BR112021003174A2

BR112021003174A2 - terapia gênica para o tratamento de galactosemia

Info

Publication number: BR112021003174A2
Application number: BR112021003174-0A
Authority: BR
Inventors: Scott Allen LOILER
Original assignee: Research Institute At Nationwide Children's Hospital
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CN112867798A; EP3844294A1; MX2021002041A; US20210299275A1; EP3844294A4; JP2021534766A; WO2020047472A1; KR20210052469A; CA3110290A1; SG11202101819QA; AU2019328573A1

Abstract

terapia gênica para o tratamento de galactosemia são proporcionados aqui vetores de aav recombinantes que codificam a proteína galt. nesta divulgação também são fornecidos composições e métodos para o tratamento de galactosemia.

Description

“TERAPIA GÊNICA PARA O TRATAMENTO DE GALACTOSEMIA” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) ao U.S. Provisório No. de Série 62/725.225, 30 de agosto de 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência.

ANTECEDENTE

[0002] A presente divulgação se refere de forma geral ao campo da terapia gênica e em particular, para o tratamento de Galactosemia.

[0003] Atualmente não há opções de tratamento para pacientes com Galactosemia sem ser a restrição dietética de alimento contendo galactose. Mesmo com aderência total a uma dieta livre sem galactose, muitos pacientes sofrem de déficits mentais e físicos em longo prazo devido às pequenas quantidades de galactose encontradas nos alimentos e à galactose produzida. Assim, existe uma necessidade na técnica de um tratamento eficiente. Esta divulgação satisfaz esta necessidade e fornece também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO

[0004] A terapia gênica divulgada fornece uma opção de tratamento de longo prazo prolongado para pacientes com Galactosemia através do fornecimento de forma eficiente do gene GALT para suas células, incluindo o cérebro, para fornecer uma expressão prolongada da proteína GALT funcional e alívio dos sintomas da doença.

[0005] Para atingir esta terapia, é fornecido aqui um polinucleotídeo ou um vetor viral adeno-associado (“AAV”) recombinante que compreende ou consiste alternativamente essencialmente ou que ainda consiste adicionalmente de uma sequência polinucleotídica que codifica galactose-1-fosfato uridil transferase (“GALT”). Em um aspecto, a sequência polinucleotídica que codifica a GALT compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, a sequência é pelo menos 85 % idêntica à SEQ ID NO: 1 com a condição de que pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 1 (ver a FIG. 4). Em outro aspecto, a sequência polinucleotídica que codifica GALT compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a sequência polinucleotídica codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 ou um equivalente da mesma.

[0006] Em um aspecto, o vetor é um vetor autocomplementar ou um vetor de DNA de filamento simples (ssDNA).

[0007] Em um aspecto, o viral adeno-associado recombinante (“AAV”) compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um AAV, tal como um scAAV ou um ssAAV flanqueado por duas Repetições Terminais Invertidas (ITRs). Estas ITRs formam grampo de cabelo na extremidade da sequência servindo como iniciadores para iniciar a síntese do segundo filamento antes que etapas subsequentes de infecção possam começar. A síntese do segundo filamento é considerada como sendo um de vários bloqueios para infecção eficiente. Vantagens adicionais de scAAV incluem expressão aumentada e prolongada do transgene in vitro e in vivo. Assim, em um aspecto, o AAV compreende ainda duas ITRs.

[0008] Exemplos não limitantes de estruturas de AAV recombinantes para criar o vetor incluem sorotipos de vetor de AAV do grupo de AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B ou AAV rh74. Em um aspecto adicional, a estrutura do vetor é um sorotipo de AAV9, um sorotipo de rh74 ou um sorotipo de AAVrh74 modificado. Também é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína VP1 do capsídeo do AAVrh74 modificada que compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo de uma substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502 e uma substituição opcional de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74 ou um equivalente da mesma ou um polinucleotídeo que é pelo menos 85% idêntico com a condição de que uma ou mais ou duas ou mais ou três ou mais ou quatro ou mais modificações sejam idênticas aos aminoácidos na proteína do capsídeo VP1 do AAVrh74 modificada e os complementos destes polinucleotídeos. Também é fornecida a proteína VP1 do capsídeo do AAVrh74 modificada que compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo de uma substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502 e uma substituição opcional de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74 ou um equivalente da mesma ou um polinucleotídeo que é pelo menos 85% idêntico com a condição de que uma ou mais ou duas ou mais ou três ou mais ou quatro ou modificações sejam idênticas aos aminoácidos na proteína do capsídeo VP1 do AAVrh74 modificada.

[0009] A sequência polinucleotídica que codifica GALT está opcionalmente ligada de forma operacional a um promotor, um elemento de controle específico para o tecido ou um promotor constitutivo. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem, por exemplo, um promotor de LTR do vírus de sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de dihidrofolato redutase, um promotor da β-actina, um promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) ou um promotor do EF1. Em um aspecto particular, o promotor da β-actina é um promotor da β-actina de frango (“CBA”). Em outra modalidade, o promotor é selecionado de um promotor de CMV, um promotor de EF1a, um promotor de SV40, um promotor de

PGK1 (humano ou de camundongo), um promotor de P5, um promotor de Ubc, um promotor da beta actina humana, um promotor de CAG, um promotor de TRE, um promotor de UAS, um promotor de Ac5, um promotor da polihedrina, um promotor de CaMKIIa, um promotor de Gal1, um TEF1, um promotor de GDS, um promotor de ADH1, um promotor de CaMV35S, um promotor de Ubi, um promotor de H1, um promotor de U6 ou um promotor da Alfa-1-antitripsina.

[0010] Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo ou o AAV recombinante compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um elemento intensificador. Exemplos não limitantes incluem um intensificador de CMV, um WPRE e um intensificador de RSV.

[0011] Em um aspecto particular, o polinucleotídeo ou o vetor de AAV recombinante compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, a sequência é pelo menos 85 % idêntica à SEQ ID NO: 2 ou 3 com a condição de que pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência de GALT do tipo selvagem (ver a FIG. 4) não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 2 ou 3. Em um aspecto adicional, o vetor de AAV recombinante, compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0012] O polinucleotídeo ou o vetor de AAV recombinante que é descrito aqui pode compreender ainda um marcador detectável ou para purificação. Os polinucleotídeos ou os vetores podem estar contidos na forma de composições que compreendem os polinucleotídeos ou os vetores e um carreador, tal como um conservante ou um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0013] Também é fornecida uma célula ou uma partícula viral que compreende os polinucleotídeos e/ou os vetores de AAV que são descritos aqui. As células também podem ser procarióticas ou eucarióticas e podem incluir linhagens de células de empacotamento. As células e as partículas virais podem estar contidas na forma de composições que compreendem os vetores e um carreador, tal como um conservante ou um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0014] Os polinucleotídeos e os vetores são úteis nos métodos terapêuticos ou outros e são contidos dentro das proteínas do capsídeo do tipo selvagem ou modificadas. Assim, são fornecidas aqui partículas virais de AAV que compreendem um polinucleotídeo e/ou um vetor de AAV recombinante que é divulgado aqui, bem como composições que contêm o polinucleotídeo e/ou partículas virais para uso nos métodos que são divulgados aqui. Também são fornecidos métodos para preparação de vetores, polinucleotídeos e partículas virais contendo os mesmos. Em um aspecto, é fornecido um método para introdução de uma enzima GALT funcional em uma célula, que compreende o contato da célula com um polinucleotídeo e/ou um vetor de AAV recombinante ou um capsídeo ou uma partícula viral contendo a mesma ou uma composição que é descrita aqui. O contato pode ocorrer ex vivo ou in vivo.

[0015] Também é fornecido um método de tratamento de galactosemia em um indivíduo que necessita do mesmo, que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente do polinucleotídeo e/ou do vetor de AAV recombinante, a partícula viral compreendendo o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV recombinante ou uma composição que é descrita aqui.

[0016] Também é fornecido um método de aumento do metabolismo da galactose em um indivíduo que pode, em um aspecto, estar sofrendo de galactosemia o método compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente da administração ao indivíduo do polinucleotídeo e/ou do vetor de AAV recombinante, da partícula viral ou de uma composição que é descrita aqui. Em um aspecto, a quantidade fornecida é uma quantidade eficiente que é determinada pelo profissional atendente.

[0017] É ainda adicionalmente fornecido um método de redução de uma condição de doença ou sintoma associado à galactosemia em um indivíduo que sofre de galactosemia que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da administração ao indivíduo do polinucleotídeo e/ou do vetor de AAV recombinante, da partícula viral ou de uma composição que é descrita aqui, em que a condição de doença compreende uma ou mais de icterícia, hepatoesplenomegalia, insuficiência hepatocelular, hipoglicemia, disfunção tubular renal, hipotonia muscular, septicemia, catarata, ataxia, tremor, densidade óssea reduzida, fertilidade em fêmeas adultas, funções motoras prejudicadas e restrição de crescimento em um deficiente em GALT ou insuficiência ovariana primária. Em um aspecto, o método compreende ainda a identificação de um indivíduo que sofre de galactosemia e então o tratamento do indivíduo infectado pelo método. Em um aspecto, a quantidade fornecida é uma quantidade eficiente que é determinada pelo profissional atendente.

[0018] Em cada um destes métodos, a galactosemia que será tratada é uma galactosemia do tipo 1, uma galactosemia do tipo 2 ou uma galactosemia do tipo 3. Em um aspecto particular, a galactosemia é a galactosemia do tipo 1.

[0019] O polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV recombinante, a partícula viral ou uma composição é administrada através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa. Alternativamente, o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV recombinante, o polinucleotídeo e/ou a partícula viral ou uma composição é administrada de forma sistêmica. Ainda adicionalmente, o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV recombinante, a partícula viral ou uma composição é administrada de forma parenteral através de injeção, infusão ou implantação. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo, o vetor de AAV recombinante, a partícula viral ou uma composição é administrada através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa e então subsequentemente de forma sistêmica.

[0020] Também é fornecido um kit através desta divulgação, o kit compreendendo o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV recombinante, a partícula viral e/ou a composição que é descrita aqui. Os kits podem opcionalmente conter instruções para produção e utilização dos polinucleotídeos, vetores, partículas virais ou composições.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] As FIGs. 1A-1C mostram os mapas de três exemplos de vetores: pAAV-CB-GALT-WPRE-kan (FIG. 1A), pAAV-CB-hGALT (FIG. 1B) e pAAV-CB-hGALT-WPREv2 (FIG. 1C).

[0022] A FIG. 2 mostra a biodistribuição do vetor pAAV-CB-GALT- WPRE-kan (FIG. 1A).

[0023] A FIG. 3 mostra a expressão da proteína GALT humana expressa utilizando o vetor do vetor pAAV-CB-GALT-WPRE-Kan (FIG. 1A).

[0024] A FIG. 4 é um alinhamento de sequências do polinucleotídeo recombinante com códons otimizados que codifica GALT que é descrito aqui quando comparado com a sequência do tipo selvagem correspondente.

[0025] A FIG. 5 mostra a biodistribuição do vetor AAV9. Fêmeas de camundongo C57Bl/6J (WT) ou GalT -/- (CG) foram injetadas de forma intravenosa com 1E+12 genomas virais (Vg) do vírus AAV9/lucEYFP repórter e 1 semana depois os tecidos foram coletados e analisados em relação às cópias de genoma do vetor por qPCR.

[0026] A FIG. 6 mostra a expressão de proteína. O plasmídeo pAAV- CB-GALT-WPRE ou o plasmídeo pAAV- CB-lucEYFP repórter foi transfectado em células HEK293 e dois dias depois avaliado em relação à expressão de GALT através da análise de Western blot. O lisado de células transfectadas com GALT (30 ou 3 µg), o lisado de células LucEYFP (138 µg), o controle de proteína GALT endógena HepG2 (135 µg), o padrão de proteína GALT expresso em bactérias purificado com peso molecular ligeiramente maior devido ao tag de purificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] As modalidades de acordo com a presente divulgação serão descritas de forma mais completa posteriormente aqui. Os aspectos da divulgação podem, entretanto, ser incorporados de formas diferentes e não devem ser interpretados como limitados às modalidades apresentadas aqui. Particularmente, estas modalidades são fornecidas de forma que esta divulgação seja criteriosa e completa e irá transmitir totalmente o âmbito da invenção para os peritos na técnica. A terminologia utilizada na descrição aqui tem a finalidade apenas de descrever modalidades particulares e não é pretendido que seja limitante.

[0028] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) utilizados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na técnica à qual esta invenção pertence. Será adicionalmente entendido que termos, tais como os definidos em dicionários comumente utilizados, devem ser interpretados como tendo um significado que é consistente com seu significado no contexto do presente pedido de patente e na técnica relevante e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal a não ser que sejam expressamente definidos aqui dessa maneira. Embora não explicitamente definidos a seguir, estes termos devem ser interpretados de acordo com seu significado comum.

[0029] A terminologia utilizada na descrição apresentada aqui tem a finalidade apenas de descrever modalidades particulares e não é pretendido que seja limitante da invenção. Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporados como referência em sua totalidade.

[0030] A prática da presente tecnologia empregará, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais de cultura de tecido, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e

DNA recombinante, que estão dentro da perícia da técnica.

[0031] A não ser que o contexto indique o contrário, é especificamente pretendido que as várias características da invenção descritas aqui podem ser utilizadas em qualquer combinação. Além disso, a divulgação também considera que em algumas modalidades, qualquer característica ou combinação de características apresentadas aqui pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se o relatório descritivo especificar que um complexo os componentes A, B e C, é especificamente pretendido que qualquer um de A, B ou C ou uma combinação dos mesmos, pode ser omitida e renunciada singularmente ou em qualquer combinação.

[0032] A não ser que seja explicitamente indicado de outra maneira, é pretendido que todas as modalidades, as características e os termos especificados incluam tanto a modalidade, a característica ou o termo citado quanto seus equivalentes biológicos.

[0033] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas ( + ) ou ( - ) por incrementos de 1,0 ou 0,1, quando apropriado ou alternativamente através de uma variação de +/- 15 % ou alternativamente 10% ou alternativamente 5% ou alternativamente 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo “aproximadamente”. Também deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes descritos aqui são meramente exemplos e que equivalentes destes são conhecidos na técnica.

