CN105506110A - 检测tex11基因第8、25号全外显子的方法和引物 - Google Patents

检测tex11基因第8、25号全外显子的方法和引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测TEX11基因第8、25号外显子的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括扩增覆盖TEX11基因第8、25号全外显子序列的2对正、反向引物和2对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述2对测序引物可用于快速检测无精子症患者的TEX11基因第8、25号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于8号外显子上的主要突变位点M171V、25号外显子上的主要突变位点A698T。本发明所述引物和方法，检测准确、高效。

Description

检测TEX11基因第8、25号全外显子的方法和引物
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的引物和方法。
背景技术
无精子症(Azoospermia)是指多次精液检查(一般3次以上)均未发现精子者。临床上根据有无输精管道的梗阻，将无精子症分为两种：梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症。前者是指睾丸能够产生精子，但是输精管道阻塞，精子无法顺利排出。后者是指睾丸不能产生或者产生很少量的精子。非梗阻性无精子症的原因比较复杂，染色体异常是这种遗传疾病其原因之一。20％的非阻止性无精症男性都能检测到染色体不正常，包括X染色体不正常、结构畸变和Y染色体微缺失等无精症因素。
TEX11是X染色体编码的精细胞特异蛋白，在睾丸精原细胞和精母细胞中有丰富的表达，与精子发生形成有很大的联系。目前已有研究指出，与Nijmegen断裂综合征中涉及的一种减数分裂双链破裂的减数分裂重组复合物11有蛋白质的相互作用。TEX11基因定位于染色体Xq13.1，含有34个外显子，编码1个104KDa的蛋白质分子，该蛋白除了一个介导蛋白质—蛋白质相互作用的TRP基序(tetratricopeptiderepeatmotif)外没有其他可以辨识的功能域。在偶线期和早期粗线期精母细胞中，TEX11焦点出现在联会复合体中，影响TEX11的同源重组。有研究指出，缺乏这种基因的雄性小鼠都不育，雌性小鼠低生育能力，且进一步研究分析表明，TEX11在雄性减数分裂中具有两个显著的功能：促进染色体的联会和交叉互换。并且TEX11与联会复合体中的SYCP2相互作用，表明TEX11在染色体联会和交叉形式中提供了一个物理连接的作用。TEX11在脊椎动物中是高度保守的。
近来有文献报道，其在33名减数分裂阻滞患者体内发现5名存在TEX11基因突变，在193名混合睾丸萎缩患者中发现2名存在TEX11基因突变，提示TEX11的突变情况对无精子症有重要意义。
多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于TEX11基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于TEX11基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对TEX11基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
本发明采用Sanger测序法检测TEX11基因第8、25号外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第8、25号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解TEX11基因第8、25号全外显子的基因突变情况，并不受TEX11基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
发明内容
本发明提供检测TEX11基因第8、25号外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测Azoospermia患者体内检测TEX11基因第8、25号外显子突变的情况。
本发明的目的在于提供检测TEX11基因第8、25号外显子的引物，包括：扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的2对正、反向引物；其碱基序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
进一步地，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
进一步地，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：
TEX11-511-F：TEX11-511-R＝1：1；
TEX11-2092-F：TEX11-2092-R＝1：1。
进一步地，所述2对测序引物的使用浓度比为：
TEX11S-511-F：TEX11S-511-R＝1：1；
TEX11S-2092-F：TEX11S-2092-R＝1：1。
本发明的目的还在于提供一种检测TEX11基因第8、25号外显子的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用2对扩增引物TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的扩增产物；
(3)利用2对测序引物TEX11S-511-F与TEX11S-511-R，TEX11S-2092-F与TEX11S-2092-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型TEX11基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
本发明的目的还在于提供一种检测TEX11基因第8、25号外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括2对扩增引物TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R，测序体系包括2对测序引物TEX11S-511-F与TEX11S-511-R，TEX11S-2092-F与TEX11S-2092-R，包括：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCRBuffer；dNTPs；KODFXDNAPolymerase。
进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和BigdyeTerminatorV3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明设计了扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子的2对正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的2对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测TEX11基因第8、25号外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第8、25号外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解TEX11基因第8、25号全外显子的基因突变情况，并不受TEX11基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1为TEX11基因在染色体上定位图
图2、3为TEX11511-F/R的电泳图，M为MarkerDL2000，1-24为送检的患者血液样本1-24号，如图2、3所示，引物TEX11511-F/R扩增有效，且条带单一。
图4、5为TEX2092-2-F/R的电泳图，M为MarkerDL2000，1-24为送检的患者血液样本1-24号，如图4、5所示，引物TEX2092-F/R扩增有效，且条带单一。
