CN107982548A - 核酸输送的区室化方法及其组合物和应用 - Google Patents

核酸输送的区室化方法及其组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供将核酸分子输送至对象的区室化组织或器官的方法。本发明还提供输送核酸分子至区室化组织或器官的实质的应用和方法。所述方法和应用可用于治疗疾病和病症中，及用于工业、农业和兽医应用中。本发明还提供配制为用于施用组织或器官的实质的含有腺病毒或腺伴随病毒或其它重组病毒的组合物。

Description

核酸输送的区室化方法及其组合物和应用
本发明是申请日为2013年2月7日，申请号为201380018970.8，标题为“核酸输送的区室化方法及其组合物和应用”的专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2012年2月7日提交的发明名称为“Compartmentalized Method ofNucleic Acid Delivery and Compositions and Uses Thereof”的美国临时申请号61/633,287的优先权。
本申请与同日申请的发明名称为“Compartmentalized Method of Nucleic AcidDelivery and Compositions and Uses Thereof”的美国专利申请系列号(AttorneyDocket No.33809.00551.US01/551)相关，该申请要求美国临时申请号61/633,287的优先权。
当允许时，每个上述相关申请的主题全文引入本申请。
通过援引并入电子序列表
在此提交电子序列表，其内容全文引入本申请。电子文件于2013年2月7日创建，大小为3kb，命名为551seqPC1.txt。
发明领域
本发明提供了给对象的区室化组织或器官(compartmentalized tissue ororgan)输送核酸分子的方法。本发明还提供了应用输送核酸分子至区室化组织或器官的实质(parenchyma)的应用和方法。所述方法和应用可以用于治疗疾病和病症及用于工业、农业和兽医应用。本发明还提供了配制用于给予组织或器官的实质的含有腺病毒或腺伴随病毒或其它重组病毒的组合物。
背景技术
基因治疗是一种治疗方法，通过该方法核酸分子被给予对象以补充或改变个体内的基因。特别地，基因治疗用于治疗疾病的目的。基因治疗被认为对于治疗由于基因突变或缺失导致的遗传疾病是基础性的。已经尝试了将编码蛋白质的基因导入需要治疗的对象中的多种方法，但是获得满意疗效的例子很少。因此，需要替代方法将核酸分子输送给对象用于基因治疗应用。
发明概述
本发明提供给对象输送核酸分子的方法。所述方法可以用于基因治疗应用中，包括治疗疾病和病症的应用以及工业、农业和兽医应用。如本发明所述，所述方法包括a)区室化组织或器官或者组织或器官的部分以使之与宿主体循环隔离；以及b)将被输送物质直接施用至所述组织或器官或者组织或器官的部分的实质，其中被输送物质包含核酸分子，所述被输送物质进入区室化组织或器官或者组织或器官的部分的实质细胞。区室化组织或器官或者组织或器官的部分是在给予被输送物质之前、同时或者之后进行。通常，组织或器官或者组织或器官的部分的区室化是在给予被输送物质之前开始，并且典型在输送含有核酸分子的被输送物质之前不超过5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟或30秒。
所提供的方法可以进一步包括恢复组织或器官或者组织或器官的部分与体循环之间的连通的步骤。恢复连通的步骤通常是在给予被输送物质之后预定时间。所述预定时间是足以使给予的被输送物质进入实质细胞(例如通过转导)的时间，由此在恢复连通时不超过20％的被输送物质未进入实质细胞。例如，不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的被输送物质未进入实质细胞。在一些实施例中，所述预定时间是足以使给予的被输送物质进入实质细胞的时间，由此在恢复连通时不超过20％的被输送物质暴露于体循环。例如，不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、或5％的被输送物质暴露于体循环。典型地，在本发明方法中，预定时间是至少或至少大约1、2、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟。在特定实施例中，预定时间是至少或至少大约30分钟或者是或大约是30分钟，通常不超过30分钟至60分钟。
在本发明方法中，区室化的组织或器官或者组织或器官的部分是肝、脑脊髓、胰腺、心脏、皮肤、肾、肺、血管、骨骼、肌肉、子宫、子宫颈、前列腺、尿道和肠。在特定实施例中，,组织或器官或者组织或器官的部分是肝。例如，在本发明方法的实施例中，组织或器官或者组织或器官的部分是肝，预定时间是至少或至少大约30分钟或者是或大约是30分钟，通常不超过30分钟至60分钟。在这种实施例中，预定时间是足以使基本上全部被输送物质、通常至少80％被输送物质进入肝实质的肝细胞的时间。在本发明方法的实施例中，组织或器官的部分被区室化。例如肝的部分被区室化，所述部分是肝叶、区段或者肝叶或区段的部分。肝叶或肝叶部分可以是右叶、左叶、方叶和尾状叶或其部分。
在本申请描述的任何方法中，区室化组织或器官或者组织或器官的部分是通过阻断组织或器官或者组织或器官的部分中的任一或多个动脉、静脉、导管(duct)和/或脉管(vessel)而实现，由此向组织或器官或者其部分的血液供应和流动被降低或消除。通常，区室化是当供应或通过待被区室化的组织或器官或者组织或器官的部分的全部动脉、静脉、导管和/或脉管被阻断时实现的。阻断动脉、静脉、导管和/或脉管是通过使用选自如下的装置或技术进行：手动压缩(manual compression)、实质钳(parenchymal clamp)、动脉或静脉钳、闭塞导管(occlusion catheter)、缝合装置、绷带、止血带和线(cable)。通常，在本发明方法中，组织或器官或者组织或器官的部分是通过用实质钳钳紧而区室化。所述钳可以是腹腔镜钳。在本发明任一方法中，与体循环隔开的组织或器官区室化也可以包括进行抽吸以降低或消除在组织或器官或其部分中的血液。
在本发明提供的任一方法中，被输送物质可以是包含核酸分子的非病毒载体、病毒、病毒样颗粒、小环(minicircle)、纳米粒子和全细胞。在一个实施例中，被输送物质是非病毒载体，所述非病毒载体是表达载体。在另一个实施例中，被输送物质是纳米粒子，所述纳米粒子是靶向或放射性标记的。在进一步的实施例中，被输送物质是病毒。在被输送物质是病毒的本发明实施例中，病毒可以是腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。例如，病毒可以是逆转录病毒，其是慢病毒。病毒通常是含有核酸分子的重组病毒，所述核酸分子对于病毒基因组是异源的。病毒可以复制缺陷病毒。病毒可以是在对象细胞核中复制的病毒。病毒也包括感染不分裂细胞如肝细胞的病毒。在一些实施例中，所述方法可以包括刺激细胞分裂的步骤。在本发明特定实施例中，例如当肝是实施所述方法的靶器官时，病毒是显示肝嗜性并且可以进入肝细胞的病毒。
例如，在本发明提供方法的实施例中，病毒是在基因组中含有异源核酸的腺病毒，其被给予区室化的组织或器官或者组织或器官的部分。腺病毒可以是任何血清型，如血清型1至血清型51(例如1,2,4,5…51)。例如，腺病毒是腺病毒2型或腺病毒5型。本发明方法中使用的任何腺病毒包括在E1、E2a、E2b、E3或E4编码区的任一或多个中具有缺失的腺病毒。例如，腺病毒含有在E1编码区中的缺失。病毒含有核酸分子作为本发明方法中的被输送物质。
在本发明任一方法中，被输送物质含有被输送至对象用于基因治疗的核酸分子。在一些实施例中，所述核酸分子编码多肽。编码的多肽可以是治疗性多肽。例如，编码的多肽可以是酶、激素、凝血因子(coagulation or clotting factor)、生长因子、抗体或抗体部分、血管发生调节剂、免疫调节剂、疼痛调节剂、受体、转运蛋白、调节蛋白、抗原和变应原。特别地，编码的多肽可以是白介素、干扰素、生长因子或其部分、生长因子受体或其部分。举例的核酸分子包括但不限于编码下述物质的核酸分子：腺苷脱氨酶、囊性纤维化跨膜传导调节物(CTFR)、加硫酶(galsulfase)、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、苯丙氨酸氨裂合酶、酸性α葡糖苷酶、伊米苷酶、阿葡糖苷酶α、促甲状腺素、生长激素、胰岛素、甲状腺激素、促红细胞生成素(EPO)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-12、IL-18、fms相关酪氨酸激酶3(flt3)、neuropilin-2(NP2)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α或β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、FGFR拮抗剂(sFGFR)、转化生长因子受体(TGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、纤溶酶原激活物、尿激酶、因子VIII、因子IX、von Willebrand因子、生长激素、金属蛋白酶凝血酶敏感蛋白基序1(METH-1)、METH-2、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)片段、增殖蛋白相关蛋白、促乳素片段、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管抑制因子(vasostatin)、血管抑素、内皮抑素、激肽原、纤维蛋白原-E片段、凝血酶敏感蛋白、tumstatin、canstatin、网状内皮系统刺激素(restin)、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、可溶性血管内皮生长因子受体(sFlk)、可溶性Neuropilin 1(sNRP1)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、血小板因子4(PF-4)、Gro-β、可溶性Ephrin B型受体4(sEphB4)、sephrinB2、IGF-1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护性蛋白/组织蛋白酶A、酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷脂酶、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-Iduronidase)、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、Niemann-Pick病C1型(NPC-1)、β-氨基己糖苷酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)、Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、酸性脂酶、肾胰岛素残基溶酶(neprilysin)、胰岛素降解酶胰岛素溶酶、thimet寡肽酶、钙结合蛋白D28、小白蛋白、低氧诱导因子1-α(HIF1-α)、sirtuin-2(SIRT-2)、活运动神经元蛋白-1(SMN-1)、SMN-2、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、脂蛋白脂酶(LPL)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)、UGT1A1、葡萄糖-6磷酸酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、生物素酶(biotinidase)、β-葡糖脑苷脂酶、β-gluronidase、胆色素原脱氨酶(PBDG)或p53。
在其它实施例中，编码的多肽可以是参与工业、兽医或农业应用的多肽。例如，所述核酸分子可以编码增加动物中肌肉产生、增加动物中毛发生长、增加动物中毛(wool)的产生、增加动物生长或者参与营养素合成或利用的多肽。在这种实施例中，编码的多肽可以是肌肉生长抑制素抑制剂、生长激素、IGF-1、生长激素释放因子、鸡Ski、丝氨酸转乙酰酶或o-乙酰丝氨酸硫化氢解酶。所述肌肉生长抑制素抑制剂可以是卵泡抑素。
在本发明提供的方法的实施例中，核酸分子可以是DNA分子、RNA分子和适体。例如，核酸分子可以是microRNA、小干扰RNA、核酶和反义核酸。这种核酸分子也可以在对象中实现治疗作用，因此是治疗性核酸分子。
在本发明提供的任一方法中，所述方法还可以任选包括在给予被输送物质之前成像组织或器官以鉴别实质组织的步骤。这种方法可以用于将被输送物质和核酸分子最小化给予导管、动脉或脉管的内腔。例如可以进行磁共振成像(MRI)、超声波检查(超声)或者计算机断层扫描(CT)。在特定实施例中，多普勒超声扫描可以用于本发明实践。
另外，在本发明任一方法的实践中，可以使用技术、方法和试剂以促进或增加被输送物质输送到组织或器官的实质细胞的效率。例如，被输送物质可以与脂质、聚合物试剂或其它物质配制以促进进入实质细胞。另外或者替代地，被输送物质可以在物理方法存在下输送以促进进入实质细胞，如电穿孔、超声穿孔、压力、超声或“基因枪”。
在本发明任一方法的进一步实施例中，可以给予对象促进被输送物质的细胞摄入的物质。所述物质可以在给予被输送物质之前、同时或之后给予。在一些实施例中，所述物质是病毒特异性细胞表面受体的转录增强子。例如，所述物质是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。举例的HDAC抑制剂包括但不限于trischostatin A、伏立诺他(vorinostat，SAHA)、belionostat(PXD101)、LAQ824、帕比司他(panobinostat，LBH589)、恩替诺特(entinostat，MS-275)、C199、mocetinostat(MGCD0103)、罗米地辛(romidepsin，Istodax)、丙戊酸、PCI-24781、SB939、resminostat、givinostat、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、Kevetrin和trichostatin A(TSA)。
在本发明方法实践中，将被输送物质输送至区室化组织是指可以给予更低剂量物质，其可以被进一步控制，因为被给予物质和表达的蛋白的动力学是线性的。这与主要是静脉内输送的现有基因治疗方法相反。例如，由本发明方法给予的物质的量比静脉内给予的相同被输送物质的量低100倍以上。例如，被输送物质的量比静脉内给予的相同被输送物质的量低200倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍。
在特定实施例中，当被输送物质是在基因组中含有异源核酸的腺病毒或腺伴随病毒(AAV)时，被给予的被输送物质的量在或大约在10至1x1012个颗粒、10至1x106个颗粒、1x103至1x1012个颗粒、1x106至1x1010个颗粒或者1x107至1x109个颗粒之间；或者在或大约在10至1x1012pfu、10至1x106pfu、1x103至1x1012pfu、1x106至1x1010pfu或者1x107至1x109pfu之间。例如，被给予的被输送物质的量小于1x1012个颗粒、1x1011个颗粒、1x1010个颗粒、1x109个颗粒、1x108个颗粒、1x107个颗粒、1x106个颗粒、1x105个颗粒、1x104个颗粒、1x103个颗粒或更小，或者小于1x1012pfu、1x1011pfu、1x1010pfu、1x109pfu、1x108pfu、1x107pfu、1x106pfu、1x105pfu、1x104pfu、1x103pfu或更小。
在本发明提供的任一方法的实施例中，被输送物质可以被给予至区室化的组织、器官或者组织或器官的部分中的一个以上位点。所述方法也可以包括从组织或器官或者组织或器官的部分的实质除去任何胞外被输送物质的步骤。这种步骤可以进一步降低或最小化被输送物质暴露于体循环，否则如果被输送物质未进入细胞，这种暴露可能在除去区室化时会发生。典型地，除去步骤在恢复组织、器官或者组织或器官的部分与全身脉管系统连通之前进行。在预定时间后通过恢复与体循环的连通而终止区室化。恢复与体循环的连通的步骤可以包括除去用于阻断动脉、静脉、导管和/或脉管的装置或技术。在本发明任一方法中，本发明提供的任何步骤可以重复多次。在一些实施例中，在所述方法的后续重复中，被输送物质被给予相同的区室化位点或者不同的区室化位点。
本发明提供的输送含有核酸分子的被输送物质的方法可以导致核酸分子在其被输送进的细胞中的功能作用或表达。在一些情况中，核酸分子可以编码蛋白质，所述蛋白质从细胞分泌进组织，并且在一些情况中可以到达或接触体循环。因此，本发明提供的方法可以用于多种应用，特别是希望多肽的局部或全身表达的应用。例如，在本发明方法中，核酸分子的输送实现多肽的产生，由此被输送物质含有编码所述多肽的核酸分子。在本发明方法的实践中，在恢复与体循环的连通后，所述多肽的表达持续至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、10年、15年或更长。
因此，在本发明提供的方法的实施例中，核酸分子的输送实现疾病或病症的治疗。所述疾病可以是遗传缺陷或者由异常细胞或蛋白质活性导致的其它疾病或病症。所述疾病可以是遗传性酶缺陷、遗传性免疫缺陷、癌症、逆转录病毒感染、血友病、糖尿病、肌营养不良症、心血管疾病、囊性纤维化、神经变性疾病、创伤、疼痛、镰刀细胞贫血、自身免疫疾病、炎性疾病和高血压。举例性的这种疾病或病症包括但不限于A型和B型血友病,I型糖尿病,α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏、血色素沉着症、Wilson’s病、Crigler-Najjar综合征I型、II型鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷、家族性高胆固醇血症、纤维蛋白原缺乏血症、糖原贮积病(GSD)Ia型、GSD Ib型、GSD II型(Pompe)、粘多糖贮积症(MPSI)、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS VII、法布里病、Gaucher’s病、Niemann-Pick综合征、鸟氨酸转甲酰酶缺乏(OTC)、苯丙酮尿症、肝纤维化、肝缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、半乳糖血症、槭糖尿病、1型酪氨酸血症、甲基丙二酸尿症、瓜氨酸血症、Gout and Lesch Nyan综合征、Sly综合征、Zellweger综合征、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、联合免疫缺陷病(SCID)、囊性纤维化、急性间歇性卟啉病、多发性硬化症、脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)或者帕金森病。在本发明方法的特定实施例中，对象是18岁以下的儿童。在一些实施例中，对象是胎儿。例如，对象可以是已被诊断为具有遗传缺陷的对象。
在本发明提供的任一方法中，所述方法可以经腹腔镜检查进行。
本发明提供了含有被输送物质的应用和组合物，所述被输送物质含有核酸分子，用于将核酸分子直接实质内施用于区室化组织、器官或者组织或器官的部分。用于将核酸分子直接实质内施用于区室化组织、器官或者组织或器官的部分的应用和组合物可以实现疾病或病症的治疗，在对象中过量产生异源多肽，增加动物中的肌肉产生，增加动物中毛发生长，增加动物中毛的产生，增加动物生长，或者实现动物中营养素合成或应用。
在本发明提供的用于将核酸输送至区室化组织或器官的实质的应用和组合物中，区室化组织或器官或者组织或器官的部分可以是肝、脑脊髓、胰腺、心脏、皮肤、肾、血管、骨骼肌肉、子宫、子宫颈、前列腺、尿道、肠，及其部分。特别地，组织或器官或者组织或器官的部分是肝。例如，本发明提供的应用和组合物可以用于将核酸直接实质输送到区室化的肝的部分，如肝叶、肝区段或者肝叶或肝区段的部分。肝叶或肝叶部分可以是右叶、左叶、方叶和尾状叶，或其部分。区室化组织或器官或者组织或器官的部分与体循环隔开，由此供应或通过组织或器官或者组织或器官的部分的动脉、静脉、导管和/或脉管被阻断。例如，所述组织或器官或者组织或器官的部分通过实质钳与体循环隔开而区室化。
在本发明提供的用于将核酸输送至区室化组织或器官或者组织或器官的部分的实质的应用和组合物的实例中，含有核酸分子的被输送物质可以是含有核酸分子的非病毒载体、病毒、病毒样颗粒、小环、纳米粒子和全细胞。在一个实施例中，被输送物质是非病毒载体，所述非病毒载体是表达载体。在另一个实施例中，被输送物质是纳米粒子，所述纳米粒子是靶向或放射性标记的。在另一个实施例中，被输送物质是病毒。例如，病毒是腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒。逆转录病毒可以是慢病毒。被输送物质通常是重组病毒，其中核酸分子是其基因组异源的。在一些实施例中，病毒是复制缺陷的。在其它实施例中，病毒是可以在细胞核中复制的。在本发明实施例中，病毒是可以感染不分裂细胞的，例如，病毒是显示肝嗜性并且可以进入肝细胞的病毒。
在本发明提供的应用和组合物的实施例中，组合物含有是腺病毒的被输送物质，所述腺病毒在基因组中含有异源核酸分子用于输送至区室化组织或器官或者组织或器官的部分。腺病毒可以是任何血清型，如血清型1至血清型51(例如1,2,3,4,5,…51)。例如，腺病毒是腺病毒2型或腺病毒5型。本发明组合物或应用中的任何腺病毒包括在E1、E2a、E2b、E3或E4编码区的任一或多个中具有缺失的腺病毒。例如，腺病毒在E1编码区中含有缺失。作为本发明组合物和应用中的被输送物质，病毒含有核酸分子，所述核酸分子对于病毒基因组是异源的。
在本发明提供的任何应用或组合物中，所述组合物含有被输送物质，其含有编码多肽的核酸分子。编码的多肽可以是酶、激素、凝血因子、生长因子、抗体或其部分、血管发生调节剂、免疫调节剂、疼痛调节剂、受体、转运蛋白、调节蛋白、抗原或变应原。例如编码的多肽可以是白介素、干扰素、生长因子或其部分或者生长因子受体或其部分。本发明的应用和组合物中的核酸分子的例子包括但不限于编码下述物质的核酸分子：腺苷脱氨酶、囊性纤维化跨膜传导调节物(CTFR)、加硫酶、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、苯丙氨酸氨裂合酶、酸性α葡糖苷酶、伊米苷酶、阿葡糖苷酶α、促甲状腺素、生长激素、胰岛素、甲状腺激素、促红细胞生成素(EPO)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-12、IL-18、fms相关酪氨酸激酶3(flt3)、neuropilin-2(NP2)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α或β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、FGFR拮抗剂(sFGFR)、转化生长因子受体(TGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、纤溶酶原激活物、尿激酶、因子VIII、因子IX、von Willebrand因子、生长激素、金属蛋白酶凝血酶敏感蛋白基序1(METH-1)、METH-2、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)片段、增殖蛋白相关蛋白、促乳素片段、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管抑制因子、血管抑素、内皮抑素、激肽原、纤维蛋白原-E片段、凝血酶敏感蛋白、tumstatin、canstatin、网状内皮系统刺激素、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、可溶性血管内皮生长因子受体(sFlk)、可溶性Neuropilin 1(sNRP1)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、血小板因子4(PF-4)、Gro-β、可溶性Ephrin B型受体4(sEphB4)、sephrinB2、IGF-1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护性蛋白/组织蛋白酶A、酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷脂酶、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、Niemann-Pick病C1型(NPC-1)、β-氨基己糖苷酶B、类肝素N-硫酸酯酶,α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)、Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、酸性脂酶、肾胰岛素残基溶酶、胰岛素降解酶胰岛素溶酶、thimet寡肽酶、钙结合蛋白D28、小白蛋白、低氧诱导因子1-α(HIF1-α)、sirtuin-2(SIRT-2)、活运动神经元蛋白-1(SMN-1)、SMN-2、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、脂蛋白脂酶(LPL)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)、UGT1A1、葡萄糖-6磷酸酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、生物素酶、β-葡糖脑苷脂酶、β-gluronidase、胆色素原脱氨酶(PBDG)或p53。
在本发明提供的应用或组合物的实施例中，所述组合物含有被输送物质，其含有核酸分子，所述核酸分子编码增加动物中肌肉产生、增加动物中毛发生长、增加动物中毛的产生、增加动物生长或者参与营养素合成或利用的多肽。例如，编码的多肽可以是肌肉生长抑制素抑制剂、生长激素、IGF-1、生长激素释放因子、鸡Ski、丝氨酸转乙酰酶和o-乙酰丝氨酸硫化氢解酶。在具体实施例中，肌肉生长抑制素抑制剂是卵泡抑素。
在本发明提供的应用或组合物的实施例中，所述组合物含有被输送物质，其含有核酸分子，所述核酸分子是DNA分子、RNA分子或适体。核酸分子可以是microRNA、小干扰RNA、核酶或反义核酸。
另外，本发明提供的组合物可以包括促进或增加被输送物质输送到组织或器官的实质细胞的输送效率的物质或试剂。例如被输送物质可以与脂质、聚合物试剂或其它物质配制以促进进入实质细胞。在其中应用或组合物用于输送至肝的实施例中，实质细胞可以是肝细胞。在其它实施例中，被输送物质可以与促进被输送物质的细胞摄入的物质配制。例如，被输送物质可以与是病毒特异性细胞表面受体的转录增强子的物质配制。这种物质的例子是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂可以是trischostatin A、伏立诺他(SAHA)、belionostat(PXD101)、LAQ824、帕比司他(LBH589)、恩替诺特(MS-275)、C199、mocetinostat(MGCD0103)、罗米地辛(Istodax)、丙戊酸、PCI-24781、SB939、resminostat、givinostat、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、Kevetrin或trichostatin A(TSA)。
在本发明提供的任何应用或组合物实施例中，组合物中的被输送物质通常的量比配制用于静脉内给予的组合物中相同被输送物质的量低100倍以上。例如，组合物中的被输送物质的量比配制用于静脉内给予的组合物中相同被输送物质的量低达200倍、500倍、1000倍、50000倍、10000倍。在特定实施例中，所述应用或组合物包括被输送物质，其是腺病毒或腺伴随病毒，所述腺病毒或腺伴随病毒在基因组中含有异源核酸分子，其中组合物中病毒的量是或大约是2x103pfu/mL至1x1014pfu/mL、2x103pfu/mL至1x1012pfu/mL、2x103pfu/mL至2x1011pfu/mL、1x104pfu/mL至5x1011pfu/mL、1x105pfu/mL至1x1011pfu/mL、2x106pfu/mL至2x1010pfu/mL或1x108至1x1010pfu/mL；或者在或大约在2x103个颗粒/mL至1x1014个颗粒/mL、2x103个颗粒/mL至1x1012个颗粒/mL、2x103个颗粒/mL至2x1011个颗粒/mL、1x104个颗粒/mL至5x1011个颗粒/mL、1x105个颗粒/mL至1x1011个颗粒/mL、2x106个颗粒/mL至2x1010个颗粒/mL或1x108至1x1010个颗粒/mL之间。组合物可以是液体组合物，体积在或大约在0.02mL至100mL、0.05mL至50mL、1mL至10mL、0.05mL至5mL或0.02mL至1mL之间。本发明的组合物可以配制用于单剂给予或多剂给予。例如，组合物可以含有用于单剂给予的腺病毒或腺伴随病毒，其中组合物中的腺病毒的量是或大约是10至1x1012个颗粒、10至1x106个颗粒、1x103至1x1012个颗粒、1x106至1x1010个颗粒或1x107至1x109个颗粒；或者是或大约是10至1x1012pfu、10至1x106pfu、1x103至1x1012pfu、1x106至1x1010pfu或1x107至1x109pfu。例如，组合物中的腺病毒或腺伴随病毒的量小于1x1012个颗粒、1x1011个颗粒、1x1010个颗粒、1x109个颗粒、1x108个颗粒、1x107个颗粒、1x106个颗粒、1x105个颗粒、1x104个颗粒、1x103个颗粒或更少；或者小于1x1012pfu、1x1011pfu、1x1010pfu、1x109pfu、1x108pfu、1x107pfu、1x106pfu、1x105pfu、1x104pfu、1x103pfu或更少。
在本发明的应用或组合物中，所述组合物配制用于给予人类患者。组合物可以配制用于给予18岁以下儿童。组合物可以配制用于给予胎儿。
在本发明的应用或者组合物中，含有核酸分子的被输送物质用于实质内施用于区室化组织的用途可以用于在对象中表达多肽。核酸分子可以是治疗性核酸分子。核酸分子可以编码治疗性多肽。因此，用于直接输送至区室化组织或器官或其部分的本发明的应用或组合物可以实现疾病或病症的治疗。举例的这种疾病和病症包括但不限于遗传性酶缺陷、遗传性免疫缺陷、病毒感染、癌症、血友病、糖尿病、肌营养不良症、心血管疾病、囊性纤维化、神经变性疾病、创伤、疼痛、镰刀细胞贫血、自身免疫疾病、炎性疾病或高血压。例如所述疾病或病症可以是A型和B型血友病,I型糖尿病,α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏、血色素沉着症、Wilson’s病、Crigler-Najjar综合征I型、II型鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷、家族性高胆固醇血症、纤维蛋白原缺乏血症、糖原贮积病(GSD)Ia型、GSD Ib型、GSD II型(Pompe)、粘多糖贮积症(MPSI)、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS VII、法布里病、Gaucher’s病、Niemann-Pick综合征、鸟氨酸转甲酰酶缺乏(OTC)、苯丙酮尿症、肝纤维化、肝缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、半乳糖血症、苯丙酮尿症、槭糖尿病、1型酪氨酸血症、甲基丙二酸尿症、瓜氨酸血症、Gout and Lesch Nyan综合征、Sly综合征、Zellweger综合征、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、重症联合免疫缺陷病(SCID)、囊性纤维化、急性间歇性卟啉病、多发性硬化症、脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)或者帕金森病。
本发明提供了一种容器，其含有配制用于直接实质内施用的腺病毒或腺伴随病毒组合物，其量在或大约在10至1x1012pfu、1x103pfu至1x1012pfu、1x102pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x109pfu、1x103pfu至1x108pfu或者1x106pfu至1x109pfu之间；或者在或大约在10至1x1012个颗粒、1x103个颗粒至1x1012个颗粒、1x102个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x109个颗粒、1x103个颗粒至1x108个颗粒或者1x106个颗粒至1x109个颗粒之间。腺病毒或腺伴随病毒通常在基因组中含有异源核酸分子。容器是无菌和密封的。容器可以是注射器或小瓶。容器也可以含有用于注射组合物的针。容器可以含有毛细管装置。例如，容器可以包括毛细管装置以穿透例如肝的Glisson胶囊(Glisson’s capsule)以实质内输送被输送物质。
在本发明提供的容器的特定实施例中，组合物含有的腺病毒或腺伴随病毒的量小于1x1012pfu，并且是至少或大约至少1x103pfu、1x104pfu、1x105pfu、1x106pfu、1x107pfu、1x108pfu、1x109pfu、1x1010pfu、1x1011pfu或更多；或者小于1x1012个颗粒，并且是至少或大约至少1x103个颗粒、1x104个颗粒、1x105个颗粒、1x106个颗粒、1x107个颗粒、1x108个颗粒、1x109个颗粒、1x1010个颗粒、1x1011个颗粒或更多。
在本发明提供的容器中的组合物含有腺病毒的实施例中，所述腺病毒可以是任何可获得或已知的血清型。例如，腺病毒是血清型1指至血清型51的一种血清型(例如1,2,3,4,5…51)。腺病毒可以是腺病毒2型或者腺病毒5型。通常，本发明容器中提供的组合物中的腺病毒在E1、E2a、E2b、E3或E4编码区的任一或多个中含有缺失。例如，腺病毒在E1编码区中含有缺失。异源核酸分子可以被插入或包含在任一或多个所述缺失的区域中。
在本发明提供的容器的实施例中，组合物含有被输送物质，其含有核酸分子。例如，对于病毒，所述核酸分子是对病毒基因组异源的。在一些实施例中，核酸分子可以是编码多肽的任何核酸分子。编码的多肽可以是酶、激素、凝血因子、生长因子、抗体或其部分、血管发生调节剂、免疫调节剂、疼痛调节剂、受体、转运蛋白、调节蛋白、抗原和变应原。例如，编码的多肽是白介素、干扰素、生长因子或其部分及生长因子受体或其部分。本发明容器中提供的组合物中的举例的核酸分子包括但不限于编码任何下述物质的核酸分子：腺苷脱氨酶、囊性纤维化跨膜传导调节物(CTFR)、加硫酶、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、苯丙氨酸氨裂合酶、酸性α葡糖苷酶、伊米苷酶、阿葡糖苷酶α、促甲状腺素、生长激素、胰岛素、甲状腺激素、促红细胞生成素(EPO)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-12、IL-18、fms相关酪氨酸激酶3(flt3)、neuropilin-2(NP2)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α或β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、FGFR拮抗剂(sFGFR)、转化生长因子受体(TGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、纤溶酶原激活物、尿激酶、因子VIII、因子IX、von Willebrand因子、生长激素、金属蛋白酶凝血酶敏感蛋白基序1(METH-1)、METH-2、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)片段、增殖蛋白相关蛋白、促乳素片段、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管抑制因子、血管抑素、内皮抑素、激肽原、纤维蛋白原-E片段、凝血酶敏感蛋白、tumstatin、canstatin、网状内皮系统刺激素、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、可溶性血管内皮生长因子受体(sFlk)、可溶性Neuropilin 1(sNRP1)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、血小板因子4(PF-4)、Gro-β、可溶性Ephrin B型受体4(sEphB4)、sephrinB2、IGF-1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护性蛋白/组织蛋白酶A、酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷脂酶、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、Niemann-Pick病C1型(NPC-1)、β-氨基己糖苷酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)、Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、酸性脂酶、肾胰岛素残基溶酶、胰岛素降解酶胰岛素溶酶、thimet寡肽酶、钙结合蛋白D28、小白蛋白、低氧诱导因子1-α(HIF1-α)、sirtuin-2(SIRT-2)、活运动神经元蛋白-1(SMN-1)、SMN-2、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、脂蛋白脂酶(LPL)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)、UGT1A1、葡萄糖-6磷酸酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、生物素酶、β-葡糖脑苷脂酶、β-gluronidase、胆色素原脱氨酶(PBDG)或p53。
