WO2020145715A1 - Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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WO2020145715A1
WO2020145715A1 PCT/KR2020/000453 KR2020000453W WO2020145715A1 WO 2020145715 A1 WO2020145715 A1 WO 2020145715A1 KR 2020000453 W KR2020000453 W KR 2020000453W WO 2020145715 A1 WO2020145715 A1 WO 2020145715A1
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promoter
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pcr
tert gene
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이병철
이휘호
최지현
박한비
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주식회사 진캐스트
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Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase for detecting TERT mutations and a kit comprising the same, and more specifically, a DNA polymerase, primer set capable of detecting somatic mutations in the promoter of the TERT gene with high sensitivity, A probe, a kit, and a method for detecting a mutation in a promoter of a TERT gene using the kit.
  • Cancer refers to a population of abnormal cells caused by continuous division and proliferation by destroying the balance between cell division and death by various causes, and is also called a tumor or a neoplasm. It usually affects more than 100 parts of the body, including organs, white blood cells, bones, and lymph nodes, and develops into serious symptoms through infiltration into surrounding tissues and metastasis to other organs.
  • cancer screening methods are physical. Examples include gastrointestinal X-ray imaging, double contrast, compression imaging, or mucosal imaging, and by using an endoscope to visually check internal organs, very small lesions that do not appear on X-ray examination can be found, as well as cancer. Biopsies can also be performed directly in this suspicious area, increasing the diagnostic rate.
  • this method has disadvantages in terms of hygiene and the need for the patient to suffer during the examination.
  • telomerase reverse transcriptase is a catalytic subunit of telomerase enzyme. This enzyme maintains the telomere end by the addition of telomere repeat TTAGGG. Somatic mutation of the TERT promoter results in structural activity and expression, which in turn leads to replication and proliferation of cancer cells.
  • the TERT promoter mutation is a diagnostic and prognostic factor for cancers such as the central nervous system (CNS), bladder, thyroid and skin.
  • CNS central nervous system
  • PTC papillary thyroid cancer
  • melanoma is associated with a much more aggressive disease and short survival.
  • the presence of the TERT mutation acts as a responsive predictor for the diagnosis and prognosis prediction of various cancers, so an effective and rapid detection method of the TERT mutation is required for early diagnosis and optimal therapeutic approach of cancer.
  • Korean Patent Publication No. 10-2015-0132181 relates to a TERT promoter mutation in a subset of glioma and tumors, and discloses a method for detecting somatic mutations in the promoter of the TERT gene and providing information on cancer.
  • polymerase for detecting somatic mutation in the promoter of the TERT gene and a reaction buffer for increasing its activity there is no known polymerase for detecting somatic mutation in the promoter of the TERT gene and a reaction buffer for increasing its activity.
  • the present inventors have developed a kit comprising a DNA polymerase capable of detecting somatic mutations at a promoter of the TERT gene with high sensitivity and a reaction buffer for increasing its activity, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a DNA polymerase for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene.
  • Another object of the present invention is to provide a set of primers for detecting mutations in the promoter of the TERT gene.
  • Another object of the present invention is to provide a probe for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, comprising the DNA polymerase and/or primer set described above.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting a mutation in a promoter of the TERT gene, using the kit described above.
  • the present invention is a 507th amino acid residue glutamic acid (E) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K), the 536th amino acid residue arginine (R) is lysine (K) It provides a DNA polymerase for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, having Taq polymerase substituted with valine (V), where arginine (R), the 660th amino acid residue, is substituted with.
  • the present invention also provides a primer set for detecting a mutation in a promoter of a TERT gene comprising any one or more primers selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 6.
  • the present invention also provides a probe for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • FAM may be labeled with a fluorescent substance at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and BHQ-1 may be labeled with a quencher at the 3'-end.
  • the present invention also provides a kit for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, comprising the DNA polymerase and/or primer set described above.
  • the kit may further include a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • FAM may be labeled with a fluorescent substance at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and BHQ-1 may be labeled with a quencher at the 3'-end. .
  • the kit comprises 0.5 to 10 mM KCl; And 1 to 30 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; and may further include a PCR buffer composition having a final pH of 8.0 to 9.5.
  • the kit comprises 1 to 5 mM KCl; 5 to 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; And 5 to 50 mM of TMAC (Tetra methyl ammonium chloride), and may further include a PCR buffer composition having a final pH of 8.0 to 9.5.
  • the present invention also provides a method for detecting a TERT gene mutation comprising the following steps:
  • the PCR may be allele-specific PCR or real-time PCR.
  • (d) may further include the step of confirming the amplification result by the PCR by measuring the Ct (cycle threshold) value.
  • the mutation in the promoter of the TERT gene is selected from the group consisting of cytosine at position 1,295,228 of chromosome 5 and deletion, substitution and insertion mutation of cytosine at position 1,295,250 of chromosome 5 1 Species.
  • the mutation in the promoter of the TERT gene includes one or more selected from the group consisting of cytosine at positions 1,295,228 of chromosome 5 and cytosine substitution at positions 1,295,250 of chromosome 5 can do.
  • a method for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene may be applied to cancer diagnosis.
  • the cancer is sarcoma, hepatocellular carcinoma, urinary tract cancer, bladder cancer, thyroid cancer, melanoma, head and neck cancer, It may be one or more selected from the group consisting of medulloblastoma, glioma, astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma.
  • the nucleic acid of step (a) may be extracted from a formalin-fixed paraffin embedded sample or a liquid biopsy of a tissue biopsy.
  • the kit of the present invention shows high detection sensitivity (up to 0.01%, 3 mutant copies in 30,000 wild-type copies), high specificity and reproducibility, and is applicable to both liquid biopsy and tissue biopsy.
  • a somatic mutation in the promoter of the TERT gene it can be applied to diagnose cancer by simultaneously detecting mutations at positions 1,295,228 and 1,295,250 of chromosome 5.
  • Figure 1 shows the production process of Taq DNA polymerase containing each of the R536K, R660V and R536K/R660V mutations, (a) schematically shows fragment PCR and overlap PCR, (b) is amplified in fragment PCR The result of confirming the product by electrophoresis, and (c) shows the result of confirming the amplified product by electrophoresis by amplifying the entire length by overlap PCR.
  • Figure 2 is a result of confirming the overlap PCR product of FIG. 1(c) purified by digestion with the restriction enzyme EcoRI/XbaI and then the SAP-treated pUC19 vector for gel extraction.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing fragment PCR and overlap PCR during the preparation of Taq DNA polymerase containing E507K, E507K/R536K, E507K/R660V and E507K/R536K/R660V mutations, respectively.
  • FIG. 4 shows the results of confirming by electrophoresis the overlap PCR product of FIG. 3 purified with the pUC19 vector digested with the restriction enzyme EcoRI/XbaI for gel extraction, and then with SAP.
  • 5A and 5B show the results of detecting mutations with AS-qPCR in WT without C228T mutant plasmid (10,000, 100, 10 and 3 copies, respectively) template and C228T mutant plasmid, respectively.
  • 6A and 6B show the results of detecting mutations with AS-qPCR in WT without C250T mutant plasmid (10,000, 100, 10 and 3 copies, respectively) template and C250T mutant plasmid, respectively.
  • the presence of the TERT mutation serves as a predictor of responsiveness to diagnosis and prognosis of various cancers, and thus an effective and rapid detection method of the TERT mutation is required for early diagnosis and optimal therapeutic approach of cancer.
  • the present inventors sought a solution to the above-mentioned problem by providing a kit containing a DNA polymerase capable of detecting mutations in the TERT promoter with high sensitivity and a reaction buffer for increasing its activity.
  • the kit of the present invention exhibits high detection sensitivity, high specificity and reproducibility, and is applicable to both liquid biopsy and tissue biopsy.
  • FAM/CY5 channels enable analysis on all qPCR devices.
  • amino acid refers to any monomeric unit that can be incorporated into a peptide, polypeptide, or protein.
  • amino acid includes the following 20 natural or genetically encoded alpha-amino acids: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspart Acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan ( Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), and valine (Val
  • Amino acids are typically organic acids, which include substituted or unsubstituted amino groups, substituted or unsubstituted carboxy groups, and one or more side chains or groups, or any analogue of these groups.
  • exemplary side chains include, for example, thiol, seleno, sulfonyl, alkyl, aryl, acyl, keto, azido, hydroxyl, hydrazine, cyano, halo, hydrazide, alkenyl, alkynyl, ether, Borate, boronate, phospho, phosphono, phosphine, heterocyclic, enone, imine, aldehyde, ester, thio acid, hydroxylamine, or any combination of these groups.
  • mutant refers to a recombinant polypeptide comprising one or more amino acid substitutions compared to the corresponding naturally occurring or unmodified DNA polymerase.
  • thermo stable polymerase (referring to a heat stable enzyme) is heat resistant, retains sufficient activity to achieve subsequent polynucleotide elongation reactions and is treated with elevated temperature for the time required to achieve denaturation of the double-stranded nucleic acid Does not irreversibly denature (deactivate) when As used herein, it is suitable for use at temperatures cycling reactions such as PCR. Irreversible denaturation herein refers to permanent and complete loss of enzyme activity.
