KR101958660B1 - 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소의 활성 증가용 pcr 버퍼 조성물 - Google Patents

유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소의 활성 증가용 pcr 버퍼 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성을 증가시키기 위한 PCR 버퍼 조성물, 상기 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트, 및 상기 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.

Description

유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물{PCR BUFFER COMPOSITIONS FOR INCREASING ACTIVITY OF DNA POLYMERASES WITH INCREASED MUTATION SPECIFICITY}
본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성을 증가시키기 위한 PCR 버퍼 조성물, 상기 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트, 및 상기 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
첫 번째 인간 유전체 서열이 밝혀진 이래로, 연구자들은 단일염기 돌연변이 (단일염기다형성, SNPs)와 같은 개체 간의 유전적 차이를 발견하는데 집중해왔다. 유전체에서 단일염기 변이는 매우 다양한 질환에 대한 서로 다른 약물 내성 또는 질병소질과 연관되어 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있기 때문에 관심의 대상이 된다. 추후 의학적으로 관련이 있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 지식은 개인의 유전적 공급에 대한 치료법을 적용할 수 있고, 비효과적이거나 부작용을 일으킬 수 있는 약물 치료를 방지할 수 있다 (Shi, Expert Rev. Mol. Diagn. 1, 363-365 (2001)). 뉴클레오타이드 변이의 시간 및 비용 효율적인 식별을 가능하게 하는 기술의 개발은 약리유전학에서의 추가적인 진보를 가져올 것이다.
SNPs는 인간 유전체에서 주요 유전적 변이를 차지하며 개체 간의 차이의 90% 이상을 유발한다 (Kwok, Annu. Rev. Genomics Hum, Genet. 2, 235-258 (2001); Kwok and Chen, Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003); Twyman and Primrose, Pharmacogenomics 4, 67-79 (2003)). 이러한 유전적 변이와 돌연변이와 같은 다른 핵산 변이를 검출하기 위해, 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 변이체를 동정하는 것은 분석하고자 하는 핵산 샘플을 적합한 혼성화 조건에서 서열 변이체에 대해 특이적인 혼성화 프라이머와 혼성화함으로써 이루어질 수 있다 (Guo et al., Nat. Biotechnol. 15, 331-335 (1997)).
그러나, 이러한 혼성화 방법은, 특히, 어세이의 필수적인 민감도 측면에서 임상학적 요구를 만족시키지 못한다는 것을 발견하였다. 따라서, PCR은 분자생물학 및 SNP 및 다른 대립 유전자 서열 변이체와 같은 돌연변이 검출을 위한 진단 검사 방법에서 폭넓게 사용되어 왔으며 (Saiki et al., Science 239, 487-490 (1988)), 여기서 변이체의 존재를 고려하여 검사하고자 하는 표적 핵산은 혼성화 전에 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 그러한 어세이를 위한 혼성화 프라이머로서, 일반적으로 단일가닥 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 상기 어세이의 변형된 구현예는 형광 혼성화 프로브를 사용하는 것을 포함한다 (Livak, Genet. Anal. 14, 143-149 (1999)). 일반적으로, SNP 및 다른 서열 변이의 측정 방법을 자동화하고자 노력하였다 (Gut, Hum. Mutat. 17, 475-492 (2001)).
당해 기술분야에 공지된 서열 변이 특이적 혼성화의 대안은 소위 유전자 변이 특이적 증폭에 의해 제공된다. 이러한 검출 방법에서, 이미 증폭하는 동안, 변이 특이적 증폭 프라이머가 사용되고, 이는 통상적으로 프라이머의 3'-말단에 소위 차별적 말단 뉴클레오타이드 잔기를 가지며, 잔기는 단지 검출하고자 하는 표적 핵산의 하나의 특이적 변이에만 상보적이다. 이 방법에서, 뉴클레오타이드 변이체는 PCR 증폭 후에 DNA 산물의 존재 또는 부재에 의해 측정된다. 유전자 변이 특이적 증폭의 원리는 유전자 변이 특이적 증폭 프라이머 말단에서 표준(canonical) 또는 비표준 프라이머-주형 복합체의 형성을 기반으로 한다. 정확하게 쌍을 이루는 3' 프라이머 말단에서, DNA 중합효소에 의한 증폭이 일어나는 반면, 미스매치된 프라이머 말단에서는 연장이 억제된다.
예를 들어, U.S. Pat. No. 5,595,890는 유전자 변이 특이적 증폭을 위한 방법 및 이의 적용, 예를 들어 k-ras 종양 유전자에서 임상적으로 연관된 점돌연변이 (point mutation)의 검출을 위한 적용을 개시하고 있다. 또한, U.S. Pat. No. 5,521,301은 ABO 혈액형 시스템의 유전형 분석을 위한 대립 유전자-특이적 증폭 방법을 개시하고 있다. 대조적으로, U.S. Pat. No. 5,639,611은 겸상 적혈구 빈혈의 원인이되는 점돌연변이의 검출과 관련된 대립 유전자-특이적 증폭의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 선택성이 낮다는 문제가 있으며, 이는 더욱 복잡하고 시간 및 비용 집약적인 최적화 단계를 필요로 한다.
서열 변이, 다형성 및 주로 점돌연변이를 검출하기 위한 상기와 같은 방법은, 특히, 검출하고자 하는 서열 변이가 동일한 핵산 분절 (또는 동일한 유전자)의 우세한 변이와 비교하여 부족한 경우 대립 유전자-특이적 증폭(또는 유전자 변이 특이적 증폭)을 필요로 한다.