在一些情况中，本发明提供的容器中的组合物编码增加动物中肌肉产生、增加动物中毛发生长、增加动物中毛的产生、增加动物生长或者参与营养素合成或利用的多肽。编码的多肽可以是肌肉生长抑制素抑制剂、生长激素、IGF-1、生长激素释放因子、鸡Ski、丝氨酸转乙酰酶或o-乙酰丝氨酸硫化氢解酶。在具体实施例中，肌肉生长抑制素抑制剂是卵泡抑素。
附图简述
图1A是肝解剖学图，示出分离的肝叶及每个肝叶的血液供应。肝传统上分成4个叶：左解剖叶、右解剖叶、尾状叶和方叶。在大鼠肝中，这些解剖学分离的肝叶是：中叶(10),左侧叶(11),右叶(13),尾状叶(12)。中叶位于膈的正下方，其通过镰状韧带固定于膈，所述韧带形成小叶间裂隙并将肝叶分离为左和右两部分。中叶占总肝质量的接近40％。左侧叶位于中叶之下和尾状叶之上。小叶间韧带固定左侧叶和尾状叶的上部。左侧叶占总肝质量的大约30％。右叶位于腔静脉(1)的右边，并且含有两个确定的部分，右上叶和右下叶。右上叶是球形的。其固定元件是肝-膈韧带。右下叶具有三角形形状，尖端指向腔静脉。右叶占总肝质量的20％。尾状叶位于腔静脉左边左侧叶正下方。该叶分成两个部分：上尾状叶和下尾状叶。上尾状叶经小叶间韧带固定于左侧叶并且经肝-胃韧带固定于胃。尾状叶下部分位于胃后面。尾状叶占总肝质量的7％。
血液流入肝内是通过门静脉(6)和肝动脉(5)，其在进入肝中后分支向右和向左以供应不同肝叶。第一个分支向右成为右下门静脉(7)和右上门静脉(8)以供应右叶。第二个分支向左成为尾状叶门静脉(4)，其分成两个静脉：上尾状叶分支和下尾状叶分支。门静脉继续其两个主干分叉，形成右中门静脉(9)供应中叶右部分，及释放左中门静脉(2)和左侧门静脉(3)的左门静脉供应相应肝叶。肝的动脉灌溉是由肝动脉提供，其在进入肝后分支向右和左以供应肝叶并与门静脉分布相同。
图1B描述了基于肝的功能/血管特征的进一步肝区分。三个主要肝静脉(右肝静脉、中肝静脉和左肝静脉)将肝分为4个部分或区段(右后段、右前段、左内侧段和左外侧段)，每个区段由相应的门脉系统分支供应。门静脉的进一步分支将人肝亚分为8个解剖学独立的亚段，每个具有自己的输出(efferent)肝静脉系统、输入(afferent)门静脉系统、输入动脉系统和胆管系统。亚段I和IV相应于左内侧段，亚段II和III相应于左外侧段，亚段V和VIII相应于右前段，亚段VI和VII相应于右后段。
图2示出在将重组腺病毒通过静脉内给予输送进腔静脉(图2A)或者在用瘤蒂钳(pedicle clamp)阻断流经尾状叶的血流的同时通过间质给予尾状叶实质(图2B)后，萤光素酶活性的比较。结果显示在暂时区室化后萤光素酶表达仅在尾状叶中。
图3示出当用区室化方法输送时腺病毒DNA在体循环中的存在。具体地，图3A显示在30分钟或60分钟后在尾状叶血管分离终止时不存在腺病毒DNA，但是在7分钟或15分钟后在尾状叶血管隔离终止(termination of vascular isolation)时全身检测到腺病毒DNA。图3B显示在30分钟血管隔离(经瘤蒂钳)起始和终止后腺病毒DNA存在的动力学。结果显示在腺病毒注射后1、3和5分钟(钳紧期间)及在钳松开后1、3和5分钟(钳松开后)外周血中不存在腺病毒DNA。
图4显示在血管隔离期间将各种剂量的重组腺病毒实质内给予大鼠尾状叶后尾状叶中的萤光素酶活性水平。虚线显示用任一剂量的相同载体的静脉内输注达到的最大表达量。结果显示血管隔离显著增加核酸表达及基于提供的病毒载体的量以剂量依赖性方式提供受控的蛋白质表达水平。
图5显示在血管隔离期间将重组腺病毒实质内给予大鼠尾状叶后在区室化肝基因治疗模型中直至1年的尾状叶中持续的萤光素酶表达。
图6示出在输送重组腺病毒至区室化尾状叶后或者在静脉内(IV)输送重组腺病毒后在肝叶中诱导的细胞因子表达水平(TNFα,IFNγ,TGFβ和IL-6)。β-肌动蛋白表达用作阳性对照。结果显示在静脉内给予腺病毒的组的全部肝叶中的强细胞因子表达。在腺病毒被给予区室化肝叶的组中，观测到降低的细胞因子表达，其仅在尾状叶中存在。
图7显示在用实质钳阻断血流的同时将重组腺病毒输送进猪左中叶实质后，在距注射位点近、中等和远的位点的左中叶(comp；注射位点)、左侧叶和右中叶的组织样品中萤光素酶基因表达的比较。结果显示萤光素酶表达仅在注射位点。
图8显示在将编码甲胎蛋白(AFP)的重组腺病毒输送至大鼠肝的区室化尾状叶后7天在大鼠血清中的AFP蛋白水平。
详细描述
大纲
A.定义
B.核酸输送及基因治疗
1.现有基因治疗方法
2.直接输送至区室化组织或器官
C.核酸输送的区室化方法
1.组织或器官的区室化
a.肝
b.其它器官
2.通过给予被输送物质而输送核酸
a.输送方法及给予途径
b.促进输送的方法
c.输送剂量及方案
3.区室化终止和释放
D.被输送物质
1.核酸分子
2.含有核酸分子的运载体及构建体
a.病毒及病毒载体
i.腺病毒
ii.腺伴随病毒(AAV)
iii.逆转录病毒
iv.慢病毒
b.非病毒载体
纳米粒子
c.全细胞
3.举例的基因治疗剂
E.组合物、系统及试剂盒
1.剂量配方
2.组合
3.制造品及试剂盒
F.评估输送、表达或功效
1.监测被输送物质
2.宿主毒性及免疫激活
G.应用及使用方法
1.治疗疾病和病症
a.A型和B型血友病
b.家族性高胆固醇血症
c.I型糖尿病
d.α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏
e.血管发生和癌症
f.自身免疫及炎性疾病(例如多发性硬化症)
g.急性间歇性卟啉病(AIP)
h.Sanfilippo综合征(粘多糖贮积症III型；MPSIII)
i.脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)
2.蛋白质表达和生产
3.兽医及农业应用
H.实施例
A.定义
除非另有定义，本申请中所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。除非另有指出，本说明书中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公开的材料均以其全部内容并入本申请作参考。在本申请中术语存在多个含义的情况中，以在当前章节的含义为准。如果援引URL或其他此类标示符或地址，要理解此类标示符可以改变，互联网中的具体信息可出现或消失，但所搜互联网可找到等同的信息。这种援引证实的是此类信息的可获得性以及公开播散。
如本申请所用，组织或器官或其部分的“区室化”或者其语法变化用词(在本申请也称作循环隔离或血管隔离)是指组织或器官或其部分从体循环中的隔离。所述隔离可以通过阻断或阻隔穿过组织或器官或其部分的一或多个且通常所有的动脉、静脉、导管或脉管以及注入(empty into)、进入或以其他方式与体循环相通而实现。组织或器官的区室化特征在于血液中断或停止流向组织或器官，或者组织或器官的部分。所述区室化破坏组织与器官或者组织或器官的部分或区域之间和之中的连通或接近，其余的机体通过体循环。区室化可以通过阻断或阻隔一或多个动脉、静脉、导管或脉管的任何方法实现，例如通过使用闭塞导管、束带、止血带或者血管钳。
如本申请所用，“血液流向组织或器官或其部分被降低或消除”或者相似用语，意味着来自维护或横贯所述组织或器官或其部分的动脉、静脉、导管和/或脉管的血液供应或流动的干扰或阻断，从而剥夺所述组织或组织部分使用血液中携带的物质。这种阻断可导致组织或器官或者组织或器官的部分的缺氧或缺血。本领域技术人员已知怎样监测血液流向组织或器官的减少或消除。例如，血流的减少或消除可以基于如下方式监测：组织的颜色、使用墨汁或其它可报告染料的电子顺磁共振(EPR)血氧测定法、使用组织分光镜(TiSpec)、磁共振灌注成像、正电子成像术、近红外线(NIR)光谱学、光学多普勒成像术、超声及本领域技术人员已知的其它方法。对于本发明，在组织或器官或其部分的区室化期间，流向所述组织或器官或者其部分的血液应降低75％、80％、85％、90％、95％以上，及直至大约或100％。
如本申请所用，“体循环”或者“大体循环”是指携带含氧的血液从左心室至机体组织及回送静脉血至右心房的大体循环。
如本申请所用，器官或组织是指对象机体的进行具体功能的分化部分。组织通常是一组特化的细胞，其组合在一起构成特化的功能。例如，肌组织是可以收缩的特化的组织。器官是由实施功能的组织组成的。举例的器官包括但不限于眼、耳、肺、肝、肾、心脏，或者皮肤。
如本申请所用，“组织或器官的部分”是指对象机体的组织或器官的一部分。该部分可以是组织或器官的一个区域、区段、叶、段或其它部分。该部分通常是可以与剩余的组织或器官分开移动或分离的，以允许所述部分自剩余组织或器官区室化。所述部分也是足以实现物质输送的部分。本领域技术人员可以确定足以区室化和/或实现物质输送的组织或器官的部分的合适大小，这依赖于特定的器官、用于区室化的仪器、治疗指征、剂量、对象的大小及其它参数。典型地，组织或器官的部分的体积为至少大约5mm3、10mm3或更大。例如，所述部分可以是任何面积的组织或器官，其长度为0.5cm至25cm、高度(或厚度)为0.5cm至20cm，和/或深度为0.5cm至15cm。例如，肝叶或区段部分是长度为5cm至10cm，高度为1cm至3cm及深度为(从顶部)为1.5cm至3cm。也涵盖更小的区域或部分，只要该部分能被区室化即可。
如本申请所用，对区室化而言的恢复连通是指组织或器官或者组织或器官的部分的区室化结束，以恢复或重新开始体循环与所述组织或器官的接入。这可以通过除去用于阻断或阻隔横贯组织或器官或其部分的一或多个及通常所有动脉、静脉、导管或脉管的装置、器械或工序而实现。
如本申请所用，关于在恢复与体循环连通之前的终止区室化的预定时间是指先前已知且可控的有限时间。典型地，预定时间是在给予或输送被输送的物质之后的时间，其中至少或大约至少80％、85％、90％、95％或更多的被输送物质在组织或器官的实质细胞中的细胞内(例如肝的肝实质细胞)。通常地，这种时间是其中在通过终止区室化而恢复连通时少于10％、5％或更少的被输送物质存在于体循环中的时间。这种时间可以由本领域技术人员根据经验确定，且与例如特定的靶器官和输送的物质相关。在特定实施例中，所述预定时间为在开始区室化和/或给予被输送物质之后至少与大约15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟。预定时间可以通过增加细胞对输送的物质的摄取的方法、机制或技术控制。这种方法为本领域技术人员已知，并在本申请中描述。因此，在一些实施例中，预定时间可以少于15分钟，如5分钟至15分钟。
如本申请所用，实质是指组织及器官相关细胞部分，其实施器官的具体功能及组成器官的主要部分。因此，实质是器官的主要基础功能组织。这些可包括上皮组织、肌组织、神经组织及其相关的细胞。实质与间质不同，间质是结缔组织、血管、神经和导管。因此，实质不包括结缔组织、血管、神经和导管。例如，肝的实质包括肝实质细胞，心脏的实质包括心肌细胞如肌细胞，肾脏的实质包括肾单位。皮肤的实质是表皮。
如本申请所用，“实质细胞”实质包含于或者组成组织或器官实质的细胞。例如，肝实质细胞是肝主要组织细胞，其组成70-80％肝实体。在肺中，75％的肺细胞包含于实质中。这些包括例如间质组织的成纤维细胞和排列在肺泡的上皮细胞，如1型和2型细胞(肺泡壁细胞)及刷细胞。在皮肤中，在实质中可见的细胞包括表皮细胞如角化细胞。本领域技术人员熟知各种组织和器官的实质及其中的细胞。
如本申请所用，实质内施用是指施用至组织或器官的实质。施用至实质典型是通过注射或毛细管扩散进行。
如本申请所用，钳是一种装置，如外科手术装置，用于压紧某结构，如器官、血管或组织。钳通常具有相对的侧面或部分，可以被活动或调节以实现对所述结构对侧的施压，以压紧该结构。钳可具有锯齿状口、锁定手柄和/或可膨胀气囊。通常地，可以调节钳紧力或压力。
如本申请所用，“实质钳”是指可以压紧组织或器官的实质的钳。实质钳包括瘤蒂钳。
如本申请所用，腹腔镜手术是指通过小切口(例如0.5-1.5cm)及使用腹腔镜进行的手术。
如本申请所用，“被输送物质”是指这样的物质或导管，如运载体、载体或构建体，其含有进行基因治疗的核酸分子及促进所述核酸分子进入细胞和/或核酸的表达。因此，被输送物质是给予对象的实体，含有包装于其中或与其结合的核酸分子。举例的被输送物质包括但不限于病毒、病毒样颗粒、小环、质粒或载体、脂质体和/或纳米粒子。例如，被输送物质可包含基于脂质的或其它基于聚合物的组合物，如脂质体、微团或反微团，其与核酸分子或其它物质结合，如本发明提供的非病毒载体或病毒，以输送进宿主对象中。在一些实施例中，裸DNA可以是被输送物质。被输送物质的摄取可以通过使用工种机械技术如电穿孔、超声穿孔或“基因枪”而进一步增加或促进。
如本申请所用，“基因治疗”包括核酸分子的转移，如异源DNA转移至具有对其试图采用这种治疗的失调或病症的哺乳动物、特别是人的某些细胞、靶细胞中。DNA以一定方式被导入选择的靶细胞中，由此该异源DNA表达及产生由此编码的治疗产物。或者，异源DNA可以一些方式介导编码治疗产物的DNA的表达，其可以编码产物如以某些方式直接或间接介导治疗产物表达的肽或RNA。基因治疗也可用于输送编码基因产物的核酸以置换缺陷的基因或者补充由其被导入之中的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物(例如生长因子抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如其受体)，其通常不在哺乳动物宿主中产生或者不以治疗有效量或者在治疗有效时间产生。编码治疗产物的异源DNA可以在修饰之后导入患病宿主的细胞中，以增强或另外改变所述产物或其表达。
如本申请所用，核酸分子是指单链和/或双链多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及RNA或DNA的类似物或衍生物。术语“核酸”还包括核酸的类似物，如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA，及其它这种类似物和衍生物。核酸可编码基因产物，如多肽、调节性RNA、microRNA、小抑制性RNA(siRNA)和功能性RNA。因此，核酸分子是指包括所有类型和大小的DNA分子，包括siRNA、适体、核酶、互补DNA(cDNA)、质粒及包括修饰的核苷酸和核苷酸类似物的DNA。
如本申请所用，治疗性核酸是编码治疗产物或者能产生治疗作用的核酸分子。所述产物可以是核酸，如调节序列或基因，或者可以编码具有治疗活性或作用的蛋白质。例如，治疗性核酸可以是核酶，反义核酸，双链RNA，编码蛋白质的核酸等。
如本申请所用，治疗产物是能产生治疗作用的化合物。所述化合物可以是多肽、肽、DNA或RNA。
如本申请所用，对于包含于病毒基因组中的核酸而言的异源核酸(也称作外源核酸或外来核酸)是指不是由生物体或其从中表达的病毒在体内正常产生的核酸，或者是由生物体或病毒但是在不同基因座产生的，或者介导或编码改变内源核酸如DNA表达的介导物，通过影响转录、翻译或者其它可调节的生物化学过程而实施。因此，异源核酸与其被导入之中的生物体或病毒通常不是正常内源的。异源核酸可以是来自相同生物体中另一病毒或者另一生物体(包括相同物种或另一物种)的核酸分子。然而，异源核酸可以是内源的，但是从不同基因座中表达的或者其表达或序列改变的核酸(例如质粒)。因此，异源核酸包括不是以与在基因组中发现的配对核酸分子如DNA精确方向或位置存在的核酸分子。通常地，尽管不是必需，但是这种核酸编码不是由所述生物体或病毒或者以与其在之中表达的病毒中相同的方式正常产生的RNA和蛋白质。本领域技术人员识别或认为对于所述核酸在其中表达的病毒是异源的、外源或外来的任何核酸如DNA，在本申请由异源核酸涵盖。举例的异源核酸包括但不限于编码外源肽/蛋白质的核酸，包括诊断剂和/或治疗剂。由异源核酸编码的蛋白质可以在病毒内表达、分泌，或者在其中已经导入异源河段的病毒表面上表达。
如本申请所用，可检测标记或可检测部分是指原子、分子或组合物，其中所述原子、分子或组合物的存在可以直接或检测测量。可检测标记可包含在本发明的任何被输送物种中。可检测标记包括例如化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射性核素和金属。例如，可检测部分包括例如荧光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、胶体金、铁、钆和镓-67。检测标记的方法为本领域熟知。这种标记可以通过例如目测、通过荧光光谱学、通过反射系数测量、通过流式细胞计量术、通过X-射线、通过各种磁共振方法如磁共振成像(MRI)和磁共振波谱法(MRS)检测。检测方法还包括任何各种X线断层摄影方法，包括计算机断层扫描(CT)、计算机轴向X线断层摄影术(CAT)、电子束计算机断层摄影术(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、圆内旋轮断层扫描、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、螺旋计算机断层摄影术及超声X线断层扫描。可检测标记的直接检测是指例如测量可检测标记自身的物理现象，如标记自身的能量或粒子放射或吸收，如通过X-射线或MRI检测。间接检测试纸测量原子、分子或组合物直接或间接结合可检测标记的物理现象，如原子、分子或组合物直接或间接结合可检测标记的能量或粒子发射或吸收情况。在间接检测的非限制性实例中，可检测标记可以是生物素，其可以通过与抗生物素蛋白的结合而检测。未标记的抗生物素蛋白可以系统给予以阻断非特异性结合，随后系统给予标记的抗生物素蛋白。因此，包含在可检测标记或可检测部分范围内的是可结合的标记或可结合的部分，其是指原子、分子或组合物，其中所述原子、分子或组合物的存在可以根据所述标记或部分与另一原子、分子或组合物结合的结果检测。
如本申请所用，DNA构建体是单链或双链的，线性或环形DNA分子，其含有以在自然未发现的方式组合和并列的DNA区段。DNA构建体以人工操纵的结果而存在，包括操纵的分子的克隆及其它拷贝。
如本申请所用，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制的分离元件。载体典型保持附加型，但是可以设计为将基因或其部分导入基因组染色体中。载体包括非病毒载体，如非病毒表达载体。还涵盖这样的载体，其是人工染色体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。载体还包括“病毒载体”。这种载体的选择和应用为本领域技术人员熟知。
如本申请所用，表达载体包括能表达DNA的载体，其与调节序列如启动子区域可操纵地地连接，能引起这种DNA片段的表达。这种额外的区段可包括启动子和终止子序列，任选可包括一或多个复制起点、一或多个可选择的标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时，导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员已知，包括在真核细胞和/或原核细胞中能复制的那些载体，及保持附加型的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本申请所用，“病毒”是指一大组感染性实体的任何一种，其没有宿主细胞则不可以生长或复制。病毒典型含有围绕遗传物质的RNA或DNA核心的蛋白质衣壳，但是不是半透膜，且仅能在活细胞中生长和增殖。病毒包括当含有全部或部分病毒基因组的载体转导进合适的细胞或细胞系以产生这种颗粒时形成的那些病毒。所得病毒颗粒具有不同用途，包括但不限于将核酸在体外或体内转移进细胞中。因此，病毒是包装的病毒基因组。病毒可以是单一颗粒、颗粒原种或者病毒基因组。
如本申请所用，病毒载体是指核酸载体构建体，其包括至少一个病毒起源元件，及可以包装进病毒载体颗粒或者病毒中。在本申请中提及病毒载体时可以与包装进蛋白质衣壳内部的病毒互换使用。病毒载体颗粒或病毒可用于将DNA、RNA或其它核酸在体外或体内转移进细胞中的目的。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(例如HSV)、杆状病毒载体、巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒(SV40)载体、Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体，及腺伴随病毒(AAV)载体。合适的病毒载体在例如美国专利No.6,057,155、5,543,328和5,756,086中描述。病毒载体典型包括工程化病毒，其与外援基因可操纵地连接，以(作为运载体或穿梭载体)将所述外源基因转移至细胞中。
如本申请所用，当描述核酸与核苷酸的调节和效应序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点及其它信号序列的排列时的可操纵地连接，是指这种核酸如DNA与这种核苷酸序列之间的关系，由此其与指定目的一致起作用，例如在启动子中起始转录及通过编码区段行进至终止子。例如，核酸与启动子的可操纵地连接是指DNA与启动子之间的物理关系，由此这个DNA的转录通过特异性识别、结合并转录所述DNA的RNA聚合酶从所述启动子开始。因此，可操纵地连接或者可操纵地结合是指核酸如DNA与核苷酸的调节序列和效应序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点及其它信号序列的功能关系。为了优化表达和/或转录，可必须除去、添加或改变克隆的5’未翻译部分，以消除额外的、潜在不适当的可选翻译初始(即起始)密码子或者可干扰或降低表达的其它序列，在转录或翻译水平。此外，共有核糖体结合位点可以插入紧接在起始密码子的5’位置，可以增强表达(见例如KozakJ.Biol.Chem.266:19867-19870(1991)和Shine and Delgarno,Nature 254(5495):34-38(1975))。这种修饰愿望(或需求)可以根据经验确定。
如本申请所用，反义是指与感兴趣的基因的信使RNA(mRNA)互补并可以结合及失活其的核酸(DNA、RNA或者化学类似物)。
如本申请所用，小干扰RNA(siRNA)是指一类长度为20-25个核苷酸的双链RNA分子，其可以干扰基因的表达。
如本申请所用，适体是指寡核苷酸(DNA或RNA)，其结合靶如小分子、蛋白质、核酸、细胞或组织。适体可以被工程化及根据靶分子通过体外选择方法选择，如通过使用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术。本领域技术人员已知各种靶的适体。
如本申请所用，核酶是指具有独特的发夹或者锤头形状的活性中心和独特的二级结构使其在特定序列裂解其它RNA分子的RNA分子。核酶包括天然核酶以及工程化或设计为裂解任何RNA分子核酶。
如本申请所用，病毒样颗粒(VLP)是指非感染性物质，其与病毒类似但是不含有任何病毒遗传物质。例如，VLP可以装配以表达病毒结构蛋白(例如包膜或衣壳)。VLP包括从细小病毒科病毒(例如腺伴随病毒)、逆转录病毒科病毒(例如HIV)和黄病毒科病毒(例如丙型肝炎病毒)中产生的那些VLP。
如本申请所用，小环是指小的环形质粒或DNA载体，其是附加型载体，作为没有任何细菌质粒主链的环形表达盒产生。其可以自含有异源核酸及两个重组酶靶位点的亲代细菌质粒中产生，通过使用位点特异性重组酶如PhiC31整合酶在分子内(顺式)重组产生。两个位点之间的重组产生小环和剩余的小质粒。可以与所述小质粒分离回收所述小环。本领域技术人员熟知小环及产生其的方法。
术语“裸”多核苷酸、DNA或RNA是指没有帮助、促进或便于进入细胞中的任何输送载体、复合物或物质包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体配制物、脂染剂(lipofectin)或沉淀剂的序列。
如本申请所用，病毒颗粒数(VP)是指病毒颗粒的总数，包括活的和死亡的组合。病毒颗粒的数目可以使用OD260测定从纯化的病毒原种中确定。
如本申请所用，噬斑形成单位(pfu)或感染单位(IU)是指感染性或者活的病毒的数目。因此其反映了制备物中活的病毒的量。Pfu可以使用噬斑形成测定或者终点稀释测定方法确定，这些测定是本领域技术人员已知的标准测定法。
如本申请所用，“腺病毒载体”和“腺病毒性载体”可互换使用，为本领域熟知是指含有所有或部分腺病毒基因组的多核苷酸。腺病毒载体是指编码完整基因组或者修饰的基因组的核酸或者当转移进细胞中时可用于导入异源核酸，特别是当作为颗粒包装时。腺病毒载体可以是任意的几种形式，包括但不限于裸DNA、包囊于腺病毒衣壳中的DNA、包装于另一病毒或病毒样形式(如单纯疱疹及AAV)中的DNA、包囊于脂质体中的DNA、与聚赖氨酸复合、与合成的聚阳离子分子复合、与运铁蛋白缀合、与如PEG等化合物复合以免疫学“掩饰”所述分子和/或增加半衰期，或者与非病毒蛋白质缀合。
如本申请所用，术语“腺病毒”或“腺病毒颗粒”用于包括可归类为腺病毒的任何和所有病毒，包括感染人或动物的任何腺病毒，包括所有类别、亚群和血清型。根据上下文语境，“腺病毒”可包括腺病毒载体。有至少51个腺病毒血清型被分类为几个亚群。例如，亚群A包括腺病毒血清型12、18和31。亚群B包括腺病毒血清型3、7、11a、11p、14、16、21、34、35和50。亚群C包括腺病毒血清型1、2、5和6。亚群D包括腺病毒血清型8、9、10、13、15、17、19、19p、20、22-30、32、33、36-39、42-49和51。亚群E包括腺病毒血清型4。亚群F包括腺病毒血清型40和41。因此，如本申请所用，腺病毒或腺病毒颗粒是包装的载体或基因组。对于本发明，该病毒典型是重组腺病毒，在其基因组中含有异源核酸，当腺病毒载体在腺病毒衣壳中包囊时形成。
腺病毒包括可以归类为腺病毒的任何及所有病毒，包括感染人或动物的任何腺病毒，包括所有类别、亚群和血清型。因此，如本申请所用，“腺病毒”和“腺病毒颗粒”是指病毒自身及其衍生物，除了特别指出的，涵盖所有血清型和亚群及天然发生的和重组形式。包括感染人细胞的腺病毒。腺病毒可以是野生型或者可以本领域已知的或者如本申请所揭示的各种方式修饰。这种修饰包括但不限于修饰包装于颗粒中的腺病毒基因组，以产生感染性病毒。举例的修饰包括本领域已知的缺失，如缺失一或多个E1a、E1b、E2a、E2b、E3或E4编码区。其它举例的修饰包括缺失腺病毒基因组的所有编码区。这种腺病毒已知为“裸(gutless)”腺病毒。该术语还包括条件复制的腺病毒，其是优先在某些类型细胞或组织中复制的病毒，在其它类型中复制程度较低或根本不复制。
如本申请所用，“靶向分子”或者“靶向配体”是指任何蛋白质、多肽或者其一部分，其结合所有细胞表面分子，包括但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质或其它这种成分。靶向配体包括但不限于生长因子、细胞因子、粘附分子、神经肽、蛋白质激素和单链抗体(scFv)。
如本申请所用，纳米粒子是指输送分子的胶体微粒，其是显微粒径大小，在大约1-1000纳米(nm)之间，如1和100nm，其在转运和性质方面是作为完整单位。纳米粒子包括单体纳米粒子(纳米球)，其中分子被吸收、溶解或分散遍及在基质中；及包括纳米微囊，其中分子限于水或油性中心，被壳样壁围绕。或者，分子可以共价附着于表面或者进入基质内。纳米粒子包括例如脂质体、树突状聚合物、聚合微团、纳米微囊、纳米球及固体脂质纳米粒子。通常地，纳米粒子是由生物相容的及可生物降解的材料制成，如天然或合成的聚合物(例如凝胶、白蛋白、聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯)或者固体脂质。纳米粒子包括含有附着于外面的靶向分子。
如本申请所用，与某部分结合的化合物是指一种复合物，其包含与某部分结合的化合物，其中所述化合物与某部分的结合可以产生于一或多个共价键或非共价相互作用如氢键，或者静电相互作用。缀合物可包括连接化合物与某部分的接头。举例的化合物包括但不限于纳米粒子和噬铁素(siderophores)。举例的部分包括但不限于可检测部分和治疗剂。
如本申请所用，关于被输送物质如病毒的向性是指通过粘粒蛋白如纤维蛋白和/或五邻体(penton)赋予颗粒的选择性的感染性或结合。
如本申请所用，关于细胞的“入内”、“摄取”或者“进入”是指被输送物质被导入细胞中的过程。因此，这种术语是指被输送物质位于细胞内。
如本申请所用，转导是指通过病毒将遗传物质转移至细胞中。
如本申请所用，被输送的核酸分子的“持续表达”是指在将核酸导入器官后的一段时间，在此期间观测到至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的峰值表达。典型地，如果编码的蛋白质表达超过6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、16个月、24个月或更长时间，则所述表达是持续的。
如本申请所用，术语启动子是指含有DNA序列的基因的一部分，其提供给RNA聚合酶的结合及转录的起始。启动子序列通常是但不总是发现于基因的5’非编码区内。
如本申请所用，通过使用重组DNA方法通过重组方式产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本申请所用，对象可以是脊椎动物，更特别地是哺乳动物(例如人、马、猫、狗、牛、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、大鼠及豚鼠)、禽类动物、爬行动物、两栖动物、鱼类，及任何其它动物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成体和新生对象，无论是雄性还是雌性的，均包含在内。如本申请所用，患者或对象可互换使用，可以是指需要治疗剂的对象。术语患者或对象包括人和兽医学对象。本发明揭示了治疗性的工业化的兽医学和农业(例如肉品生产)方面的应用。
如本申请所用，患者是指人对象。
如本申请所用，组合物是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液、非水溶液，或者上述形式的任何组合。
如本申请所用，组合是指两或多个项目之间或之中的任何关联。所述组合可以是两或多个单独的项目，如两个组合物或者两个集合，可以是其混合物，如两或多个项目的一个混合物，或者其任何变化。组合的元件通常是功能关联或相关的。
如本申请所用，试剂盒是包装的组合，其任选包括其它元件，如另外的试剂和所述组合或其元件的使用说明书。试剂盒任选包括使用说明书。
如本申请所用，“疾病或失调”是指生物体中由包括但不限于感染、获得性病症、遗传病症的因素或病症导致的病理学状况，特征在于可鉴别的症状。
如本申请所用，“可通过核酸治疗的疾病或失调”是指顺从外源输送的核酸治疗的任何疾病或失调，通过改变(增加或降低)与病因学或者疾病或病症相关或包含于其中的基因的表达、表达减轻疾病或病症的基因产物、或者置换疾病或病症中缺陷的或炔酸的基因产物。因此，可以通过核酸治疗的疾病或失调涵盖了已知的基因治疗方法和应用，包括例如通过置换缺陷的或缺损的基因产物或者外源给予治疗剂或产物而治疗遗传缺陷。举例的可以通过核酸治疗的疾病或失调在本描述。
如本申请所用，“治疗”患有疾病或病症的对象是指所述对象的症状在治疗后被部分或全部减轻，或者保持稳定。因此，治疗涵盖了预防、治疗和/或治愈。预防是指预防潜在疾病和/或预防症状恶化或疾病进展。
如本申请所用，治疗是指其中病症、失调或疾病的症状或其它指征得以减轻或得以另外的有益改变的任何方式。
如本申请所用，治疗作用是指得自治疗对象的作用，其改变、典型改善或减轻疾病或病症的症状，或者治愈疾病或病症。治疗有效量是指组合物、分子或化合物在给予对象后导致治疗作用的量。
如本申请所用，通过治疗如通过给予药物组合物或其它治疗剂减轻特定疾病或失调的症状是指可归因于或者与给予所述组合物或治疗剂相关的症状的任何减轻，无论是永久的或是暂时的、持续的或瞬时的。
如本申请所用，阻止或预防是指其中发生疾病或病症的危险被降低的方法。
如本申请所用，有效量是预防、治愈、减轻、阻止或部分阻止疾病或失调的症状所需的治疗剂的数量。
如本申请所用，单位剂量形式是指如本领域所已知的适于人和动物对象的物理分立单位，单独包装。
如本申请所用，直接施用是指不用进一步稀释而给予。
如本申请所用，单剂量配制物是指直接施用的配制物。
如本申请所用，多剂量配制物是指用于重复给予的配制物。
如本申请所用，“产品”是制成和销售的产物。如在本申请书中所用，该术语还涵盖了包含于包装物品中的被输送物质，如腺病毒颗粒。
如本申请所用，除非上下文明确表明，则单数形式“一个”包括复数指示物。因此，例如对于包含“一个胞外结构域”化合物，包括具有一或多个胞外结构域的化合物。
如本申请所用，术语“或者”用于是指“和/或”，除非明确表示是指唯一选项或者选项是互斥的。
如本申请所用，范围和量可以以“大约”的特定值或范围表示。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”及“5个碱基”。
如本申请所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或状况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或状况发生的情况或者不发生的情况。例如，任选的取代基团是指该基团未被取代或被取代。
如本申请所用，除非另有指出，任何保护基团、氨基酸及其它化合物的缩写与其常用的认可的缩写一致，或者与IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature一致(见(1972)Biochem.11:1726)。
为了更清楚地揭示本发明而无限制之意，详细描述分为如下部分。
B.核酸输送及基因治疗
本发明提供了一种为对象输送被输送物质(其是或包括核酸分子)的方法，输送至与总的脉管分开区室化的器官或器官部分，通过使所述器官与体循环中脉管分离。特别地，本发明提供了一些方法，其基于发现在将被输送物质(其是或包括核酸分子)给予器官或其部分时，当所述器官或其部分被暂时区室化(即血管剥夺或分离)时，外源输送的核酸分子的表达可以是持续且稳定的。此外，实施核酸输送的区室化方法获得先前未实现的线性动力学剂量应答。被输送的核酸分子可以是治疗性核酸，包括编码给予对象的治疗性多肽的核酸。因此，所述方法可用于选择的多肽在体内细胞表达。在一些实施例中，所述多肽可用于治疗情形中，其中所述多肽治疗或减轻对象中的失调或病症或者另外改善对象的生活质量。在其它实施例中，所述多肽可用于农业情形中，例如改善肉品生产的质量或数量的应用中。
本申请描述的方法比传统的基因治疗方法具有一些优势，不需要全身注入病毒载体(从而降低了病毒血症和免疫学应答)，使得病毒载体的数量显著减少(从而降低了给予部位的坏死)，使得可以控制输送的物质的量，对基因表达提供定量控制，及提供选择的物质的持续表达。
1.现有基因治疗方法
对生物技术的一个基本挑战是开发在体内输送遗传信息至细胞的方法。遗传物质的有目的输送至体细胞以治疗疾病或者为了生物医学研究已经被称作基因治疗。基因治疗在治疗疾病、包括体细胞和遗传性遗传疾病中有希望具有显著优势。为了成功，核酸分子必须以有效及安全的方式输送给治疗显著百分比的受影响细胞。然后被输送的核酸分子可以补偿缺损的或者部分功能性或非功能性的内源基因，提供有益功能或者阻断显性阴性(dominant negative)的内源基因或感染性生物体的基因的活性。
现有基因治疗方法是通过静脉内注射将核酸分子输送至组织或器官。使用非病毒或病毒载体的静脉内输送核酸并发一些问题，而阻碍了其广泛应用。例如，系统性输送核酸载体可导致免疫应答起始而产生不利的毒性副作用，中和转基因产物(例如由于表达的蛋白质的抗体产生所致)，降低细胞对所述核酸或载体的摄取，需要重复注入的基因表达和/或瞬时表达的丧失，需要大剂量核酸注射进对象血液循环中，组织损害，治疗期间靶器官内升高的压力，病毒血症，和/或难以靶向机体内特定细胞类型。当核酸在病毒载体如腺病毒载体中输送时，这些问题可以更严重。此外，在现有基因治疗方法中，缺少载体级联关于蛋白质输出之间的相关性。
