CN101180397A - 用于癌症治疗基因的肿瘤选择性和高效率表达的新型hTMC启动子和载体 - Google Patents

用于癌症治疗基因的肿瘤选择性和高效率表达的新型hTMC启动子和载体 Download PDF

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Abstract

公开了包括组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列的启动子，其中第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列。还公开了包括这些启动子序列的核酸和组合物。还公开了改善组织选择性启动子的功能的方法，其涉及将组织选择性启动子序列与包括病毒最小启动子序列的第二种启动子序列可操作地偶联。还公开了将基因递送至细胞内的方法，治疗具有过度增生性疾病的受试者的方法，以及涉及使用本文所述新型启动子序列使细胞成像的方法。

Description

用于癌症治疗基因的肿瘤选择性和高效率表达的新型hTMC启动子和载体
发明背景
本申请涉及2005年3月9日提交的美国临时专利申请60/659,935，所述临时专利申请在此整体引入作为参考。基于国立卫生研究院的授予号CA71618和美国国防部的授予号DAMD 17-02-1-0706，政府在本申请中拥有权利。
1.发明领域
本发明一般涉及分子生物学、癌症生物学和基因治疗领域。更具体而言，本发明涉及包括新型启动子的组合物和使用其的方法，所述新型启动子包括组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列，其中第二种启动子序列包括最小启动子序列(minimal promoter sequence)，优选病毒最小启动子序列(minimal viral promoters equence)。
2.相关领域的描述
成功的基因治疗的一个主要障碍是缺乏可以靶向目的组织的有效递送系统。例如，能够将用于癌症的基因治疗靶向癌症患者中的肿瘤将是有益的。用于肿瘤靶向的转基因表达的一种方法是经由使用对肿瘤是选择性的启动子控制基因表达。
一种此类启动子是人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子。hTERT是端粒酶的催化亚单位。端粒酶是负责染色体末端完全复制的核糖核蛋白复合物(Blackburn，1991)。许多研究已证实大多数恶性肿瘤表达端粒酶活性(Kim等人，1996)，而大多数正常细胞则不是(Shay和Wright，1996)。已鉴别出与人中的端粒酶活性相关的3种主要组分：(a)RNA组分[hTER(Feng等人，1995)]；(b)端粒酶相关蛋白[hTEP1(Harrington等人，1997)]；和(c)端粒酶催化亚单位或人端粒酶逆转录酶[hTERT(Meyerson等人，1997；Nakamura等人，1997)]。然而，只有hTER和hTERT是体外重建端粒酶活性所必需的(Nakayama等人，1998)并且因此代表人中端粒酶的最小催化核心(Beattie等人，1998)。
hTERT的启动子区先前已克隆和表征(Takakura等人，1999)。细胞毒性或促凋亡基因例如白喉毒素A链、FADD、胱天蛋白酶和Bax经由hTERT启动子的端粒酶特异性表达已在各种基因转移系统例如质粒和腺病毒中成功完成和报道(参见，例如Abdul-Ghani等人，2000；和Komata等人，2001)。
然而，如同大多数其他固有的哺乳动物启动子，hTERT启动子的转录促进强度通常比常用的病毒启动子例如CMV和SV40早期启动子弱得多。因此，其用于基因治疗的用途受到低转基因表达问题的阻碍。
为了克服未修饰的hTERT启动子在哺乳动物中体外和体内的弱转录促进能力，某些研究者已开发了二元腺病毒载体系统，其中hTERT启动子和转基因在第一种载体中置于Ga14基因或四环素应答元件(TRE)的控制下(Gu等人，2000；Gu等人，2002)。第二种载体表达增强子例如VP16蛋白质或Tet-On/Tet-Off反式激活蛋白以增强来自hTERT的转基因表达。然而，由于与使用2种分开的载体相关的缺陷，所以该系统对于临床应用太复杂且不实际。特别地，双重载体系统是随机且无法控制的，因为对于2种载体同时进入同一细胞是困难的。此外，由于该系统中涉及多重载体和多重治疗无关组分和基因产物的使用，所以很可能导致毒性增加。
因此，需要更有效的组织选择性启动子或促进启动子功能的改进方法以允许组织选择性转基因表达增强。这个领域中的启动子技术将促进用于在基因治疗中使用的载体以及需要高转基因表达的其他技术例如基于报道分子的成像模式的临床应用和开发。
发明概述
本发明人已开发了某些新型嵌合启动子，其是组织选择性的并且促进转基因在体外和体内高效率表达。特别地，本发明人已开发了由组织选择性启动子序列融合至病毒最小启动子序列构成的某些新型嵌合启动子，以及使用这些新型启动子的方法。例如，已开发了包括融合至miniCMV(hTMC)启动子序列的hTERT序列的新型嵌合启动子，其通过将基本hTERT启动子序列与miniCMV启动子序列最佳融合进行改造。他们还开发了改善组织选择性启动子功能的方法。使用这些启动子，本发明人能够实现体外和体内的高肿瘤特异性和高转基因表达。如本文所述，这些启动子在将基因转移到细胞内的方法中具有广泛的应用，例如为了治疗受试者中的过度增生性疾病或为了使细胞中的报道分子序列成像的目的。
本发明的某些实施方案一般涉及包括组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列的启动子，其中第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列，其中组织选择性启动子序列与第二种启动子序列可操作地偶联导致组织选择性启动子序列的启动子功能改善。“启动子序列”是在其上控制转录起始和速率的核酸序列区域的控制序列。启动子序列在下文说明书中更详细地讨论。
“组织选择性启动子序列”在本文中指在一种组织中能够驱动基因转录，同时在其他组织类型中很大程度上保持“沉默”或以相对低水平表达的启动子序列。组织特异性启动子序列在下文说明书中更详细地讨论。本领域普通技术人员已知的任何组织选择性启动子序列考虑包括在本发明的启动子序列中。示例性组织选择性启动子包括hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、或AFP启动子序列、人α-乳白蛋白启动子序列、羊β-乳球蛋白启动子序列、U6启动子序列、H1启动子序列、7SL启动子序列、人Y启动子序列、人MRP-7-2启动子序列、腺病毒VA1启动子序列、人tRNA启动子序列、5S核糖体RNA启动子序列、或任何这些启动子序列的功能杂交物或组合。
组织选择性启动子序列可以在受试者无论是人还是其他哺乳动物的任何组织类型中是活跃的。例如，组织选择性启动子在下列组织中可以是活跃的：心脏、肺、食管、肌肉、肠、乳房、前列腺、胃、膀胱、肝、脾、胰腺、肾、神经元、肌细胞、白细胞、永生化细胞、赘生细胞、肿瘤细胞、癌细胞、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、唾液腺、胆囊、膀胱、气管、喉、咽、大动脉、动脉、毛细管、静脉、胸腺、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结、骨髓、垂体腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、脑、大脑、小脑、髓质、脑桥、脊髓、坐骨神经、骨骼肌、平滑肌、骨、睾丸、附睾、前列腺、精囊、阴茎、卵巢、子宫、乳腺、阴道、皮肤、眼或视神经。
在某些实施方案中，组织选择性启动子序列是肿瘤选择性启动子序列。肿瘤选择性启动子序列在本文中限定为在肿瘤细胞中能够驱动基因转录，同时在其他组织类型中很大程度上保持“沉默”或以相对低水平表达的启动子序列。例如肿瘤选择性启动子序列可以是hTR启动子序列、hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、或AFP启动子序列、MUC-1、粘液样糖蛋白、C-erbB2/neu致癌基因、环加氧酶、E2F转录因子1、酪氨酸酶相关蛋白、酪氨酸酶、或存活素。
在某些实施方案中，组织选择性启动子序列是低氧特异性启动子序列。低氧特异性启动子序列在本文中限定为在细胞暴露于低氧条件时能够驱动基因转录，同时在其他组织类型中在非低氧条件下很大程度上保持“沉默”或以相对低水平表达的启动子序列。本领域普通技术人员已知的任何低氧特异性启动子序列考虑包括在本发明中。例如，低氧特异性启动子序列可以是低氧应答元件(HRE)或缺氧诱导因子。例如，缺氧诱导因子可以是HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α
在本发明的某些具体实施方案中，组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列。例如，hTERT启动子序列可以是SEQ ID NO：1。
病毒最小启动子序列或核心启动子序列在本文中指包括核苷酸序列的启动子部分，该核苷酸序列维持反式激活蛋白或转录复合物的组分结合和定位至核酸中的特定位置的能力。在不存在上游激活的情况下是无活性的或启动子活性极大减少的启动子元件，特别是TATA元件，称为最小或核心启动子。在合适的转录因子存在下，最小启动子起作用以允许转录。最小或核心启动子因此仅由转录起始所需的所有基本元件例如TATA盒和/或起始子组成。本领域普通技术人员已知的任何病毒最小启动子序列考虑包括在本发明的启动子序列中。病毒最小启动子序列例如可以是腺病毒启动子序列、杆状病毒启动子序列、CMV启动子序列、细小病毒启动子序列、疱疹病毒启动子序列、痘病毒启动子序列、腺伴随病毒启动子序列、塞姆利基森林病毒启动子序列、SV40启动子序列、痘苗病毒启动子序列、或逆转录病毒启动子序列。
在某些具体实施方案中，启动子序列是mini-CMV启动子序列。例如，mini-CMV序列可以是SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，并且第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列。例如，启动子序列可以包括SEQ ID NO：3，其包括与mini-CMV序列可操作地偶联的hTERT启动子序列。
本发明的某些其他实施方案一般涉及包括启动子的核酸，其中启动子包括组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列，其中所述第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列，其中组织选择性启动子序列与第二种启动子序列可操作地偶联导致第一种启动子序列的启动子功能改善。如本文使用的，“核酸”一般指DNA、RNA分子(即，链)或其包括核碱基(nucleobase)的衍生物或类似物。核酸在下文说明书中更详细地讨论。上文所述的任何组织选择性启动子序列和病毒最小启动子序列可以掺入本发明的核酸序列中。如上文讨论的，在某些实施方案中，组织选择性启动子序列可以进一步限定为肿瘤选择性启动子序列或低氧特异性启动子序列。在某些具体实施方案中，组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，例如SEQ ID NO：1中所示序列。此外，在某些实施方案中，核酸包括一种或多种另外的启动子序列，所述启动子序列可以与组织选择性启动子序列可操作地偶联或不偶联。
在本发明的某些实施方案中，核酸包括与启动子可操作地偶联的一个或多个基因。本领域普通技术人员已知的任何基因考虑包括在将基因递送至细胞的方法中。术语“基因”用于简单地指功能蛋白质、多肽或肽编码单位。基因在下文说明书中更详细地讨论。任何基因考虑在本发明的核酸序列中。例如，基因可以是治疗基因或选择标记。治疗基因在本文中指为了治疗或预防疾病的目的可以给受试者施用的基因。例如，治疗基因可以是为了治疗或预防过度增生性疾病给受试者施用的基因。在某些具体实施方案中，过度增生性疾病是癌症。治疗基因可以是例如肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。示例性治疗基因包括Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、LUCA-1(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、SEM A3或MCC。在某些具体实施方案中，治疗基因是FUS1。
选择标记在本文中指当表达时赋予细胞可鉴别特征的核酸序列，所述特征允许容易鉴别、分离和/或选择包含选择标记的细胞与不含选择标记的细胞。本领域普通技术人员已知的任何选择标记考虑包括在本发明的核酸中作为选择标记。例如，选择标记可以是药物选择标记、酶、免疫学标记。在某些实施方案中，本发明的核酸包括在质粒中。
本发明的核酸序列的某些实施方案包括与启动子序列可操作地偶联的一种或多种报道分子序列。如本文使用的，“报道分子”、“报道基因”或“报道分子序列”指任何遗传序列或编码的多肽序列，所述序列是可检测的并且可与细胞中存在的其他遗传序列或编码的多肽区分。示例性报道分子序列包括编码生长抑素受体氨基酸序列、钠碘同向转运体氨基酸序列、真核绿色荧光蛋白氨基酸序列、红色荧光蛋白氨基酸序列、萤光素酶氨基酸序列、β-半乳糖苷酶氨基酸序列、或胸苷激酶氨基酸序列的多核苷酸。生长抑素受体氨基酸序列可以是例如，重组生长抑素受体氨基酸序列、生长抑素2型受体氨基酸序列、或突变型生长抑素2型受体氨基酸序列。在某些实施方案中，生长抑素2型受体氨基酸序列是生长抑素2A型受体氨基酸序列。
报道分子序列可以用IRES偶联至第二种基因。IRES在本说明书的其他地方讨论。第二种基因可以是本领域普通技术人员已知的任何基因，包括上文讨论的任何基因。基因可以与第二种报道分子可操作地偶联或不偶联。第二种报道分子可以是本领域普通技术人员已知的任何报道分子，包括上文讨论的那些报道分子。例如，第二种报道分子可以是生长抑素受体氨基酸序列、钠碘同向转运体氨基酸序列、萤光素酶氨基酸序列、真核绿色荧光蛋白氨基酸序列、或胸苷激酶氨基酸序列。在某些实施方案中，第二种基因包括选择标记或治疗基因。治疗基因在上文以及本说明书的其他地方讨论。在本发明的核酸的某些实施方案中，组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列，并且启动子与编码FUS1的基因可操作地偶联。在这些实施方案中，核酸序列可以包括或不包括在质粒中。
本发明一般还涉及包括启动子的组合物，其中启动子包括上文所述的本发明的任何启动子。本发明的组合物可以包括或不包括用于将启动子递送至受试者中的细胞的递送媒介物。递送媒介物在本文中指可以促进核酸递送到细胞内的任何物质。细胞可以是受试者的任何细胞。受试者可以是任何受试者，例如哺乳动物。在某些具体实施方案中，受试者是人。本领域普通技术人员将熟悉用于促进核酸序列递送至受试者中的细胞内的递送媒介物。例如，递送媒介物可以是核酸、质粒、病毒载体、原核细胞、真核细胞、或脂质。任何病毒载体考虑包括在本发明的组合物中。例如，病毒载体可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、或痘病毒载体。在本发明的某些具体实施方案中，病毒载体是腺病毒。此外，考虑了用作递送媒介物的本领域普通技术人员已知的任何脂质。在某些实施方案中，脂质包括在脂质体中。脂质体可以是本领域普通技术人员已知适合用作递送媒介物的任何脂质体。例如，脂质体可以包括阳离子脂质，例如DOTAP:Chol。脂质体可以包括在纳米颗粒例如DOTAP:Chol纳米颗粒中。纳米颗粒在本文中指直径小于1微米的颗粒。
本发明的某些进一步的实施方案一般涉及包括上文所述的任何核酸的组合物。包括上文所述的任何核酸的组合物可以进一步包括递送媒介物，其中递送媒介物用于将核酸递送至受试者中的细胞。上文所述的任何递送媒介物适合于包括在本发明的这些实施方案中。例如，在某些实施方案中，如上文讨论的，递送媒介物是病毒载体或脂质。
本发明的其他实施方案一般涉及改善组织选择性启动子的功能的方法，其包括(1)选择组织选择性启动子序列；(2)选择第二种启动子序列，其中第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列；和(3)将组织选择性启动子序列与第二种启动子序列可操作地偶联，其中组织选择性启动子序列与第二种启动子序列可操作地偶联导致组织选择性启动子序列的功能改善。上文讨论的任何组织选择性启动子序列适合于在本发明的这些实施方案中使用。例如，如上文讨论的，组织选择性启动子序列可以是hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、AFP启动子序列、人α-乳白蛋白启动子序列、绵羊β-乳球蛋白启动子序列、U6启动子序列、H1启动子序列、7SL启动子序列、人Y启动子序列、人MRP-7-2启动子序列、腺病毒VA1启动子序列、人tRNA启动子序列、5S核糖体RNA启动子序列、或任何这些启动子序列的功能杂合体或组合。如上文讨论的，组织选择性启动子序列可以是任何低氧特异性启动子序列。
在本发明方法的某些具体实施方案中，组织选择性序列是hTERT启动子序列，例如SEQ ID NO：1。本方法的病毒最小启动子序列可以包括上文讨论的任何病毒最小启动子序列。例如，在本发明方法的某些具体实施方案中，病毒最小启动子序列是mini-CMV启动子序列。例如，mini-CMV序列可以是SEQ ID NO：2。
在某些实施方案中，组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，并且其中第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列。例如，启动子可以包括SEQ ID NO：3。
本发明的再进一步的实施方案一般涉及将基因递送到细胞内的方法，其包括：(1)制备包括与启动子可操作地偶联的基因的组合物，其中启动子是上文所述的本发明的任何新型启动子；和(2)使组合物与细胞接触，其中接触导致基因递送至细胞内。细胞可以是受试者的任何细胞。此外，如上文讨论的，受试者可以是任何受试者，例如哺乳动物。在某些具体实施方案中，受试者是人。例如，人可以是具有疾病例如过度增生性疾病的患者。例如，过度增生性疾病可以是癌症。过度增生性疾病例如癌症在下文说明书中更详细地讨论。
在某些实施方案中，组合物包括用于促进基因递送至细胞内的递送媒介物。上文讨论的任何递送媒介物适合于在本发明的这些实施方案中使用。例如，递送媒介物可以是上文所述的任何病毒载体或脂质。病毒载体和脂质还在下文说明书中更详细地讨论。在某些具体实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。例如，载体可以是鱼精蛋白复合的病毒载体。
本发明的再进一步的实施方案一般涉及治疗具有过度增生性疾病的受试者的方法，其包括：(1)获得包括上文所述的任何新型核酸序列的多核苷酸的药物组合物；和(2)给受试者施用药学有效量的所述组合物。如上文讨论的，受试者可以是任何受试者，例如哺乳动物。哺乳动物可以是人，例如具有疾病的患者。疾病可以是折磨受试者的任何疾病。在某些具体实施方案中，受试者是人，并且疾病是过度增生性疾病例如癌症。癌症可以是任何癌症，例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头与颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤、或白血病。在某些具体实施方案中，癌症是肺癌。在某些实施方案中，受试者经历第二种抗癌治疗。考虑了本领域普通技术人员已知的任何第二种抗癌治疗，例如化学治疗、手术治疗、放射治疗、免疫治疗、或另外的基因治疗。第二种抗癌治疗在下文说明书中更详细地讨论。