예를 들어, 유전자 변이 특이적 증폭에 의해 산재성 종양 세포가 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액에서 검출되게 되는 경우, 이러한 상황이 발생한다 (U.S. Pat. No. 5,496,699). 이를 위해, DNA는 첫 번째로 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액으로부터 분리되고, DNA는 부족한 산재성 종양 세포와 과량의 비증식성 세포로 구성된다. 따라서, k-ras 유전자에서 종양 DNA에 중요한 돌연변이는 과량의 야생형 DNA 존재 하에 몇 개의 복제본으로부터 검출되어야 한다.
종래 기술에 개시된 유전자 변이 특이적 증폭에 대한 모든 방법은, 3'-차별적 뉴클레오타이드 잔기의 사용에도 불구하고, 표적 핵산이 검출하고자 하는 서열 변이체와 정확하게 일치하지 않더라도, 적합한 DNA 중합효소의 존재 하에 프라이머 연장이 낮은 수준으로 발생한다는 단점을 갖는다. 특히, 특정 서열 변이체가 다른 서열 변이체를 포함하는 과량의 백그라운드 핵산으로 검출되게 되는 경우, 위양성 결과를 초래하게 된다. 공지된 방법의 또 다른 단점은 3'-말단 차별적 올리고뉴클레오타이드 잔기가 사용되어야 한다는 것이다. 이러한 PCR 기반 방법이 갖는 단점의 주된 이유는 미스매치되는 염기를 충분히 구별하기 위한 방법에 사용되는 중합효소의 부적합성이다. 따라서, PCR로 돌연변이의 유무에 대한 명확한 정보를 직접적으로 얻는 것은 아직까지 가능하지 않다. 현재까지, 추가의 시간 및 비용 집약적 정제와 분석 방법이 돌연변이의 명확한 진단을 위해 요구되었다. 그러므로, 유전자 변이 특이적 또는 대립 유전자-특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 방법은 PCR에 의한 직접적인 유전자 변이 또는 SNP 분석의 신뢰성 및 강력함에 큰 영향을 미칠 것이다.
이에 따라, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소가 제 기능을 발휘할 수 있도록 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 유전자 변이-특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, Taq 중합효소의 특정 위치의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 경우 유전자 변이 특이성이 현저하게 증가하고, PCR 버퍼 조성물의 성분 중 KCl, (NH4)2SO4 및/또는 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도를 조절하는 경우 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 15 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 60 내지 90 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 2 내지 8 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 70 내지 80 mM이고, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 4 내지 6 mM일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 PCR 버퍼 조성물에 5 내지 80 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 추가로 포함하는, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 40 내지 90 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1 내지 7 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도는 15 내지 70 mM이고, 상기 KCl의 농도는 50 내지 80 mM이며, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1.5 내지 6 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있고, 상기 DNA 중합효소는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및 (b) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환, 660번째 아미노산 잔기의 치환 또는 536번째 및 660번째 아미노산 잔기 둘 다의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시에에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; c) 중합효소 차단 항체; d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소가 제 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 최적의 PCR 버퍼 조성물을 제공하며, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소와 함께 사용하여 상기 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전자 변이 또는 SNP를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5는 구강 상피세포를 채취하여 PCR 주형을 제조하는 과정을 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, rs1408799에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 7은 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, rs1015362에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 8은 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, rs4911414에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 9는 본 발명의 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, 반응 버퍼의 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 반응 버퍼에서 최적의 KCl 농도를 확인하기 위해 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정하고 KCl 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행한 다음 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 반응 버퍼에서 최적의 (NH4)2SO4 농도를 확인하기 위해 KCl 농도를 일정하게 고정하고 (NH4)2SO4 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행한 다음 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 반응 버퍼의 (NH4)2SO4 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 13은 반응 버퍼에서 KCl과 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정한 후 TMAC 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 14는 반응 버퍼에서 TMAC과 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정한 후 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 기술에 개시된 유전자 변이-특이적 증폭 방법의 단점을 개선시키기 위해, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소가 제 기능을 발휘할 수 있도록 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있으며, 이러한 방법의 개발은 PCR에 의한 직접적인 유전자 변이 또는 SNP 분석의 신뢰성 및 강력함에 큰 영향을 미칠 것이다. 본 발명자들은 유전자 변이-특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 개발하기 위해 노력한 결과, Taq 중합효소의 특정 위치의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 경우 유전자 변이 특이성이 현저하게 증가하고, PCR 버퍼 조성물의 성분 중 KCl, (NH4)2SO4 및/또는 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도를 조절하는 경우 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소가 제 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 최적의 PCR 버퍼 조성물을 제공하며, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소와 함께 사용하여 상기 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전자 변이 또는 SNP를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 본원에 사용되는 용어를 설명한다.
"아미노산" 은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V).
아미노산은 전형적으로 유기산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시기, 및 하나 이상의 측사슬(side chain) 또는 기(group), 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
다른 예시적인 아미노산은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: 광활성화 가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 금속 결합 아미노산, 스핀-라벨링된 아미노산, 형광 아미노산, 금속-함유 아미노산, 신규 관능기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이지화된 및/또는 광이성질체화 가능한 아미노산, 방사성 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 다른 카르보히드레이트 변형된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학분해성 및/또는 광분해성 아미노산, 탄소-링크된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체"는 상응하는 자연 발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함)는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오타이드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, PCR 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아 유래 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스 유래 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80 ℃)에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
용어 "숙주 세포" 는 세포 배양액에서 배양할 때 고등 식물 또는 동물로부터 둘 모두의 단일-세포성 원핵생물 및 진핵생물 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및 방선균) 및 단일 세포를 지칭한다.