  • enzymatic activity refers to catalyzing a combination of nucleotides in a suitable way to form a polynucleotide extension product complementary to the template nucleic acid strand.
  • thermophilic bacteria include, for example: Thermomoto maritima, thermos aquaticus, thermos thermophilus, thermos flavus, thermomod philipformis, thermos species DNA polymerase derived from Sps17, Thermos species Z05, Thermos Caldophyllus, Bacillus caldotenax, Thermomoto Neopolitana, and Thermosippo africanus.
  • thermoactivity refers to an enzyme that maintains catalytic properties at temperatures (ie 45-80° C.) commonly used for reverse transcription or annealing/extension steps in RT-PCR and/or PCR reactions.
  • Thermostable enzymes are those that are not irreversibly inactivated or denatured when treated at elevated temperatures required for nucleic acid denaturation.
  • the thermoactive enzyme may or may not be thermostable.
  • the thermally active DNA polymerase can be DNA or RNA dependent from thermophilic or mesophilic species, including but not limited to:
  • nucleotide is a deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) that exists in the form of a single strand or a double strand, and is not specifically mentioned otherwise. Unless it can contain analogs of natural nucleotides.
  • nucleic acid or “polynucleotide” refers to a polymer that can correspond to a DNA or RNA polymer, or analogs thereof.
  • Nucleic acids can be, for example, chromosomal or chromosomal segments, vectors (eg, expression vectors), expression cassettes, naked DNA or RNA polymers, products of polymerase chain reaction (PCR), oligonucleotides, probes, and primers. Or may include it.
  • Nucleic acids can be, for example, single-stranded, double-stranded, or triple-stranded, but are not limited to any particular length. Unless otherwise stated, certain nucleic acid sequences include or encode complementary sequences in addition to any sequence specified.
  • primer refers to a polynucleotide that can serve as a starting point for nucleic acid synthesis in the template-direction when placed under conditions where polynucleotide elongation is initiated. Primers can also be used in a variety of other oligonucleotide-mediated synthesis processes, including as initiators of de novo RNA synthesis and in vitro transcription-related processes. Primers are typically single-stranded oligonucleotides (eg, oligodeoxyribonucleotides). The appropriate length of the primer will typically depend on the intended use in the range of 6 to 40 nucleotides, more typically in the range of 15 to 35 nucleotides.
  • Primers are not required to reflect the exact sequence of the template, but must be sufficiently complementary to hybridize with the template for elongation of the primer.
  • the term “primer pair” includes a 5′-sense primer that hybridizes complementarily to the 5′-end of the amplified nucleic acid sequence, and a 3′-antisense primer that hybridizes to the 3′ end of the amplified sequence.
  • Means a set of primers comprising Primers can be labeled, if necessary, by incorporating a label that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • useful labels include: 32 P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (usually used in ELISA assays), biotin, or haptens and proteins in which antiserum or monoclonal antibodies can be used. .
  • 5′-nuclease probe refers to an oligonucleotide comprising at least one luminescent label moiety used in a 5′-nuclease reaction to target nucleic acid detection.
  • the 5'-nuclease hydrolyzate probe comprises only a single luminescent moiety (eg, fluorescent dye, etc.).
  • the 5'-nuclease probe contains a self-complementary region so that the probe can form a hairpin structure under selective conditions.
  • the 5'-nuclease hydrolyzate probe comprises two or more labeling moieties, and one of the two labels is released from the oligonucleotide after being separated or degraded to increase the emission intensity.
  • the 5'-nuclease hydrolase probe is labeled with two different fluorescent dyes, for example a 5'-terminal reporter dye and a 3'-terminal quencher dye or moiety.
  • the 5'-nuclease probe is labeled in addition to, or at one or more positions other than the terminal position. When the probe is intact, energy transfer typically occurs between the two phosphors such that the fluorescence emission from the reporter dye is partially extinguished.
  • a 5'-nucleic acid hydrolase probe bound to the template nucleic acid has an activity such that the fluorescence of the reporter dye is no longer quenched, for example, Taq polymerase or other Degraded by the 5'to 3'-nucleic acid hydrolase activity of the polymerase.
  • a 5'-nuclease probe can be labeled with two or more different reporter dyes and a 3'-terminal quencher dye or moiety.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • poster resonance energy transfer refers to the transfer of energy between two or more chromophores, donor chromophores and receptor chromophores (referred to as quenchers).
  • the donor typically transfers energy to the receptor when the donor is excited by emitting light of a suitable wavelength.
  • Receptors typically re-emit energy transferred in the form of light emitted at different wavelengths.
  • the receptor is a “cancer” matting agent, it disperses the energy transferred in a form other than light. Whether a particular fluorescent substance acts as a donor or a receptor depends on the properties of other members of the FRET pair. Commonly used donor-receptor pairs include FAM-TAMRA pairs.
  • Commonly used matting agents are DABCYL and TAMRA.
  • Commonly used cancer matting agents include: BlackHole Quenchers' (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black' (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), And BlackBerry ⁇ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
  • nucleic acid base nucleoside triphosphate, or nucleotide refers to naturally occurring polynucleotides described (ie, for DNA, they are dATP, dGTP, dCTP and dTTP).
  • dATP dGTP
  • dCTP dCTP
  • dTTP dTTP
  • dITP, and 7-deaza-dGTP are frequently used instead of dGTP and can be used instead of dATP in in vitro DNA synthesis reactions such as sequencing.
  • nucleic acid base nucleotide, or nucleotide
  • nucleotide is a conventional base, nucleotide, or modification, derivative, or nucleotide that occurs naturally in a particular polynucleotide, or Analogs.
  • Certain unusual nucleotides are modified at the 2'position of the ribose sugar compared to conventional dNTP.
  • nucleotides for RNA are ribonucleotides (i.e., ATP, GTP, CTP, UTP, collective rNTP), since nucleotides have hydroxyl groups at the 2'position of the sugar, this is compared to the absence of dNTP,
  • ribonucleotides are unusual nucleotides as substrates for DNA polymerases.
  • unusual nucleotides include, but are not limited to, compounds used as terminators for nucleic acid sequencing.
  • Exemplary terminator compounds include, but are not limited to, compounds having a 2',3'- dideoxy structure, referred to as dideoxynucleoside triphosphate.
  • Dideoxynucleoside triphosphate ddATP, ddTTP, ddCTP and ddGTP are collectively referred to as ddNTP.
  • Additional examples of terminator compounds include 2'-PO 4 analogues of ribonucleotides.
  • Other unusual nucleotides are phosphorothioate dNTP ([[ ⁇ ]-S]dNTP), 5'-[ ⁇ ]-borano-dNTP, [ ⁇ ]-methyl-phosphonate dNTP, and ribonucleosides Triphosphate (rNTP).
  • Uncommon bases include radioactive isotopes such as 32 P, 33 P, or 35 S; Fluorescent labels; A label for chemiluminescence; Bioluminescent markers; Hapten labels such as biotin; Or it can be labeled with an enzyme label such as streptavidin or avidin.
  • Fluorescent labels can include negatively charged dyes, such as the dyes of the fluorescein family, or neutrally charged dyes, such as the dyes of the rhodamine family, or positively charged dyes, such as the dyes of the cyanine family. Dyes of the fluorescein family include, for example, FAM, HEX, TET, JOE, NAN and ZOE.
  • Rhodamine family dyes include Texas Red, ROX, R110, R6G, and TAMRA.
  • Various dyes or nucleotides labeled FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red and TAMRA are Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), or Invitrogen /Molecular Probes (Eugene, OR).
  • the cyanine family dyes include Cy2, Cy3, Cy5, and Cy7, and are marketed by GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).
  • the 507th amino acid residue, glutamic acid (E), is substituted with lysine (K), the 536th amino acid residue, arginine (R), is replaced with lysine (K), and the 660th amino acid residue.
  • It provides a DNA polymerase for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, including Taq polymerase in which phosphorus arginine (R) is substituted with valine (V).
  • the "Taq polymerase” was a thermophilic DNA polymerase named after the thermophilic bacterium Thermus aquaticus and was first isolated from the bacteria.
  • Thermos Aquaticus is a bacterium inhabiting hot springs and hot water jets, and Taq polymerase has been identified as an enzyme capable of withstanding the protein denaturation conditions (high temperature) required in PCR.
  • the optimum activity temperature of Taq polymerase is 75-80 °C, has a half-life of 9 hours at 22.5 hours at 92.5 °C, 40 minutes at 95 °C, 9 minutes at 97.5 °C, and replicates 1000 base pair DNA within 10 seconds at 72 °C Can.
  • PCR can be performed at high temperatures (above 60°C).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 for Taq polymerase is used as a reference sequence.
