CN105695596A - 检测tert基因启动子c250t、c228t突变位点的方法、引物和试剂盒 - Google Patents

检测tert基因启动子c250t、c228t突变位点的方法、引物和试剂盒 Download PDF

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刘赵玲
王淑
王淑一
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Abstract

本发明公开了检测端粒酶逆转录酶(TERT)基因启动子C228T、C250T突变位点的方法、引物和试剂盒，包括扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，此外还可包括一对测序引物。将Touch-down PCR扩增技术和Sanger测序法相结合，可快速检测脑胶质瘤患者体内TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的发生情况。

Description

检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的方法、引物和试剂盒
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的引物、方法和试剂盒。
背景技术
脑胶质瘤(glioma)是神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤。已进行的临床和基础研究都证明脑胶质瘤预后极差，无法控制的肿瘤细胞增殖、减慢的肿瘤细胞凋亡速度、肿瘤细胞的侵袭性以及新生血管生长等恶性肿瘤生物学特征使得脑胶质瘤的治疗面临巨大的困难。人端粒酶是肿瘤标志物之一，在肿瘤发生、发展过程中，端粒酶的活化起着重要的作用。端粒酶由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白、端粒酶逆转录酶(TERT)组成。TERT被认为是端粒酶活性的关键决定因子，它可以延长由于细胞分裂不断缩短的端粒，从而使细胞获得永生，只在端粒酶阳性肿瘤组织和永生化细胞中表达。
近年来，通过全基因组测序，发现TERT基因启动子突变在脑胶质瘤患者中非常常见，且TERT的表达量水平升高。文献报道TERT基因启动子存在C228T和C250T两个突变热点，在2级与3级脑胶质瘤患者中的发生率分别为10％，在4级脑胶质瘤患者中的发生率分别为74％。
本发明采用Touch-downPCR扩增和Sanger测序法检测TERT基因启动子C250T、C228T的突变，并且所设计的扩增引物的扩增产物可以涵盖启动子中包括C250T和C228T在内的所有突变位点。Touch-downPCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在互补性最强的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。
发明内容
本发明的目的在于提供检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的引物，所述引物包括扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，其碱基序列为：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：TERT-F:TERT-R＝1:1。
进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：TERT-S-F:TERT-S-R＝1:1。
进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明的目的在于还提供一种检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)利用一对扩增引物TERT-F和TERT-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物TERT-S-F和TERT-S-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref进行比较，确定突变位点是否存在，所述扩增引物和测序引物序列分别为：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明的目的在于还提供一种检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物TERT-S-F和TERT-S-R，测序体系反应液包括一对测序引物TERT-F和TERT-R，其碱基序列分别为：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
进一步地，所述试剂盒包括TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明的有益效果：本发明设计出扩增产物涵盖TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，构建出稳定的Touch-downPCR扩增体系，所述扩增产物不仅可以包含突变位点C228T、C250T，而且还可以包括所有其他的潜在突变位点，同时在扩增时，富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对PCR扩增产物进行扩增、纯化后变性和直接测序，从而检测TERT基因启动子包括C228T、C250T在内的各种突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。
附图说明
图1TERT基因启动子PCR扩增电泳结果图，其中M为TAKARADL2000。
图2样本1TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
图3样本2TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
图4样本3TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
图5样本1TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
图6样本2TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
图7样本3TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的引物，包括：扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物；其碱基序列为：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
优选地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
在检测中，先利用上述正、反向引物对TERT基因启动子C228T、C250T突变位点进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述一对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的碱基序列。
检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的试剂盒，包括：样本DNA抽提试剂(例如使用天根生物的试剂盒来抽提样本DNA)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系PCR反应液包括：2×PCRBuffer；2mMdNTPs；KODFXDNAPolymerase(1U/μl)；扩增TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的正、反向引物TERT-F(10μm)、TERT-R(10μm)。
测序体系反应液包括：EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：TERT-S-F(3.2μm)、TERT-S-R(3.2μm)，以及BigdyeTerminatorV3.1(购买自美国AppliedBiosystems公司)。
TERT-F、TERT-R；TERT-S-F和TERT-S-R的碱基序列如下所示：
引物名称 碱基序列
TERT-F AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R CGACCTCTCTCCGCTGGGGC3 -->
TERT-S-F AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液试剂配制如下：
阳性对照品：含有TERT序列的溶液。
阴性对照品：无TERT序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
优选地，该试剂盒还包括TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref，其碱基序列如下所示：
GCTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGAGAGGGCGGGGCCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGAGGGCCCGGAGGGGGCTGGGCCGGGGACCCGGGAGGGGTCGGGACGGGGCGGGGTCCGCGCGGAGGAGGCGGAGCTGGAAGGTGAA。
实施例2
检测流程：
(1)利用血液DNA抽提试剂盒(天根生物)提取血液样本中的基因组DNA:
1)抽取500μl血液加入1000μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测样本数。
(3)加样：将2μl步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2μl阴性对照品；对空白对照实验而言，加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)Touch-downPCR扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得PCR扩增产物，可用仪器包括ABIveriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
(5)Sanger测序：
取9μl步骤(4)中PCR扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：
将1μl纯化产物分别与测序引物TERT-S-F(3.2μm)和TERT-S-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlHIDI后进行变性试验。变性试验如下所示：
变性试验结束后，上测序仪(ABI3730)测序，获得PCR扩增产物的碱基序列。
(6)结果判断：将(5)中获得的碱基序列与TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床样本。
取送检脑胶质瘤患者抗凝血样本20例，按实施例2所述检测流程提取样本中的基因组DNA，配制试剂并检测。
将2μl按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
电泳结果如图1所示，表明本发明使用的正、反向引物TERT-F、TERT-R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样品1的TERT基因启动子C228T正向测序结果如图2所示，为野生型，未检测出C228T突变。
样品2的TERT基因启动子C228T正向测序结果如图3所示，为野生型，未检测出C228T突变。
样品3的TERT基因启动子C228T正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出C228T突变。
样品1的TERT基因启动子C250T正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出C250T突变。
样品2的TERT基因启动子C250T正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出C250T突变。
样品3的TERT基因启动子C250T正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出C250T突变。
检测结果如下表：
从检测结果可以看出，本发明使用的正、反向引物TERT-F和TERT-R的扩增产物已经把TERT基因启动子C228T、C250T突变位点涵盖在内，并且Sanger测序结果与焦磷酸测序结果完全一致，足以证明本发明的检测准确性。对阳性标本的检测结果准确。表明本发明使用的引物和方法及试剂盒能够准确地检测出TERT基因启动子相关位点发生突变。

Claims (10)

1.检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的引物，其特征在于，所述引物包括扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，其碱基序列为：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为：TERT-F:TERT-R＝1:1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为：TERT-S-F:TERT-S-R＝1:1。
5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
6.一种检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)利用一对扩增引物TERT-F和TERT-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物TERT-S-F和TERT-S-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
8.一种检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增引物TERT-F和TERT-R，测序体系反应液包括一对测序引物TERT-S-F和TERT-S-R，其特征在于：
TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
9.如权利要求8所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref。
10.如权利要求8至9之一所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
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