용어 “벡터(vector)”란 복제 가능하고 유전자 같은 외래 DNA를 수용 세포로 전달할 수 있는 DNA 분자로서 플라스미드, 파지, 인조 염색체 등이 있다. 본원에서 “플라스미드”, “벡터” 또는 “플라스미드 벡터”는 동일한 의미로 사용될 수 있다.
용어 “뉴클레오타이드(nucleotide)”는 단일가닥(single strand) 또는 이중가닥(double strand) 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleic acid; RNA)이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오타이드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오타이드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오타이드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍"은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-핵산가수분해효소(nuclease) 프로브"는 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-핵산가수분해효소 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 표지 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 프로브가 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 2개 이상의 표지 부분을 포함하고, 2개 중 하나의 표지가 올리고뉴클레오타이드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 2개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 표지된다. 프로브가 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-핵산가수분해효소 프로브가 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3'-핵산가수분해효소 활성에 의해 분해된다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브가 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지될 수 있다.
용어 "FRET" 또는 "형광 공명 에너지 이동" 또는 "포에스터 공명 에너지 이동" 은 둘 이상의 발색단, 공여체 발색단 및 수용체 발색단 (소광제로서 지칭됨) 사이의 에너지의 이동을 지칭한다. 공여체는 전형적으로는, 공여체가 적합한 파장의 빛이 방사됨으로써 여기될 때 에너지를 수용체에 이동시킨다. 수용체는 전형적으로는 상이한 파장으로 방사되는 빛의 형태로 이동된 에너지를 재방사한다. 수용체가 "암" 소광제인 경우, 이는 빛 이외의 형태로 이동된 에너지를 분산시킨다. 특정 형광물질이 공여체 또는 수용체로서 작용하는지 여부는 FRET 쌍의 다른 멤버의 특성에 의존적이다. 통상적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍은 FAM-TAMRA 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA 이다. 통상적으로 사용되는 암 소광제는 하기를 포함한다: BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 및 BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연"은, 기술되는 폴리뉴클레오타이드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오타이드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP)이더라도, 뉴클레오타이드가 당의 2' 위치에서 히드록실기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 통상적이지 않은 뉴클레오타이드다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오타이드의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 표지; 화학발광의 표지; 생물발광의 표지; 합텐 표지 예컨대 비오틴; 또는 효소 표지 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 표지될 수 있다. 형광 표지는, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오타이드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7 을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)에 의해 시판된다.
용어 "미스매치 구별"은, 핵산에 대해 하나 이상의 뉴클레오타이드를 부착함으로써 (예를 들어, 공유적으로), 주형-의존적 방식으로, 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오타이드)을 연장할 때 미스매치-함유 서열로부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한, 생체촉매 (예를 들어, 효소, 예컨대 중합효소, 리가아제 등)의 능력을 지칭한다. 용어 "미스매치 구별"은, 연장되는 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오타이드)이 핵산이 혼성화되는 주형에 비해 3'-말단 핵산에서 미스매치를 갖는, 미스매치-함유 (대략 상보적) 서열부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한 생체촉매의 능력을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 연장되는 핵산은 완전히 상보적인 서열에 대해 3'-말단에서 미스매치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 연장되는 핵산은, 완전히 상보적인 서열에 대해 말단에서 두번째 (N-1) 3'-위치 및/또는 N-2 위치에서 미스매치를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 15 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물에 관한 것이다.
PCR에 사용되는 중합효소들은 제 기능을 발휘하기 위해 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼를 사용해야 한다. 반응 버퍼에는 일반적으로 pH 안정화를 위한 요소, 보조인자(cofactor)로서의 금속 이온, 중합효소의 변성을 막기 위한 안정화 요소가 포함되어 있다.
상기 KCl은 효소 안정화에 필요한 요소로서 프라이머가 표적 DNA에 결합(pairing)하는 것을 도와주는 역할을 한다. 본 발명에서는 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 높은 양이온 농도를 확인하기 위해 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 조절하여 최적의 농도를 도출하였다.
E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 각각 사용하여 반응 버퍼의 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 반응 버퍼에 KCl이 포함되어 있지 않아도 미스매치에 의한 증폭 지연 효과가 우수하였고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 50mM, 대조군인 E507K의 경우에는 100mM에서 미스매치에 의한 증폭 지연 효과가 우수하였다. 결과적으로, KCl 농도 한계치는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소가 가장 낮고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 E507K 보다 낮음을 확인할 수 있었다.
추가로, 적정선의 KCl 농도를 도출하기 위해 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하고, 반응 버퍼에서 (NH4)2SO4의 농도를 일정하게 고정한 상태에서 KCl의 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행하였다. 증폭 산물을 전기영동으로 확인한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 적정선의 KCl 농도는 75 mM임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물의 KCl 농도는 25 내지 100 mM, 바람직하게는 60 내지 90 mM, 더욱 바람직하게는 70 내지 80 mM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 75 mM일 수 있다.
KCl이 25 mM 미만으로 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭에는 영향이 없으나, 매치된 프라이머에 의한 증폭과 미스매치된 프라이머에 의한 증폭의 차이가 감소할 수 있고, 100 mM을 초과하여 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭의 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
PCR 버퍼 조성물에 있어서, 상기 (NH4)2SO4는 효소 활성에 필요한 보조인자로서 Tris와 함께 중합효소의 활성을 높이기 위해 사용된다. 본 발명의 일실시예에서는 상기에서 도출된 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 75mM로 일정하게 고정하고, (NH4)2SO4의 농도를 2.5 mM 내지 25 mM로 다양하게 변화시킴으로써 적정선의 (NH4)2SO4 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 2.5 내지 15 mM의 (NH4)2SO4 농도에서 증폭 산물이 확인되었고, 적정선의 (NH4)2SO4 농도는 5 mM임을 확인할 수 있었다.