[0034] Ao longo de toda esta divulgação, várias publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicados são referidos por uma citação de identificação ou por um número arábico. A citação completa das publicações identificadas por um número arábico é encontrada imediatamente antes das Reivindicações. As divulgações destas publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicados são incorporadas aqui como referência na presente divulgação em sua totalidade para descrever de forma mais completa o estado da técnica à qual esta invenção pertence.

Definições

[0035] A prática da presente tecnologia empregará, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais de química orgânica, farmacologia, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da perícia da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[0036] Como utilizado na descrição da invenção e nas Reivindicações em anexo, é pretendido que as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluam também as formas no plural, a não ser que o contexto indique claramente o contrário.

[0037] Como utilizado aqui, é pretendido que o termo “compreendendo” signifique que as composições e os métodos incluem os elementos citados, mas não excluem outros. Como utilizado aqui, a frase de transição consistindo essencialmente de (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como abrangendo os materiais ou as etapas citadas e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da modalidade citada. Assim, o termo “consistindo essencialmente de” como utilizado aqui não deve ser interpretado como equivalente a “compreendendo”. “Consistindo de” deve significar excluir mais que elementos traços de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administração das composições divulgadas aqui. Os aspectos definidos por cada um destes termos de transição estão dentro do âmbito da presente divulgação.

[0038] O termo “aproximadamente”, como utilizado aqui quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade ou uma concentração e similar, é entendido como abrangendo variações de 20%, 10%, 5%, 1 %, 0,5% ou mesmo 0,1 % da quantidade especificada.

[0039] Os termos or “aceitável”, “eficiente” ou “suficiente” quando utilizados para descrever a seleção de quaisquer componentes, faixas, formas de doses etc. divulgados aqui significam que o dito componente, faixa, forma de dose etc. é adequada para a finalidade divulgada.

[0040] Ainda, como utilizado aqui, “e/ou” se refere a e abrange qualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado na alternativa (“ou”).

[0041] O termo “vírus adeno-associado” ou “AAV” como utilizado aqui se refere a um membro da classe de vírus associados a este nome e que pertencem ao gênero dependoparvovirus, família Parvoviridae. Vários sorotipos deste vírus são conhecidos como sendo adequados para fornecimento gênico; todos os sorotipos conhecidos podem infectar células de vários tipos de tecidos. Pelo menos 11 sorotipos de AAV numerados sequencialmente são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de sorotipos úteis nos métodos divulgados aqui incluem qualquer um dos 11 sorotipos, por exemplo, AAV2, AAV8, AAV9 ou sorotipos variantes, por exemplo, AAV-DJ e AAV PHP.B. A partícula de AAV compreende três proteínas virais principais: VP1, VP2 e VP3. Em uma modalidade, o AAV se refere ao do sorotipo de AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B ou AAV rh74.

[0042] O termo “galactosemia” se refere a um distúrbio genético que afeta a capacidade de um indivíduo de metabolizar a galactose. A lactose no alimento (tais como produtos lácteos) é rompida pela enzima lactase em glicose e galactose. Nos indivíduos com galactosemia, as enzimas necessárias para o metabolismo adicional da galactose (Galactoquinase e galactose-1-fosfato uridiltransferase) são drasticamente diminuídas ou estão completamente ausentes, levando a níveis tóxicos de galactose ou galactose 1-fosfato (dependendo de qual enzima estiver ausente) em vários tecidos no caso de galactosemia clássica, resultando em condições de doença, que incluem, mas não são limitados a icterícia, hepatomegalia (um fígado aumentado), disfunção tubular renal, hipotonia muscular, septicemia, insuficiência hepatocelular, cirrose, falência renal, cataratas, vômito, convulsão, hipoglicemia, letargia, lesão cerebral e insuficiência ovariana. Assim, estas condições também podem ser apropriadamente tratadas através dos métodos desta divulgação quando relacionadas à galactosemia no indivíduo.

[0043] Com base na enzima que é deficiente no indivíduo, a galactosemia pode ser categorizada como galactosemia do tipo 1 (galactose-1-fosfato uridil transferase), galactosemia do tipo 2 (galactoquinase) e galactosemia do tipo 3 (UDP galactose epimerase). Em uma modalidade, os vetores recombinantes ou os métodos que são divulgados aqui podem ser utilizados para tratar galactosemia do tipo 1, do tipo 2 ou do tipo 3. Em outra modalidade, os vetores recombinantes ou os métodos podem ser utilizados para tratar galactosemia do tipo 1. Devido ao fato de que a galactosemia está associada a um número de condições de doenças, em outra modalidade, a divulgação fornece um método de redução de uma condição de doença em um indivíduo que sofre de galactosemia, em que a condição de doença é selecionada de icterícia, hepatomegalia (um fígado aumentado), disfunção tubular renal, hipotonia muscular, septicemia, insuficiência hepatocelular, cirrose, falência renal, cataratas, vômito, convulsão, hipoglicemia, letargia, lesão cerebral ou insuficiência ovariana.

[0044] Outras condições de doenças associadas à galactosemia incluem, mas não são limitadas a déficits da fala, Ataxia, Ataxia de Friedreich, dismetria, densidade óssea reduzida ou insuficiência ovariana prematura. Estas condições também podem ser tratadas através dos métodos desta divulgação.

[0045] O termo “célula” como utilizado aqui pode se referir a uma célula procariótica ou eucariótica, opcionalmente obtida de um indivíduo ou uma fonte disponível comercialmente.

[0046] “Células eucarióticas” compreendem todas dos reinos da vida exceto monera. Estas podem ser facilmente distinguidas pelo núcleo ligado por membrana. Animais, plantas, fungos e protozoários são eucariotos ou organismos cujas células são organizadas em estruturas complexas por membranas internas e um citoesqueleto. A estrutura ligada por membrana mais característica é o núcleo. A não ser que seja citado especificamente de outra maneira, o termo “hospedeiro” inclui um hospedeiro eucariótico, que inclui, por exemplo, células de levedura, plantas superiores, insetos e mamíferos. Exemplos não limitantes de células ou hospedeiros eucarióticos incluem símios, bovinos, suínos, camundongos, ratos, aves, répteis e humanos, por exemplo, células HEK293 e células 293T.

[0047] “Células procarióticas” que geralmente não têm um núcleo ou quaisquer outras organelas ligadas por membrana e são divididas em dois domínios, bactérias e archaea. Em adição ao DNA cromossômico, estas células também podem conter informação genética em um laço circular chamado de epissomo. As células bacterianas são muito pequenas, aproximadamente do tamanho de uma mitocôndria animal (aproximadamente 1-2 μm de diâmetro e 10 μm de comprimento). As células procarióticas apresentam três formatos principais: formato de bastão, esférico e espiral. Ao invés de passar por processos de replicação elaborados como os eucariotos, as células de bactérias se dividem através de fissão binária. Exemplos incluem, mas não são limitados às bactérias Bacillus, à bactéria E. coli e a bactéria Salmonella.

[0048] O termo “codifica” como é aplicado às sequências de ácidos nucleicos se refere a um polinucleotídeo que se diz “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado através de métodos bem conhecidos pelos peritos na técnica, puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento antissenso é o complemento de tal ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser deduzida partindo do mesmo.

[0049] Os termos “equivalente” ou “equivalente biológico” são utilizados de forma intercambiável quando se referem a uma molécula particular, um material biológico ou celular e significam aqueles que têm homologia mínima enquanto ainda mantêm a estrutura ou a funcionalidade desejada. Exemplos não limitantes de polipeptídeos equivalentes, incluem um polipeptídeo que tem pelo menos 60% ou alternativamente pelo menos 65% ou alternativamente pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% de identidade com o mesmo ou com sequências polipeptídicas ou um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo ou seu complemento que se hibridiza sob condições de alta estringência com um polinucleotídeo que codifica estas sequências polipeptídicas. As condições de alta estringência são descritas aqui e incorporadas aqui como referência. Alternativamente, um equivalente do mesmo é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo ou um complemento do mesmo, que tem pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% de identidade ou pelo menos 97% de identidade de sequência com o polinucleotídeo de referência, por exemplo, o polinucleotídeo do tipo selvagem.

[0050] Exemplos não limitantes de polipeptídeos equivalentes, incluem um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% ou alternativamente pelo menos 65% ou alternativamente pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% ou alternativamente pelo menos

97% de identidade com um polinucleotídeo de referência. Um equivalente também significa um polinucleotídeo ou seu complemento que se hibridiza sob condições de alta estringência com um polinucleotídeo de referência.

[0051] Um polinucleotídeo ou uma região polinucleotídica (ou um polipeptídeo ou uma região polipeptídica) que tem certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de “identidade de sequência” com outra sequência significa que, quando alinhadas, a porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma na comparação das duas sequências. O alinhamento e a porcentagem de homologia ou identidade de sequência podem ser determinados utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, os descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table

7.7.1. Em certas modalidades, são utilizados parâmetros pré- estabelecidos para o alinhamento. Um exemplo não limitante de programa de alinhamento é BLAST, utilizando parâmetros pré- estabelecidos. Em particular, exemplos de programas incluem BLASTN e BLASTP, utilizando os parâmetros pré-estabelecidos a seguir: Código genético=padrão; filtro=nenhum; filamento=ambos; cutoff=60; esperado=10; Matrix=BLOSUM62; Descrições=50 sequências; separar por=HIGH SCORE; Bases de Dados=não redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR. Os detalhes destes programas podem ser encontrados no endereço da Internet a seguir: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. A identidade de sequência e a porcentagem de identidade podem ser determinadas através da incorporação das mesmas no clustalW (disponível no endereço da web:genome.jp/tools/clustalw/, acessado por último em 13 de janeiro de 2017).

[0052] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” se refere à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácidos nucleicos. A homologia pode ser determinada através da comparação de uma posição em cada sequência que pode ser alinhada com a finalidade de comparação. Quando uma posição na sequência comparada for ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas naquela posição. Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de correspondências ou posições homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade ou alternativamente menos de 25% de identidade, com uma das sequências da presente divulgação.

[0053] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” também pode se referir a duas moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes.

[0054] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através da ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer através do pareamento de bases de Watson-Crick, da ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica à sequência. O complexo pode compreender dois filamentos que formam uma estrutura em duplex, três ou mais filamentos que formam um complexo multifilamentado, um filamento individual que se hibridiza com ele mesmo ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extenso, tal como o início de uma reação da PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.

[0055] Exemplos de condições de hibridização estringentes incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 25° C. a aproximadamente 37° C.; concentrações de tampão de hibridização de aproximadamente 6×SSC a aproximadamente 10×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 0% a aproximadamente 25%; e soluções de lavagem de aproximadamente 4×SSC a aproximadamente 8×SSC. Exemplos de condições de hibridização moderadas incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 40° C. a aproximadamente 50° C.; concentrações de tampão de aproximadamente 9×SSC a aproximadamente 2×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%; e soluções de lavagem de aproximadamente 5×SSC a aproximadamente 2×SSC. Exemplos de condições de alta estringência incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 55° C. a aproximadamente 68° C.; concentrações de tampão de aproximadamente 1×SSC a aproximadamente 0,1×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 55% a aproximadamente 75%; e soluções de lavagem de aproximadamente 1×SSC, 0,1×SSC ou água deionizada. Em geral, os tempos de incubação da hibridização são de 5 minutos a 24 horas, com 1, 2 ou mais etapas de lavagem e tempos de incubação de lavagem são de aproximadamente 1, 2 ou 15 minutos. SSC é 0,15 M de NaCl e 15 mM de tampão citrato. É entendido que equivalentes de SSC utilizando outros sistemas de tampão podem ser empregados.

[0056] Como utilizado aqui, “expressão” se refere ao processo através do qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou ao processo através do qual o mRNA transcrito será subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir o processamento do mRNA em uma célula eucariótica.

[0057] Um “gene” se refere a um polinucleotídeo que contém pelo menos um quadro aberto de leitura (ORF) que é capaz de codificar um polipeptídeo ou uma proteína particular após ser transcrito e traduzido. Um “produto gênico” ou alternativamente um “produto da expressão gênica” se refere ao aminoácido (por exemplo, peptídeo ou polipeptídeo) gerado quando um gene é transcrito e traduzido.

[0058] “Sob controle transcricional” é um termo bem entendido na técnica e indica que a transcrição de uma sequência polinucleotídica, geralmente uma sequência de DNA, depende de esta estar ligada de forma operacional a um elemento que contribui para o início ou promove a transcrição. “Ligados de forma operacional” significa que os polinucleotídeos estão dispostos de uma maneira que permite que estes funcionem em uma célula. Em um aspecto, esta invenção fornece promotores ligados de forma operacional às sequências a jusante, por exemplo, gene suicida, VEGF, 165A VEGF, ativador de tet etc.

[0059] O termo “codifica(m)” que é aplicado aos polinucleotídeos se refere a um polinucleotídeo se diz “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado através de métodos bem conhecidos pelos peritos na técnica, este puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento antissenso é o complemento de tal ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser deduzida partindo do mesmo.

[0060] O termo “isolado(a)” como utilizado aqui se refere a moléculas ou agentes biológicos ou materiais celulares que são substancialmente livres de outros materiais.

[0061] Como utilizado aqui, o termo “funcional” pode ser utilizado para modificar qualquer molécula, material biológico ou celular para significar que realiza um efeito especificado particular.

[0062] Como utilizado aqui, os termos “sequência de ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são utilizados de forma intercambiável para se referirem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não é limitado a DNA ou RNA de filamento simples, duplo ou múltiplo, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que compreende bases de purina e pirimidina ou outras bases nucleotídicas naturais, quimica- ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.

[0063] O termo “promotor” como utilizado aqui se refere a qualquer sequência que regula a expressão de uma sequência codificadora, tal como um gene. Os promotores podem ser constitutivos, induzíveis, repressíveis ou específicos para o tecido, por exemplo. Um “promotor” é uma sequência de controle que é uma região de uma sequência polinucleotídica na qual o início e a taxa de transcrição são controlados.