  • the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K) in glutamic acid (E)
  • the 536th amino acid residue is substituted with lysine (K) in arginine (R)
  • the 660th amino acid Taq polymerase in which the residue is substituted with valine (V) in arginine (R) was designated as “E507K/R536K/R660V”, and its amino acid sequence and nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 2 and 16, respectively.
  • the present invention also provides a primer set for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene comprising at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 6.
  • the primer set for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene of the present invention may be, for example, those described in Table 16 of Example 3, but is not limited thereto.
  • the polymerase according to the present invention has excellent sensitivity for detecting mutations in the promoter of the TERT gene, especially when used together with the primer sequences in Table 16.
  • the present invention also provides a probe for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 may be labeled with a fluorophore at the 5'-terminus and a quencher at the 3'-terminus.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 may be labeled with a FAM with a fluorescent substance at the 5'-end and BHQ-1 with a quencher at the 3'-end.
  • the present invention also provides a kit for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene, comprising the DNA polymerase and/or primer set described above.
  • the kit of the present invention can be used for research (Research Use Only, RUO) or in-vitro diagnostic (IVD).
  • the kit of the present invention may be a PCR kit, and may contain any reagents or other elements recognized by those skilled in the art as being used in the primer extension process.
  • the PCR kit of the present invention includes (a) nucleoside triphosphate; (b) a reagent for quantification that binds double-stranded DNA; (c) polymerase blocking antibodies; (d) one or more control values or control sequences; And (e) one or more templates; may further include one or more selected from the group consisting of.
  • the kit comprises 0.5 to 10 mM KCl; And 1 to 30 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; and may further include a PCR buffer composition having a final pH of 8.0 to 9.5.
  • the kit comprises 1 to 5 mM KCl; And 5 to 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; and a final pH of 8.0 to 9.0 may be further included in the PCR buffer composition.
  • the kit comprises 0.5 to 10 mM KCl; 1 to 30 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; And 5 to 50 mM of TMAC (Tetra methyl ammonium chloride), and may further include a PCR buffer composition having a final pH of 8.0 to 9.5.
  • the kit comprises 1 to 5 mM KCl; 5 to 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; And 10 to 30 mM of TMAC (Tetra methyl ammonium chloride), and may further include a PCR buffer composition having a final pH of 8.0 to 9.0.
  • the kit according to the present invention may further include TrisCl (pH 8.0 to 9.5), MaCl 2 , Tween 20, BSA (Bovine serum albumin), and betaine in addition to KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , and TMAC, ,
  • TrisCl pH 8.0 to 9.5
  • MaCl 2 Tween 20
  • BSA Bovine serum albumin
  • betaine betaine in addition to KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , and TMAC,
  • concentration of these components can be used by adjusting to a suitable range by a person skilled in the art.
  • the PCR buffer composition as described above enables reliable gene mutation-specific amplification by remarkably improving the activity of the DNA polymerase of the present invention.
  • the PCR kit may be applied to general PCR (1st generation PCR), real-time PCR (2nd generation PCR), digital PCR (3rd generation PCR) or mass array (MassARRAY).
  • the digital PCR may be cast PCR (Competitive allele-specific TaqMan PCR) or Droplet digital PCR (ddPCR), and more specifically, allele specific cast PCR or allele It may be a specific droplet digital PCR, but is not limited thereto.
  • the “cast PCR” is a method for detecting and quantifying rare mutations in samples containing large amounts of normal wild type gDNA, allele-specific TaqMan ® qPCR to inhibit non-specific amplification from wild type alleles. In combination with gene-specific MGB blockers, specificity can be generated that is superior to traditional allele-specific PCR.
  • the "Droplet Digital PCR” is a system for counting target DNA after amplifying a PCR reaction of 20 ⁇ l by dividing it into 20,000 droplets, and depending on whether or not the target DNA is amplified in the droplet (1) It is counted as a digital signal with a negative drop (0), counts the copy number of the target DNA through Poisson distribution, and finally, the result can be confirmed by the number of copies per ⁇ l of the sample. Rare mutation detection, very small amount of gene It can be used when amplification, mutation type, etc. are to be identified at the same time.
  • the "mass array” is a multiplexing analysis method applicable to various genomic studies such as genotyping using a MALDI-TOF mass spectrometer, and rapidly analyzing multiple samples and targets at a low cost. It can be used when you want to do it, or if you want to do customized analysis only for a specific target.
  • the TERT gene mutation detection kit of the present invention may further include a probe, a fluorophore, and/or a quencher.
  • the fluorophore may be VIC, HEX, JOE, FAM, CAL Flour Orange 560, Quasar 670, CY5 EverGreen dye, etc., but is not limited thereto.
  • the probe sequence, the type of the fluorophore and the quencher, for example, may be as shown in Table 20 of Example 5, but is not limited thereto.
  • the kit of the present invention adopts AS-PCR (Allele-specific PCR) and real-time PCR technology, and includes a specific primer and a fluorescent probe for detecting TERT mutation in human plasma DNA samples.
  • AS-PCR Allele-specific PCR
  • the targeted mutant DNA matches the base at the 3'end of the primer, is selectively and efficiently amplified, and then the mutant amplicon is detected by a fluorescent probe labeled with FAM. Wild-type DNA cannot match specific primers, and no amplification occurs.
  • Kit of the present invention may be composed of pTERT Master Mixture 1 and 2, ADPS TM smart DNA polymerase, TERT positive control and nuclease-free distilled water.
  • Kit for detecting a mutation in the promoter of the TERT gene of the present invention may be configured as shown in Table 1, but is not limited thereto.
  • Table 3 shows the detection information of pTERT Master Mixture 1 and 2.
  • the present invention also provides a method for detecting a mutation in a promoter of a TERT gene comprising the following steps: (a) extracting a nucleic acid from an isolated biological sample;
  • the PCR may be allele-specific PCR or real-time PCR.
  • the TERT gene mutation detection method of the present invention may further include (d) confirming the amplification result by PCR by measuring a cycle threshold (Ct) value.
  • the cycle threshold (Ct) value means the number of cycles in which the fluorescence generated in the reaction exceeds a threshold, which is inversely proportional to the logarithm of the initial copy number. Therefore, the Ct value assigned to a particular well reflects the number of cycles in which a sufficient number of amplicons have accumulated in the reaction.
  • the Ct value is the cycle in which the increase in ⁇ Rn was first detected.
  • Rn means the magnitude of the fluorescence signal generated during PCR at each time point
  • ⁇ Rn means the fluorescence emission intensity (standardized reporter signal) of the reporter dye divided by the fluorescence emission intensity of the reference dye.
  • the Ct value is also referred to as a crossing point (Cp) in LightCycler.
  • the Ct value represents the point in time at which the system begins to detect an increase in the fluorescence signal associated with the exponential growth of the PCR product in the log-linear phase. This period provides the most useful information about the reaction.
  • the slope of the log-linear phase represents the amplification efficiency (Eff) (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
  • the TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but fluorescence is inhibited by quenching on the probe.
  • the TaqMan probe hybridized to the template is decomposed by the 5'to 3'nuclease activity of the Taq DNA polymerase, and the fluorescent dye is released from the probe.
  • the 5'-end of the TaqMan probe should be located downstream of the 3'-end of the extension primer. That is, when the 3'-end of the extension primer is extended by a template-dependent nucleic acid polymerase, the 5'to 3'nuclease activity of this polymerase cuts the 5'-end of the TaqMan probe, thereby Fluorescence signal is generated.
  • the reporter molecule and quencher molecule bound to the TaqMan probe include fluorescent and non-fluorescent materials.
  • Fluorescent reporter molecules and quencher molecules that can be used in the present invention can use any of those known in the art, and examples thereof are as follows (numbers in parentheses are the maximum emission wavelength in nanometers): Cy2 TM 506, YOPRO TM -1 (509), YOYO TM -1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), Alexa TM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon Green TM 488 (524), RiboGreen TM (525), Rhodamine Green TM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green TM (531), Calcium Green TM (533), TO-PRO TM -1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY
  • the non-fluorescent material used in the reporter molecule and the quencher molecule bound to the TaqMan probe may include a minor groove binding (MGB) moiety.
  • MGB minor groove binding
  • TaqMan MGB-conjugate probe refers to a TaqMan probe conjugated with MGB at the 3'-end of the probe.
  • MGB is a substance that binds to the minor groove of DNA with high affinity, such as netropsin, distamicin, lexitropsin, mitramycin, chromomycin A3, and olibo. Olivomycin, anthramycin, sibiromycin, pentamidine, stilbamidine, berenil, CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6- diamidino-2-phenylindole), CDPI dimers, trimers, tetramers and pentamers, MPC (N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) and dimers thereof, trimers, tetramers and pentamers It does not work.
  • Conjugation of the probe and MGB significantly increases the stability of the hybrid formed between the probe and its target. More specifically, increased stability (ie, increased degree of hybridization) results in increased melting temperature (Tm) of the hybrid duplex formed by MGB-conjugated probes compared to normal probes.