추가로, (NH4)2SO4의 5 mM 농도 부근(각각 2.5 mM, 5mM 및 10 mM) AS-qPCR을 수행한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 10 mM에서 Ct 값의 차이가 가장 컸으나, 매치에 의한 증폭에서 Ct가 다소 지연되고 피크가 눕는 현상이 나타남을 확인하고 적정한 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 결정하였다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물의 (NH4)2SO4 농도는 1 내지 15 mM, 바람직하게는 2.5 내지 8 mM, 더욱 바람직하게는 4 내지 6 mM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 mM일 수 있다.
(NH4)2SO4가 1 mM 미만으로 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭에는 영향이 없으나, 매치된 프라이머에 의한 증폭과 미스매치된 프라이머에 의한 증폭의 차이가 감소할 수 있고, 15 mM을 초과하여 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭의 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 최적화된 PCR 버퍼 조성물은 70 내지 80 mM의 KCl 및 4 내지 6 mM의 (NH4)2SO4를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 또한 5 내지 80 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 추가로 포함할 수 있다.
TMAC는 일반적으로 미스매치에 의한 증폭을 감소시키거나 혼성화 반응의 충실성(stringency)을 향상시키는데 사용된다. 본 발명의 일실시예에서는 상기에서 도출된 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 75mM, (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 일정하게 고정하고 TMAC의 농도를 0 내지 80 mM로 다양하게 변화시킴으로써 적정선의 TMAC 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 E507K/R536K Taq 중합효소는 70 mM, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 25 mM의 TMAC이 적정선인 것으로 확인되었다. 추가로 TMAC 농도를 25 mM, (NH4)2SO4 농도를 2.5 mM로 일정하게 고정한 후 KCl의 농도를 20, 40, 60 및 80 mM로 각각 변화시켜 증폭을 수행한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 SNP rs1015362 및 rs4911414에 대해 적정선의 KCl 농도는 60 mM인 것으로 확인되었다.
TMAC가 80 mM을 초과하여 포함되는 경우 증폭 효율이 감소하므로 상기 범위 내의 농도로 TMAC를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 5 내지 80 mM의 TMAC를 포함하는 경우, KCl의 농도는 40 내지 90 mM, 바람직하게는 50 내지 80 mM일 수 있고, (NH4)2SO4의 농도는 1 내지 7 mM, 바람직하게는 1.5 내지 6 mM일 수 있다.
TMAC를 포함하는 경우, 본 발명의 최적화된 PCR 버퍼 조성물은 15 내지 70 mM의 TMAC, 50 내지 80 mM의 KCl, 1.5 내지 6 mM의 (NH4)2SO4를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함할 수 있으며, 추가적으로 Tween 20 및 소혈청알부민(BSA)을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있고, 상기 DNA 중합효소는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및 (b) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환, 660번째 아미노산 잔기의 치환 또는 536번째 및 660번째 아미노산 잔기 둘 다의 치환을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 통상의 기술자에게 프라이머 신장 과정에 사용되는 것을 인지되는 임의의 시약 또는 다른 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 또한, a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; c) 중합효소 차단 항체; d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K" (서열번호 2)로 명명하였고; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K" (서열번호 6)로 명명하였으며; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R660V" (서열번호 7)로 명명하였고; 마지막으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V" (서열번호 8)로 명명하였다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머를 구별하고, 상기 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단에 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되도록 충분히 상보적이어야 하지만 표적서열의 정확한 서열을 반영하지 않은 혼성 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 "표준 뉴클레오타이드 (canonical nucleotide)" 또는 "상보적 뉴클레오타이드"는 표준 왓슨-크릭 염기쌍, A-U, A-T 및 G-C를 의미한다.
상기 "비표준 뉴클레오타이드(non-canonical nucleotide)" 또는 "비상보적 뉴클레오타이드"는 왓슨-크릭 염기쌍 외에 A-C, A-G, G-U, G-T, T-C, T-U, A-A, G-G, T-T, U-U, C-C, C-U를 의미한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭이 미스매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭보다 낮은 Ct값을 나타낼 수 있다.
예를 들어, DNA 중합효소는 프라이머에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 공유적으로 결합시킴으로써 표적서열 의존적인 방식으로 미스매치된 프라이머 보다 더 큰 효율성으로 매치된 프라이머를 신장할 수 있다. 여기서 더 큰 효율성은 예를 들어 RT-PCR에서 미스매치된 프라이머보다 매치된 프라이머에 대해 낮은 Ct값이 관찰될 수 있다. 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머의 Ct값 차이는 10 이상, 바람직하게는 10 내지 20 이거나 미스매치된 프라이머에 의한 앰플리콘의 합성이 없을 수 있다.
예를 들어 첫 번째 반응에서 매치된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 동일한 실험 세팅으로 두 번째 반응에서 미스매치된 정방향 프라이머와 매치된 역방향 프라이머를 사용하여 표준 PCR로 형성된 생성물이 두 번째 반응보다 첫 번째 반응에 대해 더 크다는 것을 의미한다.