Pode conter elementos genéticos aos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar tal como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Exemplos não limitantes promotores incluem um promotor de LTR do vírus de sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de dihidrofolato redutase, um promotor da β-actina, um promotor da fosfoglicerol quinase (PGK), um promotor de U6 ou um promotor do EF1. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor da β-actina de frango (“CBA”) (por exemplo, pares de bases de números 439 a 708 da SEQ ID NO: 2 ou pares de bases de números 644 a 921 da SEQ ID NO: 3 ou um equivalente de cada uma das mesmas).

[0064] Exemplos não limitantes adicionais de promotores com certa especificidade ao alvo são fornecidos aqui abaixo incluindo, mas não limitados ao promotor de CMV, EF1a, SV40, PGK1 (humano ou de camundongo), P5, Ubc, beta actina humana, CAG, TRE, UAS, Ac5, Polihedrina, CaMKIIa, Gal1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6 e Alfa-1-antitripsina. Promotores derivados sinteticamente podem ser utilizados para expressão ubíqua ou específica para o tecido. Ainda, promotores derivados de vírus, dos quais alguns são citados anteriormente, podem ser úteis nos métodos divulgados aqui, por exemplo, promotores de CMV, HIV, adenovírus e AAV. Em algumas modalidades, o promotor é acoplado a um intensificador para aumentar a eficiência de transcrição. Exemplos não limitantes de intensificadores incluem um intensificador de RSV ou um intensificador de CMV (por exemplo, pares de bases de números 153 a 432 da SEQ ID NO: 2).

[0065] Um intensificador é um elemento regulador que aumenta a expressão de uma sequência alvo. Um “promotor/intensificador” é um polinucleotídeo que contém sequências capazes de fornecer funções tanto de promotor quanto de intensificador. Por exemplo, as repetições terminais longas dos retrovírus contêm funções tanto de promotor quanto de intensificador. O intensificador/promotor pode ser “endógeno” ou “exógeno” ou “heterólogo”. Um intensificador/promotor “endógeno” é um que está naturalmente ligado a certo gene no genoma. Um intensificador/promotor “exógeno” ou “heterólogo” é um que está colocado em justaposição a um gene através de manipulação genética (isto é, técnicas de biologia molecular) de forma que a transcrição de tal gene seja direcionada pelo intensificador/promotor ligado.

[0066] Os termos “proteína”, “peptídeo” e “polipeptídeo” são utilizados de forma intercambiável e em seu sentido mais amplo para se referirem a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter etc. Uma proteína ou um peptídeo tem que conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada sobre o número máximo de aminoácidos que pode compreender a sequência de uma proteína ou um peptídeo. Como utilizado aqui o termo “aminoácido” se refere a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[0067] Como utilizado aqui, o termo “vetor” se refere a um ácido nucleico não cromossômico que compreende um replicon intacto de forma que o vetor possa ser replicado quando colocado dentro de uma célula, por exemplo, através de um processo de transformação. Os vetores podem ser virais ou não virais. Os vetores virais incluem retrovírus, adenovírus, herpesvírus, baculovírus, baculovírus modificados, papovírus ou outros vírus que ocorrem naturalmente modificados de outra maneira. Exemplos de vetores não virais para o fornecimento do ácido nucleico incluem DNA nu; DNA complexado com lipídeos catiônicos, individualmente ou em combinação com polímeros catiônicos; lipossomos aniônicos e catiônicos; complexos de DNA- proteína e partículas que compreendem DNA condensado com polímeros catiônicos tais como polilisina heterogênea, oligopeptídeos de comprimento definido e polietileno imina, em alguns casos contidos em lipossomos; e o uso de complexos ternários que compreendem um vírus e polilisina-DNA.

[0068] Um “vetor viral” é definido como um vírus ou uma partícula viral produzida de forma recombinante que compreende um polinucleotídeo que será fornecido dentro de uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores de AAV, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores alfavirais e similares. Os vetores alfavirais, tais como vetores baseados no vírus Semliki Forest e vetores baseados no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso na terapia gênica e na imunoterapia. Ver, Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 e Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827.

[0069] Em outra modalidade, o promotor é um promotor induzível. Em uma modalidade relacionada específica, o promotor é um promotor induzível com tetraciclina. Os Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems fornecem aos pesquisadores acesso rápido aos sistemas de expressão gênica em níveis altos regulados descritos por Gossen & Bujard (1992; Tet-Off) e Gossen et al. (1995; Tet-On). No Tet-Off System, a expressão gênica é ativada quando a tetraciclina (Tc) ou a doxiciclina (Dox; um derivado da Tc) é removida do meio de cultura. Em contraste, a expressão é ativada no Tet-On System através da adição de Dox. Ambos os sistemas permitem que a expressão gênica seja rigidamente regulada em resposta a concentrações variáveis de Tc ou Dox. Os níveis de expressão máxima nos sistemas com Tet são muito altos e se comparam favoravelmente com os níveis máximos que podem ser obtidos partindo de promotores de mamíferos constitutivos fortes tal como CMV (Yin et al., 1996). Ao contrário de outros sistemas de expressão de mamíferos que podem ser induzidos, a regulação gênica nos Tet Systems é altamente específica, assim, a interpretação dos resultados não é complicada pelos efeitos pleiotrópicos ou pela indução não específica. Em E. coli, a proteína repressora de Tet (TetR) regula de forma negativa os genes do operon de resistência à tetraciclina no transposon Tn10. TetR bloqueia a transcrição destes genes através da ligação às sequências do operador de tet (tetO) na ausência de Tc. TetR e tetO fornecem a base de regulação e indução para uso em sistemas experimentais com mamíferos. No Tet-On System, a proteína reguladora se baseia em um repressor de Tet “inverso” (rTetR) que foi criado por quatro alterações de aminoácidos na TetR (Hillen & Berens, 1994; Gossen et al., 1995). A proteína resultante, rtTA (tTA inversa também referida como proteína ativadora da tetraciclina), é codificada pelo plasmídeo regulador pTet-On. Este gene pode estar em um vetor separado daquele de um gene GALT ou codificado no mesmo gene.

[0070] Em uma modalidade relacionada, o vetor compreende ainda ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um ácido nucleico que codifica uma proteína ativadora da tetraciclina; e um promotor que regula a expressão da proteína ativadora da tetraciclina.

[0071] Outros sistemas que podem ser induzidos úteis em vetores, células isoladas, sistemas de empacotamento viral e métodos descritos aqui incluem a regulação por ecdisona, por estrogênio, progesterona, indutores químicos de dimerização e isopropil-beta-D1- tiogalactopiranosídeo (EPTG).

[0072] Como utilizado aqui, o termo “sistema de expressão recombinante” ou “vetor recombinante” se refere a uma construção ou construções genéticas para a expressão de certo material genético formadas por recombinação.

[0073] Um “veículo de fornecimento gênico” é definido como qualquer molécula que possa carregar polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Exemplos de veículos de fornecimento gênico são lipossomos, polímero biocompatíveis com micelas, incluindo polímeros naturais e polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; partículas metálicas; e bactérias ou vírus, tais como baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vetores fúngicos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica que foram descritos para expressão em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos e podem ser utilizados para terapia gênica bem como para simples expressão de proteína.

[0074] Um polinucleotídeo divulgado aqui pode ser fornecido para uma célula ou um tecido utilizando um veículo de fornecimento gênico. “Fornecimento gênico”, “transferência gênica”, “transdução” e similares, como utilizados aqui, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeo exógeno (algumas vezes referido como um “transgene”) em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a introdução. Estes métodos incluem uma variedade de técnicas bem conhecidas tal como transferência gênica mediada por vetor (por exemplo, através de infecção/transfecção viral ou vários outros complexos de fornecimento gênico à base de proteína ou à base de lipídeo) bem como técnicas que facilitam o fornecimento de polinucleotídeos “nus” (tais como eletroporação, fornecimento com “pistola gênica” e várias outras técnicas utilizadas para a introdução de polinucleotídeos). O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido de forma estável ou transitória na célula hospedeira. A manutenção estável requer tipicamente que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre em um replicon da célula hospedeira tal como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. É sabido que um número de vetores é capaz de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, como é conhecido na técnica e descrito aqui.

[0075] Um “plasmídeo” é uma molécula de DNA extra- cromossômica separada do DNA cromossômico que é capaz de se replicar independentemente do DNA cromossômico. Em muitos casos, este é circular e de filamento duplo. Os plasmídeos fornecem um mecanismo para transferência gênica horizontal dentro de uma população de micro- organismos e tipicamente fornecem uma vantagem seletiva sob certa condição ambiental. Os plasmídeos podem carregar genes que fornecem resistência a antibióticos que ocorrem naturalmente em um nicho ambiental competitivo ou alternativamente as proteínas produzidas podem agir como toxinas sob circunstâncias similares.

[0076] “Plasmídeos” utilizados na engenharia genética são chamados de “vetores plasmideais”. Muitos plasmídeos estão disponíveis comercialmente para estes usos. O gene que será replicado é inserido em cópias de um plasmídeo contendo os genes que tornam as células resistentes a antibióticos particulares e um sítio de clonagem múltipla (MCS ou poliligante), que é uma região curta que contém vários sítios de restrição comumente utilizados permitindo a fácil inserção de fragmentos de DNA nesta localização. Outro uso importante dos plasmídeos é produzir grandes quantidades de proteínas. Neste caso, os pesquisadores cultivam bactérias que contêm um plasmídeo que carrega o gene de interesse. À medida que a bactéria produz proteínas para conferir sua resistência ao antibiótico, esta também pode ser induzida a produzir grandes quantidades de proteínas partindo do gene inserido.

[0077] Em aspectos em que a transferência gênica é mediada por um vetor viral de DNA, tal como um adenovírus (Ad) ou um vírus adeno- associado (AAV), uma construção de vetor se refere ao polinucleotídeo que compreende o genoma viral ou parte do mesmo e um transgene. Os adenovírus (Ads) são um grupo de vírus homogêneo relativamente bem caracterizado, que inclui mais de 50 sorotipos. Os Ads não requerem a integração no genoma da célula hospedeira. Os vetores derivados de Ad recombinantes, particularmente aqueles que reduzem o potencial de recombinação e produção de vírus do tipo selvagem, também foram construídos. Estes vetores estão disponíveis comercialmente de fornecedores tais como Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA) e Creative Biogene (Shirley, NY). Os AAV do tipo selvagem têm alta infectividade e especificidade de integração no genoma da célula hospedeira. Ver, Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 e Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

[0078] Os vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem dentro do qual um polinucleotídeo pode ser ligado de forma operacional são bem conhecidos na técnica. Estes vetores são capazes de transcrever o RNA in vitro ou in vivo e estão disponíveis comercialmente de fornecedores tais como Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) e Promega Biotech (Madison, Wis.). Para otimizar a expressão e/ou a transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar partes não traduzidas a 5’ e/ou a 3’ dos clones para eliminar códons de início da tradução alternativos inapropriados potenciais extras ou outras sequências que possam interferir ou reduzir a expressão, no nível da transcrição ou da tradução. Alternativamente, sítios consenso de ligação ao ribossomo podem ser inseridos imediatamente a 5’ do códon de início para aumentar a expressão.

[0079] Os veículos de fornecimento gênico também incluem complexos de DNA/lipossomo, micelas e complexos de proteína viral- DNA direcionados. Os lipossomos que também compreendem um anticorpo de direcionamento ou um fragmento do mesmo podem ser utilizados nos métodos divulgados aqui. Em adição ao fornecimento de polinucleotídeos para uma célula ou uma população de células, a introdução direta das proteínas descritas aqui na célula ou na população de células pode ser realizada através da técnica não limitante de transfecção de proteína, alternativamente as condições de cultivo que podem aumentar a expressão e/ou promover a atividade das proteínas divulgadas aqui são outras técnicas não limitantes.

[0080] Como utilizado aqui, o termo “peptídeo sinal” ou “polipeptídeo sinal” significa uma sequência de aminoácidos geralmente presente na extremidade N-terminal de polipeptídeos ou proteínas secretoras ou de membrana recém-sintetizadas. Este age direcionando o polipeptídeo para uma localização celular específica, por exemplo, ao longo da membrana celular, dentro da membrana celular ou dentro do núcleo. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é removido após a localização. Exemplos de peptídeos sinais são bem conhecidos na técnica.

Exemplos não limitantes são aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos.

8.853.381, 5.958.736 e 8.795.965.

[0081] Como utilizado aqui, o termo “capsídeo viral” ou “capsídeo” se refere à carapaça ou ao revestimento proteico de uma partícula viral. Os capsídeos atuam para encapsidar, proteger, transportar e liberar dentro de uma célula hospedeira um genoma viral. Os capsídeos são geralmente compreendidos de subunidades estruturais oligoméricas de proteína (“proteínas do capsídeo”). Como utilizado aqui, o termo “encapsidado(a)” significa envolto dentro de um capsídeo viral.

[0082] Como utilizado aqui, o termo “helper” em referência a um vírus ou um plasmídeo se refere a um vírus ou um plasmídeo utilizado para fornecer os componentes adicionais necessários para replicação e empacotamento de uma partícula viral ou partícula viral recombinante, tal como o AAV modificado divulgado aqui. Os componentes codificados por um vírus helper podem incluir quaisquer genes necessários para a montagem, a encapsidação, a replicação do genoma e/ou o empacotamento dos virions. Por exemplo, o vírus helper pode codificar enzimas necessárias para a replicação do genoma viral. Exemplos não limitantes de vírus helper e plasmídeos adequados para uso com construções de AAV incluem pHELP (plasmídeo), adenovírus (vírus) ou herpesvírus (vírus).

[0083] Como utilizado aqui, o termo “AAV” é uma abreviação padrão para vírus adeno-associado. O vírus adeno-associado é um parvovírus de DNA de filamento simples que cresce apenas em células nas quais são fornecidas certas funções por um vírus helper coinfectante. Informação geral e revisões sobre o AAV podem ser encontradas, por exemplo, em Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228 e Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York). É totalmente esperado que os mesmos princípios descritos nestas revisões sejam aplicáveis aos sorotipos de AAV adicionais caracterizados após as datas de publicação das revisões porque é bem sabido que os vários sorotipos são bastante intimamente relacionados, tanto estruturalmente quanto funcionalmente, mesmo no nível genético. (Ver, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV exibem aparentemente propriedades de replicação muito similares mediadas por genes rep homólogos; e todos carregam três proteínas do capsídeo relacionadas tais como aquelas expressas no AAV2. O grau de parentesco é adicionalmente sugerido pela análise de heteroduplex que revela hibridização cruzada extensiva entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de autoanelamento análogos nos terminais que correspondem a “sequências repetidas terminais invertidas” (ITRs). Os padrões de infectividade similares também sugerem as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulador similar.

