CN104120176A - 检测cbl基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测CBL基因第371位氨基酸序列突变的引物，其特征在于，包括：扩增CBL基因包第371位氨基酸序列的引物，其碱基序列为：CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG；CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。采用Sanger测序技术，可用于快速检测JMML患者体内CBL基因突变热点情况。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测CBL基因多态突变热点的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测JMML患者体内CBL基因多态位点的突变情况。
背景技术
幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少见的儿童慢性髓系白血病，恶性程度高，兼有骨髓增生异常综合征(myelodysplastic，MDS)和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disease，MPD)的特征。CBL基因突变可影响细胞信号通路。我目前发现RAS信号通路中RAS，PTPN11，NF1，CBL4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶向治疗是目前研究的方向。Muramatsu等分析了49例儿童JMML患者的基因突变，发现5例(10.5％)CBL基因突变。同样Loh等在159例JMML患者中发现27例(17％)CBL基因突变，发生在7号内含子至9号外显子，其中25例为纯合突变。这些突变大都累及8号外显子编码的Y37l>H(组氨酸，His，H)，Asp(天冬氨酸，Asp，D)，Cys(半胱氨酸，Cys，c)等。近来研究发现，AML、MDS及MPNs共约10％～25％有CBL基因突变，CBL基因可能成为髓系血液肿瘤新的分子标记物。
CBL在JMML具有较高的突变率(10％～15％)，8号外显子密码子Y371突变是JMML的热点突变，常见的突变类型有371Tyr＞His(1111T＞C)，371Tyr＞Asp(1111T＞G)，371Tyr＞Cys(1112A＞G)。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测CBL基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测JMML患者体内CBL基因多态位点的突变情况。所述检测CBL基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增CBL基因的引物，其碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测CBL基因的测序引物碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
进一步地，引物序列I CBL-317-F和CBL-371-R是扩增CBL基因包含第371位氨基酸序列的引物。
本发明还提供了检测CBL基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提血液中的组织DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定CBL基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增CBL基因的引物，其碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
进一步地，测序引物碱基序列为：
检测IDH1基因的测序引物碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
本发明还提供了一种检测CBL基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
(ⅰ)扩增CBL基因的引物，其碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
进一步地，测序引物碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG。
有益效果：本发明设计了扩增CBL第371位氨基酸序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者CBL突变热点的方法，可以一次将CBL第371位氨基酸所有的突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计3个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。
附图说明
图1样本1CBL第371位点野生型测序截图。
图2样本2CBL第371位点突变型测序截图。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测CBL基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对CBL突变热点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增CBL基因包含第371位氨基酸序列的引物，其碱基序列为：
CBL-317-F：ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R：CCAGGATGTAAGACAGGATG
一种检测CBL基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；CBL基因第371位氨基酸序列的上、下游引物CBL-371-F(10μM)、CBL-371-R(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测CBL基因第371位氨基酸序列的上、下游引物分别为CBL-371-F(3.2μm)、CBL-371-R(3.2μm)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12,000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
| 引物名称 | 引物序列 |
| CBL-371-F | ACCATATCACTGGACACAAG |
| CBL-371-R | CCAGGATGTAAGACAGGATG |
(5)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与CBL野生型参考序列(Genbank accn：NG_016808.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。
如图1所示，CBL371野生型测序截图。
如图2所示，CBL371突变型测序截图。如图2所见，框内的碱基1111T>C，即371Try>Asp。利用本发明所述引物和方法同样能检测出CBL371突变型的另外两种突变方式，即371Tyr＞His和371Tyr＞Cys。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测CBL基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accatatcac tggacacaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaggatgta agacaggatg 20
Claims (8)
1.检测CBL基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增CBL基因的引物，其碱基序列为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测CBL基因的测序引物碱基序列为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列CBL-371F和CBL-371-R是扩增CBL基因包含第371位氨基酸序列的引物。
4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列CBL-371F和CBL-371-R是扩增扩增CBL基因包含第371位氨基酸序列的引物。
5.检测CBL基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
抽提血液中的组织DNA；
用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
对步骤2中的扩增产物进行测序；
对测序结果进行判断，确定CBL基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
7.一种检测CBL基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i) 组织DNA抽提试剂；
(ii) 检测体系PCR扩增反应液；
(iii) 测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，测序引物碱基序列为：
CBL-317-F： ACCATATCACTGGACACAAG
CBL-371-R： CCAGGATGTAAGACAGGATG。
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| CN107868823A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-04-03 | 天津协和华美医学诊断技术有限公司 | 一种检测mds/mpn相关基因群的检测试剂盒 |
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| CN102762592A (zh) * | 2009-06-29 | 2012-10-31 | 麻省理工学院 | 人类造血细胞癌的非人类哺乳动物模型 |
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