Ct(Threshold crossing cycle) 값은 로그 눈금상 사이클 수에 대한 형광을 플롯팅하는 것에 의존하는 정량적 PCR로 DNA 정량화 방법을 나타낸다. DNA 기반 형광 검출에 대한 한계값은 최소한 백그라운드보다 약간 높게 설정된다. 형광이 한계값을 초과하는 사이클 수를 Ct 또는, MIQE 가이드라인에 따라 Cq(quantification cycle)이라고 한다. 주어진 반응에 대한 Ct 값은 형광 방출이 고정된 한계값을 교차하는 사이클 수로 정의된다. 예를 들어, SYBR Green I 및 형광 프로브는 주형 DNA 정량화에 대한 실시간 PCR에 사용될 수 있다. 샘플로부터의 형광은 PCR 동안 매 사이클마다 수집되고, 사이클 수에 대해 플롯팅된다. 출발 주형 농도는 형광 신호가 최초로 나타나는 사간에 반비례한다. 신호는 주형의 농도가 높을수록 더 일찍 나타난다 (낮은 사이클 수에서 나타남).
본 발명은 또한 전술한 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산을 이용하여 다양한 벡터가 제조될 수 있다. 숙주세포와 호환되는 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 발현 벡터일 수 있고, 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 영역을 포함한다. 조절서열은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결되는 코딩서열의 발현에 요구되는 DNA 서열을 말한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 임의의 작동 서열, alc 리보솜 결합 부위를 포함한다. 또한, 벡터는 전사되는 mRNA의 반감기를 증강시키기 위해 "Positive Retroregulatory Element(PRE)"를 포함할 수 있다. 전사 및 번역 조절 핵산 영역은 일반적으로 중합효소를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 대해 적절할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터, 및 적합한 조절 서열은, 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 예를 들어, 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 벡터 또한 전형적으로는 외래 DNA 의 삽입을 위한 수 개의 제한 부위를 함유하는 폴리링커 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, "융합 플래그" 는 정제를 촉진하기 위해 사용되고, 필요에 따라, 태그/플래그가 후속 제거된다 (예를 들어, "His-Tag"). 그러나, "가열-단계" 가 사용되는 중온성 숙주 (예를 들어, E. coli) 로부터 열활성 및/또는 열안정성 단백질을 정제할 때 이들은 일반적으로 불필요하다. DNA 코딩 복제 서열, 조절 서열, 표현형 선택 유전자를 함유하는 적합한 벡터의 구축, 및 관심 돌연변이체 중합효소가 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다. 단리된 플라스미드, 바이러스 벡터, 및 DNA 단편이 분해되고 절단되어, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 원하는 벡터를 생성하기 위해 특정 순서로 함께 라이게이션된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 대해 다양하할 것이다. 적합한 선택 유전자는 암피실린 및/또는 테트라사이클린 저항성에 대한 유전자 코딩을 포함할 수 있고, 이는 이들 항생제의 존재 하에 이들 벡터를 배양하는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열은 세포에 단독으로 또는 벡터와 조합되어 도입된다. 도입 또는 이의 등가적인 표현은 핵산이 후속 통합, 증폭 및/또는 발현에 적합한 방식으로 세포로 들어가는 것을 의미한다. 도입 방법은 예를 들어 CaPO4 침전, 리포좀 융합, LIPOFECTIN®, 전기영동, 바이러스 감염 등을 포함한다.
원핵생물은 본 발명의 초기 클로닝 단계에 대해 숙주 세포로서 사용된다. 다량의 DNA 를 신속하게 제조하기 위해, 부위-지향 돌연변이생성에 사용되는 단일-가닥 DNA 주형을 제조하기 위해, 많은 돌연변이체를 동시에 스크리닝하기 위해, 생성되는 돌연변이체의 DNA 서열화를 위해, 이들이 특히 유용하다. 적합한 원핵세포의 숙주 세포는 E. coli K12 균주 94 (ATCC No. 31,446), E. coli 균주 W3110 (ATCC No. 27,325), E. coli K12 균주 DG116 (ATCC No. 53,606), E. coli X1776 (ATCC No. 31,537), 및 E. coli B; E. coli 의 많은 다른 균주, 예컨대 HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, 및 기타 다른 종들을 포함하고, 바실리 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 다른 엔테로박테리아 세아, 예컨대 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans), 및 다양한 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) 을 포함하는 원핵생물 속이 호스트로서 사용될 수 있다. 전형적으로 E. coli 의 형질전환에 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 및 Bluescript M13 을 포함한다. 그러나 많은 다른 적합한 벡터가 또한 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 배양물 및 이의 배양상청액으로부터 DNA 중합효소를 분리하는 단계;를 포함하는 DNA 중합효소 제조방법을 제공한다.
본 발명의 DNA 중합효소는 DNA 중합효소의 발현을 유도하거나 야기하는 적절한 조건 하에서, DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환되는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 단백질 발현에 적합한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 람다 pL 프로모터-함유 플라스미드 벡터로부터 중합효소의 제조에 적합한 숙주 세포는 E. coli 균주 DG116 (ATCC No. 53606)을 포함한다. 발현에 따라, 중합효소는 수확되고 분리될 수 있다.
일단 정제되면, 본 발명의 DNA 중합효소의 미스매치 구별이 검정될 수 있다. 예를 들어, 미스매치 구별 활성은, 프라이머의 3-말단에서 단일 염기 미스매치를 갖는 표적의 증폭에 대해 프라이머로 완벽히 매치되는 표적 서열의 증폭을 비교함으로써 측정된다. 증폭은, 예를 들어, TaqManTM 프로브의 사용에 의해 실시간 검출될 수 있다. 2개의 표적 서열 사이를 구분하기 위한 중합효소의 능력은 2 개 반응의 Ct를 비교함으로써 추정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
상기 "SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)"는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G 또는 C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다.