例如，系统性给予含有核酸分子的被输送物质如病毒，可以导致免疫细胞转导及不希望的免疫应答激活。参与防御外来感染第一线的天然免疫细胞，包括噬菌细胞(例如巨噬细胞，中性粒细胞)和天然杀伤(NK)细胞，由于暴露于外来物质(例如基于病毒的载体)而变得具有活性。天然免疫应答的激活通过杀伤感染的细胞及通过分泌促炎细胞因子和趋化因子(例如干扰素、IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2、MIP-1α)而限制感染。所述细胞因子和细胞应答导致组织损坏，感染的细胞凋亡，其它效应细胞如树突状细胞募集及适应性免疫应答起始。抗原呈递细胞(APC)，如存在于血液和组织中的不成熟的树突状细胞，识别并摄取外来抗原物质，从而刺激激活NF-κB的信号转导途径，分泌炎症细胞因子和趋化因子，及正调节T细胞激活分子如MHC分子和共刺激分子。
结果是激活细胞和体液免疫应答。体液免疫性可导致可结合并直接失活抗原的抗体(中和抗体)产生，或者激活免疫系统的其它细胞以破坏抗原。细胞免疫性是通过细胞毒性T细胞介导的，其识别感染的细胞表面上的外来肽，一旦识别则消除产生外来抗原的任何细胞。因此，免疫激活的结果是效应细胞如细胞毒性T细胞的免疫激活，其消除转导的细胞，以及分泌浆细胞的抗体的产生，产生阻止所述核酸(例如病毒载体)再给予的中和抗体。免疫应答的极盛期和这种应答的程度可导致系统性和局部毒性。
当广泛输送时，这种毒性也可以加重，从而一些组织或器官变成用核酸转导。虽然这种组织或器官可以被切除以限制局部毒性，在一些器官具有多个转导位点的情况中，不可能通过除去转导的组织去治疗任何毒性作用。甚至在核酸的输送靶向于靶器官的血管的情况中，不希望的免疫应答和毒性也可发生。同样，全部器官也可以遭受毒性作用。
系统性给予需要较高剂量以实现细胞足够的转导效力及赋予有效的基因转移。例如，对于病毒输送，如给予腺病毒载体，给予1010-1013个病毒颗粒(vp)/kg(vp/kg)，通常给予1012-1013vp/kg以获得在组织部位可测及可再现的细胞转导和表达，如在肝中的肝细胞转导和表达。需要更高剂量是由于在达到组织细胞如肝的肝实质细胞之前，所述载体通过免疫应答从血液中除去。在较高剂量，血液和组织的吞噬细胞(例如Kupffer细胞)变得饱和及允许高水平肝细胞转导。系统性输送核酸也可以导致遍及机体的输送和分布，如果所得治疗仅需要靶定位置，这样则是不理想的。在这种情况中，通常需要增加剂量以实现治疗效力。然而，随着剂量增加，激发不希望的毒性或其它副作用的可能性也增加。
虽然已经尝试定位输送至器官或其部分，以避免这样的一些问题，但是无一成功解决所有这些并发症。例如，通过单独的静脉内或肝动脉灌注随后闭塞肝静脉或动脉的靶向输送病毒载体(例如慢病毒或腺病毒)至肝的方法，导致肝酶升高、细胞因子升高、一些淋巴细胞侵润和/或非靶向器官或器官一部分的污染(见例如美国专利申请US2008/0025952、US2010/0010068和US2006/0188482；Kinoshita et al.(2010)J Surg.Res.,160:47-51)。通过静脉内输送核酸的流体力学基因输送至肝的方法，其在周围实质细胞的质膜中产生“孔”以实现输送至实质细胞，这也可导致其它器官污染。这种方法不是在所有物种中均有效，迄今仍未示出可适用于病毒载体(Fabre et al.(2008)Gene Ther.,15:452-62)。此外，流体力学基因输送方法已经示出要求流出阻碍是有效的，由此这种创伤性技术在临床不可行(Sawyer et al.(2010)Gen Ther.,17:560-4)。主要依赖于核酸的直接实质内施用和肝内注射的其它方法也可导致肝酶升高，细胞因子升高，和/或其它器官或其部分的污染(见例如Crettaz et al.(2006)Hepatology,44:623-32；Fumoto et al.(2009)Biol.Pharm.Bull.,32:1298-302)。
2.直接输送至区室化组织或器官
本发明提供了区室化输送核酸分子的方法，通过将被输送物质直接施用通过隔离脉管、淋巴和/或导管而区室化的器官或其部分的细胞。在本发明的方法中，所述方法特征在于：1)阻断血液流向及从器官或其部分中流出，以阻止或基本阻止与体循环的连通；2)将被输送物质直接施用至组织或其部分的组织实质细胞；及3)维持脉管分离一段时间，以足以使得细胞摄取选择的物质。这些方面的作用是使得被输送物质如病毒载体不暴露于体循环，由此系统性免疫应答不被起始，避免了系统性毒性及其它非靶向器官或组织无污染。此外，通过将被输送物质直接施用至区室化组织或器官的实质细胞，使细胞摄取最大化。物质的最大化细胞摄取意味着在组织或器官区室化释放时，实际上所有被输送的核酸分子均可用于在细胞中转基因表达，及可以漏进体循环中的被输送物质的量降低或者消除。因此，本发明提供的方法使得可以仅靶向靶器官内希望的细胞，及产生持续长时间转基因的表达。
所述方法基于以下发现：将核酸输送至区室化的组织或器官中(其中区室化的时间选择适于感兴趣的靶器官)提供了持续的被输送的核酸分子表达，这比使用现有技术可用方法的表达明显持续更长时间；降低了必须给予的以导致所述核酸分子的明显摄取和表达的被输送物质的量；避免了与系统性给予被输送物质如病毒载体或者遗传修饰的细胞相关的副作用；及首次提供了通过调节给予对象的被输送物质的量而调节多肽表达的量的机会。这些显著的改善在基因治疗领域中提供了新机会。
本发明的输送编码多肽的核酸分子的方法提供了优于直接施用多肽的方法的优势。例如，由于所得编码的多肽的表达是持续的，因此在治疗期间没有必要重复注入核酸分子给对象。此外，由于在本发明方法中所述多肽是通过对象的自身转导细胞(例如肝细胞)表达，因此编码的多肽被正确地翻译后修饰。
此外，基因输送至器官如肝的各个叶或区段具有优势。例如，区域性输送是指基因输送的任何不希望的有害影响将不发生或者可以易于通过除去靶向叶而治疗。在所述方法中，区室化的输送允许非靶向的阻止或器官部分充当内部对照。也允许除去靶向叶，从而提供基因输送至靶向叶是引起所述作用的原因的形式证明。
本申请使用直接肝给予含有异源核酸分子的腺病毒输送物质，例证了本发明的这些特征。本申请的结果示出在通过实质钳紧的脉管分离或区室化下将腺病毒直接施用至肝叶的间质细胞，给予足以使得细胞摄取实际上所有给予的腺病毒的时间，这样呈现出优于现有方法的许多优势。特别地，观测到与系统性注射相比较高效力的肝细胞转导。使用这种方法，不用免疫抑制即可实现持续及强大的基因表达，观测到高水平蛋白质合成，及少于1011个颗粒如少于1010个颗粒、109个颗粒、108个颗粒、107个颗粒、106个颗粒、105个颗粒、104个颗粒、103个颗粒或更低的低剂量给予的病毒即可足够且有效地赋予在靶向叶或区域中的高水平转基因表达。特别地，本发明的结果示出需要较少的病毒而不损失蛋白质输出。结果还示出载体剂量与蛋白质输出之间的相关性。例如，使用本发明的区室化给予方法，较少量的病毒载体(例如少于1010个颗粒及少于103个颗粒、102个颗粒或更少)即导致多肽表达，给予的病毒载体与表达量之间是正相关的。通过实施本发明的方法，未观测到副作用如病毒血症、肝炎症性应答、肝细胞因子表达、在给予部位的一般性肝损害和坏死以及系统性毒性。鉴于无毒性及长期转基因表达，这种方法可用于基因治疗应用，通过靶向转基因在肝内表达以治疗肝疾病或者哺乳动物对象包括人体内的其它疾病。
如下章节进一步详细描述了本发明提供的核酸输送的区室化方法的步骤，及举例的用于进行本方法的输送物质和组合物。应理解本发明涵盖在所述方法中可进行的额外步骤或可选步骤的描述，与本发明的任何特定方法步骤或者组合方法步骤一起进行，及特别涵盖这些组合或组合亚系。下文还描述了区室化输送方法用于表达编码多肽的核酸分子进行治疗性或工业性、兽医学或农业学应用的方法和应用。本方法中使用的各个步骤和试剂，包括靶向器官和被输送物质，可以由本领域技术人员基于本申请描述适当修改，以根据被输送物质、特定应用或治疗指征及特定对象及其它相似考虑事项用于任何可处理的器官或其部分中。
C.核酸输送的区室化方法
本发明提供了一种通过给予对象选择的被输送物质的输送核酸分子的方法，包括步骤：(1)通过隔离或几乎完全隔离脉管、淋巴和/或导管系统而区室化组织、器官或其部分；(2)将选择的被输送物质直接施用至区室化的器官或其部分；(3)在给予被输送物质之后维持区室化一段时间，之后除去所述隔离，例如恢复所述器官或其部分的脉管循环。在所述方法中，在给予所述核酸物质之后维持组织或器官或其部分的区室化足够一段时间，以便少于10％的被输送物质暴露于体循环和/或使得选择的被输送物质由器官或其部分的细胞的细胞摄取率高于80％。本发明提供的方法允许转基因产物在组织或器官或其部分中的持续表达，超过60天、90天、6个月、9个月、或者超过1年。
在实施本发明的方法中，任选地，在给予被输送物质如病毒载体之前和之后可以给予对象免疫抑制剂，以使得免疫应答的可能性最小化或降低。例如，可以给予抑制细胞毒性淋巴细胞的物质。举例的免疫抑制剂包括但不限于环孢霉素强的松(NovoApo硫唑嘌呤他克莫司或FK506吗替麦考酚酯西罗莫司OKT3(Muromorab ATGAM或Thymoglobulin。主治医生能确定是否需要免疫抑制剂。有效的免疫抑制方案在本领域中常规实施，特定的方案依赖于众多因素，包括如特定的靶器官、特定的输送物质、特定的基因治疗及治疗的对象。
本发明的输送核酸的方法可以对任何哺乳动物对象进行。举例的这种对象包括但不限于小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、山羊、马和人。特别地，本发明提供的方法是在人对象中进行的。特别地，所述方法可以对低于18岁的儿童对象进行，如婴儿、学步儿和幼儿。在一些实施例中，所述方法可以在子宫内对胎儿进行。由于本发明提供的方法允许转基因产物的持续及长时间高水平表达，因此所述方法可用于不同应用中，包括但不限于医学应用，包括置换缺陷的基因产物，或者用于外源性给予治疗剂；移植器官的产生；在转基因动物(如生物反应器)中治疗性蛋白质的产生；及在农业或兽医学应用以及工业应用。
本发明提供的将核酸输送至对象的区室化方法可以进行一次，或者可以进行多次。例如，本发明提供的方法在蛋白质产生方案或者在治疗方案过程中可以实施多次。在一些实施例中，如本申请别处所述，重复本发明的方法以在多个靶部位有效输送，特别是其中寻求高水平的转导或表达遍及组织或器官的情况中。在这种实施例中，所述方法通常在第一次应用所述方法的几分钟、几小时或几天内重复。在其它实施例中，所述方法可以在首次应用后重复几周、几个月或几年。如果病理学需要，可以加上升级方案。在相同靶部位重复所述方法的实施例中，提供足够的时间以便所述组织或器官从先前的脉管分离中恢复。在其它实施例中，当重复时，所述方法用于先前未进行脉管分离的靶组织或器官。
下文提供了关于本发明方法的步骤及各个举例的非限制性实施方案的描述。
1.组织或器官的区室化
作为本发明提供的方法中的第一个步骤，通过将组织、器官或其部分与脉管系统隔离而进行区室化。在一些实施例中，区室化是通过与导管系统和/或淋巴系统分离而另外实现的。区室化的起始先于给予选择的物质，且直至足够的时间以使得选择的物质被细胞摄取之后才释放或结束以恢复所述器官或其部分的脉管循环。
任何组织或器官或其部分均可用于本发明的输送核酸的区室化方法中。这种组织或器官包括但不限于肝、肺、CNS(脑或脊髓)、周围神经系统(例如神经)、胰腺、胆囊、内分泌腺(垂体、肾上腺、甲状腺等)、心血管器官(例如心脏和血管)、皮肤、泌尿生殖器官(肾、子宫、子宫颈、前列腺、尿道)、呼吸系统器官(例如肺和呼吸道)、骨、肌肉和肠道。这个列表不是详尽的，本领域技术人员可识别另外的靶器官及其叶。在特定实施例中，用于本发明区室化方法中的组织或器官或其部分是肝或其部分。
通常地，区室化的组织或器官或其部分是能耐受血管分离足够的一段时间，以便少于10％、通常少于5％、4％、3％、2％、1％或更少的被输送物质暴露于体循环中。通常地，这个预定时间是几乎所有被输送物质均被组织细胞摄取的时间，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的被输送物质被组织细胞摄取。允许组织细胞摄取及防止所述物质释放或暴露于体循环的所述预定时间与特定的器官或其部分、特定的被输送物质及特定的直接输送至组织细胞(例如使用电穿孔)相关。本领域技术人员可根据经验确定需要的时间，由此少于10％的被输送物质暴露于体循环。例如，本申请中提供的章节F描述了举例的测定法及评定被输送物质输送的方法。在本发明特定实施例中，器官或其部分的区室化维持至少10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟或更长时间。通常地，区室化维持至少20分钟，但不超过60分钟。例如，器官或其部分如肝或其部分的区室化为至少30分钟，通常不超过60分钟。因此，根据特定的被输送物质，区室化在可导致器官组织或其部分短暂缺血的条件下维持。因此，用于本发明方法中的器官或其部分是可顺从短暂缺血的器官。
区室化的起始先于给予选择的物质。在本发明的方法中，区室化是在输送被输送物质至组织之前立即起始的。例如，区室化在输送被输送物质之前不超过5分钟开始，典型不超过4分钟、3分钟、2分钟、1分钟或30秒。在特定实施例中，用于实现血管分离的装置可以改变或修改或者制成与输送装置相容，以允许在血管分离后更快速或更有效地输送被输送物质。
在本发明提供的将选择的被输送物质给予对象的器官或其部分的方法中，所述方法包括减少、阻断或者分离血液流经所述器官或其部分或者另外妨碍所述组织或器官或其部分与循环的接近或连通的步骤。这可以通过所述组织或器官或其部分与脉管系统、导管系统/或淋巴系统的分离而实现。所述分离可以持续预定时间。典型地，区室化是通过实现全部血管分离预定时间而产生的。所述组织或器官或其部分可以通过任何方法区室化。在一个实施例中，分离可以使用一或多个动脉或静脉钳、闭塞导管或者通过血管包扎装置以封闭各个静脉或动脉而实现。典型地，为了阻断血液流动，钳紧维护所述器官或其部分的动脉和静脉或导管。在其它实施例中，血管分离可以使用一或多个实质或瘤蒂钳实现，切断血液供应及流经所述组织。对于具有单一血液供应的(例如供应器官或其部分的动脉和血管在可以钳紧的蒂内)合理分离的器官或其部分，一个血管钳或闭塞导管即足够。在具有复杂的脉管或者具有侧支循环的其它器官或其部分中，可需要多个血管钳或闭塞导管。组织或其部分与脉管的分离方法为本领域熟知，及用于各种医学方法中，如组织切除术和横切术中。
实现组织或器官的区室化的方法可包括选择性或非选择性方法以阻断血液流经所述器官或其部分。例如，可以进行选择性钳紧器官如肝的叶、部分或区段。选择性钳紧的益处是缺血性损伤(如果有的话)可以限制在区室化的选择的区域(Chouillard et al.(2010)Annals of Surgical Innovation and Research,4:2)。
在特定实施例中，区室化是通过实质压紧实现的，例如可以进行人工压紧，例如通过使用指捏技术。在另外的实施例中，止血带、绳索或条带装置可用于器官区域或其部分。在其它实施例中，实质钳可用于压紧血管、动脉、导管或淋巴管，阻断血液流向组织或器官的区域、叶、部分或区段。这种钳包括瘤蒂钳及可以选择性钳紧器官的一个区域或区段的其它钳。用于血管分离和排除方法的钳为本领域技术人员熟知且可获得。这些钳包括可商购自如下厂商的钳，如Aesculap(Center Valley,PA)、Klein Surgical Systems(SanAntonio,TX)或者Karl Storz(Germany)。举例的钳包括但不限于Kelly钳、小弹簧镊钳、Bulldog钳、Debakey-Satinsky钳、Longmire钳、Lin或Chu肝钳或者Inokuchi肝钳。也可以使用可膨胀的球囊钳。钳的选择和大小依赖于特定的对象、对象的大小、使用的手术方法及通过本发明方法区室化的特定器官或其部分。本领域技术人员能根据经验鉴别和选择与特定应用相容的钳。
在本发明的实质压紧实施例中，应用于实质组织的压力足以中止血液流动，但是不至于引起周围组织的严重损害。本领域技术人员如外科医生能确定实现器官或其部分的最佳区室化同时使组织损害或损伤最小化的理想压力。通常地，所述钳是可实现穿过钳的远端、中间和近端咬合部位的均匀压力的钳。所述钳及应用的压力也应能使组织或器官的一区域或区段与相邻组织及与周围脉管区室化。这种区室化应在应用期间维持。通常为至少直至30分钟至60分钟。如果需要，钳的力度可以使用本领域已知的方法确定，如通过使用加压负荷细胞传感器，例如2.2.按钮型加压负荷传感器(Interface Advanced ForceMeasurement；Scottsdale,Az)。实现区室化需要的以mm Hg表示的压力(泄露压力)可以离体或在体内使用压力计确定，如Cole Parmer数字压力测量装置(例如Vernon Hills,IL)。
区室化可以通过将染料注射进区室化的靶区域或区段并评定其在该区域的位置而评定，所述染料如甲基蓝或溴酚蓝或其它相似染料。例如，在除去钳后，放置该钳的两侧的组织可以切下并分析染料的存在情况。当染料不渗入分离的组织的部分或区域中时，区室化实现。应理解染料的一些泄露(表示血液流动)可以发生在钳边界的周围区域，只要在实质受压的整个期间存在与脉管分离的组织的区域或部分。理想地，实现区室化，由此染料不渗入超出钳边界范围的相邻组织。这在实施例6中例证。
除了钳和闭塞导管之外，可以使用抽吸降低或消除血液流向所述器官或其部分。在进一步的实施例中，可以使用冲刷以灌注或部分灌注分离的器官或组织，以稀释血液及进一步使被输送物质暴露于循环最小化。冲刷可以使用任何生理学合适溶液如盐水实现。所述抽吸或冲刷可以在给予或输送被输送物质之前进行。此外，在本发明方法的实施例中，从体循环中区室化器官或其部分的步骤可以通过成像装置辅助，如超声波扫描术、计算机X线断层摄影术或者磁共振成像。在一个实施例中，可以使用手术中超声以定位血管模式及组织或器官的其它解剖学特征，以有助于阻断血液流动。
在一些实施例中，缺血预处理(IP)可以在全部的血管分离预定时间之前进行，这可能导致延长的缺血事件。预处理导致器官或其部分对延长时间的缺血的耐受性，其可以发生在本发明的方法实施中，以保证被输送物质由组织细胞摄取。在这种方法中，血液流向组织或其部分被阻断少于本发明方法中血管分离的预定时间的一段时间，但是是导致低水平、轻度或中等程度缺血的时间。例如，所述组织或器官被预处理阻断血流至少或直至2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或更长时间。然后，所述组织或器官在缺血10分钟之内立即再灌注，产生持续缺血-再灌注损伤的状态。所述再灌注持续至少或直至2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、12分钟、15分钟、20分钟或更长时间。在特征在于再灌注后轻度至中度缺血一段时间的预处理之后，立即将所述器官或其部分使用本发明的方法进行区室化预定时间，足以保证被输送物质由本发明所述组织细胞摄取。
在本发明方法的其它实施例中，其中所述器官或其部分对组织缺氧或缺氧症特别敏感，所述器官或其部分通过提供器官或其部分的体外灌注而被区室化。这种方法用于例如其中保持体循环的心脏旁路手术中。在本发明的方法中，体外灌注可维持血液在闭环中流至靶器官或其部分。体外灌注也可包括使血液加氧。
阻断血流以导致器官或其部分区室化的方法可以通过本领域已知的一般外科手术程序进行，包括开放的手术程序或腹腔镜检查。
上述例如通过血管与体循环分离的器官区室化方法可以对任何器官或其部分进行。举例的这种器官包括但不限于肝、肾、胰腺、肺或脾，或者其一部分。如下章节例证了举例的器官的血管分离。
a.肝
在人及其它动物中，肝是红褐色分叶的器官。肝具有很多功能，包括解毒、蛋白质合成及为消化所学的生化物质的产生。使用本发明的方法，肝由于一些原因是靶向输送被输送物质的特别优选的器官。其是机体内最大的器官(占总体重的2％-3％)，具有易于接近和可区室化的至少一个叶，具有适当的较慢细胞更新，精于分泌蛋白质，及耐受长期缺氧和组织缺氧。此外，肝是输送核酸分子的重要靶器官，因为其主要作用是代谢和产生血清蛋白。有许多疾病，其中一些是由肝特异性基因产物缺陷所致，其可以得益于肝分泌的或细胞内蛋白质的产生。这些包括例如家族性高胆固醇血症、血友病、Gaucher’s和Fabry’s病及尿素循环失调和糖原贮存疾病。然而，尽管有这些益处，但是将核酸靶向输送至肝仍受不能实现被输送的核酸的长期基因表达的限制。
肝位于腹腔右上象限，就在膈肌之下。其是非常血管化的结构。特征在于门静脉和肝动脉双重输入的血液流入，及通过肝静脉的单一输出的血液流出，其汇入肝静脉流入上腔静脉。双重血管流入的结果导致血流为1500mL/分钟，75％由门静脉提供，25％由肝固有动脉提供(Abdalla et al.(2004)Surg.Clin.N.Am.,84:563-585)。图1的A示出大鼠肝的解剖和血管机构。一旦门静脉进入肝，其分为右支和左支，提供给肝叶。第一个分支朝向右侧为右下门静脉和右上门静脉，提供给右叶。第二个分支朝向左侧为门静脉尾支，其分为两条静脉：尾上支和尾下支。门静脉以其主要的两个分支持续提供右中门静脉，其供给中叶的右侧部分，及左门静脉，其释放左中门静脉和左后门静脉，供给相应叶。肝的动脉灌注由肝固有动脉提供，一旦其进入肝，分为右支和左支以提供给肝叶，随后随着门静脉分布。
传统的人大体解剖学基于表面特征将肝分为四个叶。在其前面，镰状韧带将肝分为左叶和右叶。如果将肝翻转至脏面，其在右叶和左叶之间有另外两个叶，这些是尾状叶和方叶。
基于肝的功能/血管特征，可以进一步划分(图1，B)。三条主要的肝静脉(右肝静脉、中肝静脉和左肝静脉)将人体的肝分为四个部分或区段(右后段、右前段、左中段和左外侧段)，每个段均由门静脉系统的相应分支供给。门静脉进一步分支将人肝细分为8个解剖学独立的亚区段，其拥有输出的肝静脉系统，输入的门静脉系统，输入的动脉系统和胆管系统。亚段I和IV相应于左中段，亚段II和III相应于左外侧段，亚段V和VIII相应于右前段，亚段VI和VII相应于右后段。
肝的实质由结缔组织囊组成(称作Glisson’s囊)，其形成遍及肝的小叶间隔，肝被分为称作小叶的小单位。这个实质也被血管、淋巴管和胆管贯穿。每个小叶均含有六边形的肝细胞排列，其形成自中央静脉向外放射状的一或两个细胞厚度的细胞团(stacks)或肝板。所述细胞板由窦状隙间隔。肝细胞平均预期寿命为大约5个月。当肝实质丧失时，这些细胞也能充分再生。在每个小叶定点存在门管三联体，其含有胆管及肝动脉门静脉的终末分支(小叶间血管)。源自小叶间血管的血管分布在小叶周围，其提供血液流向输入管进入窦状隙及接近中央静脉。
在本发明提供的方法中，肝或者肝叶或者其区段的区室化可以通过将肝或肝叶或其区段与体循环的连通分离而实现，例如与脉管系统、胆管系统或淋巴系统分离。实现区室化的方法包括血管和/或实质钳紧方法。使得肝血管分离和闭塞的方法为本领域熟知(见例如Buell et al.(2001)Arch.Surg.,136:569-575；Belghiti et al.(1999)Annals ofSurgery,229:369-375；Chowdhury(2010)BSMMU J.,3:112-119；Chouillard et al.(2010)Annals of Surgical Innovation and Research,4:2-12；Chaib et al.(2003)ArqGastronenterol.,40:131；Abdalla et al.(2004)Surg.Clin.N.Am,84:563-585)。这种方法包括但不限于肝血管隔离、单侧入肝血流阻断法、瘤蒂钳、区段血管闭塞、不阻断下腔静脉的全血管闭塞和肝血管闭塞术。
在本发明方法的实施例中，肝的某区段或部分的区室化可以通过导致实质受压的方法实现。例如，可以进行人工加压，如指捏，其中肝实质在拇指和另一手指之间挤压。在另一个实施例中，使用瘤蒂钳，通过为在手指之间的蒂施压或者使用能为蒂施加压力的钳或其它相似装置。在进一步的实施例中，区室化可以通过将实质加压钳或闭塞钳横过肝叶放置而进行。举例的可用于肝叶的实质加压的钳包括但不限于Longmire-Storm钳(V.Mueller,Stainliss,Germany,catalog#SU-9080)、Lin或Chu肝钳(Pilling no.604113-61995)、Inokuchi肝钳(Kanematsu et al.(1984)Jpn.J.Surg.,14:432-3)、Doty钳(PatentNo.3,667,471)和Vernick钳(美国专利号5,203,786)。在一些实施例中，进一步的区段血管分离可以通过在所述钳内放置更小体积的实质钳而实现。
典型地，在本发明方法的实施中，可以将某肝叶与其它肝叶松动以选择性区室化肝的某个区域或部分。松动允许接近肝叶或区域以允许实质受压或钳紧。仅松动肝的一部分或区域的能力也意味着所述方法实现选择性输送被输送物质是可能的。由于肝的区段化解剖学结构为自身含有的单位，因此可以实现其特定叶、区段或一部分的区室化，同时保持血液流向其它区段。例如，可以对蒂、每个区段化的蒂或者实质区域的选择性钳紧或闭塞，以实现区域或区段的区室化。松动可需要分开相关联的区段和/或其它相关联的腺体。松动或分离肝的各个叶或区段的方法和技术为本领域技术人员熟知。例如，尾状叶、左叶或左中叶均是可适度血管分离及可接近的。哺乳动物物种之间的肝解剖学差异可提出在一个物种中较在另一物种中更易分离的特定区域或肝叶。本领域技术人员可识别其它动物中相应肝叶，且可以鉴别适于松动或分离以使用本发明的方法进行区室化的肝叶或区段。
在本发明特定实施例中，尾状叶、左叶或左中叶或者其一部分被区室化。如果需要，可以进行肝叶或区段从其周围附着物的回缩和剥离，以允许其接近可以适当与脉管分离而区室化的区域，不用损害或影响组织或器官的其它区域或周围结构。例如，尾状叶位于区段IV的后面，与下腔静脉和门静脉紧邻。尾状叶的松动可以通过分开胃肝网膜和背侧尾状叶-腔静脉韧带而实现。肝的左叶可以通过分开左三角韧带而松动。相似的方法可用于松动人或前体对象中相应的肝叶。
一旦肝、其肝叶或区段被区室化，被输送物质可以输送至区室化的肝叶、区域或区段，如下文进一步描述。
b.其它器官
本发明提供的方法基于各种因素可用于各个器官，所述因素包括核酸或编码的多肽的靶、器官及其脉管的可接近性、治疗的失调或疾病、编码的多肽的性质及其它因素。除了肝之外，实现血管分离和区室化的靶向器官或其部分可以是CNS(脑或脊髓)、周围神经系统(例如神经)、胰腺、胆囊、内分泌腺(垂体、肾上腺、甲状腺等)、心血管器官(例如心脏和血管)、皮肤、泌尿生殖器官(肾、子宫、子宫颈、前列腺和尿道)、呼吸系统器官(例如肺或气道)、骨、肌肉和肠道。这个列表不是穷举性的，本领域技术人员知道另外的靶器官及其分叶。
皮肤是实施本发明的区室化方法的靶器官。例如，皮肤的角化细胞是基因治疗的合适靶细胞，对其进行处理对于由遗传缺陷所致的疾病或病症、由于可释入循环中的蛋白质的产生所致系统性疾病及创伤或瘢痕是合适的(例如Meng et al.(1998)J.Clin.Invest.,101:1462；Liu et al.(2001)Yonsei Medical Journal,42:634-645)。皮肤也示出可顺从由于本发明的区室化方法所致的短暂缺血(见例如Willms-Kretschmerand Majno(1969)The American Journal of Pathology,54:327)。例如，在本发明的方法中，维持区室化一定时间，以足以将转导细胞或者使被输送物质进入细胞(例如角化细胞)。例如，区室化的时间可以少于2小时，通常为至少10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或60分钟。皮肤的区室化可以通过本发明所述能切断皮杜与周围循环的任何技术实现。在特定实施例中，可以使用钳。在这种实施例中，皮肤的折叠可以分离或松动并适配置于钳之间。钳的压力可以如本发明所述调节，由此实现与体循环的分离(见例如Willms-Kretschmer andMajno(1969)The American Journal of Pathology,54:327)。
肺是实施本发明的区室化方法的靶器官。肺的基因治疗可针对急性和慢性疾病的治疗，包括癌症、哮喘、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶缺陷及呼吸窘迫综合征等等。在本发明的方法中，区室化典型是对肺的某一区段或区域进行的，同时保持肺的通气。例如，肺的支气管区段可以被区室化。可以通过使用血管钳闭塞支气管动脉和/或通过直接实质钳紧支气管而区室化。
肾脏的基因治疗可用于治疗肾脏疾病，包括遗传性肾脏疾病(例如Alport综合征)。肾的区室化可以例如通过肾蒂闭塞而实现，例如通过钳紧肾蒂；通过使用血管钳钳紧肾实质进行区域性实质加压，如长弧形血管钳；或者肾扎带、止血带或绷带装置。对于实质钳紧，可以使用腹腔镜实质钳，包括但不限于Satinsky-或Debakey-style钳(见例如Torenet al.(2010)Can.Urol.Assoc.,4:E133-E136；Ko et al.(2010)Korean J.Urol.,51:8-14和Joung et al.(2007)Korean J.Urol.,28:265-269)。
2.通过施用被输送物质输送核酸分子
在本发明的方法中，通过将被输送物质直接施用至组织细胞而将核酸输送至器官或组织或其部分中的细胞。被输送物质可以在器官或其部分的区室化开始之前、同时、间歇或随后给予。典型地，在本发明的方法中，被输送物质在开始器官或其部分的区室化之后立即给予，如在开始器官或其部分的区室化之后10分钟之内或不超过10分钟，通常不超过5分钟。例如，被输送物质在开始区室化之后不超过30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟内输送给对象。
a.输送方法及施用途径
通过给予被输送物质输送核酸是通过能将被输送物质输送给对象的区室化器官或其部分的任何方法进行的，特别是输送给靶组织细胞以在其中基因表达。例如，直接输送给实质细胞。在肝的情况中，靶实质细胞是肝细胞，而非实质细胞包括血管内皮细胞、Kupffer细胞和支持间质细胞。
在一些实施例中，可以直接将被输送物质输送至患者，在这种情况中，所述对象直接暴露于被输送物质(例如体内输送)。例如，被输送物质可以通过直接注射进组织的实质或间质间隙中而输送。在其它实施例中，可以间接输送被输送物质，在这种情况中，首先将细胞用被输送物质在体外转化，然后移植患者中(例如离体输送)。例如，对于离体基因治疗方法，可以将实质细胞从机体除去并将其离体暴露于被输送物质，随后再植入细胞以区室化组织或器官或其部分。
在特定实施例中，通过直接组织或器官注射输送被输送物质。例如，被输送物质通过直接注射进组织或器官实质中而输送，例如通过实质内给予区室化的组织或器官或其部分，如肌肉(肌肉内)、肝、脑、肾脏等，如本发明所述及本领域已知。细胞间隙输送至实质具有优于系统性输送方法的优势。系统性输送核酸，如通过静脉内、门静脉内和动脉内给予被输送的物质，增加了被输送物质暴露于体循环的几率。这样可导致非选择性组织靶向、降低或减少细胞摄取效力而导致降低的基因表达、需要大量或大剂量被输送物质以保证组织细胞的摄取、暴露于免疫细胞并激活不希望的免疫应答，及与系统性输送方法相关的其它问题。在此发现直接注射进细胞间隙中，结合组织细胞的区室化(例如通过血管闭塞和分离)，增加了组织细胞摄取被输送物质的频率和效力，同时使暴露于体循环的几率最小化。
例如，除了增加被输送物质被组织细胞摄取的频率和效力之外，实质输送还可以避免被输送物质暴露于免疫细胞。例如，为了输送核酸分子至肝或其部分，通过直接实质注射被输送物质的间质输送如通过肝内注射可避免Kupfer细胞吞噬(见例如Crettaz et al.(2006)Hepatology,44:623-632)。Kupfer细胞是肝的噬菌性巨噬细胞，存在于肝窦状隙中，因此在静脉内给予被输送物质时暴露于被输送物质。相反，肝的肝组织细胞通过Disse间隙与窦状隙隔开。因此，将被输送物质直接靶向位于胞间隙内的肝细胞避免了不希望的可由Kupfer细胞激活起始的促炎应答，并增加由固有的组织细胞的摄取。相似地，本发明也涵盖了将被输送物质直接输送至其它器官的间质细胞。因此，在本发明的方法中，被输送物质或组合物直接输送给组织实质。
典型地，输送的被输送物质以组合物形式提供。举例的这种被输送物质和组合物是分别在章节D和E中描述的那些。被输送物质可以在药物可接受的液体或水溶液载体中输送。被输送物质可以直接导入组织或器官或其部分中，通过使用注射针或相似装置注射。被输送的载体中被输送物质的体积为大约0.5mL-100mL，如0.5mL-50mL、1mL-20mL、5mL-50mL、或者5mL-20mL。
b.促进输送的方法
通常地，本发明的方法利用注射方法，避免注射进动脉、静脉及其它相关的脉管中，及避免注射进导管和淋巴系统的管道中。被输送物质通过实质注射法的输送可以通过使用成像技术辅助，成像技术可以区分实质组织和细胞与周围脉管及相关结构。所述成像可以在注射之前、与注射同时和/或在注射之后立即进行。这种成像技术包括但不限于磁共振成像(MRI)、超声波(ultrasound)和超声检查(sonography)技术，包括多普勒超声检查技术。例如，可以使用B-glow、3-D成像或者彩色多普勒。如果需要，可以注射造影剂以促进成像。例如，这种方法也可用于使在血管或导管系统的管腔中导入所述物质的可能性最小化。
在本发明提供的方法中，由组织细胞摄取的输送物质的效力可以通过使用本领域技术人员已知的各种技术增加。应理解增强输送物质摄取的方法可减少区室化时间(如上述)，因为需要较少的时间以保证足够的被输送物质由细胞摄取。特定方法的选择可以由本领域技术人员根据经验确定，且依赖于被输送的特定输送物质、给予途径(例如特定组织或器官)及给予的物质的剂量或量。在一个实施例中，被输送物质可以与脂质、聚合物转染试剂或者气体物质一起配制。在其它实施例中，可以使用物理方法增强输送。举例的增强被输送物质输送的物理方法包括但不限于“基因枪”方法、电穿孔、超声穿孔、压力或超声波。或者，为了增强体内基因输送及最小的组织损害，药物组合物可以使用飞秒红外激光(LBGT技术)给予。
在一个实施例中，被输送物质、特别是被输送物质是病毒或病毒样颗粒如腺病毒的摄取可以通过存在各种物质而被增强。例如，被输送物质可以与是病毒特异性细胞表面受体的转录增强子的物质或化合物一起给予。这种物质或化合物包括例如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂包括氧肟酸、环形四肽、苯酰胺、亲电酮或者脂肪酸化合物类别的那些物质。例如，HDAC抑制剂包括但不限于曲古抑菌素A、伏立诺他(SAHA)、belionostat(PXD101)、LAQ824、帕比司他(LBH589)、恩替诺特(MS-275)、C199、mocetinostat(MGCD0103)、罗咪酯肽(Istodax)、丙戊酸、PCI-24781、SB939、resminostat、givinostat、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、Kevetrin或者曲古抑菌素A(TSA)。举例的HDAC抑制剂是丙戊酸，其是腺病毒受体CAR和治疗性转基因的转录增强子。研究表明腺病毒摄取在存在丙戊酸的条件下增加(Segura-Pancheco et al.(2007)Genet.Vaccines Ther.,5:10)。在这种实施例中，病毒载体是与所述物质一起配制的或者是单独配制的。在其中病毒载体是单独配制的情况中，转录增强子物质或化合物在输送被输送物质之前输送。所述转录增强子物质可以给予大约1mg/kg-100mg/kg，例如大约20mg/kg-60mg/kg，如40mg/kg。该剂量可以分开及单独给予以达到总剂量。例如，给予周期可以是1次/天，2次/天，3次/天，4次/天或者5次/天。给予频率可以是每天给予，至少3天、4天、5天、6天、7天或2周。所述物质可以通过任何给予途径给予，如皮下、静脉内、口服或局部给予。在特定实施例中，所述物质是通过直接实质内施用的。
在一些实施例中，被输送物质与结合或者与被输送物质复合的并介导其进入细胞中的物质或输送运载体一起配制的。举例的物质包括但不限于阳离子脂质体和脂质，脂蛋白，合成的聚合物或多肽，矿物质化合物或维生素。举例的聚合物包括聚阳离子或聚阴离子。例如，被输送物质可以与聚胺、磷酸钙沉淀、组蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、DEAE葡聚糖、聚凝胺、聚两性电解质复合物、亚精胺、purtrescine、人血清白蛋白、DNA结合蛋白、非组蛋白染色体蛋白、来自DNA百度的包被蛋白及N-取代的甘氨酸聚合物。
例如，被输送物质可以在脂质中包入胶囊或者在脂质体中包装以输送给对象或从对象中衍生的细胞。脂质包囊通常是使用能稳定结合或诱捕并保留核酸的脂质体完成。浓缩的核酸被输送物质与脂质制备物的比率可以变化，但是通常是大约1:1(mg DNA:微摩尔脂质)，或者更多的脂质。脂质体制备物包括阳离子(正电荷)、阴离子(负电荷)和中性制备物。这种制备物为本领域技术人员熟知且易于获得。例如，举例的阳离子脂质包括但不限于N[1-2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三乙胺(DOTMA；得自产品线)；DDAB/DOPE和DOTAP/DOPE。阴离子和中性脂质体也是易于获得的，且可以从如下物质中制备：磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，如可商购的制备物Avanti Polar Lipids。所述脂质体包括多层脂质体(MLV)、小单层脂质体(SUV)或者大单层脂质体(LUC)。