[0084] Um “vetor de AAV” como utilizado aqui se refere a um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminais (ITRs) do AAV. Estes vetores de AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectadas com um vetor que codifica e expressa os produtos dos genes rep e cap.

[0085] Um “virion de AAV” ou uma “partícula viral de AAV” ou uma “partícula do vetor de AAV” se refere a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor de AAV com polinucleotídeo encapsidado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo sem ser um genoma de AAV do tipo selvagem tal como um transgene que que será fornecido para uma célula de mamífero), esta é tipicamente referida como uma “partícula de vetor de AAV” ou simplesmente um “vetor de AAV”. Assim, a produção de partícula de vetor de AAV inclui necessariamente a produção do vetor de AAV, de forma que um vetor fique contido dentro de uma partícula de vetor de AAV.

[0086] Em algumas modalidades, o AAV é um parvovírus deficiente em relação à replicação, cujo genoma de DNA de filamento simples tem aproximadamente 4,7 kb de comprimento incluindo duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleotídeos. Há vários sorotipos de AAV. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma complete de AAV-1 é fornecido no GenBank Accession No. NC_002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no GenBank Accession No. NC_001401 e Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no GenBank Accession No. NC_1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no GenBank Accession No. NC_001829; o genoma de AAV-5 é fornecido no GenBank Accession No. AF085716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no GenBank Accession No. NC_00 1862; pelo menos partes dos genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos GenBank Accession Nos. AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375-383 (2004). A sequência do genoma de AAV rh.74 é fornecida na Patente U.S.

9.434.928, incorporada aqui como referência. A Patente U.S. No.

9.434.928 também fornece as sequências das proteínas do capsídeo e um genoma autocomplementar. Em um aspecto, o genoma é um genoma autocomplementar. As sequências que atuam em cis que direcionam a replicação do DNA viral (rep), encapsidação/empacotamento e integração no cromossomo da célula hospedeira estão contidas dentro das ITRs do AAV. Três promotores do AAV (chamados de p5, pl9 e p40 por suas localizações relativas no mapa) controlam a expressão dos dois quadros abertos de leitura internos do AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores do rep (p5 e pi 9), acoplados ao processamento diferencial do único íntron do AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) partindo do gene rep. As proteínas rep possuem várias propriedades enzimáticas que são em última análise responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso partindo do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. O processamento alternativo e os sítios de início da tradução não consensos são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação consenso fica localizado na posição 95 do mapa do genoma do AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são revisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0087] O AAV possui características únicas que o tornam atraente como um vetor para o fornecimento do DNA estranho para as células, por exemplo, na terapia gênica. A infecção com AAV de células em cultura é não citopática e a infecção natural de humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamíferos permitindo a possibilidade de direcionamento para muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz lentamente células que estão se dividindo e que não estão se dividindo e pode persistir essencialmente durante o tempo de vida destas células na forma de um epissomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma pró-viral do AAV é inserido na forma de DNA clonado nos plasmídeos, que pode tornar a construção de genomas recombinantes possível. Além disso, uma vez que os sinais que direcionam a replicação do AAV e a encapsidação do genoma estão contidos dentro das ITRs do genoma do AAV, parte ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (que codificam as proteínas de replicação e estruturais do capsídeo, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho. Para gerar os vetores de AAV, as proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outra característica significativa do AAV é que este é um vírus extremamente estável e vigoroso. Resiste facilmente às condições utilizadas para inativar o adenovírus (56° a 65°C durante várias horas), tornando a preservação a frio do AAV menos crítica. O AAV pode ainda ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção.

[0088] Vários estudos demonstraram a expressão de proteínas mediada por AAV recombinante durante longo prazo (> 1,5 anos) nos músculos. Ver, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); e Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Ver também, Chao et al., Mol Ther, 2:619- 623 (2000) e Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Além disso, uma vez que o músculo é altamente vascularizado, a transdução do AAV recombinante resultou no aparecimento de produtos transgênicos na circulação sistêmica após a injeção intramuscular como descrito em Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) e Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997). Além disso, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) demonstraram que as miofibras esqueléticas possuem os fatores celulares necessários para a glicosilação, o dobramento e a secreção corretos do anticorpo, indicando que o músculo é capaz de expressar estavelmente agentes terapêuticos proteicos secretados. Os genomas de AAV recombinantes (rAAV) da invenção compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica GALT (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e uma ou mais ITRs do AAV que flanqueiam a molécula de ácido nucleico. O DNA do AAV nos genomas de rAAV pode ser proveniente de qualquer isotipo de AAV do qual um vírus recombinante pode ser derivado incluindo, mas não limitado aos sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13, AAV PHP.B e AAV rh74. A produção de pseudotipo de rAAV é divulgada, por exemplo, na WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações no capsídeo, também são considerados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). As sequências de nucleotídeos dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica.

[0089] Como utilizado aqui, o termo “exterior” em referência a uma proteína do capsídeo viral se refere à superfície, ao domínio, à região ou à extremidade terminal da proteína do capsídeo que fica voltada para o exterior em um capsídeo viral montado. O termo “interior” em referência a uma proteína do capsídeo viral se refere à superfície, ao domínio, à região ou à extremidade terminal (extremidade amino-terminal ou carbóxi terminal) da proteína do capsídeo que fica voltada para o interior em um capsídeo viral montado. Quando utilizado em referência a um capsídeo viral montado, o termo “interior” se refere ao espaço encapsidado dentro do capsídeo viral e à superfície voltada para dentro do capsídeo que fica exposta ao espaço fechado. O espaço interno é encapsidado pelas proteínas do capsídeo viral e pode compreender ácido nucleicos tais como o genoma viral, as proteínas virais, as proteínas da célula hospedeira ou de empacotamento e quaisquer outros componentes ou fatores empacotados ou encapsidados durante a replicação, a montagem de virions, a encapsidação e/ou o empacotamento.

[0090] Como utilizado aqui, o termo “conjugado” se refere a qualquer método de ligação, acoplamento, fusão e/ou ligação de uma proteína do capsídeo viral a uma proteína GALT ou um equivalente da mesma. Exemplos não limitantes de conjugação incluem proteínas de fusão recombinantes em que a proteína GALT ou um equivalente da mesma e a proteína do capsídeo viral são codificadas por um único polinucleotídeo que compreende os genes tanto para a proteína GALT ou um equivalente da mesma quanto para a proteína do capsídeo viral, montagem à base de inteína modular de uma proteína inteína de GALT e uma proteína inteína do capsídeo viral, modificação pós-tradução que faz com que uma ligação química se forme entre uma proteína GALT ou equivalente da mesma e a proteína do capsídeo viral e ligação de uma GALT ou equivalente da mesma e a proteína do capsídeo viral através de um ou mais ligantes. Em algumas modalidades, a conjugação pode ser um estado de associação temporário ou transitório entre a proteína do capsídeo viral e o equivalente da mesma. Por exemplo, a GALT ou um equivalente da mesma pode estar transitoriamente ligado à proteína do capsídeo viral através de um polímero sensível a uma alteração no pH ou gradiente iônico em uma etapa posterior na infecção ou dentro de um microambiente celular particular, tal como ligação de oxima (ver, por exemplo, Jin et al. Biomacromolecules, 2011, 12 (10), pp 3460–3468 e Yoshida et al. Expert Opin Drug Deliv. 2013 Nov; 10(11): 1497–1513).

[0091] Como utilizado aqui, o termo “marcação” significa um composto ou uma composição que é direta- ou indiretamente detectada que é conjugada direta- ou indiretamente à composição que será detectada, por exemplo, polinucleotídeo ou proteína tal como um anticorpo de forma a gerar uma composição “marcada”. O termo inclui ainda sequências conjugadas ao polinucleotídeo que fornecerá um sinal após a expressão das sequências inseridas, tal como proteína fluorescente verde (GFP) e similar. A marcação pode por si só ser detectável (por exemplo, marcações com radioisótopos ou marcações fluorescentes) ou, no caso de uma marcação enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou uma composição de substrato que é detectável. As marcações podem ser adequadas para detecção em pequena escala ou mais adequadas para seleção de alto desempenho. Como tais, as marcações adequadas incluem, mas não são limitadas a radioisótopos, fluorocromos, compostos quimioluminescentes, corantes e proteínas, incluindo enzimas. A marcação pode ser simplesmente detectada ou pode ser quantificada. Uma resposta que é simplesmente detectada geralmente compreende uma resposta cuja existência é meramente confirmada, enquanto que uma resposta que é quantificada geralmente compreende uma resposta que tem um valor quantificável (por exemplo, que pode ser numericamente reportado) tal como uma intensidade, uma polarização e/ou outra propriedade. Em ensaio de luminescência ou fluorescência, a resposta detectável pode ser gerada diretamente utilizando um luminóforo ou um fluoróforo associado a um componente de ensaio realmente envolvido na ligação ou indiretamente utilizando um luminóforo ou um fluoróforo associado com outro componente (por exemplo, repórter ou indicador).

[0092] Exemplos de marcações luminescentes que produzem sinais incluem, mas não são limitadas a bioluminescentes e quimioluminesentes. A resposta luminescente detectável geralmente compreende uma alteração ou uma ocorrência de um sinal de luminescência. Os métodos e os luminóforos adequados para componentes de ensaio de marcação luminescente são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.). Os exemplos de sondas luminescentes incluem, mas não são limitados a aequorina e luciferases.

[0093] Exemplos de marcações fluorescentes adequadas incluem, mas não estão limitadas a fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, Verde Malaquita, estilbeno, Amarelo Lúcifer, Cascade Blue.TM. e Texas Red. Outros corantes ópticos adequados são descritos em Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.).

[0094] Em outro aspecto, a marcação fluorescente é funcionalizada para facilitar a ligação covalente a um componente celular presente na ou sobre a superfície da célula ou do tecido tal como um marcador de superfície celular. Grupos funcionais adequados, que incluem, mas não são limitados a grupos isotiocianato, grupos amino, grupos haloacetila, maleimidas, ésteres succinimidilas e halogenetos de sulfonila, dos quais todos podem ser utilizados para ligar a marcação fluorescente a uma segunda molécula. A escolha do grupo funcional da marcação fluorescente dependerá do local de ligação a um ligante, ao agente, ao marcador ou ao segundo agente de marcação.

[0095] A ligação da marcação fluorescente pode ocorrer diretamente a um componente celular ou composto ou alternativamente, pode ocorrer através de um ligante. Os pares de ligação adequados para uso na ligação indireta da marcação fluorescente ao intermediário incluem, mas não são limitados a antígenos/anticorpos, por exemplo, rodamina/anti- rodamina, biotina/avidina e biotina/estreptavidina.

[0096] A expressão “suporte sólido” se refere a superfícies não aquosas tais como “placas de cultura” “chips gênicos” ou “microarranjos”. Tais chips gênicos ou microarranjos podem ser utilizados para as finalidades de diagnóstico e terapêuticas através de um número de técnicas conhecidas por um perito na técnica. Em uma técnica, os oligonucleotídeos são ligados e dispostos sobre um chip gênico para a determinação da sequência de DNA através da abordagem de hibridização, tal como aquela apresentada nas Patentes U.S. Nos.

6.025.136 e 6.018.041. Os polinucleotídeos desta invenção podem ser modificados em sondas, que por sua vez podem ser utilizadas para a detecção de uma sequência genética. Estas técnicas foram descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.968.740 e 5.858.659. Uma sonda também pode ser ligada ou afixada a uma superfície de eletrodo para a detecção eletroquímica das sequências de ácidos nucleicos tal como é descrito por Kayem et al. Patente U.S. No. 5.952.172 e por Kelley et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:4830-4837.

[0097] É pretendido que uma “composição” signifique uma combinação de polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo ativo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, uma marcação detectável) ou ativa (por exemplo, um veículo de fornecimento gênico).

[0098] É pretendido que uma “composição farmacêutica” inclua a combinação de um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou um anticorpo ativo com um carreador, inerte ou ativo tal como um suporte sólido, tornando a composição adequada para uso para diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0099] Como utilizado aqui, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” abrange qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrões, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tal como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de carreadores, estabilizantes e adjuvantes, ver Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

[0100] Um “sujeito” de diagnóstico ou tratamento é uma célula ou um animal tal como um mamífero ou um ser humano. Um indivíduo não é limitado a uma espécie específica e inclui animais não humanos sujeitos a diagnóstico ou tratamento e são aqueles sujeitos a infecções ou modelos com animais, por exemplo, símios, roedores, tais como, ratos, camundongos, chinchila, caninos, tais como cachorros, leporídeos, tais como coelhos, gado, animais para esporte e animais de companhia. Pacientes humanos também estão incluídos no termo.

[0101] O termo “tecido” é utilizado aqui para se referir ao tecido de um organismo vivo ou morto ou qualquer tecido derivado ou planejado para imitar um organismo vivo ou morto. O tecido pode ser saudável, doente e/ou ter mutações genéticas. O tecido biológico pode incluir qualquer tecido individual (por exemplo, um conjunto de células que podem estar interconectadas) ou um grupo de tecidos que constituem um órgão ou parte ou região do corpo de um organismo. O tecido pode compreender um material celular homogêneo ou pode ser uma estrutura composta tal com a encontrada nas regiões do corpo que incluem o tórax que, por exemplo, podem incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e/ou tecido muscular. Exemplos de tecidos incluem, mas não são limitados àqueles derivados do fígado, dos pulmões, da tireoide, da pele, do pâncreas, dos vasos sanguíneos, da bexiga, dos rins, do cérebro, árvore biliar, do duodeno, da aorta abdominal, da veia ilíaca, do coração e dos intestinos, incluindo qualquer combinação dos mesmos.