본 발명의 생체 외(in vitro) SNP 검출 방법에서, 표적서열은 테스트 샘플에 존재할 수 있으며, DNA, cDNA 또는 RNA, 바람직하게는 유전체 DNA를 포함한다. 테스트 샘플은 박테리아, 박테리아 배양물 또는 세포 배양물로부터 제조된 세포 용해물일 수 있다. 또한, 테스트 샘플은 동물, 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체에 포함된 것일 수 있다. 표적서열은 유전체 DNA, 바람직하게는 개체의 유전체 DNA, 보다 바람직하게는 박테리아 또는 척추 동물, 가장 바람직하게는 인간 대상체의 유전체 DNA에 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 SNP 검출 방법은 SYBR Green I과 같은 이중 가닥 특이적 염료를 이용하여 용융 온도 분석을 포함할 수 있다.
용융 온도 곡선 분석은, 온보드 소프트웨어 (SDS 2.1)를 포함하는 ABI 5700/7000 (96 웰 포맷) 또는 ABI 7900 (384 웰 포맷) 장치와 같은 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 용융 온도 곡선 분석은 종결점 분석으로서 수행될 수 있다.
"이중 가닥 DNA에 결합하는 염료" 또는 "이중 가닥 특이적 염료"는 결합되지 않은 상태보다 이중 가닥 DNA에 결합하였을 때 높은 형광을 가지는 경우 사용될 수 있다. 이러한 염료의 예로는, SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, 브롬화 에티듐(EtBr), SYTOX Orange, TO-PRO-1, SYBR Green I, TO-PRO-3 또는 EvaGreen이 있다. EtBr 및 EvaGreen (Quiagen)을 제외한 이들 염료는 실시간 응용에 시험되어 왔다.
본 발명의 생체 외(in vitro) SNP 검출 방법은 실시간 PCR, 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행될 수 있다.
상기 "표준 PCR"은 통상의 기술자에게 알려진 DNA 또는 cDNA의 단일 또는 수 개의 복제를 증폭시키는 기술이다. 거의 대부분의 PCR은 Taq 중합효소 또는 Klen Taq와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용한다. DNA 중합 효소는 주형으로 단일 가닥 DNA를 사용하고, 올리고뉴클레오타드 (프라이머)를 사용함으로써 뉴클레오타이드로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. PCR에 의해 생성 된 앰플리콘은 예를 들어, 아가로오스 겔에서 분석될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 할 때 실시간으로 그 과정을 모니터할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
상기 "대립 유전자-특이적 증폭(Allele Specific Amplification, ASA)"은 PCR 프라이머를 단일 뉴클레오타이드 잔기가 다른 주형들을 구별할 수 있도록 고안한 증폭 기술이다.
상기 "실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭"은 매우 효율적인 방법으로 유전자 변이 또는 SNP를 검출한다. 유전자 변이 또는 SNP를 검출하기 위한 다른 대부분의 방법과는 달리, 표적 유전자 물질의 예비 증폭이 필요하지 않다. ASA는 매치 및 미스매치된 프라이머/표적서열 복합체의 구별을 바탕으로 단일 반응에서 증폭 및 검출을 결합한다. 반응동안 증폭된 DNA의 증가는 이중 가닥 DNA에 결합하는 것에 따라 발광하는 SYBR Green I과 같은 염료에 의해 야기되는 형광 신호의 증가로 실시간 모니터될 수 있다. 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 미스매치된 경우에 대한 형광 신호의 지연 또는 부재가 나타난다. 유전자 변이 또는 SNP 검출에서, 이는 유전자 변이 또는 SNP 존재 유무에 대한 정보를 제공한다.
상기 "테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR"은 단일 튜브 PCR 반응에서 대조 단편과 함께 야생형 및 돌연변이 대립 유전자를 모두 증폭한다. 비 대립 유전자 특이적 대조 앰플리콘은 돌연변이 영역 측면의 2개의 공통적인 (바깥쪽) 프라이머에 의해 증폭된다. 2개의 대립 유전자 특이적 (안쪽) 프라이머는 공통 프라이머와 반대 방향으로 설계되며, 공통 프라이머와 함께 야생형 및 돌연변이 앰플리콘 둘 다를 동시에 증폭시킬 수 있다. 결과적으로, 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘은 돌연변이가 공통 (바깥쪽) 프라이머에 대해 비대칭으로 위치하기 때문에 다른 길이를 가지며 표준 겔 전기영동으로 쉽게 분리할 수 있다. 상기 대조 앰플리콘은 증폭 실패뿐만 아니라 위음성에 대한 내부 대조를 제공하며 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘 중 적어도 하나는 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR에 항상 존재한다.
상기 "등온 증폭"은 써모사이클러에 의존하지 않고, 바람직하게는 증폭하는 동안 온도가 변화할 필요없이 핵산의 증폭이 더 낮은 온도에서 이루어짐을 의미한다. 등온 증폭에서 사용되는 온도는 실온 (22-24 ℃) 내지 약 65 ℃ 사이, 또는 약 60-65 ℃, 45-50 ℃, 37 ℃-42 ℃ 또는 22-24 ℃의 상온일 수 있다. 등온 증폭 결과의 생성물은 겔 전기 영동, ELISA, ELOSA (Enzyme linked oligosorbent assay), 실시간 PCR, ECL (개선된 화학 발광), RNA, DNA 및 단백질 또는 탁도를 분석하는 칩 기반의 모세관 전기 영동 기기인 bioanalyzer로 검출될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 SNP (rs1408799, rs1015362 및/또는 rs4911414)를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이 E507K Taq 중합효소에 비해 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소의 경우 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있으며, 그 효과는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소에서 가장 현저하게 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 중합효소는 종래의 Taq 중합효소(E507K)와 비교하여 더 높은 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 DNA 중합효소는 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 또한 a) 하나 이상의 버퍼; b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; c) 중합효소 차단 항체; d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 1에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1(a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 2와 같다.