在一些实施例中，被输送物质可以是纳米粒子，其含有官能团或靶向剂以进一步有助于和增加所述物质的细胞输送，例如结合受体的靶分子在被靶向的细胞中表达。官能团或靶向剂包括例如细胞靶向组分，其增强所述物质或复合物与细胞的结合。细胞靶向组分可以是但不限于蛋白质、肽、脂质、类固醇、糖、碳水化合物、(非表达的)聚核酸或者合成的化合物。例如，细胞靶向信号可包括增强受体的细胞结合的配体。这种配体包括但不限于胰岛素、生长因子(例如EGF或FGF)、运铁蛋白、包含RGD序列的肽。其它靶向组分包括但不限于化合物基团，其与细胞上的硫醇、巯基或二硫基团、叶酸及其它维生素反应。
在本发明的实施例中，可以通过电穿孔帮助注射。电穿孔是包括应用脉冲电场以在细胞膜产生瞬时穿孔的技术，不导致细胞的永久性损伤，从而允许导入外源分子。通过调节电泳系统产生的电脉冲，被输送物质可发现其穿过在所述方法期间产生的细胞中通道或孔的方式。使用电穿孔在体内将被输送物质输送至肌肉、肝、皮肤及其它组织或器官的方法为本领域已知(见例如美国专利No.5,704,908；公开的美国专利申请No.US2002/0102729；Titomirov,A.V.,et al.(1991)Biochim Biophys Acta 1088:131-134；Muramatsu,T.,etal.(1997)Biochem Biophys Res Commun 233:45-49；Suzuki,T.,et al.(1998)FEBS Lett425:436-440；Aihara,H.and Miyazaki,J.(1998)Nat Biotechnol 16:867-870；Mir,L.M.,et al.(1998)C R Acad Sci III 321:893-899；Rizzuto,G.,et al.(1999)Proc NatlAcad Sci USA 96:6417-6422；Goto,T.,et al(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97:354-359；Somiari,S.,et al.(2000)Mol Ther 2:178-187)。
在其中输送是输送至离体细胞、通常分离自对象的细胞实施例中，可以使用本领域技术人员已知的输送核酸至细胞的任何方法，包括可用于体内输送的任何描述的方法。例如，核酸的输送可以使用葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、DNA在脂质体中包囊或者直接显微注射而实现。对于病毒DNA输送，细胞也可以用病毒颗粒转导。然后将转化的细胞作为被输送物质用于本发明方法中。离体输送及将被输送物质转化的细胞再植入对象中的方法为本领域已知并描述(见例如InternationalPublication No.WO93/14778)。
c.输送剂量及方案
给予的被输送物质的量或剂量可以基于特定应用根据经验确定。通过本发明的方法，剂量应答动力学是线性的，由此在被输送的物质例如病毒如腺病毒或腺伴随病毒的给予的量与产生的转基因产物之间是直接相关的。例如，发现40个转导的病毒的基因组足以产生治疗量的蛋白质(见例如Nathwani et al.(2002)Blood,100:1662)。因此，在本发明的方法中，所述方法允许给予较低量的病毒以获得足够的基因组拷贝数，通过细胞例如肝实质细胞的病毒转导以产生治疗量的编码的蛋白质。例如，所述量足以用40个基因组/细胞的细胞或更高的病毒转导细胞。本发明的方法可进一步增加每个细胞的基因组拷贝，从而与现有方法相比在较低剂量进一步增加产物的持续表达。因此，使用本发明的方法，可以使注射的颗粒的量、细胞内基因组及表达的蛋白质的量准确相关。
本发明的方法与本领域现有基因治疗方法相比具有优势。例如，在现有方法中，为了输送腺病毒如输送至肝，对肝转导是非线性剂量应答的，从而较低剂量导致不可检测的蛋白质表达，而较高剂量获得转基因表达(Rosewell et al.(2011)J.Genet.Syndr.GeneTher.,S5:1-16)。然而，所述较高剂量也起始免疫激活和毒性。因此，使用腺病毒基因输送剂量水平的现有方法必须平衡实现足够的转基因表达所需的水平与不导致毒性致死性的水平。通常地，在现有方法中，给予的以实现足够的蛋白质产生的腺病毒的这些量相对较高，为大约高于1.5x1012个病毒颗粒/千克(vp/kg)，通常为至少1x1011个病毒颗粒(vp)/千克(kg)(vp/kg)，如至少5x1011vp/kg或更高。例如，在猕猴中经静脉内给予剂量为4x1012vp/kg的编码因子IX的AAV是实现持续表达以恢复8％的因子IX活性所必需的(Nathwani etal.(2002)Blood,100:1662)。人体临床试验示出需要4x1011vp/kg的剂量以校正10％的因子IX活性仅几天时间及表达持续仅2-6周(Mingozzi et al.(2011)Nature ReviewsGenetics,12:341)。典型通过静脉内输送方法提供的这些量也仍具有一些轻微毒性、免疫激活和/或组织损害。
特别地，在本发明的区室化方法中，给予的被输送物质的剂量或量是这样的，由此产生的蛋白质产物的水平能发挥治疗性或预防性作用。典型地，在本发明的方法中，所述水平持续至少6个月、7个月、8个月、9个月、10month,11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、10年、15年或更长时间。由于给予的被输送物质与产生的产物的量之间存在线性关系，因此这种剂量可以由本领域技术人员确定。确定剂量中需要考虑的事项包括特定的遗传治疗方法和治疗产物、蛋白质产物的半衰期、用于表达转基因产物的启动子、特定的被输送物质及其它相似因素。
在其中被输送物质是非病毒核酸的情况中，DNA或RNA的有效剂量范围是大约0.005mg/kg体重至大约50mg/kg体重。通常地，所述剂量是大约0.005mg/kg-20mg/kg，更通常是大约0.05mg/kg-5mg/kg。例如，对于非病毒核酸(例如质粒、裸DNA、siRNA、shRNA或者反义核酸)，输送0.01mg-2000mg，如0.05mg-1500mg、1mg-1000mg、10mg-1500mg或者100mg-1000mg。
在其中被输送物质是病毒如腺病毒或腺伴随病毒或其它病毒的情况中，剂量典型以病毒颗粒(vp)个数或噬斑形成单位(pfu)表示，剂量通常为低于1x1012个颗粒或1x1012pfu，通常为大约10-1x1012个颗粒、10-1x106个颗粒、1x103-1x1012个颗粒，如1x106-1x1010个颗粒或者1x107-1x109个颗粒，或者为大约10-1x1012pfu、10-1x106pfu、1x103-1x1012pfu，如1x106-1x1010pfu或者1x107-1x109pfu。可需要比列出的剂量更低或更高的剂量。对于任何特定对象或患者的具体剂量和治疗方案可依赖于多种因素，包括具体的遗传治疗方法及其治疗产物、特定化合物或物质的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给予时间、排泄速度、药物组合、疾病的严重度和病程、状况或症状、对象或患者的疾病倾向、状况或症状、给予方法及主治医生的判断。本领域的主治医生已知怎样确定精确剂量。
通常地，使用本发明的区室化方法，与现有方法相比可以给予明显降低数量的被输送物质，实现核酸分子如治疗性核酸分子的最佳输送。此外，由于被输送物质的剂量与产生的治疗产物的量之间是线性关系，因此可以控制给予的被输送物质的量。结果是使用本发明的方法与通过静脉内给予相同的被输送物质相比可以给予低直至100倍或更少的被输送物质。例如，在本发明方法中给予靶器官或组织的被输送物质的量可以比经静脉内给予相同的被输送物质低直至10-倍、100-倍、200-倍、300-倍、400-倍、500-倍、600-倍、700-倍、800-倍、900-倍、1000-倍、5000-倍、10000-倍或更低。本领域技术人员已知怎样确定在本发明方法中被输送物质的特定量，基于特定的被输送物质、核酸分子及被治疗的疾病或状况而定。
本领域技术人员熟知各种基因治疗载体和物质在治疗各种疾病或失调中的应用。基于在现有方案中通过静脉内输送(或者其它给予方法)给予的物质的剂量和量，本领域技术人员可通过使用本发明的方法降低用于经实质内施用于区室化的组织或器官或其部分中相同载体或物质的剂量。例如，对于用腺病毒靶向肝的基因治疗，如在其基因组中含有异源核酸分子的重组腺病毒，给予人体的腺病毒的剂量为大约2x109至6x1011vp/kg，相应于平均75kg体重人对象给予大约1.5x1011vp至4.5x1013vp，通常由于毒性和/或致死性或者由于无效的肝细胞转导而成功率较低(Brunetti-Pierri et al.(2009)Molecular Therapy,17:327-333)。在本发明的方法中，将腺病毒如在其基因组中含有异源核酸分子的重组腺病毒给予肝或其它组织或器官或其部分，给予量为低于1x1012vp或低于1x1012pfu，典型低于1x1010vp或低于1x1010pfu。例如，使用本发明的区室化方法，在靶向肝的基因治疗方法中可以给予低于1x1012vp、1x1011vp、1x1010vp、1x109vp、1x108vp、1x107vp、1x106vp、1x105vp、1x104vp、1x103vp或更低的腺病毒。在另一个实施例中，使用本发明的区室化方法，在靶向肝的基因治疗方法中，可以给予低于1x1012pfu、1x1011pfu、1x1010pfu、1x109pfu、1x108pfu、1x107pfu、1x106pfu、1x105pfu、1x104pfu、1x103pfu或更低的腺病毒。在这种实施例中，所述量可以给予人体对象。
滴定病毒以制备其组合物和/或确定剂量数量的方法为本领域技术人员熟知。例如，滴定效价可以通过OD260测定而确定，这种技术是测量病毒DNA和蛋白质的浓度。为了进行这种测定，需要纯化的病毒原种，因为生长培养基中的血清及其它因子可干扰吸光率读取。例如，病毒可以使用CsCl密度梯度通过条带或者本领域技术人员已知的其它方法纯化。典型地，产生病毒稀释物。每mL的光粒子单位(opu)或病毒颗粒(vp)可以从吸光率中确定。例如，对于腺病毒，vp/mL是将1.1x1012与OD260吸光率和病毒稀释倍数相乘确定的。OD260测定不能辨识活的与死亡的病毒。在另一个实施例中，可以通过使用本领域已知的标准方法进行噬斑测定确定效价。典型地，将可以单层生长的细胞如293细胞以中等高密度(例如为或大约或高于70％)铺板，随后用不同稀释度的病毒原种感染。在允许细胞感染和转导的足够时间之后，在细胞中计入琼脂糖溶液。通过细胞裂解形成的噬斑在几天及直至10天内可见并可以计数(典型通过使用可区分噬斑区域的染料)。通过用噬斑数目除以稀释倍数，计算效价，每mL的噬斑形成单位(pfu)。在另外的实施例中，可以使用终点稀释测定。这个测定与噬斑测定相似，除外的是产生大量稀释液(通常为10-3至10-10)。代替琼脂糖覆盖以鉴别噬斑，也可以在显微镜下人工观测感染的平板以鉴别具有细胞病理效应(CPE)的孔。可以基于Spearman-Karber方法对平板的孔评分，以确定终点稀释度。
剂量治疗方案可以是单剂量方案或者多次剂量方案。给药的频率可依赖于给予的物质、疾病的进展或者对象的状况，及本领域技术人员已知的其它考虑事项。例如，被输送物质或组合物可以1次输送，或者可以多次给予输送，如至少或大约或2、3、4、5、6、7或8次给予。治疗也可以是在单一靶向部位，或者在多个靶向部位。例如，被输送物质可以在每个靶向部位单一注射，或者可以在靶向部位重复注射。例如，在治疗肺部疾病如囊性纤维化中，可需要靶向至少25、50、75、80、85、90或95％的肺部，需要多次注射以在对象体内获得足够的转基因产物和/或功能改善。因此，可以使用多个注射部位。重复注射可以接连进行，如在前一次注射后立即进行，或者可以延迟几分钟、几小时、几天或几年。在一些实施例中，将被输送物质给予器官或其部分中的一个以上的部位，特别是在尝试高水平的转导或表达的情况中。例如，在一些实施方案中，除了第一次给予的部位之外，将含有被输送物质的组合物给予另一部位或位置。所述另一部位或位置可以是在靶组织的同一区域或部分内与第一个部位相邻或接近的位置，或者可以是在离开第一个部位当仍在相同靶器官内的位置(例如在肝或肺的不同叶或区域)。
3.区室化终止/释放
在输送被输送物质之后，将所述组织或器官或其部分的区室化维持一段时间，以足以使得被输送物质被足够摄取和/或使被输送物质最小化暴露于体循环。例如，区室化足够时间以使得被输送物质进入细胞，同时避免进入体循环。这个区室化的作用意味着毒性和免疫激活被最小化。通常地，维持组织或器官或其部分的区室化以限制、最小化或避免毒性和免疫激活(例如通过局部或系统性细胞因子表达、炎症侵润如中性粒细胞和淋巴细胞侵润、和/或组织酶等评定)。本领域技术人员基于包括基于的特定被输送物质、靶组织或器官或其部分、治疗对象或者特定应用等因素可根据经验确定维持区室化的精确时间。评定与免疫激活和毒性相关的基因表达及参数的方法和技术为本领域技术人员已知，举例的这种方法和技术在章节F中描述。
在本发明的实施例中，将组织或器官或其部分的区室化持续时间维持一段时间，以足以使得低于10％、通常低于5％、4％、3％、2％、1％或更少的被输送物质暴露于体循环。评定被输送物质或转基因产物的体循环水平的方法在章节F中提供。此外，实施例2例证了检测体循环如在周围血中被输送物质的测定法。
在本发明的实施例中，维持组织或器官或其部分的区室化的持续时间以使得选择的被输送物质由所述组织或器官或其部分的细胞摄取高于或大约高于80、85、90或95％。例如，将所述组织或器官或其一份的区室化持续时间维持一段时间，由此至少80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更多的被输送物质存在于所述组织或器官的固有细胞的细胞内。例如，为了输送至肝，将肝或其部分的区室化持续时间维持一定时间，由此至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的被输送物质由肝细胞摄取在细胞内。评定被输送物质的细胞内存在和定位的方法在章节F中描述。
本发明提供的方法可实现所述组织或器官或其部分内长期的基因表达，超过60天、90天、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月或者超过24个月。典型地，将组织或器官或其部分的区室化维持一定时间，以实现基因产物表达至少1年的时间。
区室化的最佳持续时间可以根据各种因素而变化，包括特定的靶器官或组织或其部分、被输送物质，及用于输送的特定方法等。例如，不同的组织或器官固有细胞对于被输送物质的细胞摄取呈现出不同的胞吞能力和动力学。这个胞吞功能可以根据特定的被输送物质受影响或不同。例如，对于是病毒载体如腺病毒的被输送物质，腺病毒感染的动力学在与其受体结合并相互作用时起始，所述受体对于腺病毒亚群A、C-F是柯萨奇病毒BAd受体(CAR)。与原始受体的结合介导相关病毒的胞吞。在转导后1分钟内，通常大约2％的病毒在细胞内。通过释放胞内内容进细胞质，分解的腺病毒逃往细胞溶质。在转导后30分钟内或之前，大约80％的病毒在细胞内。基于进一步分解，衣壳通过细胞质被转运，其中其最终输送病毒DNA进入细胞核。在转导后60分钟内或之前，所有转基因均被输送至细胞核。
应理解被输送至组织或细胞的被输送物质是能由固有细胞摄取的物质。如果需要，可以修饰被输送物质以增加或介导特定细胞的摄入。例如，本领域已知腺病毒的纤维壳粒修饰可允许病毒载体附着于细胞靶以有效地摄入病毒(见例如Campos et al.(2007)Curr.Gene Ther.,7:189-204；Russell WC,(2009)J Gen.Virol.,90:1-20)。此外，应理解细胞内摄取的时间可以通过使用促进摄取的方法而减少。这种方法包括电穿孔、基因枪、超声穿孔、lipoplexes、polyplexes、去污剂，或者与增加摄取受体转录的物质或化合物一起配制，以及本领域技术人员已知的其它方法，如上文所述。体内被输送物质进入细胞如进入组织或器官固有细胞中的动力学可以通过本领域已知方法确定(见例如章节F)。
此外，血管区室化的最佳持续时间可依赖于所述器官或组织或其部分及其中固有细胞对缺血状况的耐受性，是本发明方法中考虑的一方面。一些器官或组织呈现出对缺血状况较其它状况更低的耐受性。例如，肝细胞通常较神经元或心肌细胞在进行血管分离时能存活更长时间。肝通常耐受血液流动中断长达60分钟或更久(Abdalla et al.(2004)Surg.Clin.N.Am,84:563-585)。对于肾脏，血管分离可进行预定时间以允许几乎所有核酸均由组织细胞摄取。肾脏典型耐受缺血时间长达2小时，但是通常不超过1小时或不超过30分钟(Hoffman et al.(1974)AMA Arch.Surg.,109:550-551；Thompson et al.(2006)J.Urology,177:471-476)。肌肉耐受缺血的时间是长达4小时(Blaisdell F.W.(2002)Cardiovascular Surgery,10:620-630)。本领域技术人员可监测并评定组织或器官，以确定实现足够的细胞摄取、最小化体循环暴露及导致器官或其部分无缺血或者可逆的或可恢复的可接受的缺血所需的时间。例如，数字光处理高光谱成像(HSI)可用于构建所述组织或器官或其部分的“实时”组织氧合图(Best et al.(2011)Proc.SPIE,7932,793202)。
在本发明方法的特定实施例中，组织或器官或其部分的区室化超过15分钟。例如，如上文所述将组织或器官或其部分的区室化的时间维持至少或至少大约或直至15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟，随后起始区室化和/或给予被输送物质。应理解在存在促进摄取或摄入的物质的条件下，维持区室化的时间可以少于15分钟。因此，在本发明的实施例中，维持组织或器官或其部分的区室化的时间为至少或至少大约或直至5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15分钟或更长时间。在某些实施方案中，维持区室化至少大约或直至30分钟。通常地，在本发明任一方法中，组织或器官或其部分的区室化不超过60分钟，如超过15分钟但小于60分钟。
例如，在肝或其部分通过本发明的方法区室化的情况中，维持肝区室化的时间是至少或至少大约或直至15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟，随后开始区室化和/或给予被输送物质。通常地，在本发明任一方法中，肝或其部分的区室化不超过60分钟，如至少或至少大约15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟，但是少于60分钟。例如，区室化可以是大约15-60分钟、15-50分钟、15-40分钟、15-30分钟、20-60分钟、20-40分钟，通常为大约30分钟。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法可进一步包括从所述器官或其部分或者术野中除去细胞外的被输送物质(即部分给予的但未由区室化器官或其部分的细胞摄取的被输送物质)。除去步骤可包括吸收、抽吸或者冲洗，由此一旦恢复所述器官或其部分的血液循环，几乎没有被输送物质到达体循环。因此，所述除去步骤在恢复所述器官或其部分的血液循环之前进行。
在区室化一段时间之后，结束对器官或其部分的区室化。这通过恢复组织或器官或其部分与体循环的连通而实现。例如，区室化通过恢复器官或其部分的血液循环而结束。血管分离的恢复可以通过除去用于阻断血液流向所述组织或其部分的装置、器械或工艺而实现。例如，可从所述组织中松开实质钳。在其它实施例中，可以解脱组织的某区域或部分的受压。技术人员已知小心地除去用于阻断血液流向组织或器官或其部分的装置、器械或工艺，由此不发生对下面的组织、血管、静脉或动脉或者导管的损害。例如，实质钳的压力可以小心除去，以控制血液流向组织、器官或其部分的恢复。
D.被输送物质
用于本发明方法、应用或组合物中的被输送物质可以是任何希望的核酸分子，或者含有任何核酸分子的运载体、构建体或复合物。特别地，被输送物质是具有希望的功能或者编码选择的具有希望的功能的多肽的核酸分子或者包括这样的核酸分子。被输送物质可以是DNA(例如双链环形或线性DNA)、RNA、核酶或适体。此外，被输送物质可以是任何形式，包括但不限于裸DNA、microRNA、小干扰RNA，或者反义核酸。被输送物质可以含有异源核酸分子的构建体形式提供。本领域技术人员人员已知许多构建体以在体外或体内输送核酸至细胞。这种构建体包括基于病毒的输送系统和非基于病毒的输送系统。例如，被输送物质可以是含有核酸分子的构建体，其在纳米粒子(例如靶向或放射性标记的纳米粒子)、质粒或载体(例如病毒载体或表达载体)中输送。这种构建体为本领域熟知，其可易于适用于本发明的组合物和方法。
应理解使用的被输送物质的选择依赖于靶组织或器官位置。本领域技术人员已知根据经验确定和鉴别与靶组织或器官细胞的细胞摄取相容的被输送物质和/或输送方法。例如，本领域技术人员已知基于逆转录病毒的载体通常仅转导活跃分裂的细胞。肝细胞通常是静态的，因此输送基于逆转录病毒的载体至肝细胞需要这样的程序，从而所述方法包括刺激细胞分裂的步骤(例如肝部分切除术)。相反，基于腺病毒的载体能被输送至非分裂细胞。
在特定实施例中，本发明方法中使用的被输送物质典型是将不整合进宿主基因组中也不含有复制序列的物质。本发明发现甚至在不存在整合进基因组中的情况中，本发明提供的区室化输送方法也可以实现被导入的核酸分子6个月以上、及通常直至1年或1年以上时间的持续基因表达。然而，如果需要，整合进基因组中的核酸可用于本发明方法中。
1.核酸分子
用于本发明的方法、应用或组合物中的特定的被输送物质是或包括核酸分子，由此当在靶器官中存在或者分泌进血流中时，其输送和/或表达引起有益的活性或性质。例如，核酸分子的输送和/或表达导致失去的或缺陷(例如部分或非功能性)的基因产物置换、基因产物的过量产生、作为DNA疫苗、编码具有希望作用或治疗活性的多肽，或者抑制基因表达。例如，所述核酸分子可以是选择的编码具有希望作用或治疗结果的多肽的核酸分子。在另一实施例中，所述核酸分子是基因或基因产物的基于核酸的抑制剂，如基因转录或翻译的抑制剂。例如，被输送物质可以是短干扰RNA(siRNA)序列、反义序列或者micro-RNA(miRNA)序列。在另外的实施例中，被输送物质可以预防性应用以输送预防性蛋白质。在进一步的实施例中，核酸分子的输送和/或表达可编码用于农业应用中的蛋白质，例如用于改良肉品生产(例如通过阻断肌肉生成抑制素的产生)。本领域技术人员已知根据特定应用或治疗的特定疾病或失调而选择核酸，如在章节G中描述。
核酸分子可以作为裸DNA输送，或者可以在运载体中或者作为复合物或构建体输送。因此，应理解被输送物质是或包括核酸分子。例如，所述核酸分子可包括含有所述核酸分子的载体或质粒，如病毒载体或非病毒载体。核酸分子可以在脂质体中包囊。所述核酸分子可以与其它物质复合，如靶配体或其它组分，及作为纳米粒子输送。
所述核酸分子可以由启动子驱动以增强控制或调节表达。启动子与编码区可操纵地连接。本领域技术人员已知的任何强启动子均可用于驱动DNA的表达。启动子可以是组成型启动子，如CMV启动子、组织特异性启动子、可诱导或可调节的启动子。在一具体的实施方案中，被导入的进行基因治疗的核酸分子含有与编码区可操纵地连接的可诱导启动子，由此核酸的表达可以通过控制合适的转录诱导子的存在与否而控制。通常地，所述启动子是调节的启动子和转录因子表达系统，如公开的四环素调节的系统或者其它可调节的系统(见例如国际PCT申请公开WO 01/30843)，以允许编码的多肽被调节地表达。举例的其它启动子是组织选择性启动子，如在美国专利No.5,998,205中描述的那些启动子，包括例如α胎蛋白、DF3、酪氨酸酶、CEA、表面活性蛋白及ErbB2启动子。举例的可调节的启动子系统是Tet-On(和Tet-Off)系统，可得自例如Clontech(Palo Alto,CA)。这个启动子系统使得由四环素或四环素衍生物如强力霉素控制的转基因被调节的表达。已知其它可调节的启动子系统(见例如美国专利申请2002-0168714公开文本，名称为“Regulation of GeneExpression Using Single-Chain,Monomeric,Ligand Dependent PolypeptideSwitches”，其描述了含有配体结合结构域和转录调节结构域如来自激素受体的那些结构域的基因转换)。可以应用的其它合适的启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子和/或E3启动子；或者异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；Rous肉瘤病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；及ApoAI启动子。
在一些实施例中，本发明方法、应用或组合中的被输送物质是或包括编码希望的多肽的核酸分子。基于本发明方法中被输送物质的输送，编码的多肽可以是可用作生物治疗剂或药物的多肽。所述核酸分子可编码任何希望的基因产物，如细胞因子、凝集因子或凝血因子、激素、生长因子、酶、转运蛋白、调节蛋白、受体或者抗原。所述核酸分子可编码激素蛋白质，以调节细胞生长、细胞分化或者代谢。编码希望的治疗性多肽的特定核酸分子的选择依赖于被治疗的特定疾病或病症，这些为本领域技术人员所已知。例如，如果治疗对象患有I型糖尿病，则所述核酸分子编码胰岛素；如果所述对象患有血友病，则所述核酸分子编码特定的凝血因子；如果对象患有帕金森氏症，则所述核酸分子编码多巴胺；或者如果治疗对象患有家族性高胆固醇血症，则所述核酸分子编码LDL受体。本领域技术人员已知基于治疗对象的特殊需求选择希望的多肽及编码其的核酸。举例的核酸分子编码免疫调节性蛋白质、酶、激素、细胞因子、受体、抗体或者抗血管发生剂。所述核酸分子可编码是融合蛋白的蛋白质。
选择的核酸分子可编码是免疫刺激蛋白或者呈现免疫调节性质的多肽。这种核酸分子包括但不限于编码细胞因子的基因，例如白介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子，如白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-β、IFN-γ、IFN-α、TNF、IL-12、IL-18和flt3；刺激与免疫细胞(B7，分化簇28(CD28)，主要组织相容性复合物I类(MHC I类)，MHC II类，抗原加工相关转运子(TAPs))相互作用的蛋白质；肿瘤相关抗原(来自由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MART-1)的免疫原性多肽，gp100(黑素细胞蛋白pmel-17)；酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白1，酪氨酸酶相关蛋白2，黑素细胞刺激激素受体，黑素细胞相关抗原1(MAGE1)，MAGE2，MAGE3，MAGE12，B黑素瘤抗原(BAGE)，癌种系抗原(GAGE)，睾丸癌抗原NY-ESO-1，β-链蛋白，突变的黑素瘤相关抗原1(MUM-1),细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK-4)，caspase 8，通过单克隆抗体Ki-67(KIA)0205鉴别的抗原，人白细胞抗原(HLA)-A2R1701，甲胎蛋白，端粒酶催化蛋白，G-250，粘液素1(MUC-1)，癌胚蛋白，p53，Her2/neu，丙糖磷酸异构酶，细胞分裂控制蛋白27(CDC-27)，低密度脂质受体-GDP-l-海藻糖:β-d-半乳糖苷2-α-l-岩藻糖基转移酶融合蛋白(LDLR-FUT)，端粒酶逆转录酶，及前列腺特异性膜抗原(PSMA))，编码阻断抑制性信号的抗体的cDNA(细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)阻滞)，趋化因子(巨噬细胞炎症蛋白(MIP1)，MIP3，CCR7配体，及钙网蛋白)，及其它蛋白质。
所述核酸分子可以编码这样的多肽，其是生长因子或其部分，结合与配体结合的受体或生长因子受体或其部分。本领域已知生长因子和生长因子受体。见例如Baxley andSerra,Curr.Drug Targets 11(9):1089-102(2010)；Lo,Curr.Mol.Pharmacol.3(1):37-52(2010)；Barakat and Kaiser,Expert Opin.Investig.Drugs 18(5):637-46(2009)；Trojanowska and Varga,Curr.Opin.Rheumatol.19(6):568-73(2007)；Jimeno andHidalgo,Biochim.Biophys.Acta 1766(2):217-29(2006)；Finch and Rubin,J.Natl.Cancer Inst.98(12):812-24(2006)；Lo et al.,Breast Canc.Res.Treat.95(3):211-8(2006)；Schilephake,Int.J.Oral Maxillofac.Surg.31(5):469-84(2002)；George,Urology 60(3Suppl.1):115-21(2002)。生长因子包括例如骨形态发生蛋白(BMPs)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β，及血管内皮生长因子(VEGF)。生长因子受体包括例如表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)或者转化生长因子受体(TGFR)。
所述核酸分子可编码这样的多肽，其是抗体或抗体片段，包括单链抗体或抗独特型抗体。本领域已知抗体。见例如Brekke and Sandlie,Nat.Rev.Drug.Discov.2(1):52-62(2003)；Mellstedt,Drugs Today 39(Supl.C):1-16(2003)；Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols；Ed.Dimitrov,A.S.,Humana Press,Springer,New York,NY(2009)；Zheng et al.(2007)Cell Research,17:303-306。编码的抗体或其片段的非限制性实例包括例如抗胸腺细胞球蛋白、莫罗单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑珠单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、Certolizumab、达克珠单抗、Eculizumab、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、Panitumumab、Ranibizumab、利妥昔单抗、托西莫单抗或曲妥珠单抗。
所述核酸分子可编码这样的多肽，其是但不限于是酶(例如加硫酶、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、苯丙氨酸氨裂合酶、酸性α葡糖苷酶、伊米苷酶、阿葡糖苷酶α)、激素(例如促甲状腺素、生长激素、胰岛素、甲状腺激素,促红细胞生成素)、血管发生调节剂、免疫调节剂(地尼白介素2(denileukin diftitox)；白介素-2)、疼痛调节剂(painmodulator)(例如NP2)，融合蛋白(例如胰岛素样生长因子2和酸性α葡糖苷酶(IGF2-GAA)；阿巴他塞；阿来法塞；依那西普)，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，海兰(hylan)或透明质酸酶的其它衍生物，或者变应原(例如花生或其它食物变应原)。
例如，所述核酸分子可编码人促红细胞生成素或者其变体(见例如美国专利No.4,703,008，Accession No.P01588)，人G-CSF或其变体(见例如Accession No.P09919)；人GM-CSF或其变体(见例如Cantrell et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci,82:6250-4；AccessionNo.P04141)；纤溶酶原激活物或其变体(见例如Accession No.P00750)；尿激酶或其变体(见例如Accession No.P00749)；胰岛素或其变体(见例如美国专利号4,652,525,美国专利号4,431,740，Groskreutz et al.(1994)J.Biol.Chem.,269:6241-5,AccessionNo.P01308)；白介素如白介素-1或其变体(见例如Accession Nos.P01583,P01584)，白介素-2或其变体(见例如Accession No.P60568,美国专利号4,738,927)，白介素-3或其变体(见例如Accession No.P08700,EP Publ.EP275,598或282,185)，白介素-4或其变体(见例如Accession No.P05112)，白介素7或其变体(见例如Accession No.P13232，美国专利号4,965,195)，干扰素或其变体，因子VIII或其变体(见例如Accession No.P00451)，因子IX或其变体(见例如P00740)，von Willebrand因子或其变体(见例如Accession No.P04275)，或者人生长激素或其变体(见例如Accession No.P01241,P01242，美国专利号4,342,832)。
其它感兴趣的核酸分子包括编码抗血管发生或自杀蛋白的那些分子。抗血管发生蛋白包括例如METH-1、METH-2、TrpRS片段、增殖蛋白相关蛋白、促乳素片段、PEDF、血管形成抑制素、胞外基质蛋白的各个片段及生长因子/细胞因子抑制剂。胞外基质蛋白的各个片段包括但不限于血管抑素、内皮抑素、激肽原、纤维蛋白原-E片段、凝血酶敏感蛋白、肿瘤抑素,canstatin和网状内皮系统刺激素。生长因子/细胞因子抑制剂包括但不限于VEGF/VEGFR拮抗剂、sFlt-1、sFlk、sNRP1、血管生成素/tie拮抗剂、sTie-2、趋化因子(IP-10、PF-4、Gro-β、IFN-γ(Mig)、IFN、FGF/FGFR拮抗剂(sFGFR)、Ephrin/Eph拮抗剂(sEphB4和sephrinB2)、PDGF、TGF和IGF-1。自杀蛋白是随着白喉毒素A的表达或者可导致细胞对某些药物选择性敏感的蛋白质的表达可导致细胞死亡的一种蛋白质，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的表达导致细胞对抗病毒化合物如无环鸟苷、更昔洛韦和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)敏感。其它自杀蛋白包括羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)及黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。其它编码的蛋白质包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，其可用作安全转换(见美国专利申请No.08/974,391，1997年11月19日提请，公开为PCT Publication No.WO 99/25860)、Nos、FasL和sFasR(可溶的Fas受体)。