本发明一般还涉及使细胞成像的方法，其包括(1)使细胞与包括上文所述的任何核酸的组合物接触，其中启动子与报道分子氨基酸序列可操作地偶联；和(2)通过测量来源于报道分子的信号检测报道分子序列的细胞表达。如本文使用的，术语“报道分子”、“报道基因”或“报道分子序列”指任何遗传序列或编码的多肽序列，所述序列是可检测的并且可与细胞中存在的其他遗传序列或编码的多肽区分。报道分子在下文说明书中更详细地讨论。细胞可以是任何细胞。在某些实施方案中，细胞是受试者例如哺乳动物中的细胞。哺乳动物可以是人。人可以是具有疾病例如过度增生性疾病的患者。例如，过度增生性疾病可以是癌症。在某些实施方案中，例如，细胞在受试者中，并且使细胞成像的方法进一步限定为使受试者中的组织成像的方法。“组织”在本文中指在机体中共同执行特定功能的形态学相似的细胞和相关的细胞间物质的集合。例如，组织可以是肺组织、肾组织、乳房组织等等。组织还可以包括赘生细胞，例如在癌性肿瘤中。在成像方法的某些实施方案中，细胞是癌细胞，并且其中使细胞成像的方法进一步限定为使具有癌症的患者中的肿瘤成像的方法。
报道分子可以是本领域普通技术人员已知的任何报道分子。例如，报道分子可以是酶氨基酸序列、受体氨基酸序列、或核酶RNA序列。例如，报道分子氨基酸序列可以是重组的七跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列、胸苷激酶氨基酸序列、多巴胺受体氨基酸序列、内皮生长因子受体(EGFR)氨基酸序列、纤溶酶原氨基酸序列、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)氨基酸序列、激素受体氨基酸序列、或钠/碘同向转运体氨基酸序列。在本发明的某些具体实施方案中，报道分子氨基酸序列是重组的七跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)氨基酸序列。本领域普通技术人员已知的任何重组的GPCR氨基酸序列考虑用作报道分子。例如，GPCR可以是乙酰胆碱受体：M1、M2、M3、M4或M5；腺苷受体；A1；A2A；A2B；或A3；肾上腺素受体；α1A、α1B、α1D、α2A、α2B、α2C、β1、β2或β3；血管紧张素受体：AT1或AT2；蛙皮素受体：BB1、BB2或BB3；缓激肽受体：B1、B2、降钙素、Ainilin、CGRP或肾上腺髓质素受体；大麻素受体：CB1或CB2；趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CX3CR1或XCR1；趋化受体：C3a、C5a或fMLP；缩胆囊素和胃泌素受体：CCK1或CCK2；促肾上腺皮质激素释放因子受体：CRF1或CRF2；多巴胺受体：D1、D2、D3、D4或D5；内皮素受体：ET(A)或ET(B)；甘丙肽受体：GAL1、GAL2或GAL3；谷氨酸受体：mg11、mg12、mg13、mg14、mg15、mg16、mg17或mg18；糖蛋白激素受体：FSH、LSH或TSH；组胺受体：H1、H2、H3或H4；5-HT受体：5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT1B、5-HT1F、5HT2A、5-HT2F、5-HT2C、5-HT3、5-HT4、5-HT5A、5-HT5B、5-HT6或5-HT7；白三烯受体：BLT、CysLT1或CysLT2；溶血磷脂受体：edg1、edg2、edg3或edg4；黑皮质素受体：MC1；MC2；MC3；MC4或MC5；褪黑激素受体：MT1、MT2或MT3；神经肽Y受体：Y1、Y2、Y4、Y5或Y6；神经降压素受体：NTS1或NTS2；阿片样物质：DOP、KOP、MOP或NOP；P2Y受体：P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11或P2Y12)；过氧化物酶体增殖物：PPAR-α、PPAR-β或PPAR-γ；前列腺素类受体：DP、FP、IP、TP、EP1、EP2、EP3或EP4；蛋白酶-激活受体：PAR1、PAR2、PAR3或PAR4；生长抑素受体：SSTR1、SSTR2、SSTR2A、SSTR3、SSTR4或SSTR5；速激肽受体：NK1、NK2或NK3；促甲状腺激素释放激素受体：TRH1或TRH2；硬骨鱼紧张肽-II受体；血管活性肠肽或垂体腺苷酸环化酶激活肽受体：VPAC1、VPAC2或PAC1；或血管加压素或催产素受体：V1a、V1b、V2或OT。
在成像方法的某些具体实施方案中，重组GPCR氨基酸序列是重组生长抑素受体氨基酸序列、重组生长抑素2型受体氨基酸序列、或突变型生长抑素2型受体氨基酸序列。例如，重组生长抑素2型受体氨基酸序列可以是重组生长抑素2A型受体氨基酸序列。
在本发明的某些具体实施方案中，重组GPCR氨基酸序列包括编码截短的重组GPCR的核酸。截短可以是在N末端或C末端的截短。在某些实施方案中，截短是羧基末端的截短。截短可以导致或不导致GPCR作为GPCR的功能的改变。例如，在某些实施方案中，截短导致重组GPCR氨基酸序列的内化和/或信号转导的改变。
在本发明的某些实施方案中，编码报道分子氨基酸序列的核酸在报道分子氨基酸序列的N末端或C末端包括异源前导序列，其中前导序列将报道分子氨基酸序列导向特定的亚细胞定位。在本发明的进一步的实施方案中，编码报道分子氨基酸序列的核酸进一步包括融合至报道分子氨基酸序列的N末端或C末端的蛋白质标签。术语“标签”、“标签序列”或“蛋白质标签”指化学部分，其为核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或氨基酸、肽或蛋白质或其他化学品，其当加至另一种序列时提供另外的功用或赋予有用的特性，特别是在那种序列的检测和分离中。因此，例如，同聚物核酸序列或与捕获寡核苷酸互补的核酸序列可以加入至引物或探针序列以促进延伸产物或杂交产物的后续分离。在蛋白质标签的情况下，组氨酸残基(例如4-8个连续组氨酸残基)可以加入蛋白质的氨基或羧基末端以促进通过螯合金属色谱法分离蛋白质。可替代地，具有与特异性抗体分子或其他分子反应的表位或结合决定簇(例如flag表位、c-myc表位、甲型流感病毒血凝素蛋白的跨膜表位、A蛋白、纤维素结合结构域、钙调素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶等)的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合配偶体可以加入蛋白质以通过操作例如亲和力或免疫亲和层析、免疫组织化学或本文描述的非侵入性检测方法促进蛋白质分离、定位和/或鉴别。化学标签部分包括此类分子如生物素，其可以加入核酸或蛋白质以通过与抗生物素蛋白反应物等的相互作用促进分离或检测。众多其他标签部分是受过训练的技工已知的并且可以由其设想，并且预期在这个定义的范围内。在某些实施方案中，蛋白质标签可以具有酶促活性。在本发明的某些实施方案中，蛋白质标签具有酶促活性。此类蛋白质标签的例子包括血凝素A、β-半乳糖苷酶、胸苷激酶、转铁蛋白、myc-标签、VP16、(His)6-标签、或氯霉素乙酰转移酶。
在本发明的某些具体实施方案中，成像在受试者的手术期间进行。受试者可以经历由于任何原因的手术，例如用于切除患病组织。例如，在本发明的某些实施方案中，患者经历肿瘤的外科切除术。
在本发明的成像方法的进一步的实施方案中，基因与启动子可操作地偶联，并且使细胞成像的方法进一步限定为将基因递送至细胞的方法。因此，例如使细胞成像和将基因递送至细胞可以在本发明的某些实施方案中同时进行。
例如，基因可以是上文在本发明的其他实施方案背景中讨论的任何基因。例如，基因可以是治疗基因。如上文讨论的，治疗基因的例子包括肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。例如，治疗基因可以是Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、LUCA-1(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、SEM A3或MCC。在本发明的某些具体实施方案中，治疗基因是FUS1。
如上文讨论的，成像方法可以进一步包括将基因递送到细胞内的方法。在本发明的某些实施方案中，使报道分子成像以追踪递送到细胞内的基因，例如递送到受试者的患病组织内的基因。因此，在本发明的某些实施方案中，成像方法进一步限定为在给受试者施用基因后测量受试者中基因的生物分布的方法。在某些实施方案中，成像方法进一步限定为测量受试者中针对施用的治疗基因的应答的方法。
本领域普通技术人员已知的任何测量信号的方法考虑包括在本发明的成像方法中。示例性成像方法包括执行荧光成像分析、免疫组织化学分析、化学发光成像、光学成像、磁共振成像、或放射成像。测量信号的方法在本说明书的其他地方详细讨论。其他例子包括CT成像和超声。本领域普通技术人员已知的任何放射成像方法考虑在本发明的背景中用作测量信号的方法。例如，在某些实施方案中，放射成像进一步限定为γ照相机成像。本领域普通技术人员将非常熟悉γ照相机成像。在某些具体实施方案中，信号的测量进一步限定为使用111In-奥曲肽-生长抑素2A型受体(SSRT2A)报道分子系统的γ照相机成像。此外，本领域普通技术人员将熟悉磁共振成像。在某些具体实施方案中，信号的测量进一步限定为使用超顺磁性氧化铁(SPIO)-奥曲肽-SSTR2A报道分子和对比增强剂系统的磁共振成像。SPIO是用于MRI的对比剂并且通过增强与正常组织背景的对比用于增强肿瘤组织的分辨率(参见，Artemov等人，2003；Zhao等人，2002；Gupta和Curtis，2004，其各自特别引入本文作为参考)。本领域普通技术人员将熟悉对比剂(contrast agent)在成像例如在磁共振成像中的使用。对比剂在成像中的使用和示例性对比剂在下文说明书中更详细地讨论。
本发明的某些方面包括增强组织选择性启动子功能的方法以促进其他技术例如目的组织的成像的开发。在Umeoka等人，2004中得到综述。各种成像技术可用于使肿瘤成像。这些成像技术可以应用于癌症检测、诊断和治疗监控。外部成像方法例如计算机断层摄影术、磁共振成像和超声技术的改进已增加了显现肿瘤和转移灶的灵敏性(Tearney等人，1997；MacDonald和Hansell，2003)。然而，结构和解剖学成像中的限制因素是不能特异性鉴别恶性组织。组织病理学检查仍是用于检测瘤性病变的最有效方法。因此，肿瘤选择性的成像在人癌症治疗中将具有相当大的价值，因为它将允许定位肿瘤而无需显微镜分析。特别地，如果太小而不能直接视觉检测的肿瘤可以原位成像，那么外科医生可以精确地切除具有合适的外科手术边缘的肿瘤。这些成像模式需要肿瘤选择性的合适标记。如上文讨论的，改善组织选择性启动子的有效性的方法可以应用于开发组织选择性成像的改进方法。
如本文说明书中使用的，“a”或“an”可以指一个(种)或多个(种)。如本文权利要求中使用的，当与单词“包括”结合使用时，单词“a”或“an”可以指一个(种)或超过一个(种)。如本文使用的，“另一个(种)”可以指至少第二个(种)或多个(种)。
本发明的其他目的、特征和优点由于下列详细描述将是显而易见的。然而，应当理解详细描述和具体实施例在指出本发明优选实施方案的同时只作为举例说明而给出，因为本发明精神和范围内的各种改变和修改由于这个详细描述对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图简述
下列附图形成了本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1.质粒载体pLJ143/KGB2/FUS1的图解。
图2.质粒载体pLJ280/KGB2/EV的图解。
图3.质粒载体pLJ331/dCpG-KGB2/FUS1的图解。
图4.包含hTMC的质粒载体pLJ336/dCPG-KGB2/hTMC-FUS1的图解。
图5.包含hTMC的质粒载体pLJ284/pKGB2/hTMC-EV的图解。
图6.包含hTMC的质粒载体pLJ286/pKGB2/hTMC-EGFP的图解。
图7.质粒载体pLJ293/pKGB2/EGFP的图解。
图8.质粒载体pLJ287/pKGB2/hTERT-EGFP的图解。
图9.质粒载体pLJ296/KGB2/SSRT2A的图解。
图10.包含hTMC的质粒载体pLJ346/KGB2/hTMC-SSRT2A的图解。
图11.包含hTMC的质粒载体pLJ294/hTMC-FUS1-IRES-SSTR2A的图解。
图12.质粒载体pLJ290/pKGB2/FUS1-IRES-SSTR2A的图解。
图13.质粒载体pLJ340/pKGB2/hTMC-Luc的图解。
图14.质粒载体pLJ341/pKGB2/hTMC/FU1-IRES-Luc的图解。
图15A、图15B、图15C：通过荧光成像分析(图15A)和通过FACS定量分析(图15B，EGFP阳性细胞，和图15C，总荧光强度/1000细胞)的正常细胞和癌细胞转染株中EGFP的表达。
图16A、图16B：通过全身注射EGFP-阳离子脂质体复合物(lipoplexes)在小鼠各种组织中EGFP的表达。图16A：通过在裸小鼠中胸腔内注射1×106 N417细胞建立肺H417肿瘤。通过静脉内注射用各种EGFP-阳离子脂质体复合物(20μg DNA：40nmol DOTAP：胆固醇/小鼠)处理小鼠。注射后48小时杀死动物并立即制备新鲜冷冻的肿瘤、肾、脾、肺和肝样品。冷冻切片在4％多聚甲醛中固定并且立即在荧光显微镜下检查EGFP的表达。hTMC，人TERT-mini-CMV启动子。图16B：通过FACS分析在肿瘤和正常小鼠组织中定量EGFP的表达。
图17A、图17B、图17C、图17D：图17A：在HT1080转染株中SSRT2A表达的免疫荧光图像分析。图17B：具有由图17A中显示的相应SSRT2A表达(图17A的A、B和C)和不表达(图17D)细胞接种的皮下肿瘤的裸小鼠的γ照相机图像。动物静脉内注射111In-奥曲肽(13MBq)并在24小时后进行成像。图17C：在pLJ290/FUS1-IRES-SSRT2A质粒转染的H1299细胞中SSRT2A(绿色)和FUS1(红色)的共表达。图17D：通过肿瘤摄取的放射性示踪剂的相关性。％ID/g＝％注射剂量/克。
图18。经由尾静脉注射通过全身施用hTMC-EGFP-或hTMC-FUS1纳米颗粒+Glevec处理前后具有N417 SCLC肿瘤的小鼠的MRI、CT和肺阻断面Lung Block Face(LBF)成像分析。通过胸腔内注射接种N417肿瘤细胞后14天，通过MRI(之前)筛选动物的肿瘤发展。处理后2周，动物通过MR或CT进行成像，随后杀死并立即冷冻整只动物并制备阻断面切片并完整成像以匹配体内MRI和CT图像。
图19。通过原位细胞死亡分析使用TUNEL反应在hTMC-或CMV-FUS1纳米颗粒处理的小鼠中诱导凋亡。
举例说明性实施方案的描述
成功的癌症基因治疗的一个主要障碍是缺乏可以特异性靶向肿瘤的有效递送系统。用于肿瘤靶向转基因表达的一种方法是经由肿瘤特异性启动子控制转基因表达。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚单位，它在永生化细胞中以及＞85％的人癌症中是高度活跃的，但在大多数正常体细胞中是静止的。hTERT启动子已克隆并显示能够在肿瘤而不是正常细胞中靶向转基因表达。然而，如同大多数其他固有的哺乳动物启动子，hTERT启动子的转录促进强度比常用的病毒启动子例如CMV和SV40早期启动子弱得多。因此，其用于癌症基因治疗的用途受到低转基因表达问题的阻碍。为了避开这些问题，本发明人已开发了包括组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列的某些新型嵌合或杂合启动子，其中第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列。他们还开发了改善组织选择性启动子功能的某些新型方法，其涉及将组织选择性启动子序列与第二种启动子序列可操作地偶联，其中第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列。本文所述的新型启动子可以应用于将基因转移到细胞内的方法中，例如为了治疗受试者中的过度增生性疾病或为了使细胞例如受试者中的细胞成像的目的。本文所述的新型启动子可以应用于其中转基因表达改善将是有益的任何方法中。
A.启动子和包括启动子的核酸
本发明的核酸包括包含组织选择性启动子序列以及与组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列的嵌合或杂合启动子，其中第二种启动子序列包括最小启动子序列，优选病毒最小启动子序列。嵌合启动子序列可以与本发明的其他核酸元件结合使用以构建本文描述的各种核酸载体和核酸载体系统。
1.核酸
术语“核酸”是本领域众所周知的。如本文使用的，“核酸”一般指DNA、RNA分子(即，链)或其包括核碱基的衍生物或类似物。核碱基包括例如在DNA(例如腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各自作为术语“核酸”的亚属。术语“寡核苷酸”指长度约3-约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”指长度大于约100个核碱基的至少一种分子。
这些定义一般指单链分子，但在具体实施方案中还将包括与单链分子部分、基本上或完全互补的另外的链。因此，核酸可以包括双链分子或三链分子，其包括构成分子的特定序列的一条或多条互补链或“补足物”。
术语“载体”用于指核酸序列可以插入其中以用于引入细胞中的运载体，在所述细胞中它可以进行复制。术语“表达载体”或“核酸载体”指包含编码能够被转录的至少部分基因产物的核酸序列或“盒”以及“调节”或“控制”序列的载体，所述“调节”或“控制”序列指可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中转录和可能的翻译必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序列以外，表达载体还可以包含起其他功能的核酸序列。
2.启动子序列
“启动子”序列是控制序列，其是在其上控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可以包含在其上可以结合调节蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子的遗传元件。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在......控制下”和“在......转录控制下”指启动子相对于核酸序列的正确功能定位和定向以控制那种序列的转录起始和表达。启动子可以与“增强子”结合或不结合使用，所述“增强子”指涉及核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。总之，合适的启动子或启动子/增强子组合，以及目的基因构成表达盒。一种或多种表达盒可以存在于给定的核酸载体或表达载体中。在某些方面，一种表达盒可以编码与第二种表达盒的启动子相互作用的反式激活蛋白。一种或多种表达盒可以存在于相同和/或不同的表达载体上。
启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码区段或外显子上游的5′非编码序列的部分获得。此类启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是位于那种序列的上游或下游、与核酸序列天然缔合的增强子。可替代地，某些优点可以通过将编码的核酸区段置于重组或异源启动子的控制下获得，所述重组或异源启动子指在其天然环境中与核酸序列通常不缔合的启动子。在本发明的某些方面，异源启动子可以是嵌合启动子，其中2种或多种内源、异源或合成启动子序列的元件可操作地偶联以产生重组启动子。