[0102] Como utilizado aqui, “tratar” ou “tratamento” de uma doença em um indivíduo se refere a (1) prevenção de que os sintomas ou a doença ocorra em um indivíduo que é predisposto ou não exibe ainda sintomas da doença; (2) inibição da doença ou interrupção de seu desenvolvimento; ou (3) melhora ou indução da regressão da doença ou dos sintomas da doença. Como entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para as finalidades da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais, mas não são limitados a, de alívio ou melhora de um ou mais sintomas, redução da extensão de um estado de saúde (incluindo uma doença), estado estabilizado (isto é, o não agravamento) de um estado de saúde (incluindo doença), atraso ou retardo do estado de saúde (incluindo doença), progressão, melhora ou paliação da condição (incluindo doença), estados e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável.

[0103] Como utilizado aqui é pretendido que o termo “quantidade eficiente” signifique uma quantidade suficiente para atingir um efeito desejado. No contexto das aplicações terapêuticas ou profiláticas, a quantidade eficiente dependerá do tipo e da gravidade do estado de saúde em questão e das características individuais do indivíduo, tais como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a composições farmacêuticas. No contexto da terapia gênica, em algumas modalidades a quantidade eficiente é a quantidade suficiente para resultar na recuperação da função parcial ou total de um gene que é deficiente em um indivíduo. Em outras modalidades, a quantidade eficiente de uma partícula viral de AAV é a quantidade suficiente para resultar na expressão de um gene em um indivíduo. Em algumas modalidades, a quantidade eficiente é a quantidade necessária para aumentar o metabolismo da galactose em um indivíduo que necessita disso. O perito na técnica será capaz de determinar quantidades apropriadas dependendo destes e de outros fatores.

[0104] Em algumas modalidades a quantidade eficiente dependerá do tamanho e da natureza da aplicação em questão. Esta também dependerá da natureza e da sensibilidade do indivíduo alvo e dos métodos em uso. O perito na técnica será capaz de determinar a quantidade eficiente com base nestas e outras considerações. A quantidade eficiente pode compreender uma ou mais administrações de uma composição dependendo da modalidade.

[0105] Como utilizado aqui, é pretendido que o termo “administrar” ou “administração” signifique o fornecimento de uma substância a um indivíduo tal como um animal ou um ser humano. A administração pode ser realizada em uma dose, de forma contínua ou intermitente ao longo de todo o curso de tratamento. Os métodos de determinação dos meios e da dosagem de administração mais eficientes são conhecidos pelos peritos na técnica e variarão com a composição utilizada para terapia, a finalidade da terapia, bem como a idade, a saúde ou o gênero do indivíduo que será tratado. Administrações individuais ou múltiplas podem ser realizadas com o nível e o padrão de doses sendo selecionados pelo médico atendente ou no caso de animais de companhia e animais, pelo veterinário atendente. Formulações de dosagem e métodos de administração adequados dos agentes são conhecidos na técnica. A rota de administração também pode ser determinada e o método de determinação da rota de administração mais eficiente é conhecido pelos peritos na técnica e variará com a composição utilizada para o tratamento, a finalidade do tratamento, a condição de saúde ou o estágio da doença do indivíduo que será tratado e a célula ou o tecido alvo. Exemplos não limitantes de rota de administração incluem intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intratecal, subventricular, epidural, intracerebral, intracerebroventricular, sub-retinal, intravítrea, intra-articular, intraocular, intraperitoneal, intrauterina, intradérmica, subcutânea, transdérmica, transmucosal e inalação.

Modos para Realização da Divulgação Vetores, Capídeos de AAV e Métodos de Preparação

[0106] É fornecido aqui um polinucleotídeo recombinante ou um vetor viral adeno-associado (“AAV”) que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da sequência polinucleotídica que codifica galactose-1-fosfato uridil transferase (“GALT”). Em um aspecto, a sequência polinucleotídica que codifica a GALT compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em um aspecto,

a sequência é pelo menos 85 % ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 com a condição de que pelo menos um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez ou mais ou todos os nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sequência polinucleotídica que codifica GALT compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:

1. Em outra modalidade, a sequência polinucleotídica codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 ou um equivalente da mesma.

[0107] Em um aspecto, o vetor é um vetor autocomplementar ou um vetor de DNA de filamento simples (ssDNA).

[0108] Em um aspecto, o AAV compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um AAV, tal como um scAAV ou um ssAAV flaqueado por duas Repetições Terminais Internas (ITRs). Estas ITRs formam grampos de cabelo na extremidade da sequência para servir como iniciadores para iniciar a síntese do segundo filamento antes que as etapas de infecção subsequentes possam começar. A síntese do segundo filamento é considerada como sendo um dos vários bloqueios para infecção eficiente. Vantagens adicionais do scAAV incluem expressão transgênica maior e prolongada in vitro e in vivo. Assim, em um aspecto, o AAV compreende ainda duas ITRs.

[0109] Exemplos não limitantes de estruturas de AAV recombinantes para criar o vetor incluem sorotipos de vetor de AAV do grupo de AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B ou AAV rh74. Em um aspecto adicional, a estrutura do vetor é um sorotipo de AAV9, um sorotipo rh74 ou um sorotipo de AAVrh74 modificado.

[0110] A sequência polinucleotídica que codifica GALT está opcionalmente ligada de forma operacional a um promotor, um elemento de controle específico para o tecido ou um promotor constitutivo. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem, por exemplo, um promotor de LTR do vírus de sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de dihidrofolato redutase, um promotor da β-actina, um promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) ou um promotor do EF1. Em um aspecto particular, o promotor da β-actina é um promotor da β-actina de frango (“CBA”). Em outra modalidade, o promotor é selecionado de um promotor de CMV, um promotor de EF1a, um promotor de SV40, um promotor de PGK1 (humano ou de camundongo), um promotor de P5, um promotor de Ubc, um promotor da beta actina humana, um promotor de CAG, um promotor de TRE, um promotor de UAS, um promotor de Ac5, um promotor da polihedrina, um promotor de CaMKIIa, um promotor de Gal1, um TEF1, um promotor de GDS, um promotor de ADH1, um promotor de CaMV35S, um promotor de Ubi, um promotor de H1, um promotor de U6 ou um promotor da Alfa-1-antitripsina.

[0111] Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo ou o AAV recombinante compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um elemento intensificador. Exemplos não limitantes incluem um intensificador de CMV, WPRE e um intensificador de RSV.

[0112] Em um aspecto particular, o polinucleotídeo ou o vetor de AAV recombinante, compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, a sequência é pelo menos 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou 3 com a condição de que pelo menos um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez ou mais ou todos os nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 2 ou 3. Em um aspecto adicional, o vetor de AAV recombinante, compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:

2 ou SEQ ID NO: 3.

[0113] O polinucleotídeo ou o vetor de AAV recombinante que é descrito aqui pode compreender ainda um marcador detectável ou para purificação. Os polinucleotídeos e/ou vetores podem estar contidos na forma de composições que compreendem os vetores e um carreador, tal como um conservante ou um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0114] O fornecimento do vetor de AAV se baseia atualmente no uso da seleção de sorotipo para o direcionamento para o tecido com base no tropismo natural do vírus ou através da injeção direta nos tecidos alvos. Se o fornecimento sistêmico for necessário para atingir o benefício terapêutico máximo, então a seleção do sorotipo é a única opção disponível para o direcionamento para o tecido combinada com promotores específicos para o tecido. Assim, os vetores de AAV podem ser empacotados dentro do capsídeo com tropismo para o tecido.

[0115] Em alguns aspectos, o vetor é encapsulado em um capsídeo viral que é uma partícula do capsídeo do tipo selvagem ou modificada. Em um aspecto, a divulgação fornece proteínas do capsídeo, polinucleotídeos isolados, métodos para a preparação de proteínas do capsídeo, partículas virais recombinantes e sistemas de expressão recombinantes para a produção de partículas virais. Em uma modalidade, a proteína do capsídeo viral que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma proteína do capsídeo do tipo selvagem ou alternativamente, a proteína do capsídeo viral modificada através de substituição ou inserção de aminoácido entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAV9, AAV PHP.B ou um AAVrh74 modificado. Por exemplo, o AAV PHP.B tem um aminoácido 498 modificado da VP1 do AAV9 de asparagina para lisina para reduzir o tropismo para o fígado. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502 da VP1 do AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor rh74 normal. Também são fornecidos equivalentes destes polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam os mesmos, em que o equivalente tem pelo menos 85% ou 90% ou 95% ou 97 ou 99% de identidade de sequência com a condição de que um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais ou todos os aminoácidos e polinucleotídeos não sejam alterados partindo das sequências mutadas.

[0116] O vírus, por exemplo, AAV, pode ser empacotado utilizando um sistema de empacotamento viral tal como um sistema de empacotamento retroviral, adenoviral, de vírus herpes ou de baculovírus. Em algumas modalidades, o empacotamento é conseguido através da utilização de um vírus helper ou um plasmídeo helper e uma linhagem de células. O vírus helper ou o plasmídeo helper contém elementos e sequências que facilitam o fornecimento de materiais genéticos para dentro das células. Em outro aspecto, o plasmídeo helper ou um polinucleotídeo que compreende o plasmídeo helper está incorporado estavelmente no genoma de uma linhagem de células de empacotamento, de forma que a linhagem de células de empacotamento não requeira transfecção adicional com um plasmídeo helper.

[0117] Um plasmídeo helper pode compreender, por exemplo, pelo menos uma sequência de DNA helper viral derivada de um genoma viral incompetente em relação à replicação que codifica em trans todas as proteínas do virion necessárias para empacotar um AAV incompetente em relação à replicação e para produção de proteínas do virion capazes de empacotar o AAV incompetente em relação à replicação em altos títulos, sem a produção de AAV competente em relação à replicação. A sequência de DNA viral não possui a região que codifica o intensificador e/ou o promotor nativo da 5’ LTR viral do vírus e não possui a sequência da função psi responsável pelo empacotamento do genoma helper e a 3’ LTR, mas codifica um sítio de poliadenilação estranho, por exemplo, o sítio de poliadenilação do SV40 e um intensificador e/ou um promotor estranho que direciona a transcrição eficiente em um tipo de célula no qual a produção do vírus é desejada. O vírus é um vírus da leucemia tal como o Vírus de Leucemia Murina de Moloney (MMLV), o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou o Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV).

[0118] O intensificador e o promotor estranhos podem ser um intensificador e um promotor inicial imediato (IE) do citomegalovírus humano (HCMV), o intensificador e o promotor (região U3) do Vírus de Sarcoma Murino de Moloney (MMSV), a região U3 do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV), a região U3 do Spleen Focus Forming Virus (SFFV) ou o intensificador IE do HCMV ligado ao promotor nativo do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (MMLV). O plasmídeo helper pode consistir de duas sequências de DNA helper retrovirais codificadas por vetores de expressão com base em plasmídeo, por exemplo, quando uma primeira sequência helper contém um cDNA que codifica as proteínas gag e pol do MMLV ou do GALV ecotrópico e uma segunda sequência helper contém um cDNA que codifica a proteína env. O gene Env, que determina a faixa de hospedeiros, pode ser derivado dos genes que codificam as proteínas env do vírus da leucemia murina xenotrópico, anfotrópico, ecotrópico, politrópico (mink focus forming) ou 10A1 ou Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (proteína env do GALV, a proteína env (gp160) do Vírus da Imunodeficiência Humana, a proteína G do Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), os produtos do gene env dos tipos I e II da Leucemia de Célula T Humana (HTLV), gene do envelope quimérico derivado de combinações de um ou mais dos genes env mencionados anteriormente ou genes do envelope quiméricos que codificam o citoplasma e a transmembrana dos produtos do gene env mencionados anteriormente e um anticorpo monoclonal direcionada contra uma molécula de superfície específica sobre uma célula alvo desejada.

[0119] No processo de empacotamento, os plasmídeos helper e os plasmídeos que codificam as proteínas virais de AAV são cotransfectados de forma transitória em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, tais como células renais embrionárias humanas, por exemplo, células 293 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) para produzir sobrenadantes contendo retrovírus recombinante em altos títulos. Em outro método da invenção esta primeira população de células transfectada de forma transitória é então cocultivada com células alvos de mamífero para transduzir as células alvos com o gene estranho em altas eficiências.

Sistemas de Empacotamento

[0120] A invenção fornece ainda um sistema de empacotamento viral que compreende: o vetor que é descrito anteriormente, em que a estrutura é derivada de um plasmídeo, um vírus; um plasmídeo de empacotamento; e um plasmídeo de envelope. O plasmídeo de empacotamento contém o nucleosídeo, o capsídeo e as proteínas de matriz. Exemplos de plasmídeos de empacotamento também são descritos na literatura de patente, por exemplo, Patente U.S. Nos.

7.262.049; 6.995.258; 7.252.991 e 5.710.037, incorporadas aqui como referência. O sistema também contém um plasmídeo que codifica uma proteína do envelope pseudotipada fornecida por um plasmídeo de envelope. Os vetores virais pseudotipados consistem de partículas de vetor que carregam glicoproteínas derivadas de outros vírus envelopados ou alternativamente que contêm partes funcionais. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 7.262.049, incorporada aqui como referência. Em um aspecto preferido, o plasmídeo de envelope codifica uma proteína do envelope que não faz com que a partícula viral se ligue de forma inespecífica a uma célula ou uma população de células. A especificidade da partícula viral é conferida pelo domínio de ligação do anticorpo que é inserido na partícula. Exemplos de proteínas do envelope adequadas incluem, mas não são limitadas àquelas que contêm o domínio ZZ de Staph. aureus. A escolha da glicoproteína para uso no envelope é determinada em parte, pelo anticorpo ao qual a partícula pode ser conjugada.

[0121] Esta divulgação fornece ainda a linhagem de células de empacotamento adequada. Em um aspecto, a linhagem de células de empacotamento é a linhagem de células HEK-293. Outras linhagens de células adequadas são conhecidas na técnica, por exemplo, descritas na literatura de patente dentro das Patentes U.S. Nos. 7.070.994;

6.995.919; 6.475.786; 6.372.502; 6.365.150 e 5.591.624, cada uma incorporada aqui como referência.