  • Tm melting temperature
  • MGB stabilizes the van der Waals force, thereby increasing the melting temperature (Tm) of the MGB-conjugate probe without increasing the probe length, resulting in shorter probes (e.g. no more than 21 nucleotides) in Taqman real-time PCR under more stringent conditions. Enables the use of.
  • the MGB-conjugated probe removes background fluorescence more efficiently. Therefore, the probe of the present invention may be in the form of a TaqMan MGB-conjugate, wherein the length of the probe includes 15-21 nucleotides, but is not limited thereto.
  • the mutation in the promoter of the TERT gene is selected from the group consisting of cytosine at position 1,295,228 of chromosome 5 and deletion, substitution and insertion mutation of cytosine at position 1,295,250 of chromosome 5 1 Species.
  • the mutation in the promoter of the TERT gene may include one or more selected from the group consisting of cytosine at positions 1,295,228 of chromosome 5 and cytosine at positions 1,295,250 of chromosome 5.
  • the method of detecting a mutation in the promoter of the TERT gene of the present invention one or more of the two mutations listed in Table 4 below are simultaneously detected at 1,295,228 positions on chromosome 5 and 1,295,250 positions on chromosome 5 Can.
  • the target sequence may be present in the sample of step (a), and includes DNA, cDNA or RNA, preferably genomic DNA.
  • the test sample may be included in an animal, preferably a vertebrate, more preferably a human subject.
  • the biological sample can be sputum, blood, saliva, or urine, and the nucleic acid of step (a) can be extracted from a formalin-fixed paraffin embedded sample or a liquid biopsy of a tissue biopsy.
  • the method for detecting a mutation in a promoter of the TERT gene of the present invention may include melting temperature analysis using a double-strand specific dye.
  • Melt temperature curve analysis can be performed in real-time PCR devices such as ABI 5700/7000 (96 well format) or ABI 7900 (384 well format) devices with onboard software (SDS 2.1). Alternatively, melt temperature curve analysis can be performed as an endpoint analysis.
  • Double binding to double-stranded DNA or “double-strand specific dye” can be used when it has a higher fluorescence when bound to double-stranded DNA than to the unbound state.
  • dyes are SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, Etidium Bromide (EtBr), SYTOX Orange, TO-PRO-1, SYBR Green I, TO-PRO-3 or EvaGreen. These dyes, except EtBr and EvaGreen (Quiagen), have been tested in real-time applications.
  • the TERT gene mutation detection method of the present invention includes real-time PCR (RT-PCR) or quantitative PCR (qPCR), analysis on agarose gel after standard PCR, gene mutation specific amplification or allele-specific amplification through real-time PCR, Tetra-primer amplification-refractory mutant systems can be performed by PCR or isothermal amplification.
  • RT-PCR real-time PCR
  • qPCR quantitative PCR
  • the "standard PCR” is a technique for amplifying single or several copies of DNA or cDNA known to those skilled in the art. Almost all PCR uses thermostable DNA polymerases such as Taq polymerase or Klen Taq. DNA polymerases use single-stranded DNA as a template and enzymatically assemble new DNA strands from nucleotides by using oligonucleotides (primers). The amplicon generated by PCR can be analyzed, for example, on an agarose gel.
  • the "real-time PCR” can monitor the process in real time when performing PCR. Therefore, data is collected throughout the PCR process, not when the PCR ends.
  • the reaction is characterized by a time point during the cycle when amplification is first detected, rather than the target amount accumulated after a fixed number of cycles.
  • Two methods mainly dye-based detection and probe-based detection, are used to perform quantitative PCR.
  • ASA allele specific amplification
  • the "gene mutation specific amplification or allele-specific amplification through real-time PCR” detects gene mutation or SNP in a very efficient manner. Unlike most other methods for detecting gene mutations or SNPs, preliminary amplification of the target genetic material is not required.
  • ASA combines amplification and detection in a single reaction based on the distinction of matched and mismatched primer/target sequence complexes.
  • the increase in DNA amplified during the reaction can be monitored in real time with an increase in the fluorescence signal caused by dyes such as SYBR Green I, which emit light upon binding to double-stranded DNA.
  • Gene mutation-specific amplification or allele-specific amplification through real-time PCR shows delay or absence of a fluorescent signal for mismatched cases. In detecting genetic variation or SNP, it provides information on the presence or absence of genetic variation or SNP.
  • the "tetra-primer amplification-refractory mutation system PCR” amplifies both wild type and mutant alleles with control fragments in a single tube PCR reaction.
  • Non-allele specific control amplicons are amplified by two common (outer) primers flanking the mutation region.
  • the two allele specific (inner) primers are designed in the opposite direction to the common primer, and can be amplified both wild-type and mutant amplicons simultaneously with the common primer. Consequently, the two allele-specific amplicons have different lengths and can be easily separated by standard gel electrophoresis because the mutations are located asymmetrically with respect to the common (outer) primer.
  • the control amplicon provides internal control for false negatives as well as amplification failures, and at least one of the two allele-specific amplicons is always present in the tetra-primer amplification-refractory mutation system PCR.
  • the "isothermal amplification” does not depend on the thermocycler, and preferably means that the amplification of the nucleic acid takes place at a lower temperature without the need to change the temperature during amplification.
  • the temperature used in isothermal amplification can be between room temperature (22-24 °C) to about 65 °C, or at room temperature of about 60-65 °C, 45-50 °C, 37-42 °C or 22-24 °C.
  • the products of the isothermal amplification results are gel electrophoresis, ELISA, ELOSA (Enzyme linked oligosorbent assay), real-time PCR, ECL (improved chemiluminescence), RNA, DNA, and chip-based capillary electrophoresis devices that analyze protein or turbidity It can be detected with an analyzer (bioanalyzer).
  • ELOSA Enzyme linked oligosorbent assay
  • ECL improved chemiluminescence
  • RNA DNA
  • chip-based capillary electrophoresis devices that analyze protein or turbidity It can be detected with an analyzer (bioanalyzer).
  • TERT gene mutation detection method of the present invention When the TERT gene mutation detection method of the present invention is performed with qPCR, it can be performed under the conditions of Tables 19 to 21 below.
  • DNA polymerases, primer sets, probes and/or kits for detecting mutations in the promoter of the TERT gene of the present invention can be used for cancer diagnosis.
  • the present invention can provide a DNA polymerase, primer set, probe and/or kit for detecting mutations in the promoter of the TERT gene for cancer diagnosis.
  • the present invention may also provide a method for providing information for cancer diagnosis using the above-described DNA polymerase, primer set, probe, and/or kit.
  • the cancer is sarcoma, hepatocellular carcinoma, urinary tract cancer, bladder cancer, thyroid cancer, melanoma, head and neck cancer, It may be one or more selected from the group consisting of medulloblastoma, glioma, astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma.
  • the method for detecting a mutation in a promoter of the TERT gene of the present invention provides information to diagnose a cancer early by establishing a treatment strategy for each patient by detecting a known TERT mutation in Table 4 above, and through this, see a patient Contributes to effective treatment.
  • DNA polymerases, primer sets, probes and/or kits for detecting mutations in the promoter of the TERT gene of the present invention can be applied to the diagnosis, prognosis and drugs of all diseases applicable by detecting the two somatic mutations listed in Table 4 above. It can be used in reactivity prediction methods.
  • prognosis refers to the act of predicting the course and outcome of a disease in advance. More specifically, the prognosis prediction can be interpreted to mean any action that predicts the course of the disease after treatment by comprehensively taking into account the patient's physiological or environmental conditions. Can be.
  • the prognosis prediction may be interpreted as an action of predicting the disease-free survival rate or survival rate of a patient in advance by predicting the progress and complete cure of the disease after treatment of a specific disease. For example, predicting that "the prognosis is good” means that the patient has a high probability of being treated without disease or having a high survival rate after treatment of the disease, and predicting that the "prognosis is bad” is a disease After treatment, the patient's disease-free survival rate or survival rate is low, indicating that the disease is likely to recur or die from the disease.
  • no disease survival rate of the present invention means the possibility that a patient can survive without recurrence of the disease after treatment of the specific disease.
  • survival rate of the present invention means the possibility that a patient can survive regardless of whether or not the disease recurs after treatment of a specific disease.
  • Taq DNA polymerase in which the 536th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine to lysine (hereinafter referred to as "R536K”), Taq DNA polymerase in which the 660th amino acid residue is substituted with valine in arginine. (Hereinafter referred to as “R660V”) and Taq DNA polymerase (hereinafter referred to as “R536K/R660V”) in which the 536th amino acid residue is substituted from arginine to lysine and the 660th amino acid residue is substituted from arginine to valine is prepared as follows. Did.
  • Taq DNA polymerase fragments (F1 to F5) were amplified by PCR using the mutant specific primers listed in Table 5, as shown in Figure 1(a). The reaction conditions are shown in Table 6.
  • Each fragment amplified in 1-1 was used as a template to amplify the full length using primers at both ends (Eco-F and Xba-R primers).
  • the reaction conditions are shown in Tables 7 and 8.
