서의 펩타이드 YIG의 삽입의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 입자.
  31. 아미노산 위치 502에서의 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환, AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 505에서의 아르기닌에 대한 트립토판의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서의 펩타이드 YIG의 삽입의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형, 또는 그것의 동등물을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 하나 이상의 변형이 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질의 아미노산에 동일하다는 전제로 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오타이드.
  32. 아미노산 위치 502에서의 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환, AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 505에서의 아르기닌에 대한 트립토판의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서의 펩타이드 YIG의 삽입의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형, 또는 그것의 동등물을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질, 또는 하나 이상의 변형dl 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질의 아미노산에 동일하다는 전제로 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제31항의 폴리뉴클레오타이드의 보체.
  34. 제1항 내지 제14항, 제31항 또는 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제32항의 캡시드 단백질, 및/또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자 및 담체, 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  35. 기능성 GALT 효소를 세포에 도입시키는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제13항, 제31항 또는 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제32항의 캡시드 단백질, 제14항의 조성물, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 접촉단계는 생체외에서 또는 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 그것을 필요로 하는 대상체에서 갈락토스혈증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 또는 제14항의 조성물, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 갈락토스혈증을 앓고 있는 대상체에서 갈락토스 대사를 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 또는 제14항의 조성물, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 갈락토스혈증을 앓고 있는 대상체에서 질환 상태를 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제14항의 조성물, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하고, 질환 상태는 황달, 간 비장 비대증, 간세포 기능부전, 저혈당증, 신세뇨관 기능장애, 근력 저하, 패혈증, 백내장, 운동 실조, 떨림, 감소된 골밀도, 또는 원발성 난소 기능부전으로부터 선택되는 것인, 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 갈락토스혈증은 제1형 갈락토스혈증인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체는 인간 신생아인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 인간 신생아는 기능성 GALT 유전자의 발현 결핍에 대한 유전자 테스트에 의해 투여를 위해 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,투여는 근육내 주사, 간으로의 국소 전달, 또는 정맥내 주사에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 전신적 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,투여는 간으로의 국소 전달을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항 내지 제13항, 제31항 또는 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제32항의 캡시드, 제14항의 조성물, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 입자 중 하나 이상, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  49. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  51. 제50항에 있어서, 세포는 포장 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  52. 제1항 내지 제13항, 제31항 또는 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 및 헬퍼 세포주를 포함하는 AAV 포장 시스템.
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