[0122] Esta invenção fornece ainda um método para produção de uma partícula de AAV pseudotipada, que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da transdução de uma linhagem de células de empacotamento com o sistema viral que é descrito anteriormente, sob condições adequadas para empacotar o vetor viral. Estas condições são conhecidas na técnica e sucintamente descritas aqui. A partícula viral pseudotipada pode ser isolada do sobrenadante de células, utilizando métodos conhecidos pelos peritos na técnica, por exemplo, centrifugação. Tais partículas isoladas são adicionalmente fornecidas por esta invenção.

[0123] Esta invenção fornece ainda os polinucleotídeos e/ou as partículas virais de AAV isoladas produzidas através deste método. A partícula viral pseudotipada compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um polinucleotídeo que é descrito aqui e que codifica uma proteína GALT ou um equivalente da mesma (por exemplo, SEQ ID NO. 4 ou um equivalente da SEQ ID NO. 4 que é descrito anteriormente).

[0124] As partículas pseudotipadas isoladas podem ser conjugadas a um ou mais de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um fragmento que contém pelo menos o domínio Fc) que mantém a capacidade de se ligar a um receptor celular pré-selecionado.

[0125] Os anticorpos não são específicos para a espécie. Em outras palavras, os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais e podem ser de roedores, ovinos, humanos ou de outras espécies. Em adição, podem ser quiméricos ou humanizados.

Células Hospedeiras

[0126] Ainda adicionalmente é fornecida uma célula isolada ou uma população de células, que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de polinucleotídeos isolados, partículas virais, vetores e sistemas de empacotamento que são descritos anteriormente e incorporados aqui como referência. Em um aspecto, a célula isolada é uma linhagem de células de empacotamento.

[0127] Também é fornecida uma célula isolada ou uma população de células, que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína GALT ou um equivalente da mesma que é descrito aqui e um promotor constitutivo ou induzível que regula a expressão do ácido nucleico que codifica a GALT. Em uma modalidade, o promotor é um promotor induzível que é descrito aqui. Em outro aspecto, o promotor é um promotor constitutivo que é descrito aqui. Em um aspecto adicional, o ácido nucleico que codifica GALT compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente da SEQ ID NO.: 1 ou um equivalente da mesma. Em um aspecto, a sequência é pelo menos 85 % ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 com a condição de que pelo menos um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez ou mais ou todos os nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional, a célula isolada compreende ainda ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um ácido nucleico que codifica uma proteína ativadora da tetraciclina; e um promotor que regula a expressão da proteína ativadora da tetraciclina. Em uma modalidade, o promotor que regula a expressão da proteína ativadora da tetraciclina é um promotor constitutivo. Em uma modalidade relacionada, o promotor é um promotor da fosfoglicerato quinase (PGK) ou um promotor de CMV.

[0128] Em uma modalidade específica, a célula isolada compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de um ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 que codifica uma proteína GALT ou um equivalente biológico da mesma. Em uma modalidade relacionada, o equivalente biológico de GALT compreende um ácido nucleico que se hibridiza sob condições de alta estringência com o complemento da SEQ ID NO: 1 e codifica uma proteína GALT (por exemplo, SEQ ID NO 4). Em outra modalidade, o seu equivalente biológico compreende um ácido nucleico que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 85 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 90 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 92 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 95 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 97 % de identidade de sequência ou alternativamente pelo menos 98 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 e em um aspecto, em que pelo menos um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez ou mais ou todos os nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não são modificados partindo da SEQ ID NO: 1 (ver a FIG. 4). Em um aspecto adicional, a proteína GALT é uma proteína GALT humana do tipo selvagem.

[0129] As células isoladas descritas aqui podem ser qualquer uma de uma célula de uma espécie do grupo de: roedores, ratos, coelho, símios, bovinos, ovino, suíno, caninos, felino, animais de fazenda, animais de esporte, animais de companhia, equinos e primatas e em particular uma célula humana.

[0130] Em certas modalidades, a célula isolada que é descrita aqui compreende certo nível da proteína GALT. O nível da proteína GALT pode ser atingido através da seleção de um promotor constitutivo apropriado que produz o nível desejável de proteína ou através da utilização de um sistema induzível que regula a quantidade de proteína produzida. Estes promotores e sistemas que podem ser induzidos foram descritos anteriormente. Em uma modalidade, a célula isolada compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda adicionalmente, consiste de pelo menos aproximadamente 1 x10-7 ng, aproximadamente 3 x10-7 ng, aproximadamente 5 x10-7 ng, aproximadamente 7 x10-7 ng, aproximadamente 9 x10-7 ng, aproximadamente 1 x10-6 ng, aproximadamente 2 x10-6 ng, aproximadamente 3 x10-6 ng, aproximadamente 4 x10-6 ng, aproximadamente 6 x10-6 ng, aproximadamente 7 x10-6 ng, aproximadamente 8 x10-6 ng, aproximadamente 9 x10-6 ng, aproximadamente 10 x10-6 ng, aproximadamente 12 x10-6 ng, aproximadamente 14 x10-6 ng, aproximadamente 16 x10-6 ng, aproximadamente 18 x10-6 ng, aproximadamente 20 x10-6 ng, aproximadamente 25 x10-6 ng, aproximadamente 30 x10-6 ng, aproximadamente 35 x10-6 ng, aproximadamente 40 x10-6 ng, aproximadamente 45 x10-6 ng, aproximadamente 50 x10-6 ng, aproximadamente 55 x10-6 ng, aproximadamente 60 x10-6 ng, aproximadamente 65 x10-6 ng, aproximadamente 70 x10-6 ng, aproximadamente 75 x10-6 ng, aproximadamente 80 x10-6 ng, aproximadamente 85 x10-6 ng, aproximadamente 90 x10-6 ng, aproximadamente 95 x10-6 ng, aproximadamente 10 x10-5 ng, aproximadamente 20 x10-5 ng, aproximadamente 30 x10-5 ng, aproximadamente 40 x10-5 ng, aproximadamente 50 x10-5 ng, aproximadamente 60 x10-5 ng, aproximadamente 70 x10-5 ng, aproximadamente 80 x10-5 ng ou aproximadamente 90 x10-5 ng de proteína GALT.

Composições Terapêuticas e Métodos

[0131] Esta divulgação fornece composições e terapias com vetor com genes terapêuticos para tratar galactosemia. A galactosemia é uma doença órfã, que é causada por um defeito gênico único recessivo no gene GALT (Galactose-1-Fosfato Uridiltransferase). Ver ghr.nlm.nih.gov/gene/GALT. Esta afeta aproximadamente 1 em 45.000 recém-nascidos nos EUA. Felizmente, é detectada precocemente com um programa de verificação de recém-nascidos em toda a nação. O único tratamento é remover todas as fontes de lactose e galactose da dieta da criança. O tratamento precoce com restrição de galactose é benéfico e salva a vida nas formas graves da doença, mas geralmente há complicações em longo prazo tais como prejuízo na linguagem e cognitivo bem como danos físicos causados por toxicidades neuromusculares a neuromusculares e nos ovários resultantes dos níveis baixos da galactose contida em outros alimentos e da galactose produzida endogenamente.

[0132] Várias modalidades do vetor são descritas aqui. Em uma modalidade, o vetor fornecido aqui e o método que utiliza o vetor compreendem ou consistem essencialmente do mesmo ou consistem ainda da administração de uma quantidade eficiente do vetor viral adeno- associado (“AAV”) recombinante que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência polinucleotídica que codifica galactose-1-fosfato uridil transferase (“GALT”) que é fornecida através desta divulgação. Em um aspecto, a sequência polinucleotídica que codifica a GALT compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, a sequência é pelo menos 85 % ou 90% ou 95% ou 97% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 com a condição de que pelo menos um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez ou mais ou todos os nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não sejam modificados partindo da SEQ ID NO: 1 (ver a FIG. 4). Em outro aspecto,

a sequência polinucleotídica que codifica GALT compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a sequência polinucleotídica codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. Em um aspecto, o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV contém um gene repórter luciferase ou GFP para determinar a biodistribuição do vetor. Em outra modalidade, o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência polinucleotídica que compreende uma sequência do gene GALT de humano (por exemplo, NCBI Reference Sequence: NM_000155.3 ou NM_001258332.1), camundongo (por exemplo, NCBI Reference Sequence: NM_001302511.1 ou NM_016658.3), rato (por exemplo, NCBI Reference Sequence: NM_001013089.2), chimpanzé (por exemplo, NCBI Reference Sequence: XM_003951414.4 ou XM_001163419.6) ou outras espécies. Em outra modalidade, o polinucleotídeo e/ou o vetor de AAV compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma sequência polinucleotídica que compreende uma versão com códons otimizados do gene GALT humano (SEQ ID NO. 1 e FIG. 4). Um dos vetores de AAV é identificado como pscAAV-CB-hGALT (SEQ ID NO. 2). Em outra modalidade, o vetor de AAV é identificado como pAAV-CB-hGALT-WPREv2 (SEQ ID NO. 3). O vetor pscAAV-CB-hGALT compreende um promotor de CBA constitutivo com um íntron de SV40 pequeno controlando a versão com códons otimizados do gene GALT humano (Galactose-1-Fosfato Uridiltransferase) (SEQ ID NO. 1 e FIG. 4).

[0133] Em um aspecto, o vetor de AAV compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína GALT humana (por exemplo, SEQ ID NO. 4), uma proteína GALT de camundongo (por exemplo, NCBI Reference Sequence NP_001289440.1), uma proteína GALT de rato (por exemplo, NCBI Reference Sequence: NP_001013107.1), uma proteína GALT de chimpanzé (por exemplo, NCBI Reference Sequence: XP_003951463.1) ou uma proteína GALT de outras espécies. Em outra modalidade, o vetor de AAV compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína GALT humana (por exemplo, SEQ ID NO. 4).

[0134] Em um aspecto, AAV é um sorotipo de AAV9. Sorotipos alternativos ou vírus com capsídeo modificado também podem ser utilizados para otimizar o tropismo neuronal. Vetores alternativos incluem: um vetor do sorotipo de AAV9 modificado para maior tropismo neuronal que o AAV9 padrão, por exemplo, PHP.B que utiliza um sistema de recombinação Cre-lox para identificar vetores com direcionamento neuronal. Alternativamente, o AAV9 PHP.B tem um aminoácido 498 modificado da VP1 da Asparagina para Lisina para reduzir o tropismo para o fígado. Variantes adicionais de AAVrh74 que têm vários aminoácidos mutados podem ser utilizadas para tropismo para tecido muito amplo incluindo o cérebro.

[0135] Em um aspecto o vetor de AAV está contido dentro de uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma proteína do capsídeo viral modificada pela substituição ou pela inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. O Requerente gerou três mutantes. Um dos mutantes (AAVmut4, asparagina para lsoleucina no aminoácido 502 do capsídeo de VP1) aumenta o fornecimento gênico de forma global para todos os tecidos testados até uma eficiência de transdução 56 vezes maior (aumento entre 3 e 56 vezes dependendo do tecido). Outro mutante (AAVmut5, triptofano para arginina no aminoácido 505 do capsídeo de VP1) aumenta o fornecimento gênico para o coração quase 50 vezes em relação ao AAVrh74. Um terceiro mutante (AAVYIG591) se direciona para um receptor encontrado primariamente sobre as células satélites que são consideradas células tronco musculares apesar do tropismo para células satélites. Notavelmente, com base no conhecimento do Requerente das estruturas de cristal de AAV e da Alfa 7 beta 1 integrina para projetar AAVYIG591 acredita-se que tenha uma maior afinidade pelo músculo esquelético e menor afinidade pelo fígado.

[0136] Para não ficar limitado à teoria, o Requerente espera que serão atingidos benefícios terapêuticos para o paciente através do aumento da dose eficiente que alcança o músculo sem aumentar a dose total para o paciente. Reduzindo a dose total necessária para atingir um benefício terapêutico, menos antígenos virais são fornecidos para o paciente, resultando de forma ideal em respostas imunológicas reduzidas para o vetor e maior segurança. A manufatura do produto de fármaco para terapia gênica suficiente para conduzir testes clínicos no estágio final é um obstáculo importante no desenvolvimento adicional. A redução dos requerimentos de dose para atingir o benefício terapêutico resultará em requerimentos de manufatura reduzidos, custos reduzidos de manufatura, desenvolvimento mais rápido de testes clínicos e maior capacidade de tratar mais pacientes.

[0137] Consequentemente, esta divulgação se refere a vetores de AAV contidos dentro de proteínas do capsídeo modificadas, polinucleotídeos isolados, métodos para a preparação de proteínas do capsídeo modificadas, partículas virais recombinantes e sistemas de expressão recombinantes para a produção de partículas virais modificadas. Um aspecto da divulgação se refere a uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente de uma proteína do capsídeo viral modificada através da substituição ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAV9, AAV PHP.B ou AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502 da VP1 do AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente sobre células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG na posição de aminoácido 591 da VP1 do

AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade por Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor rh74 normal.

[0138] As estruturas do plasmídeo de dois exemplos de vetores são divulgadas aqui. O primeiro vetor contém um promotor/intensificador de CBA que controla a expressão de uma proteína de fusão repórter composta de luciferase e proteína fluorescente amarela aprimorada. Em um aspecto, as sequências da luciferase e da proteína fluorescente amarela aprimorada são deletadas. Este vetor pode ser empacotado na forma de um vírus de filamento simples dentro de um capsídeo do sorotipo de AAV9 padrão ou um capsídeo mutante. Em outro aspecto, o AAV contém um vetor autocomplementar com um promotor/intensificador de CBA que controla a expressão de um gene GALT humano com códons otimizados (SEQ ID NO 1) ou um equivalente do mesmo. Este vetor pode ser empacotado em um capsídeo do sorotipo AAV9 padrão. Este vetor pode fornecer níveis altos da proteína GALT humana. O vírus repórter luc-EYFP pode ser avaliado em relação à biodistribuição e à expressão gênica através da coloração da luciferase in vivo em vários pontos de tempo utilizando um Xenogen IVIS (ou similar) ou através da coleta dos tecidos em vários pontos de tempo e da avaliação da expressão gênica da atividade de EYFP ou luciferase. As amostras podem ser adicionalmente obtidas e a quantificação do genoma do vetor avaliada através da qPCR. A administração pode começar em animais afetados recém-nascidos (dia 1 ou 2 após o nascimento). Em um modelo com animais, os filhotes de camundongo podem receber injeção através da veia facial (ver jove.com/video/52037/intravenous-injections-in- neonatal-mice) e a biodistribuição do vetor é buscada através da expressão de GFP após 4 semanas. Os camundongos defeituosos em relação à GALT homozigotos nascidos de mães alimentadas com uma dieta com ração normal podem fornecer uma boa indicação do tropismo e da biodistribuição do vetor no modelo com camundongos nocauteados (KO).