  • pUC19 was digested with the restriction enzyme EcoRI/XbaI at 37°C for 4 hours under the conditions of Table 9 below, and then the DNA was purified and the purified DNA was treated with SAP for 1 hour at 37°C under the conditions of Table 10 to prepare a vector. .
  • the overlap PCR product of Example 1-2 was purified, digested with restriction enzyme EcoRI/XbaI at 37°C for 3 hours under the conditions of Table 11, and then gel extracted with the prepared vector (FIG. 2 ). ).
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed to select from the medium containing ampicillin.
  • the plasmid prepared from the obtained colonies was sequenced to obtain Taq DNA polymerase mutants ("R536K”, “R660V” and “R536K/R660V”) into which the desired mutation was introduced.
  • Taq polymerase activity of "R536K”, “R660V” and “R536K/R660V” prepared in Example 1 was tested to confirm that the activity was poor (data not shown), R536K, R660V, R536K/R660V, respectively
  • an E507K mutation substituted the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with glutamic acid for lysine
  • WT wild-type Taq DNA polymerase
  • Taq DNA polymerase fragments (F6 to F7) were amplified by PCR using the mutant specific primers listed in Table 13. The reaction conditions are shown in Table 14.
  • Each fragment amplified in 2-1 was used as a template, and the full length was amplified using primers (Eco-F and Xba-R primers) at both ends.
  • the reaction conditions are shown in Table 15.
  • pUC19 was digested with the restriction enzyme EcoRI/XbaI at 37°C for 4 hours under the conditions of Table 9, and then the DNA was purified, and the purified DNA was treated with SAP for 1 hour at 37°C under the conditions of Table 10 to prepare a vector. .
  • the overlap PCR product of Example 2-2 was purified, digested with restriction enzyme EcoRI/XbaI at 37° C. for 3 hours under the conditions of Table 11, and then gel extracted with the prepared vector (FIG. 4 ). ).
  • E. coli was transformed into DH5 ⁇ or DH10 ⁇ , and was selected in a medium containing ampicillin.
  • the plasmid prepared from the obtained colonies was sequenced to obtain Taq DNA polymerase mutants introduced with E507K mutations (“E507K/R536K”, “E507K/R660V” and “E507K/R536K/R660V”).
  • the wild type DNA of TERT a primer set capable of amplifying the peripheral region of the target mutation in Table 4 was applied to prepare wild type clones of the promoters 228 (-124) and 250 (-146) .
  • mutagenesis was performed for two target mutants, and transformed into E.Coli DH5 ⁇ cells to obtain each mutant clone. Wild type clones and mutant clones were identified by direct sequencing. Wild-type DNA and mutant DNA at the 228 (-124) and 250 (-146) regions of the promoter extracted through the clones were used as standards to evaluate the performance of the TERT mutation detection kit.
  • samples were prepared by adding 10,000, 100, 10 or 3 copies of each mutant plasmid shown in Table 4 per 30,000 copies of HEK293T cell genomic DNA, and the WT group without addition of the mutant plasmid was used as a control. Did.
  • TERT gene of Table 4 from each group of Table 17 using Taq polymerase (SEQ ID NO: 2) and the primer set of Example 3, each containing the "E507K/R536K/R660V" variant obtained in Example 2 above. My mutation was detected.
  • Table 18 shows two mutant information targeted by TERT Master Mixture 1 and 2.
  • a sufficient TERT reaction mixture containing ADPS smart DNA polymerase and TERT Master Mixture shown in Table 19 was prepared in separate sterile centrifuge tubes, and the reaction Master Mixture was vortexed for 3 seconds to thoroughly mix and briefly centrifuge.
  • Two PCR tubes were prepared for each sample as follows: For each PCR tube, 10.0 ⁇ L of the TERT reaction mixture was divided, and 2.0 ⁇ L of each sample DNA was added to each sample tube, and then the PCR tube was covered. Nuclease-free distilled water was added to all PCR tubes to 20.0 ⁇ L, and PCR strips were briefly centrifuged to collect all liquids at the bottom of each PCR tube.
  • the PCR strip tube was placed in a real-time PCR (real-time PCR) instrument, and PCR was performed after setting the PCR protocol using the cycling parameters in Table 21. After the PCR was completed, the FAM Ct value of each sample was recorded to analyze the data, and the ⁇ Ct value per well was calculated as follows:
  • the fluorescent signal was not detected in the WT group as shown in FIGS. 5A, 5B, 6A, and 6B, but the fluorescent signal was detected in the sample containing the mutation in the TERT gene promoter of Table 4, As shown in Table 24, it was confirmed that the TERT gene mutation can be detected with a high sensitivity of up to 0.01% (3 mutation copies in 30,000 wild-type copies).
  • the kit of the present invention shows high detection sensitivity (up to 0.01%, 3 mutant copies in 30,000 wild-type copies), high specificity and reproducibility, and is applicable to both liquid biopsy and tissue biopsy.
  • a somatic mutation in the promoter of the TERT gene it can be applied to diagnose cancer by simultaneously detecting mutations at positions 1,295,228 and 1,295,250 of chromosome 5.

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Abstract

본 발명은 TERT 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이 (somatic mutation)를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브, 키트 및 상기 키트를 이용한 TERT 유전자 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.

Description

TERT 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트
본 발명은 TERT 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이 (somatic mutation)를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브, 키트 및 상기 키트를 이용한 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.
현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.
또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.
따라서, 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기발견에 사용될 수 있는 것이어야 한다.
한편, 텔로머라아제 역전사 효소(Telomerase reverse transcriptase, TERT)는 텔로머라아제 효소의 촉매 서브유닛이다. 이 효소는 텔로미어 반복 TTAGGG의 첨가에 의해 텔로미어 말단을 유지한다. TERT 프로모터의 체세포 돌연변이는 구조적 활성 및 발현을 야기하며, 이는 결국 암세포의 복제 및 증식을 유도한다. TERT 프로모터 돌연변이는 중추신경계(CNS), 방광, 갑상선 및 피부와 같은 암의 진단 및 예후인자이다. 유두갑상선암(PTC)와 흑색종에서 TERT 프로모터 영역 및 TERT의 돌연변이의 공존은 훨씬 더 공격적인 질환과 짧은 생존과 관련이 있다.
이와 같이, TERT 돌연변이의 존재는 다양한 암의 진단 및 예후 예측에 대한 반응성 예측인자로 작용하므로, 암의 조기 진단 및 최적의 치료적 접근을 위해 TERT 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2015-0132181호는 신경교종 및 종양의 서브세트 내 TERT 프로모터 돌연변이에 관한 것으로, TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이를 검출하여 암에 대한 정보를 제공하는 방법에 대해 개시하고 있으나, TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이를 검출하기 위한 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 TERT 유전자의 프로모터에서 체세포 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 포함하는 키트를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 키트를 이용한, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 갖는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 프라이머를 포함하는 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프로브를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 형광물질로 FAM이 표지될 수 있고, 3'-말단에 소광물질로 BHQ-1이 표지될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 형광물질로 FAM이 표지될 수 있고, 3'-말단에 소광물질로 BHQ-1이 표지될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 0.5 내지 10 mM의 KCl; 및 1 내지 30 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 1 내지 5 mM의 KCl; 5 내지 20 mM의 (NH4)2SO4; 및 5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 TERT 유전자 돌연변이 검출방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 핵산에 전술한 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하는 방법은은 암 진단에 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 암은 육종(sarcoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 요로암(urinary tract cancer), 방광암, 갑상선암, 흑색종, 두경부암(head and neck cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 및 핍지성상세포종(oligoastrocytoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출될 수 있다.
본 발명의 키트는 높은 검출 민감도 (최대 0.01%, 30,000 야생형 카피에서 3개의 돌연변이 카피), 높은 특이성 및 재현성을 나타내며, 액체 생검 및 조직 생검에 모두 적용 가능하다. 또한, TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이로서, 5번 염색체의 1,295,228 위치 및 1,295,250 위치에서 돌연변이를 동시 다발적으로 검출하여 암을 진단하는데 적용될 수 있다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5a 및 5b는 각각 C228T 돌연변이 플라스미드 (각각 10,000, 100, 10 및 3 카피) 주형 및 C228T 돌연변이 플라스미드를 포함하지 않는 WT에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 각각 C250T 돌연변이 플라스미드 (각각 10,000, 100, 10 및 3 카피) 주형 및 C250T 돌연변이 플라스미드를 포함하지 않는 WT에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, TERT 돌연변이의 존재는 다양한 암의 진단 및 예후 예측에 대한 반응성 예측인자로 작용하므로, 암의 조기 진단 및 최적의 치료적 접근을 위해 TERT 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구되고 있다. 이에, 본 발명자들은 TERT 프로모터에서 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 포함하는 키트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 키트는 높은 검출 민감도, 높은 특이성 및 재현성을 나타내며, 액체 생검 및 조직 생검에 모두 적용 가능하다. 또한, FAM/CY5 채널로 모든 qPCR 기기에서 분석이 가능하다.