重组或异源增强子也指在其天然环境中与核酸序列通常不缔合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，和从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除了合成生产启动子和增强子的核酸序列以外，序列可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术包括PCRTM，与本文公开的组合物结合产生(参见美国专利4,683,202和5,928,906，各自引入本文作为参考)。此类启动子可以用于驱动报道分子表达，例如^-半乳糖苷酶或萤光素酶。此外，考虑还可以采用指导序列在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的转录和/或表达的控制序列。
一般将使用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员一般了解用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用，例如参见引入本文作为参考的Sambrook等人，(1989)。采用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适条件下可指导引入的DNA区段表达的，例如在重组蛋白质和/或肽的生产中有利的。启动子可以是异源的或内源的或其组合。
a.组织选择性启动子序列
启动子可以在各种组织类型和几种不同的生物种类中有功能，或者其功能可以限制于特定种类和/或特定组织或细胞类型。此外，启动子可以是组成型活性的，或者它可以经由某些物质(例如组织特异性因子)、在一定条件下(例如低氧、或在包含启动子的表达盒中增强子元件的存在)、或在生物的某一发育阶段过程中(例如在胎儿中活跃，在成人中沉默)选择性激活。
在本发明实践中有用的启动子优选是组织特异性的，即，它们能够驱动基因在一种组织中转录，同时在其他组织类型中很大程度上保持“沉默”或以相对低的水平表达。然而，应当理解组织特异性或组织选择性启动子在其中它们是沉默的那些组织中可以具有可检测量的“背景”或“基础”活性。启动子在靶组织中选择性激活的程度可以表达为选择性比率(在靶组织中的活性/在对照组织中的活性)。在这点上，在本发明实践中有用的组织特异性启动子一般具有大于约2、3、4或5的选择性比率。优选地，选择性比率大于约10或15。
应进一步理解某些启动子虽然在活性方面不限制于单一组织类型，仍然可以显示选择性，因为它们在一群组织中可以是活跃的，并且在另一群中较不活跃或沉默。此类启动子也称为“组织特异性”或“组织选择性”，并且考虑用于与本发明一起使用。例如，在各种肿瘤细胞中活跃的启动子在治疗癌症中可以是治疗上有用的，其可以影响机体的许多不同区域中的任何一个。
组织特异性启动子可以来源于例如基因的启动子区域，所述基因在不同组织或不同生长阶段或增生细胞中差异表达。
基因在特定启动子控制下的表达水平可以通过操纵启动子区域进行调节。例如，启动子区域内的不同结构域可以具有不同的基因调节活性。这些不同区域的作用一般使用具有不同启动子变体的载体构建体进行评估，所述启动子变体具有特异性区域缺失(即，缺失分析)。用于此类实验的载体一般包含报道分子序列，其用于测定每种启动子变体在不同条件下的活性。此类缺失分析的应用使得能够鉴别包含所需活性的启动子序列并因此鉴别包括核心启动子元件的特定启动子结构域。这种方法可以用于鉴别例如当与其他启动子元件例如但不限于核心CMV启动子，mini-CMV组合时，能够赋予组织特异性的最小区域，或赋予强转录应答的最小区域。
本文描述的许多组织特异性启动子在本发明的实践中可以是特别有利的。在大多数情况下，这些启动子可以分离为适合于克隆到选择的载体中的方便的限制性消化片段。本发明的某些方面包括但不限于hTERT启动子。可替代地，启动子片段可以使用聚合酶链式反应或通过寡核苷酸合成进行分离。这些启动子片段的克隆可以通过在引物的5′端掺入限制性位点来促进。
本领域普通技术人员将熟悉可以包括在本发明背景中的各种类型的组织选择性启动子序列。这些启动子的示例性列表包括在表1中。
表1列出了可以在本发明背景中用作组织选择性启动子序列来源的元件/启动子的非限制性例子。
    表1-启动子和/或增强子
启动子/增强子 参考文献
免疫球蛋白重链 Banerji等人，1983；Gilles等人，1983；Grosschedl等人，1985；Atchinson等人，1986，1987；Imler等人，1987；Weinberger等人，1984；Kiledjian等人，1988；Porton等人；1990
免疫球蛋白轻链 Queen等人，1983；Picard等人，1984
    表1-启动子和/或增强子
启动子/增强子 参考文献
T细胞受体 Luria等人，1987；Winoto等人，1989；Redondo等人；1990
HLA DQ a和/或DQ β Sullivan等人，1987
β-干扰素 Goodbourn等人，1986；Fujita等人，1987；Goodbourn等人，1988
白介素-2 Greene等人，1989
白介素-2受体 Greene等人，1989；Lin等人，1990
MHC II类5 Koch等人，1989
MHC II类HLA-Dra Sherman等人，1989
β-肌动蛋白 Kawamoto等人，1988；Ng等人；1989
肌肉肌酸激酶(MCK) Jaynes等人，1988；Horlick等人，1989；Johnson等人，1989
前白蛋白(转甲状腺蛋白) Costa等人，1988
弹性蛋白酶I Ornitz等人，1987
金属硫蛋白(MTII) Karin等人，1987；Culotta等人，1989
胶原酶 Pinkert等人，1987；Angel等人，1987
白蛋白 Pinkert等人，1987；Tronche等人，1989，1990
甲胎蛋白 Godbout等人，1988；Campere等人，1989
γ-珠蛋白 Bodine等人，1987；Perez-Stable等人，1990
β-珠蛋白 Trudel等人，1987
c-fos Cohen等人，1987
c-HA-ras Triesman，1986；Deschamps等人，1985
胰岛素 Edlund等人，1985
神经细胞粘附分子(NCAM) Hirsch等人，1990
α1-抗胰蛋白酶 Latimer等人，1990
H2B(TH2B)组蛋白 Hwang等人，1990
小鼠和/或I型胶原 Ripe等人，1989
葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78) Chang等人，1989
大鼠生长激素 Larsen等人，1986
人血清淀粉样蛋白A(SAA) Edbrooke等人，1989
肌钙蛋白I(TNI) Yutzey等人，1989
血小板衍生生长因子(PDGF) Pech等人，1989
杜兴氏肌营养不良 Klamut等人，1990
    表1-启动子和/或增强子
启动子/增强子 参考文献
SV40 Banerji等人，1981；Moreau等人，1981；Sleigh等人，1985；Firak等人，1986；Herr等人，1986；Imbra等人，1986；Kadesch等人，1986；Wang等人，1986；Ondek等人，1987；Kuhl等人，1987；Schaffner等人，1988
多瘤 Swartzendruber等人，1975；Vasseur等人，1980；Katinka等人，1980，1981；Tyndell等人，1981；Dandolo等人，1983；de Villiers等人，1984；Hen等人，1986；Satake等人，1988；Campbelland/or Villarreal，1988
逆转录病毒 Kriegler等人，1982，1983；Levinson等人，1982；Kriegler等人，1983，1984a，b，1988；Bosze等人，1986；Miksicek等人，1986；Celander等人，1987；Thiesen等人，1988；Celander等人，1988；Choi等人，1988；Reisman等人，1989
乳头瘤病毒 Campo等人，1983；Lusky等人，1983；Spandidosand/or Wilkie，1983；Spalholz等人，1985；Lusky等人，1986；Cripe等人，1987；Gloss等人，1987；Hirochika等人，1987；Stephens等人，1987
乙肝病毒 Bulla等人，1986；Jameel等人，1986；Shaul等人，1987；Spandau等人，1988；Vannice等人，1988
人免疫缺陷病毒 Muesing等人，1987；Hauber等人，1988；Jakobovits等人，1988；Feng等人，1988；Takebe等人，1988；Rosen等人，1988；Berkhout等人，1989；Laspia等人，1989；Sharp等人，1989；Braddock等人，1989
细胞巨化病毒(CMV) Weber等人，1984；Boshart等人，1985；Foecking等人，1986
长臂猿白血病病毒 Holbrook等人，1987；Quinn等人，1989
b.可操作地偶联启动子序列的方法
术语“启动子”与“启动子元件”和“启动子序列”可互换使用。同样地，术语“增强子”与“增强子元件”和“增强子序列”可互换使用。启动子可以与其他启动子、启动子元件和/或调节序列/元件偶联，其当结合合适的细胞内调节因子时，增强(“增强子”)或抑制(“抑制子”)启动子依赖性转录。当此类元件控制或影响转基因转录速率或功效时，启动子、增强子或抑制子可以说成与转基因“可操作地连接”。例如，定位接近转基因编码序列的5′端的启动子序列通常与转基因可操作地连接。如本文使用的，术语“调节元件”与“调节序列”可互换使用，并且指启动子、增强子和其他表达控制元件、或此类元件的任何组合。
启动子位于它们控制的基因的5′(上游)。许多真核启动子包含2种类型的识别序列：TATA盒和上游启动子元件。位于转录起始位点上游25-30bp的TATA盒被认为涉及指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。相反，上游启动子元件决定转录起始的速率。不管其定向，这些元件都可以起作用，但它们必须定位于TATA盒上游的100-200bp区内。
增强子元件可以刺激来自连接的同源或异源启动子的转录高达1000倍。即使其定向是反向的，增强子元件通常也保持活性(Li等人，J.Bio.Chem.1990，266：6562-6570)。此外，不像启动子元件，当置于转录起始位点下游时，例如在内含子内，或甚至在与启动子有相当距离处，增强子仍可以是活跃的(Yutzey等人，Mol.and Cell.Bio.1989，9：1397-1405)。
如本领域已知的，可以适应这种距离中的某些变化而不丧失启动子功能。类似地，调节元件相对于转基因的定位可以显著改变而不丧失功能。调节元件的多重拷贝可以协同起作用。一般地，表达载体在5′-3′方向上包括一种或多种增强子序列，随后为启动子序列，它们全部可操作地连接至转基因，转基因后面为多腺苷酸化序列。
3.基因
本发明的某些实施方案涉及包括与一种或多种目的基因可操作地偶联的本文所述新型启动子序列之一的核酸序列。本发明的某些其他实施方案涉及使细胞成像的方法，其中该方法进一步限定为将基因递送到细胞内的方法。在这些实施方案中，基因与启动子可操作地偶联。本领域普通技术人员已知的任何基因考虑包括在本发明将基因递送至细胞的方法中。术语“基因”用于简单地指功能蛋白质、多肽或肽编码单位。
在本发明的某些实施方案中，基因是治疗基因。“治疗基因”是可以为了治疗或预防疾病的目的施用于受试者的基因。例如，治疗基因可以是施用于受试者用于治疗或预防癌症的基因。治疗基因的例子包括但不限于，Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或MCC。
在本发明的某些实施方案中，治疗基因是肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因是当存在于细胞中时减少细胞的致肿瘤性、恶性或过度增生性表型的基因。这个定义包括肿瘤抑制基因的全长核酸序列，以及来源于全长序列的任何长度的非全长序列。应进一步理解序列包括天然序列的简并密码子或可以引入以在特定宿主细胞中提供密码子偏爱的序列。
在这个定义内的肿瘤抑制核酸的例子包括，但不限于，APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、scFV、ras、MMAC1、FCC、MCC、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、或编码SEMA3多肽的基因和FUS1。染色体3p21.3基因，例如FUS1，在特别整体引入本文作为参考的美国专利申请公开号20020164715中更详细地讨论。
其他示例性肿瘤抑制基因在www.cise.uf1.edu/～yy1/HTML-TSGDB/Homepage.html的肿瘤抑制基因数据库中描述。这个数据库特别引入本文作为这个以及本申请的所有其他部分的参考。如上文讨论的，编码肿瘤抑制基因的核酸包括肿瘤抑制基因、或来源于其中的核酸(例如，cDNAs、cRNAs、mRNAs及其编码各自肿瘤抑制物氨基酸序列的活性片段的子序列)、以及包括这些序列的载体。本领域普通技术人员将熟悉可以应用于本发明的肿瘤抑制基因。
在本发明的某些实施方案中，治疗基因是诱导凋亡的基因(即，促凋亡基因)。“促凋亡基因氨基酸序列”指当存在于细胞中时诱导或促进凋亡的多肽。本发明考虑包括本领域普通技术人员已知的任何促凋亡基因。示例性促凋亡基因包括CD95、胱天蛋白酶-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PERP、bad、bc1-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、BID和mda7。关于mda7的信息可以在例如美国专利申请公开号20050250127、20040009939、20030225025和20020183271中找到，所述专利各自特别整体引入本文作为参考。本领域普通技术人员将熟悉可以应用于本发明的方法和组合物中、本文没有具体列出的促凋亡基因以及其他此类基因。
治疗基因还可以是编码细胞因子的基因。术语‘细胞因子’是由一种细胞群体释放的蛋白质的通用术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。“细胞因子”指当存在于细胞中时维持细胞因子的某些或所有功能的多肽。这个定义包括全长以及来源于全长序列的任何长度的非全长序列。应进一步理解，如上文讨论的，序列包括天然序列的简并密码子或可以引入以在特定宿主细胞中提供密码子偏爱的序列。
此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；泌乳素；胎盘催乳素、OB蛋白质；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生长素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILs)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3。
细胞因子的另一个例子是IL-10。IL-10是通过免疫系统细胞以及某些肿瘤细胞产生的多效同型二聚的细胞因子(Ekmekcioglu等人，1999)。它的免疫抑制功能包括有效抑制促炎细胞因子的合成，包括IFNγ、TNF和IL-16(De Waal Malefyt等人，1991)。IL-10-样细胞因子家族在染色体1q32上的小的195kb基因簇上编码，并且由与IL-10具有结构和序列同源性的许多细胞蛋白质(IL-10、IL-19、IL-20、MDA-7)组成(Kotenko等人，2000；Gallagher等人，2000；Blumberg等人，2001；Dumoutier等人，2000；Knapp等人，2000；Jiang等人，1995a；Jiang等人，1996)。
最近发现的假定的细胞因子家族成员是MDA-7。MDA-7已表征为IL-10家族成员并且也称为IL-24。染色体定位、转录调节、鼠类和大鼠同系物表达和推定的蛋白质结构都暗示MDA-7是细胞因子(Knapp等人，2000；Schaefer等人，2000；Soo等人，1999；Zhang等人，2000)。与GM-CSF、TNFα和IFNγ转录物类似(所有这些在其3’UTR靶向mRNA中包含富含-AU的元件用于快速降解)，MDA-7在其3’UTR17中含有3个AREs。Mda-7 mRNA已在人PBMC中鉴别(Ekmekcioglu，等人，2001)，并且尽管先前没有报道人MDA-7蛋白质的细胞因子功能，但基于基因和蛋白质序列特征已将MDA-7命名为IL-24(NCBI数据库登记号XM_001405)。
治疗基因的其他例子包括编码酶的基因。例子包括但不限于，ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATPase、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTPase、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪加氧酶、裂解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶(peptidease)、支链淀粉酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报道基因、白介素或细胞因子。
治疗基因的进一步例子包括编码氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸酯合成酶、精氨基琥珀酸酯裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酸单酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧化酶、H蛋白、T蛋白、门克斯病铜-转运ATPase、威尔逊氏病铜-转运ATPase、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羧化酶、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。
治疗基因还包括编码激素的基因。例子包括但不限于，编码生长激素、泌乳素、胎盘催乳素、促黄体激素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-促黑素细胞激素、缩胆囊素、内皮素I、甘丙肽、抑胃肽、高血糖素、胰岛素、促脂素、后叶激素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、恶性因子的血钙过多(hypercalcemia of malignancy factor)、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺激素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑素、胰腺肽、肽YY、PHM、分泌素、血管活性肠肽、后叶催产素、血管加压素、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、α促黑素细胞激素、心房钠尿肽、糊精、淀粉样P组分、促肾上腺皮质素释放激素、生长激素释放因子、促黄体激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质或促甲状腺激素释放激素的基因。