在本发明的其它实施例中，所述核酸分子是编码参与溶酶体贮积症及特别是其中缺陷的酶的蛋白质的核酸，包括但不限于天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护性蛋白/组织蛋白酶A、酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷脂酶、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、Niemann-Pick疾病C1型(NPC-1)、β-氨基己糖苷酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)、乙酰-CoA:α葡糖胺N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和酸性脂酶。这种酶在各种溶酶体贮积病中的作用(见例如公开的U.S.Patent Appl.No.US2008/0025952；US20120009268)。酶的选择依赖于特定的溶酶体疾病。非限制性的感兴趣的核酸分子例如包括编码如下物质的任何核酸：β-葡糖苷酸酶，以治疗粘多糖贮积病(例如Sly综合征)；α-L-艾杜糖苷酸酶，以治疗Hurler综合征；α-L-艾杜糖苷酸酶，以治疗Scheie综合征或Hurler-Scheie综合征；艾杜糖醛酸硫酸酯酶，以治疗Hunter's综合征；肝素硫酸胺酶，以治疗Sanfilippo综合征A(MPSIIIA)；N-乙酰氨基葡糖苷酶，以治疗Sanfilippo综合征B(MPSIIIB)；乙酰-CoA:α-氨基葡糖苷乙酰转移酶，以治疗Sanfilippo综合征C(MPSIIIC)；N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶，以治疗Sanfilippo综合征D(MPSIIID)；半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶，以治疗Morquio综合征A；β-半乳糖苷酶，以治疗Morquio综合征B；N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，以治疗Maroteaux-Lamy综合征；α-半乳糖苷酶，以治疗Fabry病；葡糖脑苷脂酶，以治疗Gaucher's病，或者溶酶体酸性α-葡糖苷酶，以治疗糖原贮积病(例如Pompe病)。
其它感兴趣的核酸分子例如包括但不限于编码如下物质的任何核酸：治疗阿尔兹海默病的蛋白质如金属内肽酶，例如淀粉样-β降解酶脑啡肽酶，胰岛素降解酶胰岛素酶，或者thimet寡肽酶；可作为抗逆转录病毒物质治疗病毒感染如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的蛋白质或肽，例如恩夫韦肽治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的蛋白质，例如但不限于胰岛素生长因子-1(IGF-1)，钙结合蛋白D28，小白蛋白，HIF1-α，SIRT-2，VEGF，SMN-1，SMN-2，GDNF或者睫状神经营养因子(CNF)；在血友病患者中缺陷的蛋白质，例如但不限于因子VIII或因子IX；治疗I型糖尿病的蛋白质，如弗林蛋白酶-可裂解的胰岛素基因；治疗家族性高胆固醇血症的蛋白质，如低密度脂蛋白受体(LDLR)；治疗脂蛋白脂酶缺陷(LPLD)的蛋白质，如脂蛋白脂酶(LPL)；治疗α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏的蛋白质，如AAT；治疗I型或II型Crigler Najar综合征的蛋白质，如肝胆红素UDP-葡糖醛酸基转移酶或者其功能变体，例如UGT1A1(Gong et al.(2001)Pharmacogentics,11:357-68)；治疗糖原贮积缺陷1A型的蛋白质，如葡萄糖-6磷酸酶；治疗Pepck缺陷的蛋白质，如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶；与半乳糖血症相关的蛋白质，如半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；与苯酮酸尿症相关的蛋白质，如苯丙氨酸羟化酶；与槭糖尿病相关的蛋白质，如支链α酮酸脱氢酶；与酪氨酸血症1型相关的蛋白质，如延胡索酰乙酰乙酸水解酶；与甲基丙二酸血症相关的蛋白质，如甲基丙二酰辅酶A变位酶；与鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷相关的蛋白质，如鸟氨酸转氨甲酰酶；与瓜氨酸血症相关的蛋白质，如精氨琥珀酸合成酶；与重度联合免疫缺陷病相关的蛋白质，如腺苷脱氨酶；与Gout and Lesch Nyan综合征相关的蛋白质，如次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；与生物素酰胺酶缺陷相关的蛋白质，如生物素酶；与Gaucher病相关的蛋白质，如β-葡糖脑苷脂酶；与Sly综合征相关的蛋白质，如β-葡糖苷酸酶；与Zellweger综合征相关的蛋白质，如过氧化物酶体膜蛋白70kDa；与急性间歇性卟啉病相关的蛋白质，如胆色素原脱氨酶(PBDG)；与α-1抗胰蛋白酶缺乏(肺气肿)相关的蛋白质，如α1抗胰蛋白酶，与癌症相关的蛋白质，如肿瘤阻抑物基因如p53；编码谷氨酸脱羧酶(GAD)的蛋白质，以治疗帕金森氏症；或者在溶酶体贮积病、特别是在Sanfilippo综合征(也称作粘多糖贮积病III型，MPSIII)中缺陷的蛋白质，如溶酶体硫酸胺酶和α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)。
或者，治疗性核酸可在RNA水平发挥其作用，例如通过编码反义信使或核酶、影响剪接或3’加工(例如聚腺苷酸化)的蛋白质、影响另一基因在细胞内表达水平的蛋白质，例如通过介导mRNA积聚的改变的速度、mRNA转运的改变和/或转录后调节的变化而进行。这些包括RNA，如RNAi及其它双链RNA，反义和核酶，其可以针对编码增殖必需的蛋白质的mRNA，如结构蛋白，转录因子，聚合酶，编码细胞毒性蛋白的基因，编码核酸酶(例如RNase A)或者蛋白酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和羧肽酶)的工程化细胞质变体的基因。
例如，所述核酸分子可以是基因或基因产物的基于核酸的抑制剂，如基因转录或翻译的抑制剂。被输送物质可以是短干扰RNA(siRNA)序列，反义序列或micro-RNA(miRNA)序列。所述RNA的长度可以是10-30个核苷酸，如19-25或21-25个核苷酸。本领域已知siRNA-介导的基因沉默方法，其中基因的表达产物由特定的双链衍生的siRNA核苷酸序列靶向，所述序列与靶基因转录体的核苷酸区段互补(例如与长度为至少19-25个核苷酸的区段互补)，包括5’非翻译(UT)区、ORF或者3’UT区(见例如PCT国际专利公开号WO00/44895、WO01/75164、WO01/92513或WO01/29058)。siRNA序列典型结合靶mRNA内精确互补的的独特序列，并导致靶mRNA分子降解。siRNA序列可在nRNA分子内的任何地方结合。由siRNA靶向的序列包括表达感兴趣的多肽的基因，或者这个基因的上游或下游调节子。举例的基因的上游或下游调节自包括结合基因启动子的转录因子，与感兴趣的多肽相互作用的激酶或磷酸酶，及参与能影响感兴趣的多肽的调节途径的多肽。miRNA序列典型结合靶mRNA内的具有精确或略差精确互补的一个独特序列，并导致靶mRNA分子的翻译抑制。miRNA序列可以在mRNA序列内任何地方结合，但是通常在mRNA分子的3’非翻译区内结合。
核苷酸siRNA或miRNA序列(例如长度为21-25个核苷酸)可例如自表达载体中产生，通过短发夹RNA(shRNA)序列的转录，较长的(例如60-80个核苷酸)前体序列，其随后通过细胞RNAi机制处理产生siRNA或miRNA序列。或者，核苷酸siRNA或miRNA序列(例如长度为21-25个核苷酸)可例如是化学合成的。化学合成的siRNA或miRNA序列可商购自这种公司，如Dharmacon,Inc.(Lafayette,CO)、Qiagen(Valencia,CA)和Ambion(Austin,TX)。本领域已知输送siRNA或miRNA分子的方法。见例如Oh and Park,Adv.Drug.Deliv.Rev.61(10):850-62(2009)；Gondi and Rao,J.Cell Physiol.220(2):285-91(2009)；及Whitehead etal.,Nat.Rev.Drug.Discov.8(2):129-38(2009)。
例如，核酸分子可以是反义核酸序列。通过杂交相互作用，反义核酸阻断细胞或病原体mRNA的表达。反义核酸分子可例如自表达载体中转录，产生与靶mRNA和/或编码所述靶的内源基因的至少一个独特部分互补的RNA。反义核酸在特定的细胞条件下的杂交通过抑制转录和/或反义而导致靶蛋白质表达抑制。反义核酸的实例包括但不限于如下IsisPharmaceuticals,Inc.的产品：针对高胆固醇的Mipomersen；针对冠心病、炎症和肾病的ISIS-CRPRx；针对高甘油三酯的ISIS-APOCIIIRx；针对凝血失调的ISIS-FXIRx；针对冠心病的BMS-PCSK9Rx；针对2型糖尿病的ISIS-SGLT2Rx、ISIS-PTP1BRx、ISIS-GCGRRx和ISIS-GCCRRx；针对肥胖症的ISIS-FGFR4Rx；针对癌症的OGX-011f、LY2181308、ISIS-EIF4ERx、OGX-427、ISIS-STAT3Rx；针对ALS的ISIS-SOD1Rx；针对TTR淀粉样变的ISIS-TTRRx；针对脊髓性肌萎缩的ISIS-SMNRx；针对CMV视网膜炎的Vitravene；针对溃疡性结肠炎的Alicaforsen；针对严重细菌感染的ACHN-490；针对多发性硬化症的ATL1102；针对局部纤维化的EXC 001；针对眼睛疾病的iCo-007；及针对肢端肥大症的ATL1103。可以使用本发明的方法给予的microRNA的实例包括但不限于如下Santaris Pharma产品：针对丙型肝炎的Miravirsen；针对实体肿瘤的EZN-2968；针对癌症的EZN-3042；针对雄激素受体的EZN-4176；针对高胆固醇的SPC 4955和SPC 5001。另外的治疗性microRNA包括如下Mirna Therapeutics,Inc.治疗癌症的产品：let-7、miR-34、miR-Rx02、miR-16、miR-Rx-01、miR-Rx-03、miR-Rx-06和miR-Rx-07。
在其它实施例中，所述核酸分子可以是核酶(例如基于锤头或发夹的核酶)，设计为修复缺陷的细胞RNA或者破坏不希望的细胞或病原体编码的RNA(见例如Sullenger(1995)Chem.Biol.,2:249-253；Czubayko et al.(1997)Gene Therapy,4:943-9；Rossi(1997)Ciba Found.Symp.,209:195-204；James and Gibson(1998)Blood,91:371-82；Sullenger(1996)Cytokines Mol.Ther.,2:201-5；Hampel(1998)Prog.Nucleic AcidRes.Mol.Biol.,58:1-39；或者Curcio et al.(1997)Pharmacol Therapy,74:317-32)。
在一些实施例中，所述核酸分子编码可检测的多肽。举例的这种多肽包括但不限于荧光素酶或荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)。在特定实施例中，被输送物质是病毒载体，如腺病毒载体，其含有核酸分子。举例的这种被输送物质是Ad-CMV-Luc(见例如实施例1)。这种腺病毒可以被进一步修饰以含有进一步的或不同的核酸分子，如本领域已知或上文描述的任何核酸。例如，在其中表达的荧光素酶转基因可以被置换或替换以含有编码核酸分子的核酸分子。
2.含有核酸分子的运载体及构建体
核酸分子可以提供在载体、构建体或其它运载体中输送。举例的这种载体是病毒载体、非病毒载体、纳米粒子或全细胞。产生这种为了输送的构建体或运载体的方法为本领域技术人员熟知。例如，核酸分子可以使用本领域技术人员熟知的标准方法插入非病毒或病毒载体中。在一些情况中，可以使用常规的分子生物学和重组DNA技术(见例如Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1998,Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)。在其它情况中，可以插入核酸分子，由此其在任何合适的调节序列的控制下。在其它实施例中，核酸分子作为表达盒的一部分插入，所述表达盒包含调节元件，如启动子或增强子。合适的调节元件可以由本领域技术人员基于例如希望的表达水平而选择。在特定实施例中，可以选择调节元件以包含组织特异性启动子，如肝特异性启动子，以限制组织特异性细胞的基因表达。
a.病毒与病毒载体
病毒在本发明的方法、应用和组合物中可用作被输送物质，从而外源核酸序列插入病毒载体中。病毒在体内输送核酸分子中是有益的，因为其在将病毒DNA转移进宿主细胞中是有效的，根据病毒附着蛋白(例如衣壳蛋白或糖蛋白)其可以感染并由特定的靶细胞摄取，及其可以被操纵以除去非必需的基因及加入异源核酸分子。本领域技术人员已知许多病毒载体。可用于本发明的方法中的举例的病毒包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒属、杆状病毒、嗜肝DNA病毒、杆状病毒、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒和虫媒病毒。在特定实施例中，所述病毒是腺病毒。本领域技术人员已知病毒的选择方法，其依赖于多种因素，如希望病毒DNA的复制或整合、病毒的向性和/或病毒的免疫原性。这种病毒及其衍生物为本领域技术人员熟知及可获得。例如，许多病毒可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)或者购自商家(例如VectorBiolabs,Philadelphia,PA；Applied Biological Materials,Inc.,Richmond,BritishColumbia,Canada)。
用于产生重组病毒的病毒载体包括有复制能力的病毒和复制缺陷的病毒。在复制缺陷的病毒中，病毒典型缺少与病毒复制相关的一或多个基因，在第一个感染周期之外不能复制。在一些情况中，为了产生复制缺陷的病毒，需要转移载体、包装载体或辅助病毒。例如，包装载体可以提供为粘粒或者在细胞系中，其提供病毒结构蛋白以包装缺陷的载体。
用于本发明方法中的病毒载体也可以含有表达盒，其包含调节元件，如启动子和增强子，与选择的转基因可操纵地连接。如上文所述，可以使用任何合适的启动子。合适的启动子和增强子在本领域可广泛获得，用于选择的病毒载体中。典型地，所述启动子是组成型启动子。举例的启动子包括但不限于CMV启动子、截短的CMV启动子、人血清白蛋白启动子或者α-1-抗胰蛋白酶启动子。例如，所述启动子是截短的CMV启动子，其中已知的转录阻抑物的结合位点已经缺失。在其它实施例中，所述启动子是可诱导启动子。例如，所述启动子是可诱导的蜕皮激素启动子。其它的启动子实例包括类固醇启动子，如雌激素和雄激素启动子，以及金属硫蛋白启动子。所述增强子可以是组织特异性或者非特异性增强子。例如，所述增强子是肝特异性增强子元件。举例的增强子元件包括但不限于人血清白蛋白(HAS)增强子、人凝血酶原(HPrT)增强子、α-1-微球蛋白增强子、内含子醛缩酶增强子及阿朴脂蛋白E肝控制区。
i.腺病毒
腺病毒是在本发明的方法、应用和组合物中可用作含有感兴趣的核酸分子的被输送物质的病毒载体。腺病毒是核DNA病毒，基因组为大约36kb，其已经通过传统的遗传学和分子生物学研究充分鉴定(Horwitz,M.S.,"Adenoviridae and Their Replication,"inVirology,2nd edition,Fields,B.N.,etal.,eds.,Raven Press,New York,1990)。基因组被分类为早期(已知为E1-E4)和晚期(已知为L1-L5)转录单位，是指病毒蛋白质的两个暂时类别的产生。这些事件之间的定界是病毒DNA复制。
腺病毒呈现出对于呼吸道和胃肠道上皮细胞的天然向性。腺病毒也可以感染肝细胞，如肝实质细胞和内皮细胞，这可以在系统性给予后病毒进入肝中清除时发生。特别地，在本发明的方法中，直接注射进实质中促进肝实质细胞的选择性肝细胞摄取。所述病毒表面的五邻体碱基和纤维蛋白与病毒的向性相关。腺病毒颗粒与宿主细胞之间的多重相互作用是需要的，以促进有效的细胞进入(Nemerow(2000)Virology 274:1-4)。对于腺病毒亚群C，如腺病毒2和5(Ad2或Ad5)，病毒进入途径已经充分鉴定，确信包含两个单独的细胞表面事件。首先，腺病毒纤维knob与柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)之间的高亲和性相互作用介导腺病毒颗粒附着于细胞表面。随后五邻体与作为共受体的细胞表面整联蛋白αvβ3和αvβ5的结合增强病毒内在化。CAR，其在许多人体组织包括肺上皮细胞中表达(Bergelson etal.,(1997)Science 275:1320-1323)，呈现出作为除了亚群B之外的大多数腺病毒亚群的细胞受体的功能(Bergelson et al.,(1997)Science 275:1320-1323；Roelvink et al.,(1998)J.Virol.72:7909-7915)。
腺病毒包括超过50个血清型，分为6个不同的亚群，A-F。任何这些腺病毒血清型均可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)及其它商业或非商业供应者，其可用于本发明的方法中或者用作源料以进一步修饰，如本领域已知。可得自任何其它来源的任何其它腺病毒的血清型可以使用或进一步修饰。例如，腺病毒可以是亚群A(例如血清型12、18、31)、亚群B(例如血清型3、7、11a、11p、14、16、21、34、35、50)、亚群(例如血清型1、2、5、6)、亚群D(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、19p、20、22-30、32、33、36-39、42-49、51)、亚群E(例如血清型4)、亚群F(例如血清型40、41)，或者任何其它腺病毒血清型。在某些实施方案中，腺病毒是亚群C腺病毒或者衍生自亚群C腺病毒。亚群C腺病毒包括但不限于Ad2和Ad5。
腺病毒载体在本领域可获得(例如得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)，及本领域已知来自许多不同腺病毒血清型的野生型腺病毒蛋白的序列(见例如Roberts et al.(1984)J.Biol.Chem.,259:13968-13975；Chroboczek et al.(1992)Virology,186:280-285；Sprengel et al.(1994)J.Virol.,68:379-389；Chillonet al.(1999)J.Virol.,73:2537-2540；Davison et al.(1993)J.Mol.Biol.,234:1308-1316；www.binf.gmu.edu/wiki/index.php/Human_Adenovirus_Genome_Sequences_and_Annotations)。所述腺病毒载体可为技术人员广泛获得，例如得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或者其它商业或非商业供应者。从ATCC中，腺病毒可以ATCC编号VR-1至VR-1616获得。例如，野生型腺病毒2型得自ATCC，编号为VR-846；5型得自编号为VR-5和VR-1082。可以产生衍生自任何上述血清型的任何重组或修饰的腺病毒，如本领域及本申请所述，或者通过本领域技术人员已知的任何合适方法进行。
腺病毒载体用作基因输送载体具有许多优势，包括针对分裂或非分裂细胞的向性、最小的致病原性潜力、高效价复制的能力以制备载体原种，以及携带较大插入体的潜力(见例如Berkner(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.,158:39-66；Jolly et al.(1994)Cancer Gene Therapy,1:51-64)。
例如，腺病毒载体包括缺陷的腺病毒载体，在其最初的早期基因区(E1-E4)含有至少一个缺失。对腺病毒载体的修饰包括本领域已知的缺失，如缺失一或多个的E1、E2a、E2b、E3或E4编码区。例如，进行基因治疗的腺病毒载体可以通过异源核酸分子的取代以代替E1、E2a、E2b、E3和/或E4基因而制备。缺失可以使用限制性核酸内切酶获得。例如，E1a区可以使用在E1a区域内常规的限制性核酸内切酶位点而缺失。通常地，E3的一部分也通过限制性核酸内切酶添加而缺失，以使得可以插入较大的外源DNA，同时仍满足为包装进新的病毒颗粒中所需的大小限制。由于这些区域的缺失，腺病毒载体的克隆能力可以是大约8kb。由于在最初的病毒早期基因区域如E1(其包括E1a和E1b区域)中的至少一个缺失，这种腺病毒载体典型被称作复制缺陷的腺病毒。
早期基因如病毒E1区的缺失导致在随后感染的靶细胞中重组腺病毒的复制缺陷及不能产生感染性病毒颗粒。因此，为了允许早期基因缺失的腺病毒基因组复制，如E1缺失的腺病毒基因组复制，及产生病毒颗粒，需要提供失去的基因产物的互补系统。例如，E1互补典型由表达E1的细胞系提供，如人胚肾包装细胞系，即称作293的上皮细胞系(在ATCC保藏，登录号No.CRL-1573)。细胞系293含有腺病毒的E1区，其提供E1基因区产物以“支持”E1缺失的病毒在该细胞系中生长(见例如Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59-71,1977)。此外，已经报道了可用于产生具有一部分腺病毒E4区的缺陷的腺病毒的细胞系(见例如国际申请公开WO 96/22378)。E3也可以从载体中缺失，但是因为其不是载体产生必需的，因此其可以从互补生产细胞中忽略。
使用复制缺陷的病毒作为载体的益处是其可以波及其它细胞类型的程度受限，因为其可以在最初感染的细胞中复制，但是不能形成新的感染性病毒颗粒。也已经描述了多个缺陷的腺病毒载体及互补细胞(见例如公开的Appl.Nos.WO 95/34671,美国专利号5,994,106)。已经描述了复制缺陷的腺病毒的构建(Berkner et al.,J.Virol.61:1213-20(1987)；Massie et al.,Mol.Cell.Biol.6:2872-83(1986)；Haj-Ahmad et al.,J.Virol.57:267-74(1986)；Davidson et al.,J.Virol.61:1226-39(1987)；Zhang etal.,BioTechniques 15:868-72(1993)；Berkner(1983)Nuc.Acids Res.11:6003；Ghosh-Choudhury(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147:964；Gilardi et al.(1990)FEBSLett.267:60；Mittal(1993)Virus Res.28:67；Yang(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4601；及International published PCT WO1995/026411)。
腺病毒载体也包括“无病毒基因的病毒载体”或“空壳载体”，其中所有病毒基因被除去，仅剩下为载体增殖所需的ITR和Ψ。这种腺病毒载体被称作假腺病毒载体(PAV)，因为其衍生自腺病毒基因组，含有为载体基因组的复制和包装所需的最小顺式作用核苷酸序列。PAV载体含有5’末端反向重复(ITR)和3’ITR核苷酸序列，含有复制起点的，及包装PAV基因组所需的顺式作用核苷酸序列。其可以被修饰为含有具有合适调节元件(例如启动子或增强子)的一或多个转基因。PAV具有远远大于8kb及直至36kb的携带能力，因为其含有大多数病毒编码序列的缺失(见例如美国专利号5,882,887或5,670,48；PCT公开号WO96/40955,WO97/25466,WO95/29993,WO97/00326；Morral et al.(1998)Hum.Gene Ther.,10:2709-2716,Kochanek et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.,93:5731-5736；Parks et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.,93:13565-13570；Lieber et al.(1996)J.Virol.,70:8944-8960或者Fisher et al.(1996)J.Virol.,217:11-22)。
PAV通过生产细胞与“辅助”病毒的共感染而生长(如使用E1缺失的腺病毒载体)，其中包装细胞表达E1基因产物。辅助病毒反式补足失去的腺病毒功能，包括产生为颗粒装配所需的病毒结构蛋白。例如，辅助腺病毒载体基因组和空壳腺病毒载体基因组被输送给包装细胞。将所述细胞在标准细胞维持或生长条件下维持，从而辅助载体基因组和包装细胞一起提供互补蛋白质以包装腺病毒载体颗粒。这种空壳腺病毒载体颗粒通过标准技术回收。辅助载体基因组可以质粒或相似结构通过标准转染技术输送，或者其可以通过感染含有该基因组的病毒颗粒而输送。这种病毒颗粒通常称作辅助病毒。相似地，空壳腺病毒载体基因组可以通过转染或病毒感染输送至细胞。
腺病毒也包括有复制条件的腺病毒，其是在某些类型细胞或组织中复制但在其它类型组织或细胞中不复制的病毒，这是由于将复制必需的腺病毒基因置于异源启动子控制下的结果(如上文所述；也见于美国专利号5,998,205、US.Patent No.5,801,029及U.S.Application No.10/081,969，公开为US 2003-0104625及相应公开的InternationalPCT application No.WO 2002/067861)。
腺病毒还包括已经被修饰为含有靶向配体以增加特定靶细胞的感染的那些腺病毒，其表达靶向配体的受体(蛋白质、脂质、碳水化合物或者其一部分)，例如以改变病毒的向性。虽然腺病毒等更多地用于治疗性应用，但是其效能收到CAR的广泛组织分布的限制，其限制了腺病毒载体输送至头顶的细胞类型。此外，在体内某些细胞上缺少CAR和/或αv整联蛋白受体限制了该细胞或组织类型可以被腺病毒载体靶向。因此，腺病毒还包括已经通过降低或去除与天然受体结合和/或工程化衣壳蛋白而被修饰的那些腺病毒，如HI环，纤维的C末端，六邻体的L1环或者五邻体的RGD环，或者衣壳蛋白IX，以掺入希望的细胞受体或组织特异性受体的靶配体(见例如Krasnykh et al.(2000)Mol.Ther.,1:391-405；Wickhamet al.(2000)Gene Ther.,7:110-4；Dmitriev et al.(1998)J.Virol.,72:9706-12；Mizuguchi et al.(2004)Hum.Gene Ther.,15:1034-44；Wickham et al.(1997)J.Virol.,71:8221-9；Curiel(1999)Ann NY Acad.Sci.,886:158-71)。衣壳蛋白可以被修饰，例如通过加入靶配体或者用其它类型腺病毒纤维取代纤维而修饰。靶配体可以是任何蛋白质或其部分，其结合细胞内或上的组分，如细胞表面蛋白、脂质、碳水化合物或者其它组分。例如，靶配体包括但不限于生长因子、粘附分子、细胞因子、蛋白质激素、神经肽(神经递质)和单链抗体或其合适部分。在其它实施例中，腺病毒载体可以与适体分子缀合，如抗体和含有抗-Ad单链抗体(scFv)的融合蛋白或者具有靶向配体的CAR的胞外结构域，或者用聚合物如聚乙二醇(PEG)组分化学修饰，其含有靶向配体(见例如Mizuguchi et al.(2004)Hum.GeneTher.,15:1034-44；Eto et al.(2008)Int.J.Pharm.,354:3-8)。
任何上述或者本领域已知的腺病毒均可以被修饰以含有希望的异源核酸分子以用作本发明的被输送物质。含有希望的异源核酸序列的腺病毒可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备(Levrero et al.,Gene 101(1991)195,EP 185 573；Graham,EMBO J.3(1984)2917；International Published PCT Application No.WO95/26411)。特别地，这种病毒可以通过腺病毒载体与携带异源DNA序列的质粒之间的同源重组制备。同源重组可以在将腺病毒载体和质粒共转染进合适的细胞系之后发生。使用的细胞系通常是可转化的。转染可以在存在指导腺病毒颗粒进入生产细胞中的试剂的条件下进行。这种试剂包括但不限于聚阳离子和双功能试剂。在一些实施例中，如果腺病毒是缺陷的腺病毒(由于缺失早期基因或纤维蛋白)，所述细胞系还含有能补足缺陷的腺病毒基因组部分的序列，如整合形式，以避免重组风险。举例的互补细胞系包括但不限于人胚肾细胞系293(Graham et al.,J.Gen.Virol.36(1977)59)，其含有Ad5腺病毒基因组的左侧部分。互补细胞也包括例如PER.C6细胞系的细胞，其含有腺病毒E1基因(PER.C6可例如得自Crucell,TheNetherlands；在ECACC保藏，登录号no.96022940；也见Fallaux et al.(1998)Hum.GeneTher.9:1909-1907；也见美国专利号5,994,128)，或者AE1-2a细胞(见Gorziglia et al.(1996)J.Virology 70:4173-4178；及Von Seggern et al.(1998)J.Gen.Virol.79:1461-1468))。然后，根据常规的分子生物学技术回收已经倍增的腺病毒并纯化。
举例说明在基因治疗中使用腺病毒的参考文献包括但不限于Vorburger andHunt(2002)The Oncologist,7:46-59；Breyer et al.(2001)Current Gene Therapy,1:149-162；Shirakawa(2009)Drugs News Perspectives,22:140-5；Wang et al.(2005)GeneTherapy and Mol.Biology,9:291-300；及Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121)。
ii.腺伴随病毒(AAV)
在本发明方法、组合物和应用中用作被输送物质的病毒载体包括腺伴随病毒(AAV)。AAV是一种单链的人DNA细小病毒，其基因组大小为4.6kb。AAV基因组含有两个主要基因：rep基因和cap基因。所述rep基因编码rep蛋白(Rep 76、Rep 68、Rep 52和Rep 40)。所述cap基因编码AAV复制、挽回、转录和整合，而cap蛋白组成AAV病毒颗粒。AAV的名称得自于其依赖于腺病毒或前体辅助病毒(如疱疹病毒)以提供必需的基因产物，使得AAV经历生产性感染(即在宿主细胞中自身再生产)。在不存在辅助病毒的情况中，AAV作为前病毒整合进入宿主细胞染色体中，直至其通过用辅助病毒通常为腺病毒重复感染宿主细胞而被挽回(Muzyczka(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.,158:97-129)。
AAV病毒可以整合进细胞基因组中。整合机制是通过在AAV基因组的两端存在反向末端重复(ITR)而介导的，其含有为病毒复制、挽回、包装和整合所需的顺式作用核苷酸序列。由rep蛋白反式介导的ITR的整合功能在不存在辅助病毒条件下在感染后允许AAV基因组整合进细胞染色体中。AAV的整合位点充分确立，位于人的染色体19(Kotin et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2211-2215)。对整合位点的了解降低了随机插入细胞基因组中可激活或失活宿主基因或中断编码序列的危险。AAV还可用于基因治疗应用，因为其宿主范围广泛，呈现出对许多细胞类型的向性。AAV也可以既感染非分裂细胞也感染分裂细胞。
AAV载体可衍生自任何天然发生的AAV血清型，包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV-9。这种病毒为本领域技术人员熟知且可获得(见例如Grimm et al.(2003)Current Gene Therapy,3:281-304；Muramatsu et al.(1996)Virol.,221:208-217；Chiorini et al.(1997)J.Virol.,71:6823-6833；Chiorini(1999)J.Virol.,73:1309-1319；Rutledge et al.(1998)J.Virol,72:309-319；Xiao et al.(1999)J.Virol.,73:3994-4003；Gao et al.(2002)Proc Natl.Acad.Sci.,99:11854-11859；Kotin(1994)Human Gene Therapy,5:793-801)。其它血清型也已知及可获得，包括AAV-8至AAV-12。例如，许多AAV载体可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.；见例如VR-197、VR-645、VR-646、VR-680、VR-681、VR-1449、VR-1523、VR-1616)。也可获得的是相容宿主细胞和辅助病毒。AAV载体也包括“假型”AAV载体，其中AAV-2载体基因组被交叉包装进另一AAV血清型的衣壳中(Burger et al.(2004)Mol.Ther.,10:302-17；美国专利号7,094,604)。这种假型AAV载体克服了AAV-2衍生的血清型的限制，如其在转导一些细胞如肝细胞或肌细胞时是无效的。
许多AAV载体呈现出在输送方法遍及多个组织如骨骼肌和心肌的广泛的转导，在输送后实现系统性表达。这些包括例如AAV血清型-6、-8和-9。特别地，AAV载体包括腺病毒相关的血清型9(AAV-9；GenBank Accession No.AY530629.1；Gao et al.(2004)J.Virol.,78:6381-6388)。AAV-9是可以通过血脑屏障靶向中枢神经系统(CNS)的载体(见例如Foustet al.,(2009)Nature Biotechnology,27:59-65；Duque et al.(2009)Mol.Ther.,17:1187-1196)。因此，例如在本发明中影响或与脑或CNS相关的神经变性疾病或其它疾病中，AAV-9可用作被输送物质以编码感兴趣的蛋白质以系统性输送(例如输送至肝或其部分以在血液中表达)。
AAV载体包括重组AAV载体，其含有感兴趣的异源核酸。产生这种载体的方法为本领域技术人员已知。例如产生AAV载体的标准方法需要用含有在AAV ITR序列两侧的感兴趣的核酸分子的AAV载体基因组转染宿主细胞，通过编码反式需要的AAV rep和cap蛋白质的基因的质粒转染宿主细胞，及用辅助病毒感染转染的细胞以提供反式需要的非AAV辅助功能(Muzyczka(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.,158:97-129；美国专利号5,139,941)。辅助病毒可以是腺病毒或其它辅助病毒。所述辅助病毒蛋白激活AAV rep基因的转录，然后rep蛋白激活AAV cap基因的转录。然后cap蛋白利用ITR序列包装AAV基因组为病毒颗粒。
或者，可以使用含有辅助功能基因的质粒组合可用作复制功能起源的熟知的辅助病毒之一的感染帮助AAV病毒的重(见例如美国专利号5,622,856和5,139,941)。相似地，技术人员可使用含有辅助功能基因的质粒组合野生型AAV感染，以提供必需的复制功能。三重转染方法也可用于产生rAAV病毒粒，这是不需要辅助病毒的一种方法(见例如美国专利号6,001,650)。这可以通过使用为了rAAV病毒粒产生的三种载体完成：AAV辅助功能载体，必需功能载体和rAAV载体。
举例说明在基因治疗中使用AAV病毒的参考文献包括但不限于Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121。
iii.逆转录病毒
在本发明的方法、组合物和应用中用作被输送物质的病毒载体包括逆转录病毒(见例如Miller(1992)Nature,357:455-460)。由于其输送未重排的单一拷贝基因进入广泛范围或啮齿类动物、灵长类动物和人体细胞中的能力，逆转录病毒载体非常适于输送核酸至细胞中。逆转录病毒载体整合进宿主细胞基因组中。与其它病毒载体不同，其仅感染分裂细胞。
逆转录病毒是RNA病毒，由此病毒基因组是RNA。当宿主细胞用逆转录病毒感染时，基因组RNA被反向转录为DNA中间体，其被非常有效地整合进感染的细胞的染色体DNA中。这个整合的DNA中间体被称作前病毒。前病毒的转录及装配为感染性病毒在存在合适的辅助病毒条件下或者在含有允许包囊而不同时产生污染的辅助病毒的合适序列的细胞系中发生。如果包囊序列通过用合适载体共转染提供，则辅助病毒不是生产重组逆转录病毒必需的。
逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，其两侧是两个长末端重复(LTR)序列。所述gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核壳体)蛋白，所述env基因编码病毒包膜糖蛋白。所述pol基因编码产物，包括RNA-指导的DNA聚合酶逆转录酶，其将病毒RNA转录为双链DNA，整合酶，其将由逆转录酶产生的DNA整合进宿主染色体DNA中，及蛋白酶，其加工编码的gag和pol基因。5’和3’LTR促进病毒粒RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其它顺式作用序列。