이하, 본원에 사용되는 용어를 설명한다.
"아미노산" 은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V).
아미노산은 전형적으로 유기산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시기, 및 하나 이상의 측사슬(side chain) 또는 기(group), 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체"는 상응하는 자연 발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함)는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오타이드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, PCR 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아 유래 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스 유래 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80℃)에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
용어 "뉴클레오타이드(nucleotide)"는 단일가닥(single strand) 또는 이중가닥(double strand) 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleic acid; RNA)이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오타이드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오타이드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오타이드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍"은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-핵산가수분해효소(nuclease) 프로브"는 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-핵산가수분해효소 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 표지 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 프로브가 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 2개 이상의 표지 부분을 포함하고, 2개 중 하나의 표지가 올리고뉴클레오타이드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 2개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 표지된다. 프로브가 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-핵산가수분해효소 프로브가 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3'-핵산가수분해효소 활성에 의해 분해된다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브가 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지될 수 있다.
용어 "FRET" 또는 "형광 공명 에너지 이동" 또는 "포에스터 공명 에너지 이동" 은 둘 이상의 발색단, 공여체 발색단 및 수용체 발색단 (소광제로서 지칭됨) 사이의 에너지의 이동을 지칭한다. 공여체는 전형적으로는, 공여체가 적합한 파장의 빛이 방사됨으로써 여기될 때 에너지를 수용체에 이동시킨다. 수용체는 전형적으로는 상이한 파장으로 방사되는 빛의 형태로 이동된 에너지를 재방사한다. 수용체가 "암" 소광제인 경우, 이는 빛 이외의 형태로 이동된 에너지를 분산시킨다. 특정 형광물질이 공여체 또는 수용체로서 작용하는지 여부는 FRET 쌍의 다른 멤버의 특성에 의존적이다. 통상적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍은 FAM-TAMRA 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA 이다. 통상적으로 사용되는 암 소광제는 하기를 포함한다: BlackHole Quenchers쪠 (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black쪠 (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 및 BlackBerry쪠 Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연"은, 기술되는 폴리뉴클레오타이드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오타이드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP)이더라도, 뉴클레오타이드가 당의 2' 위치에서 히드록실기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 통상적이지 않은 뉴클레오타이드다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오타이드의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 표지; 화학발광의 표지; 생물발광의 표지; 합텐 표지 예컨대 비오틴; 또는 효소 표지 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 표지될 수 있다. 형광 표지는, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오타이드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7 을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)에 의해 시판된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소를 제공한다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V"로 명명하였고, 이의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 2 및 16에 나타내었다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트는, 예를 들어, 실시예 3의 표 16에 기재된 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 중합효소는 표 16의 프라이머 서열과 함께 사용하였을 때 특히 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출 민감도가 우수하다.
본 발명은 또한, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프로브를 제공한다.
상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열은 5'-말단에 형광물질 (fluorophore)이 표지될 수 있고, 3'-말단에 소광물질 (quencher)이 표지될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열은 5'-말단에 형광물질로 FAM이 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 BHQ-1이 표지될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 연구용(Research Use Only, RUO) 또는 생체 외 진단용 (In-Vitro Diagnostic, IVD)으로 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 PCR 키트일 수 있으며, 통상의 기술자에게 프라이머 신장 과정에 사용되는 것으로 인지되는 임의의 시약 또는 다른 요소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 PCR 키트는 (a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; (b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; (c) 중합효소 차단 항체; (d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 (e) 하나 이상의 주형;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 0.5 내지 10 mM의 KCl; 및 1 내지 30 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 1 내지 5 mM의 KCl; 및 5 내지 20 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 0.5 내지 10 mM의 KCl; 1 내지 30 mM의 (NH4)2SO4; 및 5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 1 내지 5 mM의 KCl; 5 내지 20 mM의 (NH4)2SO4; 및 10 내지 30 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 KCl, (NH4)2SO4, 및 TMAC 이외에도 Tris·Cl (pH 8.0 내지 9.5), MaCl2, Tween 20, BSA (Bovine serum albumin), 및 베타인을 더 포함할 수 있으며, 이들 구성의 농도는 통상의 기술자가 적절한 범위로 조절하여 사용할 수 있다.
상기와 같은 PCR 버퍼 조성물은 본 발명의 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 일반 PCR(1 세대 PCR), 실시간 PCR(2 세대 PCR), 디지털 PCR(3세대 PCR) 또는 매스 어레이(MassARRAY)에 적용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트에 있어서, 상기 디지털 PCR은 캐스트 PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR) 또는 드랍렛 디지털 PCR(Droplet digital PCR; ddPCR)일 수 있고, 보다 구체적으로 대립유전자 특이적 캐스트 PCR 또는 대립유전자 특이적 드랍렛 디지털 PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 "캐스트 PCR"은 다량의 정상적인 야생형 gDNA를 함유하는 샘플에서 희귀 돌연변이를 검출하고 수량화하는 방법으로, 야생형 대립유전자로부터의 비-특이적 증폭을 억제하기 위해 대립유전자-특이적 TaqMan® qPCR을 대립유전자-특이적 MGB 차단제와 조합하여 전통적인 대립유전자-특이적 PCR보다 우수한 특이성을 생성할 수 있다.
상기 "드랍렛 디지털 PCR"은 20 ㎕의 PCR 반응을 2 만개의 드랍렛으로 쪼개어 증폭시킨 후, 표적 DNA를 계수하는 시스템으로, 드랍렛에서의 표적 DNA의 증폭 여부에 따라 양성 드랍렛 (1)과 음성 드랍렛 (0)으로 디지털 신호처럼 받아들여 계수하고, 프아송 분포를 통해 표적 DNA의 카피수를 계산해 최종적으로 샘플 ㎕ 당 카피수로 결과값을 확인할 수 있고, 희귀 돌연변이 검출, 극소량의 유전자 증폭, 돌연변이 유형을 동시에 확인하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
상기 "매스 어레이"는 MALDI-TOF 질량 분석법(MALDI-TOF mass spectrometer)을 이용하여 유전형질분석(genotyping) 등 다양한 유전체 연구에 적용가능한 멀티플렉싱 분석방법으로, 적은 비용으로 다수의 샘플과 타겟을 빠르게 분석하고자 하는 경우 또는 특정 표적에 대해서만 맞춤형(customized) 분석을 하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자 돌연변이 검출용 키트는 프로브, 형광단(Fluorophore) 및/또는 소광물질(quencher)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형광단은 VIC, HEX, JOE, FAM, CAL Flour Orange 560, Quasar 670, CY5 EverGreen dye 등일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 프로브 서열, 형광단 및 소광물질의 종류는, 예를 들어, 실시예 5의 표 20과 같을 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 AS-PCR (Allele-specific PCR) 및 실시간 PCR 기술을 채용하며, 인간 혈장 DNA 시료에서 TERT 돌연변이를 검출하기 위한 특정 프라이머와 형광 프로브를 포함한다. 핵산 증폭 동안, 표적화된 돌연변이 DNA는 프라이머의 3' 말단에서 염기와 매치되고, 선택적이고 효율적으로 증폭된 다음 돌연변이 앰플리콘은 FAM으로 표지된 형광 프로브에 의해 검출된다. 야생형 DNA는 특정 프라이머와 매치될 수 없으며, 증폭이 발생하지 않는다. 본 발명의 키트는 pTERT Master Mixture 1과 2, ADPSTM 스마트 DNA 중합효소, TERT 양성 대조군 및 뉴클레아제 무첨가 증류수로 구성될 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트는, 예를 들어, 표 1과 같이 구성될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
구성 주요 성분 양
pTERT Master Mixture 1 dNTP를 포함하는 버퍼, TERT 표적 및 IC에 대한 프라이머/프로브 240 μL/튜브 Х1
pTERT Master Mixture 2 dNTP를 포함하는 버퍼, TERT 표적 및 IC에 대한 프라이머/프로브 240 μL/튜브 Х1
ADPSTM 스마트 DNA 중합효소 ADPSTM 스마트 DNA 중합효소 30 μL/튜브 Х1
pTERT 양성 대조군 각 pTERT돌연변이를 포함하는 재조합 플라스미드 블렌드 75 μL/튜브 Х1
뉴클레아제 무첨가 증류수 PCR 등급의 증류수 300 μL/튜브 Х1
상기 표 1의 각 pTERT Master Mixture 1 및 2의 예시적인 구성은 표 2와 같다.
최종농도
MMX 1-2 ADPS GC 버퍼 Tris·Cl (pH 8.8) 50 mM
MgCl2 2.5 mM
KCl 2.5 mM
(NH4)2SO4 10 mM
TMAC 25 mM
Tween 20 0.1%
BSA 0.01%
베타인 1 M
dNTP 각 0.25 mM
프라이머/프로브 특정 농도
ROX 표준 염료 1X
pTERT Master Mixture 1 및 2의 검출 정보는 표 3과 같다.