如本领域技术人员应当理解的，术语“治疗基因”包括表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、cDNA序列、和较小的改造的基因区段。编码治疗基因的核酸分子可以包括约5-约12000或更多核苷酸、核苷或碱基对的连续核酸序列。
“与其他编码序列基本上分离的”指目的基因形成核酸区段编码区的部分，并且该区段不包含天然存在的编码核酸的较大部分，例如大染色体片段或其他功能基因或cDNA编码区。当然，这指最初分离时的核酸区段，并且不排除通过人为操纵后来加入区段的基因或编码区。
“治疗基因”定义内包括的是“生物学功能等价的”治疗基因。因此，具有约70％-约90％同源性的等同于或功能等价于治疗基因氨基酸的氨基酸的序列将是生物学功能等价物的序列，条件是维持蛋白质的生物活性。
4.选择标记
在本发明的某些实施方案中，本发明的核酸构建体可以通过在表达载体中包含标记进行体外或体内鉴别。此类标记将赋予细胞允许容易鉴别包含表达载体的细胞的可鉴别改变。一般地，选择标记是赋予允许选择的特性的标记。阳性选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而阴性选择标记是其中其存在阻止其选择的标记。阳性选择标记的例子是抗药性标记。选择标记和可筛选标记的例子是本领域技术人员众所周知的。
5.报道分子
如本文使用的，术语“报道分子”、“报道基因”或“报道分子序列”指任何遗传序列或编码的多肽序列，所述序列是可检测的并且可与细胞中存在的其他遗传序列或编码的多肽区分。优选地，报道分子序列编码通过其存在、或通过其导致产生可检测信号的活性可容易地检测的蛋白质。在某些方面，可检测的部分可以包括荧光团、发光团、微球体、酶、多肽、多核苷酸和/或纳米微球体，所有这些可以偶联至识别和/或与报道分子相互作用的抗体或配体。在各种实施方案中，本发明的核酸序列包括报道分子核酸序列或编码产生可检测多肽的产物。报道分子是或编码能够直接或间接产生可检测信号的报道分子。一般地，尽管不是必需地，报道基因编码RNA和/或可检测的蛋白质，所述RNA或蛋白质不能通过细胞以别的方式生产。许多报道基因已得到描述，并且某些对于基因调节研究是商购可得的。参见，例如，Alam和Cook，1990，Ahal.Biochem.188：245-254，其公开内容引入本文作为参考。可以检测的信号包括但不限于颜色、荧光、发光、同位素或放射性同位素信号、细胞表面标签、细胞存活力、细胞营养需求的缓解、细胞生长和抗药性。报道分子序列包括但不限于编码下列的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶，膜结合蛋白质，包括例如G蛋白偶联受体、生长抑素受体、CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白、同向转运体(例如NIS)，和高亲和力抗体或配体针对其存在或可以通过常规方法产生的本领域众所周知的其他，以及包括适当融合至抗原标签结构域的膜结合蛋白质的融合蛋白，所述抗原标签结构域来自例如血凝素或Myc。
在某些实施方案中，报道分子氨基酸序列是G蛋白偶联受体氨基酸序列。示例性G蛋白偶联受体包括乙酰胆碱受体：M1、M2、M3、M4或M5；腺苷受体：A1；A2A；A2B；或A3；肾上腺素受体；α1A、α1B、α1D、α2A、α2B、α2C、β1、β2或β3；血管紧张素受体：AT1或AT2；蛙皮素受体：BB1、BB2或BB3；缓激肽受体：B1、B2、降钙素、Ainilin、CGRP或肾上腺髓质素受体；大麻素受体：CB1或CB2；趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR 3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CX3CR1或XCR1；趋化受体：C3a、C5a或fMLP；缩胆囊素和胃泌素受体：CCK1或CCK2；促肾上腺皮质激素释放因子受体：CRF1或CRF2；多巴胺受体：D1、D2、D3、D4或D5；内皮素受体：ET(A)或ET(B)；甘丙肽受体：GAL1、GAL2或GAL3；谷氨酸受体：mg11、mg12、mg13、mg14、mg15、mg16、mg17或mg18；糖蛋白激素受体：FSH、LSH或TSH；组胺受体：H1、H2、H3或H4；5-HT受体：5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT1B、5-HT1F、5HT2A、5-HT2F、5-HT2C、5-HT3、5-HT4、5-HT5A、5-HT5B、5-HT6或5-HT7；白三烯受体：BLT、CysLT1或CysLT2；溶血磷脂受体：edg1、edg2、edg3或edg4；黑皮质素受体：MC1；MC2；MC3；MC4或MC5；褪黑激素受体：MT1、MT2或MT 3；神经肽Y受体：Y1、Y2、Y4、Y5或Y6；神经降压素受体：NTS1或NTS2；阿片样物质：DOP、KOP、MOP或NOP；P2Y受体：P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11或P2Y12)；过氧化物酶体增殖物：PPAR-α、PPAR-β或PPAR-γ；前列腺素类受体：DP、FP、IP、TP、EP1、EP2、EP3或EP4；蛋白酶-激活受体：PAR1、PAR2、PAR3或PAR4；生长抑素受体：SSTR1、SSTR2、SSTR2A、SSTR3、SSTR4或SSTR5；速激肽受体：NK1、NK2或NK3；促甲状腺激素释放激素受体：TRH1或TRH2；硬骨鱼紧张肽-II受体；血管活性肠肽或垂体腺苷酸环化酶激活肽受体：VPAC1、VPAC2或PAC1；或血管加压素或或催产素受体：V1a、V1b、V2或OT。生长抑素受体作为报道分子的用途在美国专利申请公开号20020173626中更详细地讨论，所述专利申请特别整体引入本文作为说明书的这个部分以及说明书的所有其他部分的参考。
在某些实施方案中，报道分子核酸或多肽的表达赋予生长优势并且生长优势的程度可通过改变宿主细胞的生长条件进行控制。
在其他实施方案中，报道分子序列编码荧光蛋白。可以根据本发明使用的荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海笔(Renilla Reniformis)绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、来自海葵的柠檬色和红色荧光蛋白(dsRED)。
在其他实施方案中，报道基因可以编码细胞表面标签。与这个实施方案相联系，方法可以进一步包括使宿主细胞接触对细胞表面标签特异的荧光标记抗体的步骤，从而标记宿主细胞，其可以通过FACS或其他分选或分离方法进行分离。
在各种实施方案中，与报道分子序列的基础转录水平比较，至少一种报道分子序列的所需表达水平增加、减少、或在报道分子序列表达水平中没有变化。在一个具体实施方案中，与报道分子序列的基础转录水平比较，报道分子序列之一的所需表达水平在报道分子序列表达水平中增加。
在各种实施方案中，报道分子序列编码独特的可检测蛋白质，其可以独立、同时、或独立且同时进行分析。在某些实施方案中，至少一种报道分子编码荧光蛋白。在另一实施方案中，至少一种报道分子序列的表达水平可以通过FACS进行分析。
在其他实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。示例性真核细胞包括酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括人细胞和显示病理表型的各种细胞例如癌细胞。
在本发明的某些实施方案中，报道分子是核酶RNA序列。尽管在传统上使用蛋白质用于催化核酸，但已出现在这种努力中有用的另一类大分子。核酶是RNA-蛋白质复合物，其以位点特异性方式切割核酸。核酶含有具有核酸内切酶活性的特异性催化结构域(Kim和Cook，1987；Gerlach等人，1987；Forster和Symons，1987)。例如，许多核酶高度特异性地促进磷酸酯转移反应，通常只切割寡核苷酸底物中的几种磷酸酯中的一种(Cook等人，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。这种特异性已归因于在化学反应前底物经由特异性碱基配对相互作用结合核酶的内在引导序列(“IGS”)的必要条件。
6.剪接位点
大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从原始转录物中去除内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保转录物的适当加工用于蛋白质表达(Chandler等人，1997)。
7.多腺苷酸化信号
在表达构建体中可以包括多腺苷酸化信号以实现转录物的适当多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质被认为对于本发明的成功实践不是关键的，和/或可以使用任何此类序列。具体实施方案包括在各种靶细胞中方便和/或已知良好地起作用的SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号。还考虑作为表达盒元件的是转录终止位点。这些元件可以用于增强信使水平和/或最小化从盒到其他序列的连读。
8.终止信号
本发明的载体或构建体可以包括至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”包括涉及特异性终止通过RNA聚合酶的RNA转录的DNA序列。因此，在某些实施方案中考虑的是终止RNA转录物生产的终止信号。终止子可能是在体内达到所需信使水平所必需的。
在真核系统中，终止子区域还可包括特异性DNA序列，其允许新转录物的位点特异性切割以便暴露多腺苷酸化位点。这向专门的内源性聚合酶发信号以给转录物的3’末端加上一段约200A的残基(多聚A)。具有这种多聚A尾修饰的RNA分子看起来更稳定并且更有效地进行翻译。因此，在涉及真核生物的其他实施方案中，优选终止子包括用于切割RNA的信号，并且更优选终止信号促进信使的多腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可以用于增强信使水平并最小化从盒到其他序列的连读。
考虑用于在本发明中使用的终止子包括本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于，例如基因的终止序列例如牛生长激素终止子，或病毒终止序列例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以缺乏可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
9.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一种或多种复制起点(通常称为“ori”)，这是在其上起始复制的特异性核酸序列。可替代地，如果宿主细胞是酵母，那么可以采用自主复制序列(ARS)。
10.IRES
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)用于制备多基因、或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点上开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。来自小核糖核酸病毒家族的2个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件已得到描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sa rnow，1991)。IRES元件可以连接至异源开放读码框。各自通过IRES分开的多个开放读码框可以一起转录，产生多顺反子信使。由于IRES元件，每个开放读码框易接近核糖体用于有效翻译。多基因可以使用单一启动子/增强子有效表达以转录单一信使(美国专利5,925,565和5,935,819；PCT/US99/05781)。
B.使细胞成像的方法
本发明的某些实施方案涉及使细胞成像的方法，其涉及使细胞与包括核酸的组合物接触，以及通过测量来源于报道分子的信号检测报道分子序列的细胞表达，所述核酸包括本文所述的一种或多种新型启动子，其中启动子与报道分子氨基酸序列可操作地偶联。细胞可以是分离的细胞，或者它可以是组织例如受试者中的组织的一部分。在某些实施方案中，细胞是在具有癌症的受试者的肿瘤中包括的肿瘤细胞。
1.测量信号的方法
待测量的信号可以作为单独的成像操作的一部分，或作为使用超过一种成像模式(在下文中更详细地讨论)的成像操作的一部分进行测量。例如，成像操作可以是如下文讨论的CT、MRI或PET。然而，在某些方面，成像在受试者的手术操作过程中进行。在某些实施方案中，例如，报道分子可以用于选择性标记外科医生试图切除的特定组织类型。例如，在某些实施方案中，待切除的组织是肿瘤组织，并且手术中成像是肿瘤组织的成像。手术中进行的成像用于指导待切除的细胞的检测。手术中成像可以同时伴随或不伴随治疗基因的施用，其中治疗基因与报道分子序列可操作地偶联。
在某些实施方案中，成像与给受试者施用治疗基因同时进行。例如，除了与报道分子氨基酸序列可操作地偶联之外，启动子还可以与治疗基因可操作地偶联。治疗基因可以是本领域普通技术人员已知的任何类型的治疗基因。例如，治疗基因可以是肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。本发明的方法考虑了本领域普通技术人员已知的任何治疗基因。治疗基因在本说明书的其他地方更详细地讨论。
与治疗基因可操作地偶联的报道分子氨基酸序列的同时施用还可以应用于受试者中基因的生物分布的测量。因此，本文所述的使细胞成像的方法可以应用于测量组织中治疗基因的生物分布，例如具有癌症的受试者中肿瘤的治疗基因的生物分布。
报道分子氨基酸序列的成像可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。例如，报道分子可以通过给受试者施用标记的配体进行成像，其中标记的配体涉及报道分子氨基酸序列。在其他实施方案中，配体是放射标记探针，例如111In-奥曲肽。在进一步的实施方案中，配体是针对报道分子氨基酸序列的荧光探针、或针对报道分子氨基酸序列的抗体。
本领域普通技术人员已知的用于测量来源于报道分子的信号的任何方法考虑包括在本发明中。示例性检测方法描述如下。
a.γ照相机成像
用于成像的各种核医学技术是本领域普通技术人员已知的。这些技术中的任何一种可以应用于本发明成像方法中以测量来自报道分子的信号。例如γ照相机成像考虑作为可以用于测量来源于报道分子的信号的成像方法。本领域普通技术人员将熟悉用于应用γ照相机成像的技术(参见，例如特别引入本文作为参考的Kundra等人，2002)。在一个实施方案中，信号的测量可以涉及111-In-奥曲肽-SSRT2A报道分子系统的γ照相机成像的使用。
b.计算机断层摄影术(CT)
计算机断层摄影术(CT)在本发明中考虑作为成像模式。通过获得来自各种角度的一系列X光片，有时超过一千张，并随后使用计算机组合它们，CT使得能够建立机体任何部分的三维图像。计算机进行编程以显示来自任何角度和在任何深度上的二维薄层。
在CT中，当原始CT扫描无法诊断时，静脉内注射造影对比剂可以帮助鉴别和描绘软组织块。类似地，对比剂帮助评估软组织或骨病变的血管分布。例如，对比剂的使用可以帮助描绘肿瘤和邻近的血管结构的关系。
CT对比剂包括例如，碘化造影剂。这些试剂的例子包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐。钆试剂已报道可以用作CT对比剂(参见，例如Henson等人，2004)。例如，gadopentate试剂已用作CT对比剂(在Strunk和Schild，2004中讨论)。
在本发明的实施方案中，例如，针对报道分子的配体或与报道分子融合的标签可以用CT对比剂进行标记。CT成像的进行可以用于测量来源于报道分子的信号。
c.磁共振成像(MRI)
磁共振成像(MRI)是使用高强度磁体和射频信号产生图像的比CT更新的成像模式。生物组织中最丰富的分子种类是水。水质子核的量子机械“自旋”最终产生成像实验中的信号。在MRI中，待成像的样品置于强静磁场(1-12 Tesla)中，并且自旋受射频(RF)辐射脉冲激发以在样品中产生净磁场。随后将各种磁场梯度和其他RF脉冲作用于自旋以使空间信息编码入记录的信号。通过收集和分析这些信号，可以计算三维图像，其如CT图像一样通常以二维薄层显示。
MR成像中使用的对比剂与其他成像技术中使用的那些不同。它们的目的是帮助区别具有类似信号特征的组织组分，并缩短松弛时间(其将对T1-加权自旋回波MR图像产生较强的信号并对T2加权图像产生强度较弱的信号)。MRI对比剂的例子包括钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物和铁颗粒。
CT和MRI提供帮助区别组织边界和血管结构的解剖学信息。与CT比较，MRI的缺点包括较低的患者耐受性、起搏器和某些其他植入金属装置中的禁忌症、和与多重原因相关的假象，其中尤其是移动(Alberico等人，2004)。另一方面，CT是快速、良好耐受和容易获得的，但具有比MRI更低的对比度分辨率并需要碘化对照物和电离辐射(Alberico等人，2004)。CT和MRI的缺点是两种成像模式都不能提供细胞水平上的功能信息。例如，两种成像模式都不能提供关于细胞存活力的信息。
如上文关于CT成像所述，用MRI对比剂标记的配体可以使用MRI测量以测定来源于报道分子的信号的存在，其中所述配体针对报道分子或与报道分子融合的标签。
d.PET和SPECT
提供关于细胞水平上例如细胞存活力的信息的成像模式包括正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。在PET中，患者摄入或注射发射正电子的稍微放射性的物质，当物质通过机体移动时可以进行监控所述正电子。在一个共同应用中，例如，患者给予附着了正电子发射体的葡萄糖，并且当他们进行各种工作时监控其脑。因为当脑工作时其使用葡萄糖，所以PET图像显示何处脑活动很高。
与PET紧密相关的是单光子发射计算机断层摄影术，或SPECT。这两者之间的主要区别是，SPECT使用发射高能光子的放射性示踪物代替正电子发射物质。SPECT对于诊断冠状动脉疾病是有价值的，并且在美国每年已进行2.5×106例SPECT心脏研究。
用于成像的PET放射性药物通常用正电子发射体例如11C、13N、15O、18F、82Rb、62Cu和68Ga进行标记。SPECT放射性药物通常用正电子发射体例如99mTc、201T1和67Ga进行标记。关于脑成像，PET和SPECT放射性药物根据血脑屏障渗透性、脑灌注和代谢受体-结合以及抗原-抗体结合进行分类(Saha等人，1994)。血脑屏障SPECT试剂例如99mTc04-DTPA、201T1和[67Ga]柠檬酸盐被正常脑细胞排除在外，但因为改变的BBB进入肿瘤细胞内。SPECT灌注试剂例如[123I]IMP、[99mTc]HMPAO、[99mTc]ECD是亲脂性试剂，并因此扩散到正常脑中。重要的受体-结合SPECT放射性药物包括[123I]QNE、[123I]IBZM和[123I]碘西尼。这些示踪物结合特异性受体，并且在受体相关疾病评估中很重要。
e.光学成像