逆转录病毒载体由Coffin et al.,Retorviruses,Cold Spring HarborLaboratory Press(1997)描述。举例的逆转录病毒是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)或者鼠干细胞病毒(MSCV)。逆转录病毒载体可以是有复制能力的或者复制缺陷的。典型地，逆转录病毒载体是复制缺陷的，其中为病毒粒复制和包装的另外的循环必需的基因编码区被缺失或者用其它基因代替。因此，一旦初始的靶细胞被感染，该病毒不能继续其典型的细胞溶解途径。这种逆转录病毒载体及产生这种病毒必需的物质(例如包装细胞系)可商购(见例如得自Clontech的逆转录病毒载体和细胞系，如目录号634401、631503、631501等，Clontech,Moutnain View,CA)。
这种逆转录病毒载体可以作为被输送物质而产生，通过用被输送的核酸分子置换复制所需的病毒基因而产生。所得基因组在每一端均含有LTR，之间具有希望的基因。产生逆转录病毒的方法为本领域技术人员已知(见例如PCT国际申请公开号WO05/26411)。逆转录病毒载体可以在含有辅助质粒的包装细胞系中产生。所述包装细胞系提供为载体的衣壳产生及病毒粒成熟所需的病毒蛋白质(例如gag、pol和env基因)。典型地，使用至少两个单独的辅助质粒(单独地含有gag和pol基因；及env基因)，以便在载体质粒之间不可发生重组。例如，可以使用标准转染方法将逆转录病毒载体转移进包装细胞系中，如磷酸钙介导的转染法。包装细胞系为本领域熟知且可商购。举例的包装细胞系是GP2-293包装细胞系(Catalog Numbers 631505、631507、631512，Clontech)。在病毒粒产物足够时间之后，收获病毒。如果需要，收获的病毒可用于感染第二个包装细胞系，例如产生具有变化的宿主向性的病毒。最终结果是无复制能力的重组逆转录病毒，其包含感兴趣的核酸，但是丧失其它结构基因，由此在宿主细胞中不可形成新的病毒。
举例说明逆转录病毒载体在基因治疗中的应用的参考文献包括：Clowes et al.,(1994)J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem et al.,(1994)Blood 83:1467-1473；Salmonsand Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4:129-141；Grossman and Wilson(1993)Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114；Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121；Cassani et al.(2009)Blood,114:3546-3556。
iv.慢病毒
慢病毒是逆转录病毒亚类。举例的慢病毒是HIV、SIV和FIV。与其它逆转录病毒不同，慢病毒能整合进非分裂细胞的基因组中。因此，例如已经报道慢病毒载体有效且永久地输送基因至原始的肝细胞中，整合进非分裂的原始肝细胞的基因组中(Lewis and Emerman(1994)J.Virol.,68:510-6)。慢病毒载体也不受累于如MMLV逆转录病毒载体相同的转录沉默机制。慢病毒与其它逆转录病毒不同，其具有在一些病毒粒蛋白中包含的亲核决定簇，如基质或VPR，其与核输入机制相互作用并接到病毒前整合复合物通过核孔主动转运。因此，慢病毒整合进宿主细胞基因组中不依赖于细胞分裂。
与其它逆转录病毒相似，慢病毒含有gag、pol和env基因，其是编码病毒蛋白的主要基因。此外，还存在参与合成调节、病毒RNA加工及其它复制功能的其它辅助基因(例如HIV中Tat和Rev)。两侧是两个长末端重复(LTR)序列。复制循环通过病毒糖蛋白与宿主细胞受体的结合而起始，与膜融合及使病毒进入细胞中。在进入时，病毒是未包被的，逆转录发生导致前整合复合物(PIC)形成。在PIC形成及慢病毒通过PIC主动进入细胞核中感染非分裂细胞的能力中起作用的是其它辅助基因。一旦前病毒进入核包膜，其将自身整合进宿主基因组中。
举例的慢病毒载体是基于HIV-1、HIV-2、SIV或FIV。为了产生安全的慢病毒载体，产生含有几个质粒载体的包装细胞系，例如四个质粒载体系统。例如，第一个质粒含有缺失的辅助蛋白(例如tat、brf、vpr和nef)，由此其仅含有启动子、gag和pol及Psi包装序列，使得转录的病毒RNA掺入新病毒的装配中，第二个质粒含有逆转录酶，第三个质粒含有用疱疹性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)置换的env基因，第四个质粒是感兴趣的载体，用被输送的核酸分子置换复制所需的病毒基因。
这种慢病毒载体及产生慢病毒的系统和方法为本领域已知(见例如Buchshacherand Wong-Staal(2000)Blood,95:2499-2504；Blomer et al.(1997)J.Virol.,71:6641-9；Choi et al.(2001)Stem Cells,19:236-46；美国专利号6,218,186)。慢病毒载体是复制缺陷的，不含有复制所需的基因。为了产生慢病毒，将一些包装质粒转染进包装细胞系中，通常为HEK 293的衍生物或者其它相似细胞系(例如293FT细胞，目录号R700-07,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,CA)；293LTV细胞系，目录号LTV-100，Cell Biolabs,Inc.,San Diego,CA；Lenti-Pac 293Ta细胞系，目录号CLv-PK-01,GeneCopoeia,Rockville,MD)。所述包装质粒单独地编码病毒粒蛋白(例如衣壳和逆转录酶)及由该载体输送的核酸分子(其可被转染进包装细胞系中)。单链的RNA病毒基因组被转录，其被包装进病毒粒中。产生慢病毒载体的方法为本领域技术人员熟知(见例如Naldine et al.(1996)Science,272:263-267)。慢病毒载体和产生病毒的系统可商购(见例如慢病毒表达载体，如pSMPUW慢病毒载体及其衍生物和慢病毒表达和包装系统，得自Cell Biolabs,Inc.)。
慢病毒载体已经用于基因治疗应用中(见例如Manilla et al.(2005)Human GeneTherapy,16:17-25；Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121)。特别地，慢病毒载体已经用于短干扰RNA(siRNA)的输送(Sachdeva et al.(2007)Journal of MedicalVirology,79:118-26)。
b.非病毒载体
基于非病毒的物质在本发明的方法、应用和组合物中可用作被输送物质。这些包括非病毒表达载体。非病毒表达载体含有感兴趣的核酸，例如编码多肽的核酸、反义DNA或siRNA，其中核酸与表达控制序列(例如启动子)可操纵地连接。合适的载体主链包括例如在本领域中常规使用的那些，如质粒、小环和人工染色体(例如哺乳动物人工染色体(MAC)、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或者植物人工染色体(PAC))。许多载体和表达系统可商购自这样的公司，如Novagen(Madison,WI)、Clontech (Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad,CA)。
载体典型包含一或多个调节区，其与编码区功能性连接。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、SMARS(支架基质附着区)、绝缘子、应答元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。
在哺乳动物宿主细胞中控制从载体中转录的启动子可以得自公众来源，例如病毒基因组如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选巨细胞病毒(CMV)，或者得自异源哺乳动物启动子，例如β-肌动蛋白启动子或EF1α启动子，或者得自杂交体或嵌合的启动子(例如与β-肌动蛋白启动子融合的CMV)。来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本发明。
增强子通常是指在与转录起始位点无固定距离起作用的DNA序列，可以是5’或3’转录单位。此外，增强子可以在内含子内以及在其自身编码序列内。其长度通常为10-300个碱基对(bp)，其以顺式起作用。增强子通常发挥增加从附近启动子转录的功能。增强子还可以含有应答元件，其介导转录调节。虽然已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列，典型地可以使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。例如在复制起点之后的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点之后的多瘤病毒增强子，及腺病毒增强子。
所述启动子和/或增强子可以是可诱导的(例如化学或物理调节的)。化学调节的启动子和/或增强子可例如通过醇、四环素、类固醇或金属的存在而调节。物理调节的启动子和/或增强子可例如通过环境因素如温度和光而调节。任选地，所述启动子和/或增强子可以作为组成型启动子和/或增强子起作用，以最大化被转录的转录单位的区域的表达。在某些载体中，所述启动子和/或增强子区域可以是细胞类型特异性方式活性的。任选地，在某些载体中，所述启动子和/或增强子区域在所有真核细胞中均是活性的，与细胞类型无关。这种类型的启动子例如是CMV启动子、SV40启动子、β-肌动蛋白启动子、EFα1启动子，及逆转录病毒长末端重复(LTR)。
所述载体也可包含例如复制起点和/或标记。标记基因可赋予细胞可选择表型(例如抗生素抗性)或者是其它可检测的。可检测的标记例如包括发大肠杆菌lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶。此外，表达载体可包括标签序列，设计为便于表达的多肽的操纵或检测(例如定位)。标签序列如GFP、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或者FLAGTM标签(Kodak；New Haven,CT)序列典型表达为任何多肽，包括编码的多肽和所述标记。这种标签可以插入编码的多的任何地方，包括羧基或氨基末端。
特别地，含有希望的感兴趣的核酸分子的希望的核酸分子表达载体可以作为裸DNA输送，可以用作被输送物质，所述核酸分子是例如编码感兴趣的基因、反义DNA或siRNA或者其它核酸分子。本发明方法中裸DNA的输送效率可以通过使用本领域技术人员已知的任何方法增加(见例如Li and Huang(2006)Gene Therapy,13:1313-1319)。这种方法包括例如电穿孔、超声穿孔或者“基因枪“方法，如本申请别处所述及本领域技术人员所已知。输送效率也可以通过在脂质体中包囊或者与聚合物复合而增加，如本申请所述。在特定的实施例中，所述核酸可以作为纳米粒子输送。
举例说明非病毒载体在基因治疗中的应用的参考文献包括：Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121。
纳米粒子
基于非病毒的被输送物质包括纳米粒子(通常为3-200nm)，其中所述核酸分子被包囊或者与含有靶向分子的特定载体缀合以特异性靶向感兴趣的细胞。对于基因治疗的纳米粒子的产生为本领域熟知(见例如Cho et al.(2008)Clin.Cancer.Res.,14:1310；Jinet al.(2007)Biotechnol.Prog.,23:32-41)。所述纳米粒子可以制成聚合物，如通过使用聚合物载体(例如聚乳酸、多糖、聚(氰基丙烯酸酯，聚(交酯-共-乙交酯))或者分支的聚合物以产生树突状聚合物，如通过逐步聚合步骤从聚(L-谷氨酸(PGA)、聚酰胺-胺(PAMAM)、聚(乙二醇)(PEG)和聚乙烯亚胺(PEI)中制成。可以使用可生物降解的聚合物，其包括例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)或者聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。其它类型的纳米粒子可以产生为脂质体，使用各种脂质混合物；作为磁性纳米粒子，使用氧化铁；作为二氧化硅纳米粒子，使用SiO2，或者作为金纳米粒子，使用氯金酸或柠檬酸钠。纳米粒子系统为本领域技术人员熟知。
所述纳米粒子可以通过在表面上缀合或包被靶向分子而功能化，例如靶向分子是配体或者另外结合在靶向细胞中表达的受体。这种靶向分子包括但不限于配体、抗体或肽。在特定实施例中，可以使用双配体方法以增加对于细胞的选择性,。举例的靶向分子可以是生长因子，例如成纤维细胞生长因子，其靶向成纤维细胞生长因子受体。靶向分子的选择依赖于特定应用，包括靶向的组织或器官，且可以由本领域技术人员根据经验确定。靶向的纳米粒子为本领域已知(见例如Franzen(2011)Expert Opin.Drug.Deliv.8(3):281-98；Faraji and Wipf(2009)Bioorg.Med.Chem.17(8):2950-62；Sajja et al.,(2009)Curr.Drug.Discov.Technol.6(1):43-51)。特别地，纳米粒子的组织特异性基因输送方法为本领域已知(见例如Harris et al.(2010)Biomaterials,31:998-1006。例如，肝实质细胞表达脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)和肝外源凝集素。因此，肝特异性纳米粒子为本领域已知，且可包括用识别脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)及其它受体的物质功能化，包括例如asialo-feutin、asialo-运铁蛋白、asialo-血浆铜蓝蛋白、asialo-乳铁蛋白、asialo-血清粘蛋白、lac-BSA、肝球蛋白、抗体及半乳糖(见例如Pathak et al.(2008)Int.J.Nanomedicine,3:31-49)。
c.全细胞
本发明方法可以用于输送含有离体输送的核酸作为被输送物质的细胞。例如，从导入外源性异源核酸的患者或供体分离的细胞可以由本发明方法直接输送给患者。本方法优势是对所述细胞的免疫应答由血管区室化而降低。因此，本发明提供了将基因修饰的细胞给予对象中的区室化器官或其部分的方法。所述方法包括区室化器官或其部分，将基因修饰的细胞给予区室化器官或其部分，在给予本发明所述基因修饰的细胞之后保持区室化一段时间，及恢复血管循环至所述器官或其部分。被输送细胞的量取决于希望的效果、特定核酸、被治疗的对象及其它类似因素，并且可以由本领域技术人员确定。
可以导入核酸用于基因治疗目的的细胞包含任何希望的可获得的细胞类型，并且包括但不限于表皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是肝造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血或胎儿肝获得的。例如，基因修饰的细胞可以是多能或全能干细胞(包括诱导的多能干细胞)或者可以是胚胎、胎儿或完全分化的细胞。所述基因修饰的细胞可以是来自相同对象的细胞，或者可以是来自与受体对象相同或不同的物种的细胞。在优选实施例中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。基因修饰细胞及移植细胞的方法是本领域已知的。
典型地，核酸在体内给予所产生的重组细胞之前被导入细胞。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、microcell介导的基因转移、球形体融合等。大量将外来基因导入细胞的技术是本领域已知的(见例如Loeffler and Behr,Meth.Enzymol.(1993)217:599-618；Cotten et al.,Meth.Enzymol.(1993)217:618-644；Cline,Pharmac.Ther.(1985)29:69-92)并且可以使用，只要受体细胞的必须的发育及生理功能不被破坏。在特定实施例中，所述方法是允许核酸稳定转移至细胞的方法，由此核酸在细胞中表达并且可以由其细胞后代遗传和表达。
3.举例的基因治疗剂
用于本发明方法、应用和组合物中的含有核酸分子的被输送物质可以是编码感兴趣核酸如本领域技术人员已知的任何基因治疗剂的任何病毒或非病毒载体。根据被治疗的特定疾病或病症选择合适基因治疗剂属于本领域技术人员水平之内。有几百个基因治疗剂在临床试验中，有一些在欧洲(例如AdLPL)和中国(例如rAd53,)已获得批准(见例如Sheridan(2011)Nature Biotechnology,29:121)。
例如，举例的基因治疗载体包括基于腺病毒或AAV的治疗剂。用于本发明方法、应用或组合物中的基于腺病毒或基于AAV的治疗剂的非限制性例子包括但不限于：rAd-p53，其是编码野生型人肿瘤抑制蛋白p53的重组腺病毒载体，例如用于治疗癌症(也已知为Qi et al.(2006)Modern Oncology,14:1295-1297)；Ad5_dl1520，其是缺少E1B基因的腺病毒，用于失活宿主p53(也称为H101或ONYX-015；见例如Russell et al.(2012)Nature Biotechnology,30:658-670)；AD5-D24-GM-CSF，含有细胞因子GM-CSF的腺病毒，例如，用于治疗癌症(Cerullo et al.(2010)Cancer Res.,70:4297)；rAd-HSVtk，具有HSV胸苷激酶基因的复制缺陷腺病毒，例如用于治疗癌症(开发为Ark Therapeutics,见例如美国专利号6,579,855；由Advantagene开发为ProstAtakTM；国际PCT申请号WO2005/049094)；rAd-TNFα，表达在放化疗可诱导EGR-1启动子控制下的人肿瘤坏死因子α(TNF-α)的复制缺陷腺病毒载体，例如用于治疗癌症(TNFeradeTM,GenVec；Rasmussen et al.(2002)Cancer Gene Ther.,9:951-7；rAd-FGF4，编码FGF-4的腺病毒载体血清型5，例如用于治疗血管发生和冠心病(GENERX,BioDrugs,2002,16:75-6；美国专利号5,792,453)；rAd-VEGF-D，含有编码血管内皮生长因子(VEGF-D)的基因的腺病毒载体5，例如用于治疗血管发生相关疾病和病症(Ark Therapeutcs；美国专利公开号US20120308522)；rAd-PDGF，含有编码PDGF-B的基因的腺病毒载体5，例如用于治疗创伤(Excellarate,GAM501Tissue Repair Co.；Blume et al.(2011)WoundRepair Regen.,19:302-308)；Ad-IFNβ，表达在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子驱动下的人干扰素β基因的、已缺失E1和E3基因的腺病毒血清型5载体，例如用于治疗癌症(BG00001和H5.110CMVhIFN-beta,Biogen；Sterman et al.(2010)Mol.Ther.,18:852-860)；含有编码脂蛋白脂酶缺陷(LPLD)基因的基因的AAV，例如用于治疗具有LPLD或家族性高乳糜微粒血症的对象(alipogene tiparvovec,Amsterdam Molecular Therapeutics；见例如国际申请公开号WO2010/134806；WO2001000220,Yla-Herttuala(2012)Mol.Ther.,20:1831-2)；AMT-021，含有编码胆色素原脱氨酶(PBGD)的基因的AAV，例如用于治疗具有急性间歇性卟啉病(AIP)的对象(见例如美国专利公开号US2011/0262399；欧洲专利号EP1049487)；rAAV9-CMV-hNaGlu，含有编码在CMV启动子控制下的NaGlu的基因的AAV-9(见例如Fu et al.(2011)Mol.Ther.,19:1025-33)。
用于本发明方法、应用及组合物中的其它举例的基因治疗剂包括但不限于：rAd-H1F1α(Genzyme/Sunway)、V930/V932(Merck)、NLX-P101(Neurologix)、Toca-511(Tocagen，San Dieog)、LentiGlobin(Bluebird Bio)、ProSavin(Oxford BioMedica)、rAAV-1-CB-hAAT(Applied Genetic Technologies)、rAAV2-CB-人视网膜色素上皮特异性65道尔顿蛋白(RPE65)(Applied Genetic Technologies)、AMT-101(Amsterdam Molecular)、Ad5CMV-p53(Aventis)、CERE-120(Ceregene，San Diego)、CERE-110(Ceregene，San Diego)、SERCA-2a(Celladon，La Jolla)、AAV2-sFLT01(Genzyme)、tgAAG76(Targeted Genetics，Seattle)、tgAAC94(Targeted Genetics，Seattle)、GX-12(Genexine，Seoul，Korea)、SC1B1(ScanCell，Nottingham，UK)、Allovectin-7(Vical，San Diego)、VM202(ViroMed，Minnetonka，MN)或者Rexin-G纳米粒子(Epeius Biotechnologies,San Marino,CA)。
E.组合物、系统及试剂盒
本发明提供了用于通过本发明区室化方法输送至组织或器官或其部分的含有被输送物质的组合物。本发明提供的组合物适合体内给予。组合物配制为实质内给予。典型地，本发明组合物以注射剂提供。注射剂可以制备为常规形式，作为液体溶液或者悬浮液，适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或者作为乳液。通常，本发明提供的被输送物质组合物是液体形式。
组合物可以含有药物学可接受的载体。对于注射，载体典型是液体。特别是，药物学载体是任何这样的载体，其不是生物学或其它方面不希望的，即所述组合物被给予对象而不导致不希望的副作用或者不以有害方式与含有其的药物组合物的其它成分相互作用。选择载体以使活性成分的降解最小化及使对对象的副作用最小化。例如，用于给予细胞的药物学可接受载体典型是可接受的用于注射输送的载体，并且不包括如去污剂或可能损害细胞的其它化合物。
合适的载体及它们的配方描述于Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Edition,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)。用于给予的组合物包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油及注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。作为注射介质，其是通用载体，包括水，含有通常用于注射溶液的添加剂，如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲液。举例的生理学可接受载体包括无菌水、盐水、缓冲溶液或葡萄糖溶液。例如举例的生理学载体包括生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、平衡盐溶液(BSS)或者Ringer溶液及含有增稠和增溶剂如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。溶液的pH通常大约5到大约8或者从大约7到7.5。如果需要，配制物的pH可以用药物学可接受的酸、碱或缓冲液调节以增强配制的化合物或其输送形式的稳定性。
被输送物质(其是核酸分子或者含有核酸分子)可以配制为组合物中唯一药物学活性成分或者可以与其它活性成分组合物用于治疗特定疾病。任选地，其它医药学物质、药物学物质、载体、佐剂、稀释剂可以包括在本发明提供的组合物中。例如，湿润剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味、风味和芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可以存在于组合物中。可以包括在组合物中的举例的其它物质和赋形剂包括例如水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基苯甲醇(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
组合物还可以配制用于缓释配方，如吸附于生物降解支持物，包括胶原海绵，或者在脂质体中。缓释配方可以配制用于多剂量给予，由此在选择的时间期间，如一个月或直至大约一年，给予若干剂量。因此，例如，可以制备脂质体，由此单剂量在一次注射中被给予总共大约2次直至大约5次或更多次。
组合物可以与保护其抵抗从身体快速清除的载体如时间释放配方或包衣一起制备。这种载体包括受控释放配方，例如但不限于，微囊化输送系统和生物降解生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和其它类型的植入体，其可以被直接置入身体中。组合物也可以以小丸(pellet)给予，如ELVAX小丸(乙烯-醋酸乙烯酯共聚物树脂)。
脂质体悬浮液包括组织靶向脂质体也可以适用作为药物学可接受载体。例如，可以通过本领域技术人员已知的方法制备脂质体配方(见例如Kim et al.(1983)Bioch.Bioph.Acta 728:339-348；Assil et al.(1987)Arch Ophthalmol.105:400；及美国专利号4,522,811)。被输送物质可以包囊在脂质体系统的水相中。
活性材料也可以与不削弱希望作用的其它活性材料混合，或者与补充希望作用或者具有其它作用的材料混合，这种材料包括粘弹性材料，如透明质酸，其以商标HEALON出售，是大约3百万高分子量(MW)透明质酸钠的溶液(由Pharmacia,Inc制造，见例如美国专利号5,292,362、5,282,851、5,273,056、5,229,127、4,517,295和4,328,803)。可以包括额外的活性物质。
1.剂量配方
本发明提供了含有配制用于以比静脉内给予的相同被输送物质的量低100倍或更低的量实质内给予组织或器官的被输送物质的组合物。例如，提供了含有配制用于以比静脉内给予靶器官或组织的相同被输送物质的量低100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、5000倍、10000倍或更低的量实质内给予组织或器官的被输送物质的组合物。组合物可以作为单剂量配方或多剂量配方提供。
例如，提供了含有是腺病毒或腺伴随病毒的被输送物质的量的组合物。特别地，所述腺病毒或腺伴随病毒在基因组中含有至少一个异源核酸分子，如治疗性核酸分子。用于单剂量给予的组合物中的腺病毒的量是10pfu至1x1012pfu、1x102pfu至1x1010,1x103pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x109pfu、1x103pfu至1x108pfu或者1x106pfu至1x109pfu，或者是10个颗粒至1x1012个颗粒、1x102个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x109个颗粒、1x103个颗粒至1x108个颗粒或者1x106个颗粒至1x109个颗粒。通常用于单剂量给予的组合物中的腺病毒的量是10vp至1x1012vp、1x102vp至1x1010vp、1x103vp至1x1012vp、1x103vp至1x1010vp、1x103vp至1x109vp、1x103vp至1x108vp、1x103vp至1x106vp、1x106vp至1x1012vp、1x106vp至1x1010vp，或者小于或大约小于1x1012vp、1x1011vp、1x1010vp、1x109vp、1x108vp、1x107vp、1x106vp、1x105vp、1x104vp、1x103vp、1x102vp、10vp或更小。在其它实施例中，用于单剂量给予的组合物中的腺病毒的量是10pfu至1x1012pfu、1x102pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x1012pfu、1x103pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x109pfu、1x103pfu至1x108pfu、1x103pfu至1x106pfu、1x106pfu至1x1012pfu、1x106pfu至1x1010pfu，或者小于或大约小于1x1012pfu、1x1011pfu、1x1010pfu、1x109pfu、1x108pfu、1x107pfu、1x106pfu、1x105pfu、1x104pfu、1x103pfu、1x102pfu、10pfu或更小。组合物可以配制成10μL至5mL，如20μL至1mL或者50μL至500μL。在这种组合物中，腺病毒配制用于实质内给予。在特定实施例中，腺病毒配制用于实质内给予肝。
2.组合
含有配制用于实质内给予的被输送物质的组合物可以与其它物质组合。所述其它物质可以是增加效率或促进被输送物质进入实质细胞的物质，或者调节对被输送物质的免疫应答的物质。
例如，本发明提供了组合，其含有含配制用于实质内给予的被输送物质的组合物及与被输送物质结合或复合病介导其进入细胞的物质或输送运载体。举例的物质包括但不限于阳离子脂质体和脂质、脂蛋白、合成聚合物或多肽、无机化合物或维生素。举例的聚合物包括聚阳离子或聚阴离子。例如，被输送物质可以提供为与如下物质的组合：聚胺、磷酸钙沉淀、组蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、DEAE葡聚糖、聚凝胺、聚两性电解质复合物、精胺、亚精胺、purtrescine、人血清白蛋白、DNA结合蛋白、非组蛋白染色体蛋白、来自DNA病毒的外壳蛋白及N-取代的甘氨酸的聚合物。所述物质可以单独或一起配制。
在进一步实施例中，治疗性转基因的表达可以通过使用转录增强子增强，例如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，如异羟肟酸(hydroxamic acid)、环状四肽、丙戊酸及其它。因此，被输送物质可以与是病毒特异性细胞表面受体的转录增强子的物质或化合物组合提供。这种物质或化合物包括例如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂包括异羟肟酸、环状四肽、苯酰胺、亲电酮类或者脂族酸化合物。例如，HDAC抑制剂包括但不限于trischostatin A、伏立诺他(SAHA)、belionostat(PXD101)、LAQ824、帕比司他(LBH589)、恩替诺特(MS-275)、C199、mocetinostat(MGCD0103)、罗米地辛(Istodax)、丙戊酸、PCI-24781、SB939、resminostat、givinostat、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、Kevetrin或trichostatin A(TSA)。举例的HDAC抑制剂是丙戊酸，其是腺病毒受体CAR的转录增强子。研究表明在丙戊酸存在下腺病毒摄入增加(Segura-Pancheco et al.(2007)Genet.Vaccines Ther.,5:10)。在这种实施例中，含有被输送物质的组合物与额外物质或化合物(例如转录增强子物质)一起或单独配制。转录增强子物质可以以在或大约在50mg至8000mg之间的量提供，例如在或大约在100mg至5000mg之间、1000mg至4000mg之间。组合的物质或化合物组合物可以配制用于单剂量或多剂量给予。额外的物质或化合物可以配制用于可接受的和本领域技术人员已知的任意途径给予。例如，转录增强子可以配制用于口服给予、静脉内给予、皮下给予或实质内给予。
在进一步实施例中，本发明提供了这样的组合，其含有含配制用于实质内给予的被输送物质的组合物和含有免疫抑制剂的组合物。举例的免疫抑制剂包括但不限于环孢霉素泼尼松(NovoApo硫唑嘌呤他克莫司或FK506吗替麦考酚酯西罗莫司OKT3(Muromorab)、ATGAM&Thymoglobulin。在这种实施例中，含有被输送物质的组合物与免疫抑制剂一起或单独配制。含有免疫抑制剂的额外的组合物可以配制用于可接受的和本领域技术人员已知的任意途径给予。例如，免疫抑制剂可以配制用于口服给予、静脉内给予、皮下给予或实质内给予。
3.制造品及试剂盒
组合物或组合可以包装储存和/或应用。用于包装物质的包装材料是本领域技术人员熟知的。包装材料的例子包括安瓿、瓶、试管、小瓶、容器、注射器及适合选择的配方和实质内给予的任何包装材料。例如，组合物和组合可以封在安瓿、一次性注射器或玻璃、塑料或其它合适材料制成的多剂或单剂小瓶中。包装材料可以包括针或其它注射装置以便于实质内给予目的的给予。包装的选择取决于特定被输送物质。通常，包装是与其中所含的组合物不反应的。另外，组合物和包装材料是无菌的。
例如，含有被输送物质的组合物可以提供在容器中，如密封的无菌小瓶或注射器，含有的量是在给予时输送足够量的被输送物质(例如病毒颗粒)。组合物中被输送物质如腺病毒或腺伴随病毒的量是在或大约在10pfu至1x1012pfu、1x102pfu至1x1010、1x103pfu至1x1010pfu、1x103pfu至1x109pfu、1x103pfu至1x108pfu或者1x106pfu至1x109pfu之间；或者在或大约在10个颗粒至1x1012个颗粒、1x102个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x1010个颗粒、1x103个颗粒至1x109个颗粒、1x103个颗粒至1x108个颗粒或者1x106个颗粒至1x109个颗粒之间。容器中组合物的体积可以是50μL至50mL、50μL至5mL、50μL至500μL、100μL至10mL、100μL至5mL、100μL至2mL、100μL至1mL、200μL至4mL、200μL至2mL、1mL至10mL或者1mL至2mL。例如，容器可以提供用于单次使用或多次使用给予。容器中物质的量可以是100μL至10mL，其中大约20至5mL例如20至500μl、50至150μl、100μL至10mL或200μl至2mL被输送，在这种体积中含有至少大约10至1010噬斑形成单位(pfu)或颗粒、如102至106噬斑形成单位(pfu)或颗粒。
含有被输送物质的组合物或组合可以包装为制造品，含有包装材料、配制用于单剂量或多剂量给予的实质内给予物质及表明被输送物质是用于输送特定核酸分子和/或用于特定应用的标签。
这种封装组合物、组合及制造品可以提供在试剂盒中。特别是，提供了试剂盒，其含有封装有被输送物质组合物的安瓿、瓶、试管、小瓶、容器、注射器。试剂盒可以任选配有允许给予被输送物质的装置，如注射器、针或其它注射装置。组合物可以包含在给予物件中或者可以单独提供以稍后加入。试剂盒可以任选包括使用说明，包括剂量、给予方案和给予说明。也可以提供其它试剂。例如试剂盒可以任选包括实现组织或器官或其部分的区室化的装置，实现组织或器官动员的工具、监测区室化的计时器及其它用于实施方法的试剂。例如试剂盒可以包括实质钳。
F.评估输送、表达或功效
在进行本发明区室化方法时，可以监测或评估任意数量的参数以证实被输送物质的输送，核酸分子的表达和/或其它方式验证方法的事实。例如可以监测被输送物质进入细胞，可以评估在实质或体循环中被输送物质的存在，可以评估编码的多肽的表达，可以监测或评估组织毒性，和/或可以确定免疫系统的激活。本领域技术人员熟悉这种方法和技术。这种方法和技术可以任选进行。
1.监测被输送物质
例如，在用本发明提供的区室化方法输送或给予被输送物质时，可以评估或检测对象中存在的被输送物质。例如，可以进行本申请举例的测定，在血管隔离释放之前、期间和之后测量被输送物质的全身释放或者外周血中的表达的转基因产物。典型地，在本发明方法中，在用本发明方法将被输送物质给予组织或部分之后在体循环中检测到低于10％、通常低于5％、4％、3％、2％或1％的转基因产物。
被输送物质的检测可以通过将被输送物质或者核酸分子缀合于或可操作连接于可检测部分而促进。可检测部分是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射核素和金属。例如，可检测部分包括例如萤光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、胶体金、铁、钆和镓-67及本领域技术人员熟知的其它部分。