시약 형광 신호
FAM
pTERT Master Mixture 1 C228T
pTERT Master Mixture 2 C250T
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다:(a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 핵산에 본 발명의 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR일 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자 돌연변이 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 염료의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 염료의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다 (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 소광물질(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 소광물질(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 소광물질에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 소광물질에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광물질에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 소광물질 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YOPRO TM-1 (509), YOYO TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-소광물질 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다.
MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신 (distamycin), 렉시트롭신 (lexitropsin), 미트라마이신 (mithramycin), 크로모마이신 (chromomycin) A3, 올리보마이신 (olivomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 시비로마이신 (sibiromycin), 펜타미딘 (pentamidine), 스틸바미딘 (stilbamidine), 베레닐 (berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC (N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해준다.
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 따라서, 본 발명의 프로브는 TaqMan MGB-컨쥬게이트 형태일 수도 있으며, 이때 프로브의 길이는 15-21 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이의 검출방법은 5번 염색체의 1,295,228 위치 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 하기 표 4에 기재된 2개의 돌연변이 중 1종 이상을 동시 다발적으로 검출할 수 있다.
유전자 프로모터 내 돌연변이 TERT 핵산서열
TERT C228T C > T, chr5:1,295,228;
C250T C > T, chr5:1,295,250;
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법에 있어서, 표적서열은 상기 (a) 단계의 시료에 존재할 수 있으며, DNA, cDNA 또는 RNA, 바람직하게는 유전체 DNA를 포함한다. 테스트 시료는 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체에 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 객담, 혈액, 타액 또는 소변일 수 있고, (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출될 수 있다.본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법은 이중 가닥 특이적 염료를 이용한 용융 온도 분석을 포함할 수 있다.
용융 온도 곡선 분석은, 온보드 소프트웨어 (SDS 2.1)를 포함하는 ABI 5700/7000 (96 웰 포맷) 또는 ABI 7900 (384 웰 포맷) 장치와 같은 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 용융 온도 곡선 분석은 종결점 분석으로서 수행될 수 있다.
"이중 가닥 DNA에 결합하는 염료" 또는 "이중 가닥 특이적 염료"는 결합되지 않은 상태보다 이중 가닥 DNA에 결합하였을 때 높은 형광을 가지는 경우 사용될 수 있다. 이러한 염료의 예로는, SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, 브롬화 에티듐(EtBr), SYTOX Orange, TO-PRO-1, SYBR Green I, TO-PRO-3 또는 EvaGreen이 있다. EtBr 및 EvaGreen (Quiagen)을 제외한 이들 염료는 실시간 응용에 시험되어 왔다.
본 발명의 TERT 유전자 돌연변이 검출방법은 실시간 PCR(RT-PCR) 또는 정량적 PCR(qPCR), 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행될 수 있다.
상기 "표준 PCR"은 통상의 기술자에게 알려진 DNA 또는 cDNA의 단일 또는 수 개의 복제를 증폭시키는 기술이다. 거의 대부분의 PCR은 Taq 중합효소 또는 Klen Taq와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용한다. DNA 중합 효소는 주형으로 단일 가닥 DNA를 사용하고, 올리고뉴클레오타드 (프라이머)를 사용함으로써 뉴클레오타이드로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. PCR에 의해 생성 된 앰플리콘은 예를 들어, 아가로오스 겔에서 분석될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 할 때 실시간으로 그 과정을 모니터링할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
상기 "대립 유전자-특이적 증폭(Allele Specific Amplification, ASA)"은 PCR 프라이머를 단일 뉴클레오타이드 잔기가 다른 주형들을 구별할 수 있도록 고안한 증폭 기술이다.
상기 "실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭"은 매우 효율적인 방법으로 유전자 변이 또는 SNP를 검출한다. 유전자 변이 또는 SNP를 검출하기 위한 다른 대부분의 방법과는 달리, 표적 유전자 물질의 예비 증폭이 필요하지 않다. ASA는 매치 및 미스매치된 프라이머/표적서열 복합체의 구별을 바탕으로 단일 반응에서 증폭 및 검출을 결합한다. 반응동안 증폭된 DNA의 증가는 이중 가닥 DNA에 결합하는 것에 따라 발광하는 SYBR Green I과 같은 염료에 의해 야기되는 형광 신호의 증가로 실시간 모니터링될 수 있다. 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 미스매치된 경우에 대한 형광 신호의 지연 또는 부재가 나타난다. 유전자 변이 또는 SNP 검출에서, 이는 유전자 변이 또는 SNP 존재 유무에 대한 정보를 제공한다.
상기 "테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR"은 단일 튜브 PCR 반응에서 대조 단편과 함께 야생형 및 돌연변이 대립 유전자를 모두 증폭한다. 비 대립 유전자 특이적 대조 앰플리콘은 돌연변이 영역 측면의 2개의 공통적인 (바깥쪽) 프라이머에 의해 증폭된다. 2개의 대립 유전자 특이적 (안쪽) 프라이머는 공통 프라이머와 반대 방향으로 설계되며, 공통 프라이머와 함께 야생형 및 돌연변이 앰플리콘 둘 다를 동시에 증폭시킬 수 있다. 결과적으로, 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘은 돌연변이가 공통 (바깥쪽) 프라이머에 대해 비대칭으로 위치하기 때문에 다른 길이를 가지며 표준 겔 전기영동으로 쉽게 분리할 수 있다. 상기 대조 앰플리콘은 증폭 실패뿐만 아니라 위음성에 대한 내부 대조를 제공하며 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘 중 적어도 하나는 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR에 항상 존재한다.
상기 "등온 증폭"은 써모사이클러에 의존하지 않고, 바람직하게는 증폭하는 동안 온도가 변화할 필요없이 핵산의 증폭이 더 낮은 온도에서 이루어짐을 의미한다. 등온 증폭에서 사용되는 온도는 실온 (22-24 ℃) 내지 약 65 ℃ 사이, 또는 약 60-65 ℃, 45-50 ℃, 37-42 ℃ 또는 22-24 ℃의 상온일 수 있다. 등온 증폭 결과의 생성물은 겔 전기 영동, ELISA, ELOSA (Enzyme linked oligosorbent assay), 실시간 PCR, ECL (개선된 화학 발광), RNA, DNA 및 단백질 또는 탁도를 분석하는 칩 기반의 모세관 전기 영동 기기인 생물분석기 (bioanalyzer)로 검출될 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자 돌연변이 검출방법이 qPCR로 수행되는 경우, 예를 들어, 하기 표 19 내지 21의 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트를 암 진단을 위한 용도로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 암 진단을 위한 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트를 이용한, 암 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 육종(sarcoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 요로암(urinary tract cancer), 방광암, 갑상선암, 흑색종, 두경부암(head and neck cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 및 핍지성상세포종(oligoastrocytoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법은, 상기 표 4의 공지된 TERT 돌연변이를 검출함으로써 암을 조기에 진단하여 환자 맞춤별로 치료전략을 수립할 수 있는 정보를 제공하고, 이를 통해 환자를 보다 효과적으로 치료하는데 기여한다.
본 발명의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트는 상기 표 4에 기재된 2개의 체세포 돌연변이를 검출함으로써 적용할 수 있는 모든 질환의 진단, 예후 및 약물 반응성 예측방법에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 예후 예측은 특정 질환의 치료 후, 해당 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 질환이 재발하거나 또는 해당 질환으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "무병생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 용어 "생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발여부에 관계 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 5에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 6과 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 8
R536K-R CTT GGT GAG CTC CTT GTA CTG CAG GAT 9
R536K-F ATC CTG CAG TAC AAG GAG CTC ACC AAG 10
R660V-R GAT GGT CTT GGC CGC CAC GCG CAT CAG GGG 11
R660V-F CCC CTG ATG CGC GTG GCG GCC AAG ACC ATC 12
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 13
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 1 μl
R 프라이머 1 μl
증류수 18 μl
pUC19-Taq (10 ng/ μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 7 및 8과 같다.
R660V 또는 R536K
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 1 (또는 단편 3) 1 μl
단편 2 (또는 단편 4) 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
R536K/R660V
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 26 μl
단편 2 1 μl
단편 3 1 μl
단편 5 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
그 결과, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.
1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 9의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 10의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2.5 μl
pUC19 (500 ng/μl) 21.5 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 25 μl
10xSAP 버퍼 (로슈) 2 μl
정제된 DNA 17 μl
SAP (로슈) 1 μl
　 20 μl
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 11의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2 μl
정제된 PCR 산물 17 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 20 μl
표 12의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
　 벡터 단독 벡터+인서트
10x연결효소 버퍼 (솔젠트) 1 μl 1 μl
벡터 1 μl 1 μl
인서트 - 3 μl
증류수 7 μl 4 μl
T4 DNA 연결효소 (솔젠트) 1 μl 1 μl
　 10 μl 10 μl
[실시예 2]
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소 활성을 테스트해 본 결과 활성이 떨어지는 것을 확인하고(데이터 미도시), R536K, R660V, R536K/R660V 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 대조군으로 사용하기 위해 야생형 Taq DNA 중합효소(WT)에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 13에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 14와 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 8
E507K-R CTT GCC GGT CTT TTT CGT CTT GCC GAT 14
E507K-F ATC GGC AAG ACG AAA AAG ACC GGC AAG 15
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 13
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
R 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
증류수 18 μl
주형 플라스미드 (10 ng/μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
*주형 플라스미드: pUC19-Taq (WT)pUC19-Taq (R536K)pUC19-Taq (R660V)
pUC19-Taq (R536K/R660V)
2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 15와 같다.