图6、7、8分别为样本3、5、6的TEX11第8号外显子野生型测序截图。图9、10、11分别为样本3、5、6的TEX11第25号外显子野生型测序截图。其中框注部分为TEX11基因第171\698个氨基酸编码的位置，图中测序结果显示未发生突变，翻译为甲硫氨酸/丙氨酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测检测TEX11基因第8、25号外显子的引物，包括：扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子的2对正、反向引物；其中扩增所述TEX11基因第8号全外显子的因为TEX11-511-F和TEX11-511-R，扩增所述TEX11基因第25号全外显子的因为TEX11-2092-F和TEX11-2092-R，所述引物的碱基序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
在检测中，先利用上述2对正、反向引物对覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用测序引物TEX11-511-F和TEX11-511-R对所述TEX11基因第8号全外显子的扩增产物进行测序，利用测序引物TEX11-2092-F和TEX11-2092-R对所述TEX11基因第25号全外显子的扩增产物进行测序。获得扩增产物的基因序列。所述测序引物的碱基序列为：
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括了该外显子的全部序列。虽然TEX11基因在无精子症患者中有较为主要的突变位点M171V(在8号外显子上)、A698T(在25号外显子上)，但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。
检测检测TEX11基因第8、25号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系PCR反应液包括：2×PCRBuffer；2mMdNTPs；KODFXDNAPolymerase(1U/μl)；检测目的基因用的2对上、下游引物TEX11-511-F(10μm)与TEX11-511-R(10μm)，TEX11-2092-F(10μm)与TEX11-2092-R(10μm)。
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：TEX11S--511-F(3.2μm)与TEX11S--511-R(3.2μm)，TEX11S-2092-F(3.2μm)与TEX11S-2092-R(3.2μm)，以及BigdyeTerminatorV3.1(购买自美国AppliedBiosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液配制如下：
其中，TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R的碱基序列为：
TEX11-511-F：5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3'
TEX11-511-R：5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3'
TEX11-2092-F：5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3'
TEX11-2092-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3'
阳性对照品：含有TEX11序列的溶液。
阴性对照品：无TEX11序列的溶液。
空白对照品：1μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA:
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测标本数。
(3)加样：加入2个检测体系PCR反应液中各1μlDNA；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABIveriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
(5)sanger测序：
取9μlPCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与测序引物：TEX11S--511-F(3.2μm)与TEX11S--511-R(3.2μm)，TEX11S-2092-F(3.2μm)与TEX11S-2092-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlHIDI后进行变性试验。
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBankNo.:NC_000023.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床无精子症患者样本24份，检测该24份样本是否存在TEX11基因突变,样本编号1-24。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中1μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
电泳结果如图2、3、4、5所示，表明本发明所述引物TEX11-511-F/R、TEX112092-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样品3的第8号全外显子序列的部分正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
样品5的第8号全外显子序列的部分正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
样品6的第8号全外显子序列的部分正向测序结果如图8所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
样品3的第25号全外显子序列的部分正向测序结果如图9所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
样品5的第25号全外显子序列的部分正向测序结果如图10所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
样品6的第25号全外显子序列的部分正向测序结果如图11所示，为野生型，未检测出TEX11突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出TEX11基因第8、25号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出TEX11基因第8、25号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出TEX11基因突变。

Claims (5)

1.检测TEX11基因第8、25号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为：
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：TEX11-511-F：TEX11-511-R＝1：1；TEX11-2092-F：TEX11-2092-R＝1：1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对测序引物的使用浓度比为：TEX11S-511-F：TEX11S-511-R＝1：1；TEX11S-2092-F：TEX11S-2092-R＝1：1。
5.一种检测检测TEX11基因第8、25号全外显子序列的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用2对扩增引物TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得检测TEX11基因第8、25号全外显子的扩增产物；
(3)利用2对测序引物TEX11S-511-F与TEX11S-511-R，TEX11S-2092-F与TEX11S-2092-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型TEX11基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
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