光学成像是特别在医学范围已得到普遍接受的另一种成像模式。例子包括荧光成像分析、免疫组织化学成像分析和化学发光成像分析。本领域普通技术人员将非常熟悉这些成像模式。另外的例子包括细胞组分的光学标记，以及血管造影术例如荧光素血管造影术和吲哚菁绿血管造影术。光学成像剂的例子包括例如荧光素、荧光素衍生物、吲哚菁绿、Oregon绿、Oregon绿衍生物、若丹明绿、若丹明绿衍生物、曙红、赤藓红、Texas红、Texas红衍生物、孔雀绿、纳米金硫代琥珀酰亚胺酯(nanogold sulfosuccinimidyl ester)、级联蓝(cascadeblue)、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑(pyridyloxazole)衍生物、级联黄染料、dapoxyl染料。
f.超声
已得到普遍接受的另一种生物医学成像模式是超声。超声成像已非侵入性地用于提供体内软组织结构和血流信息的实时横截面以及甚至三维图像。高频声波和计算机创造了血管、组织和器官的图像。
血流的超声成像可以受到许多因素例如血管的尺寸和深度的限制。近期开发的超声对比剂包括全氟(perfluorine)和全氟类似物，其设计为通过帮助增强灰阶图像和多普勒信号克服这些局限性。
2.多模式成像
在本发明的某些实施方案中，使用超过一种成像模式的成像可以用于测量来源于报道分子的信号。本领域普通技术人员已知的任何2种或更多种成像模式可以应用于本发明以测量来源于报道分子的信号。
成像模式在包括诊断有效量化合物的组合物施用之时或之后的任何时候进行，所述化合物包括与2种成像部分缀合的寡糖。例如，成像研究可以在本发明的双重成像化合物施用之时，或在其后任何时候进行。在某些实施方案中，第一种成像模式与双重成像剂施用同时开始、或双重成像剂施用后约1秒、1小时、1天或任何更长的时间段，或任何这些指定时间之间的任何时候进行。在本发明的某些实施方案中，第二种成像模式可以与第一种成像模式同时，或在第一种成像模式后的任何时候进行。例如，第二种成像模式可以在第一种成像模式完成后约1秒、约1小时、约1天或任何更长的时间段，或任何这些指定时间之间的任何时候进行。本领域普通技术人员将熟悉本发明考虑的各种成像模式的执行。此外，本领域普通技术人员将熟悉利用使用超过一种成像模式的成像方法的成像设备和成像技术。
例子包括但不限于，CT和MRI、CT和PET、CT和SPECT、CT和超声、CT和光学成像等等。
3.配体
配体在本文中指结合另一种化学实体以形成较大复合物的离子、分子、或分子基团。在本发明的上下文中，配体是结合报道分子或附着至报道分子序列的氨基酸序列(例如，融合至报道分子氨基酸序列的N末端或C末端的蛋白质标签)以形成较大复合物的离子、分子、或分子基团。本领域普通技术人员已知的任何配体考虑在本发明的背景中用作配体。在本发明的某些实施方案中，配体可以与待成像的细胞接触。配体可以经由细胞内化或不内化。当报道分子已定位于细胞表面时，在这些实施方案中，配体可以与报道分子结合或缔合。本发明考虑了配体与报道分子结合的任何方法。在某些其他实施方案中，配体可以经由细胞内化，并且与细胞内的报道分子结合或缔合。
配体可以是具有特性的分子或分子的一部分，该特性使得它能够产生可以被检测的信号。可以应用本领域普通技术人员已知的任何成像模式以使配体成像。在某些实施方案中，配体能够结合可以进行成像的分子或分子的一部分。例如，配体能够结合放射性核素，并且放射性核素可以使用本领域普通技术人员已知的核医学技术进行成像。例如，配体可以是111-In-奥曲肽。在其他实施方案中，例如，配体能够结合可以使用本领域普通技术人员众所周知的成像技术进行检测的对比剂。例如，配体能够结合CT对比剂或MRI对比剂。
在本发明的某些实施方案中，配体可以结合报道分子，并且配体产生可以使用本领域普通技术人员已知的成像模式进行测量的信号。在其他实施方案中，配体可以结合与报道分子融合的蛋白质标签。因此，例如，成像可以涉及测量来自配体的信号，并且这又为报道分子序列在细胞或受试者内的定位提供信息。
4.放射成像和用于在成像中使用的放射性核素
“放射成像”在本文中指在信号测量中涉及放射性核酸或价金属离子(valent metal ion)应用的任何成像。各种价金属离子或放射性核素已知对于放射成像有用。例子包括但不限于67Ga、68Ga、99mTc、111In、123I、125I、131I、169Yb、60Cu、61Cu、64Cu、62Cu、201T1、72A和157Gd。
对于在人中的最佳放射成像必须考虑多种因素。为了最大化检测功效，发射100-200keV范围内的γ能量的价金属离子是优选的。“γ发射体”在本文中限定为发射任何范围的γ能量的试剂。本领域普通技术人员将熟悉其是γ发射体的各种价金属离子。为了最小化患者吸收的辐射剂量，放射性核素的物理半衰期应当尽量短至成像操作允许的程度。为了允许在任何一天以及当天的任何时间进行检查，在临床场所始终有可用的放射性核素来源是有利的。99mTc是优选的放射性核素，因为它发射140keV的γ辐射，它具有6小时的物理半衰期，并且它使用钼-99/锝-99m发生器在现场容易获得。本领域普通技术人员将熟悉在人中测定最佳放射成像的方法。
在本发明的组合物的某些实施方案中，其是治疗性金属离子但不是β发射体或γ发射体的价金属离子可以结合配体或报道分子氨基酸序列。例如，治疗性金属离子可以是铂、钴、铜、砷、硒和铊。包括这些治疗性金属离子的化合物可以应用于本发明的方法中用于过度增生性疾病的治疗，例如癌症的治疗。
在本发明的某些实施方案中，用于在本发明的成像方法中使用的核酸编码可以在体内进行放射标记的氨基酸序列。编码的报道分子序列的放射标记可以是直接的，或者它可以是间接的，例如通过放射标记可以结合蛋白质标签或报道分子序列的配体。本发明提供的放射标记的试剂、化合物和组合物具有合适量的放射性。例如，在99mTc放射性复合物的形成中，一般优选在包含浓度约0.01毫居里(mCi)-约300mCi/mL的放射性的溶液中形成放射性复合物。
一旦编码的序列已放射标记，它就可以进行成像用于显现位点，例如哺乳动物体内的肿瘤。依据本发明，放射标记通过本领域普通技术人员已知的任何方法施用。例如，施用可以是单个单位的可注射剂量，作为放射标记的配体施用。可以利用本领域技术人员已知的任何常用运载体，例如无菌盐水溶液或血浆。一般地，待施用的单位剂量具有约0.01mCi-约300mCi的放射性，优选10mCi-约200mCi。待注射的单位剂量的溶液为约0.01mL-约10mL。
放射标记的反应物静脉内施用后，需要时，体内器官或肿瘤的成像可以在放射标记的反应物引入患者后数小时或甚至更长时间内发生。在大多数情况下，足够量的施用剂量将在1小时的约0.1内积聚在待成像的区域内。
如上所述，成像可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行。例子包括PET、SPECT和γ闪烁扫描法。在γ闪烁扫描法中，放射标记是γ-辐射发射的放射性核素并且放射性示踪剂使用γ-辐射检测照相机进行定位(这种方法通常称为γ闪烁扫描法)。成像位点是可检测的，因为放射性示踪剂选择定位在病理位点(称为正反差)，或可替代地，放射性示踪剂特别选择不定位在此类病理位点(称为负反差)。
5.成像同时递送基因的方法
本发明的某些实施方案涉及同时施用基因，其中基因与编码报道分子氨基酸序列的核酸可操作地偶联。例如，基因可以是治疗基因。治疗基因在本说明书的其他地方详细讨论。治疗基因可以为了任何目的施用，例如治疗酶病症、治疗激素缺乏或治疗癌症。
因此，例如，在给受试者施用基因后本发明的成像方法可以应用于同时测量基因例如治疗基因的生物分布。此外，成像方法还可同时应用为测量受试者中针对施用的治疗基因的应答的方法。如上所述的成像方法可以用于定位受试者组织内基因的存在，例如肿瘤内的定位。因此，成像方法可以用于测定肿瘤内的肿瘤细胞存活力，并且可以在治疗基因施用后应用于跟踪针对治疗的应答。
C.用于将核酸递送到细胞内的递送媒介物
本发明的某些实施方案一般涉及包括本文所述的一种或多种新型启动子以及用于将启动子序列递送到受试者的细胞内的递送媒介物的组合物。本领域普通技术人员将了解用于递送核酸的递送媒介物的使用，因为这些实验方法是本领域众所周知的。
本领域普通技术人员已知的任何递送媒介物考虑在本发明中用作递送媒介物。例如，递送媒介物可以包括质粒、病毒载体、脂质、原核细胞或真核细胞。
1.病毒载体
在本发明的某些实施方案中，递送媒介物是病毒载体。使用“病毒载体”将核酸递送到细胞内的技术是本领域众所周知的。病毒载体包括包含病毒序列的那些构建体，所述病毒序列足以(a)支持表达盒的包装和(b)最终表达在其中已克隆的重组基因构建体。
本领域普通技术人员已知的任何病毒载体考虑在本发明中作为递送媒介物。例如，病毒载体可以是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、或痘病毒载体。
在某些实施方案中，递送媒介物是腺病毒载体。尽管腺病毒载体已知整合到基因组DNA中的能力很低，但这个特性通过经由这些载体提供的高效率的基因转移弥补。
腺病毒目前是在临床环境中用于基因转移的最常用载体。这些病毒的优点是它们有效地将基因递送至不分裂和分裂细胞并且可以大量生产。载体包括遗传改造形式的腺病毒。腺病毒的遗传结构的了解(36kb线性双链DNA病毒)允许用高达7kb的外源序列取代大片段腺病毒DNA(Grunhaus等人，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以游离体形式复制而无潜在的遗传毒性。同样，腺病毒在结构上是稳定的，并且在广泛扩增后仍未检测到基因组重排。
腺病毒特别适合于用作基因转移载体，因为其中等大小的基因组、易于操纵、高滴度、广泛的靶细胞范围和高传染性。本领域普通技术人员将熟悉使用腺病毒载体的实验方法。
腺病毒载体可以是复制缺陷的，或至少有条件地缺陷，并且腺病毒载体的性质被认为对于本发明的成功实践不是关键的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或A-F亚群中的任何一种。C亚群的5型腺病毒是优选的起始材料以便获得用于在本发明中使用的条件复制缺陷的腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，关于其已知大量生物化学和遗传信息，并且在历史上已使用采用腺病毒作为载体的大多数构建体。
腺病毒的生长和操纵是本领域技术人员已知的，并且在体外和体内显示出广宿主范围。这群病毒可以以高滴度例如109-1011噬菌斑形成单位/ml获得，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外源基因是游离的，并且因此对宿主细胞具有低遗传毒性。在使用野生型腺病毒的疫苗接种研究中未报道副作用(Couch等人，1963；Top等人，1971)，证实其作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。
逆转录病毒是一群单链RNA病毒，其特征在于在感染细胞中通过逆转录过程将其RNA转换为双链DNA的能力(Coffin，1990)。所得到的DNA随后作为前病毒稳定整合到细胞染色体中并指导病毒蛋白质的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其后代中。逆转录病毒基因组包含分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的3个基因，即gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列包含用于将基因组包装到病毒体内的信号。在病毒基因组5’和3’末端存在2个长末端重复(LTR)序列。这些包含强启动子和增强子序列并且也是在宿主细胞基因组中整合所需的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，编码目的基因的核酸插入到病毒基因组内某些病毒序列的位置中以产生复制缺陷的病毒。本领域普通技术人员将熟悉可用于构建逆转录病毒载体的众所周知的技术。
腺伴随病毒(AAV)是用于在本发明中使用的吸引人的病毒系统，因为它具有高频率的整合并且它可以感染不分裂的细胞，从而使得它能够用于将基因递送到组织培养物中的哺乳动物细胞内(Muzyczka，1992)。AAV具有关于传染性的广宿主范围(Tratschin，等人，1984；Laughlin，等人，1986；Lebkowski，等人，1988；McLaughlin，等人，1988)，这意味着它可应用于本发明。关于rAAV载体的产生和使用的细节在美国专利5,139,941和4,797,368中描述，所述专利各自引入本文作为参考。
AAV是依赖性细小病毒，因为它需要与另一种病毒(腺病毒或疱疹病毒家族成员)一起同时感染以进行培养细胞中的有效感染(Muzyczka，1992)。在不存在与辅助病毒一起同时感染的情况下，野生型AAV基因组通过其末端整合到人染色体19内，在其中它作为前病毒以潜伏状态存在(Kotin等人，1990；Samulski等人，1991)。然而，rAAV不限制于仅整合染色体19除非还表达AAV Rep蛋白质(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV前病毒的细胞再度感染辅助病毒时，AAV基因组从染色体或重组质粒中“援救”出来，并且建立正常的有效感染(Samu1ski等人，1989；McLaughlin等人，1988；Kotin等人，1990；Muzyczka，1992)。
一般地，重组AAV(rAAV)通过共转染包含侧面与2个AAV末端重复序列相接的目的基因的质粒(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；各自引入本文作为参考)和包含不含末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒例如pIM45(McCarty等人，1991；引入本文作为参考)来制备。本领域普通技术人员将熟悉可使用AAV病毒用于产生载体的技术。
单纯疱疹病毒(HSV)由于其对神经细胞的趋向性已在神经系统病症治疗中产生相当大的利益，但考虑到其广泛的宿主范围这种载体还可以用于其他组织。使得HSV成为吸引人的载体的另一个因素是基因组的大小和结构。因为HSV很大，所以多个基因或表达盒的掺入比其他较小的病毒系统中问题更小。此外，具有各种性能(时间、强度等)的不同病毒控制序列的可得性使得能以比其他系统更大的程度控制表达。该病毒具有相对少的剪接信息，进一步方便基因操纵，这也是个优点。
HSV还相对容易操纵并且可以生长至高滴度。因此，在达到足够MO I需要的体积和重复给药的需要减少方面，递送的问题较少。关于HSV作为基因治疗载体的综述，参见Glorioso等人(1995)。本领域普通技术人员将熟悉用于使用HSV作为载体的众所周知的技术。
痘苗病毒载体已广泛地使用，因为其容易构建、获得相对高的表达水平、广泛的宿主范围和携带大容量的DNA。痘苗病毒包含约186kb的线性双链DNA基因组，其显示出显著的“A-T”偏爱。约10.5 kb的反向末端重复序列侧面与基因组相接。大多数必需基因看起来定位在中央区内，所述中央区在痘病毒中是最高度保守的。痘苗病毒中的估计的开放读码框编号从150到200。尽管2条链都编码，但广泛的读码框重叠并不常见。
其他病毒载体可以在本发明中用作构建体。例如，可以使用来源于病毒例如痘病毒的载体。委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的分子克隆株已遗传改进为用于表达异源病毒蛋白质的能复制的疫苗载体(Davis等人，1996)。研究已证实VEE感染刺激有效的CTL应答并且已提出VEE可能是用于免疫接种的非常有用的载体(Caley等人，1997)。本发明预期VEE病毒可能在树突细胞靶向中有用。
多核苷酸可以置于已改造为表达特异性结合配体的病毒载体内。病毒颗粒因此将特异性结合靶细胞的相关受体并将内含物递送至细胞。基于逆转录病毒的化学修饰通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜发展了设计为允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新型方法。这种修饰可以允许经由唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
设计重组逆转录病毒靶向的另一种方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特异性细胞受体的生物素化抗体。抗体经由生物素组分通过使用链霉亲和素进行偶联(Roux等人，1989)。使用针对主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，他们证实了使用亲嗜性病毒体外感染具有那些表面抗原的各种人细胞(Roux等人，1989)。
溶瘤病毒也考虑在本发明中作为载体。溶瘤病毒在本文中一般指与它们杀死正常细胞相比较，更能杀死肿瘤或癌细胞的病毒。示例性溶瘤病毒包括过度表达ADP的腺病毒。ADP的过度表达可以限定为与来自表达野生型ADP水平的病毒的ADP表达比较，ADP表达中的任何增加。这些病毒在美国专利申请公开号20040213764、美国专利申请公开号20020028785和美国专利申请序列号09/351,778中详细讨论，所述专利各自特别整体引入本申请的这个部分以及本申请的所有其他部分作为参考。
可以在本发明中用作载体的其他病毒载体包括可以应用于疫苗、或双重疫苗和免疫治疗应用的那些病毒载体。病毒载体、以及使用病毒载体用于疫苗接种和免疫治疗的技术在PCT申请WO0333029、WO0208436、WO0231168和WO0285287中更详细地描述，所述PCT申请各自特别整体引入本申请的这个部分以及本申请的所有其他部分作为参考。可以在用于疫苗接种和双重免疫治疗/疫苗接种的技术中应用的另外的载体包括上文所述的那些溶瘤病毒。
其他病毒载体还包括杆状病毒载体、细小病毒载体、小核糖核酸病毒载体、α病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体。可以采用来源于病毒例如痘病毒的载体。委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的分子克隆株已遗传改进为用于表达异源病毒蛋白质的能复制的疫苗载体(Davis等人，1996)。研究已证实VEE感染刺激有效的CTL应答并且已提出VEE可能是用于免疫接种的非常有用的载体(Caley等人，1997)。本发明中考虑VEE病毒可能在树突细胞靶向中有用。
2.非病毒载体
本发明还考虑了可以应用于将核酸例如启动子转移到细胞内的任何非病毒递送媒介物。本领域普通技术人员将熟悉可用的非病毒递送媒介物的范围。
在某些实施方案中，待递送到细胞内的核酸包括在质粒中。本领域普通技术人员将熟悉可以作为用于将目的核酸序列递送到细胞内的试剂的质粒。
在某些其他实施方案中，待递送到细胞内的核酸包括在细胞中。本领域普通技术人员已知的任何细胞类型考虑作为核酸的递送。例如，细胞可以是原核细胞或真核细胞。
本发明考虑了用于将核酸递送到细胞内的任何方法。这些方法包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)、直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)、装载DNA的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979)和lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等人，1987)、使用高速微粒的基因轰击(Yang等人，1990)、聚阳离子(Bousssif等人，1995)以及受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可以成功适应于体内或离体使用。本领域技术人员将熟悉涉及使用非病毒载体的技术，并且将理解本发明还考虑了除本文公开的那些以外的其他类型的非病毒载体。