Figure 112017066634614-pat00001
Figure 112017066634614-pat00002
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1(b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 3 및 4와 같다.
Figure 112017066634614-pat00003
Figure 112017066634614-pat00004
그 결과, 도 1(c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.
1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
Figure 112017066634614-pat00005
Figure 112017066634614-pat00006
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
Figure 112017066634614-pat00007
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
Figure 112017066634614-pat00008
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소 활성을 테스트해 본 결과 활성이 떨어지는 것을 확인하고(데이터 미도시), R536K, R660V, R536K/R660V 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 대조군으로 사용하기 위해 야생형 Taq DNA 중합효소(WT)에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 9에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 10과 같다.
Figure 112017066634614-pat00009
Figure 112017066634614-pat00010
2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 11과 같다.
Figure 112017066634614-pat00011
2-3. 라이게이션
pUC19을 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
본 발명의 DNA 중합효소를 이용한 qPCR 수행
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V" 변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 "E507K" Taq 중합효소를 사용하였다.
본 실시예에서 사용한 SNP를 포함하는 주형은 rs1408799, rs1015362 및 rs4911414이며, 각 주형의 유전자형과 이들 각각에 대한 특이적 프라이머(IDT, 미국)의 서열 정보는 하기 표 12 및 13에 나타낸 바와 같다.
Figure 112017066634614-pat00012
Figure 112017066634614-pat00013
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 하기 표 14과 같다.
Figure 112017066634614-pat00014
프로브는 하기 표 15와 같이 이중으로 표지하였다.
Figure 112017066634614-pat00015
Noble bio로부터 구입한 구강 상피세포 채취 키트를 이용하여 구강 상피세포를 채취한 다음 500 ㎕의 용해액(lysis solution)에 용해시켜 12,000×g로 3분동안 원심분리하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮겨 실험시 1 ㎕씩 사용하였다(도 5).
반응 조건은 표 16, 반응 버퍼의 조성은 표 17과 같다.
Figure 112017066634614-pat00016
Figure 112017066634614-pat00017
상기 표 13의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.
rs1408799, rs1015362 및 rs4911414에 대한 AS-qPCR 결과, 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K에 비해 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Tap 중합효소의 경우 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있으며, 그 효과는 E507K/R536K/R660V의 돌연변이에서 가장 현저하게 나타났다.
본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Tap DNA 중합효소는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소와 비교하여 우수한 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Taq DNA 중합효소는 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
반응 버퍼의 KCl 농도 최적화
본 실시예에서는 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 높은 양이온 농도를 찾기 위해, PCR 반응 버퍼 내에서 KCl의 농도를 조절하여 최적의 KCl 농도를 확인하였다.
실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V" 변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였고, E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소와 KCl 농도 한계치를 비교하였다.
SNP를 포함하는 주형은 rs1408799를 사용하였고, 주형의 유전자형은 TT이며, 프라이머는 표 2에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였다. qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 18, 반응 버퍼의 조성은 표 19과 같다.
Figure 112017066634614-pat00018
Figure 112017066634614-pat00019
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 KCl 농도 한계치는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소가 가장 낮고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 E507K 보다 낮음을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 적정선의 KCl 농도를 결정하기 위해 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 추가 실험을 실시하였다. 프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799-T 특이적 프라이머를 사용하였고, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 35 사이클을 수행하였으며, 반응 조건은 표 20과 같다.
Figure 112017066634614-pat00020
대조군의 반응 버퍼 조성은 표 21과 같으며, 실험군의 반응 버퍼 조성은 표 8과 같이 (NH4)2SO4의 농도를 2.5 mM로 일정하게 고정하고 KCl의 농도를 다양하게 변화시켰다.
Figure 112017066634614-pat00021
상기의 조건으로 증폭을 수행한 후 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 적정한 KCl의 농도는 75 mM임을 확인하였다.
반응 버퍼의 (NH 4 ) 2 SO 4 농도 최적화
본 실시예에서는 상기 실시예 4의 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl 농도를 75 mM로 일정하게 고정한 후, (NH4)2SO4의 농도를 다양하게 변화시켜 최적의 (NH4)2SO4 농도를 확인하였다. 프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799-T 특이적 프라이머를 사용하였고, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 35 사이클을 수행하였으며, 반응 조건은 표 20, 대조군 반응 버퍼의 조성은 표 21과 같다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 적정한 (NH4)2SO4의 농도는 5 mM임을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl 농도를 75 mM로 일정하게 고정한 후 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM 부근(각각 2.5 mM, 5 mM 및 10 mM)으로 설정하고 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 추가 확인하였다.
프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 하기 표 22와 같다.
Figure 112017066634614-pat00022
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 (NH4)2SO4의 농도가 10 mM일 때 Ct 값의 차이가 가장 컸으나, 매치에 의한 증폭에서 Ct가 다소 지연되고 피크가 눕는 현상이 나타남을 확인하고 적정한 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 결정하였다.
실시예 4 및 5의 결과를 종합하면, 최적의 반응 버퍼의 조성은 50 mM Tris·Cl, 2.5mM MgCl2, 75 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20 및 0.01% BSA를 포함하는 것임을 확인하였다.