被输送物质从组织或体液样品监测。例如，可以收集和加工(例如匀浆)实体组织、特别是区室化区域并从其分离或纯化RNA或DNA。可被测定的体液包括例如外周血。从组织或体液提取RNA和DNA的方法是本领域技术人员熟知的。例如，基于的方法典型用于从生物学材料提取RNA(例如试剂,Life Technologies,Carlsbad,CA)。例如，可以设计基因特异性引物或探针，被输送物质或核酸分子可以用PCR和本领域技术人员已知的其它标准方法检测。这在本发明实施例中举例示出，其中用针对萤光素酶的引物进行PCR。在组织(例如匀浆样品)或生物学液体样品中的检测也可以使用荧光计、发光计、比色板分析仪、Geiger计数器、液闪计数器实现。方法的选择依赖于特定可检测部分并且属于本领域技术人员水平之内。例如，萤光素酶活性可以用发光计评估，如本发明实施例所述。另外，检测任选通过检测在来自对象的生物学样品中的被输送物质编码的多肽的表达而进行。所述多肽可以用本领域技术人员已知的程序检测，包括但不限于western印迹、免疫组织化学、免疫荧光或ELISA。
在特定实施例中，也可以分离来自组织或器官的实质细胞并且评估被输送物质的细胞内存在。特别地，实质细胞的分离典型是使用胰蛋白酶、胶原蛋白酶和/或其它蛋白酶消化组织而进行。这种程序是本领域技术人员熟知的(见例如Somers et al.(2007)DMD,35:1797-1805；Methods in Cell Biology,vol XIII,David M.Prescott ed.,AcademicPress,1976；Chapter 4,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells",pp 29-83)。例如，组织可以例如用磷酸盐缓冲盐水灌注，以除去任何血液。组织可以用剪刀剪碎，在含有蛋白酶的消化介质中消化。这典型产生细胞悬浮液，可以过滤其以收集细胞。可以通过例如将细胞收集在胎牛血清中而失活任何残余蛋白酶。细胞然后可以被洗涤并在已知与特定细胞相容的细胞培养基中培养。可以评估细胞存活性，可以测定新鲜分离的细胞中被输送物质的细胞内存在。细胞内物质的存在可以通过固定和透化细胞膜而评估(例如使用商业可得试剂如ORTHOPermeaFixTM(OPF)或者FIX&PERM Cell Permeabilization An DerGrub Bio Research GmbH,Imtec)。细胞可以通过使用平板分析装置(例如荧光计、发光计或比色平板分析仪)经流式细胞术而评估。另外，如果希望，可以使用显微镜方法。另外，可以制备细胞匀浆用于Western印迹分析。
2.宿主毒性及免疫激活
也可以评估当给予被输送物质时起始的组织毒性和免疫应答。例如，毒性可以用下层组织或器官或其部分的组织病理学评估。组织样品可以通过生物活检获得，并且典型用苏木精和曙红染色用于组织学分析。可以评估细胞异常。例如，组织病理学分析可以鉴别炎性细胞浸润，如与免疫激活相关的淋巴细胞或嗜中性粒细胞浸润。可以与未区室化的相同对象的相同组织或器官的区域进行比较。在其它实施例中，可以使用来自未用本发明方法治疗的对照对象的组织。
毒性也可以通过评估随着组织或器官损伤而上调、存在或与之相关的因子或标记的表达而进行监测。例如，可以评估组织损伤的生化标记。这种标记是本领域技术人员已知的，并且根据特定组织或器官而变化。例如，对于肝，已知的与肝损伤或损害相关的生物标记包括例如丙氨酸转移酶(ALT)、氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶或者胆红素。这种标记的基线水平可以在起始本发明程序之前在对象中确定。正常对照对象也可以用作这些酶的正常水平的测量。另外，标记水平可以在被区室化的组织或器官区域与未被区室化的区域之间进行比较。典型地，标记如ALT的水平是对照的至少两倍表明组织损害如肝损害。
在进一步实施例中，可以评估免疫激活的其它标记。免疫激活的标记可以在局部组织中评估。在其它实施例中，免疫激活的标记可以在体循环中评估。在本发明方法中，在给予被输送物质之后，免疫激活的标记如细胞因子表达在对象体循环中不显著升官或不升高。另外，尽管在被给予被输送物质的器官或其部分中有一些增加，观测到的局部免疫激活低于在现有基因治疗方法中观测到的。这种标记的基线值可以从正常对象确定或者在本发明方法中给予被输送物质之前从治疗对象中确定。另外，区室化的效果可以通过将区室化的组织或器官的部分中的免疫标记与未区室化的组织或器官的部分进行比较而确定。
例如，可以评估或确定针对被输送物质的中和抗体的存在。在特定实施例中，可以检测病毒特异性中和抗体。典型地，从已给予病毒的对象中收集血清，如本发明方法。评估血清中的中和抗体的存在及量的各种测定是本领域技术人员已知的。例如，中和抗体可以基于病毒功能的血清抑制而检测(Mandel et al.(1978)Adv.Virus.Res.,23:205-68),使用噬斑测定(Harvey et al.(1999)J.Virol.,73:6729-6742),使用人血清的腺病毒衣壳蛋白的Western印迹(Vincent et al.(2001)J.Virol.,75:1516-1521)及基于定量形态学标准(Vincent et al.(2001)。也可以使用抗病毒特异性抗体评估中和抗体的血清水平。例如，可以使用抗Ad5抗体(例如65H6,Thermo Scientific,Rockford,IL)。
在其它实施例中，可以评估细胞因子、特别是促炎性细胞因子。可以加工组织或体液(例如外周血)获得DNA或RNA。可以进行PCR如RT-PCR。各种阵列是商业可得的，其含有用于细胞因子的RT-PCR的试剂(见例如阵列，来自Life Technologies,Carlsbad,CA)。另外，可以针对任何感兴趣细胞因子设计引物。在另一个实施例中，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)或Western印迹测定评估细胞因子表达。用于评估细胞因子及其它免疫蛋白质的试剂是熟知并商业可得的。例如，用于许多细胞因子的EIA和ELISA试剂盒是商业可得的,所述细胞因子包括但不限于IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-2、TNF-α及其它。对于用于这种测定中的组织制备，可以使用本领域技术人员已知的组织匀浆程序。组织可以在匀浆缓冲液中匀浆，离心除去碎片及不溶性材料，可以确定总蛋白质浓度(例如使用考马斯蛋白质染色测定、BCA方法或本领域技术人员已知的其它方法)。离心的上清可以加工用于Western印迹，或者可以被稀释并直接用于基于ELISA的测定。
G.应用及使用方法
本发明提供的区室化方法使得转基因产物持续长期高水平表达。因此，所述方法可以用于各种应用中，包括但不限于医学应用，包括替代缺陷基因产物的应用或者外援给予治疗剂的应用；生产用于移植的器官；在转基因动物中生产治疗性蛋白质(例如生物反应器)；及在农业、兽医和工业应用中。例如，所述方法可以用于选择的多肽的体内细胞表达。在一些实施例中，所述多肽物质可以用于治疗，其中多肽治疗或改善对象中的疾病或病症或者改善对象的生命质量。在其它实施例中，多肽物质可以用于农业中，例如改善肉生产的质量或数量的应用。
所述方法可以在需要基因治疗并且适合于通过本发明方法治疗的任何对象或患者中进行。这种对象的例子包括但不限于小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、山羊、马和人类。在特定实施例中，本发明涉及18岁以下儿童包括婴儿、学步儿或幼儿，用于治疗与遗传缺陷相关的疾病或病症。
以下提供了本发明方法的举例应用。应理解根据被给予的特定核酸分子存在其它应用。根据任何希望的应用选择感兴趣核酸分子属于本领域技术人员水平之内。以下描述仅为举例。
1.治疗疾病和病症
本发明提供了通过用本发明提供的区室化方法将核酸分子输送至对象而治疗疾病、失调或病症的方法。治疗的疾病、失调或病症是适合通过外源输送的核酸分子治疗的任何疾病、失调或病症。例如，这种疾病或病症包括其中治疗是如下实现的任何疾病或病症：降低或增加与病症相关的基因的表达，降低或增加与病症相关的基因产物的活性，或者另外对抗与病症相关的改变(例如与疾病或病症相关的迹象、症状或效果)。例如，基因治疗可以用于治疗与遗传缺陷相关的疾病或病症，包括单基因疾病(例如A型和B型血友病、I型糖尿病、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、囊性纤维化、肌营养不良及许多其它疾病)，或者可以用于通过编码与改善疾病或病症(例如癌症)相关的治疗性蛋白而治疗疾病或病症。
在本发明任意这种实施例中，被输送物质是核酸分子或者含有核酸分子，其是治疗性核酸或者编码治疗性多肽。因此，本发明提供了治疗患有疾病或病症的对象的方法，其包括区室化对象的器官或其部分；将是或者含有感兴趣核酸分子的选择的被输送物质直接施用至所述区室化器官或其部分，在给予本发明所述核酸后保持一段预定时间；恢复器官或其部分的血管循环。
本发明提供的方法可以用于治疗各种疾病和失调。被输送物质及其中的核酸分子的选择是基于待治疗的失调或疾病及受累的特定器官。如本申请它处所述，本领域技术人员能够根据被治疗的特定疾病或失调而确定核酸分子的类型。进一步举例，例如，区室化方法用于输送编码CFTR的核酸以治疗囊性纤维化，输送编码NP2的核酸用于治疗疼痛，输送编码血管发生抑制剂或肿瘤抑制物的核酸用于治疗癌症，输送编码胰岛素或exendin-4的核酸用于治疗糖尿病。
另外，本领域技术人员已知基于待治疗疾病或失调及给予的特定被输送物质区室化特定组织或器官。在一些情况中，被输送物质不显示组织或器官转导，因此被直接输送至受累组织或器官。在其它情况中，选择在全身表达后显示组织嗜性或转导的特定被输送物质。例如，AAV-4、AAV-6、AAV-8和AAV-9显示广泛转导至多种组织，包括肺、心脏、肝、肾、骨骼和心脏，因此可以是用于全身表达的被输送物质以实现骨骼或心脏疾病和失调的治疗。在另一个实施例中，AAV-9能够绕过血脑屏障转导中枢神经系统(CNS)，因此是用于全身表达的被输送物质以实现神经变性疾病或其它CNS疾病和失调的治疗。
特别地，肺是许多急性和慢性疾病的基因治疗的重要靶器官，所述疾病包括癌症、哮喘、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶缺乏和呼吸窘迫综合征等。肌肉是治疗肌肉或运动疾病如肌营养不良或charcot-Marie-Tooth(CMT)病的基因治疗的靶器官。脑是如下疾病的基因治疗的重要靶器官：运动神经元疾病(例如脊髓性肌萎缩(AMA)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、X连锁肾上腺脑白质营养不良(ALD))、帕金森病或者与缺失或缺陷基因相关的疾病或病症，包括代谢性或溶酶体疾病如Sanfilippo(粘多糖贮积症III型；MSPIII)或者Canavan病。皮肤是慢性伤口、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、癌症、遗传病和全身性疾病的基因治疗的靶器官。例如，生长因子(例如PDGF-B、FGF2、VEGF)可以靶向皮肤用于伤口修复(Liu et al.(2001)Yonsei Medican Journal,42:634-645)。肝是许多遗传性(inherited)、遗传性(genetic)和代谢性肝病和失调的基因治疗的靶器官，所述疾病和失调包括但不限于血色素沉着症、A型和B型血友病、α1抗胰蛋白酶缺乏、Wilson病、Crigler-Najjar综合征I型、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏、IIa型家族性高胆固醇血症、纤维蛋白原缺乏血症、溶酶体贮积病、糖原贮积病、苯丙酮尿症、Tay-Sachs病、诱导的肝炎。
含有感兴趣核酸的被输送物质到特定组织或器官的基因治疗可以实现全身表达。例如，基因治疗输送至肝可以用于治疗非肝相关全身性疾病或病症，因为肝的细胞机制可以产生和分泌打量蛋白质进入血液。因此，靶向肝可以用于产生治疗性蛋白质进入血液循环，治疗各种疾病和病症，所述治疗性蛋白质包括但不限于凝血因子、激素、生长因子、细胞因子、代谢酶和抗蛋白酶。肝也可以用于分化肝细胞为肝中分泌胰岛素的β细胞。基因治疗通过靶向肝已用于治疗许多疾病和病症(Nakai H.,“Hepatic Gene Therapy,”pp.343-370in Molecular Pathology of Liver Diseases(S.P.S.Monga,ed.)。在另一个实施例中，全身性疾病可以通过靶向皮肤治疗，因为角质形成细胞可以产生大量蛋白质，可以释放进循环。因此，皮肤基因治疗可以用于输送编码细胞因子(例如干扰素或白介素或其它细胞因子)、激素(例如胰岛素、生长激素和其它激素)、凝血因子和其它蛋白质的核酸以治疗癌症、病毒性、炎性和遗传性疾病。例如，遗传缺陷如血友病B可以通过将因子IX输送进角质形成细胞而治疗。
另外，给予的被输送物质的量基于治疗性核酸或由核酸分子编码的治疗性多肽的希望的治疗剂量而调节。如本申请所述，通过使用本发明提供的区室化方法，被输送物质的剂量与蛋白质输出是线性的。因此，被输送物质的特定剂量可以基于特定核酸分子、被输送物质、特定基因治疗、给予被输送物质的对象、靶器官或其部分、预期摄入、所需治疗量和其它因素凭经验确定。
可以通过本发明区室化方法输送核酸分子而治疗的举例的疾病或失调包括但不限于，遗传性酶缺陷(例如粘多糖贮积症、糖原贮积病、溶酶体贮积病)、癌症、血友病、糖尿病、肌营养不良症、心血管疾病、囊性纤维化、神经变性疾病、创伤、疼痛、镰刀细胞贫血、自身免疫疾病、炎性疾病、遗传性免疫缺陷、高血压和帕金森病。例如，所述疾病或病症选自A型和B型血友病,I型糖尿病,α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏、血色素沉着症、Wilson’s病、Crigler-Najjar综合征I型、II型鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷、家族性高胆固醇血症、纤维蛋白原缺乏血症、糖原贮积病(GSD)Ia型、GSD Ib型、GSDII型(Pompe)、粘多糖贮积症(MPSI)、MPSIIIA、MPS IIIB、MPS VII、法布里病、Gaucher’s病、Niemann-Pick综合征、鸟氨酸转甲酰酶缺乏(OTC)、苯丙酮尿症、肝纤维化、肝缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、半乳糖血症、苯丙酮尿症、槭糖尿病、1型酪氨酸血症、甲基丙二酸尿症、瓜氨酸血症、Gout and Lesch Nyan综合征、Sly综合征、Zellweger综合征、重症联合免疫缺陷病(SCID)、囊性纤维化、急性间歇性卟啉病、脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)或者多发性硬化症。
以肝为例，本发明方法可以用于将含有任何核酸的被输送物质如D.1章节所述的输送至区室化肝或肝部分以治疗其中本领域中已使用基因治疗的任何疾病。例如，肝(或其它组织或器官)可以在本发明方法中区室化，用于输送和治疗疾病和病症，包括但不限于：输送用于治疗A型血友病的因子VIII；输送用于治疗B型血友病的因子IX；输送用于治疗α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)；输送用于治疗糖原贮积病(GSD)Ia型的葡萄糖-6-磷酸-α；输送用于治疗GSD Ib型的G6PT；输送用于治疗GSD II型(Pompe)的酸性-α-葡糖苷酶；输送用于治疗粘多糖贮积症(MPS1)的α-L-艾杜糖醛酸酶；输送用于治疗MPSIIIA的sulphamidase；输送用于治疗MPS IIIB的α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)；输送用于治疗MPS VII的β-葡糖醛酸糖苷酶；输送用于治疗法布里病的α-半乳糖苷酶A；输送用于治疗Gaucher’s病的葡糖脑苷脂酶；输送用于治疗Niemann-Pick综合征的酸性鞘磷脂酶；输送用于治疗OTC缺乏的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；用于治疗Crigler-Najjar综合征的UDP葡糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)；用于治疗家族性高胆固醇血症的LDL受体；用于治疗苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶；金属蛋白酶(MMP1或MMP8)；用于治疗肝纤维化的u-PA,TIMP拮抗剂或抗HSC分子；用于肿瘤肝缺血再灌注损伤的抗ROS分子；用于治疗糖尿病的胰岛素原前体或用于β细胞转分化的转录因子；用于治疗乙肝的抗病毒RNA的RNAi；用于治疗丙肝的抗病毒RNA的RNAi；用于肿瘤肝癌的p53；用于治疗多发性硬化的IFN-β或其它抗炎细胞因子；用于肿瘤诱导性肝炎的干扰素-α；或者用于治疗脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)的脂蛋白脂酶。
这个列表不是限制性的，因为可以用治疗性核酸或者核酸编码的治疗性多肽治疗的任何疾病或病症可以被治疗。举例的疾病和病症描述于下。
a.A型和B型血友病
可以由本发明区室化方法及材料治疗的病症的一个例子是血友病。血友病有两种类型，A和B。患有血友病A的或者缺乏已知为因子VIII的蛋白质，而血友病B的患者缺乏因子IX。这些凝血因子的低水平或完全缺乏导致患者在有伤口或者血管结构损伤时终止出血的能力严重受阻。这导致出血延长，具有潜在致命后果。目前血友病治疗包括定期输注血液制品或者所需血液因子的重组品种。但是尽管供体血液筛查改善，但是通过输血或者血液制品输注而感染病毒的风险仍是一个问题。另外，使用血液制品来源的及重组来源的因子VIII或IX治疗，阻断凝血因子活性的抗体产生使得对一些患者的治疗变得复杂。血友病已被认为是基因治疗的理想候选者，因为因子VIII或因子IX水平的温和升高已被示出足以改善血友病A或B的许多临床后果。
使用本发明方法，含有因子VIII的基因的被输送物质可以用于治疗血友病A。在另一个实施例中，使用本发明方法，含有因子IX的基因的被输送物质可以用于治疗血友病B。本方法允许肝、例如一小部分肝变成全新的(de novo)内分泌腺体，可以永久分泌所需的凝血因子进入循环，因此潜在改善疾病后果。这可以使用本发明方法，通过将编码凝血因子的被输送物质的重组病毒(例如腺病毒)或一些其它载体类型直接输送到区室化组织或器官的实质，例如区室化的肝如一小部分肝而实现。例如，特定的凝血因子根据缺陷可以是因子VIII或IX。遗传信息被转录和转导，由此合成凝血因子病分泌进入循环，矫正凝血损害/缺陷。
b.家族性高胆固醇血症
可以由本发明区室化方法及材料治疗的病症的一个例子是家族性高胆固醇血症。家族性高胆固醇血症是常染色体显性疾病，由低密度脂蛋白受体(LDLR)基因中的突变所致。尽管降低血浆胆固醇降低冠心病风险，但是患有家族性高胆固醇血症的患者通常对药物治疗响应不良。
患有家族性高胆固醇血症的对象已通过给予编码低密度脂蛋白受体的核酸而治疗(见例如Grossman et al.(1995)Nat.Med.,1:1148-1154；Shichiri et al.(2003)GeneTher.,10:827-31；Yang et al.(1994)Immunity,1:433-442；Yang et al.(1995)J.Virol.,69:2004-2015；Yang et al.(2004)Biochem.J.,379:89-97)。类似地，使用本发明区室化方法，含有LDLR基因的被输送物质可以用于治疗家族性高胆固醇血症。这可以使用本发明方法，通过将编码LDLR的被输送物质的重组病毒(例如腺病毒)或一些其它载体类型直接输送到区室化组织或器官的实质、例如区室化的肝如一小部分肝而实现。
c.I型糖尿病
可以用本发明区室化方法及材料治疗的病症的进一步的例子是I型糖尿病。I型糖尿病由于不能产生胰岛素所致，由此导致血糖水平显著升高。另外，持续高血糖水平导致严重后果，严重损害患者生活质量和预期寿命。糖尿病是慢性病，目前没有治愈手段。
减轻糖尿病的一些病理作用可以通过用本方法部分恢复胰岛素水平而实现。使用本发明的区室化方法，含有胰岛素基因的被输送物质可以用于治疗糖尿病。这可以使用本发明方法，通过将编码胰岛素基因的被输送物质(例如病毒载体或其它载体)直接输送到区室化组织或器官的实质、例如区室化的肝如一小部分肝而实现。这可以导致胰岛素由转导的肝细胞稳定、长期合成及分泌。
d.α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏
可以用本发明区室化方法及材料治疗的病症的进一步的例子是常见的单基因肺病α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。AAT由肝产生并分泌进入循环，在循环中其到达肺，保护肺泡壁的弹性蛋白纤维及其它结缔组织成分免于被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解。AAT缺乏可以导致患者由于肺气肿而死亡。编码AAT的基因已被分离，重组人AAT蛋白的外源给予代表一种目前治疗方式。
一些研究也已经显示基于基因治疗开发治疗方法的前景。基因治疗方法包括例如转导骨骼肌细胞或肝细胞以表达AAT(Song et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.,95:14384-14388；Song et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.,98:4084-8；Song et al.(2001)Gene Ther.,8:1299-1306；Song et al.(2004)Hepatology,40:918-24；Zhang et al.(2003)Gene Therapy,10:2148-52；Ferkol et al.(1998)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,18:591-601)。
使用本发明方法，含有AAT基因的被输送物质可以用于治疗AAT缺乏。这可以使用本发明方法，通过将编码AAT的被输送物质(例如非病毒或病毒载体如腺病毒)直接输送到区室化组织或器官的实质(例如骨骼肌或肝如一小部分肝)而实现。通过将编码AAT的核酸序列掺入载体并且用本方法转导组织部分，可以实现AAT的稳定长期表达，可以潜在解决肺气肿。
e.血管发生和癌症
可以用本发明区室化方法治疗的疾病或病症的一个例子是血管发生。血管发生是新的毛细血管从已有血管形成的过程。其是复杂过程，涉及内皮细胞的增殖及迁移。血管发生在生殖、胚胎发育及伤口修复中起基础作用。但是，不受调节的血管发生在许多疾病进展中起中心作用，例如实体肿瘤生长及转移、关节炎、糖尿病和一些形式的失明。例如，血管发生由于形成对肿瘤的供血而在癌症生长及扩散中起作用，所述供血可以供肿瘤生长并促进转移。因此，抗血管发生剂可以用于治疗癌症和血管发生在其中起作用的其它疾病。
血管发生由促血管发生生长因子如VEGF、FGF和PDGF与抗血管发生因子如内皮抑素和血管生成抑制素之间的复杂相互作用控制。这两组因子之间的失衡产生病理性血管发生。一些研究建议将抗血管发生因子如内皮抑素或血管生成抑制素输注给癌症患者会重建这两组间的平衡，阻止异常血管发生，由此阻止肿瘤生长及转移。
使用本发明方法，含有编码抗血管发生因子的核酸的被输送物质可以用于治疗血管发生疾病和病症，如癌症、关节炎、糖尿病和失明。这可以使用本发明方法，通过将编码抗血管发生因子如内皮抑素或血管生成抑制素的被输送物质(例如非病毒或病毒载体如腺病毒)直接输送到区室化组织或器官的实质(例如肝，如一小部分肝)而实现。通过将编码抗血管发生因子的核酸序列掺入载体并且用本方法转导组织部分，可以实现抗血管发生因子的稳定长期表达。
f.自身免疫及炎性疾病(例如多发性硬化症)
可以用本发明区室化方法治疗的疾病或病症的一个例子是自身免疫及炎性疾病，如多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病、克罗恩病、干燥综合征、囊性纤维化、myostitis和狼疮。例如，MS是中枢神经系统(CNS)的自身免疫炎症，其中脑和脊髓轴突附近的髓鞘(fatty myelin sheaths)被损伤。其结果是轴突不再传导信号。
通过基因治疗而治疗自身免疫炎症如MS和其它病症是使用细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗T细胞单克隆抗体、信号转导抑制剂而靶向免疫激活。例如，可以导入抗炎基因以下调免疫应答(Neumann et al.(2005)Gene Therapy and Molecular Biology,9:61-76)。举例的抗炎基因包括细胞因子或其它免疫调节剂，例如但不限于白介素-4、白介素-10、转化生长因子b、干扰素-β(IFNβ)、白介素-1受体α(IL-1Rα)、可溶性TNF受体(sTNF-R)、可溶性白介素-1受体(sIL-1R)或者可溶性干扰素-γ受体(sIFNγR)。例如，干扰素β治疗已被批准用于MS(Kieseier et al.(2007)Exp.Neurol.,203:1-4)。除了病毒和非病毒基因治疗途径之外，MS的治疗还包括使用从待治疗的靶对象收集的细胞(例如树突状细胞或T细胞)，所述细胞已被工程化表达抗炎细胞因子(例如IFN-β,IL-10或IL-4)，它们然后被重新导入宿主对象用于输送用于治疗的基因产物。
使用本发明方法，含有编码抗炎基因或细胞因子的核酸的被输送物质可以用于治疗自身免疫及炎性疾病，如多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病、克罗恩病、干燥综合征、囊性纤维化、myostitis和狼疮。在特定实施例中，含有编码抗炎基因或细胞因子(例如IFN-β,IL-10或IL-4)的核酸的被输送物质用于治疗MS。这可以使用本发明方法，通过将编码抗炎基因或细胞因子(例如IFN-β,IL-10或IL-4)的被输送物质(例如非病毒或病毒载体如腺病毒或全细胞)直接输送到区室化组织或器官的实质(例如肝，如一小部分肝)而实现。通过将编码抗炎基因或细胞因子的核酸序列掺入载体并且用本方法转导组织器官部分，可以实现抗炎物质的稳定长期表达。
g.急性间歇性卟啉病(AIP)
可以用本发明区室化方法治疗的疾病或病症的一个例子是急性间歇性卟啉病(AIP)。AIP是遗传性代谢疾病，特征在于血红素合成途径第三个酶胆色素原脱氨酶(PBGD)的缺陷。在遗传了该遗传性状的人中该酶活性是正常的～50％。该疾病以常染色体显性遗传方式遗传，并且是最常见的急性卟啉症。尽管其在所有人种中发生，但是最常见在北欧，主要在瑞典、英国和爱尔兰。在美国及其它国家，估计患病率是5/100,000，在北瑞典高达60-100/100,000。目前已描述了225种以上的PBGD基因中的突变。主要临床特征是由于神经系统功能障碍导致的急性间歇性侵袭，包括腹部疼痛和脑脊髓交感神经和循环系统障碍。腹部疼痛已在85-95％病例中报道，并且是最常见特征，随后或者伴有神经学变化。如果AIP未被识别及有害药物未撤除，可以进展为呼吸系统和延髓麻痹及死亡，所述有害药物例如是肝细胞色素P450酶代谢的药物，其可以参与侵袭。作为心律失常的结果也可以发生突然死亡。有时候也发生原发性肝癌和肾脏功能受损。
高比例的遗传PBGD突变的对象从不发生卟啉病症状，即临床外显率非常低。AIP携带者中的临床症状与卟啉前体δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和胆色素原(PBG)产生和排泄增加相关，其是增加的血红素合成需求的结果，而所述需求由于引发急性侵袭的药物或其它参与因子所致。在这些病症中，PBDG缺乏限制了血红素合成，因此血红素介导的ALA合成酶(ALAS1)阻遏被削弱。有证据表明肝是过量卟啉前体的主要来源。这些化合物在易发生重复卟啉症危机的对象中的侵袭之间保持升高，并且在危机期间进一步增加。如果疾病在长时间内不活动则它们可降至正常。
急性侵袭通常在青春期后发生，可以在潜伏个体中由内分泌因子和类固醇激素及各种环境因子诱导，所述环境因子包括药物、营养因子、碳水化合物和卡路里的限制摄入、吸烟、类固醇激素和口服避孕药、铅中毒、并发感染、手术和心理压力。药物是导致急性侵袭的最重要因素，安全药物列表在www.drugs-porphyria.com上可获得。吸烟、酒精及由CYP450代谢的药物大大增加肝血红素需求及导致诱导ALAS1，其增加卟啉前体产生并且导致急性侵袭。另外，ALAS1被在禁食期间在肝中被诱导的过氧化物酶体增殖子-激活的受体γ共激活物1α(PGC1α)阳性调节。在诱导因子中类固醇激素起重要作用。这个观点由如下事实支持：该病很少在青春期之前表现及口服避孕药在一些具有PBGD缺陷的女性中可以恶化侵袭。另外女性(80％)比男性(20％)更经常受累。
急性侵袭通过输注葡萄糖和氯化高铁血红素(Normosang,OrphanEurope)而治疗。葡萄糖看起来拮抗由PGC-1α介导的ALAS1诱导。氯化高铁血红素恢复调节性血红素集合病抑制肝ALAS1诱导。一些女性发生月经前侵袭，其可以由促性腺激素释放激素(GnRH)类似物预防。一些患者显示复发急性侵袭及显著的致残性神经障碍。高度神经损害和亚急性及慢性症状通常对血红素治疗不响应。这是威胁生命的病症，仅可通过异基因(allogeneic)肝移植治愈，目前在三例患者中防止了神经毒性ALA和PBG的积累。无论如何，肝移植相容供体可得性受限，发病率和死亡率显著。
基因替代治疗是肝移植的替代，特别是在除PBGD缺陷之外肝功能完全正常的患者中。腺病毒载体介导的PBGD基因转移至卟啉症小鼠揭示了作为PBGD的瞬时肝表达结果的短期治疗功效(Johansson,2004,Mol.Ther.10(2):337-43)。编码基因治疗的基因的腺病毒和腺伴随病毒介导的基因治疗也在由Amsterdam Molecular Therapeutics及其它公司开发(见例如美国申请公开号US2011/0262399和欧洲专利号EP1049487)。
使用本发明方法，含有编码PBDG的核酸的被输送物质可以用于治疗急性间歇性卟啉病(AIP)。这可以通过使用本发明方法将编码PBDG的被输送物质(例如非病毒载体、病毒载体如腺病毒或者全细胞)直接输送至区室化组织或器官(例如肝，例如肝一小部分)的实质而实现。通过将编码PBDG的核酸序列掺入载体及用本方法转导组织器官部分，可以实现PBDG的稳定长期表达，以治疗AIP。
h.Sanfilippo综合征
可以用本发明区室化方法及材料治疗的病症的一个例子是Sanfilippo综合征。Sanfilippo综合征或者粘多糖贮积症III型(MPSIII)是一种溶酶体贮积疾病，其中常染色体隐性缺陷导致硫酸类肝素的部分降解的寡糖的积累。其在70000出生者中有1例发生。Sanfilippo综合征与儿童早期学习能力下降、生长延迟或不良、发育延迟及智力状态恶化相关。Sanfilippo综合征有4种亚型：A型Sanfilippo(MPSIIIA)发生在类肝素N-硫酸酯酶缺失或改变时；B型Sanfilippo(MPSIIIB)发生在α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)缺失、改变或产生不足时；Sanfilippo C(MPSIIIC)发生在acetyl-CoAlpha-glucosaminideacetyltransferase缺失、改变或产生不足时；D型Sanfilippo(MPSIIID)发生在N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶缺失、改变或产生不足时。例如，B型Sanfilippo由NaGlu基因中的突变导致，其导致α-N-乙酰氨基葡糖苷酶的缺陷。
Sanfilippo综合征如MPS IIIA、IIIB、IIIC或IIID的治疗可以通过输送缺失或缺陷基因而实现。输送可以直接到中枢神经系统(CNS)。输送也可以通过实现跨越血脑屏障的有效CNS输送的输送方法实现，例如使用能从血管跨越血脑屏障的腺伴随病毒血清型。这种血清型的例子是AAV9(见例如Fu et al.(2011)Mol.Ther.,19:1025-33)。
使用本发明方法，含有编码类肝素N-硫酸酯酶的核酸的被输送物质可以用于治疗MPSIIIA，含有编码α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)的核酸的被输送物质可以用于治疗MPSIIIB，含有编码Acetyl-CoAlpha-glucosaminideacetyltransferase的核酸的被输送物质可以用于治疗MPSIIIC，或者含有编码N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶的核酸的被输送物质可以用于治疗MPSIIID。这可以通过使用本发明方法将编码用于特定MPSIIIS疾病的缺失或缺陷的酶的被输送物质(例如非病毒载体、病毒载体如腺病毒或者全细胞)直接输送至区室化组织或器官(例如肝，例如肝一小部分；或者直接到脑)的实质而实现。在特定实施例中，被输送物质是含有编码缺失或缺陷酶的核酸的重组腺伴随病毒9(例如rAAV9-hNAGLU)，以实现跨越血脑屏障的输送。通过将编码缺失或缺陷酶的核酸序列掺入载体及用本方法转导组织器官(例如肝)部分，可以在CNS中实现缺失或缺陷酶的稳定长期表达，以治疗MPSIII(Sanfillipo综合征)。
i.脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)
可以用本发明区室化方法及材料治疗的病症的一个例子是脂蛋白脂酶缺乏(LPLD；也已知为1型高脂血症，原发性高脂血症或者家族性高乳糜微粒血症)。LPLD由编码脂蛋白脂酶(LPL)的基因中的改变导致。在缺乏LPL或者缺陷性LPL时，血液中的脂肪水平由于长链脂肪酸代谢中的缺陷而增加。与LPLD相关的症状包括例如腹部疼痛和胰腺炎。LPLD也与高血甘油三酯水平相关，其可以预期对象早期发作糖尿病和动脉粥样硬化的倾向。
基因治疗可以用于治疗LPLD。例如，含有编码LPL基因的核酸的腺伴随病毒(AAV)已在欧洲用于输送至骨骼肌以治疗LPLD(商品名)。
使用本发明所述方法，含有编码LPL的核酸的被输送物质可以用于治疗脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)。这可以通过使用本发明方法将编码LPL的被输送物质(例如非病毒载体、病毒载体如腺病毒或者全细胞)直接输送至区室化组织或器官(例如肝，例如肝一小部分；或者骨骼肌)的实质而实现。通过桨编码LPL的核酸序列掺入载体及用本方法转导组织器官部分，可以实现LPL的稳定长期表达，用于治疗LPLD。
2.蛋白质表达及生产
本发明提供了在动物中制备多肽的方法。在动物中治疗性生产蛋白质包括治疗性蛋白质或营养补剂是本领域技术人员熟知的。例如，诸如组织纤溶酶原激活物(t-PA)、胰岛素、生长激素和凝血因子已在动物例如奶牛、绵羊或山羊中生产(见例如Mercier J.C.(1987)Exploiting New Technologies in Animal Breeding,p.122-131,OxfordUniversity Press；Lillico et al.(2005)Drug Discovery Today,10:191-196；Echelardet al.(2006)Biopharm International,19:36；Prather et al.(2003)Theriogenology,59:115-123)。也已经描述了用表达感兴趣产物的病毒载体在昆虫细胞中生产基因产物(见例如美国申请公开号US2011/0119777)。
在动物中生产蛋白质，如本申请描述或者现有技术中已知的蛋白质，包括如下步骤：将含有编码多肽的核酸分子的被输送物质给予生产动物的区室化器官或其部分，在允许多肽表达的条件下维持生产动物，及从生产动物分离表达的多肽(例如从生产动物的血液或其它生物液体中分离)。编码的多肽可以是希望产生的任何蛋白质，特别是任何治疗性蛋白质或者可以用作营养补剂的蛋白质。这种蛋白质的例子包括但不限于凝血因子(例如因子VIII、因子IX、纤维蛋白原凝血因子)、乳铁蛋白、血红蛋白。人蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)、胰岛素、生长激素、细胞因子、单克隆抗体、疫苗(例如抗原)、胆固醇氧化酶及其它。
所述多肽可以从来自生产动物的生物学样品中分离。所述生物学样品可以是血液、尿、乳、血浆、唾液或其它类似样品。在特定实施例中，所述蛋白质产物出现在乳中并且可以使用或者从中分离。生产动物可以是兔、大鼠、小鼠、山羊、马、绵羊、鸡、母鸡、猪或者牛。所述方法提供了相对于现有生产方法的优势，因为被输送物质可以被放大以产生大量多肽，特别是在大型动物如猪和牛中。另外，如上所述，多肽可以被生产动物的细胞翻译后修饰(例如糖基化)。
3.农业和兽医应用