在本发明的一个进一步的实施方案中，表达盒可以在脂质体或脂质制剂中。脂质体是特征为磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液中时它们自发地形成。在脂质双层之间形成闭合结构以及包封水和溶解的溶质之前磷脂组分经历自身重排(Ghosh和Ba chhawat，1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)复合的基因构建体。本领域普通技术人员将熟悉利用脂质体和脂质制剂的技术。
基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因治疗的可替代方法。尽管许多细胞培养研究已描述了基于脂质的非病毒基因转移，但经由基于脂质的制剂的全身性基因递送已受到限制。基于非病毒脂质的基因递送的主要局限性是包括非病毒递送媒介物的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分解释了体外和体内基因转移结果之间的差异。促成这种矛盾数据的另一个因素是在血清蛋白的存在和缺乏下脂质体稳定性的差别。脂质体和血清蛋白之间的相互作用对脂质体的稳定性特征具有显著的影响(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质体吸引并结合带负电荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂质体被溶解或被巨噬细胞吸收，导致其从循环中去除。目前的体内脂质体递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射以避免在循环中与阳离子脂质有关的毒性和稳定性问题。脂质体与血浆蛋白的相互作用促成体外(Felgner等人，1987)和体内基因转移(Zhu等人，1993；Solodin等人，1995；Thierry等人，1995；Tsukamoto等人，1995；Aksentijevich等人，1996)效率之间的不一致。
脂质制剂的生产通常通过超声处理或在(I)反相蒸发法(II)脱水-再水合(III)去污剂透析和(IV)薄层水合后连续挤出脂质体混合物完成。一旦制备了，脂质结构就可以用于封装在循环中时是有毒的(化学治疗)或不稳定的(核酸)化合物。脂质体封装已导致对于此类化合物的更低的毒性和更长的血清半衰期(Gabizon等人，1990)。众多疾病治疗使用基于脂质的基因转移策略以增强常规治疗或建立新型治疗，特别是用于治疗过度增生性疾病。
在本发明的某些实施方案中，递送媒介物包括DOTAP：胆固醇纳米颗粒。DOTAP：胆固醇纳米颗粒在特别引入本文作为参考的Templeton等人，1997中更详细地讨论。
D.过度增生性疾病的治疗和预防
1.过度增生性疾病
本发明考虑了通过施用药学有效量的包括本文所述的任何启动子序列的组合物预防、抑制或治疗受试者中的过度增生性疾病的方法。包括本文所述的任何启动子序列的任何核酸序列考虑包括在本文所述的药物组合物中，所述核酸序列可以为了预防、抑制或治疗疾病的目的应用或施用于受试者。
疾病可以是影响受试者的任何疾病，其将适于经由给受试者施用核酸序列的治疗或预防。例如，疾病可以是过度增生性疾病。过度增生性疾病是伴随细胞的异常生长或增多的疾病。过度增生性疾病可以是在受试者中表现为病变的疾病。示例性高度增生性病变包括癌前病变、癌症和肿瘤。
待治疗的疾病的其他例子包括传染病和炎性疾病例如自身免疫性疾病。本发明的方法和组合物可以应用于递送可以在疾病的免疫治疗或免疫预防中应用的抗原。本领域普通技术人员将熟悉适于使用本文所述的药物组合物和方法预防或治疗的多种疾病实体。
2.确定的生长抑制
本文所述方法的某些实施方案涉及抑制受试者中的过度增生性疾病的生长的方法。高度增生性病变的“生长抑制”被广泛定义并且包括例如减慢或停止病变的生长。抑制病变生长还可包括减少病变的大小或诱导病变细胞凋亡。诱导凋亡指其中药物、毒素、化合物、组合物或生物学实体在细胞上给予凋亡、或程序性细胞死亡的情况。在一个具体实施方案中，细胞是肿瘤细胞。病变的生长还可以通过诱导针对病变细胞的免疫应答来抑制。
E.药物组合物
本发明的药物组合物包括治疗或诊断有效量的核酸，所述核酸包括本文所述的一种或多种新型启动子序列。短语“药学或药理学可接受的”或“治疗有效的”或“诊断有效的”指当施用于动物例如人时不会产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如通过引入本文作为参考的Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990所例示的，治疗有效或诊断有效的组合物的制备按照本公开内容将是本领域技术人员已知的。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解制剂应当符合如FDA生物标准办公室要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文使用的，“包括治疗有效量的……的组合物”或“包括诊断有效量的……的组合物”包括如本领域普通技术人员已知的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、象这样的材料及其组合。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在本组合物中的使用。
本发明的组合物可以包括不同类型的载体，取决于它是否以固体、液体或气雾形式施用，以及它对于此类施用途径如注射是否必须是无菌的。本发明的双重成像剂和双重治疗剂可以如本领域普通技术人员已知的静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、泡内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口腔、表面、局部地、注射、输注、连续输注、直接局部灌注靶细胞、经由导管、经由灌洗、在脂质组合物(例如脂质体)中、或通过其他方法或前述的任何组合施用。
施用于患者的本发明组合物的实际需要量可以通过身体和生理学因素例如体重、病症严重度、待治疗的疾病类型、以前或同时进行的治疗干预、患者的特发病和施用途径来确定。在任何情况下负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度以及对于受试者个体的合适剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包括例如至少约0.1％双重成像剂或双重治疗剂。在其他实施方案中，活性化合物可以占约2％-约75％单位重量，或例如约25％-约60％，以及在其中可引出的任何范围。在其他非限制性例子中，剂量还可以包括每次施用约0.1mg/kg/体重-约1000mg/kg/体重或这个范围内的任何量，或大于1000mg/kg/体重的任何量。
在任何情况下，组合物可以包括各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，微生物活动的预防可以通过防腐剂例如各种抗菌剂和抗真菌剂产生，包括但不限于对羟苯甲酸酯(例如对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
本发明的组合物可以以游离碱、中性或盐形式进行配制。药学可接受的盐包括与来源于无机碱例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或此类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的游离羧基形成的盐。
在其中组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂、或分散介质，包括但不限于，水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。合适的流动性可以通过下列维持：例如通过使用涂层例如卵磷脂；通过分散在载体例如液态多元醇或脂质中维持所需颗粒大小；通过使用表面活性剂例如羟丙基纤维素；或此类方法的组合。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖、氯化钠或其组合。
无菌可注射的溶液通过在所需量的合适溶剂中掺入放射标记的亚乙双半胱氨酸(ethylenedicysteine)衍生物与各种量的上文列举的其他成分，需要时，随后过滤灭菌来制备。一般地，分散系通过将各种灭菌活性成分掺入包含基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其产生来自其先前过滤除菌的液体介质的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。必要时液体介质应当适当缓冲并且液体稀释剂在用足够的盐水或葡萄糖注射之前首先给予等渗。还考虑了用于直接注射的高度浓缩的组合物的制备，其中设想使用DMSO作为溶剂以产生非常快速的渗透，将高浓度的活性剂递送至小区域。
组合物在制造和贮藏条件下必须是稳定的，并且针对微生物例如细菌和真菌的污染活动进行防腐。应当理解内毒素污染应当最低限度地维持在安全水平，例如少于0.5ng/mg蛋白质。
在具体实施方案中，可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝、明胶或其组合产生。
F.细胞和细胞类型
本发明的某些实施方案一般涉及将基因递送到细胞内的方法，涉及制备包括与本文所述新型启动子之一可操作地偶联的基因的组合物，并且使组合物与细胞接触，其中接触导致基因递送到细胞内。本发明的其他方面一般涉及使细胞成像的方法，其涉及使细胞与包括本文所述的一种或多种新型启动子的组合物接触，其中启动子与报道分子氨基酸序列可操作地偶联，并且通过测量来源于报道分子的信号检测报道分子序列的细胞表达。
本领域普通技术人员已知的任何细胞类型考虑作为包括在本发明的方法中的细胞。例如，细胞可以是正常的健康细胞。可替代地，细胞可以是患病细胞。例如，疾病可以是过度增生性疾病，例如癌症。细胞可以是任何组织类型。例如，细胞可以是乳腺癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、肝癌细胞、子宫颈癌细胞、结肠癌细胞、肾癌细胞、皮肤癌细胞、头与颈癌细胞、骨癌细胞、食管癌细胞、膀胱癌细胞、子宫癌细胞、淋巴癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、睾丸癌细胞、淋巴瘤细胞或白血病细胞。
G.第二种抗癌治疗
本发明的一个方面是所要求的用于治疗过度增生性疾病的方法可以与另一种试剂或治疗方法优选另一种癌症治疗组合使用。使用所要求的双重治疗剂的治疗可以在其他治疗方法之前或之后，间隔为数分钟至数周。在其中施用另一种试剂的实施方案中，一般将确定显著的时间段在每次递送时间之间不期满，从而使得试剂将仍能对细胞发挥有利的组合效应。例如，考虑可以与本发明的双重治疗剂基本上同时施用(即，在少于约1分钟内)一种试剂的2、3、4或更多次剂量。在其他方面，治疗剂或方法可以在本发明的双重治疗剂施用之前和/或之后约1分钟至约48小时或更多时间内，或在本文未列出的任何时间量之前和/或之后施用。在某些其他实施方案中，本发明的双重治疗剂可以在另一种治疗形式例如手术或基因治疗施用之前和/或之后约1天至约2 1天内施用。然而，在某些情况下，可能希望将用于治疗的时间段显著延长，其中在各施用之间经过数周(例如约1-8周或更多)。
可以采用各种组合，所要求的用于双重化学治疗和放射治疗的试剂是“A”，并且可以是任何其他治疗剂或方法的第二种试剂是“B”：A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
考虑到这些试剂的毒性(如果有)，本发明的双重治疗剂对患者的施用将遵循用于施用化学治疗的一般规程。预期必要时可以重复治疗循环。还考虑了各种标准治疗以及手术干预可以与所述砷剂组合应用。这些治疗包括但不限于另外的化学治疗、另外的放射治疗、免疫治疗、基因治疗和手术。
a.化学治疗
癌症治疗还包括伴随基于化学和放射的处理的各种组合治疗。组合治疗包括但不限于，例如顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉酚、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤、或前述的任何类似物或衍生变体。
b.放射治疗
引起DNA损害并且已广泛使用的其他因素包括通常称为γ-射线、X-射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。也考虑了其他形式的DNA损害因素例如微波和UV-照射。最可能的是所有这些因素对DNA、对DNA前体、对DNA的复制和修复、以及对染色体的装配和维持引起广泛范围的损害。X-射线的剂量范围从用于延长的时间段(3-4周)的50-200伦琴的日剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。关于放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型、以及经由赘生细胞的摄取。术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时在本文中用于描述治疗构建体和化学治疗或放射治疗剂借以递送至靶细胞或与靶细胞直接并排放置的过程。为了达到细胞杀死或停滞，2种试剂以有效杀死细胞或预防其分裂的组合量递送至细胞。
c.免疫治疗
免疫治疗一般依赖于免疫效应细胞和分子的使用以靶向并破坏癌细胞。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标记特异的抗体。抗体单独可以充当治疗的效应子或者它可以招募其他细胞以实际上实现细胞杀死。抗体还可以缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射核苷酸(radionucleotide)、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且只充当靶向剂。可替代地，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，其与肿瘤细胞靶直接或间接地相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此免疫治疗可以用作组合治疗的一部分，可与基因治疗结合。关于组合治疗的一般方法在下文讨论。一般地，肿瘤细胞必须具有适于靶向的某些标记，即，在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标记并且这些中的任何一种可以适合于本发明背景中的靶向。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿器官的肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。
d.基因
在再一实施方案中，第二种治疗是第二种基因治疗，其中治疗性多核苷酸在本发明的核酸组合物之前、之后或同时施用。双重治疗剂与编码基因产物的载体结合递送将对靶组织具有组合的抗过度增生性效应。
e.手术
大约60％患有癌症的人将经历某一类型的手术，这包括预防、诊断或分级、治愈和姑息性手术。治愈性手术是可以与其他治疗结合的癌症治疗，所述其他治疗例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗。治愈性手术包括切除术，其中所有或部分癌性组织被从身体上去除、切除和/或破坏。肿瘤切除术指身体去除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制的手术(莫氏手术)。进一步考虑的是本发明可以与浅表癌、初期癌或附带量的正常组织的去除结合使用。
H.实施例
包括下列实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下面实施例中公开的技术由本发明人发现在本发明实践中运行良好，并且因此可以被视为构成用于其实践的优选模式。然而，依照本公开内容本领域技术人员应当理解无需远离本发明的精神和范围可以在公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍获得同样或类似结果。
实施例1
新型HTERT-mini-CMV(hTMC)启动子介导的报道分子和肿瘤抑制基因 的肿瘤选择性和高效率表达用于分子癌症治疗
1.hTMC启动子的构建
某些新型嵌合启动子包括hTERT-mini-CMV(hTMC)启动子已通过将基本hTERT启动子序列与最小CMV启动子元件最佳融合进行改造。使用PCR扩增463bp的hTERT调节区以及来自CMV启动子的147bp的最小TATA盒和转录起始区。杂合的hTERT和CMV启动子通过测试各种组合及其在肿瘤选择性以及正常和肿瘤细胞转染株中的转录促进强度方面的性能进行最优化。如本文使用hTMC-EGFP报道分子系统在体内证实的，使用这种优化的新型hTMC启动子已在体外和体内达到高肿瘤特异性和高转基因表达。
2.包含hTMC的质粒载体的构建
a.pLJ143/KGB2/FUS1。这种pLJ143/KGB2/FUS1质粒载体(图1)由经由CMV最小启动子驱动、在3’末端具有E1增强子并在5’末端具有BGH-多聚A信号序列的哺乳动物基因表达盒组成，以确保转基因在体内有效表达。选择卡那霉素抗性基因作为选择标记以避免在患者中发展抗生素抗性。使用最小的pMB1复制起点(ori)序列驱动质粒在细菌宿主株DH5a中的高拷贝复制和生产。质粒主链是最小的以确保更高产量的质粒DNA生产和更高浓度的重组质粒DNA/质粒DNA制剂。pLJ143/KGB2/FUS1载体的DNA序列已通过DNA自动测序证实并已被FDA批准用于I期临床试验(人基因转移方案#0201-513)。这种质粒用作构建一系列包含hTMC的质粒载体的主链，用于肿瘤选择性表达报道基因和肿瘤抑制基因，在临床前和临床应用中用于分子癌症治疗和非侵入性成像。
b.pLJ280/KGB2/EV。pLJ280/KGB2/EV质粒载体(图2)是起源于pLJ143/KGB2/FUS1载体的空(EV)质粒载体，其包含除了FUS1基因插入片段以外的所有原始序列元件。通过用PstI限制性消化去除pLJ143质粒载体中的413bp FUS1片段并将剩余质粒序列再连接以形成空载体。
c.pLJ331/dCpG-KGB2/FUS1。pLJ331/dCpG-KGB2/FUS1载体(图3)包含相同的质粒DNA主链，除了卡那霉素抗性基因已由其中99密码子(G或C)已改变为(A或T)的合成卡那霉素基因代替。这种合成卡那霉素基因允许完全减少原始DNA序列中潜在形成的CpG岛，但仍保留了使用卡那霉素抗生素在细菌培养物中选择重组质粒载体的能力。去CpG化质粒在体内具有更少免疫原性，并因此通过全身施用质粒：DOTAP：胆固醇纳米颗粒在临床前和临床应用中更少毒性。
d.pLJ336/dCPG-KGB2/hTMC-FUS1。pLJ331/dCpG-KGB2/hTMC-FUS1载体(图4)来源于pLJ331，其中常规CMV启动子由hTMC启动子代替。这种载体允许新型3p21.3肿瘤抑制基因FUS 1的肿瘤选择性和高效率表达，以在临床前模型和临床试验中用于分子癌症治疗。
e.pLJ284/pKGB2/hTMC-EV。pLJ284/pKGB2/hTMC-EV质粒载体(图5)来源于pLJ280，其中CMV启动子由hTMC启动子代替。这种载体在体外和体内用作阴性对照。