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 6 1 μl
단편 7 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
2-3. 라이게이션
pUC19을 표 9의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 10의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 11의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 12의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
[실시예 3]
프라이머 세트의 제작
TERT 유전자의 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 TERT 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 표 16에 나타난 바와 같이 프라이머를 디자인하였다.
돌연변이 그룹 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호 최종 농도 (nM)
C228T pTERT OF5 CAC CCG TCC TGC CCC TTC ACC TT 3 200
C228T Rmt (20-2T) GGG GCT GGG AGG GCC CGT AA 4 200
C250T pTERT OF5 CAC CCG TCC TGC CCC TTC ACC TT 5 200
C250T Rmt (19-2T) GCT GGG CCG GGG ACC CTG A 6 200
[실시예 4]
시료의 준비
돌연변이 플라스미드 준비
TERT의 야생형 DNA인 HEK293T 세포주의 gDNA를 이용하여 표 4의 표적 돌연변이의 주변 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 적용하여 프로모터의 228(-124) 및 250(-146) 부위의 야생형 클론을 제작하였다. 제작한 야생형 DNA를 이용하여 표적 돌연변이 2개에 대해 돌연변이 유발 (mutagenesis)을 진행하여 E.Coli DH5α 세포에 형질전환하여 각 돌연변이형 클론을 확보하였다. 야생형 클론과 돌연변이형 클론의 확인은 직접 염기서열분석법에 의해 확인하였다. 클론을 통해 추출된 프로모터의 228(-124) 및 250(-146) 부위의 야생형 DNA와 돌연변이형 DNA는 TERT 돌연변이 검출 키트의 성능을 평가하기 위한 표준물질로 사용하였다.
표 17에 나타낸 바와 같이, HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 당 표 4에 기재된 각 돌연변이 플라스미드를 10,000, 100, 10 또는 3 카피를 첨가하여 시료를 준비하였고, 돌연변이 플라스미드를 첨가하지 않은 WT 그룹을 대조군으로 사용하였다.
그룹 시료
WT HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피
WT + mt 104 HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + 해당 돌연변이 플라스미드 10,000 카피
WT + mt 102 HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + 해당 돌연변이 플라스미드 100 카피
WT + mt 101 HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + 해당 돌연변이 플라스미드 10 카피
WT + mt 3 HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + 해당 돌연변이 플라스미드 3 카피
[실시예 5]
TERT 돌연변이 검출
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V"변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 2) 및 실시예 3의 프라이머 세트를 사용하여 표 17의 각 그룹으로부터 표 4의 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하였다. 표 18에는 TERT Master Mixture 1 및 2가 표적하는 2개의 돌연변이 정보를 나타내었다.
MMX 형광 돌연변이 포인트 TERT 핵산 서열
MMX 1 FAM C228T C > T, chr5:1,295,228;
MMX 2 FAM C250T C > T, chr5:1,295,250;
구체적인 qPCR (Applied Biosystems 7500 Fast) 실험 조건은 하기 표 19 내지21과 같고, 프로브는 표 20과 같이 이중으로 표지하였다.
2X pTERT MMX 10 μl
시료 2 μl
뉴클레아제 무첨가 증류수 7.5 μl
ADPS Smart DNA 중합효소 (0.6 U/ul) 0.5 μl
총 20 μl
돌연변이 그룹 프로브 서열 (5'-3') 서열번호 5' 형광단 3' 소광물질 최종농도 (nM)
C228T & C250T TERT FAM-3 프로브 AGC TCC GCC TCC TCC GCG CGG A 7 FAM BHQ1 400
단계 사이클 온도 시간 데이터 수집
1 1 95℃ 5 분 -
　 2 　 　50　 95℃ 10 초 -
60℃ 30 초 FAM / Rox (표준 염료)
72℃ 10 초 -
표 19에 기재된 ADPS 스마트 DNA 중합효소, TERT Master Mixture를 포함하는 충분한 TERT 반응 혼합물을 별도의 멸균 원심분리 튜브에 각각 준비하고 반응 Master Mixture를 3초 동안 볼텍싱하여 완전히 혼합하고 짧게 원심분리하였다. 각 시료에 대해 다음과 같이 2개의 PCR 튜브를 준비하였다: 각 PCR 튜브에 대해 10.0 μL의 TERT 반응 혼합물을 나누고, 2.0 μL의 각 시료 DNA를 각 시료 튜브에 첨가한 다음 PCR 튜브의 뚜껑을 덮었다. 뉴클레아제 무첨가 증류수를 모든 PCR 튜브에 20.0 μL까지 추가하고, PCR 스트립 (strips)을 짧게 원심분리하여 각 PCR 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집하였다. PCR 스트립 튜브를 실시간 PCR (real-time PCR) 기기에 두고, 표 21의 사이클링 파라미터를 이용하여 PCR 프로토콜을 설정한 후 PCR을 수행하였다. PCR 종료 후, 데이터를 분석하기 위해 각 시료의 FAM Ct 값을 기록하고, 각 웰 당 ΔCt 값을 다음과 같이 계산하였다:
ΔCt 값 = 돌연변이 Ct 값 (FAM) - 양성 대조군 Ct 값 (FAM)
ΔCt 컷오프 값: Ct < 17.0
표 22 및 23의 컷오프 ΔCt 값에 따라 각 튜브에 대한 결과를 해석하였다. ΔCt 값이 < 컷오프 ΔCt 값인 경우 시료는 양성인 것으로 판단하고, FAM 신호가 ≥ 컷오프 값인 경우, 시료는 음성으로 판단하며, ΔCt 값이 ≥ Ct 컷오프 값인 경우 시료는 음성이거나 검출 한계 (LoD) 미만인 것으로 판단한다.
결과 결정
TERT MMX 결정
FAM
시료 Ct 값 Ct < 26.0 무효
26.0 ≤ Ct ≤ 44.0 양성
44 < Ct 음성
신호 없음 음성
ΔCt 컷오프 값 ΔCt < 17.0 양성
결과 결정 (예시)
시료 Ct 값 ΔCt 값 결정
FAM(돌연변이) FAM(양성)
#1 30.0 27.0 3.0 양성
#2 44.5 17.5 음성
#3 38.0 11.0 양성
#4 신호 없음 - 음성
상기와 같이 데이터를 분석한 결과, 도 5a, 5b, 6a 및 6b에 나타난 바와 같이 WT 그룹에서는 형광 신호가 검출되지 않았으나, 표 4의 TERT 유전자 프로모터 내 돌연변이를 포함하는 시료에서는 형광 신호가 검출되었으며, 표 24에 나타난 바와 같이 최대 0.01% (30,000 야생형 카피에서 3개의 돌연변이 카피)의 높은 민감도로 TERT 유전자 돌연변이를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
유전자 돌연변이 염기 변화 LoD (카피) 검출 민감도 (%)
TERT C228T C>T 3 0.01
C250T C>T 3 0.01
본 발명의 키트는 높은 검출 민감도 (최대 0.01%, 30,000 야생형 카피에서 3개의 돌연변이 카피), 높은 특이성 및 재현성을 나타내며, 액체 생검 및 조직 생검에 모두 적용 가능하다. 또한, TERT 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이로서, 5번 염색체의 1,295,228 위치 및 1,295,250 위치에서 돌연변이를 동시 다발적으로 검출하여 암을 진단하는데 적용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 중합효소.
  2. 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트.
  3. 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에는 형광물질 (fluorophore)로 FAM이 표지되고, 3'-말단에는 소광물질 (quencher)로 BHQ-1이 표지되는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 프로브.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소; 및/또는
    서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머;
    를 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에는 형광물질 (fluorophore)로 FAM이 표지되고, 3'-말단에는 소광물질 (quencher)로 BHQ-1이 표지되는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  8. 제5항에 있어서,
    0.5 내지 10 mM의 KCl; 및
    1 내지 30 mM의 (NH4)2SO4;
    를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  9. 제5항에 있어서,
    1 내지 5 mM의 KCl;
    5 내지 20 mM의 (NH4)2SO4; 및
    5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  10. 다음의 단계를 포함하는 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 핵산에 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR인, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  12. 제10항에 있어서, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 사이토신 및 5번 염색체의 1,295,250 위치에서 사이토신의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법은 암 진단에 적용되는, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 육종(sarcoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 요로암(urinary tract cancer), 방광암, 갑상선암, 흑색종, 두경부암(head and neck cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 및 핍지성상세포종(oligoastrocytoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출된 것인, TERT 유전자의 프로모터 내 돌연변이 검출방법.
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