반응 버퍼의 TMAC 추가 및 농도 최적화
본 실시예에서는 반응 버퍼에 TMAC을 추가하여 최적의 농도를 확인하였다. 상기 실시예 4 및 5의 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도는 75 mM, (NH4)2SO4의 농도는 5 mM로 일정하게 고정한 후 TMAC을 다양한 농도로 변화시켜 적정선의 TMAC 농도를 도출하였다.
E507K/R536K 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하였고, SNP를 포함하는 주형은 rs1408799를 사용하였으며, 주형의 유전자형은 TT이고, 프라이머는 표 2에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였다. qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 22와 같다.
실험 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 E507K/R536K Taq 중합효소는 60 mM, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 25 mM의 TMAC 농도가 적정선인 것으로 확인되었으며, TMAC의 농도가 너무 높으면 증폭 효율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
반응 버퍼의 KCl , (NH 4 ) 2 SO 4 및 TMAC 농도 최적화
본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 확인된 결과를 바탕으로, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 반응 버퍼 내 최적의 KCl, (NH4)2SO4 및 TMAC 농도를 확인하였다.
구체적으로, TMAC의 농도는 25 mM, (NH4)2SO4의 농도는 2.5 mM로 일정하게 고정한 다음 KCl의 농도를 20, 40, 60 및 80 mM로 각각 변화시켰다. rs1015362 및 rs4911414의 2개의 SNP에 대해 실험을 수행하였고, 주형의 유전자형은 표 12에 기재된 바와 같고, 프라이머는 표 13에 기재된 rs1015362 및 rs4911414 프라이머를 사용하였으며, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 22와 같다.
실험 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 2개의 SNP에 대해 60 mM 농도의 KCl이 적정선이고, 80 mM에서는 증폭 효율이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 반응 버퍼 내 최적의 KCl 농도는 60 mM, (NH4)2SO4 농도는 2.5 mM, TMAC 농도는 25 mM임을 확인하였고, 보다 세부적으로 E507K/R536K 중합효소의 경우 75 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4 및 60 mM의 TMAC를 사용하는 것이 가장 효과적이며, E507K/R536K/R660V 중합효소의 경우 60 mM KCl, 2.5 mM (NH4)2SO4 및 25 mM의 TMAC을 사용하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
<110> GeneCast Co., Ltd. <120> PCR BUFFER COMPOSITIONS FOR INCREASING ACTIVITY OF DNA POLYMERASES WITH INCREASED MUTATION SPECIFICITY <130> 1062318 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) <400> 1 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 2 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq E507K <400> 2 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 3 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq R536K <400> 3 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 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cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499 <210> 13 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq R536K/R660V 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agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499 <210> 14 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq E507K/R536 <400> 14 atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120 gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180 gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240 tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300 gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360 gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499 <210> 15 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq E507K/R660V <400> 15 atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120 gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180 gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240 tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300 gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360 gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499 <210> 16 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 16 atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120 gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180 gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240 tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300 gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360 gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eco-forward primer <400> 17 ggggtacctc atcaccccgg 20 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R536K-reverse primer <400> 18 cttggtgagc tccttgtact gcaggat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R536K-forward primer <400> 19 atcctgcagt acaaggagct caccaag 27 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R660V-reverse primer <400> 20 gatggtcttg gccgccacgc gcatcagggg 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R660V-forward primer <400> 21 cccctgatgc gcgtggcggc caagaccatc 30 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xba-reverse primer <400> 22 gctctagact atcactcctt ggcggagagc ca 32 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E507K-reverse primer <400> 23 cttgccggtc tttttcgtct tgccgat 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E507K-forward primer <400> 24 atcggcaaga cgaaaaagac cggcaag 27 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1408799 forward primer <400> 25 ccagtgttag gttatttcta acttg 25 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1408799 reverse_T primer <400> 26 gctcggagca catggtcaa 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1408799 reverse_C primer <400> 27 gctcggagca catggtcag 19 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1015362 forward primer <400> 28 tgaagagcag gaaagttctt ca 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1015362 reverse_C primer <400> 29 actgtgtgtc tgaaacagtg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1015362 reverse_T primer <400> 30 actgtgtgtc tgaaacagta 20 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4911414 forward_G primer <400> 31 gtaagtcttt gctgagaaat tcattg 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4911414 forward_T primer <400> 32 gtaagtcttt gctgagaaat tcattt 26 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4911414 reverse primer <400> 33 agtatccagg gttaatgtga aag 23 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1408799-FAM probe <400> 34 agatatttgt aaggtattct ggcct 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1015362-HEX probe <400> 35 tgctgaacaa atagtcccga ccag 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4911414-Texas Red probe <400> 36 tttctctagt tgcctttaag attt 24

Claims (16)

  1. 60 내지 90 mM의 KCl; 및
    2.5 내지 8 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물로,
    상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소인 것인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 KCl의 농도는 70 내지 80 mM이고, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 4 내지 6 mM 인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  5. 50 내지 80 mM의 KCl;
    1.5 내지 6 mM의 (NH4)2SO4; 및
    5 내지 30 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물로,
    상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소인 것인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 상기 TMAC의 농도는 25 mM이고, 상기 KCl의 농도는 60 mM이며, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 2.5 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물
  9. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  10. 제1항 또는 제5항의 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  11. 제10항에서, 상기 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서,
    a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약;
    c) 중합효소 차단 항체;
    d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및
    e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  14. 제10항의 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
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