f.pLJ286/pKGB2/hTMC-EGFP。pLJ286/pKGB2/hTMC-EGFP质粒载体(图6)包含hTMC启动子驱动的真核绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒。这种EGFP用作报道基因通过荧光成像分析或通过免疫组织化学分析使用抗-EGFP抗体在细胞裂解物和组织切片中用于体外和体内评估hTMC启动子驱动的EGFP肿瘤选择性表达、载体转染率、和EGFP的生物分布。
g.pLJ293/pKGB2/EGFP。pLJ293/pKGB2/EGFP质粒载体(图7)包含原始的非选择性CMV启动子，用作对照载体用于在体外和体内与hTMC-EGFP载体比较EGFP的肿瘤选择性表达。
h.pLJ287/pKGB2/hTERT-EGFP。pLJ287/pKGB2/hTERT-EGFP质粒载体(图8)包含原始hTERT启动子(具有非常微弱的转录促进强度在哺乳动物细胞中肿瘤选择性表达)用作对照载体用于在体外和体内与hTERT-mini-CMV杂合物、hTMC-EGFP载体比较EGFP的高效率表达。
i.pLJ296/KGB2/SSRT2A。pLJ296/KGB2/SSRT2A质粒载体(图9)具有与pLJ143完全相同的DNA主链序列，除了在pLJ143质粒载体中包含转基因FUS1的413bp片段由SSRT2A cDNA插入片段(1110bp)加上包含T7启动子序列、VJ2C-SP和HA N末端融合标签的另外DNA片段(224bp)代替，所述T7启动子序列、VJ2C-SP和融合标签对于SSRT2A的有效表达和检测是必需的。这种载体可以用作载体通过γ照相机成像(GCI)与111In-奥曲肽在动物模型和人临床试验中用于整体成像的非侵入性分子成像。
j.pLJ346/KGB2/hTMC-SSRT2A。pLJ346/KGB2/hTMC-SSRT2A质粒载体(图10)来源于pLJ296，其中CMV启动子由hTMC启动子代替用于驱动SSRT2A报道基因在体内肿瘤特异性表达。这种载体将允许SSRT2A的肿瘤特异性成像并显著减少体内GCI图像的背景。
k.pLJ294/hTMC-FUS1-IRES-SSTR2A。为了克服hERT启动子的局限性并增加转基因表达并增强通过γ照相机成像与111In-奥曲肽-SSRT2A系统转基因体内表达的肿瘤特异性成像，已开发了新型质粒载体pLJ294/hTMC-SSRT2A-IRES-FUS1载体(图11)，其中hTMC启动子将选择性地只在肿瘤细胞中驱动高水平的基因表达，而IRES元件将使得2种单独的基因(报道分子SSRT2A和治疗基因FUS1)能够以相等的水平同时表达，这从而允许测量治疗性FUS1基因与报道分子SSTRT2A基因的体内表达而不干扰FUS1的正常功能和定量表达。这种载体将允许在临床前和临床试验中通过全身施用重组质粒DNA:DOTAP：胆固醇纳米颗粒通过GCI与111In-奥曲肽-SSRT2A报道分子系统非侵入性监控癌症治疗基因例如FUS1的生物分布、转基因的表达和清除、以及在肿瘤中的治疗效果。
1.pLJ290/pKGB2/FUS1-IRES-SSTR2A。pLJ290/pKGB2/SSTR2A质粒载体(图12)包含与pLJ294载体中类似的质粒DNA主链和FUS1-IRES-SSTR2A组分，除了启动子是常规的CMV而不是hTMC启动子以外。这种载体可以用作对照载体用于与包含hTMC的pLJ294载体体内比较。
m.pLJ340/pKGB2/hTMC-Luc。pLJ340/pKGB2/hTMC-Luc质粒载体(图13)包含hTMC启动子驱动的萤火虫萤光素酶(Luc)表达盒。这种新型载体允许使用Luc作为方便的报道分子以执行非侵入性成像，用于在小动物模型中通过化学发光照相机监控肿瘤特异性的转基因表达和生物分布。
n.pLJ341/pKGB2/hTMC/FU1-IRES-Luc。pLJ341/pKGB2/hTMC/FU1-IRES-Luc载体(图14)来源于pLJ294/hTMC-FUS1-IRES-SSTR2A，其中SSTR2A报道基因由Luc报道基因代替。hTMC启动子将选择性地只在肿瘤细胞中驱动高水平的基因表达，而IRES元件将使得2种单独的基因(报道分子Luc和治疗基因FUS1)能够以相等的水平同时表达，并且从而允许使用化学发光照相机在临床前模型中测量治疗性FUS1基因与报道分子Luc基因的体内表达而不干扰FUS1的正常功能和定量表达。这种载体将允许在临床前试验中通过全身施用重组质粒DNA:DOTAP：胆固醇纳米颗粒非侵入性监控癌症治疗基因例如FUS1的生物分布、转基因的表达和清除、以及在肿瘤中的治疗效果。这种载体将不需要使用放射性材料并且将是临床前小动物模型中用于癌症治疗基因非侵入性和肿瘤特异性分子成像的高度灵敏性、方便和安全的工具。
3.在体外由hTMV启动子驱动的肿瘤特异性转基因表达。
为了评估在体外由hTMV启动子驱动的转基因表达的肿瘤特异性和效率，使用DOTP体外转染反应物(在本实验室中制备)使用质粒pLJ286/hTMC-EGFP转染各种正常和癌症细胞系。pLJ287/hTERT-EGFP和pLJ293/CMV-EGFP载体用作对照，并且单独的PBS处理用作模拟物。在各种培养的人癌细胞系(H1299、A549、HeLa和293F)、NHFB细胞、正常成纤维细胞(WI-38)和VA-13中通过FACS转染后48小时分析GFP的表达水平来评估由这些启动子介导的EGFP表达活性。在测试的所有癌症细胞系中，在用包含CMV-或hTMC-启动子的载体转染的细胞中观察到高水平的EGFP表达，但在hTERT-EGFP转染的癌细胞中只能检测到痕量水平的EGFP表达(图15A，293F、A549、H1299、Hela组；图15B和图15C)。相反，在用hTMC-EGFP或hTMC-EGFP载体转染的正常细胞HBEC、WI-38和VA-13细胞中不能检测到EGFP表达，即使在用CMV-EGFP载体转染的那些细胞中仍能普遍检测到EGFP表达(图15A，HBEC、WI-38和VA-13组，以及图15B和图15C)。这些结果表明经由hTERT-mini-CMV杂合hTMC启动子介导的转基因的肿瘤特异性和高效率表达。
4.hTMC启动子的体内转录活性
为了研究hTMC启动子诱导的体内转基因表达水平，首先，通过将人N417 SCLC细胞以1×106细胞/小鼠注射到胸间隙内建立人SCLC肿瘤。肿瘤细胞注射后3周，在小鼠的肺和内胸膜中建立实体瘤(平均直径大小为2-5mm)。具有人N417 SCLC肿瘤的动物静脉内注射各种EGFP-阳离子脂质体复合物，其中EGFP表达经由原始CMV和hTERT启动子或hTMC启动子驱动。注射后48小时，杀死动物并收集器官且立即冷冻。新鲜冷冻的组织切片在荧光显微镜下检查EGFP表达。如本文使用hTMC-EGFP报道分子系统在体内证实的，使用这种新型启动子在体外和体内达到高肿瘤特异性和高转基因表达(图16)。高水平的EGFP表达只在用hTMC-EGFP处理的动物的肿瘤细胞中检测到，但在任何其他正常组织中则没有(图16A，hTMC组)。相反，在用TERT-EGFP处理的动物中检测到非常微弱的肿瘤特异性EGFP表达，并且在用CMV-EGFP构建体处理的动物的肿瘤和正常组织中处处检测到非选择性表达。这些结果表明通过hTMC启动子驱动体内基因转录可以达到高水平和肿瘤特异性的转基因表达。此外，这些结果表明通过全身施用包含重组hTMC启动子的质粒载体例如DNA:DOTAP：胆固醇纳米颗粒，这种载体可以用于人原发和转移癌的肿瘤靶向的分子治疗。
5.通过γ照相机成像与111In-奥曲肽-SSRT2 A报道分子系统用于评估治疗基因表达的肿瘤靶向的非侵入性分子成像。
用于监控基因转移的许多体内分子成像方法依赖于γ照相机、SPECT或PET成像用于检测静脉内注射的放射标记的化合物定位于转移基因的产物的灵敏性，但它们中的大多数既不直接检测目的基因也不采用FDA批准用于全身使用的放射性药物。111In-奥曲肽在临床上用于定位主要过度表达生长抑素2型受体(SSTR2A)的肿瘤。通过使用抗-HA抗体的免疫荧光分析已成功检测到用HA-SSTR2A-表达质粒(pHA-SSTA2A)转染的HT1080细胞中SSTR2A产物的细胞表面膜定位。具有由pHA-SSTR2A-转染子产生的HT1080肿瘤的小鼠注射111In-奥曲肽，用于通过γ照相机的生物分布和成像研究(图17B)。SSTR2A表达也显示与受体结合和111In-奥曲肽放射性示踪剂经由肿瘤的摄取显著相关(图17C)。这种方法证实了临床可行性，因为在荷瘤动物中使用111In-奥曲肽检测的基因转移是类似于已在人中使用的那些的剂量，并且还显示它可以直接和非侵入性地监控目的基因的转移。
为了克服hTERT启动子的局限性并增加转基因表达并增强通过γ照相机成像与111In-奥曲肽-SSRT2A系统的转基因体内表达的肿瘤特异性成像，新型质粒载体pLJ294/hTMC-SSRT2A-IRES-FUS1载体将由hTMC启动子选择性地驱动以只在肿瘤细胞中提供高水平的基因表达，而IRES元件将使得2种单独的基因(报道分子SSRT2A和治疗基因FUS1)能够以相等的水平同时表达。这将允许测量治疗性FUS1基因与报道分子SSTRT2A基因的体内表达而不干扰FUS1的正常功能和定量表达。SSTR2A基因(图17C，绿色，细胞表面膜)和FUS1基因(图17C和图17D，红色，线粒体、ER和核周膜定位)的共表达和显著的亚细胞定位通过免疫荧光成像分析(图17D)清楚地证实。这些新型治疗载体与非侵入性和敏感性γ照相机成像以及放射性药物111In-奥曲肽组合将允许有效监控SSTR2A-FUS1-阳离子脂质体复合物-介导的基因转移在小鼠中的分布、清除、表达和效率。
6.通过肿瘤靶向的分子治疗伴随全身施用phTMC-FUS1 DNA DOTAP：胆固醇纳米颗粒和非侵入性磁共振成像(MRI)在裸小鼠中抑制SCLC肿瘤生长
基于局部水环境中的变化的非侵入性检测方法以及获得体积定量信息和区分组织之间的图像强度的能力使得磁共振成像(MRI)成为用于广泛的实验性癌症研究的有力工具。为了通过全身施用phTMC-FUS1DNA:DOTAP：胆固醇纳米颗粒评估肿瘤靶向的分子治疗对人肺原发和转移癌的功效以及非侵入性监控hTMC-介导的体内FUS1基因表达和抗肿瘤效应，在具有人SCLC肿瘤异种移植物的裸小鼠中在胸腔内间隙和肺中进行实验以使用各种MR参数表征肿瘤外观并监控肿瘤生长和用hTMC-FUS1纳米颗粒全身治疗的疗效(图18)。裸小鼠通过将肿瘤细胞(在100 PBS中1×106)直接注射到胸腔内间隙中接种人N417 SCLC细胞。实体瘤异种移植物通常在10-15天内在肺中建立或转移至骨或脑。经由尾静脉注射通过全身施用DOTAP：胆固醇复合的phTMC-FUS1质粒DNA(hTMC-FUS1纳米颗粒)处理之前和之后进行MRI。肿瘤细胞接种后约2周和治疗前进行MRI分析，这清楚地检测到肺中肿瘤的存在(由箭头指出的图18的a、b、i和j)。这些初步结果还清楚地显示使用MRI跟踪肿瘤生长和治疗效果的优点。如通过MRI检测到的增加的肿瘤体积所表明的(图18的c和d)，与治疗前的那些比较(图18的a和b)，在用对照hTMC-EGFP纳米颗粒处理的动物中的肿瘤继续生长，但肿瘤生长被使用hTMC-FUS1纳米颗粒的处理显著抑制(图18，k和1对图18，i和j)。MR图像还用来自冷冻的整只小鼠的肺阻断面(LBF)的完整图像在组织学上验证(图18，g、h、o和p)，所述小鼠是在MRI分析后立即杀死的。肿瘤的定位和大小在MR I和LBF图像中完全匹配。在这些实验中，MRIs与同一动物中通过CT扫描产生的那些图像进行比较(图18，e、f、m和n)。尽管肿瘤在某些动物中可以检测到，但通过CT既不能区分肿瘤与邻近正常组织的分界也不能测量肿瘤的体积。这些数据显示在小动物模型和临床实践中使用非侵入性MRI在hTMC介导的抗肿瘤基因的肿瘤筛选、检测、定量和治疗效果评估中的易接近性和优点。
材料和方法
1.细胞系和细胞培养。人NSCLC细胞系NCI-H1299和A549、SCLC细胞系N417以及子宫颈细胞系Hela、永生化肾细胞293F最初从美国典型培养物保藏中心获得并在我们实验室(M.D.Anderson癌症中心)中维持。正常人支气管上皮细胞系HBEC、正常肺成纤维细胞系WI-38和VA-13购自Clonetics(Clonetics Inc.，Walkersville，MD)并在制造商推荐的培养基中且根据制造商的说明书进行培养。所有细胞在包含5％CO2的增湿大气中于37℃进行培养。
2.转染和体外基因表达分析。FuGene 6反应物(Roche Inc.)或DOTAP(在我们实验室中生产)用于与质粒载体一起体外转染。PBS用作模拟转染。所有转染率在转染后48小时通过报道分子EGFP表达的百分比进行检测。简言之，细胞在启动子转染前1天在6孔板中铺板，在转染时具有60-80％的汇合度。转染后48小时，通过胰蛋白酶消化收获漂浮和粘附细胞，用PBS洗涤，并通过FACS分析定量EGFP的百分比。
3.动物实验。雌性Nu/Nu小鼠，4-6周大，从Charles River(Cambridge，MA)获得。在M.D.Anderson癌症中心关于动物核心实验室建立的机构指导方针下维持所有动物并进行所有动物实验。将在100μl PBS中的1×106 N417细胞/小鼠注射到小鼠的胸腔内间隙中。肿瘤接种后3周，小鼠通过全身施用经由尾静脉使用在100μl DOTAP/胆固醇中的25μg质粒DNA注射表达报道分子或治疗基因的质粒DNA纳米颗粒。注射后2天，处死所有小鼠，并收集肿瘤、肺、肝、脾、肾和脑并冷冻贮存用于进一步的EGFP表达分析。
4.人NSCLC皮下肿瘤异种移植物小鼠模型
关于在nu/nu小鼠中NSCLC A549和H1299皮下肿瘤接种的操作先前已描述(参见Ji等人，2002和Uno等人，2004，其各自特别引入本文作为参考)。简言之，小鼠在注射前一天在350 Rd137Cs下进行照射。将悬浮于100ml PBS中的1×107肿瘤细胞皮下注射到动物中。约10-14天后，实体瘤开始形成。对于体内成像，动物将以各自在100ml D5W(5％葡萄糖水溶液)中的25mg质粒DNA：10nmol纳米颗粒/肿瘤的剂量瘤内注射DOTAP-胆固醇-复合的pLJ296/SSRT2A质粒载体(SSRT2A-Lipoplex)。PBS和空载体分别用作模拟和阴性对照。体内成像将在注射后24-48小时进行。为了比较，注射后24-48小时从动物中取出肿瘤并固定且切片用于使用HA抗体对HA-SSRT2A融合蛋白的进一步病理学、免疫组织化学分析。
5.人NSCLC实验性肺转移小鼠模型。简言之，小鼠在注射前一天在350 Rd 137Cs下进行照射。nu/nu小鼠经由尾静脉注射接种在200μl PBS中的A549细胞(1-2×106)。肺实验性转移肿瘤集落在接种后7-10天形成。对于体内成像，动物将以各自在100ml D5W(5％葡萄糖水溶液)中的25mg质粒DNA：10nmol脂质体/肿瘤的剂量静脉内注射DOTAP-胆固醇-复合的  pLJ296/SSRT2A质粒载体(SSRT2A-Lipoplex)。PBS和空载体分别用作模拟和阴性对照。体内成像在注射后24-48小时进行。为了与体内成像比较，在注射后24-48小时收获肺，并用印度墨染色肺表面上的转移集落。肺表面上的肿瘤集落在对处理组不知情的情况下在解剖显微镜下计数，并将肺组织切片用于使用HA抗体对HA-SSRT2A融合蛋白的进一步病理学、免疫组织化学分析。
6.人NSCLC H460胸腔内肿瘤异种移植物小鼠模型。小鼠在注射前一天在350 Rd 137Cs下进行照射。当动物在麻醉时，nu/nu小鼠经由胸腔内注射接种在100μl PBS中的H460细胞(5×106)。在接种后7-10天形成在胸腔间隙内的原发性肿瘤以及在骨、淋巴结或脑中的转移性肿瘤。对于体内成像，动物将以各自在100ml D5W(5％葡萄糖水溶液)中的25mg质粒DNA：10nmol脂质体/肿瘤的剂量静脉内注射DOTAP-胆固醇-复合的pLJ296/SSRT2A质粒载体(SSRT2A纳米颗粒)。PBS和空载体分别用作模拟和阴性对照。体内成像在注射后24-48小时进行。为了与体内成像比较，在注射后24-48小时收获肿瘤，并切片用于使用HA抗体对HA-SSRT2A融合蛋白的进一步病理学、免疫组织化学分析。将进行整只动物的横切片以证实体内成像。
7.体内基因表达的分析。使用配备的数码相机记录使用不同启动子的冷冻切片的正常组织和肿瘤中的EGFP表达。简言之，冷冻样品切成5-10μm切片，在4％多聚甲醛中在冰上固定10分钟，在PBS中漂洗。风干后，组织样品用荧光增强覆盖介质(Vector Lab，Burlingame，CA)和玻璃盖玻片覆盖，并在配备数码相机和成像分析软件的荧光显微镜下进行检查。
8.通过原位细胞死亡分析使用TUNEL-反应在hTMC-或CMV-FUS1纳米颗粒处理的小鼠中凋亡的诱导。在通过hTMC-FUS1-纳米颗粒处理的具有人肺癌肿瘤的小鼠的肿瘤而非正常肺和其他正常组织中检测到凋亡的诱导(图19)。比较起来，如通过荧光图像经由原位凋亡分析使用TUNEL染色在冷冻小鼠组织切片中所示，在通过常规CMV-FUS1-纳米颗粒处理的小鼠中没有看到肿瘤选择性(图19)。
实施例2
新型合成hTERT-mini-CMV嵌合启动子-驱动的转基因的肿瘤选择性和 高效率表达，用于全身癌症基因治疗
成功的癌症基因治疗的一个主要障碍是缺乏可以特异性靶向原发性和转移性肿瘤的有效的全身递送系统。hTERT启动子已克隆并显示能够在肿瘤而不是正常细胞中靶向转基因表达。然而，如同大多数其他固有的哺乳动物启动子一样，hTERT启动子的弱转录促进强度已阻碍其直接用于癌症基因治疗。为了避开这些问题，已开发了新型嵌合启动子hTERT-mini-CMV(hTMC)，其通过将基本hTERT调节序列与最小CMV启动子元件最佳融合进行改造。各种人癌症和正常细胞用各种EGFP-构建体转染，其中EGFP表达经由原始CMV和hTERT启动子或经由hTMC启动子体外驱动。EGFP在转染株中的表达通过荧光成像(FI)在荧光显微镜下显现，并且EGFP-阳性细胞群体和荧光强度通过FACS分析定量。在所有肿瘤细胞中检测到经由hTERT启动子驱动的高水平的EGFP表达，但在正常细胞中则没有。虽然可以看到经由hTERT启动子驱动的EGFP表达的类似肿瘤选择性，但表达水平比在相同转染效率下经由hTMC启动子驱动的那种低几百倍。hTMC启动子的效力还通过将DOTAP：胆固醇-复合的hTMC-EGFP-纳米颗粒全身注射到具有胸腔内人N417肺肿瘤异种移植物的裸小鼠中进行体内评估。一致地，高水平的EGFP表达只能在用hTMC-EGFP处理的动物的肿瘤细胞中检测到，但在任何其他正常组织中则没有。此外，上述N417肿瘤小鼠模型通过非侵入性和定量MR成像分析用于评估用新型hTMC-FUS1-纳米颗粒全身处理的治疗效果。与未处理或通过hTMC-EGFP-纳米颗粒处理的那些比较，在通过hTMC-FUS1-纳米颗粒处理的动物中在少于2周的处理中检测到肿瘤生长的显著抑制(P＜0.001)，如通过MR成像和体积分析证明的。如通过原位细胞死亡分析使用TUNEL染色在冷冻组织样品中所显示的，在通过hTMC-FUS1-纳米颗粒处理的小鼠的肿瘤细胞而非周围的正常肺或其他正常组织中检测到凋亡的诱导。这些结果清楚地证实使用hTMC启动子能够在体外和体内达到高肿瘤特异性和高效率治疗基因表达，并且涉及使用治疗性hTMC-纳米颗粒的全身施用用于肿瘤靶向的分子癌症治疗。
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本文公开和要求的所有组合物和方法按照本公开内容无需过度的实验即可制备和进行。尽管本发明的组合物和方法已根据优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，无需背离本发明的概念、精神和范围即可对本文描述的组合物和方法、以及方法的步骤或步骤顺序施加改变。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文描述的试剂同时达到相同或相似结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似取代和修改视为在通过附加权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