本发明提供的方法可以用于动物中的基因治疗应用，特别是用于兽医、农业或工业应用。在这类实施例中，本发明方法中的被输送物质含有实现动物中生产率和/或控制疾病增加的核酸分子。动物中的应用包括但不限于改变或产生具有希望性状的动物、增加动物品质(例如肌肉、乳、毛)、增加疾病抗性或者产生用于工业应用的产物(例如丝)的应用。例如，基因治疗应用包括增加动物中毛发产生、增加动物中毛的产生、增加动物生长或者调节营养素合成或利用的那些应用。在这类实施例中，核酸分子编码增加动物中肌肉产生、增加动物中毛发产生、增加动物中毛的产生、增加动物生长或者参与营养素合成或利用的蛋白质。
这类应用是本领域技术人员熟知的。例如，含有核酸的被输送物质可以被给予动物以增加动物中的肌肉产生，例如给予编码生长激素(例如IGF-1)、生长激素释放因子或鸡Ski(cSki)的核酸(见例如Lee(1997)Theriogenology,47:225；Palmiter et al.(1982)Nature,300:611-615)。在另一个实施例中，核酸分子可以是或者编码肌肉生长抑制素抑制剂，其可以用于肉生产中。例如，核酸分子可以编码卵泡抑素，其阻断肌肉生长抑制素与其受体的结合，由此导致产生更大的肌肉。
在另一个实施例中，可以改善动物品质或其产物。在这类实施例中，动物整体品质的改善可以有助于农业应用(例如用于乳、蛋或肉的利用)。在一个实施例中，含有核酸的被输送物质可以被给予动物以增加乳产量或者增加乳质量(见例如Mercier J.C.(1987)Exploiting New Technologies in Animal Breeding,p.122-131,Oxford UniversityPress)。另外，动物乳也通过基因治疗方法修饰以增加或改善乳质量，例如用于人类消费。例如，乳铁蛋白已被工程化在奶牛乳中表达以提供更营养平衡的产品，给予婴儿或老年人(见例如van Berkel et al.(2002)Nat.Biotech.,20:484-487)。另外，动物乳可以通过抑制导致乳腺炎的细菌生长而改良(例如Maga et al.(2006)Foodborne Pathog.Dis.,3:384-392)。在其它实施例中，动物可以被工程化以表达脂肪酸去饱和酶基因(见例如Saekiet al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.,101:6361-6366)，以富含omega-3脂肪酸(见例如Laiet al.(2006)Nature Biotechnology,24:435-436)；以产生具有更高水平的β-酪蛋白和κ-酪蛋白的乳(见例如Brophy et al.(2003)Nature Biotechnology,21:157-162)，或者以表达唾液肌醇六磷酸酶产生低磷肥(见例如Golovan et al.(2001)Nature Biotechnology,19:741-745)。在进一步的实施例中，核酸分子包括参与氨基酸生物合成或者乙醛酸循环基因的那些，其可以用于改良营养素利用。例如，可以给予含有例如编码丝氨酸转乙酰酶和o-乙酰丝氨酸硫化氢解酶的cysE和ccsK基因的核酸分子的被输送物质。
在另外实施例中，含有核酸分子的被输送物质可以被给予动物以增加动物对疾病的抗性。例如，可以产生缺乏朊病毒蛋白的动物(Richt et al.(2007)NatureBiotechnology,25:132-138)。在其它实施例中，动物可以被工程化以对细菌感染如金黄色葡萄球菌感染有抗性(Wall et al.(2005)Nature Biotechnology,23:445-451)。
在另外实施例中，核酸分子可以编码增加动物中毛发生长或者增加毛的产生的多天。在这种方面的特定实施例中，动物是绵羊或者羔羊(lamb)或者含有适合生产毛发或毛的毛发的其它动物。例如，毛的生产可以通过在毛囊或皮肤中给予被输送物质而增加，所述被输送物质含有编码毛合成中的限制氨基酸半胱氨酸的核酸分子；编码角蛋白的核酸分子或者编码生长因子(例如EGF或IGF-1)的核酸分子。动物也可以被工程化而用于工业应用，例如通过将产丝的蜘蛛基因工程化到动物如山羊中而产丝(见例如Lazaris et al.(2002)Science,295:472-476)。
H.实施例
下述实施例仅为示例目的，而非限制本发明范围。
实施例1：腺病毒转导至尾状叶的区室化
将腺病毒注射进尾状叶，其通过使用实质钳从血管系统隔离而区室化。命名为Ad-CMV-Luc的腺病毒由David T.Curiel(University of Alabama,参见例如Bass et al.(1995)Cancer Gene Ther.,2:97-104；公开的国际PCT申请号WO1995/026411)提供。Ad-CMV-Luc衍生自人腺病毒5型并且编码由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的萤光素酶基因。具体地，为了对腺病毒转导进行分析，通过缺失E1区使腺病毒成为复制缺陷型。将报道基因萤光素酶(Adluc)克隆进此缺失的E1区并构建为由人巨细胞病毒启动子驱动(命名为rAd-CMV-Luciferase或者Ad.CMV.Luc)。
具体地，为确定可以被区室化到肝尾状叶中的腺病毒转导程度，通过腹膜内(i.p.)注射戊巴比妥钠(50mg/kg)(Abbott Laboratories,Chicago,IL)麻醉10只大鼠。每只大鼠然后置于仰卧位置，腹部区域剃毛，从胸骨剑突到脐区腹部正中切口后暴露腹腔。定位并解剖尾状叶上部，割断小叶间和肝胃韧带。鉴别尾状叶根(pedicle of the caudatelobe)并用10mm微血管钳(Fine Science Tools-USA Inc.,Foster City,CA)钳紧。
当夹住尾状叶后，将在1ml注射器中(Becton&Dickinson Corp.,Franklin,NJ)的50μl磷酸缓冲盐水(PBS)中的1x109pfu重组Ad.CMV.Luc注射进5只大鼠的尾状叶实质中。另外5只大鼠用在100μl PBS总体积中的1x109pfu Ad.CMV.Luc注射进腔静脉作为对照。钳保持30分钟。大鼠然后用5-0Vicryl(Ethicon Inc.,Somerville,NJ)双层缝合(肌肉和皮肤)，使它们恢复。
手术后72小时，大鼠用i.p.过量戊巴比妥钠安乐死。收集肝，分离肝的尾状叶、右侧叶、左侧叶和中叶，并加工以用于组织病理学评价、萤光素酶活性测定及用于核苷酸(DNA和RNA)提取。
对于DNA提取：将10mg组织置于400μL 100mM NaCl,10mM Tris×Cl,pH 8,0.5％SDS,0.1mg/ml蛋白酶K的溶液中，保温直至大部分细胞蛋白被降解。通过相继酚/氯仿/异戊醇提取使消化物去蛋白化，通过乙醇沉淀回收DNA，干燥，重悬于TE pH8缓冲液中。
福尔马林固定的组织用石蜡包埋并用于常规组织病理学。对于组织病理学，福尔马林固定的石蜡包埋的组织块以5μm切片，用苏木精和曙红染色，由合格病理学家显微镜检查。
对于萤光素酶活性测定，解剖的叶用Lysing Matrix D(MP Biomedicals)在500μL裂解缓冲液(Luciferase assay system,Promega,Madison,WI)中使用Fast Prep 24,Sample Preparation System(MP Biomedicals)匀浆。将20微升上清加入到100μl萤光素酶测定试剂中，然后用发光计(Biotek,USA)测量光子10秒而测量萤光素酶活性。用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)经Bradford方法确定肝提取物的蛋白质浓度。萤光素酶活性根据匀浆中的总蛋白标准化(每克总蛋白相对光单位(rlu/g))，用于在不同肝叶之间进行比较和统计学分析。
结果
进行了肝炎的组织学分析。为比较区室化和静脉内输液对肝炎的作用效果，分析在72小时获得的肝切片的嗜中性粒细胞浸润迹象。在来自静脉内输注对照的样品上进行的肝组织学显示强烈局部肝细胞坏死，特别是在门静脉周区域内。这些局部坏死区域被嗜中性粒细胞浸润。在得自区室化动物的组织中完全没有肝细胞坏死、非实质细胞或浸润的炎症细胞。
对于萤光素酶活性，结果显示在回收自接受腺病毒静脉内(IV)输液的对照动物的所有叶中测量到相似萤光素酶活性水平。相反，接受尾状叶腺病毒注射的动物，在钳紧后，显示比任何其它肝叶高3个数量级的萤光素酶活性，提示腺病毒转导限于注射组织中，周围组织未暴露于载体。结果示于图2。
实施例2：确定钳紧时间以使系统性释放最小化
A.在钳紧松开后的系统性病毒表达
为确定实现腺病毒在注射组织中区室化的最佳钳紧时间长度，如实施例1所述进行手术程序，随后用1mL胰岛素注射器将悬浮于50μl总体积中的1x1010pfu Ad.CMV.Luc注射进尾状叶的实质中。在腺病毒注射后7、15、30和60分钟(每个时间点n＝6)，松开微血管钳。钳松开后1分钟，从腔静脉收集200μl外周血并处理用于PCR。萤光素酶基因用下述引物进行扩增：有义5'-ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3'(SEQ ID NO:1和反义5'-AAAACCGGGAGGTAGATGAGATGT-3'(SEQ ID NO:2)，总体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。
结果示于图3A组。腺病毒DNA(Luciferase)在7分钟钳紧时间后可在外周血中检测到。增加钳紧时间至15分钟使血液中检测到的腺病毒DNA至7分钟钳紧时间后观测到的大约一半。在30和60分钟钳紧时间后在外周血中检测不到腺病毒DNA，表明至少30分钟的钳紧时间促进腺病毒被限制于注射的组织。
B.在钳紧松开期间和之后腺病毒DNA的系统性存在
为证实评估30分钟钳紧时间之后外周血中腺病毒DNA的存在的上述结果，进行了时程研究以测量在30分钟钳紧时间期间和之后(n＝3)外周血中的腺病毒存在。具体地，当尾状叶被钳紧后，进行实施例1所述的手术程序，随后用1mL胰岛素注射器将悬浮于50μl总体积中的1x1010pfu Ad.CMV.Luc注射进尾状叶的实质中。然后，在腺病毒注射后1、3和5分钟(在钳紧期间)及钳松开后1、3和5分钟(钳松开后)从腔静脉取100μl血液。钳保持30分钟。通过上述PCR经扩增萤光素酶基因分析血液样品中腺病毒DNA的存在。使用10微升Ad.CMV.Luc腺病毒作为阳性对照(C+)。
结果示于图3B组。在任一所测试时间点均未在血液中检测到腺病毒DNA，但是在阳性对照样品中检测到。这些结果表明当钳紧时，钳紧程序防止了注射的腺病毒进入血液中。结果还证实30分钟的钳紧时间足以使病毒转导进注射处的组织细胞，这由除去钳后直至5分钟在血液中未检测到病毒证实。
实施例3：转基因表达的剂量-应答动力学
为确定蛋白质表达和腺病毒给予之间的关系，产生了剂量应答曲线。在实施例1所述手术和钳紧程序之后(n＝6/剂量组)，如先前所述每组接受在50μL PBS中的1x103、1x106、1x109或者1x1012pfu Ad.CMV.Luc的注射。对照组大鼠进行手术程序，用在100μL PBS总体积中的相应腺病毒剂量直接注射进腔静脉(n＝6/剂量组)。注射后，大鼠如实施例1所述缝合，并使它们恢复。手术后72小时，如实施例1所述使大鼠安乐死，如实施例1所述收集肝尾状叶并加工用于萤光素酶活性测定。因为萤光素酶活性与样品中存在的合成萤光素酶蛋白的量成比例，因此这个度量用作合成的转基因蛋白质的测量。
结果示于图4。萤光素酶活性/表达随着增加的载体剂量线性增加，范围为来自接受103pfu腺病毒注射的组织的大约2.5x102rlu/g蛋白质至来自接受1012pfu注射的组织的大于5x109rlu/g蛋白质。这些结果表明载体剂量和蛋白质输出之间有相关性。
实施例4：转基因表达持续时间
通过在腺病毒给予后进行性时间点测量转基因表达(萤光素酶活性)而确定转基因表达的可持续性。为此，大鼠(n＝6/时间点)进行实施例1所述的手术程序，在尾状叶被钳紧后，根据实施例1所述方案，将在50μl PBS中的1x109pfu Ad.CMV.Luc注射进每只动物的尾状叶中。对照组大鼠(n＝5)进行与实验组相同的手术程序，但是接受在100μl PBS中的1x109pfu Ad.CMV.Luc静脉内(IV)注射进腔静脉。给予腺病毒之后，如实施例1所述缝合大鼠并使之恢复。在如上述实施例1所述腺病毒注射后30、60、90、120、150、180和365天在每个时间点安乐死5只大鼠。然后如实施例1所述收集肝尾状叶并加工以测定萤光素酶活性。.
结果示于图5。在第30天，在尾状叶提取物中检测到平均大约103rlu/g蛋白质。在腺病毒给予后30天和90天之间萤光素酶活性增加100倍以上(～103rlu/g蛋白质至～105rlu/g蛋白质)。在腺病毒转导后120天，蛋白质表达降至在转导后30天观测到的大约一半(～500rlu/g蛋白质)。表达然后反弹至在转导后150天为104rlu/g蛋白质以上。在注射后180天这一蛋白质表达水平被保持，在腺病毒转导后1年(365天)稍有降低。这些结果证实在转导后至少1年持续转基因表达。
实施例5：细胞因子mRNA表达
确定了在输送腺病毒至区室化尾状叶后在肝中诱导的细胞因子表达水平以及在输送腺病毒至腔静脉后在外周血中诱导的细胞因子表达水平。简而言之，当尾状叶被钳紧后，进行了实施例1所述手术程序，随后如实施例1所述将在50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1x109pfu重组Ad.CMV.Luc注射进尾状叶的实质中。作为对照组，如实施例1所述，用在50μlPBS总体积中的1x109pfu Ad.CMV.Luc注射进动物腔静脉。
所述程序72小时后，大鼠用戊巴比妥钠腹膜内剂量安乐死。收集肝，分离肝的尾状叶、右侧叶、左侧叶和中叶。用Trizol试剂盒(Gibco/Life Technologies)根据厂商方案提取总RNA。1μg总RNA用于逆转录，其用RNA PCR试剂盒(Applied Biosystems,BranchburgNJ)根据厂商指导进行。对于肿瘤坏死因子α(TNFα)mRNA检测，使用下述引物：有义5'-ACTCCCAGAAAAGCAAGCAA-3'(SEQ ID NO:3)和反义5'-CGAGCAGGAATGAGAAGAGG-3'(SEQ IDNO:4)，总反应体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、58℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。对于转化生长因子β(TGFβ)，使用下述引物：有义5'-ATACGCCTGAGTGGCTGTCT-3'(SEQ ID NO:5)和反义5'-TGGGACTGATCCCATTGATT-3'(SEQ IDNO:6)，总反应体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、58℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。对于干扰素γ(IFNγ)，使用下述引物：有义5'-GCCCTCTCTGGCTGTTACTTG-3'(SEQ ID NO:7)和反义5'-CTGATGGCCTGGTTGTCTTT-3'(SEQ IDNO:8)，总反应体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、60℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。对于白介素6(IL-6)，使用下述引物：有义5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3'(SEQ ID NO:9)和反义5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3'(SEQ IDNO:10)，总反应体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。Β-肌动蛋白的PCR引物用作内部对照，并且如下：有义5’TGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’(SEQ ID NO:11)和反义5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3’(SEQ ID NO:12)，总反应体积20μl。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。
结果示于图6。结果显示输送腺病毒至腔静脉导致在全部肝叶中检测到TNFα和IFNγ，而在除右侧叶以外的全部肝叶中检测到TGFβ和IL-6。相反，输送腺病毒至区室化尾状叶导致在尾状叶中检测到TGFβ和IFNγ，而在尾状叶中低水平TNFα表达。这些细胞因子在其它肝叶中的表达未检测到。IL-6在任何肝叶中均未检测到。因此，结果显示低肝细胞因子表达。
实施例6：在尸体猪肝上的离体(Ex-Vivo)钳紧研究
在猪肝上进行了初步离体研究。鉴于类似于人的大小、体重和大体解剖学，选择猪作为动物模型。新鲜的完整肝得自当地屠宰场。使用腹腔镜装置，钳紧左中叶，将5ml溴酚蓝注射进实质。在30分钟后，除去钳，解剖放置钳处两侧的组织并分析蓝色染料的存在。虽然在接近注射位置组织一侧钳紧边界观测到蓝色染料，但是蓝色染料没有穿透到位于远离注射部位的钳紧边界边缘的组织。因此，钳紧装置能够通过防止溶液转移到装置远侧而区室化染料。
实施例7：在猪中进行腺病毒转导的区室化
接下来在猪中使用实施例6所述钳紧装置对实施例1所述程序进行了测试。猪在标准条件下圈养，12小时日/夜循环，并无限制提供水和食物。在全身麻醉下放置猪，在无菌清洁腹部区域后，制备5cm剑突下中间切口。然后定位肝的左中叶并暴露，将实施例5所述手术钳置于左中叶远端部分。然后用胰岛素注射器将500μL含有1x109rAd-CMV-Luciferase感染性病毒颗粒的磷酸盐缓冲溶液(PBS)注射进左中叶的分离的实质中。
在30分钟实耗时间后，除去钳，双层缝合腹腔，使动物恢复。手术后72小时，动物安乐死并收集肝。从注射部位、距离注射部位近端、中间和远端的左侧叶、右侧叶和右中叶的部位取组织样品。冷冻组织样品用于萤光素酶活性和病毒DNA嵌套式聚合酶链反应(PCR)分析。
在组织样品中评估腺病毒转导的区室化。简而言之，匀浆组织样品，如实施例1所述进行萤光素酶活性测定。结果示于图7。在来自右侧、右中和左侧叶的所有样品中均观测到背景萤光素酶活性。相反，从注射部位测量的萤光素酶活性比任何其它样品高大约20倍。这些结果证实萤光素酶活性限于注射的钳紧组织，支持了腺病毒的转导在猪中被区室化的结论。
为证实腺病毒的区室化转导，组织样品进一步通过嵌套式PCR进行了分析。PCR的初始循环是通过用特异性引物扩增萤光素酶基因50个循环而进行。10微升Ad.CMV.Luc腺病毒用作阳性对照，质粒pcDNA3(Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,CA)用作阴性对照。初始产物用琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示从腺病毒注射组织扩增的大小类似于阳性对照观测到的条带，但是在任何其它组织样品中或者在阴性对照样品中未观测到。第二个PCR循环使用初始PCR产物及嵌套式引物进行，有义5’-CAACTGCATAAGGCTATGAAGAGA-3’(SEQID NO:13)和反义5’-ATTTGTATTCAGCCCATATCGTTT-3’(SEQ ID NO:14)引物，总反应体积20μL。PCR条件是：94℃ 5分钟，随后25个循环的94℃30秒、53℃30秒和72℃30秒，72℃延伸7分钟。在琼脂糖凝胶电泳分析后，在注射组织和阳性对照样品中存在相应于萤光素酶基因的清晰条带，在其它组织和阴性对照样品中完全不存在所述条带。病毒DNA序列在注射的钳紧组织中存在而在任何相邻组织中不存在，这表明病毒转导的成功区室化。
实施例8：在输送至区室化肝叶后在血液中的可溶性报道蛋白表达
为确定可溶性蛋白质是否可以在血液中表达和检测到，将表达可溶性蛋白质的腺病毒注射进用实质钳区室化的大鼠尾状叶中。命名为Ad-ALB-AFP的腺病毒来自人腺病毒5型并且编码由大鼠白蛋白启动子序列(Herbomel et al.(1989)Molecular and CellularBiology,9:4750-4758；Tronche et al.(1989)Molecular and Cellular Biology,9:4759-4766)驱动的大鼠甲胎蛋白(AFP)基因。通过缺失E1区使腺病毒复制缺陷。将报道基因甲胎蛋白(AFP)克隆进这个缺失的E1区，并构建为由大鼠白蛋白(ALB)启动子驱动以提供对肝的特异性。编码在ALB启动子控制下的大鼠AFP的pUC57质粒由Genscript(Piscataway,NJ)合成。将来自pUC57质粒的AFP表达盒亚克隆进Dual-Basic腺病毒穿梭载体并与Ad5(DE1/DE3)载体(Vector Biolabs,Philadelphia,PA)重组。所述腺病毒在HEK293细胞中包装并用氯化铯超离心纯化。ALB-AFP病毒在50μL总体积中以3.25x109给予。注射后第5天，处死动物并收集肝。
进行类似于实施例1所述程序的区室化。简而言之，8只大鼠用腹膜内(i.p.)注射60mg/kg氯胺酮-HCl和10mg/kg赛拉嗪-HCl(Baxter Healthcare Corporation,Deerfield,IL)而麻醉。然后将每只大鼠置于仰卧位置，腹部区域剃毛，从胸骨剑突到脐区腹部正中3cm切口后暴露腹腔。定位并解剖尾状叶上部，割断小叶间和肝胃韧带。鉴别尾状叶根(pedicleof the caudate lobe)并用10mm微血管钳(Fine Science Tools-USA Inc.,Foster City,CA)钳紧。
当夹住尾状叶后，将在1ml注射器(Becton&Dickinson Corp.,Franklin, NJ)中的50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3.75x109pfu重组Ad.ALB-AFP注射进6只大鼠的尾状叶实质中。另外2只大鼠用作非注射对照。钳保持30分钟。大鼠然后用5-0Vicryl(Ethicon Inc.,Somerville,NJ)双层缝合(肌肉和皮肤)，使它们恢复。
手术后7天，从腔静脉收集1mL外周血。用血清分离试管(Becton DickinsonCorp.,Franklin,NJ)收集血液，使样品凝集30分钟，之后在1000g离心15分钟。取血清，等分并储存样品在-20℃。用Rat Alpha-fetoprotein,AFP ELISA试剂盒(Cusabio BiotechCo.,Ltd.,Wuhan China)根据厂商方案检测血清中的AFP。
结果示于图8。结果显示在未注射病毒的对照大鼠血液中检测到AFP。结果显示用Ad.ALB-AFP注射的大鼠比对照动物具有更高的血清中AFP。因此，结果显示将表达可溶性蛋白质的腺病毒注射进区室化肝叶中导致在血液中可检测到的可溶性蛋白质的表达。
因为修改对于本领域技术人员是显而易见的，因此本发明仅由权利要求书范围限制。
序列表
<110> 全球生物疗法美国有限公司
<120> 核酸输送的区室化方法及其组合物和应用
<130> 33809.00551.WO02/551PC
<140> Not yet assigned
<141> Herewith
<150> 61/633,287
<151> 2012-02-07
<160> 14
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<223> IFN gamma primer - sense
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<223> IFN gamma primer - antisense
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<223> IL-6 primer - sense
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Claims (26)

1.用于治疗可由治疗性核酸治疗的疾病或病症的组合物，其中：
所述组合物包含输送物质，所述输送物质包含所述治疗性核酸；
所述输送物质是病毒载体，其编码所述治疗性核酸；所述组合物用于治疗人，含有用于注射直接施用至区室化组织、器官或者组织或器官的部分的实质的单剂的所述病毒载体，所述组织、器官或者组织或器官的部分区室化至少20分钟以进行细胞摄取使所述物质进入所述实质的细胞；
单剂是10至1x 1012个病毒颗粒或少于1x 1012pfu；
所述器官或组织大小足以实现区室化及施用所述组合物；
所述区室化组织或器官或其部分的实质不包括结缔组织、血管、神经或导管；
所述区室化组织或器官或者组织或器官的部分与体循环隔离，其中供应或通过所述组织或器官或者组织或器官的部分的动脉、静脉、导管和/或脉管被阻断，由此对组织或器官或其部分的血液供应和流动被降低或消除；及
所述可由治疗性核酸治疗的疾病或病症选自遗传缺陷、通过外源基因产物改善的疾病或病症及在其病因学中涉及基因产物的异常或改变的表达的疾病或病症。
2.用于将治疗性核酸分子直接输送到实质细胞中的组合物，包含：
包含所述治疗性核酸分子的输送物质，其中所述核酸编码治疗性蛋白质；
所述输送物质是病毒载体，其编码所述治疗性核酸；
所述组合物用于治疗人，包含用于注射直接施用至区室化组织、器官或者组织或器官的部分的实质的单剂的所述病毒载体，所述组织、器官或者组织或器官的部分区室化至少20分钟以进行细胞摄取使所述物质进入所述实质的细胞；
所述器官或组织大小足以实现区室化及施用所述组合物；及
帮助所注射的病毒进入实质细胞的物质，其中所述组合物含有单剂的所述输送物质，用于不稀释施用至区室化组织、器官或者组织或器官的部分的实质，其中所述部分大小足以实现区室化及施用所述组合物。
3.权利要求1或2的组合物，其中：
所述疾病或病症是糖尿病；
所述治疗性核酸编码胰岛素。
4.权利要求1或2的组合物，其中：
所述疾病或病症是凝血障碍；
所述治疗性核酸编码因子VIII(FVIII)。
5.权利要求1或2的组合物，其中所述治疗性核酸实现疾病或病症的治疗，在对象中过量产生异源多肽，增加动物中的肌肉产生，增加动物的生长，或者实现动物中的营养素合成或利用。
6.权利要求1或2的组合物，其中所述治疗性核酸分子编码多肽或通过转录产生治疗性RNA分子。
7.权利要求6的组合物，其中编码的多肽选自酶、激素、凝血因子、细胞因子、生长因子或其活性部分、抗体或其抗原部分、血管发生调节剂、免疫调节剂、疼痛调节剂、受体或其活性部分、转运蛋白、调节蛋白、抗原和变应原。
8.权利要求7的组合物，其中编码的多肽选自腺苷脱氨酶、囊性纤维化跨膜传导调节物(CTFR)、加硫酶、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、苯丙氨酸氨裂合酶、酸性α葡糖苷酶、伊米苷酶、阿葡糖苷酶α、促甲状腺素、生长激素、胰岛素、甲状腺激素、促红细胞生成素(EPO)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-12、IL-18、fms-相关酪氨酸激酶3(flt3)、neuropilin-2(NP2)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α或β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、转化生长因子受体(TGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、纤溶酶原激活物、尿激酶、因子VIII、因子IX、vonWillebrand因子、生长激素、金属蛋白酶凝血酶敏感蛋白基序1(METH-1)、METH-2、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)片段、增殖蛋白相关蛋白、促乳素片段、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管抑制因子、血管抑素、内皮抑素、激肽原、纤维蛋白原-E片段、凝血酶敏感蛋白、tumstatin、canstatin、网状内皮系统刺激素、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、可溶性血管内皮生长因子受体(sFlk)、可溶性Neuropilin 1(sNRP1)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、血小板因子4(PF-4)、Gro-β、可溶性Ephrin B型受体4(sEphB4)、sephrinB2、TGF、IGF-1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护性蛋白/组织蛋白酶A、酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷脂酶、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、Niemann-Pick病C1型(NPC-1)、β-氨基己糖苷酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、酸性脂酶、肾胰岛素残基溶酶、胰岛素降解酶胰岛素溶酶、thimet寡肽酶、钙结合蛋白D28、小白蛋白、低氧诱导因子1-α(HIF1-α)、sirtuin-2(SIRT-2)、活运动神经元蛋白-1(SMN-1)、SMN-2、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、脂蛋白脂酶(LPL)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、UDP-葡糖醛酸基转移酶、UGT1A1、葡萄糖-6磷酸酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、生物素酶、β-葡糖脑苷脂酶、β-gluronidase、胆色素原脱氨酶和p53。
9.权利要求1或2的组合物，其中所述可由治疗性核酸治疗的疾病或病症选自关节炎、慢性疼痛、HIV相关AIDS、动脉粥样硬化、再狭窄、遗传性酶缺陷、遗传性免疫缺陷、癌症、逆转录病毒感染、血友病、糖尿病、肌营养不良症、心血管疾病、囊性纤维化、神经变性疾病、创伤、疼痛、镰刀细胞贫血、自身免疫疾病、炎性疾病和高血压。
10.权利要求1或2的组合物，其中所述治疗性核酸分子编码选自如下的多肽：用于治疗A型血友病的因子VIII；用于治疗B型血友病的因子IX；用于治疗I型糖尿病的胰岛素基因；用于治疗α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)；用于治疗血色素沉着症的血色素沉着症蛋白(HFE)；用于治疗Wilson’s病的铜转运ATP酶2；用于治疗Crigler-Najjar综合征I型的UDP葡糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)；用于治疗II型鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；用于治疗家族性高胆固醇血症的低密度脂蛋白受体(LDLR)；用于治疗纤维蛋白原缺乏血症的纤维蛋白原α(FGA)、β(FGB)或γ(FGB)；用于治疗糖原贮积病(GSD)Ia型的葡萄糖-6-磷酸-α；用于治疗GSD Ib型的G6PT；用于治疗GSD II型(Pompe)的酸性-α-葡糖苷酶；用于治疗粘多糖贮积症(MPSI)的α-L-艾杜糖醛酸酶；用于治疗MPS IIIA的sulphamidase；用于治疗MPS IIIB的α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NaGlu)；用于治疗MPS VII的β-葡糖醛酸糖苷酶；用于治疗法布里病的α-半乳糖苷酶A；用于治疗Gaucher’s病的葡糖脑苷脂酶；用于治疗Niemann-Pick综合征的酸性鞘磷脂酶；用于治疗苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶；用于治疗肝纤维化的TIMP拮抗剂或抗HSC分子；用于治疗肝缺血再灌注损伤的抗ROS分子；用于治疗阿尔茨海默病的淀粉样蛋白β降解酶肾胰岛素残基溶酶、胰岛素降解酶胰岛素溶酶或thimet寡肽酶；用于治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)的胰岛素生长因子-1(IGF-1)、钙结合蛋白D28、小白蛋白、低氧诱导因子1-α(HIF1-α)、sirtuin-2(SIRT-2)、活运动神经元蛋白-1(SMN-1)、SMN-2、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)或睫状神经营养因子(CNF)；用于治疗半乳糖血症的半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；用于治疗槭糖尿病的支链α酮酸脱氢酶；用于治疗1型酪氨酸血症的延胡索酰乙酰乙酸水解酶；用于治疗甲基丙二酸尿症的甲基丙二酰辅酶A变位酶；用于治疗瓜氨酸血症的精氨琥珀酸合成酶；用于治疗Goutand Lesch Nyan综合征的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；用于治疗Sly综合征的β-gluronidase；用于治疗Zellweger综合征的过氧合物酶体膜蛋白70kDa；用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的恩夫韦地；用于治疗联合免疫缺陷病(SCID)的腺苷脱氨酶(ADA)；用于治疗囊性纤维化的CFTR；用于治疗急性间歇性卟啉病的胆色素原脱氨酶(PBDG)；用于治疗多发性硬化症的干扰素-β；用于治疗脂蛋白脂酶缺乏(LPLD)的脂蛋白脂酶；用于治疗癌症的p53；及用于治疗帕金森病的谷氨酸脱羧酶(GAD)。
11.权利要求1或2的组合物，其中所述区室化组织或器官或者组织或器官的部分被实质钳紧以切断通过所述组织的血液供应和流动，所述组合物施用至所述区室化组织或器官或者组织或器官的部分。
12.权利要求1或2的组合物，其中所述组织或器官或者组织或器官的部分选自肝、脑脊髓、胰腺、心脏、皮肤、肾、肺、血管、骨骼、肌肉、子宫、子宫颈、前列腺、尿道和肠。
13.权利要求1或2的组合物，其中所述组合物不稀释直接施用至区室化的肝或所述肝的部分的实质。
14.权利要求13的组合物，其中区室化的肝的部分选自肝叶、肝区段或者肝叶和肝区段的部分。
15.权利要求14的组合物，其中肝叶或肝叶部分选自右叶、左叶、方叶和尾状叶或其部分。
16.权利要求1或2的组合物，其中所述病毒选自腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒。
17.权利要求1或2的组合物，其中：
所述器官是肝；
所述病毒是包含所述治疗性核酸分子的腺病毒或腺伴随病毒载体。
18.权利要求17的组合物，其中所述病毒是腺病毒，且所述腺病毒的血清型是腺病毒2型或腺病毒5型。
19.权利要求1或2的组合物，其中所述输送物质与脂质、聚合物试剂或其它物质配制以促进进入实质细胞。
20.权利要求1或2的组合物，其中所述输送物质与促进所述输送物质的细胞摄入的物质配制。
21.权利要求20的组合物，其中所述输送物质是病毒，而所述物质是病毒特异性细胞表面受体的转录增强子。
22.权利要求21的组合物，其中所述物质是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
23.权利要求1或2的组合物，其中：
所述输送物质是在基因组中包含异源核酸分子的腺病毒或腺伴随病毒；
所述组合物是用于用作单剂；以及
组合物中腺病毒的量是或大约是在1x 103至1x 1012个颗粒、1x 106至1x 1010个颗粒或者1x 107至1x 109个颗粒之间；或者是或大约是10至1x 1012pfu、10至1x 106pfu、1x 103至1x 1012pfu、1x 106至1x 1010pfu或者1x 107至1x 109pfu；或者小于1x 1012个颗粒、1x 1011个颗粒、1x 1010个颗粒、1x 109个颗粒、1x 108个颗粒、1x 107个颗粒、1x 106个颗粒、1x 105个颗粒、1x 104个颗粒、1x 103个颗粒或更小；或者1x 1011pf、1x 1010pfu、1x 109pfu、1x108pfu、1x 107pfu、1x 106pfu、1x 105pfu、1x 104pfu、1x 103pfu或更小。
24.权利要求1或2的组合物，其中输送物质是病毒，且每剂的病毒量少于1x 1012个颗粒。
25.权利要求24的组合物，其中每剂的病毒量少于1x 1011个颗粒。
26.权利要求24的组合物，其中每剂的病毒量少于1x 1010个颗粒。
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