[0139] Esta divulgação fornece ainda composições que compreendem um carreador e um ou mais de uma proteína, um polinucleotídeo, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou sistema de expressão modificado. É adicionalmente fornecido um kit que compreende um ou mais de uma proteína, um polinucleotídeo, vetor, plasmídeo, célula hospedeira ou sistema de expressão modificado e instruções para uso. As composições podem ser formuladas em relação ao modo de administração especificado.

Administração

[0140] A administração do polinucleotídeo recombinante, do vetor (por exemplo, AAV), da partícula viral ou das composições desta divulgação pode ser realizada em uma dose, de forma contínua ou intermitente ao longo de todo o curso de tratamento. A administração pode ocorrer através de qualquer modo adequado de administração, incluindo, mas não limitado a: localizada, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intratecal, subventricular, epidural, intracerebral, intracerebroventricular, sub-retinal, intravítrea, intra- articular, intraocular, intraperitoneal, intrauterina, intradérmica, subcutânea, transdérmica, transmucosal e inalação. Em uma modalidade, o vetor recombinante ou a composição é administrada através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa. Em outra modalidade, o vetor de AAV recombinante ou a composição é administrada de forma sistêmica. Em outra modalidade, o vetor de AAV recombinante ou a composição é administrada de forma parenteral através de injeção, infusão ou implantação. Em um aspecto, o vetor de AAV ou o polinucleotídeo de GALT é fornecido de forma local no fígado.

[0141] Os métodos de determinação dos meios e dosagem de administração mais eficientes são conhecidos pelos peritos na técnica e variarão com a composição utilizada para terapia, a finalidade da terapia e o indivíduo que será tratado. Administrações individuais ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e o padrão sendo selecionados pelo médico atendente. É observado que a dosagem pode sofrer impacto pela rota de administração. As formulações de dosagem e os métodos de administração dos adequados são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes destas dosagens adequadas podem ser tão baixas quanto 1E+9 genomas de vetor até tão altas quanto 1E+17 genomas de vetor por administração.

[0142] Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, o número de partículas virais (por exemplo, AAV) administradas ao indivíduo varia de aproximadamente 109 a aproximadamente 1017. Em modalidades particulares, aproximadamente 1010 a aproximadamente 1012, aproximadamente 1011 a aproximadamente 1013, aproximadamente 1011 a aproximadamente 1012, aproximadamente 1011 a aproximadamente 1014, aproximadamente 5x1011 a aproximadamente 5x1012 ou aproximadamente 1012 a aproximadamente 1013 partículas virais são administradas ao indivíduo.

[0143] Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo, a partícula viral e as composições da divulgação podem ser administrados em combinação com outros tratamentos, por exemplo, os tratamentos aprovados adequados para galactosemia e seus distúrbios ou condições associadas. Um exemplo não limitante inclui o tratamento de galactosemia com os vetores virais ou as composições desta divulgação, enquanto reduz ou elimina a lactose e/ou a galactose da dieta de um indivíduo.

[0144] O tratamento e/ou o reparo bem-sucedido é determinado quando um ou mais dos seguintes for detectado: alívio ou melhora de um ou mais de sintomas da doença, do distúrbio ou da condição do indivíduo tratado, diminuição da extensão da doença, do distúrbio ou da condição do indivíduo, estado estabilizado (isto é, sem agravamento) de uma doença, um distúrbio ou uma condição, atraso ou retardo da progressão da doença, do distúrbio ou da condição e melhora ou paliação da doença, do distúrbio ou da condição. Em algumas modalidades, o sucesso do tratamento é determinado através da detecção da presença do polinucleotídeo alvo reparado em uma ou mais células, tecidos ou órgãos isolados do indivíduo. Em algumas modalidades, o sucesso do tratamento é determinado através da detecção da presença do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo alvo reparado em uma ou mais células, tecidos ou órgãos isolados do indivíduo.

[0145] Em uma modalidade, o polinucleotídeo e/ou o vetor viral recombinante pode reparar o gene GALT em um indivíduo. Em algumas modalidades, a proporção de polinucleotídeo ou polipeptídeo alvo reparado para o polinucleotídeo ou o polipeptídeo alvo não reparado em uma célula, um tecido, um órgão ou um indivíduo tratado de forma bem- sucedida é de aproximadamente 1,5:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 1000:1, aproximadamente 10.000:1, aproximadamente 100.000:1 ou aproximadamente 1.000.000: 1. A quantidade ou a proporção de polinucleotídeo ou polipeptídeo alvo reparado pode ser determinada através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a Western blot, Northern blot, Southern blot, PCR, sequenciamento, espectrometria de massa, citometria de fluxo, imunohistoquímica, imunofluorescência, hibridização in situ com fluorescência, sequenciamento de última geração, immunoblot e ELISA.

Kits

[0146] Os polinucleotídeos, os agentes, os vetores ou as composições descritas aqui podem, em algumas modalidades, ser reunidas em kits farmacêuticos ou para diagnósticos ou pesquisa para facilitar seu uso nas aplicações terapêuticas, para diagnóstico ou pesquisa. Em algumas modalidades, os kits da presente divulgação incluem um ou mais de: proteínas do capsídeo viral modificadas,

polinucleotídeos isolados, vetores, células hospedeiras, partículas virais recombinantes, sistemas de expressão recombinantes, AAV modificado, células modificadas, tecidos isolados, composições ou composições farmacêuticas que são descritas aqui.

[0147] Em algumas modalidades, um kit compreende ainda instruções para uso. Especificamente, estes kits podem incluir uma ou mais agentes descritos aqui, junto com instruções que descrevem a aplicação pretendida e o uso apropriado destes agentes. Como um exemplo, em uma modalidade, o kit pode incluir instruções para misturar um ou mais componentes do kit e/ou isolar e misturar uma amostra e aplicar a um indivíduo. Em certas modalidades, os agentes em um kit são uma formulação farmacêutica e uma dosagem adequadas para uma aplicação particular e para um método de administração dos agentes. Os kits com a finalidade de pesquisa podem conter os componentes em concentrações ou quantidades apropriadas para a realização de vários experimentos.

[0148] O kit pode ser projetado para facilitar o uso dos métodos descritos aqui e pode ter várias formas. Cada uma das composições do kit, quando aplicável, pode ser fornecida na forma líquida (por exemplo, em solução) ou na forma sólida, (por exemplo, um pó seco). Em certos casos, algumas das composições podem ser reconstituíveis ou de outra maneira processáveis (por exemplo, em uma forma ativa), por exemplo, através da adição de um solvente adequado ou outro tipo (por exemplo, água ou uma célula meio de cultura), que pode ou não ser fornecido com o kit. Em algumas modalidades, as composições podem ser fornecidas em uma solução de preservação (por exemplo, solução de criopreservação). Exemplos não limitantes de soluções de preservação incluem DMSO, paraformaldeído e CryoStor® (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Em algumas modalidades, a solução de preservação contém uma quantidade de inibidores de metaloprotease.

[0149] Como utilizado aqui, “instruções” podem definir um componente de instrução e/ou promoção e envolvem tipicamente instruções por escrito sobre ou associadas à embalagem dos métodos reivindicados, vetores recombinantes ou composições. As instruções também podem incluir quaisquer instruções orais ou eletrônicas fornecidas de qualquer modo de forma que o usuário reconheça claramente que as instruções devem ser associadas ao kit, por exemplo, comunicações audiovisuais (por exemplo, videoteipe, DVD etc.), da internet e/ou com base na web etc. Em algumas modalidades, as instruções por escrito estão em um documento prescrito por uma agência governamental que regula a manufatura, o uso ou a venda dos agentes farmacêuticos ou dos produtos biológicos, cujas instruções também podem refletir a aprovação pela agência da manufatura, do uso ou da venda para administração em animais.

[0150] Em algumas modalidades, o kit contém qualquer um ou mais dos componentes descritos aqui em um ou mais recipientes. Assim, em algumas modalidades, o kit pode incluir um recipiente que contém os agentes descritos aqui. Os agentes podem estar na forma de um líquido, um gel ou um sólido (pó). Os agentes podem ser preparados de forma esterilizada, embalados em seringa e transportados refrigerados. Alternativamente, podem estar contidos em um frasco ou outro recipiente para armazenamento. Um segundo recipiente pode ter outros agentes preparados de forma esterilizada. Alternativamente, o kit pode incluir os agentes ativos pré-misturados e transportados em uma seringa, um frasco, um tubo ou outro recipiente. O kit pode ter um ou mais ou todos os componentes necessários para administrar os agentes a um indivíduo, tal como uma seringa, dispositivos de aplicação tópica ou tubulação e bolsa com agulha IV.

[0151] As terapias que são descritas aqui podem ser combinadas com técnicas de diagnóstico apropriadas para identificar e selecionar pacientes para a terapia. Por exemplo, pode ser fornecido um teste genético para identificar uma mutação em um gene GALT. Assim, os pacientes que carregam uma mutação podem ser identificados como adequados para terapia.

Exemplos Administração In Vitro

[0152] As partículas virais são produzidas através do método de transfecção tripla padronizado utilizando plasmídeos para o genoma do vetor, os genes rep e cap do AAV e um plasmídeo helper Ad que fornece as funções de Adenovírus helper necessárias ao produto de AAV. Estes três plasmídeos são transfectados em células HEK293 crescidas em suspensão livre de soro utilizando PEI. Quatro dias após a transfecção os vírus são coletados e purificados através de métodos padronizados. As doses eficazes variam em 1012 a 1014 Vg/kg se fornecidas de forma intravenosa com base em modelos de doenças e sorotipos similares. O AAVmut4 compreende modificações nas regiões envolvidas na ligação específica para o fígado que fornecem ao vírus um tropismo mais amplo para outros tecidos alvos incluindo o SNC e músculos.

[0153] O plasmídeo pAAV-CB-GALT-WPRE-kan (FIG. 1) foi transfectado em células HEK293 através de transfecção transitória e dois dias depois as células foram lisadas e as proteínas coletadas foram corridas em um gel de acrilamida, transferidas para membrana de nylon e tratadas com sonda com um anticorpo anti-GALT humana seguido por um anticorpo secundário marcado com corante IR para detecção. Como mostrado na FIG. 3, faixa 1 está um marcador de peso molecular com tamanhos indicados no eixo Y. A faixa 2 é 1 µL de lisado de células transfectadas com GALT, a faixa 3 é 0,1 µL de lisado de células transfectadas com GALT, a faixa 4 é 5 µL de lisado de células HEK293 transfectadas com um plasmídeo com lucEYFP repórter utilizado com um controle de transfecção e de célula que também exibe uma quantidade baixa de proteína GALT humana nativa expressa de forma endógena, a faixa 5 está vazia, a faixa 6 é um lisado de células HepG2 que exibe proteína GALT humana nativa, a faixa 7 está vazia, as faixas 8-10 mostram concentrações crescentes de um padrão de proteína GALT expressa por bactéria com mobilidade ligeiramente maior devido à marcação utilizada para purificação.

Administração In Vivo

[0154] A abordagem de terapia gênica com GALT que é divulgada aqui é altamente inovadora porque, em primeiro lugar, não há terapia à base de gene mediada por AAV ou qualquer terapia à base de gene aprovada para o tratamento das complicações em longo prazo associadas à Galactosemia Clássica. Em segundo lugar, em adição à tecnologia, a terapia divulgada pode utilizar fornecimento gênico localizado para o fígado para normalizar o metabolismo da galactose aberrante em órgãos distantes.

[0155] Um novo modelo com camundongos com o gene GALT capturado (deficiente em relação a GalT) foi utilizado como descrito em Tang, M. et al. Eur. J. Hum. Genet, (2014):1172-1179. Utilizando um procedimento de LC-MS/MS (Li, Y. et al., Mol. Genet. Metab. (2011) 102(1):33-40, a ausência total da atividade de GALT foi confirmada nos camundongos com o gene GalT capturado homozigotos. A caracterização adicional dos camundongos com o gene GalT capturado homozigotos revelou sensibilidade à galactose nos filhotes deficientes em relação ao GalT recém-nascidos, fertilidade reduzida nas fêmeas adultas, funções motoras prejudicadas e restrição de crescimento em nos camundongos deficientes em relação a GALT de ambos os sexos (Tang, et al. (2014), supra; Balakrishnan, B. et al. (2016) 470(1):205-212; Chen et al. (2017) J. Inherit. Metab. Dis. 40(1):131-137).

[0156] Como mostrado na FIG. 6, a transdução de vetores AAV9- GALT (ver as FIGs. 1 e 2) nas linhagens de células HEK293 levou à produção de proteína GALT abundante. A expressão da proteína GALT pode ser modificada através da substituição do promotor/intensificador de CBA forte por um promotor que produzirá a proteína GALT próxima aos níveis fisiológicos quando necessário.