下列参考文献特别引入本文作为参考，参考的程度为它们提供补充本文所述的那些的示例性程序或其他细节。
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Claims (117)

1.一种启动子，其包含：
a)组织选择性启动子序列；和
b)与所述组织选择性启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列，其中所述第二种启动子序列包括病毒最小启动子序列；
其中所述组织选择性启动子序列与所述第二种启动子序列可操作的偶联导致所述组织选择性启动子序列的启动子功能改善。
2.权利要求1的启动子，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、或AFP启动子序列、人α-乳白蛋白启动子序列、绵羊β-乳球蛋白启动子序列、U6启动子序列、H1启动子序列、7SL启动子序列、人Y启动子序列、人MRP-7-2启动子序列、腺病毒VA1启动子序列、人tRNA启动子序列、5S核糖体RNA启动子序列、或任何这些启动子序列的功能杂合物或组合。
3.权利要求1的启动子，其中所述组织选择性启动子序列进一步限定为肿瘤选择性启动子序列。
4.权利要求1的启动子，其中所述组织选择性启动子序列是低氧特异性启动子序列。
5.权利要求4的启动子，其中所述低氧特异性启动子序列是低氧应答元件(HRE)或低氧诱导因子。
6.权利要求5的启动子，其中所述低氧诱导因子是HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α。
7.权利要求1的启动子，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列。
8.权利要求7的启动子，其中所述hTERT启动子序列是SEQ IDNO：1。
9.权利要求1的启动子，其中所述病毒最小启动子序列是腺病毒启动子序列、杆状病毒启动子序列、CMV启动子序列、细小病毒启动子序列、疱疹病毒启动子序列、痘病毒启动子序列、腺伴随病毒启动子序列、塞姆利基森林病毒启动子序列、SV40启动子序列、痘苗病毒启动子序列、或逆转录病毒启动子序列。
10.权利要求9的启动子，其中所述病毒最小启动子是mini-CMV启动子序列。
11.权利要求10的启动子，其中所述mini-CMV序列是SEQ ID NO：2。
12.权利要求1的启动子，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，并且其中所述第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列。
13.权利要求12的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：3。
14.一种包含启动子的核酸，其中所述启动子包含：
a)组织选择性启动子序列；和
b)与所述第一种启动子序列可操作地偶联的第二种启动子序列，其中所述第二种启动子序列包含病毒最小启动子序列；
其中所述组织选择性启动子序列与所述第二种启动子序列可操作的偶联导致所述第一种启动子序列的启动子功能改善。
15.权利要求14的核酸，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、AFP启动子序列、人α-乳白蛋白启动子序列、绵羊β-乳球蛋白启动子序列、U6启动子序列、H1启动子序列、7SL启动子序列、人Y启动子序列、人MRP-7-2启动子序列、腺病毒VA1启动子序列、人tRNA启动子序列、5S核糖体RNA启动子序列、或任何这些启动子序列的功能杂合物或组合。
16.权利要求14的核酸，其中所述组织选择性启动子序列进一步限定为肿瘤选择性启动子序列。
17.权利要求14的核酸，其中所述组织选择性启动子序列是低氧特异性启动子序列。
18.权利要求17的核酸，其中所述低氧特异性启动子序列是低氧应答元件(HRE)或低氧诱导因子。
19.权利要求18的启动子，其中所述低氧诱导因子是HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α。
20.权利要求15的核酸，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列。
21.权利要求20的核酸，其中所述hTERT启动子序列是SEQ IDNO：1。
22.权利要求14的核酸，其中所述病毒最小启动子序列是腺病毒启动子序列、杆状病毒启动子序列、CMV启动子序列、细小病毒启动子序列、疱疹病毒启动子序列、痘病毒启动子序列、腺伴随病毒启动子序列、塞姆利基森林病毒启动子序列、SV40启动子序列、痘苗病毒启动子序列、或逆转录病毒启动子序列。
23.权利要求22的核酸，其中所述病毒最小启动子序列是CMV启动子序列。
24.权利要求23的核酸，其中所述小CMV序列是SEQ ID NO：2。
25.权利要求14的核酸，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，并且其中所述第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列。
26.权利要求25的核酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO：3。
27.权利要求14的核酸，其进一步限定为包含与所述启动子可操作地偶联的基因。
28.权利要求27的核酸，其中所述基因是治疗基因或选择标记。
29.权利要求28的核酸，其中所述治疗基因是肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。
30.权利要求29的核酸，其中所述治疗基因是Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda 7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、LUCA-1(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、SEM A3或MCC。
31.权利要求30的核酸，其中所述治疗基因是FUS1。
32.权利要求28的核酸，其中所述选择标记是药物选择标记、酶、或免疫学标记。
33.权利要求14的核酸，其进一步限定为包含在质粒中。
34.权利要求14的核酸，其进一步限定为包含与所述启动子序列可操作地偶联的报道分子序列。
35.权利要求34的核酸，其中所述报道分子序列是编码生长抑素受体氨基酸序列、钠碘同向转运体氨基酸序列、真核绿色荧光蛋白氨基酸序列、红色荧光蛋白氨基酸序列、萤光素酶氨基酸序列、β-半乳糖苷酶氨基酸序列、或胸苷激酶氨基酸序列的多核苷酸。
36.权利要求35的核酸，其中所述生长抑素受体氨基酸序列是重组生长抑素受体氨基酸序列、生长抑素2型受体氨基酸序列、或突变型生长抑素2型受体氨基酸序列。
37.权利要求36的核酸，其中所述生长抑素2型受体氨基酸序列是生长抑素2A型受体氨基酸序列。
38.权利要求34的核酸，其中所述报道分子序列与I RES和第二种基因可操作地偶联。
39.权利要求38的核酸，其中所述第二种基因与第二种报道分子可操作地偶联。
40.权利要求39的核酸，其中所述第二种报道分子是生长抑素受体氨基酸序列、钠碘同向转运体氨基酸序列、萤光素酶氨基酸序列、真核绿色荧光蛋白氨基酸序列、或胸苷激酶氨基酸序列。
41.权利要求38的核酸，其中所述第二种基因包含选择标记或治疗基因。
42.权利要求41的核酸，其中所述第二种基因是治疗基因，其是肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。
43.权利要求41的核酸，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，所述第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列，并且其中所述启动子与编码FUS1的基因可操作地偶联，并且其中所述核酸包含在质粒中。
44.一种组合物，其包含如权利要求1-13中任何一项所限定的启动子。
45.权利要求44的组合物，其进一步限定为包含用于将所述启动子递送至受试者中的细胞的递送媒介物。
46.权利要求45的组合物，其中所述递送媒介物是核酸、质粒、病毒载体、原核细胞、真核细胞、或脂质。
47.权利要求46的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、或痘病毒载体。
48.权利要求47的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒。
49.权利要求46的组合物，其中所述脂质包含在脂质体中。
50.权利要求49的组合物，其中所述脂质体包含阳离子脂质。
51.权利要求50的组合物，其中所述阳离子脂质是DOTAP:Chol。
52.权利要求51的组合物，其中所述DOTAP:Chol进一步包含纳米颗粒。
53.一种组合物，其包含如权利要求14-43中任何一项所限定的核酸。
54.权利要求53的组合物，其进一步限定为包含用于将所述核酸递送至受试者中的细胞的递送媒介物。
55.权利要求54的组合物，其中所述递送媒介物是病毒载体或脂质。
56.权利要求55的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、或痘病毒载体。
57.权利要求56的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
58.权利要求55的组合物，其中所述媒介物包含脂质体。
59.权利要求58的组合物，其中所述脂质体包含阳离子脂质。
60.权利要求59的组合物，其中所述阳离子脂质是DOTAP:Chol。
61.权利要求60的组合物，其中所述DOTAP:Chol进一步包含纳米颗粒。
62.一种改善组织选择性启动子功能的方法，其包括：
a)选择组织选择性启动子序列；
b)选择第二种启动子序列，其中所述第二种启动子序列包含病毒最小启动子序列；和
c)将所述组织选择性启动子序列与所述第二种启动子序列可操作地偶联，
其中所述组织选择性启动子序列与所述第二种启动子序列可操作地偶联导致所述组织选择性启动子序列的功能改善。
63.权利要求62的方法，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列、CEA启动子序列、PSA启动子序列、probasin启动子序列、ARR2PB启动子序列、AFP启动子序列、人α-乳白蛋白启动子序列、绵羊β-乳球蛋白启动子序列、U6启动子序列、H1启动子序列、7SL启动子序列、人Y启动子序列、人MRP-7-2启动子序列、腺病毒VA1启动子序列、人tRNA启动子序列、5S核糖体RNA启动子序列、或任何这些启动子序列的功能杂合物或组合。
64.权利要求62的方法，其中所述组织选择性启动子序列是低氧特异性启动子序列。
65.权利要求64的方法，其中所述低氧特异性启动子序列是低氧应答元件(HRE)或低氧诱导因子。
66.权利要求65的方法，其中所述低氧诱导因子是HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α。
67.权利要求62的方法，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列。
68.权利要求67的方法，其中所述hTERT启动子序列是SEQ IDNO：1。
69.权利要求62的方法，其中所述病毒最小启动子序列是腺病毒启动子序列、杆状病毒启动子序列、CMV启动子序列、细小病毒启动子序列、疱疹病毒启动子序列、痘病毒启动子序列、腺伴随病毒启动子序列、塞姆利基森林病毒启动子序列、痘苗病毒启动子序列、或逆转录病毒启动子序列。
70.权利要求69的方法，其中所述病毒最小启动子序列是mini-CMV启动子序列。
71.权利要求70的方法，其中所述mini-CMV序列是SEQ ID NO：2。
72.权利要求62的方法，其中所述组织选择性启动子序列是hTERT启动子序列，并且其中所述第二种启动子序列是mini-CMV启动子序列。
73.权利要求72的方法，其中所述启动子包含SEQ ID NO：3。
74.一种将基因递送至细胞的方法，其包括：
a)制备包含与启动子可操作地偶联的基因的组合物，其中所述启动子是如权利要求1-13中任何一项所述的启动子；和
b)使所述组合物与所述细胞接触，其中所述接触导致所述基因递送至所述细胞中。
75.权利要求74的方法，其中所述组合物进一步包含递送媒介物。
76.权利要求74的方法，其中所述递送媒介物是病毒载体或脂质。
77.权利要求7 6的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、或痘病毒载体。
78.权利要求77的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
79.权利要求75的方法，其中所述病毒载体进一步限定为鱼精蛋白复合的病毒载体。
80.权利要求79的方法，其中所述鱼精蛋白复合的病毒载体是鱼精蛋白复合的腺病毒载体。
81.权利要求75的方法，其中所述递送媒介物包括阳离子脂质。
82.权利要求81的方法，其中所述阳离子脂质是DOTAP:chol。
83.权利要求82的方法，其中所述DOTAP:chol进一步限定为DOTAP:chol纳米颗粒。
84.权利要求74的方法，其中所述细胞是癌细胞。
85.权利要求84的方法，其中所述癌细胞在受试者中。
86.一种治疗具有过度增生性疾病的受试者的方法，其包括：
a)获得包含多核苷酸的药物组合物，所述多核苷酸包含如权利要求14-43中任何一项所述的核酸序列；和
b)给所述受试者施用药学有效量的所述组合物。
87.权利要求86的方法，其中所述受试者是具有癌症的患者。
88.权利要求87的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头与颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤、或白血病。
89.权利要求88的方法，其中所述癌症是肺癌。
90.权利要求89的方法，其中所述受试者经历第二种抗癌治疗。
91.一种使细胞成像的方法，其包括：
a)使所述细胞与包含如权利要求14-43中任何一项所述的核酸的组合物接触，其中所述启动子与报道分子氨基酸序列可操作地偶联；和
b)通过测量来源于所述报道分子的信号检测所述报道分子序列的细胞表达。
92.权利要求91的方法，其中所述细胞在受试者中，并且其中所述使细胞成像的方法进一步限定为使受试者中的组织成像的方法。
93.权利要求92的方法，其中所述细胞是癌细胞，并且其中所述使细胞成像的方法进一步限定为使具有癌症的患者中的肿瘤成像的方法。
94.权利要求91的方法，其中所述报道分子是酶氨基酸序列、报道分子氨基酸序列、或核酶RNA序列。
95.权利要求94的方法，其中所述报道分子氨基酸序列是重组的7跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列、胸苷激酶氨基酸序列、多巴胺受体氨基酸序列、内皮生长因子受体(EGFR)氨基酸序列、纤溶酶原氨基酸序列、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)氨基酸序列、激素受体氨基酸序列、或钠/碘同向转运体氨基酸序列。
96.权利要求95的方法，其中所述报道分子氨基酸序列是重组的7跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列。
97.权利要求96的方法，其中所述重组的7跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列是重组生长抑素受体氨基酸序列、重组生长抑素2型受体氨基酸序列、或突变型生长抑素2型受体氨基酸序列。
98.权利要求97的方法，其中所述重组生长抑素2型受体氨基酸序列是重组生长抑素2A型受体氨基酸序列。
99.权利要求98的方法，其中编码所述重组的7跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列的所述核酸包括编码截短的重组的7跨膜G蛋白偶联受体的核酸。
100.权利要求99的方法，其中编码所述截短的重组的7跨膜G蛋白偶联受体的所述核酸包括羧基末端截短。
101.权利要求100的方法，其中所述截短导致所述重组的7跨膜G蛋白偶联受体氨基酸序列的内化改变和/或信号转导改变。
102.权利要求91的方法，其中编码所述报道分子氨基酸序列的所述核酸在所述报道分子氨基酸序列的所述N末端或C末端包含异源前导序列，其中所述前导序列将所述报道分子氨基酸序列导向特定的亚细胞定位。
103.权利要求91的方法，其中编码所述报道分子氨基酸序列的所述核酸进一步包含融合至所述报道分子氨基酸序列的N末端或C末端的蛋白质标签。
104.权利要求103的方法，其中所述蛋白质标签具有酶促活性。
105.权利要求104的方法，其中所述蛋白质标签是血凝素A、β-半乳糖苷酶、胸苷激酶、转铁蛋白、myc-标签、VP16、(His)6-标签、或氯霉素乙酰转移酶。
106.权利要求93的方法，其中所述成像在患者经历肿瘤外科切除术的手术中进行。
107.权利要求91的方法，其中基因与所述启动子可操作地偶联，并且其中所述使细胞成像的方法进一步限定为将基因递送至细胞的方法。
108.权利要求92的方法，其中所述基因是治疗基因，并且其中所述使细胞成像的方法进一步限定为将治疗基因递送至细胞的方法。
109.权利要求108的方法，其中所述治疗基因是肿瘤抑制基因、诱导凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、或编码激素的基因。
110.权利要求109的方法，其中所述治疗基因是Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、P IM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL 3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、I NG1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、LUCA-1(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、SEMA3或MCC。
111.权利要求110的方法，其中所述治疗基因是FUS1。
112.权利要求92的方法，其进一步限定为在给所述受试者施用基因后测量受试者中所述基因的生物分布的方法。
113.权利要求91的方法，其进一步限定为测量受试者中针对施用的治疗基因的应答的方法。
114.权利要求91的方法，其中信号的测量进一步限定为进行荧光成像分析、免疫组织化学分析、化学发光成像、光学成像、磁共振成像、或放射成像。
115.权利要求114的方法，其中放射成像进一步限定为γ照相机成像。
116.权利要求115的方法，其中信号的测量进一步限定为使用111In-奥曲肽-SSRT2A报道分子系统的γ照相机成像。
117.权利要求114的方法，其中信号的测量进一步限定为使用超顺磁性氧化铁(SPIO)-奥曲肽-SSTR2A报道分子和对比增强剂系统的磁共振成像。
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