[0157] Biodistribuição: Foi estabelecido que o vetor de AAV9 tem ampla biodistribuição, que inclui o sistema nervoso central (SNC), enquanto que o AAV8 primariamente se direciona para o fígado nos camundongos. Assim, a administração de GALT e GALT com códons otimizados pode ocorrer com um vetor de AAV8. O fornecimento do vetor através do sistema vascular de camundongos do tipo selvagem e deficientes em relação a GALT de 4 semanas de idade pode avaliar quaisquer diferenças na biodistribuição entre os dois grupos. Como um assunto inicial, 1 E+12 Vg de cada vetor de AAV expressando a construção repórter de lucEYFP através da veia caudal em camundongos machos e fêmeas (N=5 por sexo por grupo, N com base nas diretrizes da FDA para estudos de toxicidade/biodistribuição como mostrado no documento intitulado “Guidance for Industry: Gene Therapy Clinical Trials – Observing Subjects for Delayed Adverse Events”) são utilizados. São obtidas imagens semanais dos camundongos durante 4 semanas antes do sacrifício. Os controles são animais com idade e sexo correspondentes injetados com vetores sem o inserto do gene GALT. Após 4 semanas, os animais são sacrificados e recebem perfusão com fixador e o cérebro, o coração, os rins, o fígado, os olhos e as gônadas são isolados. Os tecidos são cortados em seções para coloração com EYFP microscopicamente, enquanto que uma parte de cada tecido será utilizada para determinação por qPCR de genomas do vetor por micrograma de DNA genômico. Em outra administração controlada, os camundongos são desafiados com 10% e 20% de galactose em suas dietas.

[0158] Estudos de Dosagem: Separadamente, camundongos machos e fêmeas deficientes em relação a GalT de 4 semanas de idade são injetados IV com uma de três doses diferentes do vetor AAV9- GALT (ou AAV8-GALT) a 1E+10, 1E+11 ou 1E+12 vg, respectivamente por camundongo, 12 camundongos por grupo (N=6 por sexo por grupo), mais o grupo de controle com vetor vazio injetado do sorotipo selecionado. Os animais são monitorados durante até 6 meses e examinados em relação ao aprimoramento potencial na coordenação motora e aptidão reprodutiva. Os animais também são monitorados e avaliados em relação a quaisquer efeitos fisiológicos adversos evidentes do tratamento, tal como perda de peso ou inatividade.

[0159] Análise Comportamental: Os camundongos (n=12 por grupo) são testados em relação ao desempenho comportamental aos 6 meses de idade, para quantificar o impacto funcional do tratamento sobre os transtornos neurológicos. Os testes comportamentais incluem capacidade cognitiva e de natação no labirinto de água de Morris e função motora em uma barra rotatória. Para determinar os danos motores relacionados à ataxia dos camundongos, será utilizada uma barra rotatória modificada para encorajar o animal a caminhar ao longo da barra alternando os membros, ao invés de passivamente utilizando seu corpo para suporte. A velocidade é gradualmente aumentada para 6 RPM ao longo de dois minutos com a finalidade de treinamento. Após o repouso durante dois minutos, os camundongos são testados a 6 RPM ao longo de um máximo de dois minutos (menor tempo se o animal não passar no teste). O teste pode ser repetido a 12 RPM para cada camundongo para maior comparação do desafio com camundongos normais do tipo selvagem (WT). Cada camundongo é testado três vezes a cada velocidade após um período de repouso de cinco minutos. No final de 6 meses, todos os camundongos são submetidos à eutanásia e avaliados em relação à expressão do gene GALT por Western e ao conteúdo do genoma do vetor por qPCR em várias regiões do cérebro e outros tecidos junto com a histologia com H&E por patologistas certificados pela comissão para patologia.

[0160] Avaliação da fertilidade em fêmeas de camundongos: A aptidão reprodutiva das fêmeas de camundongos é avaliada através da monitoração de seu ciclo de cio em intervalos de tempo regulares e da realização da contagem de folículos no final de seis meses. Quaisquer sinais de normalização do ciclo do cio e a contagem de folículos são por si só indicadores suficientemente bons para maior fertilidade nestes animais.

Equivalentes

[0161] Deve ser entendido, embora a invenção tenha sido descrita em associação às modalidades anteriores, que é pretendido que a descrição e os exemplos anteriores ilustrem e não limitem o âmbito da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do âmbito da invenção serão evidentes para os peritos na técnica à qual a invenção pertence.

[0162] Em adição, quando as características ou os aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, os peritos na técnica reconhecerão que a invenção também é descrita aqui em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[0163] Todas as publicações técnicas e de patentes referidas aqui são incorporadas aqui como referência.

Referências

1. Fang, H., et al., Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods,

2012. 23(4): p. 234-41.

2. Bianconi, E., et al., An estimation of the number of cells in the human body. Ann Hum Biol, 2013. 40(6): p. 463-71.

3. Tran, T., et al., Laminin drives survival signals to promote a contractile smooth muscle phenotype and airway hyperreactivity. FASEB J, 2013. 27(10): p. 3991-4003.

4. Mori, S., et al., Biodistribution of a low dose of intravenously administered AAV-2, 10, and 11 vectors to cynomolgus monkeys. Jpn J Infect Dis, 2006. 59(5): p. 285-93.

5. Grimm, D., et al., In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol, 2008. 82(12): p. 5887-911.

6. Asokan, A., et al., Reengineering a receptor footprint of adeno- associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol, 2010. 28(1): p. 79-82.

7. Pulicherla, N., et al., Engineering liver-detargeted AAV9 vectors for cardiac and musculoskeletal gene transfer. Mol Ther, 2011. 19(6): p. 1070-8.

8. DiMattia, M.A., et al., Structural insight into the unique properties of adeno-associated virus serotype 9. J Virol, 2012. 86(12): p. 6947-58.

9. Li, C., et al., Single amino acid modification of adeno-associated virus capsid changes transduction and humoral immune profiles. J Virol,

2012. 86(15): p. 7752-9.

10. Raupp, C., et al., The threefold protrusions of adeno-associated virus type 8 are involved in cell surface targeting as well as postattachment processing. J Virol, 2012. 86(17): p. 9396-408.

11. Govindasamy, L., et al., Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol, 2013. 87(20): p. 11187-99.

12. Bentzinger, C.F., et al., Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep, 2013. 14(12): p. 1062-72.

13. Wang, Y.X., N.A. Dumont, and M.A. Rudnicki, Muscle stem cells at a glance. J Cell Sci, 2014. 127(21): p. 4543-8.

14. Loiler, S.A., et al., Targeting recombinant adeno-associated virus vectors to enhance gene transfer to pancreatic islets and liver. Gene Ther,

2003. 10(18): p. 1551-8.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo Isolado, que compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou um equivalente de cada uma das mesmas, caracterizado por que opcionalmente pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem deixam de ser modificados partindo de sua sequência do tipo selvagem correspondente.

2. Polinucleotídeo Isolado, caracterizado por que codifica o aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou um aminoácido pelo menos 85% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou um equivalente da mesma.

3. Polinucleotídeo, caracterizado por que compreende o complemento do polinucleotídeo, conforme definido na Reivindicação 1 ou 2.

4. Polinucleotídeo, compreendendo o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou um equivalente da mesma, caracterizado por que opcionalmente pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem deixam de ser modificados partindo da SEQ ID NO: 1.

5. Vetor, caracterizado por que compreende o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 2 a 4.

6. Vetor, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que compreende ainda um promotor e/ou um elemento intensificador.

7. Polinucleotídeo Isolado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, ou Vetor, de acordo com a Reivindicação 5 ou 6, caracterizado por que compreende ainda uma marcação.

8. Vetor, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que o vetor é um vetor de AAV.

9. Vetor, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que compreende ainda um polinucleotídeo que codifica uma proteína do capsídeo.

10. Vetor, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que a proteína do capsídeo é uma proteína do capsídeo do tipo selvagem ou uma proteína do capsídeo mutada.

11. Célula Isolada, caracterizada por que compreende o polinucleotídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 5 a 10.

12. Vetor de AAV Recombinante, caracterizado por que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica galactose-1-fosfato uridil transferase (“GALT”).

13. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que a sequência polinucleotídica que codifica a GALT compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 1 e opcionalmente em que pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não são modificados partindo da SEQ ID NO: 1.

14. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que a sequência polinucleotídica que codifica GALT compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1.

15. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 12 a 14, caracterizado por que o vetor é do sorotipo AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B ou AAV rh74.

16. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com qualquer uma das

Reivindicações de 12 a 14, caracterizado por que o vetor é de AAV9, rh74, um rh74 mutado ou AAV PHP.B.

17. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 12 a 16, caracterizado por que o vetor está ligado de forma operacional a um promotor, um elemento de controle específico para o tecido ou um promotor constitutivo.

18. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que o promotor constitutivo compreende um promotor de LTR do vírus de sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de dihidrofolato redutase, um promotor da β-actina, um promotor da fosfoglicerol quinase (PGK), um promotor de U6 ou um promotor do EF1.

19. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o promotor da β-actina é um promotor da β-actina de frango (“CBA”).

20. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, que compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, caracterizado por que opcionalmente pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem não são modificados partindo da SEQ ID NO:

2.

21. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2.

22. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, que compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 3, caracterizado por que opcionalmente pelo menos um ou mais dos nucleotídeos que foram modificados partindo da sequência do tipo selvagem deixam de ser modificados partindo da SEQ ID NO: 3.

23. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 3.

24. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 12 a 17, caracterizado por que a sequência polinucleotídica que codifica a enzima GALT codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

25. Vetor de AAV Recombinante, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 12 a 24, caracterizado por que compreende ainda um marcador detectável ou para purificação.

26. Partícula Viral, caracterizada por que compreende o vetor de AAV, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 12 a 24, e uma ou mais proteínas do capsídeo.

27. Partícula Viral, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizada por que as proteínas do capsídeo compreendem pelo menos uma proteína do capsídeo do tipo selvagem.

28. Partícula Viral, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizada por que as proteínas do capsídeo compreendem pelo menos uma proteína que ocorre não naturalmente ou mutada.

29. Partícula Viral, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizada por que as proteínas do capsídeo compreendem pelo menos uma proteína do capsídeo do tipo selvagem e pelo menos uma proteína do capsídeo mutada.

30. Partícula Viral, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizada por que as proteínas do capsídeo compreendem uma proteína VP1 do capsídeo do AAVrh74 modificada que compreende uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo de uma substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502 e uma substituição opcional de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74.

31. Polinucleotídeo, caracterizado por que codifica uma proteína VP1 do capsídeo do AAVrh74 modificada que compreende uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo de uma substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502, uma substituição de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74 ou um equivalente da mesma ou um polinucleotídeo que é pelo menos 85% idêntico com a condição de que uma ou mais modificações sejam idênticas aos aminoácidos na proteína do capsídeo VP1 do AAVrh74 modificada.

32. Proteína VP1 de Capsídeo de AAVrh74 Modificada, caracterizada por que compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo de uma substituição de isoleucina por asparagina na posição de aminoácido 502, uma substituição de triptofano por arginina no aminoácido 505 da VP1 do AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG na posição de aminoácido 591 da VP1 do AAVrh74 ou um equivalente da mesma ou um polinucleotídeo que é pelo menos 85% idêntico com a condição de que uma ou mais modificações sejam idênticas aos aminoácidos na proteína do capsídeo VP1 do AAVrh74 modificada.

33. Complemento, caracterizado por que é de polinucleotídeo, conforme definido na Reivindicação 31.

34. Composição, caracterizada por que compreende o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 14, 31 ou 33, a proteína do capsídeo, conforme definida na Reivindicação 32, e/ou a partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19, e um carreador, opcionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

35. Método Para Introduzir Enzima GALT Funcional em Célula, caracterizado por que compreende o contato da célula com o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, 31 ou 33, a proteína do capsídeo, conforme definida na Reivindicação 32, a composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou a partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19.

36. Método Para Introduzir Enzima GALT Funcional em Célula, de acordo com a Reivindicação 35, caracterizado por que o contato ocorre ex vivo ou in vivo.

37. Método Para Tratar Galactosemia em Indivíduo em Necessidade do Mesmo, caracterizado por que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente do polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, ou da composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou da partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19.

38. Método de Aumento do Metabolismo da Galactose em Indivíduo que Sofre de Galactosemia, caracterizado por que compreende a administração ao indivíduo do polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, ou da composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou da partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19.

39. Método de Redução de Condição de Doença em Indivíduo que Sofre de Galactosemia, compreendendo a administração ao indivíduo do polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, da composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou da partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19, caracterizado por que a condição de doença é selecionada a partir de icterícia, hepatoesplenomegalia, insuficiência hepatocelular, hipoglicemia, disfunção tubular renal, hipotonia muscular, septicemia, catarata, ataxia, tremor, densidade óssea reduzida ou insuficiência ovariana primária.

40. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 37 a 39, caracterizado por que a galactosemia é uma galactosemia do tipo 1.

41. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 37 a 40, caracterizado por que o indivíduo é um mamífero.

42. Método, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que o indivíduo é um humano.

43. Método, de acordo com a Reivindicação 42, caracterizado por que o indivíduo é um humano recém-nascido.

44. Método, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o humano recém-nascido foi selecionado para administração através de testagem genética em relação à falta de expressão de um gene GALT funcional.

45. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 37 a 44, caracterizado por que a administração ocorre através de injeção intramuscular, fornecimento localizado para o fígado ou injeção intravenosa.

46. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 37 a 44,

caracterizado por que a administração compreende administração sistêmica.

47. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 37 a 44, caracterizado por que a administração compreende fornecimento localizado para o fígado.

48. Kit, caracterizado por que compreende um ou mais de: o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, 31 ou 33, o capsídeo, conforme definido na Reivindicação 32, a composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou a partícula viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19, e instruções para uso.

49. Célula Hospedeira, caracterizada por que compreende o vetor de AAV recombinante, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13.

50. Célula Hospedeira, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizada por que a célula é uma célula procariótica ou eucariótica.

51. Célula Hospedeira, de acordo com a Reivindicação 50, caracterizada por que a célula é uma célula de empacotamento.

52. Sistema de Empacotamento de AAV, caracterizado por que compreende o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13, 31 ou 33, e uma linhagem de célula helper.

53. Uso de Polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 13 ou de 31 a 33, ou Composição, conforme definida na Reivindicação 14, ou Vetor, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 14 a 26, ou Partícula Viral, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 15 a 19 ou de 26 a 30, caracterizado por que é no fabrico de um medicamento para tratar galactosemia num indivíduo em necessidade do mesmo, conforme definido na Reivindicação 37, para aumentar o metabolismo da galactose num indivíduo que sofre de galactosemia, conforme definido na Reivindicação 38, ou para reduzir uma condição de doença num indivíduo que sofre de galactosemia, conforme definido na Reivindicação 39 ou suas dependentes de 40 a 47.